Az idiopathiás scoliosis molekuláris biológiai vizsgálata

Az idiopathiás scoliosis molekuláris biológiai vizsgálata Ph.D. értekezés

Czibula Ágnes Témavezetı: Dr. Raskó István

MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai Intézet

Biológiai Ph.D. Iskola, SZTE TTIK

SZEGED 2010

Czibula Ágnes: Az idiopathiás scoliosis molekuláris biológiai vizsgálta

Ph.D. értekezés, 2010

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ............................................................................................................................. 4 IRODALMI ÁTTEKINTÉS ................................................................................................................................ 6 GENETIKAI MEGKÖZELÍTÉSEK AZ EMBERI BETEGSÉGEK ÖRÖKLETES TÉNYEZİINEK FELTÁRÁSÁRA .................... 6 AZ IDIOPATHIÁS SCOLIOSIS DEFINÍCIÓJA ............................................................................................................. 9 Az AIS klinikai tünetei .................................................................................................................................. 10 Cobb fok meghatározása.............................................................................................................................. 11 A gerincferdülés terápiája ........................................................................................................................... 12 A gerincferdülés epidemiológiája ................................................................................................................ 13 Az idiopathiás scoliosis etiológiája.............................................................................................................. 13 Strukturális eltérések ................................................................................................................................................. 14 Neurológia rendellenességek ..................................................................................................................................... 16 Növekedési és biomechanikai hatások ...................................................................................................................... 16 Vérlemezkék rendellenességei .................................................................................................................................. 17 Hormonok szerepe az AIS-ben .................................................................................................................................. 18 Genetikai tényezık .................................................................................................................................................... 19

Az etiológiai teóriák összegzése ................................................................................................................... 22 AZ ÉRTEKEZÉS SZEMPONTJÁBÓL KIEMELTEN FONTOS ETIOLÓGIAI FAKTOROK.................................................. 23 Leptin ........................................................................................................................................................... 23 Leptin szerepe a csonttömeg szabályozásban ............................................................................................................ 24 Leptinszint nemek közötti különbsége ...................................................................................................................... 26 Polimorfikus helyek vizsgálat a LEP gén szabályozó régiójában .............................................................................. 26 Leptin és az AIS ........................................................................................................................................................ 28

Az interleukin 6 ............................................................................................................................................ 28 Az IL6 szerepe a csontátépítésben............................................................................................................................. 29 Polimorfikus helyek vizsgálat az IL6 gén szabályozó régiójában ............................................................................. 30 Az IL6 és az AIS ....................................................................................................................................................... 31

CÉLKITŐZÉSEK .............................................................................................................................................. 33 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK......................................................................................................................... 34 KÍSÉRLETBE BEVONT SZEMÉLYEK ADATAI ÉS MINTÁI ....................................................................................... 34 DNS ALAPÚ MUNKAFOLYAMATOK ................................................................................................................... 35 Genomikus DNS tisztítása ............................................................................................................................ 35 SNP-k kimutatása PCR-RFLP módszerrel ................................................................................................... 35 RNS ALAPÚ MUNKAFOLYAMATOK ................................................................................................................... 37 RNS izolálás ................................................................................................................................................. 37 Northern gél elektroforézis .......................................................................................................................... 37

2



RNS mintacsoportok tisztítása ..................................................................................................................... 38 Fluoreszcensen jelölt próba készítése a microarray hibridizáláshoz........................................................... 39 A cDNS és a 3DNA hibridizációja a CHIP-hez ........................................................................................... 40 A hibridizáció utáni kiértékelés.................................................................................................................... 41 Valós idejő kvantitatív polimeráz láncreakció (QRT-PCR) ......................................................................... 42 STATISZTIKAI ANALÍZIS .................................................................................................................................... 43 A MUNKA SORÁN HASZNÁLT FONTOSABB ONLINE BIOINFORMATIKAI ESZKÖZÖK ÉS ADATBÁZISOK INTERNET CÍMEI:

............................................................................................................................................................... 44

EREDMÉNYEK ................................................................................................................................................. 45 PARAVERTEBRÁLIS IZMOK RNS KIFEJEZİDÉSI MINTÁZATÁNAK VIZSGÁLATA CHIP MICROARRAY-VEL .......... 45 EGÉSZSÉGES ÉS SCOLIOSISOS BETEGEK IZOMBIOPSZIÁJÁNAK GÉNKIFEJEZİDÉSBELI ÖSSZEHASONLÍTÁSA ........ 45 SCOLIOSISOS BETEGEKBEN A GERINCOSZLOP KÉT OLDALÁRÓL SZÁRMAZÓ IZOMBIOPSZIÁK GÉNKIFEJEZİDÉSBELI ÖSSZEHASONLÍTÁSA ....................................................................................................... 49

PARAVERTEBRÁLIS IZMOKBAN KIFEJEZİDİ MRNS-EK VIZSGÁLATA QRT-PCR-REL ....................................... 53 POLIMORFIKUS HELYEK VIZSGÁLATA ............................................................................................................... 55 Leptin promóter G-2548A polimorfizmusa .................................................................................................. 55 IL6 promóter C-174G polimorfizmusa ........................................................................................................ 57 A két polimorfizmus IS kialakulására hajlamosító együttes hatásának vizsgálata ...................................... 58 A polimorfizmusok hatása az IS súlyosbodására ......................................................................................... 60 EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA .................................................................................................................. 61 IRODALOMJEGYZÉK .................................................................................................................................... 67 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................................................................ 78 ÖSSZEFOGLALÁS ........................................................................................................................................... 79 SUMMARY ......................................................................................................................................................... 83 KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA ............................................................................................................................ 87

3



RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACAN AIS BMP4 C/EBP CART CDK5 CHD7 CHRDL1 CI COL DEPC DST EDTA EEG ER EST FBN FGF FOXO 1 GDF GHR GLM GO GPC HIF-1 HOX7 HPRT HS3ST3 HWE IGF IL4R IL6 IRX IS JAK1 KCNA LD LEP LMNA MATN MDR

agrecan adolescens idiopathiás scoliosis, serdülıkori, ismert ok nékül kialakuló gerincferdülés bone morphogenetic protein 4 CCAAT/enhancer binding protein cocaine- and amphetamine-regulated transcript cyclin-dependent kinase 5 chromodomain helicase DNA binding protein 7 chordin-like 1 confidence interval, megbízhatósági mérettartomány collagen diethylpyrocarbonate dystonin ethylenediaminetetraacetate elektro-enkefalográf estrogen receptor expressed sequence tag fibrillin fibroblast growth factor forkhead box O1 growth differentiation factor growth hormone receptor Generalizált Lineáris Model génontológia glypican hypoxia inducible factor 1 msh homeobox 1 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 heparan sulfate (glucosamine) 3-O-sulfotransferase, Hardy-Weinberg egyensúly insulin-like growth factor receptor interleukin 4 receptor interleukin-6 iroquois homeobox idiopathiás scoliosis, ismert ok nékül kialakuló gerincferdülés Janus kinase 1 potassium voltage-gated channel, shaker-related subfamily linkage disequilibrium , kapcsoltsági kiegyenlítetlenség leptin lamin A matrilin Multifaktoros Dimenzionalitás Redukció 4


MFAP ML MOPS MTNR NLRP12 NOS NP NTF OMIM OR PCR PCR-RFLP POSTN PRKAG2 QRT-PCR RANK RANKL SAGE SDS SH3GL1 SLC2A1 SNP SNS SNTG SRS SSC TNS1 UTR VDR


microfibrillar associated protein maximum likelihood 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid melatonin receptor NLR family, pyrin domain containing 12 nitric oxide synthase nucleus pulposus neurotrophin Online Mendelian Inheritance in Man odds ratio, esélyhányados polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció polymerase chain reaction based restriction fragment length polymorphism periostin protein kinase, AMP-activated, gamma 2 non-catalytic subunit alfa 1 quantitative real time polymerase chain reaction, valós idejő kvantitatív polimeráz láncreakció NF-κβ activator NF-κβ receptor activator ligand Serial Analysis of Gene Expression Sodium dodecyl sulfate SH3-domain GRB2-like 1 solute carrier family 2 (facilitated glucose transporter), member 1 single nucletide polimorphism, egypontos nukleotid-polimorfizmus sympathetic nervous system syntrophin Scoliosis Research Society saline-sodium citrate tensin 1 untranslated region, nem transzlálódó régió vitamin D receptor

5



IRODALMI ÁTTEKINTÉS

Az orvostudomány egyik nagy és napjainkban egyre nagyobb jelentıségő feladata a betegségek hátterében álló örökletes tényezık felderítése. A tudás birtokában lehetıvé válik a betegség kialakításáért felelıs molekuláris mechanizmusok megismerése és ezáltal célzott terápia kialakítása. Természetesen nagyon hosszú az út a labortól a betegágyig; több tudományterületen dolgozó sok kutató és sok orvos munkájára van szükség ahhoz, hogy egy terápia vagy gyógyszer a betegségben szenvedık gyógyulását jelenthesse. A személyre szabott orvosláshoz az elsı lépés a betegség pathomechanizmusának feltárása és ebben sarkalatos pont a betegséget okozó, vagy az arra hajlamosító gének leírása.

Genetikai megközelítések az emberi betegségek örökletes tényezıinek feltárására

A humángenetika alapjait jelentı öröklıdési mechanizmusok egy részét már jóval a gének természetének megismerése elıtt leírták. 1866-ban Gregor Mendel által publikált öröklıdési törvények az emberi betegségek egy részének az öröklıdésére is igazak; a mai napig az egyetlen gén hibájából kialakuló betegségeket mendeli öröklıdéső betegségeknek nevezik a szakirodalomban. 1911-ben kezdıdött meg az emberi kapcsoltsági csoportok leírása annak a megfigyelésével, hogy színtévesztés ugyanúgy öröklıdik, mint az X kromoszóma. Az 1970-es években kifejlesztették a kromoszóma festés módszerét, ami lehetıvé tette az autoszomális kromoszómán elhelyezkedı gének öröklıdésének követését. Ugyanebben az évtizedben klónozták az elsı humán gént, a β-globint, és kimutatták, hogy a β-globin lánc 6. aminosavának cseréje okozza a sarlóssejtes vérszegénységet. Ez volt az elsı humán betegség, aminek meghatározták a genetikai okát. 1976-ban pedig már rendelkezésre álltak azok a DNS próbák, melyekkel prenatális diagnosztikát lehetett végezni a vérszegénység kimutatására. 1994-ben 600, 2001-ben 1112, napjainkban pedig az OMIM adatbázis 2010. márciusi adata alapján, 3063 mendeli módon öröklıdı betegség génje ismert (Peltonen and McKusick, 2001; Rasko, 1994). Az új évszázadban a monogénes betegségek kutatásáról a bonyolultabb, nem mendeli öröklıdésmenető betegségek felé fordult a figyelem, amiket komplex betegségeknek 6



neveznek, mivel több gén a környezeti hatásokkal kölcsönhatásban alakítja ki ıket. A komplex betegségek a társadalom nagyobb részét érintik, mint a ritkán elıforduló monogénes betegségek; ide tartoznak többek között a szív- és érrendszeri betegségek, a cukorbetegség és a pszichiátriai betegségek nagy része. A betegségeket okozó gének felderítésére alapvetıen két módszert használnak: a kapcsoltsági analízist és az asszociációs vizsgálatokat. A kettı között a lényegi különbség az, hogy a kapcsoltsági analízis a családfa elemzésekkel lokuszokat kapcsol a betegséghez, míg az asszociációs vizsgálatokban populációk összehasonlításával egy gén valamelyik allélját kötik az adott betegségekhez. Mindkét analízis használható mind a „reverz” mind „forward” genetikai megközelítéssel. A „reverz” genetikai megközelítés szerint véletlenszerő, anonim markerekkel végzik a vizsgálatot és utána keresik meg a jelölt markerrel fizikai kapcsolatban lévı, betegséget okozó lokuszt, míg a „forward” genetikával a betegséggel valamilyen ok alapján kapcsolatba hozható gén (kandidáns gén) polimorfizmusát vizsgálják. A kapcsoltsági analízist a mendeli öröklıdéső betegségek vizsgálatára használták nagy sikerrel, komplex betegségek esetén kevésbé alkalmazható ez a módszer, mivel csak a nagy hatású géneket tudták vele azonosítani. Ennek oka a komplex betegségek jellegzetességeiben rejlik. Elıször is a betegség fenotípusos megjelenése, kialakulásának idıpontja, súlyossága nagyon eltérı, ami mögött a hasonló tüneteket okozó, de molekuláris folyamataiban különbözı pathomechamizmus állhat. Másrészrıl a komplex betegségeket nem egy, hanem több, alacsony penetranciájú, viszonylag kis kockázatú gén okozza, ráadásul a fenotípus kialakulását még környezeti tényezık is befolyásolják. Az asszociációs vizsgálatok használata a humángenetikusok leggyakrabban alkalmazott módszerévé vált, amit a Human Genom Program befejezıdése után beindult HapMap projekt adatainak felhasználása tesz alkalmassá a komplex betegségek vizsgálatára. A kapcsoltsági kiegyenlítetlenségen alapuló térképezés (linkage disequilibrium maping, LD) az asszociációs vizsgálatok „reverz” genetikai megközelítése. Azon a feltételezésen alapul, hogy betegségre hajlamosító allél a közvetlen szomszédságában lévı polimorfikus helyekkel együtt öröklıdik, míg a tıle távolabb lévı polimorfizmusok a betegséget okozó mutáció kialakulása óta eltelt idıben, a rekombináció miatt, kapcsoltsági egyensúlyba kerülnek. A kapcsoltsági kiegyenlítettlenséget statisztikai eszközökkel mutatják ki. A polimorfizmusok közül az asszociációs vizsgálatra a legalkalmasabbak az egypontos nukleotid-polimorfizmusok (SNP), melyek az emberi genetikai variációk 90%-át jelentik és átlagosan minden 300 bp-nyi DNS szakaszon egy elıfordul belılük. Az LD térképezés alkalmas a kandidáns gén kiválasztására,

7



amit aztán további asszociációs vizsgálatokban az immár a „forward” genetikai megközelítés szerint vizsgálhatnak. A komplex betegségek epidemiológiai kutatásaiban a patológiás eltéréseket kísérı génexpressziós változások vizsgálata a technikai tudásunk fejlıdése után válhatott a jelölt gének kiválasztásának új módszerévé napjainkban. A századforduló környékén a hibridizáláson és a szekvenáláson alapuló génexpressziós vizsgálatok vonatkozásában is átütı technológiai újítások történtek. Egyrészrıl a DNS microarray vagy DNS chip technika elterjedése, amely során egyetlen hibridizálási lépésben egy tárgylemeznyi területen több tízezer mRNS analizálható egyszerre (1. ábra) (DeRisi et al., 1996), másrészrıl a szekvenáláson alapuló nagy kapacitású módszerek kifejlesztése (Serial Analysis of Gene Expression-SAGE, Next Generation Sequencing) adtak lehetıséget a transzkriptoma szintjén történı változások detektálására. Bioinformatikai adatfeldolgozás és körültekintı statisztikai elemzések után lehet olyan géneket kiválasztani, amelyek további vizsgálatokra érdemesek. A kandidáns gének alléljainak elıfordulási gyakoriságát a beteg és az egészséges kontroll populációban az ún. eset-kontroll tanulmányokban hasonlítják össze. Amennyiben valamely allél elıfordulási gyakorisága szignifikánsan magasabb a beteg populációban, akkor az adott gén, adott allélját a betegségre hajlamosítónak tekintik.

1. ábra cDNS-chipek alkalmazása génexpressziós mintázatok nyomonkövetésére

Jelen dolgozat egy komplex betegség, az idiopathiás scoliosis genetikai hátterét kutatja a DNS chip technikán alapuló kandidáns gén kiválasztása után, „forward” genetikai megközelítéssel, eset-kontroll asszociációs tanulmányban.

8



Az idiopathiás scoliosis definíciója A gerincoszlop betegségei a két lábon járás óta érintik az emberiséget. A gerinc oldalirányú elhajlását Hippocrates írja le elıször, melyet izomproblémának tekint. Celsus -a Krisztus utáni I. században- a gerincdeformitások kezelésére a tornáztatást javasolja. Az orvostudományban a gerincnek a tér mindhárom irányába történı elferdülésére Galenus a II. században a scoliosis nevet adta, ami a görögül azt jelenti, hogy görbe, ferde. A XIX. század közepén Bauer írja le elıször a betegség súlyos tünetekkel járó, fiatalkorban manifesztálódó formáját, és idiopathiás scoliosisnak nevezi. 1966-ban megalakul a gerincferdülésekkel foglalkozó orvosokat, kutatókat nemzetközi szinten összefogó szervezet, a Scoliosis Research Society (SRS) és definíciója alapján az idiopathiás scoliosis (IS) a gerinc ismeretlen okból létrejövı strukturális laterális elhajlása minimum 10°-os Cobb szöggel (normális görbülettıl való eltérés fokban kifejezve) és megegyezı csigolya rotációval.

Raffaello: A három grácia, (1498 körül). A középen álló grácián jobbra konvex scoliosis látszik (Musée Condé, Chantilly)

9



A gerincferdülések egy része nem stukturális (tartási, kompenzációs scoliosis), vagy csak átmenetileg (pl. gyulladás miatt) kialakuló strukturális gerincdeformitás, nagyobb részüket azonban szerkezeti eltérések jellemzik, ezért strukturálisak. A strukturális scoliosisok egy része veleszületett rendellenesség, más részük valamilyen más szindrómához társultan jelentkezik

(pl.

neuromuszkuláris

betegségekhez,

kötıszöveti

betegségekhez,

neurofibromatosishoz) és nagy részük kialakulásának az oka nem ismert. A gerincferdülések 70-80%-át a strukturális idiopathiás scoliosis adja, melynek a megjelenés ideje alapján három különbözı típusa különíthetı el: infantilis (0-3 életév), juvenilis (4-9 év), adolescens (10-18 év). A zárójelben lévı évszámok a betegség kezdetét jelzik, de a csontosodás állapotától függıen kissé eltérhetnek a megadott értéktıl. Vizsgálataink során a leggyakrabban elıforduló, és ezért a kutatások homlokterében álló adolescens idiopathiás scoliosisra (AIS) fókuszáltunk.

Az AIS klinikai tünetei

Gyermekkorban a deformitás az egyetlen tünet, ekkor fájdalom még nem jelentkezik. Aszimmetrikus a nyak-váll vonal, a lapockák vonala, a bordák és a csípılapátok elhelyezkedése. A konvex oldalon a nyak-váll vonal és a lapocka magasabban áll, utóbbi a törzstıl elemelkedik.

2. ábra Scoliosisos nıbeteg

10



A deformitás a gerinc több régióját is érintheti. A háti görbület a leggyakrabban elıforduló, míg a nyaki vagy a medencei régió ritkán deformálódik. Az esetek 90%-ban a jobbra konvex dorzális (háti) scoliosis fordul elı (2. ábra).

Cobb fok meghatározása A klinikai vizsgálatok során nagyon fontos a mellkas röntgen felvétele és az alapján az ún. Cobb fok meghatározása. A Cobb˚ a gerinc görbületének mértékét adja meg és fontos a további diagnosztikában, illetve a megfelelı terápia kiválasztásában. A mellkas anteroposterior felvételén láthatóvá válik a frontális síkú elhajlás mértéke. A Cobb˚meghatározásakor az alsó és felsı végcsigolyák görbület csúcsától távolabb esı zárólemezével párhuzamos vonalra egy-egy merılegest húzunk, és az általuk bezárt szög adja a görbület mértékét (3. ábra).

3. ábra A röntgen felvételen egy 62 Cobb˚-os scoliosisos gerincoszlop látszik

Nagyon fontos a görbület mértékének meghatározása a scoliosis megjelenésekor, mert a betegség mindaddig progrediálhat, amíg a csontosodás be nem fejezıdik, tehát minél fiatalabb a gyerek és minél nagyobb a növekedési potenciálja, valamint minél súlyosabb a deformitás az észlelés pillanatában, annál nagyobb eséllyel fog tovább romlani a görbület mértéke. A korai iskolai szőréseken az Adam tesztet használják a gerincferdülés korai stádiumban történı felfedezéséhez, melynek során a vizsgáló iskolaorvos megkéri a gyermeket, hogy törzsben hajoljon elıre, térdben ne hajlítson, a karjait engedje szabadon lógni, és megvizsgálja, hogy nincs e borda- vagy paravertebrális izom elıemelkedés. Hazánkban évente mintegy 450 új esettel kell számolni, melyek közül 150 gyermeknek van szüksége orthopédiai kezelésre.

11



A gerincferdülés terápiája A scoliosisos beteg kezelését befolyásolja a beteg életkora -biológiai és csontkor-, a görbület típusa és lokalizációja. A konzervatív kezelés célja a progresszió lassítása. Ebbıl a célból gyógytorna, ill. főzı viselése javasolt. Speciális

gyógytorna

elsajátítása

gyógytornász

segítségével, melyet a beteg késıbb otthonában végezhet, lehetıleg mindennap. Ajánlott kiegészítı testmozgás az úszás, mely a gerincoszlop csökkent gravitációs terhelése mellett mindkét testfél izomzatát egyformán terheli. Az iskolai tornaóra alól csak a súlyosabb esetekben szükséges felmentés, enyhébb formáknál csak a kritikus feladatokat kell mellızni. Ma már csak az esztétikailag elfogadható alacsony profilú főzıket alkalmazzák. Főzı viselése javasolt 15-40 Cobb˚ között, és ha a nagyfokú görbület ellenére a 4. ábra Nicolas Andry ortopédiai szakkönyv illusztrációja, Párizs 1741

mőtét valamely okból ellenzett.

Mőtéti kezelés szükséges, ha az ágyéki görbület meghaladja a 30 Cobb fokot, vagy a háti görbület a 40 Cobb fokot. Hatalmas elırelépést jelentett, és alapvetıen új lehetıségeket teremtett a gerincdeformitások kezelésében Yves Cotrel és Jean Dubousset munkássága, akik 1983-ban új megközelítéső multiszegmentális rögzítést biztosító korrekciós eszközt vezettek be a kezelésbe. A mőtéti technika forradalmasította a gerinc deformitások sebészetét. A technika alapja, hogy a deformált gerincet több helyen horgokkal rögzítik a kívánt fiziológiás görbületeknek megfelelıen meghajlított rúdhoz, majd a mőtıasztalon a rúd 90°-os elforgatásával korrigálják az oldalirányú deformitást, így kialakulnak a fiziológiás görbületek. Kb. 3 hónappal a mőtét után az elmerevített csontos gerincszakasz átveszi a terhelést a fém rúdtól.

12



A gerincferdülés epidemiológiája A kismértékő (Cobb˚<10) gerincferdülés elıfordulási gyakorisága 1.5-3%, a 20 Cobb˚ értéket meghaladóé 0.3-0.5% és a nagymértékő (Cobb˚>30) gerincdeformitásé 0.2-0.3%. A 10-16 évesek körében a legmagasabb az idiopathiás scoliosis elıfordulási gyakorisága, a gyerekek 2-4%-ánál figyelhetı meg. Az alacsony 10 Cobb˚ körüli deformitás esetén a fiúk és a lányok aránya egyenlı, ám a 30 Cobb˚ feletti görbületeknél a lányok aránya tízszeres (Roach, 1999). Magyarországon az 1970-es években Dr. Bellyei Árpád határozta meg az AIS prevalenciáját, a 14 éven felüliekben 0.51-0.54 ±0.05%-ban fordult elı a gerincferdülés és a 10 Cobb˚ görbületet meghaladó idiopathiás scoliosisos betegek 0.29 ± 0.035%-ban voltak jelen hazánkban (Bellyei et al., 1977). További vizsgálatok kimutatták, hogy a lányok aránya 3.4-szer magasabb a fiúkénál a 10 Cobb˚ görbületet meghaladó esetekben. A betegek családját is megvizsgálva azt találták, hogy az elsıfokú rokonok 8.34±0.37%-ban érintettek, másod és harmadfokú rokonok pedig 2.0±0.17% illetve 0.87±0.07%-ban. Amennyiben mindkét szülı érintett volt, akkor a gyerekek 40%-ánál, ha csak az egyikük volt az, akkor pedig 29.3 %-uknál jelent meg az AIS (Czeizel et al., 1978). Az ikertanulmányok eredményei azt mutatták, hogy a egypetéjő ikrek között 73%, a kétpetéjőek között 36%-os az együttes elıfordulás (konkordancia) (Kesling and Reinker, 1997).

Az idiopathiás scoliosis etiológiája Az idiopathiás scoliosis etiológiájának tisztázására az elmúlt 40 év alatt sok próbálkozás történt, számos területen keresték a deformitás kialakulásának okát. A fenotípusos megjelenés is heterogén, eltérı például a kialakulás ideje, a progresszió mértéke és sebessége, valószínőleg több különbözı patomechanizmus is eredményezheti ugyanazt a klinikai képet. Világossá vált, hogy egy komplex és valószínőleg multifaktoriális folyamatról van szó. A betegség kialakulásának okai között a genetikai faktor jelenléte általánosan elfogadott, bár az öröklıdés módja kétséges. Mivel az esetek döntı többségében a gerincferdülés kialakulása a serdülıkorra tehetı, a növekedéssel kapcsolatos hormonális, metabolikus és biomechanikai változások is szerepet játszhatnak az etiopathogenézisben, különösen a lányoknál a rövidebb idı alatt és gyorsabban lezajló fejlıdés miatt. Az etiológiai kutatások az alábbi területen folynak: 13



1) Strukturális eltérések A. Csontszöveti eltérések B. Kötıszöveti eltérések C. Harántcsíkolt izom szerkezeti eltérései 2) Neurológia rendellenességek 3) Növekedés és biomechanikai hatások 4) Vérlemezkék eltérései 5) Hormon háztartás 6) Genetikai tényezık

Strukturális eltérések A. Csontszövet rendellenességek

Elıször 1982-ben Burner munkacsoportja talált összefüggést a csökkent csontsőrőség és az idiopathiás scoliosis között és azóta több kutatócsoport is végzett hasonló méréseket (Burner, III et al., 1982). A csontsőrőség mérési adatok összességében azt mutatják, hogy csont ásványsőrősége csökkent az IS-es betegekben a korban egyeztetett kontroll populációhoz képest, de nem bizonyítja, hogy a gyengébb csontminıség a kiváltó oka vagy okozata-e a gerincferdülésnek (Li et al., 2008). Csigolya-tövisnyúlványból és a csípıcsontból származó csontmintákon végzett szövettani kísérletekben azonban azt tapasztalták, hogy az IS betegekben az oszteoklasztok száma csökkent, miáltal a csontátépítés dinamikája is csökkent. Az abnormális csont metabolizmus megzavarhatja a növekedést így okozója lehet az AIS-es betegek 20-38%-ában megfigyelt csontritkulásnak, ami akár elsıdleges kiváltó oka is lehet a scoliosisnak (Cheng et al., 2001).

14



B. Kötıszöveti rendellenességek A biomechanikai egységként értelmezett gerincoszlop funkcionális stabilitásáért a kollagénekbıl, proteoglikánokból, elasztikus rostokból és egyéb extracelluláris mátrix elemekbıl álló kötıszöveti elemek is felelısek. Ebbe a csoportba tartoznak a csigolyák közötti porckorongok és a csigolyákat összefőzı hosszanti szalagpántok. Mivel több olyan kötıszöveti rendellenesség (pl. Marfan szindróma) mellé is társulhat gerincferdülés, feltételezhetı, hogy e szövetek eltérései az AIS kiváltó okaként is szerepelhetnek. Az AIS-es betegek

82%-ában

valóban

találtak

eltéréseket

a

ligamentum

flavum

fibrillin

rostszerkezetében, azonban nem igazolt, hogy az idiopathiás scoliosisos betegeknél generalizált kötıszöveti rendellenesség állna fent (Kouwenhoven and Castelein, 2008). A porckorongokat illetıen is számos tanulmány jelent meg , ám eredményeik nem egyöntetőek. Carl Nicoladoni német sebész professzor már 1904-ben felfigyelt arra, hogy a porckorong alakja a scoliosis korai fázisában, még a csigolyák alakjának változása elıtt ék alakúvá válik. Többen leírták, hogy a ferde gerincbıl származó porckorong kocsonyamagja a görbület konvex oldalára tolódik és belsı szerkezete is megváltozik, valamint proteoglikán és kollagén tartalma is eltérıvé válik (Pedrini et al., 1973; Stokes and Aronsson, 2001). Egyes kutatócsoportok ezeket az eredményeket vitatják, mások megerısítik, de az általánosan elfogadott vélemény szerint a porckorongokban megfigyelt eltérések inkább a görbült gerincben

fellépı

egyenetlen

terhelés

következményei

és

nem

a

gerincferdülés

kialakulásának okai (Oegema, Jr. et al., 1983; Roberts et al., 1993; Cheung et al., 2008).

C. Harántcsíkolt izom eltérések

Mivel a paravertebrális izmok ereje tartja a gerincoszlopot függıleges állapotban és több, az izmok felépítését és az izomfunkciót érintı betegségben másodlagosan kialakul a gerincferdülés, igen korán, már a XIX. században felmerült a kérdés, hogy neuromuszkuláris elégtelenség okozza-e a gerincdeformitást (Kouwenhoven and Castelein, 2008). Hisztokémiai vizsgálatok alapján Spencer és Eccles írta le elıször, hogy az IS-es betegek paravertebrális izmaiban a gerincoszlop két oldalán eltérı a különbözı izomrostok (I-es típusú-lassú és II-es típusú- gyors) aránya, oly módon, hogy a II-típusú izomrostok száma lecsökkent a konvex oldalon (Spencer and Eccles, 1976). További megfigyelések igazolták, hogy nem csak a mélyizmokban, hanem a felszíni izmokban is, a konvex oldalon az I-es típusú izomrostok aránya magasabb a konvex oldalon, így a konvex oldalon megnövekedett izomaktivitás 15



szerepet játszhat a gerincferdülés kialakításában. Az elmúlt évek során elektromyográfiás aktivitásmérésekkel is alátámasztották a konvex oldali dominanciát és kimutatták, hogy a görbület progresszivitása is összefügg az izomaktivitással (Cheung et al., 2005a). Az izomrendellenességek gerincferdülés kialakulásában játszott esetleges szerepe még távolról sem tisztázott és annak ellenére, hogy a legtöbb kutató úgy gondolja, hogy az izomerı egyenetlenség a görbült gerinc kompenzálása miatt alakult ki és következménye nem pedig oka a gerincferdülésnek, további vizsgálatok szükségesek a kérdés megnyugtató lezárásához.

Neurológia rendellenességek A gerincferdülések egy része neuromuszkuláris rendellenesség fennállása során fejlıdik ki a szindrómás scoliosisos betegekben, ami felveti az esetleges idegrendszeri hibát az AIS vonatkozásában is. A mai napig nem tisztázott, hogy az AIS-sel együtt megjelenı neurológiai rendellenességek szerepet játszanak-e az idiopathiás scoliosis kialakulásában. Az IS-es gyerekekben enyhe eltérések mutathatók ki az EEG aktivitásban, a testhelyzet uralásában valamint a szomatoszenzoros neurológiai funkciókban (Kouwenhoven and Castelein, 2008). Legújabb kutatások szerint, amelyekben 3 dimenziós mágneses rezonancia képalkotó eljárások segítségével 99 neuroanatómiai agyterület nagyságát hasonlították össze 20 AIS-es és 26 korban, nemben egyeztetett kontroll személy analízisével, a vizsgált agyterületek mintegy negyedénél eltéréseket találtak a két csoport között (Liu et al., 2008). A gerincferdülés kialakulásának lehetséges okát a Roth, illetve Porter által megalkotott koncepció szerint, a gerincoszlop és a gerincvelı növekedési ütemének eltérése jelenti; ezek nincsenek egymással szinkronban és a rövidebb velı magával húzza az egyébként normális morfológiájú csontos szerkezetet, ezáltal alakítva ki gerincdeformitást (Roth, 1968; Porter, 2001a).

Növekedési és biomechanikai hatások Az AIS kialakulása és progressziója egyértelmően a serdülıkorhoz köthetı, amikor a növekedés a legintenzívebb. A lányokban a felgyorsult gerincnövekedés egy évvel korábban kezdıdik, mint a fiúknál és gerincferdülésük is hamarabb alakul ki, a gerincferdülés progressziója pedig gyorsabb és nagyobb fokú. Azt is megfigyelték, hogy a nagyobb görbülettel rendelkezı gyermekek magasabbak mind az egészséges, mind a kisebb görbülettel bíró társaiknál (Shohat et al., 1988). Ezekbıl a megfigyelésekbıl következıen a gerincferdülést kiváltó okot eltérıen ítélik meg; Gou és mtsai a lányok csigolyáinak 16



karcsúságában és nagyobb magasságában látja az okot, Lowe szerint a gerincoszlop elülsı részeinek a hátsó struktúrákhoz képest történı relatív túlnövekvése eredményezi a gerincoszlop kezdeti elhajlását, Sevastin pedig a bordák aszimmetrikus növekedését tartja fontosnak (Guo et al., 2003; Lowe et al., 2000; Sevastik et al., 2003). Mindezek az egyes csigolyákra ható erık egyenetlen eloszlását okozzák. Mivel a gerincoszlopban a csigolyák szorosan össze vannak kötve, a felsı csigolyákra ható hajlító erık az alsóbb részeken a gerincoszlop oldalirányú elhajlását eredményezik a biomechanikai modell szerint (Stokes and Laible, 1990).

Vérlemezkék rendellenességei A könnyen izolálható vérlemezkék vonzó tárgyai a scoliosis kutatásának, mivel kontraktilis rendszerük nagymértékben hasonlít a harántcsíkolt izmokéhoz, így egy, a vázizmokat érintı rendellenesség kitőnıen vizsgálható bennük. Ezen felül további nagy elınyük, hogy a gerincferdülés okozta másodlagos hatások nem károsítják ezt a rendszert. Több tanulmány is megjelent, melyben az IS-es betegek vérlemezkéinek abnormális szerkezetét és megváltozott funkcionális mőködését írták le, és az eltérések nagy része a megváltozott Ca2+ transzportra utalt. A kalmodulin, amely egy Ca2+-függı receptorfehérje az izomsejtekben és a trombocitákban kölcsönhat az aktinnal és a miozinnal és hatására megnı a szarkoplazmatikus retikulumból történı Ca2+ kiáramlás. Kindsfater és mtsai megemelkedett kalmodulin szintet mértek azon IS-es betegek vérlemezkéikben, ahol a görbület progresszív volt (Kindsfater et al., 1994). A kalmodulin, mint neurotranszmitter a melatonin szekréció szabályozásában is szerepet játszik, így a megemelkedett kalmodulin aktivitás a csökkent melatonin termelıdéssel összefüggésben lehet (Machida et al., 1996). Acaroglu és mtsai a kalmodulin és a melatonin szintjét is megvizsgálták mind a trombocitákban, mind a paravertebrális izmokban az egészséges, trauma miatt operált esetekben és a gerincferdülés korrigálása miatt mőtött IS-es betegekben is. Nem találtak különbséget a melatonin szintben sem a beteg-kontroll viszonylatban sem pedig a jobb vagy bal oldalról származó izombiopsziák között. Az IS-es betegeknél azonban a kalmodulin szint magasabb volt a gerincoszlop konvex oldaláról származó izombiopsziában (Acaroglu et al., 2009). Az eddigi kísérleti eredmények ugyan még nem elegendıek annak pontos eldöntésére, hogy mi a szerepe a kalmodulinnak az IS etiológiájában, mégis úgy tőnik a Ca2+-függı kalmodulin köthetı az IS súlyosbodásához.

17



Hormonok szerepe az AIS-ben Az a tény, hogy az AIS kialakulása és progressziója a serdülıkori gyors növekedési szakaszhoz társul, felveti a növekedés komplex folyamatában résztvevı hormonok szerepét. Feltételezték a növekedési hormon és a IGF-1 szerepét, ám a vérszérum szintben nem találtak eltérést az IS-es betegeknél (Misol et al., 1971). Mivel a nagyobb Cobb fokú görbülettel bíró eseteknél a lányok aránya magasabb, Esposito és mtsai a nıi nemi hormonok esetleges szerepét vizsgálták és azt találták, hogy mind az ösztrogén, mind a progeszteron vérszérumbeli szintje csökkent volt az IS-es lányokban az egészséges, korban egyezı társaikéhoz képest (Esposito et al. 56-60). A serdülı korú lányok antropometriás vizsgálata alapján az IS-es lányok magasabbaknak és vékonyabbaknak bizonyultak, mint a kontrollok, az alacsonyabb testsúlyuk miatt egy, a zsírszövet által termelt hormon, a leptin szerepe is felmerülhet a patogenezisben (Lee et al. 1024-35;Siu King et al. 2152-57). Mivel a dolgozat egyik célja, ennek az etiológiai elemnek a vizsgálata, részletesebben egy késıbbi, külön fejezetben fogom tárgyalni a leptin és az AIS kapcsolatát. A tobozmirigy által termelt hormon, a melatonin etiológiai tényezıként azután került az érdeklıdés középpontjába, miután 1959-ben Thillard munkacsoportja arról számolt be, hogy a csirkében (amit a gerincferdülés modellállatának tartanak), a tobozmirigy kimetszése (pinealectomia) után rendszeresen kialakul a scoliosis. Megfigyelésüket késıbb többen megerısítették a csirkékkel és a két lábon járásra kényszerített patkányokkal végzett kísérletekben is (THILLARD, 1959; Machida et al., 1999; Machida et al., 1993). Az újabb kutatások szerint azonban pinealectomia hatására nem alakult ki gerincdeformitás az emberhez evolúciósan közelebb álló, kétlábon járó rhesus majmokban (Cheung et al., 2005b). Dubousset és Machida 30 IS-os serdülı betegben kimutatta, hogy a progresszív formákban (melyekben az utóbbi évben több, mint 10 fokot nıtt a Cobb szög mértéke) az éjszakai szérum melatonin szint 35%-kal csökkent a stabil, nem progrediáló gerincferdüléses betegekkel és 50 kontroll egyénnel összevetve, ám ezt az eredményt több ezt követı tanulmányban sem sikerült megerısíteni (Machida et al., 1996; Bagnall et al., 1996; Fagan et al., 1998). A fentiek alapján a melatonin szerepe az IS kialakításában, vagy a gerincferdülés súlyosbodásában nem meggyızıen bizonyított, viszont a melatoninnal kapcsolatos kutatások napjainkban újra az érdeklıdés középpontjába kerültek a melatonin csontnövekedés szabályozásában játszott szerepe miatt (Roth et al., 1999; Satomura et al., 2007). In vitro kísérletekben AIS betegekbıl származó primer oszteoblaszt sejtvonalakban a melatonin 18



szignáltranszdukciós útvonal nem megfelelı mőködését mutatta ki Moreau munkacsoportja (Moreau et al., 2004). További megerısítést jelenthetnek a genetikai asszociációs vizsgálatok is, amit a következı fejezetben írok le.

Genetikai tényezık A genetikai tényezık szerepére kevés figyelem irányult az idiopathiás scoliosis kutatásának kezdetén, mivel a betegség többnyire szórványosan lépett fel, és gyakran a családon belül halmozódó esetek sem mutattak egyértelmő öröklıdésmenetet. A genetikai háttér kutatása a hetvenes évek óta folyik, s mára már a legfontosabb és leginkább kutatott területté vált. Az epidemiológiai részben leírt elıfordulási gyakoriságok, különösen a betegek családjában elıforduló magasabb incidencia és az ikerkutatások során kapott konkordancia adatok arra utaltak, hogy létezik örökletes faktor. A külföldi populációs tanulmányok az elsı, másod és harmadfokú rokonok között rendre 11%-os, 2.4%-os és 1.4%-os érintettséget találtak, ami jó egyezést mutat a hazai adatokkal (Riseborough and Wynne-Davies, 1973). Bellyeiék a magyar populációs adatokból poligénes, multifaktoriális öröklıdésmenetre következtettek, amit megerısíteni látszik Wyne-Davies és Risenborough közös tanulmánya, melyet 2869 önként jelentkezın, mindegyikük elsıfokú rokonain illetve 81%-uk másod és harmadfokú rokonain végeztek (Czeizel et al., 1978; Riseborough and Wynne-Davies, 1973). Wynne-Davies 2000 önként jelentkezın és elsıfokú rokonain végzett radiográfiás vizsgálatokat, eredményeik domináns öröklıdésmenetre engedtek következtetni (WynneDavies, 1968). Aksenovich komplex szegregációanalízissel 90 család 283 tagját vizsgálta és eredményeik alapján egy autoszomális domináns, de nem teljes penetranciával öröklıdı fontos gén jelenlétét valószínősítik, legalábbis a súlyosabb idiopáthiás scoliosisos esetekben (Aksenovich et al., 1988). Cowell és mtsai 17 családot megvizsgálva nem találtak apárólfiúra történı öröklıdést, ezért X-hez kapcsolt, domináns öröklıdésmenetet véleményezetek csakúgy, mint Miller és mtsai, akik szintén családfa analízissel jutottak ugyanerre a következtetésre (Cowell et al., 1972; Justice et al., 2003). Az etiológiai kutatások során feltárt eltérések alapján érintettnek gondolt gének mutációinak célzott vizsgálatával kezdıdtek a molekuláris genetikai vizsgálatok. A kötıszövet felépítésében fontos strukturális géneket, mint a kollagének (COL1A1, COL1A2, COL2A1), fibrillinek (FBN1, FBN2), elasztin (ELN) és a heparán-szulfát glükózamin 3-Oszulfotranszferázok (HS3ST3A1, HS3ST3B1), nem találták érintettnek az AIS-ben (Carr et 19



al., 1992; Miller et al., 1996; Salehi et al., 2002). A porcspecifikus mátrixmolekulák közül az aggrekán (ACAN) nem mutatott kapcsoltságot az AIS-sel, míg a matrilin-1 (MATN1) gén 3’UTR régiójában elhelyezkedı mikroszatellita marker által jelölt, 103 bp-os allélje asszociációt mutat az AIS-sel (Montanaro et al., 2006; Marosy et al., 2006). Mivel a növekedés és a gerincferdülés között szoros kapcsolat áll fenn, a növekedési hormon receptor (GHR) alléleloszlását is vizsgálták az AIS betegekben 5 SNP alapján, de nem találtak eltérést a genotípus gyakoriságban a kontrollhoz viszonyítva (Qiu et al., 2007b). Hasonló kísérleti elrendezéső vizsgálatban az inzulinszerő növekedési faktor (IGF1) promóterének SNP analízise során sem találtak különbséget a genotípus eloszlásban, de az egyik homozigóta genotípushoz magasabb Cobb˚ tartozott, ami alapján a szerzık az IGF1-et az AIS-t módosító, progressziós faktornak tekintik az IGF1-et (Yeung et al., 2006). Az ösztrogén receptor β gén (ERβ) polimorfikus helyeinek vizsgálatakor találtak egy olyan SNP-t, aminek egyik allélje gyakrabban fordul elı a scoliosisos lányokban, mint a kontrollokban, ezért ezt a gént az AISre hajlamosítónak gondolják a lányok esetén (Zhang et al., 2009). A melatonin metabolizmus zavarát feltételezik az AIS kialakulásának egyik lehetséges okaként, ezért kínai kutatók megvizsgálták a melatonin receptorainak polimorfikus helyeit asszociációt keresve a gerincferdüléssel. Az oszteoblasztokban is kifejezıdı melatonin 1B receptor (MTNR1B) gén promóterében olyan SNP polimorfizmust írtak le a-1193 pozícióban (C-1193 T, rs4753426), melynek C allélja asszociál a gerincferdüléssel és azon egyéneknél, akik homozigóta formában hordozzák a C allélt a gerincferdülés kialakulásának kockázata magasabb, mint a T allélt is hordozóké (OR:1.29) a kínai populációban (Qiu et al., 2007a). Saját vizsgálataink nem támasztják alá ezt az eredményt, a genotípus gyakoriságok nem mutattak eltérést az AISes beteg és a kontroll populáció közt (közlés alatt). Megvizsgálták a másik melatonin receptor (MTNR1A) egyik promóter polimorfizmusát is, de asszociációt nem tudtak kimutatni (Qiu et al., 2008). Az asszociációs vizsgálatokkal párhuzamosan kapcsoltsági analízist is végeztek számos laboratóriumban és az elmúlt tíz évben számos kromoszóma szakaszt azonosítottak az AIS-sel összefüggésben. Mind Chan, és mtsai, mind Alden munkacsoportja, egymással rokoni kapcsolatban nem álló családokat elemezve a 19p13.3 régióban az AIS-hoz kapcsolt lokuszt írtak le (Alden et al., 2006; Chan et al., 2002). Ocaka és mtsai is megerısítették Miller munkacsoportja által jelzett 9q31.1-q34.2 régió kapcsoltságát az AIS-hez (Ocaka et al., 2008; Miller et al., 2005). Salehi és mtsai egy háromgenerációs olasz családot vizsgáltak, ahol a 17p11 kromoszóma régiót találták kapcsoltnak 11 érintett személy kapcsán, amit Miller munkacsoportja is igazolt egy 50 családos mintán (Salehi et al., 2002; Miller et al., 20



2005). Az 1. táblázat tartalmazza a kapcsoltsági analízis eredményeként kapott kromoszóma régiókat és az ott elhelyezkedı, a szerzık által az AIS-ben potenciálisan érintettnek jelölt géneket. A kapcsoltsági analízissel jelölt gének közül a γ1 syntrophint (SNTG1) és a kromodomént tartalmazó helikáz, DNS-kötı fehérje 7-t (CHD7) vizsgálták részletesen. A SNTG1 génjében talált mutációk csak a vizsgált AIS-es betegek kis százalékában voltak megfigyelhetık és a családi halmozódást mutató esetekben sem szegregálódott együtt az AIS az SNTG1 mutációival. (Bashiardes et al., 2004) A CHD7 gén esetén Wise munkacsoportja egy potenciálisan funkcióval rendelkezı polimorfizmust (rs4738824) kapcsoltnak talált az AIS-sel beteg+szülık hármasát vizsgálva (Gao et al., 2007). A jelenleg elfogadott etiológiai modell alapján a betegség kialakulása két szakaszra osztható, egy iniciációs és egy progressziós fázisra. Mindkét fázisban több gén is szerepet játszhat és eddig ismeretlen környezeti faktorok hathatnak a fázisokra külön-külön is. A modell szerint az AIS komplex genetikai betegség, ahol egy vagy több gén egymással és a környezeti tényezıkkel együtthatva alakítja ki a gerincdeformitást (Cheung et al., 2008). résztvevık száma család/egyén 1/14

kromoszóma lokalizáció 6q 10q 18q

1/17

17p11

7/52

19p13.3

202/1198

202/1198 202/1198 202/1198 52/123 25/116 7/54

Xq23 Xq26.1 6p22-p25 6q13-q16 9q31.1-q34.2 16p13.13-q13.2 17p12-q11.2 5p13 13q13.3 13q32 19p13 1p 8q 10q 9q31.2-q34.2 17q25.3-qtel 12p3

jelölt gének

referencia (Wise et al., 2000)

HS3ST3A1 HS3ST3B1 NLRP12, SH3GL1 CHRDL1 COL4A5, 6

(Salehi et al., 2002) (Chan et al., 2002) (Justice et al., 2003)

(Miller et al., 2005) IRX1, IRX2, IRX4 POSTN,FOXO1 GPC5

(Miller et al., 2006) (Alden et al., 2006)

SNTG1, CHD7 -

(Gao et al., 2007) (Ocaka et al., 2008)

NTF3,FGF3,GDF3 KCNA1,5,6,MFAP5

(Raggio et al., 2009)

1. táblázat A kapcsoltsági analízisek eredményeként az AIS-sel kapcsolatba hozható kromoszóma szakaszok és jelölt gének 21



Az etiológiai teóriák összegzése Az elızı fejezetekben felsorolt rendellenességek leírása után minden szerzı kialakította a saját megfigyelése alapján a saját teóriáját, így mára közel 20 elmélet létezik az AIS kórfejlıdésére. A legfontosabbak listaszerő felsorolása: 1. Genetikai betegség multifaktoriális öröklıdéssel (Kouwenhoven and Castelein,

2008; Miller et al., 2005) 2. A gerincoszlop növekedésének aránytalansága, miszerint az anterior rész

gyorsabban nı (Guo et al., 2003) 3. A gerincoszlop és a gerincvelı növekedésének aszinkronja (Roth, 1968; Porter,

2001b) 4. Tartási rendellenesség, ami kialakulhat a hátsó agy diszfunkciója miatt,

neuromuszkuláris eltérések miatt, vagy az idegrendszer test-sémájának megkésett fejlıdése miatt (Burwell et al., 2008a; Lao et al., 2008; Veldhuizen et al., 2000) 5. Melatonin hiány, vagy a melatonin szignálút nem megfelelı mőködése (Machida et

al., 1996) 6. A vérlemezkékben talált kalmodulin diszfunkció szisztémás érvényesülése (Lowe

et al., 2000) 7. NOTOM (normal neuro-osseous timing of maturation) modell, ami több teória

egyesítésével jött létre (Burwell et al., 2008b) 8. LHS (leptin, hipotalamusz, szimpatikus idegrendszer) (Burwell et al., 2009)

Eddig egyetlen elmélet sem tudta az AIS-ben megfigyelt eltérések mindegyikét beilleszteni a kórfejlıdésbe, ami azt sugallja, hogy az AIS, mint a legtöbb komplex betegség pathomechanizmusa összetett. Egyre több adat utal arra, hogy a hormonháztartás nem megfelelı mőködése fontos etiológiai tényezıje az AIS-nek. Saját kísérleti eredményeink is arra utaltak, hogy fontos lenne az endokrin rendszer részének tekinthetı zsírszövet által termelt fehérjéket, az adipokineket tanulmányozni. Eddig több mint 50 adipokint írtak le, amelyek számos szerv mőködését befolyásolják,mint például a máj, az izmok, a csontok, a szaporító szervek (Trayhurn and Wood, 2004). Az adipokinek közül részletesen a leptinnel és az interleukin 6-tal foglalkozom, mivel mindkettınek fontos szerepe van a csonttömeg átalakítás szabályozásában és szerepük valószínősíthetı az AIS kialakításában. 22



Az értekezés szempontjából kiemelten fontos etiológiai faktorok Leptin A leptin egy, a citokinek családjába tartozó hormon, melyet 1994-es felfedezésekor az energiaegyensúly fenntartásában és a táplálékfelvétel szabályozásában tartottak fontosnak (Zhang et al., 1994). Elsıdleges feladatának a kövérség megelızését gondolták, erre utal az elnevezése is, amely a görög leptos (jelentése vékony) szóból ered. Az elmúlt 15 évben folytatott szerteágazó kutatások nyomán mára már elfogadott, hogy a leptin befolyásolja a glükóz- és lipidmetabolizmust, fontos szerepe van neuroendokrin rendszer szabályozásában, az immunrendszerben, a csontszerkezet átszervezıdésben. A leptin gént (LEP) Friedman munkacsoportjának extrém kövér egértörzsek (ob/ob) keresztezését követı pozícionális klónozással sikerült azonosítani (Zhang et al., 1994). Ezt követıen emberben is azonosították a leptin génjét és megállapították, hogy aminosav szinten 84%-os a homológia a két faj leptin szekvenciája között, ami arra utal, hogy egy funkcionálisan erısen konzervált fehérjérıl van szó. A LEP gén az emberben a 7-es kromoszóma 7q31.3 régiójában található, ~16.5 kb hosszúságú és 3 exonból valamint 2 intronból áll, a kódoló régiót a 2. és 3. exon tartalmazza (Gong et al., 1996). A promóter régiója tanulmányozásakor C/EBP, SP-1, HIF-1 reszponzív elemeket sikerült azonosítani (Ambrosini et al., 2002; Mason et al., 1998). A hozzájuk kötıdı transzkripciós faktorok egy alapszintő átíráson túl indukálható leptin kifejezıdést is lehetıvé tesznek. A leptin elsısorban a fehér zsírszövetben termelıdik, de kimutatták alacsony szintő, de indukálható kifejezıdését a vázizmokban is (Ambrosini et al., 2002; Wang et al., 1998). Termelıdését az inzulin és a glükokortikoidok fokozzák, a tesztoszteron pedig gátolja (Saladin et al., 1995; Blum et al., 1997). A fenti hormonokon kívül még gyulladásos citokinek is befolyásolják a termelıdését (Mantzoros and Moschos, 1998). A leptin molekula egy glikozilálatlan 16 kDa molekulasúlyú, 4 alfa hélixet tartalmazó polipeptid, amely a strukturális vizsgálatok alapján az IL6 citokin család tagjaival mutat hasonlóságot (Zhang et al., 1997).

23



Leptin szerepe a csonttömeg szabályozásban Az elmúlt években több tanulmány jelent meg, amelyek rávilágítanak arra, milyen bonyolult kapcsolatrendszer áll fenn a leptin, a központi idegrendszer és a csontszerkezet átalakulása között. Az elsı arra utaló jel, hogy a leptin fontos szerepet játszik a megfelelı csonttömeg kialakításában, abból két a megfigyelésbıl adódott, hogy a tartós energiahiánnyal párosuló alacsony leptin szérumszint összefügg az alacsony csonttömeggel (pl. az anorexia nervosa esetén) és, hogy a csontritkulás kevésbé fenyegeti az elhízott embereket (Soyka et al., 1999; De Laet et al., 2005). Bár a pontos mechanizmusok még nem teljesen ismertek, úgy tőnik, hogy a leptin két teljesen különbözı csonttömeg szabályozó folyamatban is részt vesz (5. ábra piros nyilak). Az elsı, egy a hipotalamuszon keresztüli indirekt út, két egymással ellentétes hatású folyamatból áll. Az egyik folyamatot Ducy és munkatársai írták le, miszerint a leptin a szimpatikus idegrendszeren keresztül hat és hatására az oszteoklasztok differenciációja fokozódik, ami a csontbontást erısíti (Ducy et al., 2000). A másik, csontbontást gátló folyamatra Elefteriou csoportjának munkája során derült fény, melyben a leptin egy hipotalamuszban kifejezıdı neuropeptid, a CART (kokain amfetamin által szabályozott transzkript) expresszióját fokozza, amely az oszteoklaszt-differenciáció gátlásához vezet (Elefteriou et al., 2005). A közvetlen úton keresztül a leptin a csontvelıi ıssejtekre hat, mégpedig a csontépülésért felelıs oszteoblasztok differenciációját segíti és az oszteoklasztok differenciációját gátolja (Thomas et al., 1999; Holloway et al., 2002). A fenti mechanizmusok bonyolult kölcsönhatásaként a leptin szérumszintje határozza meg, hogy a csonttömeg átalakulás egyensúlyi folyamatai közül melyik kerül túlsúlyba A szérum leptinszint a különbözı koncentráció tartományokban a csontépítést és a csontbontást is befolyásolhatja, de a koncentrációjától függıen ellentétesen (hormesis) (Martin et al., 2007). Természetesen a leptin nem egymaga határozza meg a csonttömeg átalakulást, hanem számos egyéb szabályozó úttal kölcsönhatásban, ami kielégítı magyarázatot szolgáltat arra, hogy miért olyan ellentmondóak azok a klinikai adatok, amelyek a szérum leptinszint és a csonttömeg közötti összefüggés vizsgáltával születtek.

24



5. ábra A leptin és az IL6 szerepe a csontátépítésben A csontátépülés a csontképzési és csontbontási folyamatok összehangolt, egymással egyensúlyban lévı mőködésével valósul meg. A csontszövet sejtjei közül a csontlebontásért a hematopoetikus ıssejt eredető oszteoklasztok (csontfaló sejtek) a felelısek, míg a csontépítés a mesenchymális ıssejt eredető oszteoblasztok (csontépítı sejtek) feladata. Az oszteoblasztok egy részébıl alakul ki a csontszövet szerkezetét adó oszteocita (csontsejt). A helyes csontátépülést ezeknek a sejteknek a differenciációja és funkciója határozza meg, amit sejt-sejt kapcsolataik, illetve különbözı, szolubilis faktorok által közvetített kölcsönhatásuk is biztosít. Mőködésük a központi idegrendszeren keresztüli hormonális szabályozás alatt áll.

25



Leptinszint nemek közötti különbsége A leptin felfedezése után elıször részletesen a test zsírtartalma és a leptin szérumszint összefüggését vizsgálták, és megállapították, hogy a nık leptin szintje még azonos testtömeg index mellett is 2-3-szor magasabb mint a férfiaké (Ostlund, Jr. et al., 1996). Mivel a nıkben magasabb a zsír százalékos aránya, nem meglepı, hogy a zsírsejtek által termelt leptin szintje is különbözik. Ez az eltérés a pubertás korban válik kifejezetté, ami azt mutatja hogy a zsírszövet mennyisége mellett a nemi hormonok is befolyásolják a leptin szérumszintjét. A pubertás kezdetén mindkét nemben megnı a leptin szérumszintje, ami azt jelzi, hogy a leptinnek fontos szerepe van a hipotalamusz-hipofízis-gonád tengely aktiválásában, azáltal, hogy jelet szolgáltat az agynak arról, hogy megfelelı energiatartalékkal rendelkezik-e a szervezet a reprodukcióhoz. Ezt alátámasztja az a megfigyelés, hogy alacsony leptinszinttel rendelkezı élsportoló tornászoknál a serdülıkor kezdete késik és a sovány atlétanık rendszerint amenorrheások (Weimann et al., 1999). További bizonyítékot jelent, hogy azokban az esetekben, ahol a leptin génjében elıforduló misszensz mutáció következtében nem termelıdik fehérje, a betegek az elhízás mellett hipogonadizmusban szenvednek (Strobel et al., 1998). A serdülıkor késıbbi fázisában a leptin szérumszintje a lányokban tovább emelkedik, szemben a fiúkkal akiknél inkább csökken kialakítva ezáltal a két nem közötti, az élet további részében is fennmaradó leptinszintbeli különbséget (Blum et al., 1997).

Polimorfikus helyek vizsgálat a LEP gén szabályozó régiójában Egy gén esetleges szerepét valamely fenotípus kialakításában leggyakrabban az adott gén vagy vele genetikai kapcsoltságban lévı DNS szakaszon lévı polimorfikus helyek vizsgálatával próbálják meg tisztázni az asszociációs vizsgálatokban. Eltérıen a LEP gén kódoló szakaszától, ahol csak elvétve akad polimorfikus hely, az 5’végi szabályozó régióban számos fellelhetı, közöttük olyanok is amelyek asszociációt mutattak az elhízással és a testtömegindex-szel (a testtömegindex a testsúly és a testmagasság négyzetének a hányadosa, amellyel a test zsírszövettartalmát lehet megbecsülni) (Carlsson et al., 1997). Több egymással részben ellentmondó tanulmányban számos SNP-t azonosítottak, amelynek valamely allélja kapcsoltságot mutat az alacsonyabb leptinszinttel vagy az elhízással. A leggyakrabban vizsgált SNP, egy általánosan elıforduló polimorfizmus, amely a transzkripciós starthelytıl 5’ irányban 2548 bázispárnyira helyezkedik el és egy G/A 26



tranzíciót jelent; jelölése G-2548A. Funkciójáról egyenlıre nincs adatunk, de számítógépes elemzések azt mutatják, hogy evolúciósan nem konzervált régióban helyezkedik el és egyik (eddig ismert) transzkripciós faktor kötıhely sem térképezhetı erre a pontra. Mivel azonban számos vizsgálatban erıs asszociációt mutat az elhízással egy függetlenül ható, funkcionális SNP-nek tekintik. A vérszérum leptinkoncentrációja a szervezetben tárolt energia mennyiségérıl ad információt és a test zsírszázalékával egyenesen arányos, bár az egyéni szérum leptinszintek azonos testtömegindex mellett is nagy eltéréseket mutathatnak. Több tanulmány is foglalkozott azzal, hogy a szérum leptinszintje és a G-2548A SNP alléljei közötti összefüggést feltárja, de a kapott adatok ellentmondóak. Két kutatócsoport számolt be olyan eredményrıl, hogy a -2548 A/A homozigóta genotípus a magasabb szérum leptinszinttel hozható összefüggésbe. Az egyik közlemény csak férfiakban tudta kimutatni ezt az összefüggést, a másik pedig, nem elhízott felnıtt nıkben találta a magasabb leptin szérumszintet az A/A homozigótákkal kapcsoltnak (Mammes et al., 2000; Hoffstedt et al., 2002). Több ellentétes értelmő publikáció is megjelent, amikben a -2548 A/A genotípusú testesebb fiatal lányokban 20 %-kal alacsonyabb szérum leptinszintet mutattak ki, mint a G/A vagy G/G genotípusúakban, illetve 50%-kal alacsonyabb receptorhoz kötött szérum leptinszintet A/A genotípusú normál súlyú lányokban (Le Stunff et al., 2000; Yiannakouris et al., 2003). A legújabb témával foglalkozó cikk az eddigiektıl eltérıen nem európai populációkat, hanem brazil nıket vizsgálva jutott arra a következtetésre, hogy a -2548 G allél jelenléte összefüggésben van az emelkedett szérum leptinszinttel (Hinuy et al., 2008). Meg kell említeni azonban, hogy olyan publikációk is megjelentek, amelyek nem tudtak összefüggést kimutatni a LEP -2548 G/A allélok és a szérum leptinszintje között (Bienertova-Vasku et al., 2008; Wang et al., 2006). Az ellentmondó eredmények hátterében több jelenség is állhat. Egyik ilyen különbséghez vezetı ok lehet a G-2548A polimorfizmussal kölcsönható másik allél jelenléte a leptin vagy a leptin receptorának a génjében. Szintén eltérı eredmények megszületéséhez vezethetnek a vizsgálatokba bevont populációk nagyságában, illetve nemi és testfelépítési paramétereiben megnyilvánuló különbségek, valamint az eltérı statisztikai modellek használata. A leptin rákos folyamatokban betöltött lehetséges részvételére elıször azon in vitro eredmények hívták fel a figyelmet, amelyek igazolták a sejtosztódásban és a véredények kialakulásában betöltött szerepét. E kísérletek nyomán a G-2548A polimorfizmust nemcsak az elhízással kapcsolatban, hanem számos rákos elváltozással összefüggésben is megvizsgálták (Dieudonne et al., 2002). Több, eddig vizsgált tumor kialakulása vagy malignitásának vonatkozásában igazolást nyert, hogy a 2548 A/A homozigóta állapot 27



tekinthetı a magasabb kockázati tényezınek. A kutatások során tapasztalt, esélyhányados értékük (OR) a mellrák esetén 3.17, nem kissejtes tüdıráknál 1.97, szájnyálkahártya tumor esetén 1,56, non-Hodgkin limfóma esetén 2,3, és a prosztataráknál 2,93 (Ribeiro et al., 2004; Ribeiro et al., 2006; Skibola et al., 2004; Snoussi et al., 2006; Yapijakis et al., 2009).

Leptin és az AIS Mára már széleskörben elfogadott nézet, hogy az AIS kialakulása és súlyosbodása a növekedéssel áll kapcsolatban. Az AIS-es betegeknek nemcsak alacsonyabb a testsúlyuk és a testtömegindexük, hanem csonttömegük is és csontsőrőségük is csökkent (Cheng et al., 2000; Sadat-Ali et al., 2008). Ez az állapot felnıttkorban is fennmarad, és a betegek további életútját követı kísérletekbıl az is kiderült, hogy a gerincferdülésben szenvedı betegek 50%ában csontritkulásos kórkép alakult ki (Cheng et al., 1999; Thomas et al., 1992). Mivel az elızı fejezetekben már részletesen leírtam, milyen szerepet tulajdonítanak a leptinnek a testés a csonttömeg szabályozásában logikusan merült fel a kérdés, van-e szerepe a leptinnek az AIS kialakításában. Eddig a szakirodalomban egyetlen tanulmány jelent meg, ami a leptin szérumszintjét vizsgálja a gerincferdüléssel összefüggésben (Qiu et al., 2007c). A kínai kutatócsoport 120 AIS-es és 80 korban illesztett egészséges lány leptinszintjét vizsgálta meg és azt találta, hogy a kontrollhoz képest mintegy a felére csökkent a szérum leptinszint az AIS-es betegekben, 14.9 µl/L-rıl 7.2 µl/L-re függetlenül a görbület nagyságától.

Az interleukin 6 Az interleukin 6–ot (IL6) eredetileg mint makrofág differenciációs markert és hepatocita, B sejt stimuláló faktort írták le, mára már igazolást nyert szerteágazó pleiotróp hatása az immunrendszert, központi idegrendszert, sıt a csontrendszert érintı számos biológiai folyamatban. Az IL6 génje a 7-es humán kromoszóma 7p21 régiójában található és 6.1 kb hosszúságú. A gén 5 exont tartalmaz és eddig 9 különbözı mRNS variánsát írták le. Az IL6 fehérje 212 aminosavból áll és különbözı poszttranszlációs módosulások jellemzik, mint az O- és Nglikoziláció valamint a szerin és tirozin aminosavakon történı foszforiláció. A vérszérumban jelenlévı 26 kDa-os fehérje mintegy 30%-a a zsírszövetben termelıdik, de az adipocitákon kívül termelik még az oda bevándorló makrofágok is. A mőködı vázizom is nagy mennyiségő IL6-ot termel, a maratoni táv lefutása után például a vérplazma IL6 szintje 28



mintegy 100-szorosára emelkedik, melynek mértéke hasonló, mint amekkorát egy komoly fertızésben szenvedı betegnél tapasztalnak (Ostrowski et al., 1999). A csontfejlıdésben parakrin módon szerepet játszó IL6-ot elsısorban az oszteoblasztok és a csontvelıi sztróma sejtek termelik (Holt et al., 1996). Az IL6 az antigénspecifikus immunválasz szabályozásában szintén meghatározó szerepet játszik. A B sejtek plazmasejtté történı érését és ellenanyagtermelı képességét szabályozza, indukálja a T sejtek növekedését és a citotoxikus T sejt differenciációt. Májsejtekben az akut fázis proteinek, elsısorban a C reaktiv-protein termelıdését közvetlenül indukálja. Az akut fázis válasz során az izom- és zsírszövetekben energiát mobilizál, ezáltal segítve elı a láz kialakulását, illetve hatására alakul ki a gyulladás során megfigyelhetı súlyvesztés (Leon et al., 1998). Dolgozatom szempontjából talán a legérdekesebb megfigyelés, hogy az IL6 érintett több elhízással

járó

megbetegedésben

(2-es

típusú

diabetes,

a

szív-

és

érrendszeri

megbetegedések), illetve a csontritkulás kialakulásában is (Thalmann and Meier, 2007; Zhao et al., 2008).

Az IL6 szerepe a csontátépítésben A szervezetben lejátszódó csontátépítési esemény a csontbontás, illetve csontépítés egymással ellentétes, viszont térben és idıben egymással szorosan kapcsolódó, egymással összehangolt folyamatai által valósul meg, melyben a résztvevı oszteoklasztok és oszteoblasztok

egymással

kölcsönhatásban

szabályozzák

differerenciációjukat

és

mőködésüket. Ebben a folyamatban a legjobban vizsgált pont az oszteoblasztok és a csontvelıi sztróma sejtek által termelt citokinek hatása az oszteoklaszt differenciációra. A legnagyobb szerepet az oszteoblaszt/oszteoklaszt kommunikációban a RANKL (NF-κβ receptor aktivátor ligandja) szolubilis citokinnek tulajdonítanak (5. ábrán szürke nyilak). A RANKL kötıdése receptorához, a RANK-hoz (NF-κβ receptor aktivátor) stimulálja a preoszteoklasztok differenciációját és aktiválja az érett oszteoklasztokat. Számos egyéb gyulladáskeltı citokin, köztük az IL6 is befolyásolja a RANKL funkcionális hatását. Legújabb adatok szerint az IL6 típusú citokinek hatására az oszteoblasztokban indukálódik a RANKL expressziója, mely az oszteoklasztokra parakrin, az oszteoblasztokra autokrin módon képes hatást gyakorolni, tovább stimulálva ez által a parakrin faktorok kifejezıdését (5. ábra kék nyilak). A kaszkád eredményeképp a gyulladáskeltı citokinek végsı soron a csontbontást segítik (Kwan et al., 2004). In vitro adatok szerint az IL6 típusú citokinek a

29



mesenchymális ıssejtek oszteoblaszt irányba történı differenciációját is segítik és védik az oszteoblaszt sejteket az apoptózistól, ami pozitívan befolyásolja a csontépítés folyamatát (Taguchi et al., 1998). Az in vitro kísérletekkel párhuzamosan különbözı transzgenikus és génkiütött egerek létrehozásával in vivo is vizsgálták az IL6 típusú citokinek csontképzıdésre kifejtett hatását. Az IL6 hiányos egerekben a csontépítés mértéke nıtt, míg az IL6-ot túlzottan kifejezı transzgenikus egerekben mind az oszteoblasztok, mind az oszteoklasztok csökkenı száma mellett, a csontbontás folyamata dominált. Összeségében úgy tőnik, hogy a csontbontásból és csontépítésbıl álló csontátalakulási folyamat egészét szupresszálja az IL6 (Blanchard et al., 2009).

Polimorfikus helyek vizsgálat az IL6 gén szabályozó régiójában Az IL6 vérszérum koncentrációja egy adott populáción belül lényeges eltéréseket mutat az egyedek között. Különösen a gyulladásos folyamatokra jellemzı IL6 szérumszint emelkedés mértéke mutat nagy egyedi eltérést. A különbözı immunstimulusra kialakuló magas IL6 szérumkoncentráció sokáig fennmarad, így jó molekuláris markere számos klinikai állapotnak, mint pl. a hasi fertızéseknek, áttétes mellráknak, szív- és érrendszeri megbetegedéseknek. Idıvel a vizsgálatok egyik lényeges kérdésévé az vált, hogy az egyén genetikai háttere hogyan befolyásolja az IL6 szérumkoncentrációt egészséges és pathológiás állapotokban. Mivel az IL6 gén kódoló szekvenciája csak néhány nagyon ritkán elıforduló polimorfikus helyet tartalmaz, a gén szabályozó régiójában található és a génkifejezıdésre ható variánsokat kezdték el vizsgálni. A leggyakrabban vizsgált SNP a transzkripciós starthelytıl -174 bázispárnyira elhelyezkedı G>C transzverzió(G-174C, rs1800795), amely az IL6 promóter egyik negatív regulációs doménjében helyezkedik el és in vitro kísérletek alapján funkcionális variánsnak tekinthetı. HeLa sejteken végzett „reporter assay” vizsgálatokban a -174C allélt tartalmazó konstrukciók luciferáz expressziója 0.624±0.15-ször volt alacsonyabb a -174G allélt hordozó vektorénál. IL1 stimulust követıen a -174C reporter gén aktivitása nem változott, míg a -174G allélt tartalmazó konstrukciók esetében az aktivitás 3.60±0.26-szorosára nıtt (Fishman et al., 1998). Számos tanulmány foglalkozott a G-174C polimorfizmus és a vérszérum IL6 szintjének összefüggésével, de a kapott eredmények ellentmondásosak. A G-174C polimorfizmust felfedezı, az elıbbiekben ismertetett in vitro eredményeket közlı csoport egészséges emberek vizsgálatakor azt találta, hogy összehasonlítva a G allélt is hordozó egyedeknél mért értékekkel, a C allélt homozigóta formában hordozóknál szignifikánsan alacsonyabb az IL6 szérumszint (Fishman et al., 1998).

30



A késıbbiekben ennek épp az ellenkezıjét megállapító tanulmányok is megjelentek (Boiardi et al., 2006; Ravaglia et al., 2005). Az ellentmondásos eredményekre egy lehetséges magyarázattal szolgálhat az IL6 kifejezıdését szabályozó, egy másik régióban jelenlévı polimorfizmus, amelyet Smith és mtsai le is írtak a közelmúltban (Smith et al., 2008). A G-174C polimorfizmust a felfedezése óta eltelt tíz évben számtalan olyan betegséggel kapcsolatban megvizsgálták, ahol az IL6 szerepe felmerülhetett. Ezek: - a fiatalkori ízületi gyulladásban a -174C/C genotípus ritkábban fordul elı (Fishman et al., 1998) - a 2-es típusú diabetesben a kezdeti eredmények alapján a -174G allél, míg az elhízással kapcsolatban a -174C allél jelenlétét tekintették a magasabb kockázati tényezınek, ám ezeket az eredményeket a meta-analízisek már nem támasztják alá (Qi et al., 2006) (Qi et al., 2007) - a -174C/C genotípus hordozóinak a méhnyakrák kialakulására nagyobb a kockázata (OR=3.16; p=0.014) míg a nyelıcsı tumor esetén a -174G/G genotípusú homozigóta egyéneknek magasabb a esélyhányadosa (OR 2.28; P=0.001) (Gangwar et al., 2009; Upadhyay et al., 2008) - a csontritkulással kapcsolatos vizsgálatban azt találták, hogy a -174C/C homozigótákban magasabb a csontsőrőség, mint a -174G/G homozigótákban (Xiao et al., 2005)

Az IL6 és az AIS A porckorongokat érı abnormális terhelés miatt a gerincferdülésben a porckorong alakja megváltozik, kiékelıdik és ezt a változást követi a porckorong belsı kocsonyás magjának (nucleus pulposus, NP) szerkezeti és metabolikus módosulása is (Oegema, Jr. et al., 1983; Roberts et al., 1993; Taylor et al., 1981). Burke és mtsai kimutatták, hogy gyulladáskeltı stimulusra a scoliotikus porckorong NP sejtjei megnövekedett IL6 szekrécióval válaszolnak, ugyanakkor alapállapotban nincs eltérés az egészséges és scoliotikus sejtek IL6 termelésben (Burke et al., 2003). A fenti eredmények ismeretében Logroscino munkacsoportja megvizsgálta, hogy az IL6 promóterében lévı G-174C SNP eloszlása mutat-e eltérést az egészséges és kontroll populáció között (Aulisa et al., 2007). A vizsgálatba Olaszország középsı és déli részérıl származó 53 IS-es és 202 kontroll egyedet vontak be és eset-kontroll 31



asszociációs analízist végeztek. A kapott genotípus eloszlás mind a kontroll, mind a beteg csoportban Hardy-Weinberg egyensúlyban volt és a kontroll minták alléleloszlása nem mutatott eltérést a más populációt érintı irodalmi adatokhoz képest. A gerincferdülésben szenvedı betegek között azonban kétszer olyan gyakran fordult elı a -174 G/G genotípus, mint a kontroll csoportban (52.8% , illetve 26.2% p<0.001) míg a -174 C/C genotípus gyakorisága szignifikánsan magasabb volt a kontroll csoportban (30,1%), mint a scoliosisos betegek között (5.7%). Az elvégzett statisztikai elemzés szerint az IL6 -174 G/G homozigóta genotípusú egyedek esélye a gerincferdülés kialakulására 10.54-szer, a G/C heterozigóta genotípusú személyeké pedig 4.84-szer magasabb, mint a C/C homozigóta genotípusú embereké, bár szignifikáns különbséget csak a két homozigóta pár között lehet kimutatni. Az eredmények alapján a szerzık úgy gondolják, hogy az IL6 gén promóterének polimorfizmusa fontos genetikai faktora lehet a gerincferdülésre való hajlamnak. Ugyanakkor a vizsgálatba bevont 53 gerincferdülésben szenvedı beteg mintaszáma alacsony ahhoz, hogy a kapott eredményeket maradéktalanul elfogadhassuk.

32



CÉLKITŐZÉSEK

Az idiopathiás scoliosis kialakulásának okát évtizedek óta széles körben kutatták és kutatják a mai napig. Az erıfeszítések ellenére azonban eddig nem sikerült olyan etiolóiai teóriát kialakítani, ami minden, az AIS-ben megfigyelhetı jellegzetességet, rendellenességet, eltérést be tudna illeszteni egy egységes rendszerbe. A munkánk során célul tőztük ki, hogy molekuláris szintő vizsgálatokban, két megközelítéssel az AIS-re jellemzı további eltéréseket tárjunk fel és az eltérések hátterében álló genetikai tényezıket vizsgáljuk. A. Az elsı megközelítésben a gerincoszlop stabilitásáért felelıs paravertebrális izmok génexpressziós mintázatát kívántuk megvizsgálni. A teljes izom transzkriptoma egyidejő analízisével, a CHIP microarray módszerrel összehasonlítottuk az:

I. Egészséges és scoliotikus paravertebrális izmok génkifejezıdését II. Scoliotikus izmokban a görbület konvex és konkáv oldali génkifejezıdését Azokat a géneket vizsgáltuk tovább, amelyek kandidánsként szóbajöhetnek az alábbi szempontok alapján: 1. Bioinformatikai módszerekkel meghatározott,

a

háttér eloszlástól eltérı

génontológiai kategóriába esnek 2. Közös az AIS szempontjából érdekes, biológiai, metabolikus folyamatban vesznek részt 3. Az

AIS

vonatkozásában

elvégzett

kapcsoltsági

analízisek

által

jelölt

kromoszómaszakaszra lokalizálódnak 4. Az általuk termelt fehérje a funkciója alapján beilleszthetı az AIS etiológiájába B. Második lépésként a génexpressziós vizsgálatok által jelölt gén/gének SNP polimorfizmusának asszociációs analízisét eset-kontroll tanulmányban terveztük vizsgálni. A genotipizálás eredményeit különbözı, a gének közötti interakciók kimutatására alkalmas statisztikai módszerekkel szándékoztuk kiértékelni. A genotípus adatokat a klinikai adatokkal összevetve a statisztikai analízis lehetıséget ad annak a meghatározására, hogy a gén/gének adott allélja a gerincferdülés kialakulásához vagy súlyosbodásához köthetı-e.

33



ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Kísérletbe bevont személyek adatai és mintái Gerincferdülésben szenvedı betegek mintái Az AIS-es betegek mintáit a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvosi Kar Ortopédiai Klinikájáról Prof. Illés Tamástól kaptuk. A vizsgálatba bevont személyeknél a kiválasztásuk elıtt ortopédiai vizsgálat, gerincröntgen, laboratóriumi vizsgálat (szérum kalcium, foszfor, alkalikus foszfatáz szint és vizelet kalcium és foszforszint mérés) történt. Teljes vázrendszeri vizsgálat készült a lehetséges diszpláziák kiszőrésére. A betegeket és elsı fokú rokonaikat egy genetikus vizsgálta meg a lehetséges genetikai szindrómák szempontjából. Az idiopathiás scoliosis diagnózisát bizonyított genetikai szindróma, metabolikus, neurológiai-, kollagénvagy izombetegség hiányában állapították meg. DNS minták egyrészt a mőtétek során nyert izom biopsziákból, másrészt IS-es betegek perifériás vérébıl nyert fehérvérsejtjeibıl preparáltuk, összesen 126-ot. RNS mintákat a korrekciós mőtéten átesett betegekbıl az operáció során nyert bilaterális musculus latissimus dorsi izombiopsziából preparáltuk összesen 32-öt. A betegeket minden esetben tájékoztattuk a kísérletbe történı bevonásukról és a beleegyezésükkel történtek a mintavételek.

Kontroll személyek mintái A kontroll személyek mintái több forrásból származnak, de a kiválasztásnál mindig szem elıtt tartottuk a dél alföldi régióból való származást. A kontroll minták mintegy felét (112 minta) a Szegedi Tudományegyetem Gyerekgyógyászati Klinikájáról, Dr Endreffy Emıkétıl kaptuk, a másik részét a munkacsoportunkban folytatott másik populációgenetikai vizsgálathoz győjtöttük, fıleg az SZBK Genetika Intézet dolgozóitól. A kontroll személyek sem egymással sem az AIS betegekkel nem állnak rokonságban. DNS mintákat perifériás vérbıl kinyert fehérvérsejtekbıl, szájnyálkahártya kenetbıl és hajszálak végén lévı hajhagymákból készítettük. A microarray analízishez használt kontroll RNS mintákat trauma miatt operált betegek bilaterális musculus latissimus dorsi biopsziából készítettük.

34



DNS alapú munkafolyamatok Genomikus DNS tisztítása A genomikus DNS tisztítása perifériás vérbıl, izombiopsziából a hagyományos fenolos extrakcióval (Short Protocols in Molecular Biology 1992), száj nyálkahártya kenetbıl és hajszálakból pedig a Walsh és munkatársai által kidolgozott Chelex-alapú módszerrel történt (Walsh et al., 1991).

SNP-k kimutatása PCR-RFLP módszerrel A PCR-RFLP módszeren alapuló genotipizálás során elıször PCR-rel felszaporítjuk a vizsgálni kívánt SNP-t tartalmazó DNS szakaszt, majd olyan restrikciós enzimmel emésztjük az amplikont, melynek felismerı helyét a polimorfizmus érinti. A leptin promóter G-2548A polimorfizmusát ezzel a módszerrel már többen is vizsgálták, mi Yapijakis és kollégái által leírt módszer alapján végeztük el a genotipizálást. (Yapijakis et al., 2009) Az IL6 promóter C-174G polimorfizmusát pedig Aulisa és munkatársai által használt protokoll szerint vizsgáltuk. (Aulisa et al., 2007) A következı primereket (Merck Kft) használtuk a PCR-hez:

Leptin (rs7799039)

F:5`-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3` R:5`-AAAGCAAAGACAGGCATAAA-3`

IL6 (rs1800795)

F:5’- TGACTTCAGCTTTACTCTTTgT-3’ R:5’- CTGATTGGAAACCTTATTAGG-3’

A PCR-t MJ Research PTC 200-as PCR készülékben végeztük GOTaq (Promega) DNS polimerázzal a következık szerint:

25 µl össztérfogatban a PCR reakciót az alábbiak alkották: 100 ng DNS templát,

200 µM ΣdNTP, 2 mM MgCl2, 1 µM forward és 1 µM reverz primer, 1x GOTaq puffer (Promega), 0.25 U GOTaq DNS polimeráz.

A reakcióelegyet 94 oC–on 5 percig tartottuk a Taq polimeráz aktiválásához majd

35 ciklusban végeztük az amplifikálást: denaturálás 94 oC–on 30 másodpercig, primer kapcsolódás (annealing) 52 oC-on 30 másodpercig, átírás 72 oC–on 30 másodpercig. Végezetül a szál lezárása 72 oC–on 5 percig zajlott. 

A PCR termék restrikciós emésztését a következık szerint végeztük: a 20 µl

össztérfogatú reakcióelegyben: 8 µl PCR termék, a gyártó által szolgáltatott megfelelı 1x 35



puffer, 3 U HhaI (Fermentas), illetve 5 U NlaIII (New England Biolabs). A reakciót 37 oC–on egész éjszakán át inkubáltuk. A restrikciós emésztéseknél mindig használtunk kontroll DNS mintát, hogy ellenırizhessük az emésztés eredményességét.

A PCR termékek kimutatására a Mini-PROTEAN III Electrophoresis System (BioRad)

gélelektroforézis rendszert használtunk. 8%-os natív poliakrilamid gélen 1x TBE futtató puffer jelenlétében. A vizualizációhoz festettük a gélt 1 µg/ml etidium-bromidos vízben 10 percig, majd a GelBase (UVP) géldokumentációs rendszerrel archiváltuk és értékeltük a géleket (6. ábra).

6.ábra

A. A leptin G-2548A, illetve az IL6 C-174G SNP által meghatározott genotipusokhoz

tartozó restrikciós fragmentumok hossza B. Gélfotó, amely a leptin G-2548A SNP meghatározását mutatja C. Gélfotó, amely az IL6 C-174G SNP meghatározását mutatja 36



RNS alapú munkafolyamatok RNS izolálás

A hátizom biopsziából kb. 50-100 mg szövetet folyékony nitrogén alatt dörzsmozsárban

porítottuk, ehhez 1 ml TRIzol (Invitrogen) reagenst adtunk és 5 percig szobahımérsékleten inkubáltuk a nukleoprotein komplexek disszociációja végett. A mintát nagy proteoglikán, zsír és poliszacharid tartalma miatt 4 oC-on, 12000 g-vel, 10 percig centrifugáltuk.

A felülúszót új Eppendorf csıbe helyeztük s ahhoz 200 µl kloroformot adtunk. 15

másodpercig összeráztuk, majd 15 perces inkubáció után 4 oC-on, 12000 g-n, 15 percig centrifugáltuk. A kialakult három fázis közül az RNS-t is tartalmazó vizes óvatosan eltávolítottuk, ügyelve, hogy az interfázistól elválasszuk.

A vizes fázishoz hozzámértünk 0.5 ml izopropilalkoholt, majd 15 másodperc összerázás

után 10 percig szobahımérsékleten inkubáltuk. A 4 oC-on, 12000 g-vel, 10 percig tartó centrifugálás hatására az Eppendorf csı aljára kicsapódott az RNS. A felülúszót leszívtuk, 1 ml 70%-os etil-alkohollal mostuk a csapadékot vortexelés mellett. 7500 g-s 5 perces centrifugálás után az etil-alkoholt eltávolítottuk.

Az RNS-t szobahımérsékleten szárítottuk, majd 50 µl RN-áz mentes, DEPC-s vizet

(Fermentas) mértünk a csapadékra. Az RNS oldódását az 55-60 oC-on történı 10 perces inkubáció segítette.

Northern gél elektroforézis Az RNS minták minıségének ellenırzésére használtuk.

Agaróz gél összetétele: 1% agaróz (GIBCO), 1x MOPS pH:7, 0.65% formaldehid.

A futtató puffer: 1x MOPS ph:7, 0.65%-os formaldehid.

RNS minták gélfuttatás elıtti kezelése az alábbiak szerint történt: 3.5 µl RNS

oldathoz hozzámértünk 10 µl formamidot, 3.5 µl 35%-os formaldehidet, 2 µl 10x MOPS pH:7 oldatot, 1 µl 1 mg/ml etídium-bromidot, majd 70 oC-on 10 percig inkubáltuk.

37



A mintákhoz a gélre való feltöltés elıtt 0.1 térfogat Blue Juice oldatot (50%

glicerin, 0.4% bróm-fenolkék, 0.4% xilén-cianol, 1mM EDTA)adtunk.

A gél futtatása 80 V-on kb. 2 órán keresztül történt.

A vizualizációhoz és a dokumentációhoz a GelBase géldokumentációs rendszert

(UVP) használtuk.

28S RNS 18S RNS

5S RNS

7.ábra Northern agaróz gélelektroforézis

Az RNS mintákat akkor fogadtuk el megfelelı minıségőnek, amennyiben a 28S nagy molekulasúlyú riboszomális RNS-ek is erısen látszottak, mint az a 7.ábrán is látható.

RNS mintacsoportok tisztítása Az egyéni RNS mintákat egyenlı arányban összekevertük, létrehozva ezzel azokat a mintacsoportokat (pool-okat), amelyekkel a továbbiakban dolgozni szándékoztunk. A további munkafolyamatok elıtt a kialakított RNS oldatokat tovább tisztítottuk Macherey-Nagel Nucleospin RNAII kitjével a gyártó leírása alapján:

Az RNS oldathoz 450 µl RA1 oldat és 7 µl β-merkaptoetanol keverékét adtuk, majd

összeráztuk és 350 µl 70%-os etanolt hozzáadása után nukleinsav-kötı oszlopra pipettáztuk. 2 percig centrifugáltuk 1000 RPM-mel.

A membránhoz kötött RNS mosása után 90 µl 25 mM-os DN-áz I hozzáadásával 15

percig szobahımérsékleten inkubáltuk, majd hozzámértünk 200 µl RA2-t (DNase stop solution buffer). 2 perces centrifugálás-1000 RPM-mel.

38



A DN-áz tökéletes eltávolítása érdekében további mosásokkal tisztítottuk a

membránhoz kötött RNS-t: 300 µl RA3 puffer hozzáadása után 2 perc centrifugálás 1000 RPM-mel, majd 125 µl RA3 pufferrel történı mosás után 4 perc centrifugálás 1000 RPM-mel.

A nukleinsav-kötı mosást követıen az oszlopot áttettük egy steril Epp.csıbe, 60 µl

DEPC H2O-t (Fermentas) mértünk rá és szobahımérséklet 10 percig állni hagytuk, majd az RNS-t 4 perces 1000RPM-mel történı centrifugálással oldottuk le a membránról.

Amennyiben szükséges volt akkor az RNS oldatokat koncentráltuk Amicon

Microcon centrifugacsıvel (Millipore) 11000 RPM-mel 20 percig történı centrifugálás után 8 µl DEPC H2O-t mértünk a nukleinsav-kötı oszlopra, majd a csövet megfordítva 1 percig centrifugáltuk.

Fluoreszcensen jelölt próba készítése a microarray hibridizáláshoz A próba készítéséhez a Cy5 fluoreszcens festékkel kapcsolt 3DNA Array 900MPX Kitet (GeniSphere) használtuk a gyártó leírása alapján: 1. A reverz transzkripciót a RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kittel (Fermentas) végeztük a gyártó leírása alapján. Röviden:

A mintacsoportonként 2.5 µg RNS-hez 5µl random hexamer primert és 1 µl oligo

dT primert adtunk 13 µl térfogatban. 10 percig 80 oC-on inkubáltuk, majd rögtön jégre tettük.

Hozzáadtunk 4 µl 5x Fermentas puffert, 1 µl 10mM ΣdNTP-t, 1 µl ribonukleáz

inhibitort és 1 µl Fermentas MMLV reverz transzkriptázt. Inkubáltuk 2 órán át 42 oCon.

A mRNS-t hidrolizáltuk 3.5 µl 0.5M NaOH/50mM EDTA oldat hozzáadása után 65

o

C-on 15 percig, majd a cDNS oldatot neutralizáltuk 5 µl TRIS-t pH:7.5

hozzáadásával. A mintákat -20 oC-on tároltuk másnapig. 2. A cDNS tisztítása MinElute Spin column 50 kittel (Qiagen) történt a gyártó leírása alapján:

39



50 µl cDNS-hez 250 µl PB puffert adtunk, és az oldatot a MinElute oszlopra

pipettáztuk, majd 1 percig 13000 RPM fordulatszámmal centrifugáltuk.

Az átfolyt PB mosópuffer eltávolítása után 750 µl PE puffert mértünk az oszlopra és

1 percig centrifugáltuk majd az átfolyó puffert kiöntve újabb egy perces centrifugálás történt a maradék etanol eltávolítása érdekében.

A cDNS visszanyerésénél az oszlopot egy steril csıbe helyeztük, a nukleinsav-kötı

membránra 10 µl EB puffert pipettáztunk, 2 percig szobahımérsékleten inkubáltuk, majd 2 perc centrifugálás után az oszlopot eltávolítottuk. 3. Címkézés

A cDNS-hez 6.5 µl nukleázmentes desztillált vizet adtunk. A 16,5 µl-nyi mintát

80oC-on 10 percig melegítettük, majd rögtön jégre helyeztük.

Hozzámértünk 2.5 µl 10x címkézı puffert, 4 µl 10 mM dTTP-t és 2 µl terminális

deoxynukleotidil transzferázt, 37

o

C-on 30 percig, majd 65

o

C-on 15 percig

inkubáltuk. 4. Ligálás

A 25 µl mintát 10 percre 95 oC-ra helyeztük, majd rögtön jégre tettük.

Hozzáadtunk 5 µl 6x Ligation Mix-et (Cy5/Alexa 647) és 2 µl T4 DNS ligázt.

Finoman összeráztuk, szobahımérsékleten fél óráig inkubáltuk.

A reakciót leállítottuk 3.5 µl 0.5M EDTA oldat hozzáadásával és 10 másodpercig

vortex-szel összekevertük. 14.5µl TE8 hozzáadásával értük el az 50 µl-es végtérfogatot. 5. A jelölt cDNS-t tisztítottuk, a fentebb már említett módon, Qiagen MinEluteTM Spin columns 50 kittel.

A cDNS és a 3DNA hibridizációja a CHIP-hez A Genishere jelölı kithez tartozó protokollt követtük a továbbiakban is a hibridizációs mix elkészítéséhez.

40



DNS hibridizációs mixet állítottunk össze a következıképpen: 10 µl cDNS, 2 µl

LNA dT Blocker, 3 µl nukleáz mentes víz, 15 µl 2x hibridizációs puffer.

A mixet összekevertük vortex-szel, röviden centrifugáltuk, 75-80 oC-on inkubáltuk

10 percig, majd 55-65 oC között tartottuk a további használatig.

Rövid vortexelés és centrifugálás után a mixet az elımelegített CHIP lemezre

tettük. A hibridizáció a Ventana hibridizáló állomásban (Ventana Discovery) „antibody” protokol szerint zajlott.

Az elsı hibridizálási lépés (cDNS hibridizálás) 42 oC-on 18 órán keresztül a

következı hibridizáló pufferben történt: 10x Denhart oldat, 0.25 M Na foszfát puffer pH 7.0, 1 mM EDTA, 1x SSC, 0.5% SDS.

A második hibridizálási lépés (3DNA hibridizálás) 2.5 µl Cy5 fluorofort tartalmazó

„elıhívó” reagens jelenlétében 200 µl „Chiphyb” hibridizáló pufferben (Ventana) történt 42 oC-on 2 óráig.

A hibridizálás után a lemezeket 0.2X SSC oldatban kétszer mostuk.

A hibridizáció utáni kiértékelés

A lemezek leolvasása konfokális lézer szkennerrel (ScanArray Lite, GSI Luminics)

történt.

A pontok kiértékelése GenePix analizáló programmal történt. A számszerősített adatokat Misrosoft Excell program segítségével, minıségi

paraméterek figyelembe vételével értékeltük és normalizáltuk. Azok a pontok, melyeknél a minta és a kontroll fluoreszcencia intenzitás értékekbıl képzett, normalizált hányados -ami a gén relatív kifejezıdési szintjét mutatja- 2 felett illetve 0,5 alatt van, olyan gént jelöl, amelynek kifejezıdése eltérı a kontrollból és betegbıl, illetve a jobb és a bal oldalról származó izombiopsziákban.

41



Valós idejő kvantitatív polimeráz láncreakció (QRT-PCR) A génspecifikus primereket a Primer Express programmal (Applied Biosystem) terveztük a szoftver által javasolt beállításokat követve. A primerek specifitását az NCBI BLAST szerverének a primerek tesztelésére alkalmas programjával (“Search for Short, Nearly Exact Matches”) ellenıriztük. A primerek szintetizálását az SZBK Nukleinsav Szintézis Központi Laboratóriumában végezték el. A primer szekvenciák a következıek voltak: LMNA

F:5’ GAGCTGCCTTCCCTAGCTTTAGA 3’ R:5’ CTCCCAGCACCCCACTTG 3’

VDR

F: 5’ GATATGGCAGCGAAAGGATGTAA 3’ R: 5’ TGACAAACTTCTGGCAAACTTTTT3’

COL15A1

F:5’ CATCCCAACATAGGTTAAGAGCAA 3’ R:5’ 3ACACTCAACAACAATGGTTTAAAAGG’

JAK1

F: 5’ TGCCCAGAAGCAGTTCAAGA 3’ R: 5’ TCCGAACCGTGCAGACTGTA 3’

BMP4

F:5’ CAAGCGTAGCCCTAAGCATCA 3’ R:5’ GGCGCCGGCAGTTCTT 3’

IL4R

F: 5’ GCACCTCGACTTGTGAACGA 3’ R: 5’ GGACAGTCTGCTGCAGAAGCT 3’

NTF3

F:5’ TCCAGCCGGTGATTGCA 3’ R:5’ CGGTGAGTTGTAGCGTCTCTGT 3’

LEP

F:5’ TTGTCACCAGGATCAATGACA 3’ R:5’ GTCCAAACCGGTGACTTTCT 3’

CDK5

F:5’ TTAATTTCCTGAGTGACCAGCAT 3’ R:5’ AGCCTCCTTTGGAAAGGTCT 3’

HOX7

F:5’ ACATCGAGCCTTCAACGTG 3’ R:5’ ACTTTTTGCAAATGAAGAAACTAAGA 3’

NOS1

F:5’ CCTCCTGGGTTTACTCCTTGAGT 3’ R:5’ AGTTTTGTAAGAGCCACTGCAGATT 3’

NOS2

F:5’ CCTCAAGTCTTATTTCCTCAACGTT 3’ R:5’ CCGATCAATCCAGGGTGCTA 3’

NOS3

F:5’ GCGGCTGCATGACATTGAG 3’ R:5’ TCGCGGTAGAGATGGTCAAGT 3’

HPRT

F:5’ CACTGGCAAAACAATGCAGACT 3’ R:5’ CGACCTTGACCATCTTTGGATT 3’

β-AKTIN F:5 ’CCAACCGCGAGAAGATGA 3’ R:5 ’CCAGAGGCGTACAGGGATAG 3’

42



A reverz transzkripciót oligoT és random hexamer primerek felhasználásával a RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kittel (Fermentas) végeztük a gyártó leírása alapján, amint azt a microarray próba készítésénél már röviden leírtam. A valós idejő PCR során a Rotor-Gene 3000 (Corbett Research) PCR készüléket használtuk a PCR termék amplifikálására és kimutatására, ami a SYBR-Green festésen alapuló detekciós eljárást használtuk a keletkezı termék nyomon követésére. Röviden:

20 µl össztérfogatban a PCR reakciót az alábbiak alkották: 5 µl ötszörösére hígított

cDNS, 0.5 µl 10 µM-os forward primer, 0.5 µl 10 µM-os reverz primer, 4 µl nukleáz mentes víz (Fermentas) és 10 µl ABsolute QPCR SYBR Green Mix (ABgene).

A reakcióelegyet elıször 94

o

C–on 10 percig tartottuk, a DNS polimeráz

aktiválásához, majd 50 ciklusban amplifikáltuk a következık szerint: denaturálás 94 oC–on 25 másodpercig, primer kapcsolódás 61 oC-on 25 másodpercig, átírás 15 másodpercig.

Minden reakció után elvégeztük az olvadáspont analízist, amihez a PCR reakció

hımérsékletét 55 oC–ról 93 oC–ra emeltünk és folyamatosan, fél percenként mértük a SYBRGreen festék floureszcencia jelét. A PCR termékre jellemzı olvadáspont meghatározásával a keletkezett amplikont ellenıriztük. Minden primerpárhoz használtunk egy negatív kontrollt, ahol a cDNS helyett vizet tettünk a reakcióelegybe, ellenırizve a primer dimer képzıdést.

Statisztikai analízis A beteg-kontroll asszociációs vizsgálatoknál alapvetı fontosságú, hogy a biallélikus polimorfikus pontok által meghatározott allél- és genotípus gyakoriság eloszlások HardyWeinberg egyensúlyban (HWE) legyenek. A HWE fennállását a „Hardy-Weinberg

equilibrium calculator including analysis for ascertainment bias” web program segítségével igazoltuk (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml) (Rodriguez et al., 2009). Pearson-féle χ 2 vagy Fisher egzakt teszt segítségével hasonlítottuk össze a LEP G-2548A és az IL6 G-174C polimorfizmusok elıfordulási gyakoriságát a beteg és a kontroll populációban, meghatároztuk az egyes genotípusokhoz tartozó esélyhányadosokat (OR, odds ratio) és a hozzájuk tartozó 95%-os megbízhatósági tartományt (CI, confidence intervals). A polimorfikus SNP-k közötti kölcsönhatások vizsgálatára két módszert használtunk. Az MDR (Multifaktoros Dimenzionalitás Redukció) analízis egy genetikai modell-mentes, nem 43



paraméteres eljárás amihez Jason Moore Számítástechnikai Genetika Laborja által fejlesztett, szabadon felhasználható szoftvercsomagot (MDR 2.0 Beta 6) használtuk és a következı webcímrıl töltöttük le: http://www.multifactordimensionalityreduction.org (Hahn et al., 2003b). A másik módszer egy paraméteres eljárás, ami a génkombinációk hatásának ML (maximum likelihood) becslését alkalmazza annak a kimutatására, hogy az adott génkombináció milyen mértékben emeli meg a betegség kialakulásának esélyét a legkevésbé hajlamosító genotípus kombinációhoz viszonyítva (Yamada et al., 2001). A relatív esélyhányadosok meghatározását és kereszttáblába történı rendezését Hirose és mtsai közleménye alapján végeztük el (Hirose et al., 2008). A GLM (Generalizált Lineáris Model) analízist használtuk arra, hogy kimutassuk létezik-e valamilyen összefüggés a Cobb˚ nagysága és a vizsgált két funkcionális SNP által meghatározott genotípus, vagy kettıjük genotípus kombinációi között. Az elızıekben említetteken kívül a statisztikai elemzésekhez az SPSS 16.0 for Windows szoftvercsomagot

használtuk.

A

p<0,05

statisztikai

teszteredményeket

tekintettük

szignifikánsnak.

A munka során használt fontosabb online bioinformatikai eszközök és adatbázisok internet címei: •

DAVID: http://niaid.abcc.ncifcrf.gov/

•

GeneCards: http://www.genecards.org/

•

KEGG PATHWAY Database: http://www.genome.jp/kegg/pathway.html

•

MDR 2.0: http://www.multifactordimensionalityreduction.org

•

NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

•

Scoliosis Research Society: www.srs.org

•

STRING: http://string.embl.de/

44



EREDMÉNYEK

Az idiopathiás scoliosis etiológiájának genetikai komponensét két megközelítéssel vizsgáltuk. Az elsıben a gerincoszlop tartásában szereppel bíró paravertebrális izmok génexpresszió szintő vizsgálata volt a cél, a másodikban pedig a génkifejezıdésben szabályozó szerepet játszó promóter polimorfizmusok asszociációját néztük eset-kontroll tanulmányban.

Paravertebrális izmok RNS kifejezıdési mintázatának vizsgálata CHIP microarray-vel Az elsı megközelítés a kontroll és az IS-es betegek paravertebrális izmainak génexpressziós analízise volt és abból a feltevésbıl indult ki, hogy az idiopathiás scoliosisban jelenlévı strukturális változások tükrözıdnek a génexpresszió szintjén is. A PTE ÁOK Ortopédiai Klinikától 95 beteg mőtéti anyagából bilaterális musculus latissimus dorsi biopsziákat kaptunk, amibıl teljes RNS preparátumot készítettünk. Az SZBK Funkcionális Genomika munkacsoportjával (CHIP Labor) közösen két microarray analízist végeztünk el. Az elsıben gerincferdüléses és egészséges személyekbıl származó mintákat, a másodikban pedig a gerincferdüléses személyeknél a gerincoszlop két oldaláról vett mintákat hasonlítottunk össze.

Egészséges és scoliosisos betegek izombiopsziájának génkifejezıdésbeli összehasonlítása A CHIP kísérlet során két párhuzamos pool-t készítettünk (IS I és IS II), melyek esetében egyenként 6-6 korban, nemben és a scoliosisos görbülete fokában közel megegyezı személy RNS mintáit kevertük össze. Ez a ún. ”pool„ kialakítás arra szolgál, hogy az egyedi különbségeket elfedjük és a közös, vizsgálni kívánt jelenséghez kapcsolható változás hangsúlyozottabban jelenhessen meg. A választásnál figyelembe vettük a közel azonos életkort és a Cobb fokot. (2. táblázat) A kontroll csoport 4 traumás eredető és ékcsigolya miatt mőtött egyén mintáit tartalmazta.

45


IS I életkor

Minták

Átlag

IS II életkor

Cobb˚


Cobb˚

Kontroll életkor

1

13.46

54.00

14.00

62.00

12.65

2

15.23

62.00

15.73

57.00

14.83

3

15.58

52.00

15.94

54.00

21.39

4

16.66

65.00

16.98

60.00

38.47

5

17.96

60.00

17.43

52.00

6

18.71

55.00

17.44

77.00

16.27

58.00

16.25

60.33

21.84

2. táblázat Az RNS „pool”-ok kialakításában résztvevı egyének életkora és Cobb˚ értéke (az AIS-es betegnél) a mintavétel idején. Két párhuzamos „pool” kialakítására volt lehetıség (IS I, ill. IS II) a betegnél, míg kontrollként csak egy „pool”-t tudtunk használni

Az általunk készített RNS „pool”-okból kialakított próbákat a CHIP labor által elıállított 24 nukletoidos oligokat (Sigma-Aldrich) hordozó mikrochipekhez hibridizáltuk melyek egyenként 13000 db részben annotált humán cDNS-t, illetve EST-t reprezentáltak. Az adatok kiértékelése és statisztikai elemzése után 96 gént azonosítottunk úgy, hogy génkifejezıdésük magasabb, míg 91-ot úgy, hogy alacsonyabb a gerincferdüléses betegek paravertebrális izmaiban a kontroll egyedekhez képest. A viszonylag nagyszámú génkifejezıdésbeli változás további feldolgozást igényelt, hogy kiválaszthassuk azokat a géneket, amelyekkel érdemes tovább dolgozni. Ehhez a SAICFrederick Inc. Bioinformatikai munkacsoportja által fejlesztett, szabad felhasználású, interneten használható programot a DAVID-et (Database for Annotation, Visualization and

Integrated Discovery) használtuk (Huang et al., 2009). A DAVID 40 különbözı annotációs kategóriát tartalmaz és a felhasználó által adott génlistában szereplı géneket csoportosítja a kiválasztott kategória, vagy kategóriák kombinációja szerint és a csoportosítást különbözı módon is láthatóvá teszi. Elvégeztük az expresszióváltozást mutató gének génontológiai (GO) besorolását olyan GO kategóriákat keresve, amelyek a teljes humán genom génkészletben tapasztalható GO eloszláshoz (háttér) képest statisztikailag alul vagy felülreprezentáltak az adatainkban. A 3. táblázatban látható az a 25 legszignifikánsabb

46



változást mutató biológiai folyamatokat jelölı GO kategória, amelyben eltérést találtunk a háttérhez képest. Ezek mindegyikének az általános sejtmőködésben és a sejtek metabolikus folyamataiban van szerepe. Nem találtunk közöttük olyan GO kategóriát, amelyrıl feltételezhetnénk, hogy az idiopathiás scoliosis etiopathológiájába beleillhet. Elvégeztük még a funkcionális fehérje doméneket és a fehérje-fehérje kölcsönhatásokat tartalmazó adatbázisok alapján történı besorolást is és azt is megnéztük, hogy létezik-e olyan biológiai útvonal, amelyben a génlistánkból több gén is szerepel. Sajnos ezek a kutatások sem vezettek eredményre, általuk sem tudtunk olyan géneket jelölni, amit érdemes lenne tovább vizsgálni.

3. táblázat. A DAVID programcsomag által szolgáltatott táblázat, amely a CHIP kísérletben kapott, a scoliosisos és kontroll minták közötti génkifejezıdésbeli különbséget mutató gének biológiai folyamatokat jelölı GO kategóriák szerinti besorolását mutatja

Következı lépésben a génlistánkon szereplı gének kromoszóma lokalizációját néztük meg olyan kromoszóma szakaszokat keresve, ahová több expresszió változást mutató gén is térképezıdik. Továbbá azoknak a gének az azonosítása volt a célunk, amelyek olyan kromoszóma szakaszon helyezkednek el, amit más tudományos közlemények az AIS-sel már korábban kapcsolatba hoztak. Egy gént találtunk, amelyik az 1. táblázatban bemutatott 47



kapcsoltsági analízisben jelöltként szerepelt, ez a 12 p13-as kromoszóma szakaszon található NTF3 (neurotrofin 3) gén volt, ami egy neuronokra ható növekedési faktor (8. ábra). A továbbiakban irodalmi kutatásokat végeztünk a microarray kísérletben szignifikáns eredményt adó génekkel kapcsolatban, majd a vonatkozó GeneCards leírások és számos publikáció elolvasása után 5 gént kiválasztottunk a további célzott vizsgálatok célpontjainak. A kiválasztott gének a következık voltak: strukturális alkotókat kódoló gének: LMNA (lamin A), COL15A1 (XV-ös típusú kollagén alfa 1 lánc); a VDR (D vitamin receptor); egy a másodlagos jeltovábbításban szereplı kináz JAK1 (Janus kináz 1); sejtmembrán receptor; IL4R (interleukin 4 receptor); a csontfejlıdésben szerepet játszó differenciációs faktor BMP4 (csont morfogenetikus protein 4); a Ca2+-szignálútban a kalmodulinnal kapcsolatban lévı NOS1 (nitrogénmonoxid szintetáz 1). Ezeknek a géneknek a további, QRT-PCR-rel történı vizsgálatára a fejezet egy késıbbi szakaszában még visszatérek.

8. ábra. Az ENSEMBL Genome browser által készített kariogram, ahol a CHIP kísérletben kapott, a scoliosisos és kontroll minták közötti génkifejezıdésbeli különbséget mutató gének kromoszóma lokalizációja látható grafikus ábrázolással. Piros nyíllal jelöltem azt a régiót, amit az AIS-sel már korábban kapcsolatba hoztak.

48



Scoliosisos betegekben a gerincoszlop két oldaláról származó izombiopsziák génkifejezıdésbeli összehasonlítása A második microarray analízis során 10-10 személy RNS mintáit kevertük össze, két-két párhuzamos (IS I, IS II) konvex, illetve konkáv oldali mintát hozva létre, így a biológiai és a technikai párhuzamosokkal a késıbbiekben lehetıségünk nyílt statisztikai kiértékelést végezni. A „pool”-ok kialakításánál csak lányokból származó mintákat használtunk és figyelembe vettük az életkort, valamint a Cobb görbület mértékét. (4. táblázat)

IS I életkor

Minták

Átlag

Cobb˚

IS II életkor

Cobb˚

1

15.23

62.00

17.72

88.00

2

14.00

62.00

16.93

79.00

3

17.44

77.00

14.58

51.00

4

15.94

54.00

16.27

63.00

5

14.28

78.00

14.97

46.00

6

17.43

52.00

19.83

42.00

7

15.58

52.00

24.60

66.00

8

13.46

54.00

15.22

48.00

9

16.98

60.00

16.06

33.00

10

16.66

65.00

20.91

57.00

15.70

61.60

17.71

57.30

4. táblázat Az RNS „pool”-ok kialakításában résztvevı egyének életkora és Cobb˚ értéke a mintavétel idején. Két párhuzamos „pool” kialakítására volt lehetıség (IS I, ill. IS II), és mindkét „pool” esetén külön kezeltük a konvex oldali, illetve a konkáv oldali mintákat

A 4. táblázatban szereplı egyének RNS „pool”-jából készített próbákat a humán 20K Genomic Microarray (Microarray Inc) mikrochipekhez

hibridizáltattuk.

A kapott

fluoreszcens jelek automatikus beolvasása és a kapott értékek statisztikai elemzése után 63 génben találtunk szignifikáns eltérést a gerincoszlop konvex és konkáv oldali expressziós 49



szintjében; 22 gén mutatott erısebb konvex oldali expressziót, 41 pedig erısebb konkáv oldalit. A továbbiakban az elsı microarray kísérletnél leírt bioinformatikai elemzéseket végeztük el ezzel a génlistával is. Az 5. táblázatban látható génontológiai besorolásuk után két területen tapasztaltunk a humán genom GO eloszlásához képest lényeges eltérést. Az egyik a lipid anyagcsere (az 5. táblázatban pirossal bekeretezve az egymást átfedı GO katagóriák), ahol a 63-ból 7 gén szerepel, a másik a fejlıdés (az 5. táblázatban kékkel bekeretezve az egymást átfedı GO kategóriák), ahol pedig 13.

5. táblázat. A DAVID programcsomag által szolgáltatott táblázat, amely a 2.CHIP kísérletben kapott, a gerincferdüléses betegek gerincoszlopának konvex és konkáv oldalán génkifejezıdésbeli különbséget mutató gének biológiai folyamatokat jelölı GO kategóriák szerinti besorolásából a legszignifikánsabb 25-öt mutatja. Pirossal bekeretezve a lipid anyagcseréhez, kékkel a fejlıdéshez tartozó, átfedı GO katagóriák.

50



Az elemzések egy a KEGG Pathway adatbázisban szereplı biológiai útvonalat is a felszínre hoztak, amelyben a génlistánkból 3 gén is szerepel. A KEGG Pathway (Kyoto

Encyclopedia of Genes and Genomes) adatbázis a Japán Humán Genom Program részeként jött létre és a sejten belüli kölcsönhatások olyan győjteménye, amelyet folyamatosan bıvítenek és magas szinten annotálnak így adatai a aktuális tudásunknak leginkább megfelelı naprakész információkat hordozzák (Kanehisa et al., 2010). A 9. ábrán látható az adipocita szignálút (KEGG_PATHWAY:hsa04920), aminek három tagja: LEP (Leptin), PRKAG2 (alfa 1 AMP-aktivált protein kináz katalitikus alegysége), SLC2A1 (szolubilis karrier család 2 4. tagja (facilitált glükóz transzporter)) mutatott szignifikáns génexpressziós eltérést a gerincoszlop két oldalán. Mindhárom gén esetében a gerincferdülés konvex oldalán magasabb génexpressziós szintet észleltünk, mint a konkávon.

9. ábra. A KEGG_PATHWAY:hsa04920 adipocita szignálút folyamatábrája. Piros csillag jelöli azokat a géneket, amelyek expressziója eltérést mutat a gerincoszlop két oldala között a gerincferdüléses betegekben.

Az elızı elemzésünkben, ahol a biológiai folyamatokat jelölı GO kategóriákba soroltuk a génlistán lévı géneket (5. táblázat), a szignifikánsan (P<0.05) megjelenı génontológiai kategóriák két fı csoportot határoztak meg, nevezetesen a lipid metabolizmust és a fejlıdési folyamatokat. A leptin gén mindkét megnevezett biológiai folyamatban szerepet játszik. Az irodalmi bevezetıben is ismertettem a leptin lehetséges kapcsolódását a gerincferdülés kialakulásához, így ezt a gént mindenféleképp további vizsgálatra érdemesnek tartottuk. 51



Irodalmi adatok alapján a fejlıdéssel kapcsolatba hozható GO kategóriába tartozó további két, a microarray vizsgálatban szignifikánsnak mutatkozó gént, a HOX7-et (msh homeobox 1) és a CDK5-öt (ciklin-dependens kináz 5) is kiválasztottuk még célzott vizsgálatok elvégzésére. A kromoszóma lokalizációs elemzéseket elvégezve hét olyan gént találtunk, melyek olyan kromoszóma szakaszra esnek, amit más laboratóriumok kapcsoltsági analízisben az AIS-sel összefüggésbe hoztak (ld. 1. táblázat). Ezek a gének a következık voltak: GPR107 (G-proteinhez kapcsolódó receptor 107)-9q34.11, ATAD1 (ATP-áz családba tartozó AAA domént tartalmazó fehérje 1)-10q23.2, APC2 (vastagbél adenomatózus polipózis 2)-19p13.3, APLN (apelin)-Xq25, CDK5-7q36.1, ARMC7 (armadilló ismétlıdést tartalmazó fehérje 7)-17q25.1, CPN3 (copine 3)-8q21.3. (10. ábra) Ezen felül a microarray kísérletben szignifikáns eltérést mutató gének listáján szereplı összes gén GeneCards leírását feldolgozva összefüggést próbáltunk találni a gének jelenleg ismert funkciója és az AIS pathomechanizmusára vonatkozó jelenleg ismert modellek között. Két gént találtunk érdekesnek, az izomerı meghatározásában szereplı a disztonint (DST) (Dalpe et al., 1999a) és a sérült izmok regenerálódásában fontos tenzint (TNS1)(Ishii and Lo, 2001).

10. ábra. Az ENSEMBL Genome browser által készített kariogram, ahol a második CHIP kísérletben kapott, a scoliosisos és kontroll minták közötti génkifejezıdésbeli különbséget mutató gének kromoszóma lokalizációja látható grafikus ábrázolással. Piros nyíllal jelöltem azokat a kromoszóma szakaszokat, amelyek korábbi a kapcsoltsági analízis során már kandidáns génként felmerültek (1. táblázat).

52



A microarray kísérletek mindig kiváló kiindulási alapként szolgálnak a génexpressziós vizsgálatokban, mivel látótérbe hoznak a vizsgált jelenséggel funkcionális kapcsolatban álló, de eddig az adott kontextusban még le nem írt géneket. Második lépésként azonban mindenképp szükséges ellenırizni egy független módszerrel, hogy valóban fennáll-e a megfigyelt génkifejezıdésbeli különbség. Ez a független módszer napjainkban általában QRT-PCR.

Paravertebrális izmokban kifejezıdı mRNS-ek vizsgálata QRT-PCR-rel

A microarray vizsgálatok után az AIS-es betegek konvex és a konkáv oldali paravertebrális izmainak génexpressziós analízisét elvégeztük kvantitatív valós idejő polimeráz láncreakció (QRT-PCR) módszerrel is. Mivel minden egyes génhez külön-külön kell PCR reakciót végezni ez technika már nem alkalmas nagyszámú gén vizsgálatára, így az elızıekben ismertetett CHIP analízisekben a szignifikáns expresszióbeli különbséget mutató és az irodalmi adatok alapján kiválasztott gének közül 13-t analizáltam tovább. Ezek a gének a LMNA, VDR, COL15A1, JAK1, BMP4, IL4R, NTF3, LEP, CDK5, HOX7, NOS1, illetve a NOS2 és a NOS3. A QRT-PCR során a cDNS mintákat 4-6 személy RNS-ének elegyébıl állítottam elı. A QRT-PCR során lehetıség van az amplifikációval egy idıben a PCR kinetikai-görbéjének felvételére és a kiindulási mRNS mennyiségével arányos áttörési ciklusszám (threshold cycle, Ct) meghatározására (Higuchi et al., 1993). A vizsgálni kívánt target gének expressziós szintjét egy adott referencia gén, esetünkben az aktin, illetve a HPRT (hipoxantin foszforibozil-transferáz

1)

expressziós

szintjére

vonatkoztatjuk

azért,

hogy

összehasonlíthassuk a gerincoszlop két oldalán a target gén kifejezıdést. A komparatív ∆Ctmódszer alkalmazásával meghatároztuk azokat a géneket, ahol legalább kétszeres különbség van a két oldali izombiopszia közt a relatív mRNS szint tekintetében, vagyis a ∆Ctkonvex∆Ctkonkáv 1-nél nagyobb, vagy -1-nél kisebb. A 13 gén közül egyedül a leptin esetén tudtunk kimutatni eltérést, a konvex oldalon a leptin relatív mRNS mennyisége 2,5-szerese a konkávénak. A 11. ábrán pirossal jelölve láthatók a leptinnél kapott értékek.

53


A LMNA VDR COL15A1 AKT JAK1 HPRT BMP4 IL4R NTF3 HPRT LEP CDK5 HOX7 HPRT NOS1 NOS2 NOS3 HPRT

B

Ct átlag konvex 18.86 24.52 17.89 16.77 19.615 21.78 21.685 22.325 26.275 21.505 21.53 21.33 27.8 19.84 21.45 25.795 21.945 20.045

Ct átlag konkáv 19.3 24.37 17.99 16.59 19.49 21.895 22.56 22.9 26.035 21.74 20.16 21.55 28.33 19.79 21.37 26.25 22.345 20.4

1.5


∆∆Ct ∆ Ct konvexkonkáv konkáv 2.705 -0.61 7.775 -0.02 1.395 -0.275 0 0 -2.405 0.24 0 0 0.82 -0.64 1.16 -0.34 4.295 0.475 0 0 0.37 1.32 1.76 -0.27 8.54 -0.58 0 0 0.97 0.435 5.85 -0.1 1.945 -0.13 0 0

∆ Ct konvex 2.095 7.755 1.12 0 -2.165 0 0.18 0.82 4.77 0 1.69 1.49 7.96 0 1.405 5.75 1.9 0

LEP

∆ ∆ Ct konvex-konkáv

1 NTF3

0.5

NOS1

JAK1 0 VDR COL15A1

-0.5 LMNA

NOS2 NOS3 CDK5

IL4R

HOX7

BMP4

-1

11. ábra. Konvex és konkáv oldal közötti RNS expresszió különbség meghatározása a ∆Ct-módszer alkalmazásával 13 gén esetén. Az ábra A. részén két párhuzamos QRT-PCR-bıll származó kitörési ciklusszámok átlagát (Ct), a belılük belı számított, aktin, illetve HPRT referenciagénhez normált ciklusszámot (∆ Ct) és a konvex és konkáv oldal közötti ciklusszám ci különbséget (∆∆ Ct) adtam meg. meg Az ábra B. részén az A. rész utolsó oszlopában lévı értékeket ábrázoltam grafikusan, így szemléletesen látható, hogy csak a LEP gén esetén található több, mint egy ciklusszám különbség, amit konvencionálisan valós különbségnek lehet tekinteni a QRT-PCR QRT használatakor

54



Polimorfikus helyek vizsgálata Annak ellenére, hogy több tanulmány is megjelent a paravertebrális izmok vizsgálatáról, amelyekben a két oldal között eltérı strukturális, fehérjeszintbeli és génkifejezıdési mintázatot írtak le, a tudományos közvélemény inkább a kialakult gerincferdülés következményének, nem pedig az okának tartja a megfigyelt különbségeket. Amennyiben a megfigyelt eltérések genetikai okaira sikerül fényt deríteni, akkor jelenthetı ki, hogy a betegség kóroki tényezıi, nem pedig a gerincferdülés következtében kialakult eltérések a megfigyelt jelenségek. Több strukturális gén kódoló szekvenciájában lévı mutációt vizsgáltak eddig, de nem találtak eltérést az AIS-es betegekben. Egyre több humán betegség kapcsán derül ki, hogy a gének szabályozó régióiban lévı nukleotid eltéréseknek szerepe lehet az adott betegség kialakításában, így mindenképp indokoltnak láttuk, hogy a leptin gén esetén megvizsgáljuk annak az SNP-nek az elıfordulási gyakoriságát, amelynek szerepe lehet a leptin gén szabályozásában. Egy 2007-ben megjelent közleményben bemutatták, hogy az IL6 promóter régiójában - a transzkripció szabályozásban érintett - polimorfikus hely asszociációt mutat a gerincferdüléssel, amit mi is megpróbálunk igazolni (Aulisa et al., 2007). Mivel mindkét vizsgálni kívánt SNP olyan gének szabályozásában vehet részt, amelyek az AIS-sel kapcsoltba hozható, zsírszövetben termelıdı adipokint kódolnak, szükségesnek láttuk a két polimorfikus hely kombinatorikus analízisét is elvégezni.

Leptin promóter G-2548A polimorfizmusa Eset-kontroll asszociációs vizsgálatainkban 126 idiopathiás scoliosisos beteg és 197 egészséges, egymással nem rokon személy esetében határoztuk meg a leptin gén G-2548A (rs7799039) SNP genotípus eloszlását PCR-RFLP módszerrel. A genotípus eloszlás alapján mindkét vizsgált csoport Hardy-Weinberg egyensúlyban volt. A genotípus eloszlást a 6. táblázat A. része mutatja. Mivel a nagyfokú görbülettel rendelkezı AIS-es betegek nagyrésze lány volt - ami egyezik az irodalmi adatokkal – külön vizsgáltuk a genotípus és allél eloszlást ebben a csoportban is ( 6. táblázat B. része). A Hardy-Weinberg egyensúly továbbra is fennállt. Az A allél elıfordulási gyakoriságának értéke magasabb a beteg csoportban (0.48 vs. 0.42), de a statisztikai értékelés azt mutatta, hogy sem az allélgyakoriság, sem a genotípus gyakoriság szignifikánsan nem tér el a beteg és a kontroll csoport között (χ2=1.705, p=0.192). A relatív kockázatbecslést elvégezve azt kaptuk, hogy az A allél jelenléte hajlamosít a 55



gerincferdülésre, mert az A allélt homozigóta vagy heterozigóta állapotban hordozó személyekben megnıtt a scoliosis kialakulásának esélye a kontroll populációhoz képest (AA vs. GG: OR=1.49 (CI:0.769-2.921); AG vs. GG: OR=1.513 (CI:0.894-2.562)). Amennyiben külön vizsgáljuk a lányokat, azt találtuk, hogy az A allél még magasabb arányban fordul elı az IS-es betegek közt, mint a teljes populáció esetén (0.52 vs. 0.48), de szignifikáns különbséget itt sem találtunk a sem a genotípus eloszlásban (χ2=2.63 p=0.269) sem az alléloszlásban (χ2=2.053, p=0.168). Az A allélt homozigóta formában hordozó nık esetén a relatív esélyhányados értéke megnıtt (AA vs. GG: OR=2.02 (CI:0.824-4.961)) és az A allélt heterozigóta formában hordozó nıkben pedig a gerincferdülés kockázata nem tér el a GG homozigótáéktól (AG vs. GG: OR=1.118 (CI:0.583-2.422)), ami azt mutatja, hogy a nıkben a leptin gén promóterében lévı, funkcionális polimorfizmus hajlamosító faktor lehet a gerincferdülés kialakulásában.

A.

AIS

Kontroll

összes

GG

GA

AA

G

A

126

31

70

25

132

120

1

0.24

0.56

0.2

0.52

0.48

196

65

96

35

226

166

1

0.33

0.48

0.18

0.58

0.42

összes

GG

GA

AA

G

A

96

21

51

24

93

99

1

0.22

0.53

0.25

0.48

0.52

83

23

47

13

93

73

1

0.28

0.56

0.16

0.56

0.44

B.

AIS

Kontroll

6. táblázat. Leptin gén genotípus és allél gyakoriság eloszlás idiopathiás scoliosis-os és egészséges populációba: A. teljes vizsgált csoportban, B. nıkben.

56



IL6 promóter C-174G polimorfizmusa Szintén PCR-RFLP módszerrel határoztuk meg az IL6 promóter régiójában lévı, funkcionális SNP allélgyakoriságát is. A genotípusok eloszlása szerint fennállt a HardyWeinberg egyensúly. Sem az allél, sem a genotípus eloszlásban nem találtunk szignifikáns eltérést a gerincferdüléssel élık és az egészséges kontroll személyek között (χ2=0.779, p=0.378) (7. táblázat). A relatív kockázatbecsléseket elvégezve a különbözı genotípusok vonatkozásában az esélyhányados 1 körüli értékeket mutatott, az 1-tıl történı legnagyobb eltérés a homozigóta párok összehasonlításakor mutatkozott GG vs. CC: OR=0.765 (CI: 0.396-1.468), ami alapján a GG genotípus protektívnek mondható. Külön értékelve a lányok szubpopulációját

nem

kaptunk

eltérést

a

teljes

populációhoz

képest,

sem

az

allélgyakoriságban, sem a relatív esélyhányados mértékében (GG vs. CC: OR=0.594 (CI: 0.242-1.457)). A.

AIS

Kontroll

összes

CC

GC

GG

C

G

126

25

67

34

117

135

1

0.2

0.53

0.27

0.46

0.54

197

36

97

64

169

225

1

0.18

0.49

0.33

0.43

0.57

összes

CC

GC

GG

C

G

96

21

48

27

90

102

1

0.22

0.5

0.28

0.47

0.53

83

12

46

25

70

96

1

0.15

0.55

0.3

0.42

0.58

B.

AIS

Kontroll

7. táblázat. IL6 gén genotípus és allél gyakoriság eloszlása idiopathiás scoliosis-os és egészséges populációban: A. teljes vizsgált csoportban, B. nıkben. 57



A két polimorfizmus IS kialakulására hajlamosító együttes hatásának vizsgálata Multifaktoriális öröklıdéső betegségek esetén több gén eltérı hozzájárulással a környezettel kölcsönhatásban vesz részt a legtöbbször heterogén fenotípus kialakításában, így 2-3 gén egy adott allélkombinációja, legalábbis az esetek egy részében, hozzájárulhat a betegség etiológiájához. A gén-gén kölcsönhatás feltárásához két eljárást is használtunk, az elsı az MDR analízis, amely kisszámú mintaelem esetén is kimutatja az episztázist és a módszer kidolgozói rámutattak, hogy akkor is alkalmas a gének közötti szinergizmus kimutatására, ha az allél eloszlásban nem mutatkozik eltérés a beteg-kontroll vizsgálat során (Hahn et al., 2003a). A génkombinációk hatásának maximum likelihood becslését alkalmazza a másik statisztikai módszer és megadja,

hogy

egy

adott

génkombináció milyen mértékben emeli meg a betegség kialakulásának esélyét

egy

másik

génkombinációhoz viszonyítva. Az MDR analízis a LEP promóter SNP és az IL6 promóter SNP között szinergiát jelzett. A 12. ábrán a kereszttáblán genotípus

összerendezett

kombinációk

láthatók,

minden egyes négyzetben bal oldali oszlop a scoliosisos jobb oldali pedig a

kontroll

mutatja.

személyek Az

eloszlását

MDR

analízis

12. ábra. Az MDR analízis az összes genotípus

végeredményként minden genotípus

kombinációt besorolja a betegség kialakulása

kombinációt besorol vagy alacsony,

szempontjából alacsony (világosszürke hátterő)

vagy

vagy magas (sötétszürke hátterő) kockázatot jelentı kategóriába. Minden egyes négyzetben a bal oldali oszlop a scoliosisos a jobb oldali pedig a kontroll

magas

csoportba.

A

kockázatot grafikus

jelentı ábrázolás

szerint világosszürke kitöltéssel az alacsony, míg sötétszürke háttérrel a

személyek eloszlását mutatja.

magas rizikójúakat jelölve. 58



Mivel az MDR analízis arra alkalmas, hogy felfedje az episztázist és megadja azokat a genotípus kombinációkat, amelyek hordozása kockázatot jelent az adott betegség kialakulására, további vizsgálatot végeztünk annak a megállapítására, hogy milyen mértékő kockázatot jelentenek az egyes genotípus kombinációk a gerincferdülés esetén. Ehhez a LEP G-2548A és az IL6 C-174G polimorfizmus genotípusait páronként összerendeztük és relatív kockázat közelítı becslését végeztük el a legkevésbé hajlamosító genotípus kombinációhoz képest adva meg az esélyhányadosokat. Az elızı fejezetekben leírtak alapján a LEP gén esetében az A allél hordozása jelentett magasabb kockázatot, ezért a GG homozigóta lehet a legkevésbé hajlamosító genotípus, míg az IL6 esetén a GG genotípus protektívnek bizonyult. Így a LEP GG-IL6 GG genotípus kombináció lehet a legkevésbé hajlamosító, amit alátámaszt az MDR analízis is, mivel alacsony kockázattal bírónak jelölte ezt a genotípus kombinációt. A relatív esélyhányadosok kiszámolásánál ez volt a referencia, amit 1.00-es szám jelöl a 8. táblázatban. A LEP GG-IL6 GG genotípus kombinációhoz viszonyítva a leginkább hajlamosító kombináció az IL6 CC-LEP AA, ami azt jelenti, hogy a hajlamosító genotípust hordozó egyénnél szignifikánsan (χ2=5.511, p=0.019), közel ötször nagyobb (OR=4.667 (CI:1.237-17.6)) az esélye a gerincferdülés kialakulásának, mint a referenciának tekintett genotípussal bíró személyé. Az MDR analízis és a ML becslésen alapuló kombinációs hatás vizsgálat eredményei jól összeegyeztethetık, mivel azokat a genotípus kombinációkat jelölte magas rizikót jelentınek az elsı vizsgálat, amelyekben a relatív OR értéke magasabb volt 1.5-nél.

IL6 C-174G

LEP G-2548A GG

GA

CC

0.848 (0.212-3.391)

1.283 (0.439-3.752)

4.667 (1.237-17.600)

GC

1.273 (0.483-3.355)

1.887 (0.775-4.595)

1.51 (0.508-4.484)

GG

1.00

1.633 (0.626-4.264)

0.787 (0.183-2.814)

allélkombinációk

kombinatorikus

8. táblázat

Az

esélyhányadosok megadásával

59

AA

hatásának

kimutatása

a

relatív



Amennyiben a relatív esélyhányadost meghatározzuk csak a lányok esetén, akkor azt kapjuk, hogy a leginkább hajlamosító allélkombináció (IL6 CC-LEP AA) hordozása még nagyobb kockázatot jelent a gerincferdülés kialakulásában (OR= 6.667 (CI:0.597-74.506). A relatív esélyhányadoshoz tartozó konfidencia intervallum elég széles, ami az esélyhányados értékének megbízhatóságát rontja és ez egyértelmően az alacsony mintaszámnak tudható be.

A polimorfizmusok hatása az IS súlyosbodására További statisztikai elemzéseket végeztünk annak felderítésére, hogy a LEP promóter G2548A polimorfizmusa, illetve az IL6 promóter C-174T polimorfizmusa szerepet játszik-e a gerincferdülés progressziójában. Nem találtunk szignifikáns összefüggést sem a LEP p=0.712 (ANOVA) -, sem az IL6 - p=0.586 (ANOVA) – polimorfizmusa és a Cobb˚ között. Meghatároztuk minden egyes genotípus kombinációhoz tartozó átlagos Cobb˚-ot és nem találtunk olyan genotípus kombinációt, amelyhez az összes adatból számolt átlagtól szignifikánsan eltérı Cobb˚ társult volna. A fentiek alapján úgy gondoljuk, hogy a LEP AAIL6 CC genotípus kombináció a betegség kialakításában inkább hajlamosító, nem az AIS súlyosbodásában vehet részt.

60



EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA A komplex betegségek etiológiájának feltárása a XXI. század kutatóinak egyik legnagyobb kihívása. A mendeli öröklıdésmenetet követı monogénes betegségek genetikai hátterét a rendelkezésre álló módszerekkel jórészt feltárták, vagy nagy lépésekkel haladnak e cél elérése felé. Ezzel ellentétben az emberek többségét érintı multifaktoriális, poligénes betegségek genetikai elemeinek azonosítása eddig nem hozott áttörı eredményt. Természetesen tudtak azonosítani hajlamosító allélokat különbözı betegségekben, de csak azoknál, ahol az adott allél jelenléte nagymértékben hozzájárult a betegség kialakulásához. Jelen dolgozatban a serdülıkori populáció 10%-át érintı, ismert ok nélkül kialakuló gerincferdülés genetikai hátterében álló elemek felkutatására vonatkozó vizsgálataimat írtam le. Két megközelítést használtunk a munkánk során. Az elsı megközelítésünk szerint az AIS etiológiájában szerepet játszó gének (kandidáns gén) kiválasztása a transzkriptoma szintjén jelenlévı eltéréseken alapult. Vizsgálatainkra a gerincoszlop két oldalán elhelyezkedı izmok RNS mintáit választottuk, amit a korrekciós mőtét során kivett izombiopsziákból nyertünk. A paravertebrális izmok génexpressziós változásait vizsgáltuk microarray analízissel két különbözı összehasonlítással. Az elsı CHIP kísérletben egészséges és AIS-es betegek különkülön „pool”-ozott mintáit vetettük össze és 187 génben tudtunk génexpresszióbeli eltérést detektálni. A másodikban a kontroll minták kihagyásával csak az AIS-es betegek konvex és konkáv oldali izmainak expressziós szintő összehasonlítását végeztük el és 63 génben tudtunk különbséget kimutatni. A microarray kísérletek az elsı szőrıt jelentették a jelölt gén kiválasztásában, a másodikat bioinformatikai adatelemzéssel végeztük el. Meghatároztuk a génlistáinkon lévı gének kromoszóma lokalizációját és két szempont szerint is átnéztük a gének elhelyezkedését. Egyrészrıl kerestünk olyan kromoszóma szakaszokat, ahová több gén is térképezıdik közel egymáshoz, mert egy helyen lévı és egyforma expressziós eltérést mutató gének esetén gondolhatunk valamiféle genomszintő átrendezıdésre az adott régióban (delécióra vagy inszercióra). Ilyet nem tudtunk kimutatni. Másrészrıl, azokat a géneket a késıbbiekben mindenféleképpen érdemes tovább vizsgálni, amelyek olyan kromoszóma szakaszra esnek, amit családokon kapcsoltsági analízissel az AIS-hez kötöttek (1. táblázat). Nyolc ilyen gént találtunk, amelyek közül kettınek (NTF3 és CDK5) meghatároztuk a relatív mRNS mennyiségét az AIS-es betegek gerincoszlopának konvex és konkáv oldalán QRT-PCR-rel és nem tudtunk különbséget kimutatni a két oldal

61



között. A többi 6 gén további vizsgálata még az elkövetkezendı idıszak hátralévı feladatai közé tartozik. A két elvégzett microarray egy 187, illetve egy 63 tagból álló génlistát eredményezett, melyek tagjait a génontológiai kategóriákhoz rendeltük, olyan GO kategóriákat keresve, amelyekben a génjeink a humán genom átlagos GO eloszlásához képest magasabb arányban reprezentáltak és szerepük lehet az AIS kialakításában. Az elsı CHIP kísérletbıl nem tudtunk ilyen kategóriát kiemelni, de a másodikból a lipid anyagcsere (GO:0006629) és a morfogenezis (GO:0007275) is felvetıdött; ebbe a két katagóriába a 63 génbıl összesen 18-at tudtunk besorolni. A lipid anyagcsere érintettségét az AIS-ben alátámaszthatja az a tény is, hogy az adipociták szignálútjának (KEGG_Pathway: hsa04920) több elemében is (LEP, PRKAG2, SLC2A1) ki tudtuk mutatni a génexpressziós különbséget a második microarray analízisben, amikor a konvex és konkáv oldali paraspinális izmok transzkriptomáit hasonlítottuk össze. A leptin szerepének további vizsgálatához elıször egy független módszerrel, a QRT-PCR-rel meghatároztuk az AIS betegekre jellemzı génexpressziós szintet. Az így kapott eredmény megerısítette a microarray analízisben megfigyelt értéket, vagyis a LEP génrıl az izmokban termelıdı mRNS mennyisége a konvex oldalon 2.5szerese a konkávénak. Ahhoz, hogy minél kevesebb információt veszítsünk el a microarray adatokból egy a tudományos szakirodalmi adatokon alapuló szőrıt is beépítettünk vizsgálatainkba, azaz a listán szereplı gének közül az adatbázisokban és a rendelkezésre álló publikációs forrásokban fellelhetı adatok tanulmányozása után kiemeltük azokat, amelyeknek szerepük lehet az AIS etiológiájában. Egy részüket ezidáig már sikerült tovább célzott vizsgáltnak alávetni arra vonatkozóan, hogy megerısíthetıek-e a microarray analízisben kapott eredmények. A génlistánk másik részének esetében azonban ezek a vizsgálatok még elıttünk állnak. QRT-PCR-módszert használtuk, annak a kimutatására, hogy az AIS-es betegek paravertebrális izmaiban tapasztalható-e különbség az adott gének expressziójában attól függıen, hogy a konvex vagy a konkáv oldalról származtak-e. A már az elızıekben említett leptin kivitelével nem találtunk több gént, ahol szignifikáns expressziós különbség állt volna fenn. Az irodalomban eddig egy közlemény jelent meg a paravertebrális izmok molekuláris biológiai vizsgálatáról, ahol Western-blottinggal a kalmodulin és a NOS1 fehérje mennyiségét vizsgálták a görbült gerincoszlop két oldaláról származó sejtlizátumban. Mind az egészséges kontrollhoz, mind pedig a konkáv oldalhoz képest csökkent fehérje mennyiségeket találtak a konvex oldalon (Zhao and Qiu, 2004). Ennek az eredménynek a kapcsán vizsgáltuk meg mindhárom nitrogénmonoxid szintetáz mRNS mennyiségét, mivel az elsı microarray analíziskor mi is azt tapasztaltuk, hogy a kontrollhoz képest csökkent a 62



NOS1mRNS mennyisége az AIS-es betegben. Ezt az eltérést azonban nem tudtuk kimutatni az AIS-es betegekben a konvex és konkáv oldali génexpresszió vonatkozásában. A microarray analízisben kapott és az AIS kialakulásának lehetséges okai közé beilleszthetı gének közül további vizsgálatra érdemesek azok a gének, amelyek a kapcsoltsági vizsgálatok által jelölt kromoszóma szakaszra esnek. Mivel a paraspinális izmok megfelelı izomereje nagyon fontos a gerincoszlop támasztásában és az AIS-es betegekben valóban kimutattak eltéréseket a konvex és a konkáv oldali izomaktivitásban, azok a gének, amelyek az izmok izomerejének kialakításában vesznek részt jelöltek lehetnek a betegség súlyosbodásáért felelıs progressziós génként az AIS etiológiájában (Cheung et al., 2005a). Az irodalmi adatok alapján a disztonin kandidáns lehet az AIS progressziós génjeként, mivel a desmin és az aktin szálak keresztkötésével az izomsejtek struktúrájának stabilizálásában van fontos szerepe. A disztonin hiányos egerek izomgyengeséget mutatnak (Dalpe et al., 1999b). Az AIS-es betegek paravertebrális konvex és konkáv oldali izmainak expresszióját összehasonlítva a disztonin gén mRNS mennyisége kétszer magasabb a konvex oldalon, mint a konkávon a CHIP hibridizálás eredménye szerint, viszont ezt az eredményt független módszerrel a késıbbiekben igazolni kell. A génkifejezıdés szabályozása az egyik nagyon sokat tanulmányozott területe a molekuláris biológiának. A transzkripciós faktorok, a cisz regulációs elemek és a kromatin átszervezıdés génszabályozásban betöltött szerepe régóta a sejt és molekuláris biológia egyik legintenzívebben kutatott területe. A komplex betegségek vonatkozásában az elmúlt idıszakban egyre nagyobb figyelem fordul a génkifejezıdés módosulatai mögött álló allélspecifikus transzkripció felé. Többen is kimutatták, hogy a humán gének 20 %-ában a gén két alléljáról nem egyforma mértékben fejezıdnek ki a géntermékek, aminek az egyik oka a gének promóter régiójában található, funkcionális polimorfizmus lehet (Lo et al., 2003). A leptin gén promóter régiójában is található olyan SNP, aminek hatása lehet a génkifejezıdésre, amint részletesen kifejtve a dolgozat bevezetıjében leírtam. A dolgozatban bemutatott munka során megvizsgáltuk, hogy az általunk detektált génexpressziós különbségben szerepet játszik-e a LEP G-2548A polimorfizmus. Az irodalmi adatok alapján az összefüggés a LEP gén alléljei és a vérszérumban mért leptin szint között ellentmondó, valószínőleg a köztük lévı kapcsolatot más tényezık is befolyásolják (Yiannakouris et al., 2003). Egy eset-kontroll tanulmány során meghatároztuk a LEP genotípusok elıfordulási gyakoriságát

mindkét

populációban

és

kiszámoltuk

a

különbözı

genotípusok

esélyhányadosait. Nem kaptunk szignifikáns eltérést a két populáció között a genotípus gyakoriságok tekintetében, de az esélyhányadosok meghatározása után úgy tőnik, hogy az A 63



allél jelenléte lehet hajlamosító faktor az AIS-ben. Vizsgálatainkban az AA vs. GG: OR=1.513(CI:0.894-2.562), ami komplex betegségek esetén a hajlamosító allélokra jellemzı értéknek tekinthetı (Baron, 2001). Kíváncsiak voltunk arra, milyen más tényezı befolyásolja a LEP -2548A allél hatását. Elıször a szérum leptinszint nemek közti különbségébıl kiindulva megvizsgáltuk a csak külön a lányokat tartalmazó vizsgálati csoport esetében a LEP genotípus gyakoriságát, de ebben a szubpopulációban sem kaptunk szignifikáns eltérést. Az esélyhányados értéke megnıtt (AA vs. GG: OR=2.02(CI:0.824-4.961)), ami azt jelzi, hogy a leptinnek a lányokban nagyobb szerepe lehet az AIS kialakításában. A komplex betegségekben a gének egymással bonyolult kölcsönhatásban alakítják ki a fenotípust, ezért a leptinnel funkcionális kölcsönhatásban lévı gének vizsgálatával is értékes információhoz juthatunk az AIS etiológiáját

illetıen.

Bioinformatikai

eszközök

használatával

jelenítettük

meg

az

interakciókat. Ehhez a STRING 8.2 adatbázist használtuk, ami az ismert és prediktált, fizikai és funkcionális fehérje kölcsönhatásokat több forrásból összegyőjtve tartalmazza (Jensen et al., 2009). Ez az adatbázis jelenleg 630 élılény 2,590,259 fehérjéjét tartalmazza. A 13. ábrán látható a leptinre jellemzı hálózat ábrázolása. A leptin és a leptin receptora körül két csoport rajzolódik ki, melyek több különbözı szempont alapján összegyőjtött kölcsönható fehérjéket tartalmaznak. A 13. ábrán látható táblázatból további elemzésre az IL6-ot választottuk ki, mert egy nemrég megjelent közleményben már vizsgálták az AIS-sel összefüggésben (Aulisa et al., 2007).

13. ábra. A STRING programcsomag által készített hálózat, amely a leptin interakciós partnereit jeleníti meg.

64



Az IL6 G-174C SNP GG genotípusát szignifikánsan magasabb elıfordulási gyakorisággal találták meg egy olasz eset-kontroll tanulmányban, ahol Aulisa és mtsai 53 AIS-es beteg és 206 egészséges kontroll egyed genotípusát határozták meg. A GG genotípus kétszer olyan gyakran fordult elı az AIS-esek között, mint a kontroll populációban (0.52 vs. 0.26) és az esélyhányados OR= 10.54-nak adódott, ami szokatlanul magas egy multifaktoriális betegség esetén (Aulisa et al., 2007). Elvégezve a genotipizálást nem tudtunk kimutatni semmilyen eltérést a genotípus eloszlásban, az OR értékének egytıl való legnagyobb eltérése a két homozigóta pár összehasonlításánál adódott GG vs. CC: OR=0.765 (CI: 0.396-1.478), ami a G allél protektív tulajdonságát jelzi, és ellentmond az olasz kutatócsoport által tett megfigyelésnek. A komplex betegségek asszociációs vizsgálatánál a reprodukálhatóság kicsi, aminek okát több összefoglaló cikk is taglalja (Hirschhorn et al., 2002; Newton-Cheh and Hirschhorn, 2005). A megismételhetıség hiányának fıbb okait a nem megfelelı kísérleti elrendezésben, a kicsi statisztikai erıben vagy a populáció rétegzıdésében jelölik meg. Kiemelik, hogy a multifaktoriális betegségek esetén a gének és a környezeti tényezık közötti komplex kölcsönhatás figyelembe vétele is fontos lehet. Még több, megfelelı statisztikai erıvel rendelkezı, független populáción elvégzett eset-kontroll tanulmány elvégzése szükséges ahhoz, hogy eldönthetı legyen az IL6 promóter polimorfizmusának asszociációja a gerincferdüléshez. A LEP és az IL6 gének közötti episztázis analízist két független statisztikai módszerrel is elvégeztük, mindkettı szerint létezik az alléljeik között kölcsönhatás és a LEP AA-IL6 CC genotípus kombináció hordozása szignifikánsan magasabb kockázatot jelent az AIS kialakulásában (OR=4.667 (CI:1.237-17.6). Mivel a Cobb˚ és a genotípusok között nem találtunk összefüggést úgy gondoljuk, hogy a LEP AA-IL6 CC genotípus kombináció az AIS kialakulására hajlamosít, nem pedig a progressziójában játszhat szerepet. Az AIS etiológiájában fontos szerepe van az örökletes tényezıknek, de a kiterjedt kutatások ellenére a mai napig nem sikerült olyan gént/géneket találni, melyek hibái az AIS kialakulásáért lennének felelısek. A sikertelenségnek több oka is lehet, és ezek a komplex betegségekre általánosan jellemzı tulajdonságokból erednek. Egyrészrıl a komplex betegségek multigénes öröklıdésőek, ahol egy-egy génhiba hozzájárulása a fenotípus kialakulásához nem minden esetben egyforma, sıt még a környezeti tényezık is befolyásolhatják azt. Másrészrıl egy adott betegség megjelenési formája mögött teljesen más pathomechanizmus is állhat, mivel a komplex betegségek gyakran genetikailag heterogének. Az AIS genetikai modellje szerint a betegség kialakulása két szakaszra osztható, egy iniciációs és egy progressziós fázisra (14. ábra). Feltételezések szerint más-más gének hibái 65



felelısek a hajlamosításra és a súlyosbodásra. Ezért nem csak a prediszponáló, hanem a progressziós gének azonosítása is fontos. Amennyiben bizonyos génhibák, vagy polimorfizmusok ismeretében megjósolható a súlyosbodás mértéke, akkor a megfelelı terápiás kezelések kerülhetnek alkalmazásra. A legújabb kutatási eredmények szerint kifejlesztettek olyan genetikai tesztet, amely alkalmas annak az eldöntésére, hogy mennyi a kockázata a görbület további súlyosbodásának (Ogilvie, 2009).

Normál pubertás Iniciációs gének Környezeti faktorok

Az AIS kezdete Progressziós gének

A görbület progressziója a csontosodás befejezıdéséig 14.ábra A jelenleg elfogadott genetikai modell az AIS kialakulására

66



IRODALOMJEGYZÉK

Acaroglu,E., I.Akel, A.Alanay, M.Yazici and R.Marcucio: Comparison of the melatonin and calmodulin in paravertebral muscle and platelets of patients with or without adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 34, E659-E663(2009). Aksenovich,T.I., I.R.Semenov, E.K.Ginzburg and A.M.Zaidman: [Preliminary analysis of inheritance of scoliosis]. Genetika Dev. 24, 2056-2063 (1988). Alden,K.J., B.Marosy, N.Nzegwu, C.M.Justice, A.F.Wilson and N.H.Miller: Idiopathic scoliosis: identification of candidate regions on chromosome 19p13. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 31, 1815-1819 (2006). Ambrosini,G., A.K.Nath, M.R.Sierra-Honigmann and J.Flores-Riveros: Transcriptional activation of the human leptin gene in response to hypoxia. Involvement of hypoxia-inducible factor 1. J.Biol.Chem. Dev. 277, 34601-34609 (2002). Aulisa,L., P.Papaleo, E.Pola, F.Angelini, A.G.Aulisa, F.C.Tamburrelli, P.Pola and C.A.Logroscino: Association between IL-6 and MMP-3 gene polymorphisms and adolescent idiopathic scoliosis: a case-control study. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 32, 2700-2702 (2007). Bagnall,K.M., V.J.Raso, D.L.Hill, M.Moreau, J.K.Mahood, H.Jiang, G.Russell, M.Bering and G.R.Buzzell: Melatonin levels in idiopathic scoliosis. Diurnal and nocturnal serum melatonin levels in girls with adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 21, 19741978 (1996). Baron,M.: The search for complex disease genes: fault by linkage or fault by association? Mol.Psychiatry Dev. 6, 143-149 (2001). Bashiardes,S., R.Veile, M.Allen, C.A.Wise, M.Dobbs, J.A.Morcuende, L.Szappanos, J.A.Herring, A.M.Bowcock and M.Lovett: SNTG1, the gene encoding gamma1-syntrophin: a candidate gene for idiopathic scoliosis. Hum.Genet. Dev. 115, 81-89 (2004). Bellyei,A., A.Czeizel, O.Barta, T.Magda and L.Molnar: Prevalence of adolescent idiopathic scoliosis in Hungary. Acta Orthop.Scand. Dev. 48, 177-180 (1977). Bienertova-Vasku,J., P.Bienert, J.Tomandl, M.Forejt, M.Vavrina, J.Kudelkova and A.Vasku: No association of defined variability in leptin, leptin receptor, adiponectin, proopiomelanocortin and ghrelin gene with food preferences in the Czech population. Nutr.Neurosci. Dev. 11, 2-8 (2008). Blanchard,F., L.Duplomb, M.Baud'huin and B.Brounais: The dual role of IL-6-type cytokines on bone remodeling and bone tumors. Cytokine Growth Factor Rev. Dev. 20, 19-28 (2009). Blum,W.F., P.Englaro, S.Hanitsch, A.Juul, N.T.Hertel, J.Muller, N.E.Skakkebaek, M.L.Heiman, M.Birkett, A.M.Attanasio, W.Kiess and W.Rascher: Plasma leptin levels in healthy children and adolescents: dependence on body mass index, body fat mass, gender, pubertal stage, and testosterone. J.Clin.Endocrinol.Metab Dev. 82, 2904-2910 (1997). Boiardi,L., B.Casali, E.Farnetti, N.Pipitone, D.Nicoli, F.Cantini, P.Macchioni, G.Bajocchi, M.G.Catanoso, L.Pulsatelli, D.Consonni and C.Salvarani: Relationship between interleukin 6

67



promoter polymorphism at position -174, IL-6 serum levels, and the risk of relapse/recurrence in polymyalgia rheumatica. J.Rheumatol. Dev. 33, 703-708 (2006). Burke,J.G., G.W.RW, D.Conhyea, D.McCormack, F.E.Dowling, M.G.Walsh and J.M.Fitzpatrick: Human nucleus pulposis can respond to a pro-inflammatory stimulus. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 28, 2685-2693 (2003). Burner,W.L., III, V.M.Badger and F.C.Sherman: Osteoporosis and acquired back deformities. J.Pediatr.Orthop. Dev. 2, 383-385 (1982). Burwell,R.G., R.K.Aujla, M.P.Grevitt, P.H.Dangerfield, A.Moulton, T.L.Randell and S.I.Anderson: Pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis in girls - a double neuro-osseous theory involving disharmony between two nervous systems, somatic and autonomic expressed in the spine and trunk: possible dependency on sympathetic nervous system and hormones with implications for medical therapy. Scoliosis. Dev. 4, 24(2009). Burwell,R.G., P.H.Dangerfield and B.J.Freeman: Concepts on the pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis. Bone growth and mass, vertebral column, spinal cord, brain, skull, extraspinal left-right skeletal length asymmetries, disproportions and molecular pathogenesis. Stud.Health Technol.Inform. Dev. 135, 3-52 (2008a). Burwell,R.G., P.H.Dangerfield and B.J.Freeman: Etiologic theories of idiopathic scoliosis. Somatic nervous system and the NOTOM escalator concept as one component in the pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis. Stud.Health Technol.Inform. Dev. 140, 208-217 (2008b). Carlsson,B., K.Lindell, B.Gabrielsson, C.Karlsson, R.Bjarnason, O.Westphal, U.Karlsson, L.Sjostrom and L.M.Carlsson: Obese (ob) gene defects are rare in human obesity. Obes.Res. Dev. 5, 3035 (1997). Carr,A.J., D.J.Ogilvie, B.P.Wordsworth, L.M.Priestly, R.Smith and B.Sykes: Segregation of structural collagen genes in adolescent idiopathic scoliosis. Clin.Orthop.Relat Res. Dev. 305-310 (1992). Chan,V., G.C.Fong, K.D.Luk, B.Yip, M.K.Lee, M.S.Wong, D.D.Lu and T.K.Chan: A genetic locus for adolescent idiopathic scoliosis linked to chromosome 19p13.3. Am.J.Hum.Genet. Dev. 71, 401-406 (2002). Cheng,J.C., X.Guo and A.H.Sher: Persistent osteopenia in adolescent idiopathic scoliosis. A longitudinal follow up study. Spine Dev. 24, 1218-1222 (1999). Cheng,J.C., L.Qin, C.S.Cheung, A.H.Sher, K.M.Lee, S.W.Ng and X.Guo: Generalized low areal and volumetric bone mineral density in adolescent idiopathic scoliosis. J.Bone Miner.Res. Dev. 15, 1587-1595 (2000). Cheng,J.C., S.P.Tang, X.Guo, C.W.Chan and L.Qin: Osteopenia in adolescent idiopathic scoliosis: a histomorphometric study. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 26, E19-E23(2001). Cheung,J., J.P.Halbertsma, A.G.Veldhuizen, W.J.Sluiter, N.M.Maurits, J.C.Cool and J.R.van Horn: A preliminary study on electromyographic analysis of the paraspinal musculature in idiopathic scoliosis. Eur.Spine J. Dev. 14, 130-137 (2005a). Cheung,K.M., T.Wang, A.M.Poon, A.Carl, B.Tranmer, Y.Hu, K.D.Luk and J.C.Leong: The effect of pinealectomy on scoliosis development in young nonhuman primates. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 30, 2009-2013 (2005b).

68



Cheung,K.M., T.Wang, G.X.Qiu and K.D.Luk: Recent advances in the aetiology of adolescent idiopathic scoliosis. Int.Orthop. Dev. 32, 729-734 (2008). Cowell,H.R., J.N.Hall and G.D.MacEwen: Genetic aspects of idiopathic scoliosis. A Nicholas Andry Award essay, 1970. Clin.Orthop.Relat Res. Dev. 86, 121-131 (1972). Czeizel,A., A.Bellyei, O.Barta, T.Magda and L.Molnar: Genetics of adolescent idiopathic scoliosis. J.Med.Genet. Dev. 15, 424-427 (1978). Dalpe,G., M.Mathieu, A.Comtois, E.Zhu, S.Wasiak, Y.De Repentigny, N.Leclerc and R.Kothary: Dystonin-deficient mice exhibit an intrinsic muscle weakness and an instability of skeletal muscle cytoarchitecture. Dev.Biol. Dev. 210, 367-380 (1999a). Dalpe,G., M.Mathieu, A.Comtois, E.Zhu, S.Wasiak, Y.De Repentigny, N.Leclerc and R.Kothary: Dystonin-deficient mice exhibit an intrinsic muscle weakness and an instability of skeletal muscle cytoarchitecture. Dev.Biol. Dev. 210, 367-380 (1999b). De Laet,C., J.A.Kanis, A.Oden, H.Johanson, O.Johnell, P.Delmas, J.A.Eisman, H.Kroger, S.Fujiwara, P.Garnero, E.V.McCloskey, D.Mellstrom, L.J.Melton, III, P.J.Meunier, H.A.Pols, J.Reeve, A.Silman and A.Tenenhouse: Body mass index as a predictor of fracture risk: a metaanalysis. Osteoporos.Int. Dev. 16, 1330-1338 (2005). DeRisi,J., L.Penland, P.O.Brown, M.L.Bittner, P.S.Meltzer, M.Ray, Y.Chen, Y.A.Su and J.M.Trent: Use of a cDNA microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat.Genet. Dev. 14, 457-460 (1996). Dieudonne,M.N., F.Machinal-Quelin, V.Serazin-Leroy, M.C.Leneveu, R.Pecquery and Y.Giudicelli: Leptin mediates a proliferative response in human MCF7 breast cancer cells. Biochem.Biophys.Res.Commun. Dev. 293, 622-628 (2002). Ducy,P., M.Amling, S.Takeda, M.Priemel, A.F.Schilling, F.T.Beil, J.Shen, C.Vinson, J.M.Rueger and G.Karsenty: Leptin inhibits bone formation through a hypothalamic relay: a central control of bone mass. Cell Dev. 100, 197-207 (2000). Elefteriou,F., J.D.Ahn, S.Takeda, M.Starbuck, X.Yang, X.Liu, H.Kondo, W.G.Richards, T.W.Bannon, M.Noda, K.Clement, C.Vaisse and G.Karsenty: Leptin regulation of bone resorption by the sympathetic nervous system and CART. Nature Dev. 434, 514-520 (2005). Fagan,A.B., D.J.Kennaway and A.D.Sutherland: Total 24-hour melatonin secretion in adolescent idiopathic scoliosis. A case-control study. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 23, 41-46 (1998). Fishman,D., G.Faulds, R.Jeffery, V.Mohamed-Ali, J.S.Yudkin, S.Humphries and P.Woo: The effect of novel polymorphisms in the interleukin-6 (IL-6) gene on IL-6 transcription and plasma IL6 levels, and an association with systemic-onset juvenile chronic arthritis. J.Clin.Invest Dev. 102, 1369-1376 (1998). Gangwar,R., B.Mittal and R.D.Mittal: Association of interleukin-6 -174G>C promoter polymorphism with risk of cervical cancer. Int.J.Biol.Markers Dev. 24, 11-16 (2009). Gao,X., D.Gordon, D.Zhang, R.Browne, C.Helms, J.Gillum, S.Weber, S.Devroy, S.Swaney, M.Dobbs, J.Morcuende, V.Sheffield, M.Lovett, A.Bowcock, J.Herring and C.Wise: CHD7 gene polymorphisms are associated with susceptibility to idiopathic scoliosis. Am.J.Hum.Genet. Dev. 80, 957-965 (2007).

69



Gong,D.W., S.Bi, R.E.Pratley and B.D.Weintraub: Genomic structure and promoter analysis of the human obese gene. J.Biol.Chem. Dev. 271, 3971-3974 (1996). Guo,X., W.W.Chau, Y.L.Chan and J.C.Cheng: Relative anterior spinal overgrowth in adolescent idiopathic scoliosis. Results of disproportionate endochondral-membranous bone growth. J.Bone Joint Surg.Br. Dev. 85, 1026-1031 (2003). Hahn,L.W., M.D.Ritchie and J.H.Moore: Multifactor dimensionality reduction software for detecting gene-gene and gene-environment interactions. Bioinformatics. Dev. 19, 376-382 (2003b). Hahn,L.W., M.D.Ritchie and J.H.Moore: Multifactor dimensionality reduction software for detecting gene-gene and gene-environment interactions. Bioinformatics. Dev. 19, 376-382 (2003a). Higuchi,R., C.Fockler, G.Dollinger and R.Watson: Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N.Y) Dev. 11, 1026-1030 (1993). Hinuy,H.M., M.H.Hirata, N.Forti, J.Diament, M.F.Sampaio, D.Armaganijan, L.A.Salazar and R.D.Hirata: Leptin G-2548A promoter polymorphism is associated with increased plasma leptin and BMI in Brazilian women. Arq Bras.Endocrinol.Metabol. Dev. 52, 611-616 (2008). Hirose,Y., K.Chiba, T.Karasugi, M.Nakajima, Y.Kawaguchi, Y.Mikami, T.Furuichi, F.Mio, A.Miyake, T.Miyamoto, K.Ozaki, A.Takahashi, H.Mizuta, T.Kubo, T.Kimura, T.Tanaka, Y.Toyama and S.Ikegawa: A functional polymorphism in THBS2 that affects alternative splicing and MMP binding is associated with lumbar-disc herniation. Am.J.Hum.Genet. Dev. 82, 1122-1129 (2008). Hirschhorn,J.N., K.Lohmueller, E.Byrne and K.Hirschhorn: A comprehensive review of genetic association studies. Genet.Med. Dev. 4, 45-61 (2002). Hoffstedt,J., P.Eriksson, S.Mottagui-Tabar and P.Arner: A polymorphism in the leptin promoter region (-2548 G/A) influences gene expression and adipose tissue secretion of leptin. Horm.Metab Res. Dev. 34, 355-359 (2002). Holloway,W.R., F.M.Collier, C.J.Aitken, D.E.Myers, J.M.Hodge, M.Malakellis, T.J.Gough, G.R.Collier and G.C.Nicholson: Leptin inhibits osteoclast generation. J.Bone Miner.Res. Dev. 17, 200-209 (2002). Holt,I., M.W.Davie and M.J.Marshall: Osteoclasts are not the major source of interleukin-6 in mouse parietal bones. Bone Dev. 18, 221-226 (1996). Huang,d.W., B.T.Sherman and R.A.Lempicki: Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat.Protoc. Dev. 4, 44-57 (2009). Ishii,A. and S.H.Lo: A role of tensin in skeletal-muscle regeneration. Biochem.J. Dev. 356, 737-745 (2001). Jensen,L.J., M.Kuhn, M.Stark, S.Chaffron, C.Creevey, J.Muller, T.Doerks, P.Julien, A.Roth, M.Simonovic, P.Bork and C.von Mering: STRING 8--a global view on proteins and their functional interactions in 630 organisms. Nucleic Acids Res. Dev. 37, D412-D416(2009). Justice,C.M., N.H.Miller, B.Marosy, J.Zhang and A.F.Wilson: Familial idiopathic scoliosis: evidence of an X-linked susceptibility locus. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 28, 589-594 (2003).

70



Kanehisa,M., S.Goto, M.Furumichi, M.Tanabe and M.Hirakawa: KEGG for representation and analysis of molecular networks involving diseases and drugs. Nucleic Acids Res. Dev. 38, D355-D360(2010). Kesling,K.L. and K.A.Reinker: Scoliosis in twins. A meta-analysis of the literature and report of six cases. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 22, 2009-2014 (1997). Kindsfater,K., T.Lowe, D.Lawellin, D.Weinstein and J.Akmakjian: Levels of platelet calmodulin for the prediction of progression and severity of adolescent idiopathic scoliosis. J.Bone Joint Surg.Am. Dev. 76, 1186-1192 (1994). Kouwenhoven,J.W. and R.M.Castelein: The pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis: review of the literature. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 33, 2898-2908 (2008). Kwan,T.S., M.Padrines, S.Theoleyre, D.Heymann and Y.Fortun: IL-6, RANKL, TNF-alpha/IL-1: interrelations in bone resorption pathophysiology. Cytokine Growth Factor Rev. Dev. 15, 4960 (2004). Lao,M.L., D.H.Chow, X.Guo, J.C.Cheng and A.D.Holmes: Impaired dynamic balance control in adolescents with idiopathic scoliosis and abnormal somatosensory evoked potentials. J.Pediatr.Orthop. Dev. 28, 846-849 (2008). Le Stunff,C., C.Le Bihan, N.J.Schork and P.Bougneres: A common promoter variant of the leptin gene is associated with changes in the relationship between serum leptin and fat mass in obese girls. Diabetes Dev. 49, 2196-2200 (2000). Leon,L.R., A.A.White and M.J.Kluger: Role of IL-6 and TNF in thermoregulation and survival during sepsis in mice. Am.J.Physiol Dev. 275, R269-R277(1998). Li,X.F., H.Li, Z.D.Liu and L.Y.Dai: Low bone mineral status in adolescent idiopathic scoliosis. Eur.Spine J. Dev. 17, 1431-1440 (2008). Liu,T., W.C.Chu, G.Young, K.Li, B.H.Yeung, L.Guo, G.C.Man, W.W.Lam, S.T.Wong and J.C.Cheng: MR analysis of regional brain volume in adolescent idiopathic scoliosis: neurological manifestation of a systemic disease. J.Magn Reson.Imaging Dev. 27, 732-736 (2008). Lo,H.S., Z.Wang, Y.Hu, H.H.Yang, S.Gere, K.H.Buetow and M.P.Lee: Allelic variation in gene expression is common in the human genome. Genome Res. Dev. 13, 1855-1862 (2003). Lowe,T.G., M.Edgar, J.Y.Margulies, N.H.Miller, V.J.Raso, K.A.Reinker and C.H.Rivard: Etiology of idiopathic scoliosis: current trends in research. J.Bone Joint Surg.Am. Dev. 82-A, 1157-1168 (2000). Machida,M., J.Dubousset, Y.Imamura, T.Iwaya, T.Yamada and J.Kimura: An experimental study in chickens for the pathogenesis of idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 18, 16091615 (1993). Machida,M., J.Dubousset, Y.Imamura, Y.Miyashita, T.Yamada and J.Kimura: Melatonin. A possible role in pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 21, 11471152 (1996). Machida,M., I.Murai, Y.Miyashita, J.Dubousset, T.Yamada and J.Kimura: Pathogenesis of idiopathic scoliosis. Experimental study in rats. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 24, 1985-1989 (1999).

71



Mammes,O., D.Betoulle, R.Aubert, B.Herbeth, G.Siest and F.Fumeron: Association of the G-2548A polymorphism in the 5' region of the LEP gene with overweight. Ann.Hum.Genet. Dev. 64, 391-394 (2000). Mantzoros,C.S. and S.J.Moschos: Leptin: in search of role(s) in human physiology and pathophysiology. Clin.Endocrinol.(Oxf) Dev. 49, 551-567 (1998). Marosy,B., C.M.Justice, N.Nzegwu, G.Kumar, A.F.Wilson and N.H.Miller: Lack of association between the aggrecan gene and familial idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 31, 1420-1425 (2006). Martin,A., V.David, L.Malaval, M.H.Lafage-Proust, L.Vico and T.Thomas: Opposite effects of leptin on bone metabolism: a dose-dependent balance related to energy intake and insulin-like growth factor-I pathway. Endocrinology Dev. 148, 3419-3425 (2007). Mason,M.M., Y.F.He, H.Chen, M.J.Quon and M.Reitman: Regulation of leptin promoter function by Sp1, C/EBP, and a novel factor. Endocrinology Dev. 139, 1013-1022 (1998). Miller,N.H., C.M.Justice, B.Marosy, K.F.Doheny, E.Pugh, J.Zhang, H.C.Dietz, III and A.F.Wilson: Identification of candidate regions for familial idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 30, 1181-1187 (2005). Miller,N.H., B.Marosy, C.M.Justice, S.M.Novak, E.Y.Tang, P.Boyce, J.Pettengil, K.F.Doheny, E.W.Pugh and A.F.Wilson: Linkage analysis of genetic loci for kyphoscoliosis on chromosomes 5p13, 13q13.3, and 13q32. Am.J.Med.Genet.A Dev. 140, 1059-1068 (2006). Miller,N.H., B.Mims, A.Child, D.M.Milewicz, P.Sponseller and S.H.Blanton: Genetic analysis of structural elastic fiber and collagen genes in familial adolescent idiopathic scoliosis. J.Orthop.Res. Dev. 14, 994-999 (1996). Misol,S., I.V.Ponseti, N.Samaan and J.T.Bradbury: Growth hormone blood levels in patients with idiopathic scoliosis. Clin.Orthop.Relat Res. Dev. 81, 122-125 (1971). Montanaro,L., P.Parisini, T.Greggi, M.Di Silvestre, D.Campoccia, S.Rizzi and C.R.Arciola: Evidence of a linkage between matrilin-1 gene (MATN1) and idiopathic scoliosis. Scoliosis. Dev. 1, 21(2006). Moreau,A., D.S.Wang, S.Forget, B.Azeddine, D.Angeloni, F.Fraschini, H.Labelle, B.Poitras, C.H.Rivard and G.Grimard: Melatonin signaling dysfunction in adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 29, 1772-1781 (2004). Newton-Cheh,C. and J.N.Hirschhorn: Genetic association studies of complex traits: design and analysis issues. Mutat.Res. Dev. 573, 54-69 (2005). Ocaka,L., C.Zhao, J.A.Reed, N.D.Ebenezer, G.Brice, T.Morley, M.Mehta, J.O'Dowd, J.L.Weber, A.J.Hardcastle and A.H.Child: Assignment of two loci for autosomal dominant adolescent idiopathic scoliosis to chromosomes 9q31.2-q34.2 and 17q25.3-qtel. J.Med.Genet. Dev. 45, 87-92 (2008). Oegema,T.R., Jr., D.S.Bradford, K.M.Cooper and R.E.Hunter: Comparison of the biochemistry of proteoglycans isolated from normal, idiopathic scoliotic and cerebral palsy spines. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 8, 378-384 (1983). Ogilvie,J.: Adolescent idiopathic scoliosis and genetic testing. Curr.Opin.Pediatr. Dev. (2009).

72



Ostlund,R.E., Jr., J.W.Yang, S.Klein and R.Gingerich: Relation between plasma leptin concentration and body fat, gender, diet, age, and metabolic covariates. J.Clin.Endocrinol.Metab Dev. 81, 3909-3913 (1996). Ostrowski,K., T.Rohde, S.Asp, P.Schjerling and B.K.Pedersen: Pro- and anti-inflammatory cytokine balance in strenuous exercise in humans. J.Physiol Dev. 515 ( Pt 1), 287-291 (1999). Pedrini,V.A., I.V.Ponseti and S.C.Dohrman: Glycosaminoglycans of intervertebral disc in idiopathic scoliosis. J.Lab Clin.Med. Dev. 82, 938-950 (1973). Peltonen,L. and V.A.McKusick: Genomics and medicine. Dissecting human disease in the postgenomic era. Science Dev. 291, 1224-1229 (2001). Porter,R.W.: The pathogenesis of idiopathic scoliosis: uncoupled neuro-osseous growth? Eur.Spine J. Dev. 10, 473-481 (2001b). Porter,R.W.: The pathogenesis of idiopathic scoliosis: uncoupled neuro-osseous growth? Eur.Spine J. Dev. 10, 473-481 (2001a). Qi,L., R.M.van Dam, J.B.Meigs, J.E.Manson, D.Hunter and F.B.Hu: Genetic variation in IL6 gene and type 2 diabetes: tagging-SNP haplotype analysis in large-scale case-control study and meta-analysis. Hum.Mol.Genet. Dev. 15, 1914-1920 (2006). Qi,L., C.Zhang, R.M.van Dam and F.B.Hu: Interleukin-6 genetic variability and adiposity: associations in two prospective cohorts and systematic review in 26,944 individuals. J.Clin.Endocrinol.Metab Dev. 92, 3618-3625 (2007). Qiu,X.S., N.L.Tang, H.Y.Yeung, J.C.Cheng and Y.Qiu: Lack of association between the promoter polymorphism of the MTNR1A gene and adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 33, 2204-2207 (2008). Qiu,X.S., N.L.Tang, H.Y.Yeung, K.M.Lee, V.W.Hung, B.K.Ng, S.L.Ma, R.H.Kwok, L.Qin, Y.Qiu and J.C.Cheng: Melatonin receptor 1B (MTNR1B) gene polymorphism is associated with the occurrence of adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 32, 1748-1753 (2007a). Qiu,X.S., N.L.Tang, H.Y.Yeung, Y.Qiu and J.C.Cheng: Genetic association study of growth hormone receptor and idiopathic scoliosis. Clin.Orthop.Relat Res. Dev. 462, 53-58 (2007b). Qiu,Y., X.Sun, X.S.Qiu, W.G.Li, Z.Z.Zhu, F.Zhu, B.Wang, Y.Yu and B.P.Qian: Decreased circulating leptin level and its association with body and bone mass in girls with adolescent idiopathic scoliosis. Spine Dev. 32, 2703-2710 (2007c). Raggio,C.L., P.F.Giampietro, S.Dobrin, C.Zhao, D.Dorshorst, N.Ghebranious, J.L.Weber and R.D.Blank: A novel locus for adolescent idiopathic scoliosis on chromosome 12p. J.Orthop.Res. Dev. 27, 1366-1372 (2009). Rasko,I.,Downes C.S.: Genes in Medicine Molecular biology and human genetic disorders (Chapman&Hall) (1994). Ravaglia,G., P.Forti, F.Maioli, M.Chiappelli, P.Dolzani, M.Martelli, M.Bianchin, E.Mariani, L.Bolondi and F.Licastro: Associations of the -174 G/C interleukin-6 gene promoter polymorphism with serum interleukin 6 and mortality in the elderly. Biogerontology. Dev. 6, 415-423 (2005).

73



Ribeiro,R., A.P.Araujo, A.Coelho, R.Catarino, D.Pinto, A.Araujo, C.Calcada, C.Lopes and R.Medeiros: A functional polymorphism in the promoter region of leptin gene increases susceptibility for non-small cell lung cancer. Eur.J.Cancer Dev. 42, 1188-1193 (2006). Ribeiro,R., A.Vasconcelos, S.Costa, D.Pinto, A.Morais, J.Oliveira, F.Lobo, C.Lopes and R.Medeiros: Overexpressing leptin genetic polymorphism (-2548 G/A) is associated with susceptibility to prostate cancer and risk of advanced disease. Prostate Dev. 59, 268-274 (2004). Riseborough,E.J. and R.Wynne-Davies: A genetic survey of idiopathic scoliosis in Boston, Massachusetts. J.Bone Joint Surg.Am. Dev. 55, 974-982 (1973). Roach,J.W.: Adolescent idiopathic scoliosis. Orthop.Clin.North Am. Dev. 30, 353-viii(1999). Roberts,S., J.Menage and S.M.Eisenstein: The cartilage end-plate and intervertebral disc in scoliosis: calcification and other sequelae. J.Orthop.Res. Dev. 11, 747-757 (1993). Rodriguez,S., T.R.Gaunt and I.N.Day: Hardy-Weinberg equilibrium testing of biological ascertainment for Mendelian randomization studies. Am.J.Epidemiol. Dev. 169, 505-514 (2009). Roth,J.A., B.G.Kim, W.L.Lin and M.I.Cho: Melatonin promotes osteoblast differentiation and bone formation. J.Biol.Chem. Dev. 274, 22041-22047 (1999). Roth,M.: Idiopathic scoliosis caused by a short spinal cord. Acta Radiol.Diagn.(Stockh) Dev. 7, 257271 (1968). Sadat-Ali,M., A.Al Othman, D.Bubshait and D.Al Dakheel: Does scoliosis causes low bone mass? A comparative study between siblings. Eur.Spine J. Dev. 17, 944-947 (2008). Saladin,R., P.De Vos, M.Guerre-Millo, A.Leturque, J.Girard, B.Staels and J.Auwerx: Transient increase in obese gene expression after food intake or insulin administration. Nature Dev. 377, 527-529 (1995). Salehi,L.B., M.Mangino, S.De Serio, D.De Cicco, F.Capon, S.Semprini, A.Pizzuti, G.Novelli and B.Dallapiccola: Assignment of a locus for autosomal dominant idiopathic scoliosis (IS) to human chromosome 17p11. Hum.Genet. Dev. 111, 401-404 (2002). Satomura,K., S.Tobiume, R.Tokuyama, Y.Yamasaki, K.Kudoh, E.Maeda and M.Nagayama: Melatonin at pharmacological doses enhances human osteoblastic differentiation in vitro and promotes mouse cortical bone formation in vivo. J.Pineal Res. Dev. 42, 231-239 (2007). Sevastik,J., R.G.Burwell and P.H.Dangerfield: A new concept for the etiopathogenesis of the thoracospinal deformity of idiopathic scoliosis: summary of an electronic focus group debate of the IBSE. Eur.Spine J. Dev. 12, 440-450 (2003). Shohat,M., T.Shohat, M.Nitzan, M.Mimouni, R.Kedem and Y.L.Danon: Growth and ethnicity in scoliosis. Acta Orthop.Scand. Dev. 59, 310-313 (1988). Skibola,C.F., E.A.Holly, M.S.Forrest, A.Hubbard, P.M.Bracci, D.R.Skibola, C.Hegedus and M.T.Smith: Body mass index, leptin and leptin receptor polymorphisms, and non-hodgkin lymphoma. Cancer Epidemiol.Biomarkers Prev. Dev. 13, 779-786 (2004). Smith,A.J., F.D'Aiuto, J.Palmen, J.A.Cooper, J.Samuel, S.Thompson, J.Sanders, N.Donos, L.Nibali, D.Brull, P.Woo and S.E.Humphries: Association of serum interleukin-6 concentration with a functional IL6 -6331T>C polymorphism. Clin.Chem. Dev. 54, 841-850 (2008). 74



Snoussi,K., A.D.Strosberg, N.Bouaouina, S.Ben Ahmed, A.N.Helal and L.Chouchane: Leptin and leptin receptor polymorphisms are associated with increased risk and poor prognosis of breast carcinoma. BMC Cancer Dev. 6, 38(2006). Soyka,L.A., S.Grinspoon, L.L.Levitsky, D.B.Herzog and A.Klibanski: The effects of anorexia nervosa on bone metabolism in female adolescents. J.Clin.Endocrinol.Metab Dev. 84, 44894496 (1999). Spencer,G.S. and M.J.Eccles: Spinal muscle in scoliosis. Part 2. The proportion and size of type 1 and type 2 skeletal muscle fibres measured using a computer-controlled microscope. J.Neurol.Sci. Dev. 30, 143-154 (1976). Stokes,I.A. and D.D.Aronsson: Disc and vertebral wedging in patients with progressive scoliosis. J.Spinal Disord. Dev. 14, 317-322 (2001). Stokes,I.A. and J.P.Laible: Three-dimensional osseo-ligamentous model of the thorax representing initiation of scoliosis by asymmetric growth. J.Biomech. Dev. 23, 589-595 (1990). Strobel,A., T.Issad, L.Camoin, M.Ozata and A.D.Strosberg: A leptin missense mutation associated with hypogonadism and morbid obesity. Nat.Genet. Dev. 18, 213-215 (1998). Taguchi,Y., M.Yamamoto, T.Yamate, S.C.Lin, H.Mocharla, P.DeTogni, N.Nakayama, B.F.Boyce, E.Abe and S.C.Manolagas: Interleukin-6-type cytokines stimulate mesenchymal progenitor differentiation toward the osteoblastic lineage. Proc.Assoc.Am.Physicians Dev. 110, 559-574 (1998). Taylor,T.K., P.Ghosh and G.R.Bushell: The contribution of the intervertebral disk to the scoliotic deformity. Clin.Orthop.Relat Res. Dev. 79-90 (1981). Thalmann,S. and C.A.Meier: Local adipose tissue depots as cardiovascular risk factors. Cardiovasc.Res. Dev. 75, 690-701 (2007). THILLARD,M.J.: [Vertebral column deformities following epiphysectomy in the chick.]. C R.Hebd.Seances Acad.Sci. Dev. 248, 1238-1240 (1959). Thomas,K.A., S.D.Cook, T.C.Skalley, S.V.Renshaw, R.S.Makuch, M.Gross, T.S.Whitecloud, III and J.T.Bennett: Lumbar spine and femoral neck bone mineral density in idiopathic scoliosis: a follow-up study. J.Pediatr.Orthop. Dev. 12, 235-240 (1992). Thomas,T., F.Gori, S.Khosla, M.D.Jensen, B.Burguera and B.L.Riggs: Leptin acts on human marrow stromal cells to enhance differentiation to osteoblasts and to inhibit differentiation to adipocytes. Endocrinology Dev. 140, 1630-1638 (1999). Trayhurn,P. and I.S.Wood: Adipokines: inflammation and the pleiotropic role of white adipose tissue. Br.J.Nutr. Dev. 92, 347-355 (2004). Upadhyay,R., M.Jain, S.Kumar, U.C.Ghoshal and B.Mittal: Association of interleukin-6 (-174G>C) promoter polymorphism with risk of squamous cell esophageal cancer and tumor location: an exploratory study. Clin.Immunol. Dev. 128, 199-204 (2008). Veldhuizen,A.G., D.J.Wever and P.J.Webb: The aetiology of idiopathic scoliosis: biomechanical and neuromuscular factors. Eur.Spine J. Dev. 9, 178-184 (2000). Walsh,P.S., D.A.Metzger and R.Higuchi: Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques Dev. 10, 506-513 (1991). 75



Wang,J.L., R.Liu, M.Hawkins, N.Barzilai and L.Rossetti: A nutrient-sensing pathway regulates leptin gene expression in muscle and fat. Nature Dev. 393, 684-688 (1998). Wang,T.N., M.C.Huang, W.T.Chang, A.M.Ko, E.M.Tsai, C.S.Liu, C.H.Lee and Y.C.Ko: G-2548A polymorphism of the leptin gene is correlated with extreme obesity in Taiwanese aborigines. Obesity (Silver.Spring) Dev. 14, 183-187 (2006). Weimann,E., W.F.Blum, C.Witzel, S.Schwidergall and H.J.Bohles: Hypoleptinemia in female and male elite gymnasts. Eur.J.Clin.Invest Dev. 29, 853-860 (1999). Wise,C.A., R.Barnes, J.Gillum, J.A.Herring, A.M.Bowcock and M.Lovett: Localization of susceptibility to familial idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 25, 2372-2380 (2000). Wynne-Davies,R.: Familial (idiopathic) scoliosis. A family survey. J.Bone Joint Surg.Br. Dev. 50, 24-30 (1968). Xiao,P., P.Y.Liu, Y.Lu, Y.F.Guo, D.H.Xiong, L.H.Li, R.R.Recker and H.W.Deng: Association tests of interleukin-6 (IL-6) and type II tumor necrosis factor receptor (TNFR2) genes with bone mineral density in Caucasians using a re-sampling approach. Hum.Genet. Dev. 117, 340-348 (2005). Yamada,R., T.Tanaka, M.Unoki, T.Nagai, T.Sawada, Y.Ohnishi, T.Tsunoda, M.Yukioka, A.Maeda, K.Suzuki, H.Tateishi, T.Ochi, Y.Nakamura and K.Yamamoto: Association between a singlenucleotide polymorphism in the promoter of the human interleukin-3 gene and rheumatoid arthritis in Japanese patients, and maximum-likelihood estimation of combinatorial effect that two genetic loci have on susceptibility to the disease. Am.J.Hum.Genet. Dev. 68, 674-685 (2001). Yapijakis,C., M.Kechagiadakis, E.Nkenke, Z.Serefoglou, D.Avgoustidis, A.Vylliotis, D.Perrea, F.W.Neukam, E.Patsouris and E.Vairaktaris: Association of leptin -2548G/A and leptin receptor Q223R polymorphisms with increased risk for oral cancer. J.Cancer Res.Clin.Oncol. Dev. 135, 603-612 (2009). Yeung,H.Y., N.L.Tang, K.M.Lee, B.K.Ng, V.W.Hung, R.Kwok, X.Guo, L.Qin and J.C.Cheng: Genetic association study of insulin-like growth factor-I (IGF-I) gene with curve severity and osteopenia in adolescent idiopathic scoliosis. Stud.Health Technol.Inform. Dev. 123, 18-24 (2006). Yiannakouris,N., L.Melistas, M.Yannakoulia, K.Mungal and C.S.Mantzoros: The-2548G/A polymorphism in the human leptin gene promoter region is associated with plasma free leptin levels; interaction with adiposity and gender in healthy subjects. Hormones.(Athens.) Dev. 2, 229-236 (2003). Zhang,F., M.B.Basinski, J.M.Beals, S.L.Briggs, L.M.Churgay, D.K.Clawson, R.D.DiMarchi, T.C.Furman, J.E.Hale, H.M.Hsiung, B.E.Schoner, D.P.Smith, X.Y.Zhang, J.P.Wery and R.W.Schevitz: Crystal structure of the obese protein leptin-E100. Nature Dev. 387, 206-209 (1997). Zhang,H.Q., S.J.Lu, M.X.Tang, L.Q.Chen, S.H.Liu, C.F.Guo, X.Y.Wang, J.Chen and L.Xie: Association of estrogen receptor beta gene polymorphisms with susceptibility to adolescent idiopathic scoliosis. Spine (Phila Pa 1976.) Dev. 34, 760-764 (2009). Zhang,Y., R.Proenca, M.Maffei, M.Barone, L.Leopold and J.M.Friedman: Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature Dev. 372, 425-432 (1994). 76



Zhao,L.J., H.Jiang, C.J.Papasian, D.Maulik, B.Drees, J.Hamilton and H.W.Deng: Correlation of obesity and osteoporosis: effect of fat mass on the determination of osteoporosis. J.Bone Miner.Res. Dev. 23, 17-29 (2008). Zhao,Y. and G.X.Qiu: [Expression of calmodulin and nNOS in the paraspinal muscles in idiopathic scoliosis]. Zhonghua Yi.Xue.Za Zhi. Dev. 84, 1358-1361 (2004).

77



KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik a munkámban és a dolgozatom elkészítésében segítettek. Elıször is hálásan köszönöm Dr. Raskó Istvánnak, hogy lehetıvé tette a kutatómunkám végezését a csoportjában, köszönöm a tudományos irányítást és az anyagi támogatás biztosítását. Nagyon köszönöm a Humán Molekuláris Munkacsoport minden volt és jelenlegi tagjának a jó munkahelyi légkört, a segítıkészséget és azt a támogatást, amit a hosszú évek alatt nyújtottak. Külön köszönöm Dr. Mórocz Mónikának, Szécsényi Anitának, Dr. Álmos Péternek, Dragon Annamáriának és Grózer Zsuzsannának, hogy a dolgozat megírásához szakmai segítséget nyújtottak. Nem tudok elég hálás lenni Lehıcz Istvánnénak és Radóné Dudás Máriának az asszisztensi munkájukért és barátságukért. Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Endreffy Emıkének és Dr. Illés Tamásnak a munkához szükséges mintákért; Dr. Zvara Ágnesnek a microarray kísérletekben nyújtott baráti segítségért és végül, de nem utolsó sorban Dr. Monostori Évának az irántam való türelméért és a dolgozat megírásához szükséges baráti támogatásért. Köszönöm szüleimnek, férjemnek és gyerekeimnek, hogy a munkámmal járó nehézségeket elviselték, a dolgozat megírását türelemmel fogadták és mindenben támogattak.

78



ÖSSZEFOGLALÁS A XXI. században a társadalom nagyobb részét érintı, komplex betegségek etiológiai vizsgálatai kerültek a humángenetikai kutatások középpontjába. Ezekre a betegségekre jellemzı, hogy több gén hibás mőködése a környezeti hatásokkal kölcsönhatásban alakítja ki ıket és genetikailag is heterogének lehetnek, például a szív- és érrendszeri betegségek. Az általunk vizsgált, a felnıttkor elején valamely ismert ok nélkül kialakuló gerincferdülés (AIS) olyan komplex betegség, amelynek genetikai hátterérıl a kiterjedt kutatások ellenére nem tudunk sokat. Az AIS klinikai kórképe változatos, eltérı lehet a kialakulás ideje, a görbület progressziójának mértéke, sebessége és nagysága. Az esetek döntı többségében a gerincferdülés kezdete a serdülıkorra tehetı, ezért valószínősítik, hogy a növekedéssel kapcsolatos hormonális, metabolikus és biomechanikai változások szerepet játszhatnak az AIS pathomechanizmusában. A lányoknál a rövidebb idı alatt és gyorsabban lezajló serdülıkori fejlıdés lehet az oka annak, hogy 3.4-szer gyakoribb a nagyobb mértékő gerincferdülés a körükben, mint a fiúknál. Az elmúlt 40 év alatt számos területen keresték a deformitás kialakulásának okát, vizsgálták: a csont- és a kötıszövet, valamint a harántcsíkolt izmok strukturális eltéréseit; a neurológiai rendellenességeket; a hormonháztartás egyensúlyát; a biomechanikai hatásokat; a genetikai tényezıket. Az etiológiai kutatások kezdetén kevés figyelem irányult a genetikai háttér felé, mivel a betegség többnyire szórványosan lépett fel, és gyakran a családon belül halmozódó esetek sem mutattak egyértelmő öröklıdést. Az AIS ma elfogadott, genetikai modellje szerint a betegség kialakulása két szakaszra osztható, egy iniciációs és egy progressziós fázisra és feltételezések szerint más-más gének hibái felelısek a hajlamosításra és a súlyosbodásra. Magyarországon a Pécsi Tudományegyetem Általános Orvosi Kar Ortopédiai Klinikáján végzik az évi 450 új eset döntı többségének mőtéti korrekcióját. A dolgozatomban leírt munkát szoros együttmőködésben végeztük a klinika tanszékvezetı professzorával Dr. Illés Tamással, akitıl az AIS-es betegek vérmintáit és a korrekciós mőtét során a gerincoszlop két oldaláról származó izombiopsziákat kaptuk.

79



A munkánk során célul tőztük ki, hogy molekuláris szintő vizsgálatokban az AIS-re jellemzı további eltéréseket tárjunk fel a harántcsíkolt izmok transzkriptoma analízisével és az eltérések hátterében álló genetikai tényezıket vizsgáljuk. Elıször CHIP microarray módszerrel kívántuk összehasonlítani külön-külön az: 1. Egészséges és scoliotikus paravertebrális izmok génkifejezıdési mintázatát, valamint a: 2. Scoliotikus izmokban a görbület konvex és konkáv oldali génkifejezıdését. Másodszor a génexpressziós vizsgálatok által jelölt gének SNP polimorfizmusát terveztük vizsgálni asszociációs analízissel eset-kontroll tanulmányban. A két microarray analízis eredményeként egy 187, illetve egy 63 tagból álló génlistát kaptunk, melyek tagjait négy szempont alapján elemeztük annak eldöntésére, melyek azok a gének, amelyek számításba jöhetnek a további vizsgálatokban. 1. Elıször biológiai folyamatokat jelölı génontológiai (GO) kategóriákhoz rendeltük a génlista tagjait és olyan GO kategóriákat kerestünk, amelyekben a vizsgált gének a humán genom átlagos GO eloszlásához képest magasabb arányban vannak jelen és szerepük lehet az AIS kialakításában. A gerincferdüléses betegek gerincoszlopának konvex és konkáv oldalán génkifejezıdésbeli különbséget mutató gének két GO kategóriában,

a lipid anyagcserében

(GO:0006629) és a

morfogenezisben

(GO:0007275) nagyobb arányban jelentek meg, ebbe a két kategóriába a 63 génbıl összesen 18-at tudtunk besorolni. 2. A génlisták tagjainak közös biológiai, metabolikus útvonalban való szereplése és együttes génexpressziós változásuk jelzi az adott folyamat fontosságát, ilyen útvonal keresésekor több gén is expressziós változást mutatott az adipociták jelátviteli mechanizmusában (KEGG_Pathway: hsa04920), ami a lipid anyagcsere érintettségét az AIS-ben alátámasztja. 3. Meghatároztuk a génlistáinkon lévı gének kromoszóma lokalizációját és két szempont szerint is átnéztük a gének elhelyezkedését. Egyrészrıl kerestünk olyan kromoszóma szakaszokat, ahová több gén is térképezıdik közel egymáshoz, mert egy helyen lévı és egyforma génkifejezıdésbeli eltérést mutató gének esetén gondolhatunk valamiféle genomszintő átrendezıdésre az adott régióban (delécióra vagy inszercióra). Ilyet nem tudtunk kimutatni. Másrészrıl kiválogattuk azokat a géneket, amelyek olyan kromoszóma szakaszra esnek, amit családokon kapcsoltsági analízissel a szakirodalom az AIS-hez kötöttnek tekint. Nyolc ennek megfelelı gént 80



találtunk, amelyeknek további vizsgálata szükséges. 4. Irodalmi kutatásokat végeztünk és a vonatkozó GeneCards leírások és számos publikáció alapján összefüggést próbáltunk találni a gének jelenleg ismert funkciója és az AIS pathomechanizmusára vonatkozó jelenleg ismert modellek között. Az érdekesnek talált gének közül ötöt már tovább vizsgáltunk, de két ígéretes gén, az izomerı meghatározásában szereplı a disztonin és a sérült izmok regenerálódásában fontos tenzin célzott vizsgálata még várat magára. A microarray kísérletek kiváló kiindulási alapként szolgálnak, mivel látótérbe hoznak a vizsgált jelenséggel kapcsolatban álló új géneket. Következı lépésként azonban mindenképp szükséges ellenırizni egy független módszerrel, hogy valóban fennáll-e a megfigyelt génkifejezıdésbeli különbség. Ez a független módszer napjainkban általában a kvantitatív valós idejő polimeráz láncreakció (QRT-PCR). A vizsgálatra kiválasztott 13 gén közül egyedül a leptin (LEP) esetén tudtunk kimutatni eltérést a QRT-PCR-rel is. A scoliosisos betegekben a görbült gerincoszlop konvex oldalán a leptin relatív mRNS mennyisége 2,5szerese a konkáv oldalénak és ennek az eredménynek kapcsán kezdtük el vizsgálni a LEP gént. A leptin szerepe az AIS kialakításában napjainkban merült fel a szakirodalomban és eddig egyetlen közlemény jelent meg, amelyben az AIS-es lányokban alacsonyabb leptin szérumszintet találtak az egészséges kontrollokhoz viszonyítva. Egy eset-kontroll tanulmányban asszociációs analízissel a leptin gén promóter régiójában vizsgáltuk annak az SNP-ének az elıfordulási gyakoriságát, amelynek szerepe lehet a leptin gén szabályozásában. Az asszociációs vizsgálatba bevontuk az interleukin 6 (IL6) szabályozó régiójában lévı polimorfizmust is, mivel egy közlemény szerint a gerincferdüléssel asszociációt mutatott. A két SNP, a LEP G-2548A és a IL6 G-174C kimutatására a PCR-RFLP módszert használtuk és 126 idiopathiás scoliosisos beteg és 197 egészséges, egymással nem rokon személy esetében határoztuk meg a jelenlévı allélokat. Mindkét populáció Hardy-Weinberg egyensúlyban volt valamennyi vizsgált lókuszra. Egyik SNP esetén sem találtunk szignifikáns különbséget sem az allélgyakoriságban, sem a genotípus gyakoriságban az AISes és a kontroll csoport között de a különbözı genotípusok esélyhányadosainak meghatározása után úgy tőnik a LEP-2548A allél jelenléte lehet hajlamosító faktor az AISben. Vizsgálatainkban az AA vs. GG: OR=1.513(CI:0.894-2.562), ami a komplex betegségek esetén a hajlamosító allélokra jellemzı értéknek tekinthetı. Az esélyhányados értéke megnıtt akkor, ha külön vizsgáltuk a lányokat (AA vs. GG: OR=2.02(CI:0.824-4.961)), ami azt jelzi, hogy a lányokban nagyobb szerepe lehet az AIS kialakításában a LEP-2548A allélnak, mint a 81



fiúkban. Ugyanakkor nem találtunk összefüggést a görbület mértéke (Cobb˚) és az SNP által meghatározott allélok között. Az IL6 G-174C polimorfizmusát vizsgálva nem tudtuk megerısíteni a korábban, mások által leírt asszociációt. A reprodukálhatóság hiánya egyáltalán nem egyedi, sıt a komplex betegségekre jellemzınek tartja a szakirodalom, ezért szükséges több, megfelelı statisztikai erıvel rendelkezı, független populáción elvégezni az asszociációs vizsgálatokat. Mivel multifaktoriális öröklıdéső betegségekben a gének nem önmagukban hatnak, hanem egymással kölcsönhatásban, ezért megvizsgáltuk létezik-e episztatikus kapcsolat az általunk vizsgált két gén alléljei között. A gén-gén kölcsönhatás feltárásához két eljárást is használtunk, az elsı az MDR analízis, amely kisszámú mintaelem esetén is kimutatja az episztázist és alkalmas a gének közötti szinergizmus kimutatására akkor is ha az allél eloszlásban nem mutatkozik eltérés a beteg és a kontroll csoport között. Az analízis eredményeként megkaptuk azokat a genotípus kombinációkat , amelyek elıfordulása esetén nagyobb a kockázata az AIS kialakulásának. A másik statisztikai módszer, ami a génkombinációk hatásának maximum likelihood becslését alkalmazva megadja, hogy egy adott génkombináció milyen mértékben emeli meg a betegség kialakulásának esélyét egy másik génkombinációhoz viszonyítva. Az elemzés után a leginkább hajlamosító allélkombináció (IL6 CC-LEP AA) hordozójának 4.667-szor nagyobb az esélye az AIS kialakulására, mint az (IL6 GG-LEP GG) kombináció hordozójának. Ez az esélyhányados még magasabb a lányok esetén, tehát a hajlamosító allélkombináció (IL6 CC-LEP AA) hordozása még nagyobb kockázatot jelent náluk (OR= 6.667 (CI:0.597-74.506). Statisztikai módszerrel megvizsgálva a genotípus kombinációk és a Cobb˚ közötti kapcsolatot, nem találtunk semmiféle összefüggést köztük. A vizsgálati eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a LEP AA-IL6 CC genotípus kombináció az AIS kialakulására hajlamosít, nem pedig a progressziójában játszhat szerepet. Jelen dolgozatban az AIS kutatásában újszerő megközelítést használva a paravertebrális izmok génexpressziós mintázatát vizsgáltuk és sikerült transzkriptoma szinten megjelenı eltérést feltárni és független módszerrel visszaigazolni a leptin gén esetén. A további genetikai és statisztikai elemzések az AIS kialakításában szerepet játszható gén-gén kölcsönhatás felderítéséhez vezetett és elsıként sikerült kimutatnunk, hogy két adipokint (leptint, interleukin-6-ot) termelı gén szabályozását befolyásoló polimorfizmus együttes jelenléte szóba jöhet, mint hajlamosító faktor az AIS etiológiájában.

82



SUMMARY

In the 21st Century the human genetic studies focus on revealing etiology of common complex diseases. Complex diseases are believed to be caused by a several number of genes, usually interacting with various environmental factors and to be genetically heterogenic like coronary heart diseases. Adolescence idiopathic scoliosis, a multifactorial disease represents a three-dimensional deformity of spine with lateral curvature in which the causes are unknown. Many studies are conducted to uncover contributing genetic factors of AIS, however, genetics underlying AIS have not been identified yet. Adolescent idiopathic scoliosis occurs at the peripubertal period (between 10 and 16 years of age) supposing the role in AIS pathomechamism the changes in endocrine, metabolic and biomechanical alterations during growth spurt. It is widely accepted that scoliosis has a sex-conditioned manifestation, girls have a higher risk for development of curve progression the ratio of girls to boys is 3.4/1 with curves greater than 30 degrees. In the last 40 years many different research area were involved in hunting for etiology factors of spine deformity like connective tissue abnormalities, asymmetries in the central nervous system, hormonal variation and genetics. According to the most accepted model for inheritance the genetic factors can be divided into predisposing factors, initiating factors and contributing factors in accordance with their role in the pathogenesis of AIS. Moreover, the current view is that there are no major genes causing AIS, but combinations of sequence variants of possible predisposition genes may have synergic effects on determining the deformity. Therefore, it is important to identify such sequence variants and combined genotype pattern of these susceptibility genes to get a better understanding of AIS pathogenesis. The major objectives of the work presented in my dissertation were the investigation of the genetic background of AIS and the identification of novel molecular alterations that are associated with this disease. The study was performed in close collaboration with Prof. Tamás Illés at Department of Orthopaedics, Medical School University of Pécs, who provided us the clinical samples of AIS patients. For molecular biology studies I used two different molecular biological approaches.

83



In the first approach I have investigated the gene expression pattern of the paravertebral muscles responsible for the stability of the spinal column. By using the DNA microarray technology in transcriptome profiling experiments I have compared: I.

The gene expression pattern of the paravertebral muscles in healthy control individuals and AIS patients.

II.

The gene expression pattern of the paravertebral muscles in the concave and the convex side of the spinal column deformity.

I have collected those genes that could be candidates for further studies according to the following criteria: 1. They are significantly accumulated in a functionally relevant Gene Ontology group. 2. They are accumulated in a functionally relevant metabolic or signal transduction pathway. 3. They are located in a chromosome region has been previously reported to be involved in AIS. 4. According to the scientific publications reliable hypothesis could be built regarding its involvement in AIS pathomechanism. In the second approach the identified potential candidate genes were investigated in casecontrol SNP polymorphism association studies. The data resulted by these experiments was subjected to different statistical evaluation processes suitable for the identification of the genetic interactions and the determination whether a particular gene is involved in the onset or in the later progression phase of the AIS. For revealing the gene expression differences in AIS 95 total RNA samples have been prepared from muscle biopsies of patients subjected to correction surgery interventions. In collaboration with the Functional Genomics Group of the BRC two microarray transcription profiling experiments have been performed. In the first experimental layout I have compared the gene expression levels in healthy and AIS individuals. In the second I have revealed the differences in the transcriptional landscape of muscle samples derived from the concave and the convex side of the spinal column deformity. To select genes for further genetic investigations, the elements of the gene lists have been evaluated regarding to the following four criteria: 1. The members of the gene lists has been classified according to their Gene Ontology annotation, and the significantly overrepresented GO categories that functionally 84



might be involved in the AIS etiology have been identified. Genes from the lipid metabolism (GO:0006629) and morphogenesis (GO:0007275) categories were enriched in gene set showing expression difference in the concave and convex side of the spinal cord deformity. These GO categories contained 18 out of the total 63 genes of this list. 2. The simultaneous accumulation of genes with significantly altered expression in particular metabolic or signal transduction networks might help to reveal molecular or cell physiological processes involved in the appearance of a disease phenotype. In our microarray investigations an adipocyte signalling cascade (KEGG_Pathway: hsa04920) proved to be overrepresented in the significant gene list, indicating the potential role of lipid metabolism in AIS disorder. 3. I have identified the chromosomal localization of genes showing significant expression difference in microarray experiments and selected 8 of them to be localized to chromosomal region have previously been reported in family based linkage analysis as could be involved in AIS. 4. Performing very exhaustive data mining in different biomedical literature and gene annotation databases like Pubmed, GenCards or OMIM, I tried to find connections between the known functions of the selected genes and the different AIS pathogenesis models suggested up till now by the scientific community working in this field. Two of the identified genes might be very interesting in this respect. Distrophin (DTS) has well characterized role in affecting the muscle strength, while tensin has an important function in the regeneration process of the wounded muscles. It is always necessary to validate the microarray results by an independent method. In bulk majority of the currently applied experimental strategies this independent method is the quantitative real time polymerase chain reaction (QRT-PCR). In QRT-PCR assay the abundance of leptin gene relative mRNA was 2.5 times higher in the convex side of the spine in AIS patients. These findings inspired me to make further studies concerning the involvement of leptin gene in AIS pathogenesis. In a case-control association study I have investigated the association of a promoter SNP in the leptin gene with the manifestation of the AIS phenotype. In the same assay I have also analyzed another SNP from IL6 gene promoter region that has been reported to be associated with AIS. By using the PCR-RFLP method for the concurrent detection of LEP G-2548A and IL6 G-174C polymorphisms I have determined the genotypes in 126 AIS and 197 healthy individuals. Both investigated populations were in Hardy-Weinberg equilibrium at these loci. 85



No significant differences were found for allele and genotype frequencies of the polymorphisms of LEP G-2548A and IL6 G-174C between cases or controls. However the determination of the odds ratio of the different genotypes indicates that the presence of the LEP-2548A allele might be a susceptibility factor for AIS. In my studies the odds ratio of LEP-2548 AA vs. LEP-2548 GG was OR=1.513 (CI:0.894-2.562) which is generally accepted as an indicator for susceptibility alleles in the case of complex diseases. The odds ratio value was further increased (LEP-2548 AA vs. LEP-2548 GG: OR=2.02(CI:0.8244.961)) when the female subpopulations was subjected, suggesting that in females LEP2548A allele might have a greater impact on the manifestation of AIS than in males. In the other hand I didn’t find any association between the alleles determined by these SNPs and the extent (Cobbo) of the spinal curve. I have investigated whether there is any epistatic interaction between the alleles of leptin and IL6 in respect of the manifestation of idiopathic scoliosis. I have used two different approaches for revealing the gene-gene interactions. MDR analysis is suitable for detection of epistatic interactions in such situations when the sample size is relatively small for the investigation. As a result of this study the genotype combinations had increased risk of the appearance of AIS could be emerged. The other statistical process based on the maximum likelihood estimation can give a quantitative answer how a particular allelic combination increases the chance of AIS manifestation compared to the other allelic patterns. By performing these studies I have demonstrated that the IL6 CC-LEP AA allele combination has the strongest susceptibility effect, which is 4.667 times higher to that of appear in the presence of IL6 GG-LEP GG alleles. This relative odds ratio is even higher in the case of female target population (OR= 6.667 (CI:0.597-74.506) indicating a higher genetic risk for idiopathic scoliosis. In the studies described in my Ph.D. dissertation I used a novel approaches, namely microarray analyses in AIS research for the investigation of the gene expression pattern of the paravertebral muscles. I could identify several genes where the altered gene expression indicates their potential role in AIS pathogenesis. An independent method (QRT-PCR) was successfully used to collect supporting evidence regarding the detected gene expression difference in the case of leptin. Further genotyping studies and statistical investigations lead to the identification of a gene-gene interaction resulting in increased susceptibility for AIS. I could demonstrate that the simultaneous occurrence of allelic variants determined by single nucleotide polymorphisms in the regulatory promoter regions of two adipokine genes (IL6 and leptin) might be a susceptibility factor in AIS etiology. 86



KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA 1. Czibula, A; Leiker, G; Rasko, I Changes in alkylation damage removal during in vitro neuronal differentiation ACTA BIOLOGICA HUNGARICA Volume: 48 Issue: 1 Pages: 113-120 (1997)

2. Czibula, A; Morocz, M; Bachrati, CZ, et al. Hunt for genetic susceptibility in a complex disease JOURNAL OF MOLECULAR STRUCTURE-THEOCHEM Volume: 666 Pages: 681-686 (2003)

3. Gervain J, Czibula A, Simon J, Kalmár T. Structural analysis of the PKR-binding region of HCV 1b samples from patients with chronic hepatitis C and the correlation with IFN-sensitivity ORV HETIL. Volume:144 Issue: 24 Pages: 1179-84( 2003) Hungarian.

4. Bogácsi-Szabó E, Kalmár T, Csányi B, Tömöry G, Czibula A, Priskin K, Horváth F, Downes CS, Raskó I. Mitochondrial DNA of ancient Cumanians: Culturally Asian steppe nomadic immigrants with substantially more western Eurasian mitochondrial DNA lineages HUMAN BIOLOGY Volume: 77 Issue: 5 Pages: 639-662 ( 2005)

5. Ion G, Fajka-Boja R, Kovács F, Szebeni G, Gombos I, Czibula A, Matkó J, Monostori E. Acid sphingomyelinase mediated release of ceramide is essential to trigger the mitochondrial pathway of apoptosis by galectin-1 CELLULAR SIGNALLING Volume: 18 Issue: 11 Pages: 1887-1896 (2006)

6. Hegedus Z, Czibula A, Kiss-Toth, E Tribbles: novel regulators of cell function; evolutionary aspects CELLULAR AND MOLECULAR LIFE SCIENCES Volume: 63 Issue: 14 Pages: 16321641 (2006)

87



7. Zana M, Szécsényi A, Czibula A, Bjelik A, Juhász A, Rimanóczy A, Szabó K, Vetró A, Szucs P, Várkonyi A, Pákáski M, Boda K, Raskó I, Janka Z, Kálmán J. Age-dependent oxidative stress-induced DNA damage in Down's lymphocytes BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS Volume:345 Issue:2 Pages: 726-733 (2006)

8. Hegedus Z, Czibula A, Kiss-Toth, E Tribbles: A family of kinase-like proteins with potent signalling regulatory function CELLULAR SIGNALLING Volume: 19 Issue: 2 Pages: 238-250 (2007)

9. Tömöry G, Csányi B, Bogácsi-Szabó E, Kalmár T, Czibula A, Csosz A, Priskin K, Mende B, Langó P, Downes CS, Raskó I Comparison of maternal lineage and biogeographic analyses of ancient and modern Hungarian populations AMERICAN JOURNAL OF PHYSICAL ANTHROPOLOGY Volume: 134 Pages: 354-368 (2007)

10. Sung HY, Guan H, Czibula A, King AR, Eder K, Heath E, Suvarna SK, Dower SK, Wilson AG, Francis SE, Crossman DC, Kiss-Toth E. Human tribbles-1 controls proliferation and chemotaxis of smooth muscle cells via MAPK signaling pathways JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Volume: 282 Issue: 25 Pages: 18379-18387 (2007)

11. Almos PZ, Horváth S, Czibula A, Raskó I, Sipos B, Bihari P, Béres J, Juhász A, Janka Z, Kálmán J. H1 tau haplotype-related genomic variation at 17q21.3 as an Asian heritage of the European Gypsy population. HEREDITY Volume: 101 Issue: 5 Pages: 416-419 (2008)

12. Csányi B, Bogácsi-Szabó E, Tömöry G, Czibula A, Priskin K, Csõsz A, Mende B, Langó P, Csete K, Zsolnai A, Conant EK, Downes CS, Raskó I Y-chromosome analysis of ancient Hungarian and two modern Hungarian-speaking populations from the Carpathian Basin 88



ANNALS OF HUMAN GENETICS Volume: 72 Pages: 519-534 (2008)

13. Matusek,T.; Gombos,R.; Szecsenyi,A.; Sanchez-Soriano,N.; Czibula,A.; Pataki,C.; Gedai,A.; Prokop,A.; Rasko,I.; Mihaly,J. Formin proteins of the DAAM subfamily play a role during axon growth JOURNAL OF NEUROSCIENCES Volume: 28 Issue: 49 Pages: 13310-13319 (2008)

14. Nagy,D.; Bogacsi-Szabo,E.; Varkonyi,A.; Csanyi,B.; Czibula,A.; Bede,O.; Tari,B.; Rasko,I. Prevalence of adult-type hypolactasia as diagnosed with genetic and lactose hydrogen breath tests in Hungarians EUROPEAN JOURNAL OF CLINICAL NUTRITION Volume: 63 Issue: 7 Pages: 909-912 (2009)

15. Mórocz M, Czibula A *, Grózer Zs, Szécsényi A, Álmos P, Dragon A, Raskó I, Illés T Association study of MMP-3, IL-6, Leptin, BMP4, MTNR1B Gene Promoter Polymorphisms and Adolescent Idiopathic Scoliosis Közlésre elküldve a SPINE-ba, revízió alatt *megosztott elsı szerzıség

Konferencia kiadványok 1. Regulation of the bovine leukemia-virus basal transcription Kiss-Toth E, Unk I, Bachrati C, Czibula A JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY Pages: 48-48 Supplement: 18C (1994)

2. Repair of alkylation damage by differentiating mouse teratocarcinoma cells Czibula A, Leiker G, Margison GP, T, Rasko I JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY Pages: 278-278 Supplement: (1995)

3. Changes of DNA repair during in vitro cellular differentiation Czibula A, Gerencser A, Bachrati C, Borda S, Johnson RT, Rasko I CELL BIOLOGY INTERNATIONAL Volume: 20 Pages: 220-220 (1996)

89



4. A putative molecular genetic susceptibility allele for idiopathic scoliosis Czibula A, Morocz M, Csiszar A, Bachrati C, Olah E, Szeszak F, Morava E, Szappanos L, Rasko I EUROPEAN JOURNAL OF HUMAN GENETICS Volume: 10 Pages: 76-77 (2002)

5. The correlation of genom mutations in HCV-1b with IFN-sensitivity in Hungarian patients Gervain J, Simon J, Czibula A, Kalmar T JOURNAL OF GASTROENTEROLOGY AND HEPATOLOGY Volume: 21 Pages: A139A139 Supplement: 2 (2006)

90

Az idiopathiás scoliosis molekuláris biológiai vizsgálata

Recommend Documents