SZTE, Orv. Biol. Int., Mol- és Sejtbiol. Gyak., VIII.
Az örökítőanyag Az élőlények örökítőanyaga minden esetben nukleinsav (DNS,RNS) (1)Griffith, (2)Avery, MacLeod and McCarty (3)Hershey and Chase
Ez az örökítőanyag hordozza az élőlények létezéséhez szükséges információ java részét Az örökítőanyag megismerésével, módosításával tehát az élőlényekről – beleértve magunkat is – szerezhetünk ismereteket, valamint lehetőségünk nyílhat az örökítőanyag „hibáiból” fakadó betegségek gyógyítására
Az örökítőanyag izolálása Fehérvérsejtek
Növényi, állati szövetek
Tenyésztett sejtek
Embrionális sejtek
Igazságügyi minták
Fossziliák
1, A minta feltárása
2, A nukleinsavak elválasztása a többi sejtalkotótól 3, Kísérletes felhasználás
Géntár
Molekuláris
Szekvenálás
Southern-blot Polimorfizmus vizsgálatok
klonozás
Szöveti minta/sejtek izolálása és sejtfeltárás, a DNS oldatba vitele Fehérvérsejtek: hipotóniás kezelés, detergensek alkalmazása
DNS izolálás fehérvérsejtekből A mintavétel gyorsan, olcsón elvégezhető. A minta könnyen tárolható. A vér fehérvérsejtjeiből genom DNS hatékonyan, nagy mennyiségben izolálható (1 ml vér 4x106-11x106 fehérvérsejtet tartalmaz). Sejtek feltárása: - Hipotóniás kezelés -Detergens alkalmazása (pl.:SDS, TritonX100)
Szöveti minta/sejtek izolálása és sejtfeltárás, a DNS oldatba vitele Fehérvérsejtek: hipotóniás kezelés, detergensek alkalmazása Növényi, állati szövetek: enzimes sejtfalbontás, késes homogenizátor, fagyasztva örlés dörzsmozsárban
DNS izolálás növényi, állai szövetekből, gombákból Az intercelluláris állomány (növ. gombák sejtfala, állati szövetek kötőszöveti rostjai) nehezítik a sejtek homogenizálását ill. feltárását. Alkalmazható lehetőségek: - Enzimes kezelés (növény, gomba sejtfal bontása). - Roncsolás: késes, üveggyöngyös homogenizátorok. - Folyékony nitrogénben fagyasztott minta őrlése dörzsmozsárban
Szöveti minta/sejtek izolálása és sejtfeltárás, a DNS oldatba vitele Fehérvérsejtek: hipotóniás kezelés, detergensek alkalmazása
DNS izolálás tenyésztett sejtekből
Növényi, állati szövetek: enzimes sejtfalbontás, késes homogenizátor, fagyasztva örlés dörzsmozsárban
A sejtek a tenyészedény falát egy rétegben kolonizálják. Membránfehérjék felelősek a felszínhez való adhézióért.
Tenyésztett sejtek: Leválasztás: tripszines kezeléssel Sejtfeltárás: hipotóniás kezelés, detergensek
A sejtek leválasztása a tenyészedény faláról: - Tripszines kezelés - Mechanikusan Az összegyűjtött sejtek feltárása: - Hipotóniás kezelés - Detergens alkalmazása 106 tenyésztett sejtből ~200μg genom DNS izolálható
Szöveti minta/sejtek izolálása és sejtfeltárás, a DNS oldatba vitele Fehérvérsejtek: hipotóniás kezelés, detergensek alkalmazása Növényi, állati szövetek: enzimes sejtfalbontás, késes homogenizátor, fagyasztva örlés dörzsmozsárban Tenyésztett sejtek: Leválasztás: tripszines kezeléssel Sejtfeltárás: hipotóniás kezelés, detergensek Embrionális sejtek: differenciál centrifugálással izolálhatóak a megzatvízből.
Embrionális sejtek Amniocentézis során 15-20ml magzatvíz nyerhető. Az embrionális sejtek differenciál centrifugálással izolálhatóak a magzatvízből. A sejtek feltárása hasonlóan történik a tenyésztett sejtekéhez.
Szöveti minta/sejtek izolálása és sejtfeltárás, a DNS oldatba vitele Fehérvérsejtek: hipotóniás kezelés, detergensek alkalmazása Növényi, állati szövetek: enzimes sejtfalbontás, késes homogenizátor, fagyasztva örlés dörzsmozsárban Tenyésztett sejtek: Leválasztás: tripszines kezeléssel Sejtfeltárás: hipotóniás kezelés, detergensek Embrionális sejtek: differenciál centrifugálással izolálhatóak a megzatvízből. Igazságügyi minták: kis mennyiségű, komplex minták
Igazságügyi minták A genom DNS izolálás sajátságai:
- Ált. extrém kis mennyiségű sejtből indulhatunk ki (pl: cigaretta szűrőjében maradt emberi sejtek). -A minták komplexitása: a.) Az izolált sejtek több személytől származhanak, vagy embertől és állatól is. (pl.: kutyaharapás helye). b.) A minta fizikai és kémiai, mirkobiológiai szennyezetsége. (pl.: földre száradt vércsepp). A mintavétel, és genom DNS izolálás a legtöbb esetben több szempont együttes mérlegelését igényli.
Szöveti minta/sejtek izolálása és sejtfeltárás, a DNS oldatba vitele Fossziliák A DNS rendkívül stabil makromolekula. Élettelen, megkövesedett csontokban akár több millió évig konzerválódhat. A fossziliák porrá őrlése után a DNS a mintából kioldható.
Az örökítőanyag izolálása 1, A minta feltárása
2, A mintában található makromolekulák (fehérjék, nukleinsavak) elválasztása fizikai-kémiai tulajdonságok alapján 3, A nuukleinsav(ak) tisztítása 4, Nukleinsav oldat tisztaságának, koncentrációjának és
minőségének meghatározása • Oldat abszorbancia értéke alapján • Gélelektroforézis-kép alapján
Genom DNS izolálás proteináz kezeléssel, fenolos extrakcióval és alkoholos kicsapással
1,Sejtfeltárás
2, Proteináz kezelés
2, Fenolos extrakció
DNS RNS denat. fehérjék
3, Alkoholos precipitáció
fenol
+ Kelátképző
DNS RNS csapadék DNS RNS Fehérjék
3, Mosás
Visszaoldás
Szárítás
+ RN-áz kezelés DNS oldat
Genom DNS izolálás affinitás oszlopon Szilika-mátrix: chaotropikus sók jelenlétében köti a DNS-t (pl. guanidine hydrochlorid, NaBr, NaI)
1,Sejtfeltárás: chatropikus sók pl: NaI jelenlétében
2,Minta felvitele a szilikamátrix oszlopra
2, Mosás
2, Eluálás alacsony só koncentrációjú oldattal
+Kelátképző +RN-áz DNS oldat DNS Denat. Fehérjék
Denaturált fehérjék
Genom DNS izolálás mágnesezhető szemcsékkel
1,Sejtfeltárás: chatropikus sók pl: NaI jelenlétében
2, Szilikamátrix bevonatú
+Kelátképzők +RN-áz
mágnesezhető golyók hozzáadása
DNS Denat. fehérjék
2, Mosás
2, Eluálás: alacsony só koncentrációjú oldattal DNS oldat
Genom DNS izolálás mágnesezhető szemcsékkel
Könnyen automatizálható: 20 db, 200μl térfogatú vér mintábol negyed óra alatt genom DNS izolálható.
Genom DNS izolálás proteináz kezeléssel, fenolos extrakcióval és alkoholos kicsapással BioProtocol http://www.bio.com/protocolstools/discipline.jhtml?id=pc1
Genom DNS izolálás affinitás oszlopon http://www.genomed-dna.com/G_M03_03.htm http://www.clontech.com/clontech/techinfo/faqs/mn.shtml http://www1.qiagen.com/
Genom DNS izolálás mágnesezhető szemcsékkel GenoPrep™ Cartridge www.genovision.com
RNS izolálás alapjai RNS izolálás hasonló elven működik, mint a genom DNS elválasztása
Totál RNS preparátum
Sajátságok: RN-áz nehezen inaktiválható. Következésképpen a kontaminációt kerülni kell: kesztyű, RN-áz mentes eszközök, pipetták, oldatok, futtató rendszer alkalmazása (DEPC kezelt oldatok, chaotropikus ágensek alkalmazása). A minta alacsony hőmérsékleten tartása. A tisztítási műveletek lehető legrövidebb idő alatti elvégzése. Downstream applications: Northern analysis, RT-PCR, in vitro translation, expression profiline determination (DNA chips) and cDNA library construction.
28S rRNS
18S rRNS
Az RNS-ek a láncon belüli bázispárosodások miatt natív körülmények közt sokféle térszerkezetet vehetnek fel. A molekulaméret szerinti elválasztás érdekében a térszerkezetűket egyöntetűvé kell tenni az elválasztás alatt. Mindez denaturáló körülmények közt valósítható meg: előhőkezelés, formaldehid tartalmú elválasztó közeg (1%-os agaróz gél).
Plazmid DNS tisztítás Denaturálódott genom-, plazmid DNS és RNS
1,Sejtfeltárás erősen bázikus közegben
Renaturálódott plazmid DNS és RNS
2, Oldat pH gyors semlegesítése
3, Mosás
3, Alkoholos precipitáció
Szárítás
+Kelátképző
Visszaoldás + RN-áz kezelés Deant. genom DNS és denat. fehérjék
+RNS
Plazmid DNS, RNS csapadék
+RNS
Plazmid DNS oldat
4, Nukleinsav oldat tisztaságának, koncentrációjának meghatározása
•Oldat abszorbancia értéke alapján A nukleiotidák - és így a nukleinsavak is – abszorbeálják az UV fényt. Az abszorpció maximuma 260 nm hullámhosszon van, és 0-100 µg/ml koncentrációtartományban lineáris
4, Nukleinsav oldat tisztaságának, koncentrációjának meghatározása 1 A260= 40 μg/ml RNS Abszorbancia 260 nm-en
Abszorbancia
2,0
240
260
280
300 (nm)
1,5
1,0
1 A260= 50 μg/ml DNS
0,5
20
40 60 80 100 120 Nukleinsav koncentráció (μg/ml)
RNS DNS Fehérje
Nukleinsav oldat tisztaságának ellenőrzése
A260/A280 > 1,8
4, Nukleinsav oldat tisztaságának koncentrációjának és minőségének meghatározása •Gélelektroforézis-kép alapján Gélelektroforézis során a töltéssel rendelkező makromolekulák töltés/tömeg arány szerint szétválnak egymástól
Mivel a nukleinsavak töltés/tömeg aránya azonos, így az elválás tömeg (és részben alak) szerint történik Gélelektroforézissel meghatározható az adott nukleinsav hozzávetöleges tömege (mérete), mennyisége
-
A DNS/RNS molekula színtelen, szagtalan, hangot sem ad
Plazmid Lineáris
A láthatóvá tétel érdekében festjük: - autofluoreszcencia nélküli fluoreszcens festékkel pl.: EtBr, SYBR-green, GEL-red stb. -„színes festékkel” pl.: ezüst, metilén-kék A gélről leolvasható: a DNS molekula mérete: „band” pozíciója alapján (cirkuláris és lineáris eltérő) a DNS mennyiség: „band” vastagsága alapján
+
~1 μg DNS
Lineáris Zárt gyűrű (supercoiled)
RNS
Genom DNS
Plazmid DNS +RNS Nyitott gyűrű
Plazmid DNS RN-áz hozzáadása után
Fragmentálódott kromoszóma DNS (lineáris)
A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK
A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK A baktériumokban kifejlődött restrikciós-modifikációs rendszer felfedezése tette lehetővé az irányított, reprodukálható, in vitro DNS szabás-varrást és a technikán alapuló DNS-klónozást. A restrikciós-modifikációs rendszer két különböző enzimaktivitáson alapszik: 1. A restrikciós endonukleázok: A restrikciós enzimek meghatározott sorrendű bázispárokból álló egységet (palindrom szekvenciák) ismernek fel a DNS-spirál kettősláncán és a felismerő helyen, vagy annak közelében hasítani képesek a kettősláncú DNS molekulát. A "restrikciós" szó ezen enzimcsoport nevében a baktériumban betöltött szerepükre utal: a restrikciós enzimek feldaraboljak a gazdasejtbe bejutó idegen DNS-t (pl. bakteriofág DNS-e), "restriktív" körülményeket teremtve számukra. 2. A DNS metilázok metil-csoportokkal jelölik meg a baktériumok saját DNS-ét a baktérium restrikciós endonukleáza által felismert szekvenciánál. A módosítás lehetetlenné teszi az endonukleázok működését, "védik" a DNS molekulát. A baktériumokba bejutott idegen DNS molekula viszont nincs a megfelelő helyen metilálva, és áldozatul esik az endonukleázoknak
A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK
TOMPA VÉG
RAGADÓS VÉG
A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK
A génmanipulációs kísérletekben olyan restrikciós endonukleázokat használnak, amelyek reprodukálhatóan, a felismerőhelyen belül hasítanak. Ezek az enzimek 4-8 bp méretű specifikus szekvenciákat ismernek fel (restrikciós helyek), amelyek un. palindromok: 5'-3' irányban mindkét szálon ugyanaz a bázisok sorrendje. A restrikciós enzimek egy része úgy vágja a DNS-t, hogy rövid, egyszálú, komplementer végek keletkeznek a hasítás helyen. Ezek a "ragadós" végek nagy szerepet játszanak a rekombináns DNS-technikákban, mert könnyen újra összetapadnak ugyanazon vagy más DNS-darabok ugyanolyan ragadós végeivel. A párosodott szekvenciák a DNS-ligáz nevű enzim segítségével stabilan összekötik a két DNS-fragmentet. A restrikciós enzimek másik csoportja a DNS-t a felismert szekvencia középpontjában vágja, így „tompa” végek keletkeznek, amelyek - miután hiányoznak az összekapcsolódást megkönnyítő túlnyúló komplementer szálak - igen nehezen tapadnak újra össze. Előnyük azonban, hogy ebben az esetben csak annyi szükséges az összekapcsolódáshoz, hogy mindkét vég „tompa” legyen.
Teszt kérdések 1, Mely anyagból nem nyerhető DNS molekula az izolálás során? A .fosszilia B. csimpánz vér C. emberi vörösvértest szuszpenzió D. baktérium kolónia E. emberi nyál
2, Gél elektroforézis során a látott band mely tulajdonsága nyújt információt a benne lévő DNS mennyiségéről? A. a pozíciója B. a „vastagsága” C. a band-ek száma D. a színe E. egyik sem
3, Mely sejtek termelik a restrikciós endonukleázokat? A. Neutrofil granulociták B. A máj sejtjei
C. A hasnyálmirigy sejtjei D. Bizonyos baktérium törzsek E. vörösvértestek
