A Z IBUPROFEN AEROB ÉS ANAEROB MIKROBIÁLIS LEBONTÁSÁNAK VIZSGÁLATA HAGYOMÁNYOS TENYÉSZTÉSES ÉS MOLEKULÁRIS U J J L E N Y O M AT T E C H N I K Á K K A L
Készítette: Hatos Zsófia környezettudomány szakos hallgató 2012
Gyógyszermaradványok
Gyógyszermaradványok körforgása fogyasztó szennyvíz
gyógyszerek
felszín alatti vizek
trágya
szennyvíztisztító telep
talaj
felszíni vizek + szediment
iszap
tisztított víz
Ibuprofen élettani hatása
(RS)-2-[4-(2-metilpropil)fenil]propánsav
COX gátló – prosztaglandin szintézis
gasztrointesztinális vérzés
vese- és májkárosodás
ökotoxikológiai hatások
NSAIDs
akut és krónikus tesztek
nonsteroidal anti-inflammatory drugs
kockázatbecslés - 93/67EGK Európai
Uniós Biztonsági Irányelv
metabolitok:
biodegradáció
hidroxi-ibuprofen, karboxi-ibuprofen, fenilpropionát 1,2-dihidroxi-ibuprofen, ibuprofenol, ibuprofenol-acetát, izobutilkatekol
Nocardia sp.
Sphingomonas sp.
Trametes versicolor
Célkitűzéseink
kísérleti rendszer – gyógyszerek aerob és anaerob lebontása
különböző közösségek biodegradációs potenciálja
ibuprofen közösség átalakító hatása
ibuprofent lebontó mikroorganizmus azonosítása
Kísérleti rendszer összeállítása [1]
mintavétel: ◦ zöld növényi komposzt – VÜSZI komposztáló telep ◦ eleveniszap – Észak-pesti Szennyvíztisztító Telep ◦ rothasztott iszap - Észak-pesti Szennyvíztisztító Telep ◦ Duna iszap – Soroksári Dunaág, parttól 5 m, 50 cm-es magmintavevő
aerob és anaerob kísérletek
sterilizált eszközök és vegyszerek autokláv, égetés
3 párhuzamos mérés
hőlégsterilizáló,
Kísérleti rendszer összeállítása [2]
AEROB: eleveniszap I, II; zöld növényi komposzt ◦ DSMZ 465 ásványi médium (teflon-szilikon kupakos 1 l-es Schott üvegekben)
◦ 50 ml inokulum ◦ 2009.03.26. eleveniszap I, 2009.08.11. eleveniszap II ◦ 73 mg/L és 300 mg/L ibuprofen koncentráció
biotikus kontroll – inokulum , ibuprofen
abiotikus kontroll – inokulum , ibuprofen
hetente mintavétel, 2. kísérletnél naponta
1. kísérlet 1 hónapig; 2. kísérlet 2 hétig
Kísérleti rendszer összeállítása [3]
Aerob eleveniszapos és zöld növényi komposztos kísérleti rendszer
Kísérleti rendszer összeállítása [4]
Kísérleti rendszer összeállítása [5]
ANAEROB: Duna iszap (22°C); rothasztott iszap (35°C) ◦ Ramm médium (teflon-szilikon kupakos 1 l-es Schott üvegekben)
◦ 50 ml inokulum ◦ anaerob indikátorként 20 l 1%-os rezazurin oldat ◦ kupakok - méhviasz-paraffin keverékkel zárás
biotikus kontroll – inokulum , ibuprofen
abiotikus kontroll – inokulum , ibuprofen
hetente mintavétel anaerob körülmények között
Vizsgálati módszerek {1}
DUNA ISZAP ELEVENISZAP
ROTHASZTOTT-
ISZAP
ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT
Vizsgálati módszerek {1} 2 kísérleti rendszer – 03.26. és 08.11.
tenyésztés
DUNA ISZAP
ELEVENISZAP
kémia
szekvencia analízis
ROTHASZTOTT-
ISZAP
DNS izolálás, PCR reakciók
klónkönyvtár
T-RFLP
ARDRA
ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT
Vizsgálati módszerek {2} 2 kísérleti rendszer – 03.26. és 08.11.
tenyésztés kémiai analízis ELEVENISZAP
DUNA ISZAP
LC-ESI-MS/MS BME - Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar kémia
szekvencia analízis
elektrospray ionizációs folyadékkromatográfia – kapcsolt DNS izolálás, tandem tömegspektrometria PCR reakciók
klónkönyvtár
T-RFLP
ARDRA
ZÖLD NÖVÉNYI KOMPOSZT
ROTHASZTOTT-
ISZAP
Kutatás lépései
100
80 60
eleveniszap - átlag abiotikus aerob kontroll
40 20 0
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
03.26.
04.02. 04.09. 04.16. Mintavételek időpontja
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
120
120 100 80 60 40
komposzt - áltag abiotikus aerob kontroll
20 0 03.26.
04.28.
04.02. 04.09. 04.16. Mintavételek időpontja
04.28.
100
100
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
Kémiai analízis eredményei (1)
80 60 40
Duna iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll
20 0 03.26.
04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja
05.26.
80
60 40
rothasztott iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll
20 0 03.26.
04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja
05.26.
100
80
eleveniszap I
60
eleveniszap - átlag abiotikus aerob kontroll
>95%-os csökkenés
40 20 0
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
03.26.
04.02. 04.09. 04.16. Mintavételek időpontja
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
120
120 100 80
zöld növényi komposzt
60
25%-os csökkenés komposzt - áltag
40
abiotikus aerob kontroll
20 0 03.26.
04.28.
04.02. 04.09. 04.16. Mintavételek időpontja
04.28.
100
100
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
Kémiai analízis eredményei (1)
80
Duna iszap
60 40
Duna iszap - átlag abiotikus anaerob kontroll
12%-os csökkenés
20 0 03.26.
04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja
05.26.
80
rothasztott iszap
60 40
<5%-os rothasztott csökkenés iszap - átlag abiotikuskontroll) anaerob kontroll (szórás, abiotikus
20 0 03.26.
04.02. 04.09. 04.16. 04.28. Mintavételek időpontja
05.26.
Kémiai analízis eredményei (2) 600
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
500
ibuprofen visszapótlás
400
300
200
abiotikus kontroll
eleveniszap II - átlag 100
0
2009.08.11-én indított eleveniszapos kísérlet kémiai analízisének eredményei
Kémiai analízis eredményei (2) 600
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
500
400
300
eleveniszap I
ibu. visszapótlás
>95%-os csökkenés ◦ 1 hét alatt ◦ 5 napos lag fázis ◦ visszapótlás után 2 nap alatt
200
abiotikus kontroll
eleveniszap II - átlag 100
0
2009.08.11-én indított eleveniszapos kísérlet kémiai analízisének eredményei
Tenyésztéses vizsgálatok eredményei Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Shewanella, Wautersiella spp. 60
Flavobacterium sp. Genusok jelenlétének realtív aránya [%]
50
Pseudomonas sp.
40
Aeromonas sp.
30
Comamonas sp.
Stenotrophomonas sp.
20
Acinetobacter sp. 10
Shewanella sp.
0 2009.03.26.
12. napi minta 1. kísérlet 21 db izolátum
2009.08.11.
6. napi minta 2. kísérlet 36 db izolátum
Wautersiella sp.
Tenyésztéses vizsgálatok eredményei Pseudomonas, Flavobacterium, Aeromonas, Comamonas, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Shewanella, Wautersiella spp. Genusok jelenlétének realtív aránya [%]
60
55
Flavobacterium sp.
50
Pseudomonas sp.
40
Aeromonas sp.
34,70
Comamonas sp.
30
20
20
10
17,3
15 5
5
21,6
8,7
13
0 2009.03.26.
12. napi minta 1. kísérlet
Stenotrophomonas sp.
2009.08.11.
6. napi minta 2. kísérlet
4,3
Acinetobacter sp. Shewanella sp. Wautersiella sp.
Klónkönyvtár eredményei kiindulási minta 45
6. napi minta Flavobacteria
42%
41% 40
Sphingobacteria
35
Betaproteobacteria
30 25
27%
nem osztályzott, kitenyésztetlen
21%
20
18%
19% 19%
Alphaproteobacteria
15
Gammaproteobacteria
11% 10 5
Planctomycetacia
3%
1% 0 2009.08.11.
56 db klón
2009.08.17.
91 db klón
Spartobacteria
T-RFLP analízis eredményei [1]
2009.08.11. eleveniszap – kiindulási minta
2009.08.17. eleveniszap – 6. napi minta – ibuprofennel kezelt (300 mg/L)
T-RFLP analízis eredményei [2]
2009.08.11. eleveniszap – kiindulási minta
2009.08.17. eleveniszap – 6. napi minta – Na-acetátos biotikus kontroll
Ibuprofen koncentráció [mg/L]
T-RFLP analízis eredményei [3]
600 500
Irodalmi adatok
ibuprofen visszapótlás
400 300 200 100 0
abiotikus kontroll eleveniszap II - átlag
Az
ibuprofen
lebontása
egy
Sphingomonas
törzs által. (Forrás: Murdoch, R. W. – Hay, A. G., 2005)
Összefoglalás
ibuprofen lebontása csak aerob körülmények között jelentős
eleveniszapban ibuprofen teljes eltávolítása
300 mg/L-es ibuprofen koncentráció mellett is voltak mikroorganizmusok, melyek szaporodtak és az ibuprofen általi szelekciós nyomás hatására a közösség domináns tagjává váltak
T-RFLP és klónkönyvtár segítségével Sphingomonas sp. kimutatása
Jövőbeli célkitűzések
komposzt további vizsgálata
más szennyvíztisztító telepek és további környezeti minták közössége
ibuprofen bomlástermékeinek detektálása
funkciógének meghatározása
Sphingomonas sp. kitenyésztése - egyéb gyógyszerek
lebontásának vizsgálata a törzzsel
a kísérleti rendszerben más gyógyszermaradványok biodegradációja
Köszönetnyilvánítás
Mohr Anita - konzulens
ELTE Mikrobiológiai Tanszék
Környezettudományi Kooperációs Kutatóközpont
Tóth Blanka – BME, Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar
Köszönöm a figyelmet!
~
Metabolitok /1/
ibuprofen
karboxi-ibuprofen
hidroxi-ibuprofen
fenilpropionát Az ibuprofen humán metabolitjai (Forrás: Zwiener, C. et al., 2002)
Metabolitok /2/
ibuprofen
2-hidroxi-ibuprofen
1-hidroxi-ibuprofen
1,2-dihidroxiibuprofen Az ibuprofen T. versicolor általi lebontási útvonala (Forrás: Marco-Urrea, E. et al., 2008)
Az ibuprofen lebontása egy Nocardia sp. által (Forrás: CHEN, Y. – ROSAZZA, J. P. N., 1993)
Metabolitok /3/
Az ibuprofen lebontása egy Sphingomonas törzs által. a – ibuprofen; b – izobutilkatekol; c – 5-formil-2-hidroxi-7metilokta-2,4-dienoik sav; d – 2-hidroxi-5-izobutilhexa-2,4-dienedoik sav (Forrás: (MURDOCH, R. W. – Hay, A. G., 2005)
Vizsgálati módszerek {1}
kémiai analízis – LC-ESI-MS/MS ◦ cél: ibuprofen koncentrációjának meghatározása ◦ BME - Vegyészmérnöki és Biomérnöki Kar ◦ mintaelőkészítés: homogenizálás, centrifugálás ◦ automatikus mintaváltóval direkt injektálás ◦ eluens: acetonitril, ammónium-acetát
◦ elektrospray ionizáció ◦ tripla kvadrupol analizátor MRM üzemmód ◦ m/z szerint szétválasztás
Vizsgálati módszerek {2}
DNS izolálás ◦ cél: sejtalkotók és környezeti minta mátrixának eltávolítása és DNS kivonása a baktérium sejtekből ◦ közösségi minták – Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit ◦ tenyésztett törzsek - G-spin Genomic DNA Extraction Kit
PCR reakciók ◦ cél: DNS szálak amplifikálása ◦ 16S rRNS gén ◦ primerek: 27f, 27f-hex, 519r, 1492r, M13
Vizsgálati módszerek {3}
T-RFLP ◦ terminális restrikciós fragmenthossz polimorfizmus ◦ cél: közösségi mintázatok léterehozása
◦ fluoreszcens primerrel jelölt DNS ◦ restrikciós endonukleázokkal emésztés ◦ detektálás kapilláris elektroforézisben
◦ közösségben elváló csoportok felismerése és osztályozása, populációk azonosítása, mikrobiális változatosság és környezeti tényezők közötti összefüggés feltárása
Vizsgálati módszerek {4}
T-RFLP ◦ ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)
◦ elektrokinetikus injektálás ◦ Elválasztás: 30 perc, POP-4 polimer ◦ TAMRA 500, formamid ◦ GeneMapper v3.7 szoftver
Vizsgálati módszerek {5}
ARDRA ◦ amplifikált riboszomális DNS restrikciós analízis ◦ PCR reakció
◦ restrikciós enzimekkel emésztés ◦ etanol precipitálás ◦ elválasztás agaróz gélelektroforézissel ◦ klónok, tenyésztett törzsek csoportosítása
Mikrobiológiai vizsgálatok {1}
tenyésztéses vizsgálat ◦ 2009. 04.07. és 2009.08.17-ei minták ◦ párhuzamosak összekeverése – 3 x 1 ml + 27 ml fizsó ◦ hígítási sorozat ◦ 73 mg/L koncentrációjú ibuprofent tartalmazó R2A és nutrient táplemez ◦ 100 µl szélesztés – tisztítási sorozat ◦ kolóniák izolálása
DNS izolálás – ARDRA - T-RFLP - szekvenciaanalízis
Mikrobiológiai vizsgálatok {2}
közösségi vizsgálat ◦ minták: 2009.08.11., 14., 16., 17., 19., 21. ◦ közösségi DNS izolálás [Ultraclean Microbial DNA Isolation Kit (MoBio)]
◦ PCR: 27f-hex-519r primerek ◦ restrikciós emésztés: Alu, Bsh ◦ etanol precipitálás ◦ T-RFLP analízis
Mikrobiológiai vizsgálatok {3}
klónkönyvtár készítés ◦ 08.11. és 08.17. minták ◦ pGEM-T Easy Vector Systemmel (Promega) ◦ 27-519r PCR, tisztítás, ligálás, transzformálás, tenyésztés, kék-fehér próba, klónok felszedése, M13 PCR
ARDRA
T-RFLP
szekvenciaanalízis
Klónkönyvtár eredményei /1/
RDP Classifier internetes adatbázissal azonosítás
klónkönyvtár készítése során kapott eredmények: ◦ 2009.08.11. – 56 db klón ◦ 2009.08.17. – 91 db klón ◦ genus szintű besorolás – 500 bp
◦ tenyésztésbe nem vont törzsek kimutatása ◦ szennyvíztisztító telepekről izolálás
kiindulási és 6. napi minta összehasonlítása ◦ diverzitás változás ◦ új osztályok megjelenése
Klónkönyvtár eredményei /2/ Csoportreprezentánsok
%
Azonosítás [RDP adatbázis]
hasonlóság %
Osztály (classis) [RDP adatbázis]
Alu
Bsh
K-1
16 Flavobacterium sp.
100
Flavobacteria
235,94
102,37
K-3
9
100
Flavobacteria
66,99 és 232,13
103,98
K-6
11 Pedobacter sp.
91
Sphingobacteria
67,4
106
K-8
2
100
Betaproteobacteria
235
143
K-9
11 Sediminibacterium sp.
100
Sphingobacteria
207
396
K-13
11 Flavobacterium sp.
97
Flavobacteria
67,71
103,82
K-21
5
Zoogloea sp.
98
Betaproteobacteria
69,15
203-204
K-30
4
Bacteroidetes phylum
95
Flavobacteria
146,57
203-204
K-37
2
Flavobacterium sp.
100
Flavobacteria
450
103,92
K-44
2
Simplicispira sp.
90
Betaproteobacteria
146,57
203-204
K-51
2
Hydrogenophaga sp.
90
Betaproteobacteria
69,97
193,7
K-5, 45
13 kitenyésztetlen törzs ’P’
140
93
K-27
2,5 kitenyésztetlen törzs 1
233
208
K-55
2,5 kitenyésztetlen törzs 2
203
289
9
Flavobacterium sp.
Thauera sp,
nem azonosítható
Klónkönyvtár eredményei /3/ Szekvenált klónok
%
Azonosítás
hasonlóság
Osztály (classis)
[RDP adatbázis]
%
[RDP adatbázis]
Alu
Bsh
K-1
37,4
Sphingobacteriales rend
97
Sphingobacteria
237,53
389,48
K-2
4,4
Zoogloea sp.
100
Betaproteobacteria
68,22
383,64
K-3
3,3
Comamonas sp.
Betaproteobacteria
152,23
383,34
K-4
1,1
Prosthecobacter sp.
Spartobacteria
383,34
228,12
K-5
2,2
Thaurea sp.
Betaproteobacteria
150,11
203,67-204,69
K-6
3,3
Pseudomonas sp.
100
Gammaproteobacteria
67,91
383,98
K-8
18,7
Sphingomonadaceae család
100
Alphaproteobacteria
206,65
92,14
K-9
4,4
Gammaproteobacteria osztály
94
Gammaproteobacteria
231,47
62,08
K-10
8,8
Acinetobacter sp.
100
Gammaproteobacteria
82,24
387,09
K-14
4,4
Chitinophagaceae család
95
Sphingobacteria
67,64
388,09
K-35
1,1
Achromobacter sp.
100
Betaproteobacteria
150,22
143,23
K-41
4,4
Comamonadaceae család
100
Betaproteobacteria
147,12
202,53-203,8
K-47
3,3
Planctomycetaceae család
97
Planctomycetacia
423,68
136,45
K-54
2,2
Methylotenera sp.
95
Betaproteobacteria
185,65
385,96
K-83
1,1
Xanthomonadaceae család
100
Gammaproteobacteria
242,79
55.0-55.85
100
Klónkönyvtár eredményei /4/ Flavobacterium sp.
3%
2%
2% 2% 2%
kitenyésztetlen törzsek "P"
16%
Flavobacterium sp.
5%
Pedobacter sp.
5%
Sediminibacterium sp.
13%
Flavobacterium sp. nem azonosítható
9%
Zoogloea sp.
kitenyésztetlen törzsek 1, 2
9%
11%
Bacteroidetes phylum Thauera sp,
11%
10%
Flavobacterium sp. Simplicispira sp. Hydrogenophaga sp.
Klónkönyvtár eredményei /5/ Sphingobacteriales order 3%
2%
2% 1%1%1%
Sphingomonadaceae family Acinetobacter
3%
Zoogloea sp.
3% 37%
4%
Gammaproteobacteria class Chitinophagaceae family Comamonadaceae family
5%
Comamonas sp. 5%
Pseudomonas sp. Planctomycetaceae family
5%
Thaurea sp. 9%
Methylotenera 19%
Prosthecobacter sp.
Achromobacter Xanthomonadaceae family
