AZ N-METIL-D-ASZPARAGINSAVNAK ÉS AMID SZÁRMAZÉKAINAK ELŐÁLLÍTÁSA, A CSOPORT- ÉS ROTAMER-SPECIFIKUS BÁZICITÁSOK MEGHATÁROZÁSA
Doktori (Ph.D.) értekezés
Boros Miklós Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Témavezető:
Dr. Noszál Béla egyetemi tanár, a kémiai tudomány doktora
Opponensek:
Dr. Balázs Barbara tudományos munkatárs, Ph.D. Dr. Éliás Olivér egyetemi tanársegéd, Ph.D.
Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Lemberkovics Éva egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Stájer Géza egyetemi tanár, a kémiai tudomány doktora Dr. Tóth Gábor egyetemi tanár, a kémiai tudomány doktora
Budapest, 2006
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE................................................................................................ 3 ÖSSZEFOGLALÓ .................................................................................................................. 4 SUMMARY.............................................................................................................................. 5 1
BEVEZETÉS,CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................. 6
2
IRODALMI ÁTTEKINTÉS........................................................................................ 11 2.1 Az NMDA molekula és az NMDA receptorok jelentősége ....................................... 11 2.1.1
Az glutaminsav receptorok osztályozása és az ionotróp altípusok összehasonlítása ................................................................................................. 11 2.1.2 Az NMDA receptor élettani és kórélettani jelentősége...................................... 12 2.1.3 Az NMDA receptor felépítése és ioncsatorna aktivitásának szabályozása........ 14 2.1.4 Az NMDA receptor működése, illetve az általa kifejtett neurotoxicitás molekuláris mechanizmusa......................................................... 16 2.1.5 A glutaminsav kötőhelyen ható agonisták és kompetitív antagonisták receptorkötődésének és aktivitásának szerkezet-hatás összefüggései................ 17 2.2 Protonálódási állandók jelentősége és meghatározási módjai ................................. 22 2.2.1
Sav-bázis paraméterek néhány gyakorlati alkalmazása a glutaminsav receptorok ligandumai körében ............................................................................................ 22 2.2.2 A dolgozatban használt protonálódási állandók meghatározására szolgáló módszerek áttekintése ........................................................................................ 27 2.2.2.1 Potenciometriás titrálás vizes közegben....................................................... 28 2.2.2.2 1H NMR-pH titrálás ..................................................................................... 29 2.3 N-metil aminosavak és származékaik előállítása....................................................... 31 2.4 Rotamer analízis........................................................................................................... 32 2.4.1 Konformációvizsgálatok a glutaminsav receptorok ligandumai körében .......... 32 2.4.2 Rotamer populációk meghatározása homonukleáris hidrogén csatolási állandókból ......................................................................................................... 34 3
KÍSÉRLETI RÉSZ ...................................................................................................... 39 3.1 Felhasznált anyagok..................................................................................................... 39 3.2 Szintetikus kísérletek leírásai...................................................................................... 40 3.3 Vékonyréteg kromatográfia. ....................................................................................... 46 3.4 Az NMA és az amid származékok protonálódási állandóinak meghatározása...... 46
1
3.4.1 3.4.2 4
Potenciometriás titrálások .................................................................................. 46 H NMR pH-titrálások ....................................................................................... 47
1
A KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEI ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ........................................ 49 4.1 Az NMA molekula és a további kísérletekben vizsgált származékok spektroszkópiás és kromatográfiás tulajdonságainak ismertetése .......................... 49 4.2 Az NMA, valamint amid és észter származékainak előállítása ............................... 56 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.2.5
Az NMA előállítására alkalmas reakciók áttekintése ........................................ 56 Az NMA-β-amid előállítása............................................................................... 61 Szubsztituált szukcinimid gyűrű kialakulása és hidrolízise ............................... 61 NMA-α-amid előállítása .................................................................................... 64 NMA-diamid és 1,5-dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid előállítása............................................................................................................ 66
4.3 Az NMA, valamint amid származékainak protonálódási egyensúlyai, azok makroszkopikus szintű leírása és vizsgálata.............................................................. 70 4.3.1 A potenciometriás titrálások kiértékelése .......................................................... 72 4.3.2 Az 1H NMR pH-titrálási görbék kiértékelése .................................................... 73 4.4 Protonálódási egyensúlyok mikroszkopikus szintű leírása és vizsgálata ................ 77 4.4.1
Az összemérhető koncentrációval rendelkező NMA részecskék egyensúlyi állandóinak meghatározása származékvegyület bázicitásának importálásával.. 83 4.4.2 Az NMA mikroállandóinak ellenőrzése............................................................. 83 4.4.3 Az extrém alacsony koncentrációval rendelkező NMA részecskék egyensúlyainak vizgálata.................................................................................... 87 4.5 A protonálódási állandókból levonható következtetések.......................................... 88 4.6 Az NMA és amid származékainak rotamer analízise ............................................... 93 5
ÖSSZEFOGLALÁS, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK................................ 105
IRODALOMJEGYZÉK..................................................................................................... 108 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK ................................................................................................. 112 ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK JEGYZÉKE ............................................................... 112 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................ 113
2
Rövidítések jegyzéke ALS AMPA Arg Asn Asp cAMP ESI-MS Glu HIV HPTLC IC50
iGluRs IUPAC KA LTP Lys MAPKp Met mGluRs MM MRI NMAαa NMAβa NMR NR PCP Ser Thr Tyr Val
amyotrophiás lateral sclerosis (izomsorvadás) alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid arginin aszparagin aszparaginsav ciklikus adenozin-monofoszfát electrospray-ionization mass spectroscopy glutaminsav Human Immunodeficiency Virus nagy hatékonyságú vékonyréteg kromatográfia Általában: Az a hatóanyag mennyiség, amely 50 %-ban gátolja a vizsgált enzimet. A dolgozatban hivatkozott irodalmi forrás értelmezésében: az a hatóanyag mennyiség, amely 50%-ban gátolja a glutaminsav és glicin együttes jelenlétével kiváltható maximális receptorválaszt. ionotróp glutaminsav receptor International Union of Pure and Applied Chemistry kaininsav long-term potentiation lizin mitogénaktivált proteinkináz metionin metabotróp glutaminsav receptor molekula-mechanika magnetic resonance imaging N-metil-DL-aszparaginsav-α-amid N-metil-DL-aszparaginsav-β-amid nuclear magnetic resonance NMDA receptor fenciklidin szerin treonin tirozin valin
3
ÖSSZEFOGLALÓ Az NMDA molekula az excitatorikus glutaminsav-receptorok altípusán, az NMDA receptoron fejt ki szelektív agonista hatást, ezért in vitro kísérletekben évtizedek óta használt farmakológiai tesztanyag. A glutaminsav által közvetített neurotranszmisszióban az NMDA receptorok kulcsszerepet játszanak az idegrendszer kifejlődésében és tanulási mechanizmusok, memória működésében. Számos neurodegeneratív kórképben (Alzheimer kór, Huntington kór, CNS ischemia) azonban az NMDA receptorok hiperaktivációja által közvetített neurotoxicitás a felelős az idegsejtek pusztulásáért. Doktori munkámban az NMDA molekula és származékainak protonálódási egyensúlyait tanulmányoztuk 1H NMR pH-titrálással és pH-potenciometriával. Az NMDA molekula makroállandói, melyek makroszkopikus (molekuláris) szinten jellemzik a molekulák által adott pH-n átlagosan megkötött protonok számát, az NMR és potenciometriás titrálásokból közvetlenül meghatározhatók. A három funkciós csoport protonálódása részben átfedő pH tartományban következik be. Kiszámítottuk a csoportok mikroszkopikus (szubmolekuláris) bázicitásait és a mikrorészecskék koncentrációjának pH függését. Az NMDA 12 protonálódási mikroállandóját három független módszerrel határoztuk meg. Felhasználtuk az NMDA amid-származékainak protonálódási állandóit és pH-függő 1H NMR paramétereit. A karboxilát és metilamino csoportok protonáltsági állapotának hatását a többi csoport bázicitására kölcsönhatási tényezőkkel jellemeztük. Az NMDA 8 mikrorészecskéjének pH-függő eloszlása alapján azonosítottuk a protonálódási folyamatok legmagasabb koncentrációjú részecskéit. Az NMDA molekula és az NMDA receptor kapcsolódási pontjait feltáró farmakológiai vizsgálatok szerint az aktív részecske feltehetően a major protonálódási útvonal valamelyik tagja. Az NMDA molekula rotamer populációit, valamint rotemer-specifikus mikroállandóit 1
H NMR spektrumok vicinális csatolási állandóiból Karplus típusú egyenletek felhasználásá-
val határoztuk meg. Kiszámítottuk a különböző protonáltsági állapotú rotamerek pH-függő eloszlását. A szakirodalomban közölt farmakofór modellek atomtávolságai alapján kiválasztottuk azt a részecskét, amely feltehetően a receptorkötődési folyamatok aktív résztvevője. Hatékony és egyszerű szintetikus eljárásokat dolgoztunk ki az NMA (NMDA racém formája, N-metil-DL-aszparaginsav) és amid-, illetve észter származékainak előállítására. Kidolgoztunk továbbá a származékok vékonyréteg kromatográfiás elválasztására alkalmas módszereket. 4
SUMMARY NMDA (N-methyl-D-aspartate) is a selective glutamate receptor agonist, a widely used in vitro test compound in pharmacologycal studies. NMDA has also been identified as an endogenous molecule in mammalian central nervous systems, acting as a local hormone. NMDA receptors are important in memory formation, synaptic plasticity, whereas their malfunctions (mostly over-excitation) are related to barely curable neurodegenerative disorders such as Huntington’s disease, CNS ischemia, and Alzheimer’s disease. Developing specific and subtype-selective antagonists is therefore a major goal of drug design. In this work, protonation equilibria of NMDA and its derivatives are characterized at the macroscopic and microscopic levels. 1H NMR-pH and pH-potentiometric titrations were carried out to determine macroconstants that quantitate the association of hydrogen ions at the molecular level. Protonation of the three ionizing moieties takes place in a partly overlapping pH ranges. NMDA microconstants were obtained by appropriate combination of acidity and NMR parameters of the parent compound and its three synthetic derivatives. These derivatives were close models of the NMDA minor microspecies, allowing the calculation of all the 12 microconstants, the pH-dependent concentrations of the 8 microspecies, and 3 siteinteractivity parameters. Reliability of the microconstants was assessed by 3 independent test methods. pH-dependent distribution diagrams of the 8 NMDA microspecies allow the identification of the most populated ones. According to recent pharmacological studies, active species on the NMDA receptor are part of the major protonation pathway. Rotamer populations and rotamer-specific protonation microconstants of NMDA were also determined from 1H NMR vicinal coupling constants using Karplus-type equations. pHdependent distribution of rotamers with different protonation stages are calculated. Pharmacophore models resulted in distance values between atoms of the receptor-active conformer of NMDA. We have calculated all the possible distances between atoms of the rotamers by molecular mechanic calculations, and compared with the reported values. Excellent agreement was obtained in one of the gauche rotamers. A novel practical method for the synthesis of NMA (N-methyl-DL-aspartic acid) and new syntheses for NMA amid and ester derivatives are also described. Thin layer chromatography systems were developed to separate the important compounds as well. 5
1
BEVEZETÉS, CÉLKITŰZÉSEK A
biológiai
hatással
rendelkező
kismolekulák
fizikai-kémiai
paramétereinek
tanulmányozása igen széleskörűen felhasználható a gyógyszerkutatás valamennyi fázisában. Az experimentálisan meghatározott adatok lehetőséget szolgáltatnak a gyógyszerkémiai folyamatok kvantitatív leírására, valamint hozzájárulnak biológiai hatásaik és viselkedésük molekuláris és szubmolekuláris szinten történő értelmezéséhez. A farmakológiai hatásmechanizmusok vizsgálatában kitüntetett szerepe van a receptor-szubsztrát kölcsönhatásoknak. A biológiai válasz kiváltásához vagy blokkolásához egy adott receptoron számos feltételnek kell egyidejűleg teljesülni. A természetes ligandumok és modulátorok, exogén agonista, antagonista és allosztérikus hatásmódú vegyületek a receptor különböző, jól körülhatárolható régióival alakítanak ki specifikus kapcsolatokat. A specificitást az biztosítja, hogy a ligandum farmakofór csoportjainak típusa és térbeli elhelyezkedése megfelelő a kölcsönhatás kialakulásához a receptor kötőhely aminosav oldalláncaival. Tekintettel arra, hogy a kölcsönhatások típusa is pontosan meghatározott (hidrogén-kötés, ionos kötés, π-π kötés, n-π kötés, stb), a farmakofór csoportok tipizálása magába foglalja azok kémiai minőségén túl az ionizáltsági állapotukat is. A megfelelő molekularészletek komplementaritása tehát csoportspecifikus (szubmolekuláris) bázicitásadatok ismeretében eredményesebben tanulmányozható. A farmakofór modellek és receptor-ligand komplexek szilárd fázisú izolálása nagyon sok, alapvetően fontos információt szolgáltathat a megfelelő affinitású ligandummal szemben támasztható szükséges és elégséges feltételekről. In vivo körülmények között azonban a receptorfehérje-komplex és a ligandum kölcsönhatásában dinamikus egyensúlyi folyamatok játsszák a főszerepet. A farmakokinetikai vizsgálatok a molekulák sorsát követik nyomon a szervezetben. Egy vegyület fizikai-kémiai paramétereinek (logP, logK) ismerete hozzájárul olyan farmakokinetikai jellemzők értelmezéséhez és előrejelzéséhez, mint a szervezet különböző kompartmenjei közötti megoszlás, illetve a biológiai membránokon keresztüli transzportfolyamatok kinetikája. Nyilvánvaló például, hogy két bázikus csoportot tartalmazó molekulák ikerionos formái sokkal nehezebben jutnak át a membránok lipofil kettősrétegén, mint a semleges részecskék. A semleges / ikerionos (pH-tól független) részecskearány kiszámításához azonban csoport-specifikus bázicitási adatok szükségesek. Bizonyos analitikai meghatározási módszerek, így a kapilláris
6
elektroforézis és a fordított fázisú folyadékkromatográfiás eljárások tervezése szintén csoportspecifikus bázicitási adatokat igényelhet. A flexibilis kismolekulák végtelen számú konformációs állapotot vehetnek fel, és savbázis csoportjaik ionizáltsági állapota alapján is különböző protonáltsági állapotú, illetve egymással protonáltsági izomer viszonyban levő részecskék formájában vannak jelen, amennyiben egynél több (de)protonálható funkciós csoportot tartalmaznak. Ha egy vegyület logK makroszkopikus protonálódási állandóinak különbsége 3-nál kisebb, ezek az állandók nem rendelhetők közvetlenül csupán egy-egy ionizálódó centrumhoz. Hasonló bázicitású csoportok H+ -felvétele közös pH-tartományban játszódik le, ahol azonos HiL összegképletű, de különböző helyen protonált izomerek keletkeznek. Ezen mikrorészecskék eltérő fizikai-kémiai és spektrális tulajdonságokkal rendelkeznek, analitikailag azonban elválaszthatatlanok. Relatív és abszolút koncentrációjuk
csak
indirekt
úton
határozható
meg
(mikrospeciáció).
Képződésük
mikroszkopikus protonálódási állandókkal (logk) írható le, melyek egy kiválasztott funkciós csoport bázicitását a többi csoport adott protonáltsági állapotában jellemzik. A különböző részecskék egymásba történő átalakulásai pillanatszerűen lejátszódó folyamatok, a relatív részecske-koncentrációk (köztük a feltételezett aktív részecske koncentrációja) azonban kiszámíthatóak, amennyiben a külső körülmények (pH, ionerősség, dielektromos állandó, hőmérséklet), valamint az átalakulási folyamatokat jellemző termodinamikai állandók (logk) ismertek. Az említett egyensúlyi reakciók aktiválási energiája alacsony, ennek ellenére sokszor található összefüggés egy vegyület agonista vagy antagonista hatáserőssége, illetve az aktív részecske relatív koncentrációja között. Az ionizáltsági állapot mellett a funkciós csoportok térhelyzete is alapvetően befolyásolja a biológiai felismerést. A biológiailag aktív, receptor-ligandum kölcsönhatásokat kialakító kis molekulák
konformációs
szabadsági
fokuknak
megfelelően
többféle
potenciális
energiaminimumot képviselő konformerek formájában vannak jelen az extracelluláris közegben, vagy a modellként alkalmazott vizes oldatokban. A receptor és specifikus ligandja közötti molekuláris szintű kölcsönhatás megértésében fontos előrelépést jelent, ha ismerjük az ún. receptor-aktív konformációt. Célunk volt ezért az NMDA molekula rotamer eloszlásának meghatározása, valamint a rotemer-specifikus bázicitási paraméterek kiszámítása. Az oldatfázisban lejátszódó egyensúlyi folyamatok dinamikájának vizsgálatában a mágneses magrezonancia elvén alapuló különböző spektroszkópiás módszereknek (NMR, MRI)
7
kitüntetett szerepük van. Példaként említhetjük a molekulák oldalláncainak mozgékonyságáról információt szolgáltató T1 relaxációs idő méréseket, vagy a mag Overhauser effektus (NOE) nagyságának és előjelének függését a molekula egészének mozgékonyságától (így közvetve a molekulatömegtől). Az NMR spektrumok rendelkeznek továbbá egy olyan sajátsággal, hogy az oldatban végbemenő átalakulások kiindulási anyagai és termékei a reakciósebességi állandók függvényében különálló vagy közös jeleket adnak. A sav-bázis reakciók általában pillanatszerűen gyorsak az NMR kémiai eltolódás időskálán, ezért egy közös rezonanciajel figyelhető meg a részecskék egyedi kémiai eltolódásainak móltörtekkel súlyozott átlagánál. Ez a jelenség lehetővé teszi a részecskék móltörtjének NMR spektroszkópiás meghatározását, ami az NMR pHtitrálások egyik elvi alapját képezi. A kémiai eltolódás az elektronsűrűségre jellemző NMR paraméter, így értéke egy adott mag esetében változik a szomszédos csoportok protonáltsági állapotának függvényében. Az NMR magok kémiai eltolódásai általában nem azonos mértékben reagálnak a tőlük különböző távolságban elhelyezkedő protonálható csoportok ionizáltsági állapotának változására, ezért az NMR protonálódási állandó meghatározás a (részben) szelektív módszerek közé tartozik. Az eltérő protonáltsági állapotú, illetve különböző csoportokon protonált részecskék koncentrációjának, illetve móltörtjének a kiszámításához a csoportspecifikus bázicitási paraméterek meghatározása szükséges. Ezek kísérleti mérése közvetlenül ritkán lehetséges (pl. 100 % szelektivitással rendelkező NMR mag vagy UV kromofór esetén), általában különböző titrimetriás módszerek kombinációjára (pH-potenciometria / UV pH-titrálás, pH-potenciometria / NMR pH-titrálás) vagy rokon szerkezetű, redukált számú protonálható csoportot tartalmazó származék vegyületek protonálódási állandóinak felhasználására van szükség (deduktív módszer). A módszerek magukban foglalják a mérési adatok feldolgozását, ami a megszokott nem-lineáris paraméterillesztéseken kívül algebrai egyenletrendszerek megoldását jelenti. A lehetséges konformációs állapotok közül az energetikailag kedvezményezett nyitott állású konformerek relatív koncentrációjának (populációinak) meghatározására oldat fázisban szintén az NMR spektroszkópiás módszerek a legalkalmasabbak. Ebből a szempontból az egyik legfontosabb NMR paraméter a spin-spin csatolási állandó, aminek értéke nagymértékben függ a csatoló magok között mérhető, a konformáció jellemzésére szolgáló diéderes szögtől. Doktori
munkámban
az
NMDA
(N-metil-D-aszparaginsav)
molekula
sav-bázis
tulajdonságainak meghatározását tűztük ki célul makroszkopikus és mikroszkopikus szinten. A
8
makroállandók meghatározását 1H NMR pH-titrálással és pH-potenciometriával végeztük. A savbázis folyamatok és konformációs egyensúlyok vizsgálatát akirális környezetnek tekinthető vizes oldatokban végeztük, ezért a kísérletekben az NMDA racém formáját, az N-metil-DLaszparaginsavat
(NMA)
használtuk,
következtetéseink
azonban
érvényesek
mindkét
enantiomerre, így az NMDA-ra is. Az NMDA molekula csoport-specifikus bázicitásainak meghatározásához szükség volt redukált
számú
protonálható
csoportot
tartalmazó
származékvegyületek
protonálódási
állandóinak meghatározására. Ezért célul tűztük ki az NMA amid, illetve észter származékainak előállítását. Ez részben megoldható volt irodalmi módszerek továbbfejlesztésével, részben azonban új reakcióutak feltérképezését igényelte. A preparatív eljárások egy részében a kiindulási anyag az NMA, ezért kidolgoztuk gazdaságos és egyszerűen elvégezhető preparatív előállítását. Célunk volt továbbá a közti- és végtermékek kromatográfiás elválasztásához és detektálásához megfelelő rendszerek kidolgozása, valamint spektroszkópiás és kromatográfiás paramétereinek meghatározása. Az NMDA molekula az ionotróp glutaminsav receptorok egyik altípusának szelektív és névadó agonista liganduma a központi idegrendszerben, ezért farmakológiai kísérletek fontos teszt és referencia vegyülete. Az emberi szervezetben eddig még nem sikerült a jelenlétét természetes körülmények között kimutatni, megtalálható viszont bizonyos emlősfajok központi idegrendszerében, ahol nem neurotranszmitterként, hanem helyi hormonként tölt be fiziológiás funkciót. A glutaminsav a központi idegrendszer legjelentősebb excitatorikus ingerületátvivő anyaga, az NMDA receptorokon keresztül kifejtett hatása számos fiziológiás és patológiás folyamatért felelős. A napjainkig publikált nagyszámú NMDA agonista és kompetitív antagonista vegyület csoport specifikus bázicitásáról nem található irodalmi adat, az NMDA molekula protonálódási állandóira pedig még közelítő értékeket sem határoztak meg. Ennek oka feltehetően a három funkciós csoport közelsége, és a molekula kis méretéből adódó kompakt elektronszerkezet, ami megnehezíti csoport-szelektív meghatározási módszerek alkalmazását. Mikroegyensúlyok analízisére egyrészt akkor van szükség, ha az átfedő pH tartományban protonálódó csoportok bázicitásának különbsége nem nagy, ezért a protonáltsági izomerek mérhető koncentrációval rendelkeznek. Másrészt az extrém alacsony koncentrációban előforduló mikrorészecskék is rendelkezhetnek adott esetben aktivitással, például biológiai folyamatokban.
9
Az NMDA-ra mindkét megállapítás vonatkozhat, célul tűztük ki tehát a mikroegyensúlyok teljes körű leírását. A sav bázis folyamatokat a dolgozatban egységesen protonálódási állandókkal (K, logK, k, logk) jellemezzük. Amennyiben egy irodalmi hivatkozás eltérő paramétereket (pKa, pKb, stb) tartalmaz, az adatokat mindig protonálódási állandókra átszámolva mutatjuk be. A k az alternatív protonálódási útvonalakra jellemző termodinamikai mikroállandókat jelöli (nem tévesztendő össze a reakciósebességet jelölő kinetikai állandóval). Az NMDA és származékainak elnevezésekor az aminosav-származékok szakirodalmában legelterjedtebb nomenklatúrát használtuk. Ez adott esetben eltér az általános preparatív előiratok szabályos nevezéktanától, vagy a IUPAC előírásaitól, azonban megkönnyíti a származékok szerkezeti rokonságának illetve eltéréseinek gyors áttekintését. Az irodalmi bevezetőben idézett vegyületek szisztematikus elnevezésük helyett a farmakológiai szakirodalomban általánosan elterjedt neveikkel szerepelnek a könnyebb beazonosíthatóság érdekében.
10
2
IRODALMI ÁTTEKINTÉS
2.1
Az NMDA molekula és az NMDA receptorok jelentősége Az utóbbi évek kutatási eredményei szerint az NMDA molekula emlősök (patkány)
központi idegrendszerében megtalálható, lokális hormonhatást kifejtő endogén molekula [Seleni és mtsai 2000], in vitro kísérletekben pedig évtizedek óta használt farmakológiai tesztanyag. Az NMDA a központi idegrendszer egyik ionotróp glutaminsav alreceptorának glutamát kötőhelyén agonista hatást kifejtve képes az excitatorikus neurotranszmitter glutamátot helyettesíteni, mint nem-specifikus, de szelektív ligandum. 2.1.1 Az glutaminsav receptorok osztályozása és az ionotróp altípusok összehasonlítása A központi idegrendszer fő excitatorikus neurotranszmittere a glutaminsav, receptorai gyakorlatilag minden agyi és gerincvelői neuronon megtalálhatóak [Madsen és mtsai 2005]. Az excitátoros glutaminsav receptorok két fő típusát különböztetjük meg. Az ionotróp receptorok (iGluRs) (transzmembrán proteinek) nátrium és/vagy kalcium, illetve kálium membráncsatornák is egyben; a metabotróp receptorok G fehérjéken keresztül fejtik ki aktivitásukat. A metabotróp receptor (mGluRs) családot három főbb csoportra osztják. Az I csoport (mGluR1, mGluR5) esetén a foszfolipáz C aktivizálódik, míg a II és III csoport tagjai (mGluR2,3, mGluR4,6-8) a cAMP szintézis gátlásán keresztül fejtik ki biológiai hatásukat. Az altípusokat szekvenciális hasonlóság, valamint agonista szelektivitás alapján különböztetik meg. Az ionotróp receptorok három altípusba sorolhatók, ezek közé az N-metil-Daszparaginsav (NMDA), valamint a nem-NMDA receptorok tartoznak. Ez utóbbiakon belül AMPA
(alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-izoxazolpropionsav)
illetve
KAINÁT
altípusokat
különböztetünk meg (2.1. ábra). Az AMPA receptorok jelölése GluR1-4, míg a GluR5-7 receptorokat, valamint a KA1 és KA2 receptorokat a KAINÁT receptorok közé sorolják [Madsen és mtsai 2005].
11
O
O
O
HO O
NH2
NH
Glu
NMDA
2.1. ábra
O
OH
OH HO
HO
OH
O
HO
NH2 AMPA
N O
HO
N H O Kainát (kaininsav)
A glutaminsav (Glu), és az ionotróp glutaminsav receptor altípusok névadó agonistáinak szerkezete
Az AMPA és Kainát receptorok nátrium és kálium ioncsatornák szabályozásával fejtik ki biológiai hatásukat, aktivációjuk valamint deszenzibilizálódásuk egyaránt gyors (1-14 msec) [Michaelis 1998]. Az NMDA receptor ioncsatornák reagálása a glutaminsavra viszonylag lassabban következik be, viszont nagyfokú kalciumion permeábilitással és vezetőképességgel rendelkeznek. A lassabb receptorválasz elsődleges oka a receptor környezetében jelen levő magnéziumionok tónusos gátlása. A glutaminsavnak az NMDA receptorok kötőhelyén nagyobb az affinitása, mint a KA vagy AMPA receptorokon, ezért a neuronok felszínén általában találhatóak részlegesen aktivált állapotú NMDA receptorok, amelyek növelik a neuron érzékenységét a beérkező excitátoros ingerekre az AMPA / KA receptorokon. Az NMDA receptorok teljes aktivitása viszont csak a feszültség-függő Mg2+ blokád megszűnésekor következhet be, amit elősegít az AMPA /KA receptorok által kiváltott depolarizáció (lásd 2.1.3 fejezet) [Michaelis 1998]. 2.1.2 Az NMDA receptor élettani és kórélettani jelentősége A központi idegrendszer glutaminsav által közvetített neurotranszmissziójában az NMDA receptorok kulcsszerepet játszanak [Chen és Lipton 2006; Madsen és mtsai 2005]. Az egyedfejlődés bizonyos fázisaiban közreműködnek az idegrendszer kifejlődésében és az idegsejtek migrációjában, elengedhetetlenek az egészséges idegsejtek szinaptikus plaszticitásának kialakításában és fenntartásában, valamint a tanulási mechanizmusok (elsősorban a hosszú távú memória) működésében szerepet játszó celluláris, elektrofiziológiás folyamatokban (pl. LTP, long-term potentiation [Michaelis 1998; Chen és Lipton 2006; Robbins és Murphy 2006]).
12
A neurodegeneratív betegségek egy jelentős csoportja valamilyen módon kapcsolatba hozható a glutaminsav, mint neurotranszmitter kórosan magas központi-idegrendszeri koncentrációjával, és az általa okozott, elsősorban NMDA receptorokon keresztül kifejtett neurotoxicitással [Chen és Lipton 2006]. Az Alzheimer kór, a Parkinson kór, a Huntington betegség, a HIV vírus okozta dementia, bizonyos izomsorvadásos betegségek (ALS, amyotrophiás lateral sclerosis), a schizofrénia és glaukóma bizonyos fajtái jelentősen eltérő patomechanizmussal rendelkeznek. A különböző kiváltó okok és folyamatok ellenére, az idegsejtek károsodásában és pusztulásában a végső kiváltó ok az NMDA receptorokon keresztül a sejtekbe áramlott kalciumionok kórosan magas koncentrációja, és az ennek hatására beinduló (pato)biokémiai folyamatok. Az olyan akut rendellenességek, mint pl. agyvérzés, gerincvelő és agysérülés következtében fellépő ischemia [Kemp és McKernan 2002] neurotoxikus hatásáért ugyancsak az NMDA receptorok tehetők elsősorban felelőssé. A Parkinson kór és a Huntington betegség a neuronok excitotoxikus hatásokkal szembeni megnövekedett érzékenységével jár, míg az epilepszia és az akut traumák esetében a glutaminsav koncentráció emelkedik meg a neuronok környezetében. Az NMDA receptorokat gátló hatóanyagok kifejlesztésével a fenti kórfolyamatok neurodegenerativ elváltozásai feltehetően megállíthatóak ill. csökkenthetőek. A kórosan hiperaktív NMDA receptorokat blokkoló szerek lehetséges támadáspontja négy nagyobb csoportra osztható: •
az NMDA (glutaminsav) kötőhely (lásd 2.1.5 fejezet)
•
a glicin kötőhely
•
az ioncsatorna pórusa
•
allosztérikus modulátor régiók (redoxpotenciál érzékeny felület, pH érzékeny régió, nagy affinitású Zn2+ kötőhely, poliamin kötőhely).
Az NMDA antagonisták terápiás felhasználásának korlátot szab az alkalmazott vegyületeknek a fiziológiás, NMDA receptor-mediált központi idegrendszeri szinapszisokat blokkoló hatása. Ennek következtében ígéretes szerek gyógyszerré válása hiúsulhat meg a klinikai vizsgálatokon fellépő igen súlyos mellékhatások miatt. Ezek közé tartoznak a pszichotomimetikus hatások, idegsejt vakuolizációs folyamatok, valamint tanulási és memória zavarok. [Madsen és mtsai 2005] Előrelépést jelenthetnek az altípus- és alegység-szelektív antagonisták. Jó példa az ifenprodil, ami egyrészt NR2B alegység-szelektív (a neurodegeneratív folyamatokért elsősorban az NR2B alegységet teszik felelőssé [Gogas 2006]), másrészt csak a folyamatosan aktív
13
receptorokhoz kapcsolódik reverzibilis módon, tehát az aktivitás csökkenésekor képes disszociálni a receptorról [Kemp és McKernan 2002]. Meg kell említenünk, hogy bizonyos kórképekben (schizofrénia, kognitív zavarok) az NMDA agonistáknak lehet terápiás felhasználási lehetősége [Kemp és McKernan 2002]. 2.1.3 Az NMDA receptor felépítése és ioncsatorna aktivitásának szabályozása Az iGluRs receptor-csatorna komplexek négy polipeptid alegységből álló úgynevezett homo- vagy heterotetramerek. Négy NMDAR1 alegységből felépülő homotetramer az NMDA receptor-csatorna komplex minden karakterisztikus tulajdonságával rendelkezik, így a glutaminsav és az NMDA egyaránt képes aktiválni, NMDA antagonistákkal gátolhatók, és glicin is szükséges a teljes aktiválódáshoz. [Michaelis 1998] In vitro receptor-kötődés vizsgálatokban legtöbbször a Xenopus Laevis (sima karmosbéka) petesejtjeinek felszínén tanulmányozzák a rekombináns géntechnológiával előállított NMDA receptorokat. Működőképes glutaminsav receptorként azonban csak az említett békafaj petesejtjeinek felszínén működnek a homotetramerek, emlős sejteken a fiziológiás funkciókhoz szükség van egy vagy több NR2 alegységre [Dingledine 1999]. Az NMDAR2A-D alegységeknek csatorna aktivitása nincs, de befolyásolják a heteromer receptor komplex aktivitását, illetve érzékenységét glicinnel, kompetitív antagonistákkal, valamint a magnézium ionok gátlásával szemben [Michaelis 1998]. A heterotetramer receptor komplexben a két NMDAR1 alegység felelős a glicin, míg a két NMDAR2A-D alegység a glutaminsav kötődésért [Chen és Wyllie 2006]. Bizonyos receptorok tartalmazhatnak NR3A,B alegységeket is [Chen és Lipton 2006]. Az NMDA receptor-ionofór komplex, amely különböző szabályozó egységeket tartalmaz. [Dingledine 1999] Található rajta egyrészt akceptor kötőhely glutamát agonisták és antagonisták számára, valamint sztrichnin-érzéketlen koagonista glicin kötőhely. A feszültség-független modulátorok közül a legfontosabbak: a poliamin kötőhely, egy pH érzékeny H+ kötőhely, egy fenciklidin (PCP) kötőhely és egy redox felület, ami cisztein oldalláncként tiol csoportokat tartalmaz és az extracelluláris környezet redoxpotenciál értékére érzékeny (2.1. táblázat). A Mg2+ tónusos gátlása membránpotenciál függő, a cink ionok hatására fellépő inhibíció viszont történhet feszültség függő és feszültség független mechanizmus szerint is. Megjegyzendő még a poliaminok (pl. spermin) hatásáról is, hogy kis (fiziológiás) koncentrációban tapasztalható
14
aktiváló hatás magasabb koncentrációk esetén feszültség-függő gátlásba csap át [Madsen és mtsai 2005]. 2.1. táblázat
Az NMDA receptorok feszültség-független modulátorai [Dingledine 1999]
Modulátor
hatás
EC50
Maximális hatás
Dinorfin
Inhibitor
0.3 μM
100%
Ozmózisnyomás
Inhibitor
75%
Oxidálószerek
Inhibitor
70%
Proton
Inhibitor
50–200 nM
100%
Cink
Inhibitor
0.2–2 μM
100–80%
Arachidonsav
potencíroz
10 μM
2-szeres
PACAPg
potencíroz
<1 μM
3- szoros
Poliaminok,
potencíroz
100 μM
2- szeres
hisztamin
potencíroz
Redukálószerek
potencíroz
3- szoros
A hidrogén-ionok, mint allosztérikus modulátorok fiziológiás pH-n 50%-os tónikus inhibítor hatással rendelkeznek az NMDA receptorokon [Low és mtsai 2003]. A pH kis mértékű eltolódása savas irányba neuroprotektív hatású, mivel képes teljes mértékben gátolni a receptor aktivitást, bázikus eltolódás pedig a receptor-ioncsatorna működését fokozza. Bizonyos allosztérikus modulátorok (Zn2+, poliaminok) is a receptor H+ érzékeny régióinak logK értékét módosítva fejtik ki hatásukat. Pontmutációkat szenvedett NR1 alegységekben behatárolták a protonok koncentrációjára érzékeny régiókat (2.2. ábra, piros részek), az NR2A alegységekben azonosították a protonok koncentrációjára közvetlenül érzékeny, ionizálható aminosavoldalláncokat (pl. Tyr645, Asp815). A protonálódás hatására megváltozik az érintett oldalláncok hidrogénkötésre, illetve ionos kölcsönhatásra való képessége, ami konformációs változásokon keresztül a receptor aktivitás változását eredményezi. Noha a protonok IC50 értéke pH 7.0, azaz 100nM (a hivatkozott közlemény szerint IC50 az a hidrogénion koncentráció, amely 50%-ban gátolja a glutaminsav és glicin együttes jelenlétével kiváltható maximális receptorválaszt), ilyen logK érték specifikusan nem rendelhető hozzá a H+ – receptor kölcsönhatásért felelős egyik
15
aminosav-oldallánchoz sem. A folyamatot tehát több aminosav protonáltsági állapotának változása, illetve kölcsönhatásaik együttesen szabályozzák.
2.2. ábra
Az NMDA receptor NR1 ATD alegységén piros szín jelöli azokat a régiókat, amelyek mutációi a receptor-komplex hidrogén-ion érzékenységét közvetlenül befolyásolják [Low és mtsai 2003].
2.1.4 Az NMDA receptor működése, illetve az általa kifejtett neurotoxicitás molekuláris mechanizmusa A neurotranszmisszió közvetítése során az ionotróp receptor komplexek aktiválódása figyelhető meg, amely Ca2+, K+ és Na+ beáramlást eredményez a sejtbe, és ez a membrándepolarizáció váltja ki a normális sejtválaszt. Egészséges körülmények között azonban a magnézium-ionok által kifejtett tónusos gátlás következtében a receptor aktivitás, és így a Ca2+ beáramlás nem haladja meg a maximális receptorválasz 50 %-át. Betegségek és traumák következtében azonban a sérült vagy elpusztuló glutaminerg neuronokból nagy mennyiségben felszabaduló glutaminsav hatására az AMPA /KA receptorok aktivációja, valamint az NMDA receptorok folyamatos ingerlése követeztében a neuron membránja depolarizálódik. Ennek hatására a Mg2+ által fenntartott, feszültség-függő blokád megszűnik, ami az NMDA receptor ioncsatorna maximális aktivitását eredményezi. [Chen és Lipton 2006] Mivel az NMDA receptor rendelkezik a legjobb Ca2+ vezetőképességgel és akár több száz milliszekundumig nyitva
16
maradhat, az intracelluláris Ca2+ koncentráció sokszorosára emelkedik. A kórosan magas kalciumion koncentráció számos biokémiai mechanizmus elindítója. A mitokondriumok oxidatív anyagcseréje fokozódik és szabadgyökök képződnek, fehérjebontó kaszpáz enzimek és a Ca2+ függő nitrogénoxid szintetáz aktiválódnak, valamint apoptózis indukáló faktorok szabadulnak fel. A megnövekedett NO koncentráció toxikus peroxinitrit (ONOO-) keletkezéséhez vezet, ami egy kóros enzim, az 5-nitrozil-glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz szintézisét indukálja. Szintén a magas Ca2+ szint tehető felelőssé a mitogénaktivált proteinkináz p38 (MAPKp38) stimulációjáért. Az enzim hatására transzkripciós faktorok aktiválódnak és a sejtmagba jutva neuronkárosodást, illetve apoptózist okoznak. A fenti folyamatok következtében a sérült neuronokból felszabadult glutaminsav a környező idegsejteket károsítja, illetve programozott sejthalálukat idézi elő. 2.1.5 A glutaminsav kötőhelyen ható agonisták és kompetitív antagonisták receptorkötődésének és aktivitásának szerkezet-hatás összefüggései Tekintettel arra, hogy jelen dolgozat az NMDA molekula sajátságaival foglalkozik, az NMDA receptor működését befolyásoló vegyületek közül csak azokkal foglalkozunk, amelyek azonos támadásponton hatnak, mint az NMDA, tehát az NR2 alegységek glutaminsav-kötő helyén. A glutaminsav receptorok agonistáit általában jellemzi egy bázikus és két savas funkciós csoport [Madsen és mtsai 2005]. A bázikus nitrogén és az egyik savas csoport α helyzetű, míg az ω savas funkció távolsága az alfa savtól 3-6 szénatom kell hogy legyen. A nem szelektív glutamát agonisták nem tartalmaznak egyéb funkciós csoportokat, jellemzi őket az Lkonfiguráció és a nagy konformációs szabadságból eredő flexibiltás. Az NMDA altípus szelektivitás elérhető: •
kiegészítő funkciós csoportokkal, oldalláncokkal (N-metil csoport az NMDAban);
•
az α és ω savas csoport távolságának csökkentésével az AMPA és KA agonistákhoz képest (2.3. ábra). Ez megvalósítható egyrészt rövidebb szénlánccal (NMDA, L-aszparaginsav [Lunn és mtsai 1992], tetrazolil-glicin, R-AMAA, 2.3. ábra), másrészt olyan konformációs rigiditást biztosító szerkezeti elemekkel,
17
amelyek a térbeli távolságot a két savas funkciós csoport között lecsökkentik (iboténsav, (1R,3R-ACPD, 2S,3R,4S-CCG, transz-ACBD); •
a D konfigurációval (NMDA);
•
az ω savas csoport bioizoszter helyettesítésével pl. tetrazol gyűrűre (tetrazolilglicin), illetve 3-izoxazolol gyűrűre (iboténsav, R-AMAA 2.3. ábra)
O
OH
O OH
HO
HO
NH2 O
iboténsav O OH
1R,3R-ACPD 2.3. ábra
N
NH2
OH
N O R-AMAA O
O
HO
OH
NH2 H N O N N N tetrazolil-glicin O
HO
O
NH2
L-aszparaginsav O O HO H2N
O
HO
HO
OH NH2
NH2 2S,3R,4S-CCG
trans-ACBD
Néhány jellemző NMDA agonista vegyület
Az NMDA receptor glutaminsav kötőhelyének feltérképezésében fordulópontot jelentett az NR2A alegység agonistákkal együtt történő kikristályosítása [Chen és Wyllie 2006]. Sikerült a Glu kötő zsebet felépítő, a ligandummal közvetlen kapcsolatot kialakító, vagy a kötődésben közvetett szerepet játszó aminosavak azonosítása, illetve pontos térbeli helyzetének meghatározása. Érdekes megfigyelés, hogy a glutaminsav protonált α-ammónium-csoportja nem közvetlenül kapcsolódik a negatív töltésű Asp731 és Glu413 oldalláncához, hanem a Tyr761, illetve egy vízmolekula közvetítésével (2.4. ábra). Az ammónium csoportot ezen kívül a Ser511, illetve a Thr513 hidroxilcsoportjai veszik körül (feltehetően hidrogén-kötéssel). Az α-karboxilát csoport „lehorgonyzásában” az Arg493 pozitív töltésű oldallánca a főszereplő. A γ-karboxil(át)csoport rögzítéséért felelős aminosav-oldalláncok hidroxil-csoportokat tartalmaznak (Ser689, Thr690, Tyr730), pozitív töltést viszont nem, a γ-karboxil(át) ionizáltsága tehát nem esszenciális a kötődéshez.
18
2.4. ábra
A glutaminsav kötődése az NMDA receptor ligandumkötő helyéhez két nézőpontból [Chen és Wyllie 2006]
A glutamát receptorok szelektivitásának molekuláris tényezői között az egyik kulcsfontosságú szerkezeti elem az NMDA receptor Asp731 oldallánca, ami lehetővé teszi az NMDA molekula N-metil csoportjának illeszkedését a zsebbe (2.5. ábra). A GluR2 AMPA receptorban a ligandumkötő zseb megfelelő helyzetében a Glu705 aminosav található, ami hosszabb oldalláncának következtében ütközne az N-metil-csoporttal. Az AMPA receptorok kötőhelyének „bejáratában” található továbbá egy metionin oldallánc (Met708), ami elzárja az „utat” az NMDA molekula elől (sztérikus gátlás), az NMDA receptorokban a metionint helyettesítő valin (Val715) oldallánca nem nyúlik be olyan mértékben a hidrofil zsebbe. A feltételezést alátámasztja, hogy a pontmutációt szenvedett NMDA receptorral szemben, amelyben a valin helyén metionin található, az NMDA molekula affinitása drasztikusan lecsökken. A kötődés következményeként fellépő konformációs változások, amelyek a receptor aktivációjához vezetnek, még nem teljesen ismertek. Tanulmányozták viszont a kompetitív NMDA antagonista AP5 (2.6. ábra) kötődését a receptorhoz [Chen és Wyllie 2006]. Az αkarboxilát, illetve ammónium csoportok ugyanazokat a kötőhelyeket foglalják el, mint glutaminsav esetén. Az ω-foszfonsav csoport viszont két lizin oldallánccal (Lys459, Lys462) létesít ionos kapcsolatot az NR2B alegységben. A harmadik kapcsolódási pont különbsége okozhatja az eltérő receptorválaszt az agonisták és kompetitív antagonisták között.
19
2.5. ábra
Az NMDA molekula szelektivitását biztosító metionin oldallánc az NMDA
receptoron [Chen és Wyllie 2006] Az NMDA receptor glutaminsav kötő helyén ható kompetitív NMDA antagonistákban a disztális savas funkciót legtöbbször foszfonsav (R-AP5, R-AP7) csoporttal helyettesítik (2.6. ábra) [Madsen és mtsai 2005]. Az α és ω savas csoport távolsága 1-3 kötéssel hosszabb mint a glutaminsavban. Az antagonista affinitás növelhető a konformációs mozgás gátlásával. Ennek megvalósítása történhet kettős kötés (CGP39653, CGP39551), különböző monociklusos (CGS19755, R-CPP, NPC17742), illetve biciklusos (LY235959) szerkezeti elemek beépítésével (2.6. ábra). Kedvezőbb farmakokinetikai tulajdonságokkal (jobb biohasznosíthatóság, könnyebb átjutás a véragy-gáton) rendelkezik a CGP39551 észterszármazék, az ω helyzetben tetrazol gyűrűt tartalmazó LY233053 molekula, valamint a fenilalanin-származékok (SDZ-220-581 lásd 2.6. ábra). Kvalitatív szerkezet-hatás összefüggés vizsgálatok eredményei szerint kompetitív antagonista aktivitás érhető el, amennyiben a proximális nitrogén tartalmú illetve anionos, valamint a disztális, hidrogénhíd kialakításra képes csoportok mellett további két, nagyobb térkitöltésű illetve hidrofób régiót is beépítenek a szerkezetbe [Catarzi és mtsai 2006]. Az utóbbi csoportok biztosítják, hogy a receptor-ligandum kapcsolat kialakulása után a receptor aktivációjához szükséges konformációs elmozdulás ne mehessen végbe (2.7. ábra).
20
O
O
OH OH HO P O
HO NH2
NH2
OH OH P O
HO NH2
O
OH OH P O
O NH2
HN
R-CPP N
HO HN
CGP39551
R-AP7 H
OH OH P O
HN
N N N H LY233053
O
HO
OH OH P O
N
O
O
O
OH OH HO P O
CGS19755
CGP39653
R-AP5
O
O OH OH P HO O HN
OH HO P O
HO
OH OH P O
O
OH
H2N
Cl
H SDZ-220-581
NPC17742
LY235959 O
HO HN
OH OH P O
O OH
HO HN
LY257883
O
LY221501
2.6. ábra
Jellegzetes NMDA kompetitív antagonisták.
2.7. ábra
Kvalitatív Gly/NMDA receptor kompetitív antagonista modell [Catarzi és mtsai 2006]
21
2.2
Protonálódási állandók jelentősége és meghatározási módjai A makroszkopikus protonálódási állandók (K, logK) molekuláris szinten jellemzik a
protonálódási egyensúlyokat, ismeretük lehetővé teszi a vegyület pH függő protonáltsági állapotának és bruttó töltésének kiszámítását. A K állandókat egy molekulán belül értékeik szerinti csökkenő sorrendben számozzuk. Az aszparaginsavban például logK1= 9.53, logK2= 3.65, logK3=1.96 [Noszál és Sándor 1989]. A molekulák funkciós csoportjainak protonálódási folyamatai gyakran átfedő pH tartományokban mennek végbe. A felvett protonok megoszlását a funkciós csoportok között, tehát a csoportspecifikus sav-bázis tulajdonságokat mikroszkopikus (szubmolekuláris) szinten jellemzik a protonálódási mikroállandónak (k, logk) nevezett fizikaikémiai paraméterek (részleteket lásd a 4.4. fejezetben). A farmakológiai témájú szakirodalomban az experimentálisan meghatározott makroállandókat gyakran közvetlenül hozzárendelik egy adott bázikus vagy savas csoporthoz, a 2.2.1. fejezetben bemutatott logK2 makroállandókat például a hivatkozott irodalmi források a vegyületek disztális (γ) sav-funkciójához rendelik. Ez a közelítés kisebb-nagyobb hibaforrást jelent attól függően, hogy mekkora a molekula logK értékeinek különbsége. 2.2.1 Sav-bázis paraméterek néhány gyakorlati alkalmazása a glutaminsav receptorok ligandumai körében A molekulák különböző protonáltsági állapotú részecskéinek relatív koncentrációit, illetve protonáltsági állandóit a farmakokinetikai területen széleskörűen alkalmazzák [Matzen és mtsai 1997]. A glutaminsav receptorokkal kapcsolatos kutatások során kiderült, hogy bizonyos AMPA receptor agonisták in vitro, valamint in vivo szubkután alkalmazását követően a mérhető aktivitás értékek között jelentős különbségek tapasztalhatóak. Az AMPA, ATPA, valamint HIBO vegyületek (2.8. ábra) 3-izoxazolol gyűrűjében az oxigén atomot kénre cserélve a nyert 3izotiazolol származékokban (tio-AMPA, tio-ATPA, valamint tio-HIBO, 2.8. ábra) a hidroxilcsoport logK2 értéke a várakozásoknak megfelelően 1.5-2 értékkel csökken [Matzen és mtsai 1997] (2.8. ábra). A logK értékeket NMR pH-titrálással határozták meg, a metilén és metin szénatomok kémiai eltolódásait követték a pH függvényében. Mivel egyik NMR mag sem volt szelektív, az illesztett egyenletből a makroszkopikus protonálódási állandókat határozták meg. In
22
vitro kísérletek adatai szerint a tio származékok az AMPA receptoron általában hasonló vagy alacsonyabb hatékonyságúak, mint a megfelelő izoxazolol vegyületek. Szubkután alkalmazást követően viszont az izotiazolol vázas molekulák bizonyultak szignifikánsan hatékonyabbnak. A jelenség magyarázatához a különböző bruttó töltésű molekulák móltörtjeit a pH függvényében ábrázolták, illetve fiziológiás pH viszonyokra kiszámították. pH 7.4-nél a tio származékok kétszeresen protonált, nulla össz-töltésű ikerionos részecskéi számottevő mértékben (0.16-0.28 %) jelen vannak, míg az izoxazolol vegyületek ikerionos részecskéinek móltörtje mindig 0.01 % alatt marad. Feltételezték, hogy a vér-agy gáton való átjutás szempontjából a leginkább kedvezményezett, nulla össztöltésű részecskék magasabb relatív koncentrációja felelős a tapasztalt hatékonyságbeli különbségekért. Ennek igazolására, az egyéb szerkezeti különbségek hatásának kizárására összehasonlították a Br-HIBO vegyületet és tiazolol származékát (tio-BrHIBO, 2.8. ábra). Fiziológiás pH tartományban mindkét molekula negatív töltésű részecskék formájában van jelen, a semleges forma aránya mindkét esetben 0.01 % alatt marad, tekintettel az alacsony logK2 értékekre. Ennek megfelelően a szubkután alkalmazást követően sem tapasztalható a tio vegyület nagyobb hatékonysága [Matzen és mtsai 1997]. Kiegészítésként elmondható, hogy a vér-agy gáton a semleges részecskék juthatnak át legkönnyebben, ezek móltörtjeinek kiszámításához, illetve az ikerionos / semleges részecske arány meghatározásához csoport-specifikus bázicitási adatok lennének szükségesek. A részecskespecifikus paraméterek nem csak farmakokinetikai, hanem farmakodinámiás vizsgálatokban is alkalmazhatóak a glutaminsav receptorok körében. Sikerült összefüggést kimutatni néhány AMPA receptor agonista hatékonysága (efficacy) és az ω helyzetű savas funkciós csoport logK értékei között [Wahl és mtsai 1996]. A 3-hidroxi-izoxazol molekularészlet hidroxilcsoportjához az AMPA-ban 4.8, míg az 5-HPCA-ban 4.7 logK2 érték tartozik (2.8. ábra). A trifluorometil-AMPA-t logK 3.4, az ACPA disztális karboxilcsopotját a legsavasabb, 2.2-es logK jellemzi. A receptorválasz kiváltásában mutatott hatékonyság sorrendje szintén ACPA > Tri-FAMPA> AMPA > 5-HPCA. Megjegyzendő, hogy a logK 2.2 és 3.4 értékek közel esnek az α-karboxil csoport protonálódási állandójához (logK= 2.5), így ezekben az esetekben az ωkarboxilátra jellemző logk pontos kiszámításához mikroszkopikus analízisre lenne szükség. További megjegyzés, hogy az itt közölt adatok eltérnek a korábban említett irodalmi logK értékektől, amit a mérési körülmények, elsősorban az alkalmazott ionerősség (0.15 M [Wahl és mtsai 1996; Madsen és mtsai 1986], 1 M [Matzen és mtsai 1997]) különbsége okoz.
23
HO
HO
N O
NH2
OH
O
OH
O
NH2
HO
N S
NH2
HO
tio-AMPA logK2=7.00 O
NH2
N O
5-HPCA logK2= 4.7
2.8. ábra
S
S
HO
N
NH2
NH2
Br
OH
tio-HIBO logK2=6.69
N O
N OH
tio-Br-HIBO logK2=5.35
O
OH
NH2
Br-HIBO logK2=3.49 O
HO
HO
N OH
Br
HIBO logK2=5.07
O
OH
NH2 OH
O
N S
O
HO
N
NH2
tio-ATPA logK2=7.03
HO HN
O
HO
OH
O
OH
N O
ATPA logK2=4.76
AMPA logK2=5.12 O
O
O
O
OH
HO
CF3 trifluorometil-AMPA logK2= 3.4
NH2
N O
ACPA logK2= 2.2
Néhány AMPA receptor agonista logK értéke.
Néhány AMPA agonistára jellemző heterociklusos gyűrűrendszer hidroxilcsoportjának protonálódási állandóit ab initio, illetve szemiempirikus módszerekkel számították, majd összevetették az azonos, vagy hasonló molekularészletet tartalmazó vegyületek experimentálisan mért, irodalmi logK értékeivel [Greenwood és mtsai 1998]. A receptor-ligand kölcsönhatásának szerkezet-hatás összefüggéseit vizsgálva feltételezték, hogy az AMPA receptor ligandumok mindhárom funkciós csoportja ionizált állapotban van a kötődés kialakulásakor. A modell szerint az AMPA agonisták hidroxil csoportot hordozó heterociklusa bioizoszter viszonyban van a glutaminsav γ-karboxil-csoportjával. A 2.9. ábra első öt csoportjára (ismert AMPA agonisták ωhelyzetű savas csoportjait modellező heterociklusok) jellemző, hogy logK értékeik következtében fiziológiás pH tartományban mindig számottevő koncentráció jellemzi az ionizált formát. A willardiine gyűrűjének protonálódási állandójára a metil-uracil logK értékéből következtettek. A willardiine (R=H) logKω értékéből következik az ionizált forma alacsony (0.01 %>) koncentrációja extracelluláris viszonyok között, (feltehetően) ezért nem mutat számottevő AMPA receptor aktivitást. Az elektronszívó csoportokkal szubsztituált származékok (R=F, Cl, NO2, CN,
24
CF3), a logKω értékek csökkenése következtében viszont hatékonyak az AMPA receptoron. Általánosan levonható a következtetés, hogy a receptor-affinitást mutató vegyületek logKω értéke 4 és 8 közé esik [Greenwood és mtsai 1998]. (Korábban említett irodalmi adatok szerint a logKω< 4 vegyületek is aktívak [Conti és mtsai 1999; Wahl és mtsai 1996].) A logK adatok szemi-empírikus, illetve ab initio számítások alapján történő becslése azonban óriási hibával terhelt (RMS=2-2.4), így a kapott eredmények csak tájékoztató jelleggel használhatóak fel szerkezet-hatás összefüggések megállapítására. Greenwood közleménye ennek megfelelően az irodalomban található, experimentálisan meghatározott logK értékeket alkalmazta a fentebb vázolt összefüggések alátámasztására [Greenwood és mtsai 1998]. OH
OH
N S
N O dimetil-izoxazolol
dimetil-izotiazolol
logK= 5.85
logK= 8.15
O
OH
metil-izoxazolol
3-hidroxi-2-metiloxadiazolon
O
O
R N
O OH
metil-uracil NH2 logK=9.75
logK=4.2
metil-tiadiazolol logK= 5.1
logK=4.5
HN N
N N S
HO
HN
N
2.9. ábra
N O
O
O O N
OH
willardiine
NMDA agonisták néhány lehetséges heterociklusos ω helyzetű csoportja és logK értékeik.
Az NMDA receptor koagonistáinak (Glu, Gly), valamint kompetitív antagonistáinak receptor kötődéséről kvantitatív leírást adó operációs modellek a receptor / ligand disszociációs állandókat a glutaminsav és glicin egyensúlyi koncentrációit tartalmazó egyenletekkel fejezik ki [Corsi és mtsai 1996]. Az eddig publikált modellek nem veszik figyelembe a ligandumok funkciós csoportjainak ionizáltsági állapotait, illetve ezek pH függését. A receptorhoz azonban glutamát esetében az α-karboxilát / α-ammónium / γ-karboxil csoportokat tartalmazó részecske
25
(αCOO-/αNH3+/γCOOH) kötődik [Chen és Wyllie 2006], így célszerű lenne a mikorészecskék egyensúlyi koncentrációjának az ismerete és az egyenletekben történő alkalmazása. Az αCOO/αNH3+/γCOOH részecske aktuális koncentrációjának, illetve móltörtjének a kiszámításához a közeg pH-jának pontos meghatározása mellett a protonálódási mikroállandók ismerete is szükséges. Az ilyen típusú modellek továbbfejleszthetőek, pontosságuk növelhető, alkalmazási területük kiszélesíthető lehet az ismert ligandumok (glutaminsav [Burger és mtsai 1988], aszparaginsav [Noszál és Sándor 1989], NMDA, stb.) csoport-specifikus bázicitásainak felhasználásával. Kompetitív NMDA antagonisták ω foszfonsavas származékai nagyobb antagonista potenciállal rendelkeznek, mint az ω karbonsav vagy ω tetrazol csoporttal rendelkezők [Benveniste és Mayer 1992]. Ennek magyarázatához Benveniste és munkatársai megvizsgálták a kérdéses funkciós csoportok viselkedését, ionizáltsági állapotát az extracelluláris pH tartományban. Feltételezték, hogy az ω karbonsav és ω tetrazol csoportok pH 7.3-8.2 között teljesen ionizált állapotban vannak, tehát egy negatív töltést hordoz a disztális funkciós csoport*. Az LY257883 molekula (2.6. ábra) foszfonsav-csoportjának logK értékei alapján (logK1=2.5, logK2=7.85) a kétszeresen, illetve egyszeresen deprotonált forma egyaránt jelen van (pH 7.3-8.2 között), tehát két, illetve egy láncvégi negatív töltéssel rendelkező részecskék jelenlétével számoltak. Az antagonista ligand-receptor asszociációs (kon) és disszociációs (koff) konstansokat, illetve ezek hányadosát (koff/ kon) használták az antagonista affinitás mérőszámaként. A kon minél nagyobb, illetve a hányados minél kisebb, annál nagyobb egy vegyület antagonista potenciálja. A kinetikai konstansok mérése alapján megállapították, hogy a pH-t 7.3-ról 8.2-re emelve az AP7 molekula (2.6. ábra) receptoraffinitása megháromszorozódik, és sokkal nagyobb antagonista potenciállal rendelkezik, mint a karboxilát csoportot tartalmazó LY221501 (2.6. ábra). Figyelembe vették, hogy a pH az NMDA receptorra is hat. Ez a hatás azonban, feltételezéseik szerint, csak allosztérikusan befolyásolja a receptor aktivitását, és a receptor ligand kapcsolatra a glutaminsav kötőhelyen nincsen befolyással. A Henderson-Hasselbalch egyenlet alkalmazásával kiszámították az egy, illetve két láncvégi töltést hordozó részecskék koncentrációját, illetve móltörtjét 7.3 és 8.2 pH értékre ( f PO32− , pH 7.3 = 28% ,
f PO32− , pH 8.2 = 75% ,
f HPO3− , pH 7.3 = 72% ,
* Ezt a közelítést nem ellenőrizték, logK értékeket nem említettek; irodalmi források szerint logkγ,Glu=4.05 [Burger és mtsai 1988], logK2,γ-tetrazol=4.83 [Elwood és mtsai 1965], a tanulmányban vizsgált LY221501 karbonsav származék logK értékei azonban ismeretlenek 26
f HPO3− , pH 8.2 = 25% [Benveniste és Mayer 1992]). Következtetésként megállapították, hogy a receptorhoz a -PO32- csoportot tartalmazó részecske kötődik (legalábbis nagyobb affinitással). A hipotézist alátámasztja, hogy az ω-foszfinsavas származékok (egy láncvégi negatív töltés) kisebb antagonista potenciállal rendelkeznek foszfonsavas analógjaiknál. kon értéke foszfonsav csoport esetében a legalacsonyabb, amit a közel tetraéderes -PO32-, illetve planáris −COO− csoportok közötti geometriai különbséggel, a bruttó töltések és a töltéseloszlás eltérésével, valamint a különböző kémiai minőséggel magyaráztak. Az antagonista potenciál mérésekor azt vizsgálták, hogy a vegyület milyen mértékben képes az NMDA által kiváltott receptorválasz csökkentésére. Az LY257883 vegyület pH=8.2 közegben 3.7-szer nagyobb antagonista potenciállal bír pH=7.3hoz képest. Ez alátámasztja a -PO32- csoport prioritását a receptorkötődésben. A pH változás azonban a karbonsav származékok esetén (LY221501) is eltérést okoz az antagonista potenciálban. Sőt, a tanulmány szerint az NMDA molekula receptor-affinitása is pH függő ebben a tartományban. Ezek a megfigyelések tehát óvatosságra intenek a receptorfelszín közvetlen közelében uralkodó viszonyok (ionerősség, pH) értelmezésével, illetve a makroszkopikusan mérhető paraméterek receptorfelszínre történő közvetlen alkalmazhatóságával kapcsolatban. Nem zárható ki továbbá a vegyületek alacsony koncentrációban jelen levő (a domináns részecskétől különböző protonáltsági állapotú, illetve protonáltsági izomer) részecskéinek a jelenléte, illetve szerepe a receptor-ligand kölcsönhatásokban. 2.2.2 A dolgozatban használt protonálódási állandók meghatározására szolgáló módszerek áttekintése Makroszkopikus protonálódási állandók meghatározására mindazon módszerek alkalmasak, amelyekben a mért fizikai-kémiai mennyiség pH-függő változása a molekula H+ -felvételével egyértelmű kapcsolatba hozható [Szakács, Kraszni, Noszál 2004]. A számos metodika közül az alábbiakban a dolgozatban alkalmazott vizes közegű potenciometriás titrálást és az 1H NMR pHtitrálást említjük. A titrált oldatokban az ionerősséget teljesen disszociáló biner elektrolittal (inert só, NaCl) állítjuk a kívánt értékre. Az inert só a minta komponenseinél sokkal nagyobb koncentrációban van jelen és azokkal (elvileg) semmilyen kémiai vagy fizikai (például ionasszociációs) kölcsönhatásba nem léphet [Anderegg 1993]. Az ilyen körülmények között
27
lejátszódó egyensúlyok jellemzéséhez a hidrogénion koncentráción alapuló pH skála használata célszerű, ezért minden mért és számolt eredményt eszerint adunk meg [Irving és mtsai 1967]. 2.2.2.1
Potenciometriás titrálás vizes közegben A pH-metriás titrálás a protonálódási állandók meghatározásának klasszikus, igen pontos
módszere. [Avdeef 2001; Nancollas és Tomson 1982; Bjerrum 1941] A vizsgálandó vegyület (legtöbbször ismert mennyiségű erős savat is tartalmazó) oldatához állandó kevertetés és temperálás mellett adagoljuk egy erős bázis faktorozott mérőoldatának ismert térfogatait. A hígulást figyelembe véve a titrálás minden pontjára kiszámítható a még nem semlegesített H+ (vagy OH-) ionok összkoncentrációja ( CH + − COH − ), a szabad H+ (OH-) ionok koncentrációját pedig a pH-n keresztül mérjük. Felírható a H+ és ligandum (L) anyagmérleg-egyenleteinek kombinálásával a 2.1 egyenlet, ami tartalmazza a ligandum által felvett protonok számát ( C Lz− ⋅ n H , ahol C Lz− a mért ligandum bemérési koncentrációja).
CH + − COH − = [ H + ] − [OH − ] + CLz − ⋅ n H
2.1
Átrendezéssel az egy ligandum által átlagosan kötött protonok száma ( n H ) kifejezhető (2.2 egyenlet, K v a vízionszorzat), és az így kiszámított n H / pH adatpárokra a Bjerrum-függvények (4.7, 4.8 és 4.9 egyenletek) közvetlenül illeszthetők. nH =
C H + − COH − − [ H + ] + K v [ H + ]−1 C Lz−
2.2
Az üvegelektród kalibrálását hidrogénion koncentráción alapuló pH skálára üres (blank) titrálással végezik. Ennek menete, hogy ismert koncentrációjú és térfogatú erős savat titrálunk faktorozott erős bázissal, így a titrálás minden pontjában kiszámítható a [H+] [Irving 1967]. A mért elektródpotenciál (E) és számított pH adatpárokból súlyozott lineáris regresszióval az elektródparaméterek meghatározhatók. A pH-metriás titrálás egyik korlátja, hogy az összkoncentrációkat úgy kell megválasztani, hogy az 2.1 mérlegegyenlet jobb oldalán a ligandum H+ -felvételének járuléka domináns legyen, ez a 1,7-12 pH-tartományban általában teljesül. Erősen savas (vagy lúgos) közegbe eső logK mérésekor viszont az összes H+ (vagy OH-) ion túlnyomó része szabadon van jelen és az oldat pufferkapacitásában nem a ligandum, hanem az oldószer dominál [Avdeef 2001] Ezt a szokásos
28
0,5-10 mM-nál nagyobb ligandumkoncentrációval ellensúlyozni lehet ugyan, de ekkor az ionerősséget nehezebb állandó értéken tartani. A szélsőséges pH-tartományba eső állandók méréséhez célszerűbb NMR vagy UV spektroszkópiás módszert választani.[ Szakács és Hägele 2004] A pH-metria másik hátránya, hogy nem szelektív módszer, ezért csak gondosan tisztított anyagok vizsgálatára alkalmas. A vizsgált pH-tartományban ionizálódó szennyezők, pl. az esetleges mellék- és bomlástermékek c ⋅ n H járuléka nem különíthető el a mérendő anyagétól a kiértékelés alapjául szolgáló (2.1) egyenletben [Avdeef 2001; Bányai és mtsai 1992].
2.2.2.2 1H NMR-pH titrálás Egy NMR mag kémiai eltolódását (δ) a 2.3 egyenlettel definiáljuk [Sohár 1976]:
δ≡
ν − ν ref σ −σ ≅ σ ref − σ ⋅ 106 [ ppm ] = ref 1 − σ ref ν0
2.3
ahol ν a kiválasztott mag és νref egy referenciaanyag magjának rezonanciafrekvenciája [Hz], σ és σref ugyanezek árnyékolási tényezője, ν0 pedig a használt spektrométer alapfrekvenciája [MHz] a
mért magra. A protonálódás hatására a funkciós csoport körül csökken az elektronsűrűség, ezért a közeli NMR magok diamágneses árnyékolása, így kémiai eltolódása is megváltozik (δHL > δL). Az 1H NMR spektroszkópiában a paramágneses és egyéb komponensek hatása általában elhanyagolható a diamágneses hatáshoz képest (kivételek természetesen vannak, pl. az anizotróp hatás konformációváltozások következtében bizonyos esetekben mutathat pH függést), ezért a szénhez kötött, nem cserélődő hidrogének kémiai eltolódása alkalmas az ionizációval kapcsolatos elektronsűrűség-változások követésére [Sterk és Holzer 1974]. A protonált (δHL, savas forma), illetve nem protonált (δL, bázikus forma) részecskék egyedi kémiai eltolódásai az ún. határeltolódások, értékük közvetlenül leolvasható olyan szélső pH-n felvett spektrumokról, ahol a HL vagy az L részecskék móltörtje gyakorlatilag 100 %. Mivel a legtöbb kismolekula vízben a diffúziós limit közeli sebességgel cserél protont, ezek a reakciók pillanatszerűen gyorsak a „kémiai eltolódás” időskálán (fast-exchange regime): k >> |νHL − νL|, ahol νL és νHL a vizsgált 29
NMR mag frekvenciája az átalakuló L és HL részecskefajtákban. Ilyenkor csak egy közös rezonanciajel figyelhető meg a részecskék egyedi δL és δHL kémiai eltolódásainak (határeltolódások) móltörtekkel (XL, XHL) súlyozott átlagánál [Gutowsky és Saika 1953; Grunwald és mtsai 1957].
δ mért = δ L X L + δ HL X HL =
δ L + δ HL K1[ H + ]
2.4
1 + K1[ H + ]
A 2.4 egyenletet a mért pH / δ
adatpárokra illesztve a protonálódási állandó(k)
meghatározhatók. A mágnesek térerejének növekedésével a kémiai eltolódások egyre pontosabban mérhető mennyiséggé válnak [Govindaraju és mtsai 2000; Rabenstein és mtsai 1997] így a számolt logK pontosságát a pH-mérés precizitása (± 0,02 [Naumann és mtsai 2002]) determinálja. A dolgozatban egycsöves technikát alkalmaztunk, in situ pH meghatározással. A titráló oldatot μl részletekben kell adagolni az NMR csőbe, amely a meghatározandó anyagon kívül pH indikátormolekulákat is tartalmaz. Az indikátor mért kémiai eltolódásából a pH a 2.5, HendersonHasselbach típusú egyenlettel számítható ki:
pH = pK Ind
mért δ HInd − δ Ind [ Ind ] + log = pK Ind + log mért [ HInd ] δ Ind − δ Ind
2.5
Az indikátormolekulák nem protonált (δInd) és protonált (δHInd) formáinak határeltolódásait, valamint protonálódási állandóit (logKInd) külön kísérletből kell meghatározni. A 0 és 8.5 közötti pH tartományban a Szakács és munkatársai által bevezetett indikátormolekulákat alkalmaztuk [Szakacs és Hägele 2004; Szakacs, Hägele, Tyka 2004]. Előnye a módszernek, hogy a 0 és 1,8 közötti pH-értékeket a diklórecetsav indikátorral torzításmentesen és kisebb véletlen hibával lehet meghatározni, mint üvegelektróddal. Az NMR spektroszkópiás logK mérés további előnye, hogy a vizsgálandó anyag pontos koncentrációját nem szükséges ismerni, továbbá a szennyezők mindaddig nem zavarnak, míg a rezonanciajelek hovatartozása (például 2D technikákkal) egyértelműen eldönthető [Bányai és mtsai 1992].
30
Fontos szempont olyan referensanyag választása az NMR titráláshoz, amely ionizációs állapotát a vizsgált pH-tartományban nem változtatja meg. 1H NMR titráláshoz a 3-trimetilszilil1-propánszulfonsav nátriumsója (DSS, δ=0 ppm) megfelelő, mert csak -6 alatti „pH-n” protonálódik [Koeberg-Telder és Cerfontain 1975]. A titrált ligandum és az indikátormolekulák kölcsönhatásai zavarhatják a titrálást, ezért minden mérés esetében meg kell győződni arról, hogy interakciók nem lépnek fel. 2.3
N-metil-aminosavak és származékaik előállítása
Az N-alkil aminosavak alacsonyabb rendű élőszervezetekben különböző biológiai funkcióval rendelkező endogén vegyületek, amelyeket széles körben alkalmaznak humán peptidek N-szubsztituált származékainak felépítéséhez kombinatorikus szintézisekben. Ezen belül az N-metil származékokat kiterjedten használják peptidvázak konformációjának tanulmányozására, szerkezetük merevítésére, enzimstabilitásuk fokozására. Számos biogén peptid bizonyos ponton szisztematikusan N-metilezett analógjait szerkezet-hatás összefüggések felderítéséhez használják [Vitoux és mtsai 1986; Goodfellow és mtsai 1996]. A következő rövid áttekintés az N-metil-aminosavak előállítására alkalmas néhány módszert és azok korlátait mutatja be. A peptidkémiában igen széleskörű szintetikus repertoár áll rendelkezésre N-szubsztituált származékok előállítására, kevésbé mondható ez el az aszparaginsav származékokról, amelyek a legreaktívabb szubsztrátok közé tartoznak és az általánosan használható módszerek alkalmazása igen változatos reakciótermékekhez vezet, polimer, gyűrűzárt , mono- és diszubsztituált variációk sokasága jelenhet meg. Így nitrogénen szubsztituált aszparaginsav származékok előállítására még napjainkban is dolgoznak ki új módszereket, egy általános eljárás alkáli maleátok és aminok reakcióján alapul [Piispanen és Pihko, 2005]. Ezek a módszerek azonban N-metil származékok előállítására nem alkalmasak. Az N-metil aminosavak előállítására kidolgozott általános eljárások viszont ritkán működnek aszparaginsav és aszparagin származékokra, tekintettel a vegyületek 4.2.3. fejezetben részletezett szukcinimid és szukcinanhidrid gyűrűzárásra majd -nyílásra való hajlamára, és az ezzel járó átalakulásokra illetve izomerizációra [Tam és mtsai 1988]. Az aminosavak sztereoszelektív N-metilezési reakciói között van, amelyik nem alkalmazható háromfunkciós (aszparagin, hisztidin, triptofán, lizin) aminosavakra [Aurelio és mtsai 2000;
31
Burger és mtsai 2000], illetve szélsőséges reakciókörülményeket alkalmaz [Papaioannou és mtsai
1994; Wisniewski és Kotodziejczyk, 1997]. Az O'Donnell's Schiff bázis reduktív
aminezésén alapuló általános eljárások változatos redukálószereket alkalmaznak, például nátrium-cianobórhidridet [Chruma és mtsai 1997; Oppolzer és mtsai 1993], aldehideket és ketonokat triacetoxybórhidriddel [AbdelMagid és mtsai 1996], az aszparaginsavból azonban ilyen reakciókban mono-, di-, és trimetilezett vegyületek keletkeznek, amelyeket utólag nehéz szétválasztani [Verardo és mtsai 2002]. A gyakorlatban alkalmazható módszerek N-metil aszparaginsav származékok előállítására aktiváló és védőcsoportok párhuzamos kialakításán alapulnak, a reagens lehet az erősen toxikus foszgén [Liwschitz és Zilkha, 1954; Deming, 1997], trifoszgén [Thern és mtsai 2002], hexafluoroaceton [Burger és Spengler, 2000] vagy diklór-dialkil-szilán [van Leeuwen és mtsai 2002]. Az utóbbi reakciót amid nitrogénen szubsztituált L-aszparaginsav-amidok régiószelektív szintéziséhez is felhasználták. Megemlítjük még azt a széles körben alkalmazott reakciótípust, amelyben 5-oxazolidinon köztitermékek reduktív hasításával oldják meg bizonyos N-metil aminosav-származékok szintézisét [Reddy és Iyengar, 1999; Aurelio és mtsai 2002; Aurelio és mtsai 2003; Aurelio és mtsai 2004]. Az NMA és származékainak előállítására a szakirodalomban közölt és általunk módosított, illetve újonnan kifejlesztett szintetikus módszereket a hivatkozásokkal együtt a 3.2. és 4.2. fejezet tartalmazza. 2.4
Rotamer analízis
2.4.1 Konformációvizsgálatok a glutaminsav receptorok ligandumai körében A lehetséges konformációs állapotok, ezen belül a receptor-aktív konformáció meghatározásához, illetve a konformerek mólarányainak megismeréséhez korábban elsősorban szemiempírikus, majd később ab initio számításokat, szilárd fázisban röntgendifrakciós, oldatban NMR spektroszkópiás mérési módszereket alkalmaztak. Általában áttörést jelent a receptorligand komplex kristályos formában történő előállítása, ami lehetővé teszi a kapcsolatot kialakító aminosav-oldalláncok és ligandum funkciós csoportok térbeli elhelyezkedésének meghatározását, és azok ionizáltsági állapotáról is nyerhetünk információt [Chen és Wyllie 2006]. A receptor és a
32
ligandum közötti kölcsönhatás azonban dinamikus természetű, a szilárd fázisú analízis így csak egy kiragadott „pillanatképről” szolgáltat információt. Az agonista, illetve antagonista potenciált sok ligandum esetében befolyásolhatja a lehetséges konformerek száma, illetve az aktív konformer populációja. A glutamát receptor agonisták és kompetitív antagonisták körében végzett, konformációanalízissel kapcsolatos tudományos munkákból emelünk ki néhány érdekes eredményt az alábbiakban. AMPA és KA receptor agonisták tervezése és szintézise során összefüggéseket találtak bizonyos vegyületek konformereinek populációi és az AMPA receptoron mérhető affinitás között [Conti és mtsai 1999]. A konformerek relatív energiáit, a diéderes szögeket, valamint a funkciós csoportok d1 és d2 távolságát (d1: az α-karboxil / ω-sav, illetve d2: α-amino / ω-sav) molekulamechanikai számításokkal optimálták, és a kapott adatokat összehasonlították az AMPA és kainát azon konformereivel, amelyek feltételezések szerint a receptorokhoz kapcsolódnak. Az egyes rotamerek populációit az energiaadatok alapján becsülték. A CIP A és CIP B vegyületeknek (2.10. ábra) van két olyan stabil konformere, amelyekben a funkciós csoportok fedésbe hozhatóak az AMPA és kainát megfelelő konformereivel, amivel a mindkét receptor altípuson kifejtett agonista hatást a két molekulára értelmezték. A 3-hidroxi-izoxazolinil prolin A és B szerkezeteknek ezzel szemben nincsenek olyan, számottevően betöltött populációjú konformerei, amelyekben a d1, illetve d2 távolságok megfelelnének valamelyik receptor-aktív konformernek, így ezek a molekulák nem rendelkeznek mérhető receptor-affinitással egyik altípuson sem. O
H O N
OH
O
H O N
OH O CIP-A
2.10. ábra
OH OH
H
N H
H O N
O
HO
N H
H
N H
H
OH
O HO
H O N OH N H
H
O 3-hidroxiizoxazolinil prolin A
CIP-B
3-hidroxiizoxazolinil prolin B
Néhány AMPA / KA receptor koagonista
Az NMDA receptorok egyik szelektív agonistája a tetrazolil-glicin (2.3. ábra), amelyben az ω-sav funkció szerepét a tetrazol gyűrű NH csoportja tölti be [Lunn és mtsai 1992].
33
Fiziológiás körülmények között a tetrazol-glicinnek, a glutaminsavhoz és aszparaginsavhoz hasonlóan, a két negatív és egy pozitív töltést hordozó részecskéje dominál. Ez a részecske felvehet olyan, számottevő populációval rendelkező konformációt, amelynek geometriája, különös tekintettel az ionizált csoportok elhelyezkedésére és a részecskék töltéseloszlására, nagyfokú hasonlóságot mutat a glutaminsav és aszparaginsav egy-egy stabil konformerével. A tetrazol-glicin és az aszparaginsav NMDA receptor szelektivitásának magyarázata lehet, hogy ezek a vegyületek nem képesek olyan konformációt felvenni, ami fedésbe hozható a glutaminsav AMPA és KA receptorokon aktív konformerével. NMDA agonisták, kompetitív antagonisták és a receptor között kialakuló kölcsönhatások molekuláris tényezőinek értelmezésére farmakofór modelleket alakítottak ki [Ortwine és mtsai 1992]. A flexibilis molekulák lehetséges, alacsony energiaminimummal rendelkező konformerei közül azokat választották be a modellbe, amelyek átfedésbe hozhatóak rigidebb, ám farmakológiailag hasonlóan aktív szerkezetek konformereivel. 14 vegyület elemzésével megbecsülték a három funkciós csoport (α-sav, α-bázis, ω-sav) ideális térbeli elhelyezkedését agonista, illetve antagonista kromofór modellekre. Az Angströmben kifejezett távolságok alapján meghatározták a nyílt láncú, flexibilis agonisták, többek között az NMDA molekula konformerei közül azt, amelyben a megfelelő atomok távolságai leginkább megközelítik a modell predikcióját (4.30. ábra, részleteket lásd a 4.6. fejezetben). Az antagonista farmakofór modell alapján előre jelezték azt a másodlagos receptor kötőhelyet, ami az antagonisták ω-sav csoportjával lép kölcsönhatásba. A receptor és különböző ligandumok kristályos formában történő koizolációja 18 évvel később [Chen és Wyllie 2006] alátámasztotta ezt az elképzelést. Az ismert antagonisták biológiailag aktív konformációjának, valamint a kötődésben közvetlen szerepet nem játszó és ezáltal szabadabban variálható szerkezeti elemeinek ismerete lehetővé teszi olyan rigid szerkezetek előállítását, amelyek a nagyobb potenciál és szelektivitás mellett jobb farmakokinetikai tulajdonságokkal (pl. lipofilitás) is rendelkeznek. 2.4.2 Rotamer populációk meghatározása homonukleáris hidrogén csatolási állandókból Az egyes kötések körüli rotáció eredményeként nyílt láncú molekulák esetében a potenciális energiaminimummal rendelkező konformerek pillanatszerűen átalakulnak egymásba, egyedi
életidejük
pikoszekundumos
nagyságrendű.
34
Alfa
aminosavak
konformációs
egyensúlyainak vizsgálatában elterjedt megközelítés a vizsgálatokat a C2-C3 tengely körüli rotációra korlátozni. Ebben az esetben a végtelen számú konformációs állapot közül az energiaminimummal rendelkezőket rotamereknek nevezik*. Általános esetben három nyitott állású rotamer előfordulásával kell számolni. A diéderes szögek azonban általában eltérnek az etánmolekulában tapasztalható 60 °-os szögektől. Ez az eltérés a szubsztituensek eltérő térkitöltésével, illetve a közöttük fellépő kölcsönhatásokkal (vonzó, taszító) magyarázható. Az egyes rotamerekhez tartozó, közelítően pontos diéderes szögek elméleti kémiai számításokkal meghatározhatók. Az egyes rotamerek a jelenleg alkalmazott analitikai módszerekkel egymástól elválaszthatatlanok, szerencsés esetben meghatározható viszont relatív koncentrációjuk, illetve betöltöttségük (populációjuk). Az 2.11. ábrán az NMA legbázikusabb formájának három rotamerje látható Newman projekcióval ábrázolva.
CH3 H2N HA
COOHX
CH3 H A
2.11. ábra
HX
H2N
HB COOt (g-)
CH3 H B H2N
COO-
HB
-OOC
COO-
HX HA COOh (g+)
g (t)
Az NMA legbázikusabb formájának három rotamerje Newman projekcióval ábrázolva.
Az aminosav rotamerek megkülönböztetésének korábban általánosan elterjedt módja a Martin-féle [Martin és Mathur 1965] jelölésmód (t, g, h), amely szerint a t jelű rotamerben a két legnagyobb térkitöltésű csoport (jelen esetben a két karboxilát) egymáshoz képest transz helyzetű, a h rotamerben a három nagy térkitöltésű csoport egymás közelében helyezkedik el (2.11. ábra). Az elsősorban peptidek konformereihez használt IUPAC jelölésmód* alapja a szubsztituensek Cahn-Ingold-Prelog rendszer szerinti rangsora, és a két legmagasabb rangú szubsztituens által bezárt diéderes szög. Ennek megfelelően a t rotamerben a béta karboxilát és a metilamino csoport közötti diéderes szög értéke 180 °, a g+ rotamerben + 60 °, míg a g-
*
www.chem.qmw.ac.uk/iupac/misc/ppep1.html 35
rotamerben -60°. A IUPAC jelölést a 2.11. ábrán zárójelben tüntettük fel, a dolgozat további részében a Martin-féle jelölést alkalmazzuk. Az NMA molekula rotamerjeinek relatív koncentrációját 1H NMR spektroszkópiával határoztuk meg. Az elvi alapokat a vicinális 1H – 1H csatolási állandók és a diéderes szög közötti Karplus-féle összefüggés szolgáltatta [Karplus 1959; Karplus 1960; Karplus 1963]. A vegyületek adott protonáltsági állapotában a három különböző rotamerben eltérő diéderes szögeket mérhetünk, így az egyedi csatolási állandók értéke is eltér. A vizsgált vegyületek ABX spinrendszerének (lásd. 4.1. fejezet) C2-C3 kötéstengelye körül két darab háromkötéses 1H – 1H csatolási állandó mérhető (3JAX, illetve 3JBX). A mért csatolási állandók az egyes rotamerekhez tartozó csatolási állandók (például az NMA legbázikusabb formájának transz rotamerében az A és X hidrogének között mérhető J AX , NMAt , stb.) súlyozott összegei, ahol a súlyfaktorok az egyes rotamerek f móltörtjei. Az NMA legbázikusabb formájára felírhatóak a 2.6 – 2.8 egyenletek [Pople 1958]: 3
J AX , NMA = f NMAt J AX , NMAt + f NMAg J AX , NMAg + f NMAh J AX , NMA,h
2.6
3
J BX , NMA = f NMAt J BX , NMAt + f NMAg J BX , NMAg + f NMAh J BX , NMAh
2.7
f NMAt + f NMAg + f NMAh = 1
2.8
ahol J AX , NMAt , J AX , NMAg és 3 J AX , NMA,h a t, g, és h rotamerek AX csatolási állandói, f NMAt , f NMAg és
f NMAh pedig a t, g, és h rotamerek móltörtjei. A t rotamer móltörtje kifejezhető például a következő (2.9) egyenlettel:
f NMAt =
[t ] [t ] = [t ] + [ g ] + [h] [ NMA]
2.9
A mért 3JAX és 3JBX csatolási állandók és a rotamer csatolási állandók ismeretében a 2.6-2.8 egyenletrendszer felhasználásával a rotemerek móltörtjei számíthatók, de csak abban az esetben, ha feltételezzük, hogy a vizsgált molekula túlnyomó többségében csak egyetlen protonáltsági állapotú részecske formájában van jelen az oldatban. Az eltérő protonáltságú állapotokban,
36
valamint az azonos bruttó töltésű protonáltsági izomerekben ugyanis nemcsak az egyes rotamerek csatolási állandói különböznek, hanem különbözőek a rotamer betöltöttségek is. Az egyes rotamerek a kapcsolódó csoportok elektronegativitása és a csatoló hidrogének által bezárt diéderes szög miatt különbözhetnek. A rotamer betöltöttségek különbségét az eltérő kölcsönhatások okozzák, két karboxil-csoport között például hidrogénkötés alakulhat ki, ami gauche helyzetet stabilizál, míg két karboxilát-csoport elektrosztatikusan egymást taszító hatása a t rotamer arányát növeli. Az 2.6-2.8 egyenletek kiértékelése feltételezi a rotamer csatolási állandók ismeretét. Ezek kiszámítására az egyik elfogadott módszer napjainkban különböző módosított Karplus típusú egyenletek
alkalmazása.
A
vicinális
csatolási
állandókat
befolyásoló
tényezőket
(a
szubsztitituensek elektronegativitása, a szubsztituensek csatoló protonokhoz viszonyított relatív térhelyzete, a kötéshosszak és kötésszögek) az Altona által bevezetett 2.10 egyenlet úgynevezett szubsztituens konstansok (λ) formájában veszik figyelembe [Altona 1994]. 3
{
}
J ( HH ) = 14.63 cos 2 (φ ) − 0.78 cos(φ ) + 0.60 + ∑ λi × 0.34 − 2.31 cos 2 [si (φ ) + 18.4 λi ] 2.10 i
A csatoló hidrogének által bezárt diéderes szög (φ) az eredeti Karplus egyenlethez hasonlóan koszinuszos, illetve koszinusz négyzetes tagok formájában szerepel. A szubsztituensek egymáshoz viszonyított térhelyzetétől függő (si) értéke +1, illetve −1 lehet annak megfelelően, hogy az adott hidrogéntől a kérdéses szubsztituens az óramutató járásával megegyezően vagy ellentétes irányban helyezkedik el (2.12. ábra).
2.12. ábra
A szubsztituensek si értékének leolvasása [Altona 1994]
A szubsztituens konstansokat 1,1-diszubsztituált etán származékok (2.13. ábra) proton-proton csatolási állandóiból a 2.11 egyenlet alapján határozták meg [Altona 1994].
37
R2 R1 H
CH3
2.13. ábra 3
Szubsztituált etán származékok a λ szubsztituens konstansok méréséhez.
J ( HH ) = 7.84 − 0.59(λ1 + λ2 ) − 0.42(λ1λ2 )
2.11
Az egyenlet paramétereit nagyszámú mérési eredmény felhasználásával, a legkisebb négyzetek módszerével számították. Vizsgálataikat kiterjesztették többek között az oldószer változtatásának, valamint a sav-bázis centrumok protonáltsági állapotának csatolási állandókra gyakorolt hatásának jellemzésére. Egy adott rotamer csatolási állandója kiszámítható, ha a szubsztituens állandókat és az elméleti kémiai módszerekkel optimalizált geometriából kapott diéderes szöget a 2.10 Altona-féle Karplus egyenletbe helyettesítjük. Így a 2.6-2.8 egyenletekben szereplő hat rotamer csatolási állandó mindegyike ismert lesz (hatparaméteres megközelítés).
38
3
KÍSÉRLETI RÉSZ A protonálódási és konformációs egyensúlyok vizsgálatához használt molekulák
szerkezete a 3.1. ábrán látható. Akirális részecskékkel szemben (vízmolekula, proton) az egyes enantiomerek reakciója nem különbözik egymástól, ezért a további kísérletekhez NMDA helyett a racém formát, az N-metil-DL-aszparaginsavat (NMA) használtuk. Néhány ábrán, táblázatban és egyenletben NMAαa és NMAβa jelöli a monoamidokat, NMAαβa pedig az NMA-diamidot. O H Hx N a Hb
O OH
Ha
H Hx N a
OH
b
Hb
3.1. ábra
3.1
NH2 OH
b
Hb
O
NMA
Ha
O
O H Hx N a
OH Ha NH2
b
H Hx N a Hb
Ha
NH2 NH2
b O
O
O
NMA-α-amid
NMA-β-amid
NMA-diamid
Sav-bázis és konformációs vizsgálatok modellvegyületei.
Felhasznált anyagok Az
N-metil-DL-aszparaginsavat
(NMA),
az
NMR
titrálásokban
alkalmazott
indikátormolekulákat (Trisz [trisz (hidroximetil)-aminometán], diklórecetsav, klórecetsav, ecetsav,
1H-imidazol,
metilamin-hidroklorid,
trimetilamin-hidroklorid),
az
NMR-
spektroszkópiához referensanyagként használt 3-trimetilszilil-1-propánszulfonsav nátriumsóját (DSS), az NMR mérések során használt D2O-t (izotóptisztaság ≥ 99.8 atom%) és d6-DMSO-t (deuteráltság ≥ 99.5 atom%), a szintetikus reakciók alapanyagait valamint a titrálásokhoz (NaOH, NaCl, ccHCl) és szintetikus reakciókhoz használt vegyszereket, reagenseket és oldószereket a Reanal, Sigma, Fluka, Merck és Aldrich gyártóktól szereztük be, és további tisztítás nélkül használtuk fel. A potenciometriás titrálások oldószereként desztillált Millipore ioncserélt vizet, az NMR pH-titrálásokhoz Millipore ioncserélt vizet használtunk. A VRK eluensek HPLC minőségű Riedel-de Haën termékek (Chromasol V ≥ 99.9 %). Az olvadáspont mérésekhez Boetius készüléket használtunk, a kapott eredményeket korrekció nélkül közöljük.
39
3.2
Szintetikus kísérletek leírásai A preparatív eljárások termékeinek sómentesítésére ioncserélő oszlopkromatográfiás
töltetet használtunk (Merck, Amberlyst 120, 200 mes-szám, erősen savas), az anyagot a gyantáról piridin / víz 40 : 10 arányú elegyével eluáltuk.
N-metil-DL-aszparaginsav dimetilészter 9 A módszer: Fumársav dimetilészter (28.8 g, 0.2 mol) piridines oldatához (150 ml) metilamin hidrokloridot (22.5 g, 0.3 mol) adunk és állandó intenzív kevertetés mellett a reakcióelegyet 100 °C-ra melegítjük. A szuszpenzióhoz ekvivalens mennyiségű trietilamint (27.3 g, 41 ml, 0.3 mol) csepegtetünk 3 óra alatt. A becsepegtetés után a reakcióelegyet további 2 órát melegítjük 110oCon. Az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot etilacetátban (150 ml) szuszpendáljuk, és az elegyet telített nátrium-karbonát oldattal semlegesítjük. A szerves fázist elválasztjuk, és a vizes fázist etilacetáttal (2x50 ml) extraháljuk. Az egyesített szerves fázist vízzel (3x25 ml) mossuk, vízmentes nátriumszulfáton megszárítjuk, és az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk. Sárgás olajat kapunk (31.4 g, 90 %), amelyet további tisztítás nélkül közvetlenül felhasználunk a következő átalakításokban. F.p. 68-70 °C / 0.3 Hgmm, (Irod. 60-61 °C / 0.25 Torr; Stadler és Hofmann 1962), Törésmutató nD = 1.4378 20 °C-on. 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ = 3.64 (3 H, s, OCH3), 3.58 (3 H, s, OCH3), 3.45 (1 H, t, 3J1(H,H) = 6,68 Hz, 3J2(H,H) = 7,02 Hz C-H), 2.65 (1 H, d-d, 3J1 (H,H) = 6.68 Hz, 2J3(H,H) = 15.80 Hz, HCH), 2.55 (1 H, d-d, 3J2(H,H) = 7.02 Hz, 2J3(H,H) =15.80 Hz, HC-H), 2.23 (3 H, s, NCH3) MW= 175.19 ESI-MS m/z: 175.2 [M + H]+ Analízis a C7H13NO4 összegképletre számítva: C = 44.30 % H = 6.08 % N = 9.39 % Talált C = 43.95 % H = 6.18 % N = 9.29 % B módszer: Fumársav dimetilésztert (28.8 g, 0.2 mol) 50 ml abs. etanolban szuszpendálunk, és 25 ml 8 M etanolos
metilamin oldatot (0.2 mol) adunk hozzá 0 °C-on. A reakcióelegyet a fumársav
dimetilészter teljes feloldódásáig, majd további három órát kevertetjük. Az oldószert csökkentett
40
nyomáson ledesztilláljuk. Sárgás olajat kapunk közel kvantitatív hozammal. Analitikai vizsgálatokhoz az olajat vákuumdesztillációval tisztítjuk, amely után színtelen olajat kapunk.
N-metil-DL-aszparaginsav β-metilészter 7 A módszer: Maleinsav monometilészter (13 g, 0.1 mol) vízmentes piridines oldatához (100 ml), metilamin hidrokloridot (13.5 g, 0.2 mol) adunk állandó kevertetés mellett, és a reakcióelegyet 100 °C-ra melegítjük. A szuszpenzióhoz ekvivalens mennyiségű trietilamint (27.3 g, 41 ml, 0.3 mol) csepegtetünk 2 óra alatt. Az adagolás után a reakcióelegyet további 1 órát melegítjük 110oC-on, majd csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot minimális mennyiségű piridinben (25 ml) oldjuk, és az oldatot ioncserélő kromatográfiás oszlopon (80 g, erősen savas gyanta) kromatografáljuk. A terméket piridin-víz (79:18) arányú elegyével (150 ml) eluáljuk. Az eluált oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A terméket metanolból kristályosítva fehér kristályokat kapunk (24.4 g, 76 %), o.p. 206-7 °C. 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ = 3.58 (3 H, s, OCH3), 3.42 (1 H, d-d, 3J1(H,H) = 5.17 Hz, 3J2(H,H) = 6.84 Hz, C-H), 2.81 (1 H, d-d, 3J1 (H,H) = 5.17 Hz, 2J3(H,H) = 16.91 Hz, H-CH), 2.67 (1 H, d-d, 3J2 (H,H) = 6.84 Hz, 2J3 (H,H) = 16.91 Hz, HC-H), 2.47 (3 H, s, NCH3) MW= 161.16 ESI-MS m/z: 161.2 [M + H]+ Analízis a C6H11NO4 összegképletre számítva: C = 44.93 % H = 6.35 % N = 9.28 % Talált: C = 45.43 % H = 6.06 % N = 9.35 % B módszer: Fumársav monometilészter (1.31 g, 0.01 mol), etanolos oldatához (8 ml) 2.5 ml of 8 M etanolos metilamin oldatot (0.02 mol) adunk állandó hűtés mellett 0 °C-on. Egy óra kevertetés után az etanolt és a metilamin felesleget csökkentett nyomáson lepároljuk. N-metil- aszparaginsav– monometilészterének fehér kristályait kapjuk, amelyet éterrel szűrőre viszünk, és éterrel mossuk. A kapott termék kevés kötött metilamint tartalmaz. A nyers terméket vákuum szárítószekrényben cc. kénsav fölött egy éjszaka szárítjuk, majd acetonban szuszpendálva szűrjük, acetonnal mossuk. Szárítás után aminmentes terméket kaptunk. (1.48 g, 91 %), o.p. 207-8 °C. (Irod. 206 °C; Zilkha és Bachi 1959)
N-metil-DL-aszparaginsav (NMA)
41
N-metil-DL-aszparaginsav dimetilésztert (17.5 g, 0.1 mol) 5 % nátrium-hidroxid oldattal (100 ml) elegyítünk, és a reakcióelegyet 3 órát melegítjük 60 °C-on. Az oldat lehűtése után cc. hidrokloriddal semlegesítjük az elegyet pH = 4 értékig, és az oldószert csökkentett nyomáson ~25 ml térfogatra beszűkítjük. Az oldatot ioncserélő kromatográfiás oszlopon (80 g, erősen savas gyanta) kromatografáljuk. A terméket piridin-víz (79:18) arányú elegyével (250 ml) eluáljuk. Az eluált oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A szilárd maradékot izopropanolban (50 ml) szuszpendáljuk és a fehér kristályokat kiszűrjük, izopropanollal és éterrel mossuk, majd szobahőmérsékleten szárítjuk. N-metil-DL-aszparaginsav monohidrátot kapunk (14.1 g, 86 %), op. 141 °C (NMAx1 H2O) (irod. 138 °C; Watkins 1962). A terméket vákuumszárítószekrényben 100oC-on szárítva az olvadáspont 178 °C–ra (NMA) emelkedik (Irod. 175 °C; Watkins 1962). Rf (A, b)= 0.61, Rf (B, a) = 0.36 Rf (B, b) = 0.54 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ = 3.69 (1 H, dd, 3J1 = 8.56 Hz, 3J2 = 4.51 Hz, C-H), 2.77 (1 H, d-d, 3J1 = 8.56 Hz, 2J3 = 16.45 Hz, H-CH), 2.61 (1 H, d-d, 3J2 = 4.51 Hz, 2J3=16.45 Hz, HC-H), 2.54 (3 H, s, NCH3) MW = 147.13 ESI-MS m/z: 147.13 [M + H]+ Analízis a C5H9NO4 összegképletre számítva: C = 40.60 % H = 6.48 % N = 16.02 % Talált C = 41.00 % H = 6.65 % N = 15.94 %
N-metil-DL-izoaszparagin β-metilészter 14 Maleinsavamid metilészter (1.29 g, 0.01 mol) etanolos oldatához (8 ml) 1.3 ml 8 M etanolos metilamin (0.01 mol) oldatot adunk 0 °C-on. A reakcióelegyet 12 órán át kevertetjük 0 °C-on. Az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk. Az N-metil-DL-izoaszparagin β-metilésztert kvantitatív hozammal nyerjük színtelen átlátszó olajként. (1.34 g, 84 %), Rf (B, a) = 0.84 Rf (B,
b) = 0.85 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ = 7.48 (1 H, s, NH), 7.11 (1 H, s, NH), 3.59 (3 H, s, OCH3), 3.27 (1 H, d-d, 3J1(H,H) = 5.58 Hz, 3J2(H,H) = 8.27 Hz, C-H), 2.57 (1 H, d-d, 3J1(H,H) = 5.58 Hz, 2J3(H,H) = 15.38 Hz, H-CH), 2.39 (1 H, d-d, 3J2(H,H) = 8.27 Hz, 2J3(H,H) = 15.38 Hz HC-H), 2.21 (3 H, s, NCH3) MW= 160.17 ESI-MS m/z: 160.4 [M + H]+ Analízis a C6H12N2O3 összegképletre számítva: C = 45.13 % H = 7.62 % N = 17.41 % Talált C= 44.99% N=17.49%
N-metil-DL-aszparaginsav-β-amid
42
H=7.55%
A módszer: Malinsav monoamid (11.5 g, 0.1 mol) száraz piridines (100 ml) oldatához metilamin hidrokloridot (13.5 g, 0.2 mol) adunk állandó kevertetés mellett, és a reakcióelegyet 100 °C-ra melegítjük. A szuszpenzióhoz ekvivalens mennyiségű trietilamint (18.2 g, 27 ml, 0.2 mol) csepegtetünk 2 óra alatt. Az adagolás után a reakcióelegyet további 1 órán át melegítjük 110oCon. Az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk. A maradékot minimális mennyiségű vízben (25 ml) oldjuk és az oldatot ioncserélő kromatográfiás oszlopon (80 g, gyengén savas gyanta) kromatografáljuk. A terméket piridin-víz (79:18) arányú elegyével (150 ml) eluáljuk. Az eluált oldatot csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A terméket metanolból kristályosítva fehér kristályokat kapunk (12.4 g, 86 %), o.p. 208 °C (irod. 208 °C; Liwschitz et al., 1956) Rf (B, a)= 0.25, Rf (B, b) =0.40 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ = 7.69 (1 H, s, NH), 7.05 (1 H, s, NH), 3.39 (1 H, d-d, 3J1 (H,H) = 4.04 Hz, 3J2 (H,H) = 7.96 Hz, C-H), 2.73 (1 H, d-d, 3J1 (H,H) = 4.04 Hz, 2J3 (H,H) = 16.68 Hz, H-CH), 2.47 (1 H, d-d, 3J2 (H,H) = 7.96 Hz, 2J3 (H,H) =16.68 Hz, HCH), 2.50 (3 H, s, NCH3) MW= 146.15 ESI-MS m/z: 147.07 [M + H]+ Analízis a C5H10N2O3 összegképletre számítva: C = 41.00 % H = 6.65 % N = 15.94 % Talált: C = 40.89 % H = 6.87 % N = 15.79 % B módszer: Maleinsav monoamid (1.15 g, 0.01 mol), etanolos oldatához (8 ml) 2.5 ml of 8 M etanolos metilamin oldatot (0.02 mol) adunk állandó hűtés mellett 0 °C-on. Egy óra kevertetés után az etanolt és a metilamin felesleget csökkentett nyomáson lepároljuk. N-metil-DL-aszparaginsav-βamid fehér kristályait kapjuk, amelyet éterrel szűrőre viszünk, acetonnal mossuk, majd szárítjuk. (1.32 g, 91 %), o.p. 208-210 °C.
DL-α-metilamino-szukcinanhidrid .HCl 15 N-metil-DL-aszparaginsavat (1.47 g, 0.01 mol) feloldunk 8 ml ecetsavban és teljes felodódásig melegítjük (60 °C-on) szonikátor alkalmazásával, ill. a nem oldódott kis mennyiségű anyagot kiszűrjük. Az oldatot 5 °C-ra hűtve az NMA részben amorf csapadék formájában leválik. Az oldathoz hozzácsepegtetünk 8 ml acetil-kloridot állandó kevertetés és hűtés mellett 0-5 °C-on. Az
43
adagolás során az elegy fokozatosan feltisztul és az NMA teljesen beoldódik. A reakcióelegyet 5 °C-on tartjuk 12 órán át, azután 20 ml dietiléterrel higítjuk. A leváló DL-α-metilaminoszukcinanhidrid-hidrokloridot leszűrjük, és dietiléterrel mossuk. Az instabil, erősen higroszkópos anyagot azonnal továbbalakítjuk a következő reakcióban. (0.95 g, 74 %) 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ = 3.97 (1 H, d-d, 3J1(H,H) = 4.13 Hz, 3J2(H,H) = 7.65 Hz, C-H), 2.91 (1 H, d-d, 3
J1(H,H) = 4.13 Hz, 2J3(H,H) = 17.05 Hz, H-CH), 2.83 (1 H, d-d, 3J2 (H,H) = 7.65 Hz, 2J3(H,H) =
17.05 Hz HC-H), 2.57 (3 H, s, NCH3) MW= 129.12 ESI-MS m/z: 127.87 [M - H]-
N-metil-DL-aszparaginsav-α-amid I. módszer: N-metil-DL-aszparaginsavat (1.47 g, 0.01 mol) száraz tetrahidrofuránban (15ml) szuszpendálunk, és párhuzamosan tionil-kloridot (1.19 g, 0.73 ml, 0.01 mol) és trietilamint (1.01 g, 1.39 ml, 0.01 mol) csepegtetünk hozzá -20 °C-on. A szuszpenzió feloldódása után a reakcióelegyet további 30 percig kevertetjük, azután 7 M metanolos ammónia (4.5 ml, 0.3 mol) oldatot adunk hozzá -10 °Con. Az oldószert csökkentett nyomáson szárazra pároljuk. A maradékot aceton-víz (9:1) arányú elegyében szuszpendáljuk, szűrjük és hideg acetonnal mossuk. N-metil-DL-aszparaginsav-αamidot kapunk. (1.21 g, 82 %), o.p. 194 °C. (bomlékony) (Irod. 191 °C; Zilkha és Bachi 1959) Rf (A, b)= 0.41, Rf (B, a) = 0.36 Rf (B, b) = 0.38 1H-NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ = 7.71 (1 H, s, NH), 7.29 (1 H, s, NH), 3.43 (1 H, d-d, 3J1 = 4.77 Hz, 3J2 = 9.43 Hz, C-H), 2.42 (1 H, d-d, 3J1 = 4.77 Hz, 2J3 = 16.05 Hz, H-CH), 2.25 (1 H, d-d, 3J2 = 9.43 Hz, 2J3=16.05 Hz, HC-H), 2.34 (3 H, s, NCH3) MW= 146.15 ESI-MS m/z: 147.07 [M + H]+ Analízis a C5H10N2O3 összegképletre számítva: C = 40.89 % H = 6.87 % N = 15.79 % Talált: C = 41.00 % H = 6.65 % N = 15.94 %, II. módszer: DL-α-metilamino-szukcinanhidrid hidrokloridot (1.29 g, 0.01 mol) feloldunk 15 ml 7 M metanolos ammónia (0.1 mol) oldatban 10 °C-on. Egy óra állás után a metanolt és az ammónia felesleget csökkentett nyomáson lepároljuk 35 °C alatt tartva a hőmérsékletet. A kapott fehér kristályokhoz acetont (5 ml) adunk, szűrjük és acetonnal mossuk. Az N-metil-DL-aszparaginsav-
44
α-amidot cc. kénsav fölött vákuum szárítószekrényben szárítjuk egy éjszaka 10 °C-on. (1.16 g, 78 %), o.p. 191-193 °C. (bomlékony)
DL-α-metilamino-szukcinimid 12 Maleimidet (1.94 g 0.02 mol) etanolban (10 ml) feloldunk, és 2.5 ml, 8 M etanolos metilamin (0.02 mol) oldatot adunk hozzá 0 °C-on. A reakcióelegyet további 20 percig kevertetjük 0 °C-on. Az oldószert csökkentett nyomáson bepároljuk 35 °C alatt tartva a hőmérsékletet. A kapott DLα-metilamino-szukcinimid amorf tömegét további tisztítás nélkül közvetlenül felhasználjuk a következő átalakításokban. 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ = 3.61 (1 H, d-d, 3J1 (H,H) = 4.82 Hz, 3J2 (H,H) = 8.51 Hz, C-H), 2.83 (1 H, d-d, 3J1 (H,H) = 4.82 Hz, 2J3 (H,H) = 17.80 Hz, H-CH), 2.36 (1 H, d-d, 3J2 (H,H) = 8.51 Hz, 2J3 (H,H) = 17.80 Hz HC-H), 2.32 (3 H, s, NCH3) MW=128.13 ESI-MS m/z: 129.2 [M + H]+
N-metil-DL-aszparaginsav-diamid DL-α-metilamino-szukcinimidet (2.63 g 0.02 mol) 25 %-os vizes ammónium-hidroxid oldatban (20 ml) 0 °C-on hagyjuk reagálni 5 napig. A levált fehér kristályokat szűrjük és hideg acetonnal mossuk. N-metil-DL-aszparaginsav-diamidot kapunk. (1.2 g, 41 %), o.p. 144-146 °C. 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ = 7.39 (1 H, s, NH), 7.34 (1 H, s, NH), 7.02 (1 H, s, NH), 6.81 (1 H, s, NH), 3.16 (1 H, d-d, 3J1(H,H) = 4.52 Hz, 3J2(H,H) = 8.99 Hz, T1 = 1.27 s C-H), 2.29 (1 H, d-d, 3
J1(H,H) = 4.52 Hz, 2J3(H,H) = 14.87 Hz, T1 = 0.87 s H-CH), 2.17 (1 H, d-d, 3J2(H,H) = 8.99 Hz,
2
J3(H,H) = 14.87 Hz, T1 = 0.87 s HC-H), 2.12 (3 H, s, T1 = 1.55 s NCH3) MW=145.16 ESI-MS
m/z: 146.2 [M + H]+ Analízis a C5H11N3O2 összegképletre számítva: C=41.37% H= 7.64% N=28.95% Talált C= 41.30% H=7.72% N=28.70%
1,5-dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid 19 DL-α-metilamino-szukcinimidet (2.63 g, 0.02 mol) feloldunk 20 ml 7 M metanolos ammónia oldatban, és szobahőmérsékleten hagyjuk reagálni 12 órát. A levált fehér kristályokat szűrjük, és hideg acetonnal mossuk. (0.4 g, 15 %), o.p. 173-175 °C. 1H-NMR (DMSO-d6, 600 MHz): δ =
45
7.41 (2 H, s, NH), 6.85 (2 H, s, NH), 4.126 (2 H, d-d, 3J1(H,H) = 4.50 Hz, 3J2(H,H) = 4.04 Hz, T1=1.36 s, C-H), 2.79 (2 H, d-d, 3J1 (H,H) = 4.50 Hz, 2J3(H,H) = 16.137 Hz, T1 = 0.68 s, H-CH), 2.72 (2 H, d-d, 3J2 (H,H) = 4.04 Hz, 2J3 (H,H) =16.137 Hz, T1 = 0.68 s, HC-H), 2.80 (6 H, s, T1 = 1.27 s, NCH3) MW=256.26 ESI-MS m/z: 257.2 [M + H]+ Analízis a C10H16N4O4 összegképletre számítva: C= 46.87% H= 6.29% N= 21.86%: Talált :C= 46.69% H= 6.35% N= 21.80%
3.3
Vékonyréteg kromatográfia. A foltok felcseppentését Camag Nanomat 4 készülékkel végeztük. Az észterszármazékok
vizsgálatához Merck silica gel GF54 réteget (rétegvastagság 0.1 mm) és benzol / metanol (4:1 V/V) eluenst használtunk. Az NMA-t és amid származékait cellulóz rétegeken (Macherey-Nagel Polygram Cel 300, rétegvastagság 0.1 mm, 20 x 20 cm A; Merck HPTLC-cellulóz réteg 10 x 10 cm B) választottuk el. Az alkalmazott eluens rendszerek a következők voltak: n-butanol / ecetsav / víz (60:15:25 V/V) (a), illetve 2-propanol / 2-butanon / 1M HCl (60:15:25 V/V) (b). Futtatási távolság: 15 cm. A foltok előhívására Ph.Hg.VIII. 2% ninhidrin reagenst permeteztünk a rétegre, majd szárítószekrényben 120 – 140 °C-on 10 percig hevítettük. A ninhidrines kezelés előtt valamennyi rétegről denzitogramot készítettünk Shimadzu CS-9301PC denzitométerrel. A metilamin addíciós reakciók követése UV detektálással történt, az aktivált kettős kötést tartalmazó kiindulási anyag elfogyását az UV aktív folt eltűnése jelezte.
3.4
Az NMA és az amid származékok protonálódási állandóinak meghatározása
3.4.1 Potenciometriás titrálások A mérőcella hőmérsékletét Cole-Parmer folyadéktermosztáttal 0,1 °C pontossággal 25 °C-on tartottuk. A titrálást Metrohm 716 DMS titrino autobürettával és a hozzá csatlakoztatott Metrohm 6.0234.110 típusú kombinált üvegelektróddal végeztük. A titrálási görbék 50-90 adatpontot tartalmaztak. Az elektród kalibrálását hidrogénion koncentráción alapuló pH skálára végeztük üres titrálással [Irving és mtsai 1967; Leggett 1986]. Ennek során 5 ml 0.05 M koncentrációjú, faktorozott HCl törzsoldatot titráltunk 0.05 M faktorozott NaOH törzsoldattal. A protonálódási állandók meghatározásához a vizsgálandó anyag pontosan mért mennyiségét a HCl
46
törzsoldatban oldottuk, majd a NaOH törzsoldattal titráltuk. A bemérést úgy terveztük, hogy a ligandum koncentrációja 0.01 M legyen. A titrált oldatok és mérőoldatok ionerősségét a szükséges mennyiségű NaCl hozzáadásával állandó (0.15 M) értéken tartottuk. A titrálások kiértékelését, a koncentráció alapú protonálódási makroállandók kiszámítását Szakács Zoltán nemlineáris regressziós paraméterillesztésre alkalmas programjával, a PROTCvel végeztük [Noszál és Szakács 2003]. 3.4.2
1
H NMR pH-titrálások
A pH mérése az NMR csőben. Az egycsöves 1H NMR pH-titrálások in situ pH mérése során az NMR-csőben uralkodó pH-t a megfelelő indikátormolekula aktuális kémiai eltolódásából számítottuk a 2.5 egyenlet felhasználásával, így a pH-ra vonatkozó információt a felvett spektrum tartalmazza [Szakacs, Hägele, Tyka 2004]. A módszer lehetővé teszi, hogy a törzsoldat pH-ját a mérőoldat adagolásával folyamatosan, a spektrumok felvétele között változtassuk.
A mérések körülményei. A titrálandó oldatok összetételének és pH-jának, valamint a titrálás során adagolt mérőoldat mennyiségének tervezésére, illetve becslésére Szakács Zoltán PROTCSIM programját alkalmaztuk [Szakács 1998]. Az NMR spektrumok felvételét 600, illetve 500 MHz Varian Inova Unity készüléken végeztük. Az NMR titrálások egységesen 5 mm-es NMR csőben történtek, a titrálandó oldatok kiindulási térfogata egységesen 0.6 ml, a mért ligandumok koncentrációja pedig 0.02 M volt. A kémiai eltolódásokat 0.5 mM koncentrációjú DSS belső referensre vonatkoztattuk. A titrált oldatok és mérőoldatok ionerősségét a 0.1 – 0.12 M NaCl hozzáadásával állandó (0.15 M) értéken tartottuk, a lock jelet 3 V/V% D2O biztosította. A mérési hőmérséklet állandó értéken (25 ± 0.1 °C) tartását az NMR készülék megfelelő beállításával biztosítottuk. A H2O rezonanciajelének csökkentésére előtelítő (presaturation) pulzust [Hoult 1976] alkalmaztunk (500 MHz Varian Inova Unity készüléken a paraméterek: presat program, satpwr = 10, satdly = 4 s, 600 MHz Varian Inova Unity készüléken a paraméterek: presat program, satpwr = 0-1, satdly = 3 s). Titrálószernek 0.005 – 0.15 M NaOH, illetve 0.005 – 0.15 M HCl oldatokat használtunk, számított mennyiségeiket (3 – 20 μl) Hamilton fecskendővel adagoltuk az NMR csőbe, majd homogenizálás után a spektrumokat regisztráltuk. A műveletet a megfelelő titrálási pontsűrűség
47
eléréséig (15 – 30) ismételtük. A titrálószerek a mért ligandumot is tartalmazták 0.02 M koncentrációban a hígulás kiküszöbölésére. A többértékű vegyületekkel (NMA és a két monoamid) külön titrálást végeztünk a savas, illetve bázikus tartományban a jobb reprodukálhatóság érdekében. A spektrumok kiértékelésével nyert adatpárokra (pH / ligandum megfigyelt magjának kémiai eltolódása ppm egységben) a Statistica 6.0 program* nemlineáris paraméterillesztő moduljának alkalmazásával illesztettük a megfelelő függvényt. Ha a protonálódási lépések átfednek (log K2 - log K3 < 3), az egyensúlyi állandókat legpontosabban a többváltozós nemlineáris regresszió szolgáltatja, amit a Microcal Origin 6.0 programmal végeztünk**. Az alábbiakban összefoglaljuk az egyes vegyületek titrálása során alkalmazott indikátormolekulákat, a kiindulási pH beállításához használt sav vagy lúg koncentrációt, valamint a kiindulási és végső pH értékeket.
NMA savas tartomány (pH 6.65 – 0.83): 4 mM diklórecetsav, 2 mMklórecetsav, 1 mM ecetsav, 1 mM TRIS, 0.026 M NaOH.
NMA bázikus tartomány (pH 6.58 – 13.23): 1 mM ecetsav, 1 mM TRIS, 0.5 mM trimetilamin, 0.01 M NaOH.
NMA-α-amid savas tartomány (pH 6.51 – 1.12): 2 mM klórecetsav, 1 mM ecetsav, 1 mM TRIS, 0.01 M NaOH.
NMA-α-amid bázikus tartomány (pH 5.07 – 12.81): 1 mM ecetsav, 1 mM TRIS, 0.5 mM trimetilamin.
NMA-β-amid savas tartomány (pH 7.72 – 0.72): 4 mM diklórecetsav, 2 mM klórecetsav, 1 mM ecetsav, 1 mM TRIS, 0.01 M NaOH.
NMA-diamid bázikus tartomány (pH 6.57 – 13.23): 1 mM ecetsav, 1 mM TRIS, 0.5 mM trimetilamin, 4 mM 1H-imidazol, 0.013 M HCl.
* StatSoft, Inc. (2001). STATISTICA (data analysis software system), version 6. www.statsoft.com. ** www.OriginLab.com 48
4
A KÍSÉRLETEK EREDMÉNYEI ÉS ÉRTÉKELÉSÜK
4.1
Az NMA molekula és a további kísérletekben vizsgált származékok spektroszkópiás és kromatográfiás tulajdonságainak ismertetése Az NMA molekula rövid, négy szénatomos lánccal és három sav-bázis csoporttal
rendelkezik. A nem ionizált aminosavban az alfa szénatomhoz egy karboxil-, és egy Nmetilamino-csoport, míg a béta szénatomhoz egy karboxil-csoport kapcsolódik. A továbbiakban a protonálódási folyamatok pH függő vizsgálata a molekula legbázikusabb formájából (L2-) indul ki. A három ionizálható csoport jelenléte és közelsége okozza a molekula egészének erősen hidrofil jellegét és magas olvadáspontját. Vízben szinte korlátlanul, dimetil-szulfoxidban és metanolban közepesen, más szerves oldószerekben egyáltalán nem oldódik.
NMR spektroszkópia. d6-DMSO-ban, valamint D2O – víz elegyekben felvett 1H NMR spektrumán karakterisztikus jelleggel csak a szénkötésű (nem cserélődő) hidrogének bírnak. Az N-metil jel egy háromszoros intenzitású szingulet, a metilén (A és B) valamint metin (X) hidrogének ABX spinrendszert alkotnak. Vizes oldatokban pH változás hatására az A és B hidrogének kémiai eltolódása eltérő „sebességgel” változik, és pH 2.28-nál a két kémiailag nem ekvivalens mag nyolcszoros multiplicitású AB jele egy dubletre egyszerűsödik a létrejött izokrónia miatt. A pH savas vagy bázikus irányba történő eltolódására ismét megjelenik az AB multiplet (4.1. ábra). A protonálódási mikroállandók meghatározásához (4.4.1. fejezet) felhasznált amid származékok D2O-ban felvett spektruma hasonló, d6-DMSO-ban viszont megjelennek az amidcsoport(ok) lassan cserélődő NH jelei. Annak eldöntésére, hogy az amid-csoport, illetve észter-csoport alfa vagy béta helyzetű, fázisérzékeny 2D heteronukleáris szén – hidrogén korrelációs méréseket (HMBC) végeztünk. Az NMA-β-amid HMBC spektrumán három kötéses korreláció látható az egyik amid hidrogén (7.05 ppm) és a metilén szén (34 ppm) között (4.2. ábra), míg az NMA-α-amid HMBC spektrumán az amid hidrogének a metin szénatommal adnak három kötéses korrelációt. Az észter származékok HMBC felvételén az O-metil hidrogének jelölték ki a három kötés távolságra található α- vagy β-karbonil szénatomot.
49
pH= 0.13
pH= 2.28
pH= 7.36
4.3
4.1. ábra
4.1
3.9
3.7
3.5 3.3 δ (ppm)
3.1
2.9
2.7
2.5
Az NMA 1H NMR spektruma három különböző pH-n.
A szintetikus reakciók nyers termékei gyakran tartalmazták az NMA-t és a monoamidokat különböző arányokban. Szükség volt tehát egy rutinszerűen végezhető, gyors spektroszkópiás
módszerre
a
komponensek
azonosításához
és
relatív
1
H NMR
mennyiségeik
összehasonlításához. A szénkötésű protonok kémiai eltolódásainak eltérései a különböző származékok esetében nem jellegzetesek. Ennek oka, hogy a szomszédos funkciós csoportok ionizáltsági állapota jelentősebb hatást gyakorol a kémiai eltolódásra, mint a kémiai szerkezetek közötti eltérések. Hasonló nagyságú eltérések tapasztalhatóak deuterált DMSO-ban felvett spektrumok esetében is, attól függően, hogy a szabad aminosavat, illetve annak nátrium vagy hidroklorid sóját vizsgáljuk. Az amid NH jelek ugyan megjelennek 7 – 8 ppm körül, ez azonban önmagában nem elég a szerkezet biztonságos azonosításához. Mindkét oldószerre jellemző, hogy az egyes komponensek különböző protonáltsági állapotokban lehetnek jelen, az egyedi reakciótermékekben eltérő arányokkal. A nehézség kiküszöbölésére DCl-al, illetve NaOD-vel szabályozott kémhatású deutériumoxidot használtunk NMR oldószerként. A 4.1. táblázat adatait
50
felhasználva, egy elegy 1H-NMR spektrumát két pD értéknél (13 illetve 1) felvéve mindhárom komponens jelenléte megerősíthető, illetve kizárható.
4.2. ábra
Az NMA-β-amid HMBC spektrumának részlete. A metilén szénatom (34 ppm) az egyik amid NH (7.05 ppm), az N-metil hidrogének (2.5 ppm) a metin szénatommal (59 ppm) mutatnak három kötéses korrelációt.
4.1. táblázat pD
Különböző kémhatású D2O oldatokban mért metin hidrogén kémiai eltolódások δx (ppm) NMA
NMA-α-amid
NMA-β-amid
1
4.32
4.26
4.24
13
3.29
3.43
3.29
7
3.73
4.11
3.84
51
Tömegspektroszkópia. Az NMA-származékok tömegspektroszkópiás vizsgálatához a legalkalmasabbnak
az
elektronspray-ionizációs
technika
(ESI-MS)
bizonyult.
A
tömegspektrumok felvétele Thermo Finnigan LCQ Advantage LC / MS spektrométeren történt, elektrospray ionizációval (ESI pozitív vagy negatív ion módban). Az acetonitril-metanol-víz elegyben néhány μmol mennyiségben oldott vizsgálandó anyagok az oldószer víz hatására pozitív, illetve negatív töltés(ek)kel rendelkező ionokká alakulnak, amelyek az oldat elporlasztása után detektálhatóak. A molekulaionok tömegéből számolt molekulatömegek alapján lehetett például az NMA-t (M=147) az NMA-monoamidoktól (M=146), monoészterektől (M= 161), az NMA-diamidtól (M=145) a metilamino-szukcinimid-gyűrűtől (M=128) megkülönböztetni.
Vékonyréteg kromatográfia. Az aminosavak vékonyréteg kromatográfiás analízisében használt módszerek irodalmi áttekintése alapján általánosságban megállapítható, hogy rokon szerkezetű vagy izomer, oldalláncban sav- és / vagy amid-funkciót tartalmazó aminosavak vékony-réteg kromatográfiás (VRK) elválasztására szilikagél alapú rétegek kevéssé alkalmasak. A cellulóz állófázisú VRK rendszerekre jellemző viszont a hosszú, 3 – 4 órás kifejlesztési idő. Az is nehézséget okoz, hogy az irodalomban nem található olyan eluens-rendszer, amelyben valamennyi, általunk vizsgált komponens egy, vagy akár többszöri egy dimenziós kifejlesztéssel elválna egymástól. A hivatkozott rendszerek [Benoiton 1962; Chambers és Carpenter 1955] ezen kívül főleg biogén aminosavakra, illetve egyéb, de nem N-metil származékokra vonatkoznak. Az NMA azonosítására használt, Watkins munkájában található [Watkins 1962] papírkromatográfiás rendszer viszont a rokon szerkezetű amidoktól való megkülönböztetésre nem alkalmas. Célul tűztük ki tehát olyan rendszerek kidolgozását, amelyekkel valamennyi, általunk vizsgált N-metil származék, a kiindulási anyagok, és izolálható intermedierek egymástól megkülönböztethetőek. Igyekeztünk a kifejlesztés idejét lerövidíteni, hogy lehetővé váljon a reakciók időbeni lefutásának, kinetikájának, valamint a képződő közti- illetve melléktermékeknek a vizsgálata. Az általunk vizsgált, rokon szerkezetű aminosav-származékok fizikai-kémiai tulajdonságai nagymértékben hasonlítanak, ezért elválasztásuk csak megoszláson alapuló rendszerekben valósítható meg, a jobb reprodukálhatóság érdekében tehát úgy optimáltuk a rendszereket, hogy kizárólag megoszláson alapuljon az elválás, az adszorpciós folyamatok ne játszanak számottevő szerepet. Első lépésben a vizuális előhívást optimáltuk. A származékok többsége nem rendelkezik számottevő mértékű UV elnyeléssel 220 nanométer felett, 220 nm alatt viszont az alkalmazott
52
eluensek, sőt, a rétegek is nagymértékű elnyelést mutatnak, ezért a foltokat közvetlenül UV lámpa alatt detektálni nem lehetett. A legmegfelelőbb általános előhívó reagensnek a Ph.Hg.VIII. által alkalmazott ninhidrines oldat bizonyult. Az előhívás technikája azonban módosításra szorult, mivel a ninhidrin eltérő módon viselkedik a különböző anyagokkal szemben, amit az alkalmazott réteg is jelentősen befolyásol. Egy adott komponens különböző színű foltok formájában jelenik meg a különböző állófázisokon. A ninhidrines permetezést szárítószekrényben történő hevítés kíséri, aminek a pontos hőmérsékletét minden esetben külön optimálni kellett. Az általunk alkalmazott cellulóz rétegeken az NMA foltja már néhány perc alatt 80 – 90 0C-on megjelent, ezzel szemben az amidok csak 130 – 140 0C-os hőmérsékleten, hosszabb idő alatt váltak láthatóvá. Az előhívást meggyorsítaná a még magasabb hőmérséklet, ekkor viszont a félpreparatív célokra alkalmazott MN300-cellulóz réteg olyan mértékben megsötétedik, ami lehetetlenné teszi a kiértékelést. A 170 0C-os előhívást tehát csak a reakciók követéséhez használt Merck HPTLC rétegeken alkalmazhattuk. Az álló-, és mozgófázis rendszerek kidolgozását az irodalomban található, aszparaginsav,
aszparagin,
izoaszparagin,
különböző
N-metil-aminosav
komponensek
elválasztására alkalmas VRK módszerek vizsgálatával kezdtük. Az N-metil-aszparaginsav elválasztható az aszparaginsavtól t-butanol – ecetsav – víz (70 : 15 : 15) papírkromatográfiás rendszerben [Watkins 1962]. Hasonló eluens rendszerrel (n-butanol – ecetsav – víz / 60 : 15 : 25;
a rendszer) az izoaszparagin és az aszparagin is elválasztható egymástól [Benoiton 1962]. A fenti futtatóelegy MN-300 cellulóz rétegen alkalmazva kísérleteink szerint alkalmas az NMA-β-amid és az NMA-α-amid elválasztására. Az NMA Rf értéke azonban ebben a rendszerben nem különbözik szignifikánsan az NMA-α-amid Rf értékétől. Ez a rendszer tehát nem alkalmas önmagában az NMA-ból kiinduló, α-amid szintézisére irányuló szintetikus reakciók nyomon követésére. Alkalmas viszont az NMA-β-amid szintézisek kiértékelésére, mivel a termék elválik az esetleges NMA-α-amid, illetve NMA szennyezőktől. Az aszparaginsav és az aszparagin megkülönböztetésére alkalmas a 2-propanol – butanon – 1 N sósav (60 : 15 : 25) (b) eluens rendszer MN-300 cellulóz (A) rétegen futtatva [Chambers és Carpenter 1955]. Az NMA-α-, és βamid az Rf értékek alapján ebben a rendszerben nem különíthető el egymástól, viszont mindkettő szignifikánsan elkülönül az NMA-tól (4.3. ábra). A fenti rendszerben a különböző észter származékok is elválnak az amidoktól, illetve az NMA-tól. Az (a) és (b) eluens rendszer egyaránt alkalmazható Merck HPTLC cellulóz (B) rétegen, ami lerövidíti a futási időt, lehetővé téve a
53
folyamatos reakciókövetést. A MN-300 rétegeket viszont a fél-preparatív technikák alkalmazásakor továbbra is alkalmaztuk. A vizsgált molekulák jelentős részénél nem rendelkeztünk referencia anyaggal, így a foltok azonosításához gyakran szükség volt félpreparatív mennyiségeket csík formában felvinni a rétegre. Az elválás után a rétegről eluált csíkokat tömeg, illetve NMR spektroszkópiás vizsgálatokkal analizáltuk. Az utólagos elúciót megnehezítette, hogy a legfontosabb termék, az NMA-α-amid rendkívül érzékeny a legtöbb oldószerre (pl. metanol), a bepárlás során általában szukcinimid gyűrűs intermedieren keresztül izomerizálódik. Az elúciót így vízzel, illetve deutérium-oxiddal végeztük és az oldatot közvetlenül vizsgáltuk. Hasonló nehézségek miatt nem próbálkoztunk folyadék-kromatográfiás elválasztás-technikák kifejlesztésével. 4.2. táblázat
Az aszparaginsav, az aszparagin, az izoaszparagin, az NMA, az NMA-α-amid-βmetilészter, az NMA-β-amid és az NMA-α-amid Rf értékei három kromatográfiás rendszerben. I. rendszer
II. rendszer
III. rendszer
Rf
Rf
Rf
aszparaginsav
0.51
0.50
0.41
aszparagin
0.33
0.31
0.33
izoaszparagin
0.31
0.29
0.41
NMA
0.54
0.61
0.36
NMA-β-amid
0.40
NMA-α-amid
0.38
NMA-α-amid-β-metilészter
0.85
0.25 0.41
0.36 0.84
I. rendszer: B réteg b eluens II. rendszer: A réteg b eluens III. rendszer: B réteg a eluens
54
I.
a
a+b
b
c
a+b
b
a+c
a+c
II.
a
III.
a
4.3. ábra
Az NMA (a), az NMA-β-amid (b) és az NMA-α-amid (c) elválasztása három
a+b
b
a+c
c
c
kromatográfiás rendszerben. A molekulák szerkezeti különbségei alapján megpróbáltuk értelmezni az egyes komponensek különböző rendszerekben tapasztalható viselkedését. Mindkét eluens rendszer savas karakterű, a metilamino csoport így minden vegyület esetében egységesen protonált állapotban vándorol. Az erősen savas (b) rendszer az NMA, valamint az amidok valamennyi karboxil-csoportjának savi disszociációját teljesen visszaszorítja, és mivel az amid-csoport erősebb hidrogén-kötéses kölcsönhatásra képes a réteg hidroxil-csoportjaival mint a karboxil-csoport, ezért a monoamidmonosav molekulák egymással megegyező, ám a dikarbonsav NMA-nál jóval kisebb Rf értékkel rendelkeznek. A gyengén savas közegű (a) rendszerben az NMA alfa sav csoportja ionizált, ám a
55
béta karbonsav csoport protonált állapotban van. Hasonlóan ikerionos szerkezetű az NMA-βamid, míg az α-amid csak a metilamino-csoport pozitív töltésével rendelkezik, és kevésbé kötődik a réteghez, így Rf értéke is nagyobb. A monoészterek a (b) rendszerben az NMA-nál lényegesen nagyobb Rf értékkel rendelkeznek, a diészterek pedig gyakorlatilag a frontvonallal együtt futnak, ami a hidrogén-kötésre képes karbonsav, illetve −amid funkciók hiányával magyarázható. A komponensek Rf értékeit a 4.2. táblázat tartalmazza.
4.2
Az NMA, valamint amid és észter származékainak előállítása
A célként kitűzött amid származékok szintetikus előállítása közben intermedier termékekként a monoésztereket is előállítottuk. A preparatív eljárások egy részében a kiindulási anyag az NMA, kidolgoztunk tehát egy gazdaságos és hétköznapi alapanyagokból elvégezhető preparatív NMA szintézist. 4.2.1 Az NMA előállítására alkalmas reakciók áttekintése A 2-bróm-borostyánkősav (1) és ammónium-hidroxid szubsztitúciós reakcióján (4.4. ábra) alapuló eljárás [Watkins, 1962] kitermelése a körülményes feldolgozás után meglehetősen alacsony (67 %), a terméket ugyanis utólag, preparatív kromatográfiával lehet a melléktermékektől, kiindulási anyagoktól megtisztítani.
O
O
Br OH
NH4OH
H N OH
OH
OH
O
O
1
NMA
4.4. ábra
NMA előállítása 2-bróm-borostyánkősavból
Gyakorlati célokra is alkalmas szintézis módszerek a különböző telítetlen dikarbonsav származékok Michael addíciós reakciói. Az egyetlen szabadalmi eljárás maleinsav-anhidrid (2)
56
vizes közegű reakciója metilaminnal [Reppe és Ufer, 1937]. A maleinsav-anhidrid a legerélyesebb filodién komponens, amely magános elektronpárral rendelkező nukleofil ágensekkel, köztük primer és szekunder aminokkal képes ún. Michael addíciós reakcióba (Nnukleofilek konjugált addíciója aktivált kettős kötésekre) lépni. A reakciópartner az aktivált kettős kötésre addícionálódik racém aminosav származékok képződése közben. A maleinsavanhidrid vizes közegű reakciója metilaminnal (4.5. ábra) egy hetes (szabadalmi recept!!) forralás után vegyes terméket eredményez, amely főként az addíciós reakcióban keletkezett metilaminoszukcinanhidrid (3) gyűrű hidrolízisével képződő NMA-ból, és a metilamino-szukcinanhidrid aminolíziséből származó NMA-N-metilamidokból (4a, 4b) áll (4.5. ábra). A kiindulási anhidrid közvetlen hidrolitikus gyűrűnyitása maleinsavat (5) eredményez, ami nem képes addícionálni a metilamint, csak sóképzés következik be. Az addíciós reakciót követő lúgos hidrolízis szintén maratoni forralás után 15 órás reakcióban gyenge hozammal szolgáltatja az NMA-t. A hosszú reakcióidő alatt képződő bomlástermékektől derítéssel és vizes átkristályosítással lehetett megtisztítani a végterméket, amely további jelentős anyagveszteséget okoz. Az N-metilamidok hidrolízise a végtermékhez (NMA) vezet, viszont a maleinsav csak többszöri vizes átkristályosítással távolítható el, amit a termék UV aktivitásának megszűnése jelez. O
O
O
H N
O
CH3NH2
O
H N O
H2O
O
H2O
2 H2O
3
O
O
O
NMA
CH3NH2
OH
O
O
O
H N O H N
O O O
5
4.5. ábra
NaOH
H N N H O
+
O
O
4a
4b
Az NMA előállítása maleinsav-anhidridből
A fentiek mutatják, hogy vizes közeg alkalmazása több szempontból előnytelen, lassítja az addíciós reakciót, hidrolitikus melléktermékeket eredményez. A maleinsav-anhidrid 57
reaktivitása szintén elősegíti a mellékreakciókat. Az oldószer és / vagy a kiindulási anyag megváltoztatása tisztább és egységesebb reakció lefutást eredményezhet. Maleinsav-anhidrid fél óra melegítés hatására metanolban maleinsav félészterré (6) alakul (4.6. ábra), amely piridinben feloldva metilaminnal lép addíciós reakcióba [Zilkha és Bachi 1959]. Ebben az esetben az észter csoport aktiválja a béta helyzetű szénatomot és régióspecifikusan, kvantitatív hozammal az NMA-β-metilészter (7) képződik (A módszer). Az észter vizes hidrolízissel, egy órás reakcióidővel NMA-vá alakítható. Ebben a reakcióban is probléma azonban a maleinsav metilészter fokozott hajlama gyűrűzárási és amidképződési reakciókra, ami a hozamot és a végtermék tisztaságát jelentősen lerontja.
O
O
CH3
MeOH
OH
30 perc
O
O
CH3NH2.HCl, Piridin HN
NaOH
OH O
CH3 Et3N, 100 °C, 3 óra
O
CH3
O
CH3
HN
OH
H2O
OH
O
O
O
O
2
6
7
NMA
4.6. ábra
NMA-β-metilészter előállítása maleinsavanhidridből
A fumársav származékok NMA szintézisben való felhasználására vonatkozó irodalmi adatokat nem találtunk, a maleinsav fumársavvá történő izomerizációja viszont régóta tanulmányozott jelenség [Pfeiffer 1914]. A maleinsav származékok savas és bázikus katalízissel, vagy
szobahőmérsékleten
nyomnyi
jód
jelenlétében
gyorsan
átalakulnak
fumársav
származékokká [Patai és Rapoport 1964]. Nagyszámú közlemény foglalkozik a szubsztituált akrilátok izomerizációjának kinetikai vizsgálataival [Davies és Wales 1963; Grünbaum és mtsai 1966], köztük számos tanulmány vonatkozik a maleinsav dimetilészter fumársav dimetilészterré történő átalakításával termikus és báziskatalizált folyamatokban [Nozaki 1941]. A legutóbbi évekig számos reakciómechanizmust írtak le és a reakció köztitermékeinek és mechanizmusának igazolása mind a mai napig vizsgálatok tárgya [Cook 2000]. Érdemesnek tartottuk tehát a maleinsav-származékok helyett fumársav-származékok közvetlen kipróbálását metilamin addíciós reakciókban, elképzelhető ugyanis, hogy a maleinsav
58
származékok metilaminnal történő addíciós reakcióiban a bázis katalizálta izomerizáció a bevezető lépés (4.7. ábra).
O
_ H3C
NH2
OCH3
+
O
H H3C
N+ OCH3
H -
OCH3 O
O
O OCH3
H3C
NH2
+
CH3O
4.7. ábra
N+ OCH3
H CH3O
O
O
H H3C
_
OCH3
H
H O
Maleinsav dimetilészter bázis katalizált E/Z izomerizációja
A fumársav metanolos oldatában kénsavas katalízissel előállított fumársav dimetilésztert (8) piridinben oldottuk, majd metilamin-hidrokloridot szuszpendáltunk az oldatban. A metilamint trietilamin lassú adagolásával fokozatosan szabadítottuk fel. A reakciókörülmények részletesebb vizsgálata (hőmérséklet, koncentráció, aminfelesleg, adagolás sebessége) alapján kidolgozott reakció-feltételek mellett három órás reakcióidővel, 100 oC-on, 2.5-szeres metilamin felesleg alkalmazásával, kvantitatív hozammal jutottunk az NMA-dimetilészterhez (9) (A módszer, 4.8. ábra). Az olajos észter származék tiszta, amin mentes, és 1H-NMR spektrumán 4 ppm felett nem látható jel, ami igazolja a fumársav-észter kettős kötésének teljes átalakulását, valamint UV aktív szennyezés sem mutatható ki vékonyréteg kromatográfiával. Nem találhatók az észtercsoport esetleges amidálása útján képződő N-metil-amid származékok sem, mert az amin felesleg az adott reakció-feltételek mellett fokozatosan kidesztillált a reakcióelegyből. Az NMAdimetilészterét híg lúgos hidrolízissel alakítottuk NMA-vá. A vizes oldatot semlegesítés után erősen savas ioncserélő gyantán sómentesítettük piridin – víz 1:1 mólarányú keverékét használva eluensnek. A termékből és egy referencia anyagból (nátrium-acetát) pontos bemérést készítve az 1
H-NMR spektrumok integráljai alapján az NMA monohidrát tisztasága 100 ± 2%. 59
O
O
O O
CH3
H N
O
A vagy B H3C
O
H N
CH3 5% NaOH
OH
H3C
OH
O
H3C
CH3
9
8
O
60 °C, 1 óra O
O
A: CH3NH2.HCl, Piridin, Et3N, 100 °C, 3 óra; B: CH3NH2, EtOH, 0 °C, 1 óra
4.8. ábra
NMA
Az NMA előállítása Fumársav dimetilészterből
Fumársav dimetilészter és ekvivalens mennyiségű metilamin etanolos oldatban, 0 °C-on 1 óra alatt kvantitatív reakcióban szintén NMA dimetilészterré alakítható (B módszer). Hasonló feltételek mellett az NMA-β-metilészter (7, B módszer) is előállítható fumársav (10) monometilészterből (4.9. ábra, A sor).
O
OH O
B
H3C
H N
OH
A
O O CH3O O
B O
O
10 H N OH A vagy B H3C
OH
NH2
NH2
11
O NMA-β-amid
i
O NH2 OCH3
O
7
O
O
C
CH3
13
H N B
NH2
H3C
O
14
i
H3C
O
H N
NH
CH3
12
O
O
A: CH3NH2.HCl, Piridin, Et3N, 100 °C, 3 óra; B: CH3NH2, EtOH, 0 °C, 1 óra; i: 10% Na2CO3, 60 °C, 1 óra
4.9. ábra
Metilamin szelektív addíciója szubsztituált akrilátokra.
60
4.2.2 Az NMA-β-amid előállítása N-alkil-aszparaginok előállítására általánosan használható eljárás maleinsav monoamid és a megfelelő N-alkil-amin vagy ammónia (utóbbi az esetben aszparagint kapunk) Michael addíciós reakciója (4.9. ábra, B sor). Az észtercsoporthoz hasonlóan az amidcsoport kettős kötésre gyakorolt aktiváló hatása is erősebb, mint a szabad karboxil-csoport hatása (az ionizált karboxilát ugyanis dezaktivál), ezért jelen esetben is β-amidok képződnek. Az irodalomban hozzáférhető recept szerint piridinben oldott maleinsav-monoamid (11) reagál melegítés közben metilaminnal [Liwschitz és mtsai 1956]. Az általános eljárás azonban a metilamin illékonysága miatt nem produktív az N-metil származékokra. Az egyik megoldás (A módszer) jelen esetben is ekvivalens metilamin-hidroklorid alkalmazása és a bázis felszabadítása cseppenként adagolt trietil-aminnal 100 °C-os piridinben. Az oldószert etanolra, a reagenst pedig etanolos metilaminra változtatva (B módszer) szintén sikerült az NMA-β-amidot előállítani, gondoskodni kellett azonban a reakció hűtéséről, illetve 0 °C-on tartásáról. Amennyiben ugyanis az 1 éjszakás reakcióidő alatt a hőmérséklet 25 0C fölé emelkedett, számos mellékreakció lépett fel. 4.2.3 Szubsztituált szukcinimid gyűrű kialakulása és hidrolízise A metilamino-szukcinimid gyűrű szelektív hidrolízisével elvileg megvalósítható az NMA monoamid származékok előállítása. Másrészt viszont a gyűrűzárási, majd felnyílási reakció lehetővé teszi az alfa és béta izomerek egymásba alakulását, ami az egyes monoamidok szelektív preparatív előállítását meghíusíthatja. Tanulmányoztuk tehát a gyűrű zárás és nyitás lehetőségeit és szelektivitását különböző körülmények között. A szukcinimid képződését számos környezeti faktor befolyásolja, például pH, a hőmérséklet, a dielektromos állandó, stb. Már Bruckner klasszikus összefoglalójában kiemeli az aszparaginsav különleges hajlamát e nem kívánatos mellékreakciókra. [Bruckner 1993]. Különösen könnyen, már szobahőmérsékleten enyhén lúgos közegben (0.1 N ammóniumhidroxid) bekövetkezik az aszparaginsav-észterek és az aszparagint tartalmazó peptidek dezaminálódása ill. ciklizációja [Oliyai és Borchardt 1994; Nabuchi és mtsai 1997]. A gyűrűs imid további lúg hatására parciális hidrolízissel kétféleképpen nyílhat fel. A fő
61
termék az aszparagin, semleges oldatban 3 : 1 arányban képződik az izoaszparaginhoz képest. Kísérleteink tanúsága szerint vizes oldatban az arányok a metilamino-szukcinimid gyűrű (12) felnyílására is érvényesek (4.10. ábra). O H N H3C
NH2
-H2O
H3C
H N
H2O NH
OH O NMA
4.10. ábra
O
O
O
H N
H N H3C
H3C
OH
NH2
+
OH
NH2 O
12
O
O NMA-β-amid
NMA-α-amid
75 %
25 %
3-metilamino-szukcinimid képződése és hidrolízise
A szukcinimidképződés fiziológiai jelentőségét mutatja, hogy a szervezet egy specifikus helyreállító mechanizmust hozott létre az aszparagin és aszparaginsav oldalláncok kémiai reaktivitásának következtében kialakuló aminosav szekvenciális átalakulások biokémiai és fiziológiai következményeinek felszámolására [Aswad és mtsai 2000]. Az aszparagin és aszparaginsav oldalláncok ugyanis hajlamosak szukcinimid gyűrű képzésére a peptidkötés nitrogénatomjával. A gyűrű felnyílásának fő terméke az izoaszpartil aminosav (megfelel a βamidnak), ami az egész peptidláncot egy metilén csoporttal meghosszabbítja, teljesen felborítva ezzel a fiziológiás térszerkezetet. (4.11. ábra) A helyreállító mechanizmus hiánya növekvő stresszérzékenységhez, sejt szinten apoptózishoz vezet, és jellemzően rövid túlélést tesz csak lehetővé. Az elektronegatív metil-amino (-ammónium) szubsztituens hatása következtében tehát az α-karbonil-szénatom nukleofil ágensekkel szemben reaktívabb. Ennek következménye, hogy a metilamino-szukcinimid gyűrű hidrolízise az NMA-β-amidot, a metilamino-szukcinanhidrid aminolízise viszont szelektíven az NMA-α-amidot eredményezi.
62
4.11. ábra
Szukcinimid gyűrű képződése és felnyílása peptidekben [Aswad és mtsai 2000]
Az izoaszparagin (és NMA-α-amid) reaktivitása, sokrétű átalakulási hajlama megnehezíti a szintetikus reakciók kivitelezését. A legtöbb nehézséget a (metilamino-)szukcinimid gyűrű kialakulása és újra felnyílása okozza, ilyenkor ugyanis semleges vagy bázikus közegben a hidrolízis fő terméke a termodinamikailag kedvezményezettebb aszparagin (NMA-β-amid). A kereskedelmi forgalomban beszerezhető izoaszparagin mindig tartalmaz aszparagin szennyezést, az izomerizálódás tehát még a szubsztanciában is végbemegy. A szukcinimid gyűrű kialakulását elősegíti az N-metil csoport jelenléte, így az NMA-α-amid még az izoaszparaginnál is instabilabb. Katalizálja a gyűrűzárást szinte valamennyi oldószer, amelyben a termék egyáltalán oldódik (metanol, izopropanol, dioxán). Az egyetlen lehetőség a termék izolálására a semleges kémhatású vizes oldatból történő kíméletes bepárlás, mivel a hidrogén- és hidroxid-ionok, valamint a túl magas hőmérséklet egyaránt katalizálják a gyűrűzárást. Ezzel magyarázható, hogy a szelektív szintetikus reakciókban képződő szubsztancia utólagos tisztítási kísérletei (átkristályosítás, kromatográfia), a termék elbomlásához vezetnek.
63
4.2.4 NMA-α-amid előállítása A savamid és az észter csoport közötti reaktivitás-különbség alapján feltételeztük, hogy a maleinsavamid metilészter (13) Michael addíciós reakciója metilaminnal NMA-α-amid-βmetilésztert (14) eredményez. (A maleinsavamid metilésztert metanolban, kénsavas katalízissel állítottunk elő maleinsav monoamidból.) A 0 °C-on, etanolos metilaminnal előállított NMA-αamid-β-metilésztert a következő lépésben, az észter-csoport enyhén bázikus hidrolízisével akartuk NMA-α-amiddá alakítani. Az észter-csoport jelenléte azonban olyan mértékben elősegíti a metilamino-szukcinimid gyűrű kialakulásán és felnyílásán keresztül lejátszódó izomerizációt, hogy a keletkezett elegyben az NMA-β-amid volt a major komponens (4.9. ábra C sor). A vonatkozó szakirodalom alapján amino-nitrogénen alkilezett, tehát szekunder aminocsoportot tartalmazó aszparaginsav-α-amidok előállítása általában megvalósítható gyűrűs anhidrid intermedieren keresztül. A kiindulási anyag N-alkil-DL-aszparaginsavból jégecetes közegben ekvivalens mennyiségű acetil-klorid hatására erősen exoterm reakcióban vízkilépéssel N-alkil-DL-aszparaginsav-anhidrid-hidroklorid (15) keletkezik [Zilkha és Bachi 1959]. A keletkezett anhidrid-hidroklorid spontán kiválik az oldatból, vagy éterrel kicsapható. A metilamino-csoportot protonáltsága védi meg az acetilezéssel szemben (sóvédelem), és a 4.2.3. fejezetben leírtak értelmében irányító hatást fejt ki az anhidridgyűrű felnyílására. Az anhidrid vizes ammóniaoldattal reagálva N-alkil-dl-aszparaginsav-α-amidot eredményez. Az általános reakció az N-metil-aszparaginsav kivételével szinte valamennyi alkil-származék esetében megvalósítható. Az NMA esetében az alábbi problémák lépnek fel: •
A kiindulási anyag (NMA) a megfelelő hőmérsékleten (legfeljebb 20 0C) nem oldódik jégecetben megfelelő mértékben. A szilárd fázisban maradt NMA, illetve hidroklorid sója nem vesz részt a további reakciókban.
•
Magasabb hőmérsékleten a sóvédelem ellenére N-acilezési (ESI-MS m/z: 188 [MH]-) mellékreakciók, valamint dipeptidképződés (ESI-MS m/z: 275 [M-H]-) lép fel. Túl nagy acetil-klorid felesleg hatására NMA-ecetsav vegyes anhidrid (16) is képződik, ami aminolízissel NMA-diamiddá alakul (ESI-MS m/z: 145 [M-H]-).
•
Az
NMA-anhidrid-hidroklorid
és
a
maradék
kristályosodik ki a jégecetes – éteres fázisból.
64
NMA-hidroklorid
együtt
•
Az anhidrid gyűrű fokozott bomlékonysága következtében a cc. ammóniumhidroxid oldat hatására az aminolízissel párhuzamosan mindig történik hidrolízis, ami a kiindulási anyaghoz (NMA-hidroklorid) vezet.
•
A vizes oldatot még vákuum alkalmazásával is csak viszonylag magasabb hőmérsékleten (60 0C) lehet bepárolni, ami a jelen levő hidroxid-ionok és ammónia molekulák katalizáló hatásával együtt fokozza a szukcinimid gyűrű kialakulásának sebességét, ezáltal elősegíti az egyéb N-alkil származékokhoz képest is fokozottan instabil NMA-α-amid izomerizációját β-amiddá.
•
Az NMA-val és β-amiddal szennyezett NMA-α-amid tisztítása oldószeres átkristályosítással nem volt megoldható, egyrészt a komponensek rendkívül hasonló oldékonysági és fizikai-kémiai tulajdonságai miatt, másrészt mindig bekövetkezett az α-amid izomerizációja és bomlása.
Az irodalmi recept pontos betartásával kivitelezett reakció termékét két vékonyréteg kromatográfiás rendszerben (I és III. rendszer, 4.1. fejezet) vizsgálva a legfőbb szennyező a kiindulási anyag (NMA) mellett az NMA-β-amid volt. Az α- és β-amidok aránya denzitometriás kiértékeléssel 5:1-nek adódott. A nehézségek kiküszöbölésére a következő módosításokat hajtottuk végre (II. módszer, 4.12. ábra). Az NMA oldódását jégecetben ultrahanggal, illetve melegítéssel elősegítve telített oldatot készítettünk. Az elegyet 10
0
C-ra hűtve a nem oldódott szubsztanciát szűréssel
eltávolítottuk. Folyamatos hűtés és keverés mellett apró részletekben adagoltuk az acetilkloroidot. A reakció lejátszódása után (1 éjszaka) a 15 anhidrid-hidroklorid kiválását éterrel segítettük. Az aminolízist vizes ammónium-hidroxid helyett metanolos ammónia oldattal végeztük, elkerülve ezzel a hidrolitikus reakciókat. A metanolos oldatot alacsonyabb hőmérsékleten be lehet párolni, és vákuum hatására az ammónia feleslege is pillanatszerűen kiforr az oldatból.
Az alacsonyabb hőmérséklet és a vízmentes közeg kevésbé kedvez a
szukcinimid-gyűrű kialakulásán keresztüli izomerizációnak, ezáltal a termék β-amid szennyezést gyakorlatilag nem tartalmaz. A reakció mechanizmusának alátámasztására a 15 intermediert izoláltuk és szerkezetét 1
H-NMR és tömegspektroszkópiás adatokkal igazoltuk (lásd az előiratot). A végtermék
tisztaságát két réteg-kromatográfiás rendszerben (I és III. rendszer, 4.1. fejezet) vizsgáltuk, és megállapítottuk, hogy 10 %-nál kisebb mennyiségben tartalmaz NMA szennyezést. Az α-amid
65
szerkezetét tömegspektroszkópiával, illetve az 1H-NMR spektrum amid-NH jelei, valamint HMBC mérések alapján igazoltuk (4.1. fejezet).
O O
O S
H N
H3C
I
OH
H3C
H N
O
N O
OH
NH2
H3C
NH3
OH
OH MeOH O
O
O
II
NMA
17 O
O H N
O
H3C
+
-AcOH
NMA-α-amid
ii
H3C
O
NH2
O
OH
16
15
O
O
I: SOCl2, TEA, THF, -20oC; II: AcCl / AcOH, 10 °C
4.12. ábra
NMA-α-amid előállítása
A szelektív amidálást Leuchs-anhidrid köztiterméken (17) keresztül is sikerült megvalósítani. Az NMA és tionil-klorid között lejátszódó reakciót (I. módszer, 4.12. ábra) nagyon enyhe körülmények között (tetrahidrofurán oldószer, -20 °C, ekvivalens trietilamin) végeztük, hogy elkerüljük az öttagú szulfinamid gyűrű fokozott reaktivitásából származó mellékreakciókat. A gyűrűt a következő nukleofil reakcióban ammóniával felnyitva NMA-αamid képződik. A reakciót a köztitermék érzékenysége miatt csak 10 mmol nagyságrendben sikerült kivitelezni, nagyobb arányokban sokféle mellékreakció előzi meg az aminolízist, és a terméket nem sikerült izolálni. 4.2.5 NMA-diamid és 1,5-dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid előállítása A szukcinimid gyűrűk képződése és hasítása nukleofil reagensekkel széleskörűen tanulmányozott terület (4.2.3. fejezet), a 3-metilamino származék kialakításával és reakcióival
66
azonban viszonylag kevés publikáció foglalkozik [Maddaluno és mtsai 1992, Briere és mtsai 1997, Katritzky és mtsai 1998]. Az NMA-diamidot a 3-metilamino-szukcinimid gyűrű aminolízisével állítottuk elő. Az első lépés maleimid (18) és ekvivalens metil-amin kvantitatív reakciója metanolban 0 °C-on. A keletkezett 3-metilamino-szukcinimid (12) és metanolos ammóniaoldat reakciója egy éjszaka alatt egy nyolctagú gyűrűs diazocinon (19) származékot eredményezett (4.13. ábra). A reakció feltételezett köztiterméke a két kiindulási molekula reakciójában képződő N-metil-N-(Nmetilamino-aszpartil)-szukcinimid (20). O H N
NH2
H3C
NH2 O NMA-diamid ii
O H3C
i
O CH3
O
H N
N
O NH
NH
X N
18 O
12
NH2
O
H2N
O
CH3
O
21
iii
H2N CH3 O
NH2
O
H3C O O
N
N
NH O
O
N
H3C
NH
O
CH3
O
20
19
NH2
i: CH3NH2, EtOH,0 °C; ii: NH3, MeOH, 0 °C, 3 nap; iii: NH3, MeOH, 40 °C
4.13. ábra
Az
NMA-diamid
és
az
dikarbonsavdiamid szintézise
67
1,5-Dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-
A reakció végtermékének, az 1,5-dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid (19) szerkezetének igazolásakor az elsődleges információ (mint általában), a vegyület tömegspektroszkópiából meghatározott tömegszáma volt. A lehetséges izomerek számát a d6DMSO oldószerben felvett 1H NMR spektrumokkal szűkítettük. A két, nem-ekvivalens amid NH jel mindegyikének integrálja egységnyi. Az integrálok alapján az amid-H1, amid-H2, a metin, a metilén, és az N-metil jelek aránya 1:1:1:2:3, ami megfelel az NMA-monoamidok integrál arányainak. Az ekvivalens hidrogénektől származó jelcsoportok a molekula tökéletes szimmetriájára utalnak, a spektrumon ugyanis első ránézésre egyetlen ABX spinrendszer, valamint egyetlen N-metil szingulet látható. Csak az integrálok kiértékelése jelzi, hogy a jelek két, kémiailag és mágnesesen is ekvivalens molekularészletet takarnak. Figyelembe véve továbbá azt, hogy az N-metil jel az acilezett, és nem az alifás nitrogénekre jellemző (2.80 ppm), a nyílt láncú, valamint a nem szimmetrikus 7 tagú gyűrűs szerkezeteket kizárhatjuk. A fennmaradó két lehetőség a 4.13. ábrán látható diazocinon (19) vagy diketopiperazin (21) gyűrű. A kérdés eldöntéséhez először a molekula mozgékonyságára jellemző T1 relaxációs idő méréseket végeztünk (4.3. táblázat). 4.3. táblázat
T1 relaxációs idők a metilén, a metin és N-metil hidrogénekre az NMA-diamid és az 1,5-dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid molekulákban
NMA-diamid
diazocinon
T1 (sec)
T1 (sec)
X
4.36
1.27
AB
1.35
0.68
CH3-N
1.68
1.55
Az NMA-diamid T1 adatait tekintettük referenciának, mert a szénkötésű hidrogének analóg kémiai környezetben vannak. Az ABX spinrendszer valamennyi hidrogénjéhez jelentősen (50 – 70 %) kisebb T1 érték, ezáltal lecsökkent mozgékonyság tartozik az ismeretlen vegyületben, ami a nyolctagú gyűrűt valószínűsíti. A hattagú gyűrűben ugyanis a metilén hidrogének exociklusos helyzetűek, ezért az 50 %-os T1 idő csökkenés kevésbé valószínű. Elvégeztük a hat és nyolctagú gyűrűk geometriaoptimalizálását molekula-mechanikával (MM), és a stabil konformerek diéderes szögeit összevetettük az 1H NMR spektrumok vicinális
68
csatolási állandóiból a 2.10 egyenlet alapján számolt diéderes szögekkel. Az elméleti számításokban figyelembe vettük, hogy a metin szénatom kiralitáscentrum, ezért a gyűrű kialakításában részt vevő kiindulási molekuláknak (3-metilamino-szukcinimid) mindkét enantiomerje egyforma valószínűséggel reagál, így a lehetséges végtermék (mindkét gyűrű) összesen négy konfigurációval rendelkezhet (RR, SS, RS, SR). Ezek közül az RR és SS, valamint az RS és SR párok egymás enantiomerjei, tehát azonos geometriák rendelhetők hozzájuk. A nyolctagú gyűrű meglehetősen merev szerkezet a két savamidcsoport planáris geometriája miatt.
4.14. ábra
Az 1,5-dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid (19) optimalizált térszerkezete.
Az energetikailag legkedvezőbb geometriájú, SR (RS) konfigurációjú szerkezet (4.14. ábra) diéderes szögei, valamint az NMR csatolási állandókból számolt diéderes szögek kiváló egyezését mutatja a 4.4. táblázat. A hattagú diketopiperazin származék sokkal nagyobb konformációs szabadsággal rendelkezik, a metin és metilén szénatomok kötéstengelye körüli szabad rotáció következtében nyitott állású konformerek képviselik az energiaminimumot. A megfelelő diéderes szögek nagymértékben különböznek a csatolási állandókból számított értékektől, figyelembe véve azt is, hogy oldatban a 21 diketopiperazin származék sok lehetséges konformerként van jelen, és a spektrumokról a csatolási állandók populációkkal súlyozott átlagát lehet leolvasni. A 4 – 4.5 Hz körüli csatolási állandó valamennyi konformer 1H vicinális csatolási állandójánál kisebb. 69
4.4. táblázat
1,5-Dimetil-4,8-dioxo-[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamid molekulamechanikával optimált, illetve a 3J csatolási állandókból számolt φ diéderes szögei.
3
J (Hz) 1H NMR φ (°) 1H NMR φ (°) MM
AX 4.50
241.05
243.9
BX
123.25
128.2
4.04
A fentiek alapján a vizsgált reakció végtermékeként az 1,5-Dimetil-4,8-dioxo[1,5]diazocin-2,6-dikarbonsavdiamidot azonosítottuk. A szelektív gyűrűnyitási reakció megvalósításához a 3-metilamino-szukcinimidet 0 °C-on kell állni hagyni tömény ammónium-hidroxidban. A keletkezett NMA-diamid három nap után spontán kikristályosodik az oldatból.
4.3
Az NMA, valamint amid származékainak protonálódási egyensúlyai, azok makroszkopikus szintű leírása és vizsgálata Többértékű savak, bázisok ionizációja egységesen tárgyalható, ha az egyensúlyokat a
konjugált bázis protonfelvételének irányából szemléljük. Az L2- jelöli a ligandum (NMA) két negatív töltésű formáját, amely három funkciós csoportjára tud H+-t felvenni. Az asszociációs lépésekre a következő egyenletek és egyensúlyi állandók vonatkoznak:
L2-+H+
HL-
K1 =
[ HL− ] [ L2− ][ H + ]
4.1
HL-+H+
H2L
K2 =
[ H 2 L] [ HL− ][ H + ]
4.2
H2L+H+
H 3L +
K3 =
[ H 3 L+ ] [ H 2 L ][ H + ]
4.3
70
β1 = K1 =
[ H 2 L] [ HL− ] [ H 3 L+ ] β = K K = β = K K K = 2 1 2 3 1 2 3 [ L2− ][ H + ] [ L2− ][ H + ]2 [ L2− ][ H + ]3
4.4
A továbbiakban mindig a 4.4 egyenlet szerinti sztöchiometrikus állandókkal foglalkozunk. A tárgyalt látszólagos protonálódási állandók csak a mérés során beállított hőmérsékleten és ionerősségnél érvényesek [Irving és mtsai 1967], mérésükhöz az elektródot a hidrogénion koncentráción alapuló pH-skálára kell kalibrálni. A Ki a lépcsőzetes (szukcesszív), míg a βi jelölés az összevont (bruttó, kumulatív) protonálódási állandókat jelenti. A különböző protonáltsági fokú részecskék koncentrációinak összege az NMA bemérési (analitikai) koncentrációjával (cNMA) egyenlő: cNMA = [ L2− ] + [ HL− ] + H 2 L + [ H 3 L+ ] = = [ L2− ](1 + K1[ H + ] + K1K 2 [ H + ]2 + K1K 2 K 3 [ H + ]3 )
4.5
A részecskék parciális móltörtje (x, relatív koncentráció) kiszámító a protonálódási makroállandók és az oldat pH-jának ismeretében. A H3L+ részecskére például az alábbi képlet írható fel:
xH L+ = 3
[ H 3 L+ ] K1K 2 K 3[ H + ]3 = [ L2− ] + [ HL− ] + [ H 2 L] + [ H 3 L+ ] 1 + K1[ H + ] + K1K 2 [ H + ]2 + K1K 2 K 3[ H + ]3
4.6
A potenciometriás titrálások kiértékeléséhez fontos az n H , más néven Bjerrum-függvény, amely a molekula által átlagosan felvett protonok számát fejezi ki a pH függvényében (4.7. egyenlet). NMA esetében n H értéke 0 és 3 közötti értéket vehet fel.
n H ,NMA =
[ HL− ] + 2[ H 2 L] + 3[ H 3 L+ ] K1[ H + ] + 2 K1 K 2 [ H + ]2 + 3K1 K 2 K 3 [ H + ]3 = [ L2− ] + [ HL− ] + [ H 2 L] + [ H 3 L+ ] 1 + K1[ H + ] + K1 K 2 [ H + ]2 + K1 K 2 K 3 [ H + ]3
4.7
A különböző módszerekkel (NMR pH-titrálás, pH-potenciometria) mért makroállandók összehasonlíthatóságát az azonos mérési körülményekkel (oldószer, ionerősség, hőmérséklet) biztosítottuk.
71
4.3.1 A potenciometriás titrálások kiértékelése
Az NMA pH-potenciometriás titrálásából nyert pH / n H adatpárokra a 4.7 egyenletet, az NMA-β-amid adataira a 4.8. egyenletet, végül az NMA-diamid és a trimetilamin titrálási görbéjére a 4.9. egycsoportos egyenletet illesztettük.
n H , NMAβa =
K 1 [ H + ] + 2 K 1 K 2 [ H + ]2 1 + K 1 [ H + ] + K 1 K 2 [ H + ]2
n H , NMAαβa =
4.8
K1 [ H + ] 1 + K1 [ H + ]
4.9
Az NMA és az NMA-β-amid pH-metriás titrálásából kapott Bjerrum-függvény illesztését a 4.15. ábra mutatja be . Az eredményül kapott makroállandókat a 4.7. táblázat tartalmazza.
2.5
2
nH
1.5
1
0.5
0 1.5
3.5
5.5
7.5
9.5
11.5
pH
4.15. ábra
Az NMA (♦) és az NMA-β-amid (▲) potenciometriás titrálásokból kapott Bjerrum-görbéi az illesztett függvénnyel.
72
4.3.2 Az 1H NMR pH-titrálási görbék kiértékelése A Szakács Zoltán és munkatársai által bevezetett indikátormolekulák [Szakacs, Hägele, Tyka 2004] közül a diklórecetsav, a klórecetsav és az ecetsav lefedi a savas közegben lejátszódó protonálódások (NMA: K2, K3, monoamidok: K2) követéséhez szükséges pH tartományt, a TRIS [trisz (hidroximetil)-aminometán] pedig közel semleges közegben alkalmazható az egyszeresen protonált részecskék kémiai eltolódásának pontos leolvasásához. Valamennyi indikátormolekula savas és bázikus határeltolódása a különböző ligandumok titrálásakor 5 ppb-n belül azonos volt és megegyezett az irodalmi adatokkal, ami alkalmazhatóságukat igazolta, és a zavaró kölcsönhatások fellépését kizárta. A K1 állandók méréséhez az imidazol molekula alkalmazása nem elegendő, mert az csak pH 7.13 – 9.13 tartományban használható elfogadható pontossággal [Szakacs, Hägele, Tyka 2004]. Az NMA logK1 állandója 10 körüli érték, aminek méréséhez szükséges egy erősen bázikus indikátor molekula bevezetése. A metilamin-hidrokloriddal elvégzett titrálások kiértékelése során kiderült, hogy a metilamin nem megfelelő molekula. A mérendő komponenst és a többi indikátor molekulát tartalmazó oldatban ugyanis a metilcsoport kémiai eltolódását a pH függvényében ábrázolva nem szigmoid, hanem közel lineáris görbét kaptunk, így a HenderssonHasselbach összefüggés nem volt alkalmazható. A jelenség oka valószínűleg pH függő kölcsönhatások kialakulása az oldat egyéb komponenseivel. Alkalmazhatónak bizonyult viszont a trimetilamin-hidroklorid, amely 9 proton intenzitású szingulet jelet ad (ez lehetővé teszi, hogy koncentrációját 0.5 mM értékre csökkentsük a mért oldatban), nagy a határeltolódások különbsége (Δδ = 0.736 ppm, ez növeli a pH mérés pontosságát), és jól reprodukálhatóak a határeltolódásai a különböző ligandumok titrálásakor. LogK értékét pH-potenciometriával határoztuk meg (4.5. táblázat). 4.5. táblázat logK
A trimetilamin protonálódási állandója és határeltolódásai
δInd
δHInd
ΔδInd
TMA 9.907 2.168 2.904 0.736
73
A protonálódási folyamatok követésére az NMA-ban és amid származékaiban az N-metil, valamint az ABX metilén és metin szénkötésű hidrogének alkalmasak. Tekintettel arra, hogy két egymással csatoló mag kémiai eltolódás–különbsége kisebb, mint a köztük lévő csatolási állandó tízszerese (∆δ<10*J), az 1H kémiai eltolódások és vicinális csatolási állandók meghatározásához a spektrumok kiértékelésekor az ABX spinrendszer másodrendű analízisére volt szükség [Günther 1980]. A szénkötésű hidrogén kémiai eltolódásokat a pH függvényében ábrázolva (4.16. ábra) látható, hogy a három sav-bázis csoport protonálódása egyaránt befolyásolja a metilén és metin protonok kémiai eltolódását, sőt, még az N-metil-hidrogének kémiai eltolódásán is mérhető savas tartományban változás.
4.25
ppm
3.75
3.25
2.75
2.25 0.13
2.13
4.13
6.13
8.13
10.13
12.13
pH
4.16. ábra
Az NMA 1H NMR pH-titrálási görbéje a metin (X) (■), metilén A (□) és B (◆), valamint az N-metil (△) hidrogénekre, a folytonos vonalak az illesztett függvények.
Mivel az NMA 3 értékű ligandum, egy adott mag mérhető kémiai eltolódása a 4 különböző összetételű részecske kémiai eltolódásainak parciális móltörtekkel súlyozott átlaga:
74
δ mért = δ L x L + x HL δ HL + x H L δ H L + x H L δ H L 2−
2−
−
−
2
2
3
+
3
4.10
+
Az x móltörteket a 4.6 típusú egyenletből a 4.10 egyenletbe helyettesítve és átrendezve egy kiválasztott mag kémiai eltolódását a pH függvényében a következő kifejezés adja meg:
δ
mért
=
δ L + δ HL K1[ H + ] + δ H L K1 K 2 [ H + ]2 + δ H L K1K 2 K 3 [ H + ]3 2−
−
2
3
+
1 + K1[ H + ] + K1 K 2 [ H + ]2 + K1K 2 K 3 [ H + ]3
4.11
Olyan pH értékeknél, ahol döntően csak az egyik protonáltsági izomer van jelen az oldatban, az NMR titrálási görbék plató szakaszairól illetve végpontjairól leolvashatjuk a megfelelő részecskékhez tartozó kémiai eltolódás értékeket (határeltolódások, 4.6. táblázat). 4.6. táblázat
Az NMA makrorészecskéinek 1H NMR kémiai eltolódásai. X
A
B
N-Me pH
δ L ( ppm)
3.281 2.487 2.281 2.253
13
δ HL ( ppm)
3.733 2.811 2.701 2.746
7
δ H L ( ppm)
3.989 3.061 3.055 2.776
δ H L ( ppm)
4.314 3.241 3.202 2.846
2−
−
2
3
+
1
A L2− , HL− és H 3 L+ részecskék 4.6. táblázatban látható, megfelelő pH-nál mért kémiai eltolódásait (δ) a paraméterillesztés 4.11 egyenletébe behelyettesíthetjük. Az ABX hidrogének pH függő kémiai eltolódásában egy proton felvétele viszonylag nagy változást okoz (Δδ= 0.2-0.6 ppm), ami az illesztés, és ezáltal a makroállandók mérésének pontosságát megnöveli. A logK1 és logK2 értékek különbsége kicsi, ennek eredményeként az α- és β-karboxilátok protonálódása pH 2 és 4 között párhuzamos folyamatok. H2L tehát több protonáltsági izomerre jellemző összetétel, így δ H 2 L nem olvasható le közvetlenül a titrálási görbéről. Mivel a paraméterillesztés csak a [H+] együtthatókat adja meg egyértelműen, a 4.11 egyenletből a K2 makroállandót csak nagy hibával
75
lehet meghatározni [Szakács, Kraszni, Noszál 2004]. Kiszámítható viszont δ H 2 L , amennyiben a potenciometriás titrálásból kapott K2 értékét helyettesítjük be a 3.11 függvénybe. Az NMA-α- és β-amid titrálásakor a 4.12. egyenletnek megfelelő kétcsoportos függvényt, végül az NMA-diamid mérésénél a 2.4. egyenlet szerinti egycsoportos függvényt illesztettük.
δ
mért
=
δ L + δ HL K1[ H + ] + δ H L K 2 K 3 [ H + ]2 −
2
+
4.12
+
1 + K1[ H ] + K 2 K 3[ H + ]2
4.7. táblázat
Protonálódási makroállandók *[Noszál és Sándor 1989]. módszer
logK2
módszer
logK3
vegyület
logK1
Asp*
9.53
3.65
1.96
NMA
10.06 ± 0.02 pH-pot.
3.54 ± 0.02 pH-pot.
1.85 ± 0.01
1
H-NMR
NMA-α-amid 8.07 ± 0.01
1
H-NMR 3.04 ± 0.01
NMA-β-amid 9.01 ± 0.02
pH-pot.
NMA-diamid
1
10.10 ± 0.01
7.02 ± 0.01
1.90 ± 0.01
1
H-NMR
1
H-NMR
módszer 1
H-NMR
H-NMR
A 4.7. táblázat foglalja össze a vizsgált vegyületek protonálódási makroállandóit. Az NMA logK3 és a β-amid logK2 kettőnél kisebb értékei diklóracetáttal indikált 1H NMR titrálással pontosabban meghatározhatóak mint potenciometriával, tekintettel arra, hogy erősen savas (vagy lúgos) tartományban az üvegelektród válasza nem követi a lineáris Nernst-egyenletet. Az NMAα-amid bomlékony vegyület, makroállandóit ezért NMR pH-titrálással határoztuk meg, ami az
egyes spektrumok alapos kiértékelésével lehetővé teszi a vizsgált anyag jeleinek azonosítását az esetleges bomlástermékek mellett. Az NMA logK2 állandója viszont az előzőekben említett paraméterillesztési problémák miatt potenciometriával pontosabban határozható meg. Az NMA és az NMA-β-amid logK1 értéke jó egyezést mutat NMR titrálással és potenciometriával mérve. Ez bizonyítja, hogy az NMR csőben az oldat komponensei (titrált vegyület, esetleges bomlástermékek, indikátormolekulák, DSS) nem lépnek pH függő kölcsönhatásba egymással, valamint azt is mutatja, hogy a 3 % D2O jelenléte (szemben a 10 %-al [Noszál és Szakács 2003]) az NMR mérés során nem okoz érzékelhető izotópeffektust.
76
4.4
Protonálódási egyensúlyok mikroszkopikus szintű leírása és vizsgálata
A makroszkopikus leírás keretében csak a felvett protonok számával foglalkoztunk, a kötődés helyével nem. A makroállandók ugyanis nem jellemzik közvetlenül a donorcsoportok egyedi bázicitását. A csoportspecifikus vagy mikroszkopikus szintű leírásban valamennyi kötőhely protonaffinitását külön egyensúlyi állandókkal jellemezzük. A mikroszkopikus protonálódási sémán (4.17. ábra) az NMA összes, 23=8 részecskéjét, valamint a lehetséges protonálódási útvonalakat és a hozzájuk tartozó állandókat mutatjuk be. O
O
O
k Nα
O +
NH2
+
kN
NH2
k Nβα
kαN O
O OH NMANα
O O NMAN
O
O NH
O
k Nβ
kα
O
O OH NMAα O
k
OH
k Nαβ
+
NH2
+
NH2
NH O O NMA
O
OH
k βN
OH
N kαβ
O O NMANβ O
O OH NMANαβ
OH
β
NH
NH
kαβ O
O
NMAβ
k βα
HL-
4.17. ábra
OH
NMAαβ
K2
K1 L 2-
O
K3 H 3L +
H 2L
Az NMA makroszkopikus és mikroszkopikus protonálódási sémája
Az NMA legbázikusabb formája (L2-) három csoporton vehet fel protont, ennek megfelelően a HL és a H2L összetétel elvileg három – három protonáltsági izomert jellemez az oldatban (4.13 és 4.14. egyenlet). A mikrorészecskék szimbólumain alsó indexben tüntettük fel a protonált funkciós csoportokat. [HL- ] = [NMA N ] + [ ΝΜΑ β ] + [ ΝΜΑ α ]
4.13
[ Η 2 L] = [ ΝΜΑ Nβ ] + [ ΝΜΑ Nα ] + [ ΝΜΑ αβ ]
4.14
77
A k (lépcsőzetes) mikroállandók a funkciós csoportok bázicitását a többi csoport tetszőleges protonáltsági állapotában jellemzik. Az α-karboxilát bázicitása például négy mikroállandóval jellemezhető a β-karboxilát, illetve a metilamino-nitrogén protonáltsági állapotának megfelelően. A mikroállandók és részecskék alsó indexe (ha van) a protonált csoporto(ka)t jelöli, a mikroállandók felső indexe pedig azt a csoportot, aminek a protonálódási egyensúlyát az adott mikroállandó jellemzi. Az α-karboxilát protonálódási folyamataira például az alábbi mikroállandók írhatók fel:
kα =
[ ΝΜΑ αβ ] [ ΝΜΑ Nαβ ] [ ΝΜΑ α ] [ ΝΜΑ Nα ] k Nα = k βα = k Nαβ = + + + [NMA][H ] [NMA N ][H ] [ ΝΜΑ β ][H ] [ ΝΜΑ Nβ ][H + ]
4.15
A 12 mikroállandó redundáns rendszert alkot (nem függetlenek egymástól, illetve a makroállandóktól), nem szükséges tehát valamennyit kísérleti úton meghatározni. A Hess-tétel értelmében ugyanis egy több csoporton protonált forma energiatartalma független a protonálódás útvonalától. Ezt az elvet felhasználva összefüggések írhatók fel a makro- és mikroállandók kapcsolatáról: K1 = k N + k β + k α
4.16
K 1 K 2 = k N k Nβ + k N k Nα + k β k βα = k β k βN + k α k αN + k α k αβ
4.17
N N K1K 2 K 3 = k N k Nβ k Nαβ = k N k Nα k Nβα = k β k βN k Nαβ = k β k βα kαβ = k α kαN k Nβα = k α kαβ kαβ
4.18
Az NMAN, NMAα, NMAβ, valamint az NMANα, NMANβ és NMAαβ részecskék azonos sztöchiometriával, de eltérő konstitúcióval rendelkező protonáltsági izomerek. Ezek átalakulása általában gyors kinetikával játszódik le, ezért összetett analitikai (spektroszkópiai) jelet szolgáltatnak [Noszál 1986]. Egyedi koncentrációjuk többnyire nem mérhető, egymástól el nem választhatóak, a kísérleti adatokból kedvező esetekben az egyes csoportok pH-függő protonáltsági foka (f) kapható meg. A kölcsönhatási tényező számszerűsíti az egyik funkciós csoport protonáltsági állapotának hatását a másik csoport bázicitására. Az α- és β-karboxilátok Eα − β kölcsönhatási
78
tényezője például azt fejezi ki, hogy az α csoport protonálódása hogyan változtatja meg a β csoport bázicitását és viszont. Eα − β =
k βα kα
=
kαβ kβ
4.19
A csoportok bázicitás-módosító kölcsönhatását közvetíthetik a szénlánc kovalens kötései (statikus induktív effektus), ekkor nagysága a csoportokat elválasztó kötések számával csökken. Flexibilis molekulákban, így az általunk vizsgált aminosav-származékokban számolni kell ezen kívül téren keresztül ható (elektrosztatikus, illetve hidrogénhidas) kölcsönhatásokkal is, amely nagyobb kovalens távolságú csoportokat is összeköthet. Az effektusra jó példa, hogy az α-, ωdikarbonsavak logE értéke nem csökken egészen zérusig [Noszál 1986]. Kismolekulákban az egyik kötőhely protonálódása a másik bázicitását általában csökkenti (antikooperativitás, E < 1), mivel egy proton asszociációja az egész molekulában csökkenti az elektronsűrűség. Például az α-karboxilát mikroállandóinak sorrendje k α > k Nα > k Nαβ . A 4.20 - 4.22. egyenletek az általánosan használt logaritmikus formában fejezik ki a kölcsönhatásokat, mindhárom csoportot figyelembe véve. log Eα − β = log k α − log k βα = log k β − log kαβ
4.20
log E N −α = log k α − log k Nα = log k N − log kαN
4.21
log E N − β = log k β − log k Nβ = log k N − log k βN
4.22
Az NMA mikroegyensúlyi folyamatainak áttekintése. A potenciometriás titrálási görbékből a mikroállandók közvetlenül nem számíthatóak, mert a független mikroegyensúlyi paraméterek száma nem-szimmetrikus molekulákban meghaladja a makroállandókét. Az NMA esetében az NMR titrálás sem tekinthető csoport-specifikus módszernek, mert valamennyi C-H hidrogén kémiai eltolódására hatással van mindhárom csoport protonáltsági állapota. Bizonyos fokú szelektivitás tapasztalható, amit a Sudmeier-Reilly modellben felhasználunk (lásd később). Specifikus spektroszkópiás módszer hiányában szükség van kémiai megfontolásokon alapuló feltételezésekre a mikroállandók kiszámításához. Az NMA mikroállandóinak meghatározására három módszert alkalmaztunk, mindhárom módszer azon a feltételezésen alapul, hogy rokon
79
szerkezetű származékvegyületek bizonyos paraméterei kielégítő pontossággal közelítik az NMA megfelelő paraméterét. A potenciometriás titrálás eredményeként kapott Bjerrum görbe (4.15. ábra) elemzéséből kiderül, hogy a metilamino-csoport és a karboxilátok protonálódását egy plató szakasz választja el pH 6 és 7 között. Ennek megfelelően a K2 és K3 makroállandók elsősorban a két karboxilát, K1 főként a metilammónium protonálódását jellemzi. Az NMAαβ részecske móltörtje ezért bármely N k βα
pH-n rendkívül alacsony, a hozzá tartozó
mikroállandó csak az NMA-diamid
felhasználásával számítható (lásd 4.4.3 fejezet). A K2 és K3 makroállandókat tehát jó közelítéssel felbonthatjuk a k Nα , k Nβ , k Nβα és k Nαβ mikroállandókra. Figyelembe véve továbbá, hogy a metilammónium csoport közelsége miatt az α-karboxilát gyengébb bázis, mint a β-karboxilát, felírhatóak
a
k α < k β <<< k N
és
k β k βα <<< k N k Nα < k N k Nβ
relációk.
Azoknak
a
mikrorészecskéknek tehát, amelyekben az α- és/vagy β-karboxilátok protonálva vannak, a metilamino-csoport viszont nincs (NMAβ NMAα, NMAαβ), extrém alacsonyak a koncentrációi (móltörtjei). Ezeknek a részecskéknek a koncentrációváltozása a mért analitikai jeleket nem befolyásolja. Az analitikailag mérhető koncentrációtartományban a pH-tól függően az NMA, NMAN, NMANβ NMANα, NMANαβ részecskék járulnak hozzá a detektált NMR vagy potenciometriás jelekhez. O
O
α
log k N = 2.35
O
O
O CH3 NH
O O NMA
log k N = 10.06
O
CH3 +
NH2 O
OH
O
NMANα
CH3
log k Nβ ,α = 3.04
OH
+
O O NMAN
CH3 +
NH2
NH2
O
O OH
log k Nβ = 3.51
CH3 +
NH2
OH
NMANαβ
log k Nα ,β = 1.88
O O NMANβ
4.18. ábra
Az NMA összemérhető koncentrációjú mikrorészecskéinek protonálódási sémája a mikroállandók értékeivel.
80
A 4.18. ábra a detektálható részecskék lehetséges protonálódási útvonalait mutatja. A protonálódási állandók méréseinek hibahatárán belül K1= k N , mivel logK1-logK2> 6, viszont logK2-logK3< 3, ezért ezeknek a makroállandóknak az értékéhez mindkét karboxilát csoport hozzájárul. pH 7 és 0 között jó közelítéssel felírhatóak tehát a kétcsoportos mikrospeciáció jól ismert egyenletei a makro- és mikroállandók kapcsolatára (4.23. és 4.24. egyenlet).
K 2 = k Nβ + k Nα
4.23
K 2 K 3 = k Nβ k Nαβ = k Nα k Nβα
4.24
Az β-karboxilát erősebb bázicitása miatt a k Nβ és k Nαβ állandók tartoznak a major, míg a k Nα és k Nβα állandók a minor protonálódási útvonalhoz. Az α- és β-karboxilátok bázicitásának sorrendjét az NMA-α-, illetve β-amid logK2 étékeinek sorrendje is alátámasztja (4.7. táblázat). A makroállandók, a fenti kényszerfeltételek és egy független információ felhasználásával (például az egyik mikroállandó meghatározása) valamennyi paraméter kiszámítható.
Az NMA-amidok csoport-specifikus protonálódási folyamatainak vizsgálata. Az NMAβ, NMAα, és NMAαβ, részecskék protonálódási egyensúlyait az NMA-α-amid, NMA-βamid és NMA-diamid származékokkal modellezhetjük. Az NMA-α- és β-amid mikroállandóit a 4.19. ábra mutatja. Az NMA-diamid logK=7.02 értéke megfelel a megfelelő karboxiláton protonált formák metilamino-csoportjához rendelhető protonálódási állandóknak (NMA-α-amid: log k βN , NMA-β-amid: log k αN ). A mikroállandók kiszámításához a makroállandókat és a 4.23 – 4.24. egyenleteket használtuk fel (4.19. ábra). A kölcsönhatási tényezők a 4.21 – 4.22 egyenletek alapján logEN−α=1.99 és logEN−β= 1.05 értékeknek adódtak.
81
O
O
log k N = 8.07 O
log k βN = 3.04
+
NH2 O
O
NH2
O
OH
NMAαaN
+
NH
A
O
NH2
NH2
O
O
NMAαa
OH
NH2
NMAαaNβ
NH β
log k = 4.09
log k βN = 7.02 O NH2 NMAαaβ
logK2=3.04
logK1=8.07
H2L+
HL
LO
NH2
log k N = 9.01 O
log k αN = 1.90
+
NH2 O
NH2
O
O
NH2
NMAβaN
+
NH
B
O
NH2
O
O
O
OH
NMAβa
OH
NMAβaNα
NH
log k α = 4.09
log k αN = 7.02 O
OH
NMAβaα
logK2=1.90
logK1=9.01
H2L+
HL
LO
NH2
logK=7.02
O
NH2
NH
C O
+
NH2
NH2
4.19. ábra
O
NH2
Az NMA-α-amid (A), NMA-β-amid (B) és az NMA-diamid (C) protonálódási sémái
82
4.4.1
Az összemérhető koncentrációval rendelkező NMA részecskék egyensúlyi állandóinak meghatározása származékvegyület bázicitásának importálásával Azokban az esetekben, amikor a protonáltsági izomerek aránya jelentősen eltér, az
importált bázicitási adatokon alapuló deduktív módszer szolgáltatja a legmegbízhatóbb eredményt [Noszál 1990]. A megközelítés lényege, hogy a karboxil-csoport hatását egy másik csoport bázicitására olyan csoporttal modellezzük, amelyik nem képes disszociációra, elektronikus hatásai viszont kellő pontossággal közelítik a karboxil-csoportét. Erre a célra a legmegfelelőbb a karboxamid csoporttal történő helyettesítés [Noszál és Sándor 1989; Szakács, Kraszni, Noszál 2004], ami izoelektronikus és közel bioizoszter viszonyban van a −COOH-val, valamint induktív és hidrogénkötési képességek szempontjából is jobb közelítés, mint a korábban alkalmazott metilészter [Ebert 1926]. A modellvegyület mindig kevesebb protonálható csoportot tartalmaz a vizsgált molekulánál, és a helyettesített csoport kivételével ne tartalmazzon más szerkezeti eltéréseket. A vizsgált vegyület egyik mikroállandóját az alkalmasan megválasztott modellvegyület megfelelő makroállandójával helyettesítjük, ami a többi mikroállandó kiszámítását lehetővé teszi. A makro- és mikroállandók kapcsolatát kifejező egyenletek (4.23 – 4.24), valamint a logaritmus egységek alkalmazásának matematikai következménye, hogy a számított logk mikroállandók pontosabbak, amennyiben az importált állandó a minor protonálódási útvonalhoz tartozik. Ennek megfelelően az NMA-α-amid logK2= 3.04 értékét fogadtuk el az NMA k Nβα értékének. Az 4.23 – 4.24 egyenletek és a makroállandók felhasználásával kiszámított mikroállandókat (4.18. ábra) három módszerrel ellenőriztük. 4.4.2 Az NMA mikroállandóinak ellenőrzése α Az NMA-β-amid logK2 értékének felhasználása. Az 4.18. ábra k Nβ = 1.88 állandója
gyakorlatilag megegyezik a megfelelő modellvegyület, az NMA-β-amid logK2=1.90 állandójával (4.19. ábra).
A Sudmeier és Reilly modell alkalmazása. Az NMA molekulában a funkciós csoportokat kevesebb, mint öt kovalens kötés választja el egymástól, ezért az NMR magok 83
kémiai eltolódását elvileg az összes kötőhely protonálódása érinti. Az α- és β-karboxilátok csoportjának hatása a kiválasztott szénkötésű hidrogén kémiai eltolódására Sudmeier és Reilly szerint additív [Sudmeier és Reilly 1964], a metin hidrogénre például a következő egyenlet írható fel: Δδ ( pH ) X = δ (mért pH ) X − δ X , L− = f ( pH )α CαX + f ( pH ) β C βX
4.25
ahol CαX az α-karboxilát, CβX a β-karboxilát teljes protonfelvételének ppm-ben mért hozzájárulása a metin (X) hidrogén kémiai eltolódásának pH függő eltolódásához. Az fα,, fβ protonáltsági móltört függvények az adott csoporton protonált mikrorészecskék móltörtjeinek összegei. Figyelembe véve az 4.15 egyenleteket, valamint hogy [NMANαβ] = [H3L+], fα és fβ a két csoportos séma (4.18. ábra) szerint az alábbi módon írhatóak fel:
fα =
k Nα [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2 [ NMANα ] + [ NMANαβ ] = TL 1 + K 2 [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2
4.26
fβ =
[ NMANβ ] + [ NMANαβ ] k β [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2 = N TL 1 + K 2 [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2
4.27
Az NMA mindkét karboxil-csoportjának teljes protonálódása esetén: f ( pH )α = f ( pH ) β = 1
4.28
Δδ Xmax = δ X , H 2 L − δ X , L− = CαX + C βX
4.29
A 4.25 egyenletben az f protonáltsági móltörteket a 4.26 – 4.27 egyenletek szerint makro- és mikroállandókkal kifejtve a következő egyenlethez jutunk:
Δδ ( pH ) X =
k Nα [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2 ( K 2 − k Nα )[ H + ] + K 2 K 3[ H + ]2 + C C βX α X 1 + K 2 [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2 1 + K 2 [ H + ] + K 2 K 3 [ H + ]2
84
4.30
ami az 1H NMR pH-titrálásból nyert Δδ ( pH ) X / pH adatpárokra közvetlenül illeszthető. Az illesztés azonban csak abban az esetben eredményez megbízható mikroállandót, ha a C konstansokat előzetesen meghatároztuk. Paraméterbecsléssel ugyanis csak a [H+] együtthatók kaphatók meg egyértelműen, a két paraméter tehát erősen korrelált mennyiség [Szakács, Kraszni, Noszál 2004]. A C konstansok meghatározása az NMA-α-amid és -β-amid savas tartományban mérhető Δδ Xmax értékeiből lehetséges, mert a monoamidokban pH 0 és pH 7 között csak az egyik
karboxilát protonálódása befolyásolja a metin hidrogén kémiai eltolódását. Az amidok Δδ max együtthatóinak összegét az NMA megfelelő Δδ max értékeivel hasonlítottuk össze az ABX spinrendszer mindhárom magjára (4.8. táblázat, 4.20. ábra). 4.8. táblázat
Az NMA, az NMA-α-amid (NMAαa) és NMA-β-amid (NMAβa) protonálódási eltolódásainak összehasonlítása
NMR
Δδ ( pH ) max (ppm)
mag
NMAαa és NMAβa
az NMA átskálázott C
Δδ ( pH ) max összegek
konstansai
NMA NMAαa NMAβa
Cα
Cβ
HX
0.580 0.154
0.423
0.154 + 0.423 = 0.577
0.425 0.154
HA
0.430 0.381
0.163
0.381 + 0.163 = 0.544
0.301 0.129
HB
0.504 0.397
0.187
0.397 + 0.187 = 0.584
0.342 0.162
Az additivitás a metin hidrogénekre közel tökéletes (0.5 % eltérés), a metilén magokon viszont jelentős eltérés tapasztalható (27 % a HA, 16 % eltérés a HB hidrogénen). Az A és B magok viselkedésének oka, hogy a geminális metilénprotonok kémiai eltolódását az ionizáltsági állapoton kívül a molekula konformációjának változása is pH függő módon befolyásolja [Szakács Kraszni, Noszál 2004].
85
III
II 4,88
4,88
4,38
4,38
4,38
3,88
3,88
3,88
3,38
3,38
3,38
2,88
pH
4,88
pH
pH
I
2,88
2,88
2,38
2,38
2,38
1,88
1,88
1,88
1,38
1,38
1,38
0,88 3,73
0,88
3,93
4,13
0,88 2,8
ppm
4.20. ábra
2,9
3
3,1
ppm
3,2
2,7
2,9
3,1 ppm
Az NMA (●), valamint az α- (▲) és β- (■) amidok metin (I), metilén A (II) és metilén B (III) hidrogénjeinek protonálódási eltolódásai az illesztett függvénnyel savas pH tartományban.
További számításainkban ezért a metin hidrogén CαX és CβX konstansait azonosítottuk a monoamidok savas régióban mért Δδ Xmax értékeivel. A 0.5 %-os eltérés korrigálására a modellvegyületekből származó konstansokat átskáláztuk az alábbi egyenletek szerint:
CαX = CβX =
Δδ ( pH ) X max,NMA Δδ ( pH ) X max,NMAαa + Δδ ( pH ) X max,NMAβa Δδ ( pH ) X max,NMA Δδ ( pH ) X max,NMAαa + Δδ ( pH ) X max,NMAβa
Δδ ( pH ) X max,NMAβa
4.31
Δδ ( pH ) X max,NMAαa
4.32
A HX mag 1H NMR pH-titrálási adataiból kiszámolt pH / Δδ ( pH ) X adatpárokra a 4.30 egyenletet illesztve log k Nα értéke 2.29-nek adódott. Ez az érték, valamint a 4.23 – 4.24 egyenletek alapján számolt mikroállandók ( log k Nβ = 3.51, log k Nαβ = 1.88, log k Nβα = 3.10) jó egyezésben vannak a 4.18. ábra adataival.
Rokon szerkezetű vegyület kölcsönhatási tényezőjének importálása. Szintén deduktív módszer egy nagymértékben hasonló molekula ismert E kölcsönhatási paraméterének felhasználása. Kisebb szerkezeti módosítások a mikroállandókat már jelentősen befolyásolhatják, a kölcsönhatási tényező viszont robosztus mennyiség (lásd később, 4.5. fejezet). Az α- és β86
karboxilátok kölcsönhatását számszerűsítő log Eα − β az aszparaginsav esetében 0.39 [Noszál és Sándor 1989], amit az NMA karboxilát csoportjaira bevezetve a 4.23 – 4.24, 4.20 egyenletek felhasználásával lehetővé válik a négy mikroállandó kiszámítása. A kapott sorozat ( log k Nα = 2.26,
log k Nβ = 3.52, log k Nαβ = 1.87, log k Nβα = 3.13) egyezése a 4.18. ábra mikroállandóival alátámasztja a kölcsönhatási tényező átvihetőségét. 4.4.3
Az extrém alacsony koncentrációval rendelkező NMA részecskék egyensúlyainak vizsgálata Az NMA makroállandóit (4.7. táblázat), valamint k Nα , k Nβ , k Nβα , k Nαβ mikroállandóit (4.18.
ábra) ismerjük, valamint megállapítottuk, hogy k N = K1. Mivel az amid modell alapján N , a 4.16 – feltételezzük, hogy logK1NMAβa= log k βN , logK1NMAαa= log kαN , logK1NMAαβa= log k βα
4.18 egyenletek felhasználásával a fennmaradó mikroállandók kiszámíthatóak. A számítás menete a következő egyenletekkel foglalható össze:
log k α = log K1K 2 K 3 − log kαN − log k Nβα
4.33
N log kαβ = log K1K 2 K 3 − log k α − log kαβ
4.34
log k β = log K1K 2 K 3 − log k βN − log k Nαβ
4.35
N log k βα = log K1K 2 K 3 − log k β − log k βα
4.36
Az NMA protonálódási állandóit a 4.9. táblázat foglalja össze. A makroállandók hibái megfeleltethetők a paraméterillesztés szórásának (standard deviáció). A mikroállandók kiszámításához legalább két független mérés eredményét használjuk fel, ezek hibái tehát összeadódnak, ezért a k értékek bizonytalansága 0.05 – 0.15 logaritmus egység. Kivétel ez alól k N , ami megegyezik az NMA K1 értékével, valamint a major protonálódási útvonal két állandója
( k Nβ és k Nαβ ), amelyek bizonytalansága kisebb mint 0.1 logaritmus egység.
87
4.9. táblázat
Az NMA protonálódási makro- és mikroállandói logaritmus egységekben.
Makroállandók
Mikroállandók
K1
10.06
kN
10.06
kβ
4.56
kα
4.34
K2
3.54
k βN
9.01
k Nβ
3.51
k Nα
2.35
K3
1.85
kαN
8.07
kαβ
4.09
k βα
3.87
N k βα
7.02
k Nβα
3.04
k Nαβ
1.88
Protonálódó csoport metilamino
4.5
β-karboxilát α- karboxilát
A protonálódási állandókból levonható következtetések Az NMA és az aszparaginsav amino-csoportjainak bázicitásában megmutatkozó
különbség (0.5 logaritmus egységgel erősebb bázis a metilamino csoport) a primer-, és szekunder-aminok eltérő báziserősségével értelmezhető. Az α-, illetve β-karboxilát csoport bázicitása kisebb az NMA-ban, mint az aszparaginsavban, ez az eltérés megmutatkozik a makro-, és mikroállandókban egyaránt. Ez az eredmény összhangban van D.D. Perrin szerves savak és bázisok logK értékeit befolyásoló tényezőkről szóló könyvének adataival [Perrin és mtsai 1981]. A protonált ammónium-csoport, a protonált dimetil-ammónium-, valamint trimetil-ammónium csoport a hozzá képest alfa helyzetű karboxilát-csoportok bázicitását a 4.10. táblázatban bemutatott értékekkel csökkenti. Ebbe a sorrendbe a metilammónium-csoport jól illeszkedik. 4.10. táblázat (Alkil-)ammónium csoportok alfa helyzetű karboxilát bázicitást csökkentő hatása [Perrin és mtsai 1981] -NH3+ -NH(CH3)2+ N(CH3)3+ − ΔpK a
2.43
2.81
2.93
A mikrorészecskék parciális móltörtje (x, előfordulási valószínűsége, koncentrációjának és a teljes NMA koncentrációnak a hányadosa) pH függő mennyiség, az azonos összetételű izomerek egymáshoz viszonyított aránya viszont független a pH-tól. Minden olyan tényező
88
viszont, ami a termodinamikai állandókat befolyásolja (ionerősség, hőmérséklet, dielektromos állandó), az izomerek arányát is módosítja. Az NMANα és az NMANβ részecskék móltörtjei:
x NMANα =
k N k Nα [ H + ]2 [ NMANα ] = TL 1 + K1[ H + ] + K1 K 2 [ H + ]2 + K1 K 2 K 3[ H + ]3
4.37
xNMANβ =
k N k Nβ [ H + ]2 [ NMANβ ] = TL 1 + K1[ H + ] + K1 K 2 [ H + ]2 + K1 K 2 K 3[ H + ]3
4.38
ahol TL az NMA teljes bemérési koncentrációja. A részecskék arányát a következő összefüggés segítségével számíthatjuk: [ NMANβ ] k N k Nβ [ H + ]2 k Nβ = = = 14.5 [ NMANα ] k N k Nα [ H + ]2 k Nα
4.39
Ez az arány azt is jelenti, hogy a β-karboxilát közel 15-ször bázikusabb, mint az α. Ennek oka a metil-ammónium csoport helyzete a molekulán belül. A kölcsönhatási tényező sokkal kevésbé érzékeny a külső körülmények változására, mint a mikroállandók, vagy azok aránya, így akár a közeg dielektromos állandójától is függetlenek lehetnek. A log E N −α kölcsönhatási tényező értéke az NMA-β-amidban 1.99, az NMA-αamidban log E N − β =1.05. Az α-, illetve β-amidok kölcsönhatási tényezőjéből arra lehet következtetni, hogy az alfa, illetve béta helyzetű karboxilát protonálódása megközelítőleg 1, illetve 2 logaritmus egységgel csökkenti a metilamino-csoport bázicitását. Figyelembe véve a négy függetlenül meghatározott logK1 értéket (10.06 az NMA-ban, 9.04 a β-amidban, 8.07 az -αamidban és 7.02 a diamidban), kivételesen pontos additivitás figyelhető meg. Az NMA-diamid logK= 7.02 értéke azt bizonyítja, hogy az alfa és béta helyzetű karboxilátok protonálódása egymástól független hatásként összegződik. Ez az eredmény az amidok, mint karboxil-csoport „helyettesítő” modellek alkalmazásának jogosultságát látványosan alátámasztja. A kölcsönhatási tényező tehát erősen független a molekula egyéb részeitől, így az egyszerű szerkezeteken (pl. NMA) meghatározott értékek nagy biztonsággal átvihetők
89
bonyolultabb rendszerek analóg részeire. A kölcsönhatási tényezők robusztus jellegét támasztják alá a további megfigyelések is. A karboxilátok kölcsönhatását a metilamino-csoport protonáltsági állapota nem befolyásolja, tehát: log Eα − β = log k α − log k βα = log k β − log kαβ = log k Nα − log k Nαβ = log k Nβ − log k Nβα = 0.47 A 4.4.2. fejezetben azt láttuk, hogy az aszparaginsav log Eα − β paraméterét felhasználva a kiszámolt mikroállandók elfogadható egyezésben vannak a 4.4.1 fejezetben számoltakkal. Az NMA log E N −α = 1.99 és log E N − β = 1.05 kölcsönhatási tényezői a megfelelő monoamid paraméterével egyeznek meg (lásd 4.4. fejezet bevezetője), ami a deduktív számítási módszerek következménye.
1
NMAN
NMANαβ
NMA
0.9 NMANβ
0.8 móltört (X )
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 NMANα
0.1 0 0
2
4
6
8
10
12
14
pH
4.21. ábra
Az öt analitikailag mérhető NMA mikrorészecske pH-függő eloszlása.
A mérhető koncentrációjú részecskék pH függő százalékos eloszlását a mikrospeciációs görbén (részecske-specifikus eloszlási diagram) ábrázoltuk (4.21. ábra). Az x protonáltsági móltörtek kiszámításához a makro- és mikroállandókat helyettesítettük a 4.37 – 4.38 egyenletekbe. A 4.21. ábrán látható, hogy az NMANβ a major és NMANα a minor protonáltsági
90
izomer, így a protonálódási folyamatok legvalószínűbb résztvevői az NMA, NMAN NMANβ, és NMANαβ részecskék.
0
NMA
-2
NMAN
-4 -6
NMAβ
LogX
-8
NMAα
-10
NMANβ
-12
NMANα
-14 NMAαβ
-16 -18
NMANαβ
-20 0
2
4
6
8
10
12
pH
4.22. ábra
Az NMA valamennyi mikrorészecskéjének pH-függő eloszlása.
A 4.22. ábrán mutatjuk be az összes (nyolc) mikrorészecske móltörtjét logaritmikus diagrammon. A párhuzamosan futó vonalak az azonos bruttó össztöltésű részecskéket jelölik. Az NMAα,
NMAβ és
NMAαβ részecskék
koncentrációja
több
nagyságrenddel
kisebb
a
megfigyelhető izomerek koncentrációjánál. A mikroállandók ismeretében adott pH-n kiszámítható az egyes funkciós csoportok átlagos ionizáltsági állapota, amit az f protonáltsági móltört függvényekkel ábrázolhatunk (4.23. ábra). A karboxilát csoportok móltörtjeit (fα, fβ) a 4.26 – 4.27 egyenletek és a mikroállandók felhasználásával számítottuk ki.
91
1
protonáltsági fok
0.8
0.6
0.4
0.2
0 0
1
2
3
4
5
pH
4.23. ábra
Az NMA-α- (folytonos vonal) és β-karboxilát (szaggatott vonal) csoportjainak protonáltsági foka.
A karboxilát csoportok ionizáltsági állapota tetszőleges pH-n, egymástól függetlenül meghatározható a függvény segítségével. Az NMDA receptor és az NMDA molekula együtt kikristályosított szerkezetének tanulmányozása azt mutatja [Chen és Wyllie 2006], hogy a receptor glutaminsav kötő helyéhez a kétcsoportos séma major protonáltsági útvonalához tartozó NMAN és NMANβ részecskék kapcsolódása a legvalószínűbb (lásd 2.1.5 fejezet). A receptorfelszín közvetlen kémiai környezete azonban (különös tekintettel a közeg dielektromos állandójára és az ionerősségre) jelentősen eltérhet a híg vizes oldatoktól, vagy akár a vérplazma viszonyaitól. Ilyen körülmények között a molekulák viselkedésének prediktálásában nagy szerephez juthatnak az intrinszik paraméterek, amelyek a molekula csoportjainak kölcsönhatásait képesek eltérő körülmények között is megbízhatóan előrejelezni. Az NMA molekula Eα−β kölcsönhatási tényezője például a karboxilát csoportok kölcsönhatását a mérés során alkalmazottól eltérő körülmények között is megbízhatóan jellemzi.
92
4.6
Az NMA és amid származékainak rotamer analízise Az NMA rotamer populációinak meghatározása. Az NMA 8 mikrorészecskéje közül a
major protonálódási útvonal 4, összemérhető koncentrációval rendelkező részecskéjével foglalkozunk (NMA, NMAN, NMANβ, NMANαβ; 4.18. ábra). A csatolási állandók méréséhez az 1
H NMR-pH titrálások NMR spektrumait használtuk fel, így az adott spektrumhoz tartozó pH
értékből a protonálódási állandók ismeretében az eltérő protonáltsági állapotú részecskék koncentrációi kiszámíthatóak, illetve választható olyan pH, ahol a felvett spektrum döntően egy részecskéhez rendelhető. A metilén csoport A, illetve B hidrogénjei diasztereotróp viszonyban vannak. Mivel a kémiai eltolódások különbsége kisebb, mint a köztük lévő csatolási állandó tízszerese (Δδ<10*J), az ABX spinrendszer másodrendű analízise szükséges a csatolási állandók pontos megállapításához [Günther 1980]. Az A és B hidrogének asszignációja a heteronukleáris és a homonukleáris csatolásokból számolt rotamer betöltöttség összevetése alapján nem vezetett eredményre, mert a vicinális
13
C – 1H csatolási állandók az α-karbonil szénatom és az A,
valamint a B metilén hidrogén között azonosnak adódtak. Felhasználható viszont az a kémiai evidencia, hogy lúgos közegben a karboxilátok taszító hatása miatt az NMA-ban a transz rotamer a domináns [Kraszni és mtsai 2004] Az A és B hidrogének nem megfelelő hozzárendelése esetén a t rotamer aránya adódna a legalacsonyabb értéknek, így ez a lehetőség kizárható. Az NMA molekula karboxil, illetve karboxilát csoportjainak λ szubsztituens állandóit az izobutánsav savas, illetve bázikus közegben felvett 1H NMR spektrumairól leolvasott csatolási állandók 2.11 egyenletbe helyettesítésével számítottuk. A metilcsoport λ értékét Altona közleményéből [Altona és mtsai 1994] vettük. A szubsztituens konstansok (4.11. táblázat) jó egyezést mutatnak az irodalmi értékekkel. A metilamino, illetve metilammónium csoport szubsztituens állandójának meghatározásához az izopropil-metilamin csatolási állandóit mértük meg bázikus, illetve savas közegben. A 4.11. táblázat adataiból látható, hogy az értékek gyakorlatilag megegyeznek az amino-csoport állandóival.
93
4.11. táblázat Az izobutánsav, valamint az izopropil-amin csatolási állandói savas, illetve bázikus közegben, valamint a számolt és irodalmi szubsztituens állandók. *[Altona és mtsai 1994] Saját mérések csoport
Irodalmi adatok* 3
J(HH)
λ
csoport
λ
-NH-CH3
6.35
1.10
-NH2
1.10
-NH2+-CH3
6.601
0.83
-NH3+
0.82
-COOH
7.001
0.39
-COOH
0.39
-COO−
6.979
0.42
-COO−
0.41
A protonálódási állandók ismeretében (4.3. – 4.4. fejezet) bázikus közegben (pH≈13) az NMA kétszeresen negatív (L2-) formája dominál, semleges oldatban (pH≈7) az aminocsoporton protonált (HL-, NMAN) míg erősen savas körülmények között (pH<1) a minden csoporton protonált (H3L+, NMANαβ) részecskék vannak túlnyomó többségben. A részecskék AX és BX csatolási állandói így az adott pH-hoz tartozó spektrumokból kiolvashatók. A részecskék rotamerjeivel végzett geometria optimálás szolgáltatta az 4.12. – 4.13. táblázat diéderes szögeit (φt, φg, φh). A számítógépes geometria optimalizálásokat Rácz Ákos végezte SGI Octane típusú készüléken. Az optimalizálások SYBYL 7.0 (Tripos) operációs rendszerrel, MMFF94s erőtérben történtek, ahol a közeg (víz ) hatását a dielektromos állandóval lehet figyelembe venni (εr =78.3 „distance dependent dielectric term”). A rotamer csatolási állandók kiszámítása a λ szubsztituens konstansok és a diéderes szögek 2.10 egyenletbe helyettesítésével történt (4.12. – 4.13. táblázat).
94
4.12. táblázat
Geometria optimalizálással kapott, fokban (°) kifejezett diéderes szögek (φt, φg, φh) az A és X hidrogének között, valamint Herzben (Hz) kifejezett 3JAX rotamer
csatolási állandók. Részecske
összetétel
φt,AX
JAX,t
φg,AX
JAX,g
φh,AX
JAX,h
NMA
L2-
-172.5
12.26
-61.2
3.71
64.8
2.06
NMAN
-
HL
-170.0
12.37
-62.0
3.49
59.8
2.99
NMANβ
H 2L
-165.9
12.43
-65.0
3.48
60.3
3.02
NMANαβ
H3L+
-162.4
11.66
-74.1
1.87
65.6
2.21
NMA-α-amid
L-
176.3
12.74
-71.2
2.28
44.6
5.23
NMA-α -amidN
HL
178.8
12.96
-69.2
2.46
47.9
4.99
NMA-α -amidNβ
H2L+
-175.0
12.83
-73.1
1.98
45.7
5.43
NMA-β-amid
-
L
-179.5
12.68
-70.6
2.33
68.3
1.69
NMA-β -amidN
HL
-175.8
12.81
-70.3
2.30
50.2
4.61
NMA-β -amidNα
H2L+
-175.7
12.86
-77.0
1.59
49.1
4.81
NMA-diamid
L
-178.2
12.69
-79.9
1.39
51.3
4.08
-175.3
12.84
-73.3
1.96
76.3
1.21
+
NMA-diamidN
HL
Az 2.6 – 2.8 típusú egyenleteket a három protonáltsági állapotra (NMA, NMAN, NMANαβ;
4.18.
ábra)
felírtuk,
és
a
rotamer
betöltöttségeket
a
háromismeretlenes
egyenletrendszerekhez felírt harmadrendű determinánsok megoldásával számítottuk ki (4.14. táblázat, 4.27. ábra). pH 2.5-3 között az NMANβ mikrorészecske koncentrációja a legmagasabb (4.7. és 4.18. ábra), de a H3L+ és HL- részecskék koncentrációja sem elhanyagolható. Az NMANβ koncentrációja minden pH-n 14.45-szerese a minor protonáltsági izomernek (NMANα), ez utóbbi részecske hozzájárulását a mérhető csatolási állandóhoz ezért figyelmen kívül hagyjuk. Az NMANβ részecske rotamer populációinak kiszámításához a protonálódási makro- és mikroállandók ismeretében (4.4. fejezet) meghatároztuk az 1H NMR-pH titrálási sorozatból azt a pH értéket, ahol az NMANB részecske koncentrációja a legmagasabb (pH= 2.75). Kiszámítottuk az oldatban jelen lévő részecskék móltörtjeit (4.6, 4.37 – 4.38 egyenletek), majd a spektrumon
95
mért csatolási állandókat ( J AX , pH ( 2.75) , J BX , pH ( 2.75) ) felbontottuk az egyes részecskékhez tartozó csatolási állandók móltörtekkel súlyozott összegeként (4.40 – 4.41 egyenletek). 4.13. táblázat Geometria optimalizálással kapott, fokban (°) kifejezett diéderes szögek (φt, φg, φh) a B és X hidrogének között, valamint Herzben (Hz) kifejezett 3JBX rotamer csatolási állandók. Részecske
összetétel
φt,BX
JBX,t
φg,BX
JBX,g
φh,BX
JBX,h
NMA
L2-
71.2
1.57
-178.7
12.61
-49.4
5.51
NMAN
-
HL
73.7
1.53
-179.1
12.88
-56.1
4.23
NMANβ
H 2L
74.9
1.52
-176.4
12.93
-56.1
4.26
NMANαβ
H3L+
78.6
1.17
165.6
12.41
-52.4
4.95
NMA-α-amid
-
L
60.9
2.77
171.0
12.56
-68.6
2.44
NMA-α -amidN
HL
63.6
2.66
172.9
12.83
-65.9
2.72
NMA-α -amidNβ
H2L+
67.1
2.19
166.4
12.48
-71.2
2.06
NMA-β-amid
-
L
63.4
2.43
170.3
12.52
-47.1
5.96
NMA-β -amidN
HL
67.1
2.20
170.7
12.72
-66.0
2.71
NMA-β -amidNα
H2L+
67.3
2.17
163.6
12.22
-66.8
2.61
NMA-diamid
L
64.8
2.24
160.8
11.81
-64.0
3.10
67.9
2.10
167.3
12.55
-39.2
7.39
+
NMA-diamidN
HL
4.14. táblázat Az NMA, az NMA-α-amid (NMAαa) és az NMA-β-amid (NMAβa) major részecskéinek rotamer populációi. NMA NMAN NMANβ NMANαβ NMAαa NMAαaN NMAαaNβ NMAβa NMAβaN NMAβaNα fg 0.27
0.13
0.22
0.11
0.44
0.47
0.42
0.56
0.39
0.24
ft 0.63
0.53
0.31
0.32
0.40
0.17
0.17
0.34
0.09
0.14
fh 0.10
0.34
0.47
0.57
0.16
0.36
0.41
0.10
0.52
0.62
J AX , pH ( 2.75) = J AX , NMANαβ x NMANαβ + J AX , NMANβ x NMANβ + J AX , NMAN x NMAN
96
4.40
J BX , pH ( 2.75) = J BX , NMANαβ x NMANαβ + J BX , NMANβ x NMANβ + J BX , NMAN x NMAN
4.41
Az NMAN és NMANαβ részecskék AX és BX csatolási állandóit már leolvastuk a megfelelő pHhoz (7.36 illetve 0.13) tartozó spektrumokról, így
J AX , NMANβ illetve J BX , NMANβ kiszámítható, és
felírhatóak a 4.42 – 4.44 egyenletek, amelyeket megoldva a 4.14. táblázat 3. sorában szereplő rotamer betöltöttségek meghatározhatók. 3
J AX , NMANβ = f NMANβ ,t J AX , NMANβ ,t + f NMANβ ,g J AX , NMANβ ,g + f NMANβ ,h J AX , NMANβ ,h
4.42
3
J BX , NMANβ = f NMANβ ,t J BX , NMANβ ,t + f NMANβ ,g J BX , NMANβ ,g + f NMANβ ,h J BX , NMANβ ,h
4.43
f NMANβ ,t + f NMANβ ,g + f NMANβ ,h = 1
4.44
A különböző protonáltsági állapotú rotamerek móltörtjeinek összegét a pH függvényében ábrázoltuk a 4.24. ábrán. Az egyes rotamerek betöltöttségei a különböző protonáltsági állapotú rotamerek móltörtjeinek összegeként írhatók fel: xt = f NMAt + f NMAN ,t + f NMANβ ,t + f NMANαβ ,t
4.45
x g = f NMAg + f NMAN ,g + f NMANβ ,g + f NMANαβ ,g
4.46
xh = f NMAh + f NMAN ,h + f NMANβ ,h + f NMANαβ ,h
4.47
Lúgos közegben, a karboxilátok taszításának megfelelően a t rotamer betöltöttsége a legmagasabb, savas közegben a hidrogénkötések a h rotamernek kedveznek. A g rotamer kiemelkedő koncentrációja pH 2.5 és 3 között az NMANβ magas relatív mólarányával magyarázható (4.24. ábra). Ebben a részecskében a karboxilátok t rotamert stabilizáló elektrosztatikus taszító hatása megszűnik, a h rotamer magas mólarányát biztosító hidrogénkötések viszont még nem tudnak mind kialakulni.
97
t 0.59
móltört (x )
0.49
0.39
0.29
g
0.19
h
0.09 0
2
4
6
8
10
12
14
ph
4.24. ábra
Az NMA rotamer populációi a pH függvényében.
Az NMA-α-amid és az NMA-β-amid rotamer populációinak meghatározása. Az NMA-α- és -β-amid protonálódási makroállandóinak ismeretében (4.3.2 fejezet) bázikus közegben (pH=13) a monoamidok kétszeresen negatív (L-) formája dominál, semleges oldatban (pH≈7) a metilamino-csoporton protonált (HL) míg erősen savas körülmények között (pH<1) a minden csoporton protonált (H2L+) részecskék vannak túlnyomó többségben. A monoamid rotamerek MM számítással nyert diéderes szögeit és a belőlük számolt rotamer csatolási állandókat a 4.12 – 4.13 táblázatok tartalmazzák. A standard csatolási állandók ismeretében a megfelelő pH-n mérhető AX és BX csatolásokat 4.42 – 4.44 típusú egyenletrendszerekbe helyettesítve az adott protonáltsági állapothoz tartozó rotamer betöltöttségek kiszámíthatóak (4.25. – 4.26. ábra, 4.14. táblázat). A 4.24. és 4.25. – 4.26. ábrákat összehasonlítva az első szembeszökő különbség az NMAhoz képest, hogy a monoamidokban lúgos pH-n nem a t rotamer a domináns, mert nincs két negatív töltésű karboxilát csoport. A g rotamer betöltöttsége minden pH-n és mindkét monoamid izomerben magasabb mint a t rotameré, a metilamino csoport „helyigénye” tehát nagyobb mint az alfa sav(amid) csoporté. Az aszparaginsavban ellenkező tendencia figyelhető meg [Noszál és Sándor 1989], az aszparaginsav rotamerek populációinak kialakításában a karboxil(át) csoportok közötti kölcsönhatás a domináns tényező. 98
g
0,45
t
0,4 0,35
móltört
0,3 0,25 0,2
h
0,15 0,1 0,05 0 0
2
4
6
8
10
12
14
pH
Az NMA-α-amid rotamer populációi a pH függvényében.
4.25. ábra 0,6
g
0,5
móltört
0,4
t 0,3
0,2
h
0,1
0 0
2
4
6
8
10
12
14
pH
4.26. ábra
Az NMA-β-amid rotamer populációi a pH függvényében.
Az NMDA rotamer-specifikus bázicitásainak meghatározása. A csoport-specifikus bázicitások ismeretében megvizsgáltuk a major protonálódási állandók konformációfüggését. Az NMA három major protonálódási mikroállandója a következő egyenletekre bontható fel:
kN =
[ NMAN ] [t N ] + [ g N ] + [hN ] = + [ NMA][ H ] ([t ] + [ g ] + [h])[ H + ]
4.48
99
k Nβ =
[ NMANβ ] [t Nβ ] + [ g Nβ ] + [hNβ ] = + [ NMAN ][ H ] ([t N ] + [ g N ] + [hN ])[ H + ]
k Nαβ =
4.49
[ NMANαβ ] [t Nαβ ] + [ g Nαβ ] + [hNαβ ] = + [ NMANβ ][ H ] ([t Nβ ] + [ g Nβ ] + [hNβ ])[ H + ]
4.50
A rotamereket jellemző protonálódási állandók a mikroállandókhoz hasonlóan definiálhatók:
k Nβ ,t =
[t Nβ ] [t N ][ H + ]
4.51
ahol k Nβ ,t a t rotamer megfelelő protonálódási lépcsőjére jellemző egyensúlyi állandó. A rotamer koncentrációk kifejezhetők a megfelelő móltört (f) és a molekulakoncentráció szorzatával: [t Nβ ] = f NMANβ ,t [ NMANβ ]
4.52
[t N ] = f NMAN ,t [ NMAN ]
4.53
A 4.52 – 4.53 egyenleteket a 4.51-be behelyettesítve a k Nβ ,t rotamer-specifikus protonálódási állandó kiszámítására alkalmas összefüggéshez jutunk:
k Nβ ,t =
f NMANβ ,t [ NMANβ ] f NMANβ ,t β = k N ,t + f NMAN ,t [ NMAN ][ H ] f NMAN ,t
4.54
A rotamerek protonálódási állandóinak számításához szükség van a protonálódási állandók (k) és a megfelelő protonáltsági állapotú rotamerek relatív koncentrációinak (f) ismeretére. Az NMA rotamer specifikus mikroállandói a 4.27. ábrán láthatóak, felhasználásukkal a rotamerek pH függő eloszlása ábrázolható (4.28. ábra).
100
CH3 H2N
COOH 9.98
H
H
CH3
CH3 H3N+
CH3
1.89
H
H
H3N+
COOH H H
H
COOtNβ
COOH tNαβ
0.63
0.53
0.31
0.32
CH3
H H
9.74
CH3
COOh 0.10
3.74
COO-
10.59
H3N+
-OOC
H
1.58
COOH
H
3.65
H3N+
HOOC
CH3
H H H
1.97
H3N+
HOOC
COOhNβ 0.47
COOhN 0.34
H H
H3N+
0.22 CH3
H
H
COOgNβ
H H
CH3
H
H3N+
COOgN 0.13
H
H
H
H
0.27
H
CH3
H
H3N+
COOg
4.27. ábra
H
H
COO-
-OOC
3.28
H3N+
COOH H
COOtN
H
H2N
CH3
COOt
H2N
CH3
COOH
COOH COOH gNαβ 0.11 H H H COOH hNαβ 0.58
Az NMA major protonálódási útvonalához tartozó rotamerek populációi és protonálódási egyensúlyai a rotamer-specifikus mikroállandókkal.
A kétszeresen negatív részecskék közül a g rotamer a legkevésbé bázikus, mert a negatív töltésű β-karboxilát távol van a metilamino-csoporttól, ezért kevésbé növeli a nitrogénatom elektronsűrűségét (hidrogénkötésen keresztül) mint a két másik rotamerben. A metilaminocsoporton protonált egy negatív töltésű részecskék közül viszont a g rotamer a legbázikusabb, amit két tényező támaszt alá. A proton megkötése a β-karboxiláton megszűnteti a két karboxilát közti anionos taszítást (a t rotamerben ez a hatás kevésbé jelentős). A másik tényező, hogy a h rotamerben a térközelben elhelyezkedő β-karboxilát és a metilammónium-csoport közötti elektrosztatikus vonzás csökkenti a β-karboxilát bázicitását a g rotamerhez képest.
101
t
hNαβ
0,6
tN 0,5
móltört
0,4
hN
hNβ
tNαβ 0,3
g
tNβ gNβ
0,2
gN
gNαβ
h
0,1
0 0
2
4
6
8
10
12
14
pH
4.28. ábra
Az NMA major protonáltsági formáihoz tartozó rotamerek eloszlása a pH függvényében.
Az NMDA molekula aktív, az NMDA receptor ligandumkötő helyével kölcsönhatásba lépő konformációját farmakofór modellek (2.4.1 fejezet [Ortwine és mtsai 1992]) segítségével határozták meg. A megfelelő funkciós csoportok távolsága Angströmben kifejezve a 4.29. ábrán látható.
4.29. ábra
Az NMDA molekula funkciós csoportjainak ideális távolsága Angströmben kifejezve Ortwine tanulmánya szerint. [Ortwine és mtsai 1992] 102
A különböző protonáltsági állapotú NMA rotamerek geometria-optimalizálása a diéderes szögek mellett (4.15. táblázat) az atomtávolságokat is meghatározta. Megkerestük azt a részecskét, amelynek atomtávolságai legjobban közelítik a 4.29. ábrán látható értékeket. Kiderült, hogy a H2L összetételű, metilamino és β-karboxiláton protonált gauche rotamerben (gNβ) a következő atomtávolságok mérhetők: 4.15. táblázat
Az NMA gNβ részecskéjének optimalizált atomtávolságai Angströmben kifejezve. C (α-COOH) O1 (β-COOH)
N (-N-CH3)
2.49
4.81
O1 (β-COOH) 4.13 O2 (α-COO−)
3.96
Az NMA valamennyi részecskéje közül a gNβ atomtávolságai közelítik meg legjobban a farmakofór modell predikcióját (4.15. táblázat, 4.30. ábra). Farmakodinámiás tanulmányok [Chen és Wyllie 2006; Ortwine és mtsai 1992] alapján a gNβ részecske protonáltsági állapota is összhangban van a leginkább valószínűsíthető, receptor-kötésben közvetlenül részt vevő NMAN és NMANβ protonáltsági formák közül az utóbbival.
4.30. ábra Az NMA gNβ részecskéjének optimalizált térszerkezete. A 4.28. ábra tanúsága szerint a gNβ részecske előfordulása vizes oldatokban pH 6-nál savasabb közegben a legvalószínűbb, a t és h rotamerek populációja azonban mindig magasabb. Az NMA és a hozzá hasonló nyílt láncú, flexibilis molekulák (Asp, Glu) alacsony konformációs
103
energiagátja miatt azonban a receptoraffinitás nincs közvetlen korrelációban az aktív konformer populációjával, mint rigidebb szerkezetek esetén (2.4.1 fejezet [Conti és mtsai 1999]). Nagyobb receptoraffinitású és szelektívebb, gátolt rotációjú szerkezetek tervezéséhez viszont fontos lehet az NMDA protonálódási és konformációs sajátságainak, a részecskék (különösen az aktív) eloszlásának az ismerete.
104
5
ÖSSZEFOGLALÁS, ÚJ TUDOMÁNYOS EREDMÉNYEK Dolgozatomban az NMDA molekula és amid származékainak fizikai-kémiai paramétereit,
ezen belül a makroszkopikus és csoport-specifikus protonálódási állandóit határoztuk meg, valamint kiszámítottuk a különböző protonáltsági állapotú és töltéseloszlású mikrorészecskék rotamer populációit. Az NMDA, az NMDA-α-amid, az NMDA-β-amid és NMDA-diamid sav-bázis tulajdonságait kvantitatíven jellemző protonálódási állandókat pH-potenciometriával, illetve 1H NMR pH-titrálással határoztuk meg. Az erősen bázikus pH tartományban bevezettük a trimetilamint, mint indikátor molekulát az egycsöves 1H NMR pH-titrálás in situ pH mérési gyakorlatába, meghatároztuk protonálódási állandóját és határeltolódásait. Az NMDA molekula három protonálható funkciós csoporttal rendelkezik, amelyek protonálódása részben átfedő pH tartományokban következik be. A dolgozatban három független módszerrel meghatározott protonálódási mikroállandók mikroszkopikus (szubmolekuláris) szinten jellemzik a csoportspecifikus sav-bázis tulajdonságokat, lehetővé teszik a felvett protonok megoszlásának kiszámítását a funkciós csoportok között. A mikroállandók kiszámításához az NMA amid származékainak protonálódási állandóit és pH függő
1
H NMR paramétereit
használtuk fel. Bemutattuk a mikrorészecskék pH függő eloszlását, és az irodalmi farmakológiai vizsgálatok szerint a receptorhoz kötődő mikrorészecskét (NMANβ) a major protonáltsági izomerrel azonosítottuk. Meghatároztuk az NMDA molekula intrinszik paramétereit, a kölcsönhatási tényezőket, amelyek a külső körülmények változására kevésbé érzékenyek, mint a protonálódási állandók. A kölcsönhatási tényező azt számszerűsíti, hogy egy funkciós csoport protonáltsági állapota milyen hatással van egy másik csoport bázicitására. Ismeretük lehetővé teszi, hogy a funkciós csoportok protonáltsági állapotáról a receptorfelszín környezetében uralkodó, a vizes oldatoktól jelentősen eltérő körülmények között is rendelkezzünk információval. A metilamino-csoport és az α-, illetve β-karboxilátok kölcsönhatása additívnek bizonyult, és kimutattuk, hogy az egyik karboxilát protonáltsági állapota nem befolyásolja a másik karboxilát és a metilamino csoport kölcsönhatását. Az aszparaginsav karboxilát csoportjainak kölcsönhatási tényezőjét felhasználtuk az NMDA mikroállandóinak ellenőrzéséhez. A kiváló egyezés azt mutatja, hogy a kölcsönhatási tényező ebben az esetben átvihető mennyiség a rokon szerkezetű molekulák között.
105
Az NMDA molekula és monoamid származékainak rotamer populációit, valamint rotamer-specifikus bázicitásait 1H NMR spektrumok vicinális csatolási állandóiból Karplus típusú egyenletek felhasználásával határoztuk meg. Az adott protonáltsági állapotú és konformációjú rotemerek diéderes szögeit számítógépes geometria-optimálással nyertük, a szubsztituensállandókat Hasnoot-Altona módszerrel számítottuk ki, a rotamerek populációit pedig az 1H NMR spektrumokból kiolvasott vicinális csatolási állandókkal felírt hatparaméteres egyenletrendszerrel
számoltuk.
Kiszámítottuk
a
rotamerek
pH
függő
eloszlását.
A
szakirodalomban közölt farmakofór modellek atomtávolságai alapján kiválasztottuk azt a részecskét (gNβ), amely feltehetően a receptorkötődési folyamatok aktív résztvevője. Molekulamechanikai számításokkal meghatározott atomtávolságai, valamint protonáltsági állapota a különböző farmakológiai modellek adataival elfogadható egyezést mutatnak. Megvizsgáltuk az NMA (NMDA racém formája, N-metil-DL-aszparaginsav), az NMA-αés β-monometilészterek és -monoamidok, valamint az NMA-dimetilészter és -diamid régiószelektív szintetikus előállítási módszereit. A szakirodalomban található reakciókat reprodukáltuk és korszerűsítettük, illetve új reakciókörülményeket vezettünk be. A szerkezeteket NMR és tömegspektroszkópiával karakterizáltuk. NMA-amidok és észterek előállítása elvileg megvalósítható peptidkémiai módszerekkel, melynek során védőcsoport kombinációkat alakítanak ki a kiindulási anyagként felhasznált aszparaginsav molekulán, amit a funkciós csoportok szelektív átalakítása, majd a védőcsoportok hasítása követ. Az aszparaginsav előállítása ezen az úton speciális reakciókörülményeket, szelektív reagenseket, szelektíven lehasítható védőcsoport képző ágenseket, valamint peptidkémiai laboratóriumi módszerek kivitelezésére alkalmas felszerelést, laboreszközöket igényel. Az NMA-α-amid kialakítását ezért az N-metil-aszparaginsav védőcsoport kombinációk nélküli átalakításával oldottuk meg. A szelektivitást a két karboxil(át)-csoport reaktivitásbeli különbsége és az amino-csoport protonálódásával kialakuló sóvédelem biztosította. (Az irodalom ezt a szintetikus közelítést védés-aktiválás stratégiaként jelöli.) Az NMA és az NMA-β-amid előállítására kidolgoztuk a megfelelően megválasztott telítetlen dikarbonsav származékok és metil-amin Michael addíciós reakcióján alapuló gazdaságos és egyszerű preparatív eljárást. A származékok regioszelektív előállítását a reakciókörülmények optimális kialakítása biztosította. Az irodalmi receptekben részletezett, piridines
106
közegű Michael addíciós reakciók közvetlenül ugyanis nem alkalmazhatóak metilamin addícióra annak nagyfokú illékonysága miatt. Egyik megoldás (A módszer) a metilamin hidroklorid alkalmazása és a bázis felszabadítása részletekben adagolt trietilaminnal. A hosszabb reakcióidő, a magasabb reakció-hőmérséklet és az utólagos tisztítási nehézségek kiküszöbölésére fejlesztettük ki a (B módszer) módszert. Ennek lényege az oldószer lecserélése etanolra, amelyben a metilamin bázis jól oldódik. Az általunk bevezetett reakciók legfőbb újdonsága a fumársav származékok alkalmazása kiindulási anyagként a korábban használt maleinsav származékok helyett. A maleinsav származékok számos mellékreakcióra hajlamosak (szemben a fumársav származékokkal), ezért az utóbbiakkal kivitelezett reakciók sokkal tisztább termékeket eredményeznek.
Feltérképeztük
továbbá
a
metilamino-szukcinimid
és
a
metilamino-
szukcinanhidrid gyűrűk képződésének és felnyílásának lehetőségeit különböző körülmények között. Kidolgoztunk az NMA és amid, illetve észter származékainak vékonyréteg kromatográfiás elválasztására alkalmas módszereket. Az NMA-α-, és β-amid az Rf értékek alapján a 2-propanol – butanon – 1 N sósav (60 : 15 : 25) eluens rendszerben, MN-300 cellulóz rétegen futtatva szignifikánsan elkülönül az NMA-tól. Az NMA-β-amid elválasztására az NMA-tól és az NMAα-amidtól a n-butanol – ecetsav – víz (60 : 15 : 25) rendszer és MN-300 cellulóz réteg alkalmas. Az előhívó reagens minden esetben a Ph.Hg.VIII. által előírt ninhidrin oldat.
107
IRODALOMJEGYZÉK AbdelMagid AF, Carson KG, Harris BD, Maryanoff CA, Shah RD. (1996) Reductive amination of aldehydes and ketones with sodium triacetoxyborohydride. Studies on direct and indirect reductive amination procedures. J. Org. Chem., 61 (11): 3849-3862. Altona C, Francke R, de Haan R, Ippel JH, Daalmans GJ, Hoekzema AJAW, van Wijk J. (1994) Empirical group electronegativities for vicinal NMR proton-proton couplings along C – C bond: Solvent effects and reparametrization of the Hasnoot Equation. Magn Reson Chem, 32: 670–678. Anderegg G. (1993) The investigation of complex formation equilibria at constant ionic strength. Talanta, 40: 243– 246. Aswad DW, Paranandi MV, Schurter BT. (2000) Isoaspartate in peptides and proteins: formation, significance, and analysis. J. Pharm. Biomed. Anal., 21: 1129–1136. Aurelio L, Box JS, Brownlee RTC, Hughes AB, Sleebs MM. (2003) An Efficient Synthesis of N-Methyl Amino Acids by Way of Intermediate 5-Oxazolidinones. J Org Chem, 68: 2652-2667. Aurelio L, Brownlee RTC, Hughes AB, Sleebs BE. (2000) The Facile Production of N-Methyl Amino Acids via Oxazolidinones. Aust J Chem, 53: 425–433. Aurelio L, Brownlee RTC, Hughes AB. (2002) A novel synthesis of N-methyl asparagine, arginine, histidine, and tryptophan. Org Lett, 4 (21) 3767-3769. Aurelio L, Brownlee RTC, Hughes AB. (2004) Synthetic preparation of N-methyl-alpha-amino acids. Chem. Rev., 104 (12): 5823-5846. Avdeef A. (2001) Physicochemical profiling (solubility, permeability and charge state). Curr. Top. Med. Chem., 1: 277–351. Bányai I, Blixt J, Glaser J, Tóth I. (1992) On the dissociation of hydrogen cyanide in aqueous solutions containing different ionic media. A combined potentiometric and carbon-13 NMR study. Acta Chem. Scand., 46, 138–141. Benoiton L. (1962) A synthesis of isoasparagine from ß-benzyl aspartate. Can J Chem, 40: 570-572. Benveniste M, Mayer ML. Effect of extracellular pH on the potency of N-methyl-D-aspartic acid receptor competitive antagonists. (1992) Mol Pharmacol., 42(4): 679-86. Bjerrum J. Metal ammine complex formation in aqueous solution. Dissertation. Haase, Copenhagen, 1941. Bruckner Gy. Szerves Kémia I-II, Nemzeti Tankönyvkiadó Rt. 1993: 892 Burger K, Sipos P, Véber M, Horváth I, Noszál B, Löw M. (1988) Formation microequilibria of proton, calcium and magnesium complexes of the gamma-carboxyglutamate ion and related compounds. Inorg. Chim. Acta, 152: 233–239. Burger K, Spengler J, Hennig L, Herzschuh R, Essawy SA. (2000) Synthesis of derivatives of omega-isocyanatoalpha-methylamino, omega-ureido-alpha-methylamino, and N-alpha-methyl alpha, omega-diamino acids. Monatsh. Chem., 131: 463-473. Burger K, Spengler J. (2000) A new approach to N-methylaspartic, N methylglutamic, and N-methyl-alpha aminoadipic acid derivatives. Eur J Org Chem, 2000: 199-204. Catarzi D, Colotta V, Varano F (2006) Competitive Gly/NMDA receptor antagonists. Curr. Top. Med. Chem., 6: 809-821. Chambers RW, Carpenter FH. (1955) On the Preparation and Properties of Some Amino Acid Amides. J Am Chem Soc, 77: 1522-1526. Chen HSV, Lipton SA. (2006) The chemical biology of clinically tolerated NMDA receptor antagonists. J. Neurochem., 97 (6): 1611-1626. Chen PE, Wyllie DJA. (2006) Title: Pharmacological insights obtained from structure-function studies of ionotropic glutamate receptors. Br. J. Pharmacol. 147 (8): 839-853. Chruma JJ, Sames D, Polt R. (1997) General Method for the Synthesis of N-Methyl Amino Acids and N-AIkyl Amino Esters from O'Donnelrs Schiff Bases. Tetrahedron Lett, 38: 5085-5086. Conti P, De Amici M, De Sarro G, Rizzo M, Stensbol TB, Brauner-Osborne H, Madsen U, Toma L, De Micheli C. (1999) Synthesis and enantiopharmacology of new AMPA-kainate receptor agonists. J Med Chem., 42(20): 4099-107. Cook AG, Voges AB, Kammrath AE. (2001) Aminal-catalysed isomerisation of and addition to dimethyl maleate. Tetrahedron Lett., 42, 7349-7352. Corsi M, Fina P, Trist DG. (1996) Co-agonism in drug-receptor interaction: illustrated by the NMDA receptors. Trends Pharmacol Sci., (6): 220-2.
108
Davies M, Wales FP. (1963) The kinetics of cis-trans isomerisation reactions in solution Trans. Faraday Soc. 51: 1506. Deming TJ. (1997) Facile synthesis of block copolypeptides of defined architecture. Nature, 390 (6658): 386-389. Dingledine R, Borges K, Bowie D, Traynelis SF. (1999) The glutamate receptor ion channels. Pharmacol. Rev., 51(1): 7-61. Ebert L. (1926) Determination of double ions in solutions of ampholytes. Z. phys. Chem., 121: 385–400. Elwood JK, Herbst RM, Kilgour Gl. (1965) Tetrazole analogues of glutamic acid. I. Reaction with glutamic dehydrogenase. J Biol Chem., 240: 2073-6. Gogas KR. (2006) Glutamate-based therapeutic approaches: NR2B receptor antagonists. Curr Opin Pharmacol., 6(1): 68-74. Epub 2005 Dec 22. Goodfellow VS, Marathe MV, Kuhlman KG, Fitzpatrick TD, Cuadrado D, Hanson W, Zuzack JS, Ross SE, Wieczorek M, Burkard M, Whalley ET. (1996) Bradykinin receptor antagonists containing N-substituted amino acids: In vitro and in vivo B-2 and B-1 receptor antagonist activity. J. Med. Chem., 39: 1472-84. Govindaraju V, Young K, Maudsley AA. (2000) Proton NMR chemical shifts and coupling constants for brain metabolites. NMR in Biomed., 13: 129–153. Greenwood JR, Capper HR, Allan RD, Johnston GAR. (1998) Heterocycles as bioisosteres for the ω-carboxylate moiety of glutamate in AMPA receptor agonists: A review and theoretical study. Internet J. Chem., 1: 38. Grünbaum Z, Patai S, Rapoport Z. (1966) Nuclephilic attack on carbon-carbon double bonds. Part X. Nucleophile catalysed cis-trans isomerisation of cis-4 -nitrochalcone and dimethylmaleate in 95% ethanol. J. Chem. Soc (B) 1133. Grunwald E, Loewenstein A, Meiboom S. (1957) Application of nuclear magnetic resonance to the study of acidbase equilibria. J. Chem. Phys., 27: 641–642. Günther H. NMR Spectroscopy; John Wiley & Sons: Chinchester, 1980, Chapter V: 160-170. Gutowsky HS, Saika A. (1953) Dissociation, chemical exchange and the proton magnetic resonance in some aqueous electrolytes. J. Chem. Phys., 21: 1688–1694. Hoult DI. (1976) Solvent peak saturation with single-phase and quadrature Fourier transformation. J. Magn. Reson., 21: 337–347. Irving HM, Miles MG, Pettit LD. (1967) A study of some problems in determining the stoichiometric proton dissociation constants of complexes by potentiometric titrations using a glass electrode. Anal. Chim. Acta, 38: 475–488. Karplus M. (1959) J. Chem. Phys., 30: 11-15. Karplus M. (1960) J Phys Chem, 64: 1793–1798. Karplus M. (1963) J. Am. Chem. Soc., 85: 2870-2871. Katritzky AR, Yao JC, Qi M, Chou YT, Sikora DJ, Davis S. (1998) Ring opening reactions of succinimides. Heterocycles 48 (12): 2677-2691. Kemp JA, McKernan RM. (2002) NMDA receptor pathways as drug targets. Nat Neurosci., 5: 1039-1042. Koeberg-Telder A, Cerfontain H. (1975) Solutes in sulphuric acid. Part VI. A nuclear magnetic resonance study of organic sulphonic acids and 1 H nuclear magnetic resonance standards; pKBH determination of sulphonic acids. J. Chem. Soc. Perkin Trans. 2, 226–229. Kraszni M, Szakács Z, Noszál B. (2004) Determination of rotamer populations and related parameters from NMR coupling constants. A critical review. Anal. Bioanal. Chem., 378: 1449–1463. Leggett D. J. (Ed.) Computational methods for the determination of formation constants. Plenum Press, New York, 1986. Liwschitz Y, Edlitz-Pfeffermann Y, Lapidoth Y. (1956) Syntheses of Aspartic Acid Derivatives. II. N-Alkylated alpha- and beta-Asparagines. J Am Chem Soc, 78: 3069-3072. Liwschitz Y, Zilkha A. (1954) Syntheses of Aspartyl Amides and Peptides through N-Benzyl-dl-aspartic Acid. J Am Chem Soc, 76: 3698-3701. Low CM, Lyuboslavsky P, French A, Le P, Wyatte K, Thiel WH, Marchan EM, Igarashi K, Kashiwagi K, Gernert K, Williams K, Traynelis SF, Zheng F. (1992) Molecular determinants of proton-sensitive N-methyl-D-aspartate receptor gating. Mol Pharmacol., 63(6): 1212-22. Lunn WH, Schoepp DD, Calligaro DO, Vasileff RT, Heinz LJ, Salhoff CR, O'Malley PJ. (1992) DL-tetrazol-5ylglycine, a highly potent NMDA agonist: its synthesis and NMDA receptor efficacy. J Med Chem., 35(24): 4608-12. Maddaluno J, Corruble A, Leroux V, Ple G, Duhamel P. (1992) Handy access to chiral n,n'-disubstituted 3aminopyrrolidines. Tetrahedron: asymmetry, 3 (10): 1239-1242.
109
Madsen U, Brauner-Osborne H, Greenwood JR, T.N. Johansen, P. Krogsgaard-Larsen, T. Liljefors, M. Nielsen, B. Frolund, GABA and Glutamate Receptor Ligands and Their Therapeutic Potential in CNS Disorders. ed. Shayne Cox Gad, Drug Discovery Handbook, John Wiley & Sons Ltd, Chichester West Sussex, 2005: ch. 18, 797-907. Madsen U, Schaumburg K, Brehm L, Curtis DR, Krogsgaard-Larsen P. (1986) Ibotenic acid analogues. Synthesis and biological testing of two bicyclic 3-isoxazolol amino acids. Acta Chem Scand B., 40(2): 92-7. Martin RB, Mathur R. (1965) Analysis of proton magnetic resonance spectra of cysteine and histidine and derivatives. Conformational equilibria. J. Am. Chem. Soc., 87: 1065-70. Matzen L, Engesgaard A, Ebert B, Didriksen M, Frolund B, Krogsgaard-Larsen P, Jaroszewski JW. (1997) AMPA receptor agonists: synthesis, protolytic properties, and pharmacology of 3-isothiazolol bioisosteres of glutamic acid. J Med Chem., 40(4): 520-7. Michaelis EK. (1998) Molecular biology of glutamate receptors in the central nervous system and their role in excitotoxicity, oxidative stress and aging. Prog. Neurobiol., 54: 369 – 415. Nabuchi Y, Fujiwara E, Kuboniwa H, Asoh Y, Ushio H. (1997) The stability and degradation pathway of recombinant human parathyroid hormone: Deamidation of asparaginyl residue and peptide bond cleavage at aspartyl and asparaginyl residues. Pharm. Res., 14 (12): 1685-1690. Nancollas GH, Tomson MB. (1982) Guidelines for the determination of stability constants. Pure Appl. Chem., 54, 2675–2692. Naumann R, Alexander-Weber CH, Eberhardt R, Giera J, Spitzer P. (2002) Traceability of pH measurements by glass electrode cells: performance characteristic of pH electrodes by multi-point calibration. Anal. Bioanal. Chem., 374: 778–786. Noszál B, Sándor P. (1989) Rota-microspeciation of aspartic acid and asparagine. Anal. Chem., 61: 2631–6237. Noszál B, Szakács Z. (2003) Microscopic Protonation Equilibria of Oxidized Glutathione. J. Phys. Chem. B, 107 (21): 5074–5080. Noszál B. Acid-base properties of bioligands. ed: Burger K. Biocoordination chemistry: coordination equilibria in biologically active systems. Ellis Horwood, Chichester, 1990: ch. 2, pp. 18–55. Noszál B. Group constant: a measure of submolecular basicity. (1986) J. Phys. Chem., 90: 4104–4110. Nozaki K. (1941) J.Am.Chem.Soc. 63: 2681. Oliyai C, Borchardt RT. (1994) Chemical pathways of peptide degradation .6. effect of the primary sequence on the pathways of degradation of aspartyl residues in model hexapeptides. Pharm. Res., 11 (5): 751-758. Oppolzer W, Cintas-Moreno P, Tamura O, Cardinaux F. (1993) Enantioselective Synthesis of -N-Alkylamino Acids via Sultam-Directed Enolate Hydroxyamination. Helv Chim Acta, 76: 187-196. Ortwine DF, Malone TC, Bigge CF, Drummond JT, Humblet C, Johnson G, Pinter GW. (1992) Generation of Nmethyl-D-aspartate agonist and competitive antagonist pharmacophore models. Design and synthesis of phosphonoalkyl-substituted tetrahydroisoquinolines as novel antagonists. J Med Chem., 35(8): 1345-1370. Papaioannou D, Athanassopoulos C, Magafa V, Karamanos N, Stavropoulos G, Napoli A, Sindona G, Aksnes DW, Francis GW. (1994) Redox N-alkylation of tosyl protected amino-acid and peptide esters. Acta Chem Scand, 48: 324-333. Patai S, Rapoport Z. The chemistry of alkenes Interscience, New York, 1964: 525-555. Perrin DD, Dempsey B, Serjeant EP. pKa prediction for organic acids and bases, Chapman and Hall, London, 1981: 27-32. Pfeiffer P. (1914) Ber., 47: 1592. Piispanen PS, Pihko PM. (2005) Direct synthesis of N-substituted, functionalized aspartic acids using alkali maleates and amines. Tetrahedron Lett., 46 (16): 2751-2755. Pople JA. (1958) Mol Phys, 1: 3–8 Rabenstein DL, Hari SP, Kaerner A. (1997) Determination of acid dissociation constants of peptide side-chain functional groups by two-dimensional NMR. Anal. Chem., 69: 4310–4316. Reddy GV, Iyengar DS. (1999) A simple and rapid protocol for N-methyl-alpha-amino acids. Chem Lett, 28: 299300. Reppe W, Ufer H. (1937) N-substituted aspartic acids and their functional derivatives and process of producing them. 1246815; Patent; I.G.Farbenind. U.S. Patent 2,200,220. Robbins TW, Murphy ER (2006) Behavioural pharmacology: 40+years of progress, with a focus on glutamate receptors and cognition. Trends Pharmacol Sci., 27(3): 141-8. Seleni A, D’Aniello S, Perna AF, Ingrosso D. (2000) Occurrence of D-aspartic acid and N methyl-D-aspartic acid in rat neuroendocrine tissues and their role in the modulation of luteinizing hormone and growth hormone release. Faseb J., 14: 699-714. Sohár P. Mágneses magrezonancia spektroszkópia. Akadémiai Kiadó, Budapest, 1976: 40.
110
Sterk H, Holzer H. (1974) Relation between chemical shifts and charge densities. Org. Magn. Reson., 6: 133–143. Sudmeier JL, Reilly CN. (1964) Nuclear magnetic resonance studies of protonation of polyamine and aminocarboxylate compounds in aqueous solution. Anal. Chem., 36: 1698-1706. Szakács Z, Hägele G, Tyka R. (2004) 1 H/31 P NMR pH indicator series to eliminate the glass electrode in NMR spectroscopic pKa determinations. Anal. Chim. Acta, 522: 247–258. Szakács Z, Hägele G. (2004) Accurate determination of low pK values by 1 H NMR titration. Talanta, 62, 819–825. Szakács Z, Kraszni M, Noszál B. (2004) Determination of microscopic acid-base parameters from NMR-pH titrations. Anal. Bioanal. Chem., 378 (6): 1428–1448. Szakács Z. A glutation mikrospeciációja és kapilláris elektroforézis analízise. ELTE 1998. Tam JP, Riemen MW, Merrifield RB. (1988) Mechanism of aspartimide formation: the effects of protecting groups, acid, base temperature and time. Pept Res, 1: 6-18. Thern B, Rudolph J, Jung G. (2002) Triphosgene as highly efficient reagent for the solid-phase coupling of Nalkylated amino acids - total synthesis of cyclosporin O. Tetrahedron Lett, 43: 5013-5016. van Leeuwen SH, Quaedflieg PJLM, Broxtermanc QB, Liskampa RMJ. (2002) Synthesis of amides from unprotected amino acids by asimultaneous protection–activation strategy using dichlorodialkyl silanes. Tetrahedron Lett., 43: 9203–9207. Verardo G, Geatti P, Pol E, Giumanini AG. (2002) Sodium borohydride: A versatile reagent in the reductive N monoalkylation of -amino acids and -amino methyl esters. Can J Chem, 80: 779–788. Vitoux B, Aubry A, Cung MT, Marraud M. (1986) N-methyl peptides .7. Conformational perturbations induced by n-methylation of model dipeptides. Int. J. Pept. Protein Res., 27 (6): 617-632. Wahl P, Madsen U, Banke T, Krogsgaard-Larsen P, Schousboe A. (1996) Different characteristics of AMPA receptor agonists acting at AMPA receptors expressed in Xenopus oocytes. Eur. J. Pharmacol., 308: 211-218. Watkins JC. (1962) The synthesis of some acidic amino acids possessing neuropharmacological activity. J Med Pharm Chem, 5: 1187-1199. Wisniewski K, Kotodziejczyk AM. (1997) Pmc-protected Amino Acid Esters as Substrates in N-alkylamino Acid Synthesis. Tetrahedron Lett, 38: 483-486. Zilkha A, Bachi MD. (1959) Syntheses of N-Alkyl-aspartic Acids and N2-Alkyl-alpha-asparagines. J Org Chem, 24: 1096 – 1098.
111
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK Az értekezés témájában megjelent közlemények Miklós Boros, József Kökösi, József Vámos and Béla Noszál: Site-specific acid-base properties of N-methyl-Daspartic-acid and related compounds. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2006. Elfogadva, megjelenés alatt. Miklós Boros, József Kökösi, József Vámos, István Kövesdi, Béla Noszál: Methods for syntheses of N-methyl-DLaspartic acid derivatives. Amino Acids 2006. Elfogadva, megjelenés alatt. Boros Miklós ; Vámos Jozsef ; Kökösi József ; Szokán Gyula ; Rácz Akos ; Noszál Béla (2003) Amidcsoport szelektív kialakítása dikarbonsavakban (Synthesis of dicarboxylic acid monoamides). Acta Pharmaceutica Hungarica (Acta Pharm. Hung.). 73: 51-59.
ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK JEGYZÉKE Boros Miklós, Noszál Béla (2001) Az N-metil-D-aszparaginsav (NMDA) rotamer populációinak és protonálódási állandóinak meghatározása. VII. Korányi Frigyes Tudományos Fórum. (előadás) Boros Miklós, Dr. Noszál Béla, Dr Kökösi József (2001) Az N-metil-D-aszparaginsav (NMDA) rotamer populációinak és protonálódási állandóinak meghatározása. Fiatal Szerves Analitikusok Publikációs Fóruma. (előadás) Boros Miklós, Dr. Noszál Béla, Dr Kökösi József (2002) Az N-metil-D-aszparaginsav (NMDA) rotamer populációinak és protonálódási állandóinak meghatározása. Ph.D. Tudományos Napok. (előadás) Boros Miklós, Dr. Noszál Béla, Dr Kökösi József (2002) Az N-metil-D-aszparaginsav (NMDA) rotamer populációinak és protonálódási állandóinak meghatározása. VI. Clauder Ottó Emlékverseny. (előadás) Boros Miklós, Dr. Kökösi József, Dr. Vámos József, Dr. Noszál Béla (2003) N-metil-dl-aszparaginsav-alfa-amid és N-metil-dl-aszparaginsav-béta-amid előállítása. Ph.D. Tudományos Napok. (előadás) Boros Miklós, Dr. Kökösi József, Dr. Vámos József, Dr. Szókán Gyula Dr. Noszál Béla (2003) N-metil-dlaszparaginsav-alfa-amid és N-metil-dl-aszparaginsav-béta-amid előállítása. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XII. (poszter) Boros Miklós (2004) N-metil-aszparaginsav NMR-pH jellemzése. VII. Clauder Ottó Emlékverseny. (előadás) Miklós Boros, Béla Noszál, József Kökösi, József Vámos (2005) Acid-base properties of N-methyl-aspartic-acid. II. PhD Joint Meeting on Biomedical Sciences (előadás) Boros Miklós, Kökösi József, Vámos József, Noszál Béla (2006) Az N-metil-aszparaginsav NMR-pH jellemzése. Congressus Pharmaceuticus Hungaricus XIII. (poszter)
112
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom: ¾
Dr. Noszál Béla egyetemi tanárnak, témavezetőmnek, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet igazgatójának sokoldalú segítségéért és értékes tanácsaiért, valamint hogy biztosította számomra a kísérleti munka feltételeit.
¾
Dr. Kökösi Józsefnek, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet tudományos főmunkatársának a szintetikus munkában, a dolgozat bizonyos fejezeteinek megírásában és a szakirodalmak áttekintésében nyújtott segítségéért.
¾
Dr. Vámos Józsefnek, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet tudományos főmunkatársának a kromatográfiás rendszerek kidolgozásában nyújtott segítségéért.
¾
Dr. Újszászi Kálmánnak és Dr. Kövesdi Istvánnak, az EGIS Gyógyszergyár Rt. Szerkezetkutatási Osztály vezetőinek, valamint a Szerkezetkutatási Osztály valamennyi munkatársának, hogy négy éven keresztül lehetővé tették számomra az NMR mérések végzését és mind gyakorlati, mind elméleti
útmutatásaikkal segítségemre volt azok
kivitelezésében. ¾
Dr. Szakács Zoltánnak, az Eötvös Loránd Tudományegyetem Szervetlen és Analitikai Kémiai Tanszék egyetemi tanársegédének a potenciometriás és NMR titrálások kiértékelésében nyújtott segítségéért.
¾
Rácz Ákosnak, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet egyetemi tanársegédének a molekulamechanikai számítások elvégzéséért és kiértékeléséért.
¾
Dr. Mazákné Dr. Kraszni Mártának, a Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet egyetemi tanársegédének az NMR mérésekhez nyújtott segítségéért.
¾
Dr Demeter Ádámnak, a Richter Gedeon Rt. Hatóanyagmorfológiai Osztály vezetőjének a disszertáció megírásában nyújtott segítségéért.
¾
A Semmelweis Egyetem Gyógyszerészi Kémiai Intézet valamennyi munkatársának támogatásukért és biztatásukért.
113
