Az energiaforgalom és az intracelluláris kalcium koncentráció kapcsolata gyors és lassú izomban
DOKTORI ÉRTEKEZÉS
Témavezeto: Dr. Ligeti László
Dr. Bátkai Sándor SEMMELWEIS EGYETEM KLINIKAI KÍSÉRLETI KUTATÓ- ÉS HUMÁN ÉLETTANI INTÉZET
Budapest, 2002
Tartalomjegyzék ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................... 4 SUMMARY .......................................................................................... 5 1. Bevezetés ........................................................................................ 6 2. Célkituzés....................................................................................... 8 3. Irodalmi háttér................................................................................ 9 3.1. Az emlos vázizomrostok típusai, rostklasszifikáció .................... 9 3.1.1 Történeti háttér .................................................................... 9 3.2.1. A szöveti vérellátás, a mikrocirkuláció jellegzetességei ...... 14 3.2.2. Elektrofiziológiai különbségek ........................................... 17 3.2.3. Kontraktilis enzimrendszer rostspecifikus eltérései........... 19 3.2.4. Metabolikus eltérések........................................................ 23 3.2.5. [Ca2+]i homeosztázis rostspecifikus jellegzetességei ........... 25 3.2.5.1. Kalcium szintet szabályozó receptorok, csatornák.......... 29 3.2. Rostspecifikus eltérések kórélettani aspektusai ...................... 36 3.2.1. Iszkémiás érzékenység....................................................... 36 4. Módszerek..................................................................................... 39 4.1. Módszertani áttekintés............................................................ 39 4.1.1. [Ca2+]ic -mérés áttekintése................................................... 39 4.1.2. NADH mérés áttekintése.................................................... 42 4.2. A méro rendszer felépítése ....................................................... 43 4.2.1. Az intravitál-mikroszkóp.................................................... 43 4.2.2. A lézer-Doppler méroegység............................................... 45 4.3. A vizsgált paraméterek. ........................................................... 45 4.3.1. A kapilláris keringés meghatározása ................................. 45 4.3.2. Szöveti áramlás meghatározása ......................................... 46 4.3.3. Az intracelluláris szabad kalcium szint ............................. 46 4.3.4. NADH fluoreszcencia mérése ............................................. 46 4.4. Kísérleti modell........................................................................ 47 4.4.1. Anesztézia, mutéti elokészítés ........................................... 47 4.4.2. Aorta ligatúra .................................................................... 47 4.4.3. Az izmok preparálása ........................................................ 48 2
4.4.3.1. Intravitál mikroszkópos preparátum .............................. 48 4.4.3.2. Kontrakúrás küszöb meghatározása .............................. 49 4.5. Felhasznált vegyszerek............................................................ 50 4.5.1. Indo-1 AM.......................................................................... 50 4.5.2. A felhasználásra került egyéb vegyszerek, oldatok............. 50 4.6. Kísérleti protokoll.................................................................... 50 4.6.1. [Ca2+]ic -szint mérések......................................................... 50 4.6.2. NADH fluoreszcencia mérése ............................................. 51 4.7. Adatfeldolgozás, statisztikai analízis ....................................... 51 5. Eredmények.................................................................................. 53 5.1. Iszkémia hatására bekövetkezo változások .............................. 53 5.1.1. Véráramlás az izmokban ................................................... 53 5.1.1.1. Szöveti véráramlás.......................................................... 53 5.1.1.2. Kapilláriskeringés........................................................... 53 5.1.2. Anyagcsere változás........................................................... 55 5.2. Kalcium-szint mérése az izmokban ......................................... 57 5.2.1. Az Indo-1 szöveti kinetikája............................................... 57 5.2.2. A koffein által kiváltott fluoreszcens hányadosváltozás ..... 59 5.3. A koffein hatása az izomfeszülésre .......................................... 61 6. Megbeszélés.................................................................................. 62 6.1. Metodikai kérdések ................................................................. 62 6.1.1. Izmok kiválasztása ............................................................ 62 6.1.2. Epiiluminációs intravitálmikroszkópia .............................. 63 6.1.3. Intracelluláris kalciumszint mérése ................................... 63 6.2. Az izomrost-típusok összehasonlítása ..................................... 64 6.2.1. Iszkémia hatása az izomrostok anyagcseréjére .................. 65 6.2.2. A [Ca2+]ic -szint változás rostspecifikus eltérései ................. 67 7. Következtetések ............................................................................ 72 8. Köszönetnyilvánítás ...................................................................... 73 9. Rövidítések.................................................................................... 74 10. Irodalomjegyzék.......................................................................... 76 11. Saját közlemények jegyzéke ........................................................ 96 3
ÖSSZEFOGLALÁS Az energiaforgalom és az intracelluláris kalcium koncentráció kapcsolata
gyors
és
lassú
izomban.
Dr.
Bátkai
Sándor,
témavezeto: Dr. Ligeti László, Semmelweis Egyetem, Klinikai Kísérleti Kutató és Humán Élettani Intézet, 2002. Vizsgálataink célja a harántcsíkolt izom jellegzetes rosttípusainak össze hasonlítása volt, különös tekintettel az intracelluláris kalcium [Ca2+]ic homeosztázisra. Az egyes rosttípusok élettani és kórélettani jellemzoi jelentosen különböznek, de az intakt rostok szintjén ismereteink rendkívül korlátozottak. Intravitál mikroszkópia és az Indo-1 hányados-módszer összekapcsolásával olyan kísérleti modellt fejlesztettünk
ki,
mely
lehetové
teszi
a
szöveti
[Ca2+]ic -szint
változásainak kép formában történo megjelenítését, valamint a mikrocirkuláció állapotának egyide ju tanulmányozását intakt, eredeti helyzetében magtartott patkány harántcsíkolt izmokon. Kísérleteinket a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó m. soleus (SOL) és a túlnyomóan gyors rostokat tartalmazó m. extensor digitorum longus (EDL) patkány izmokban végeztük. Megvizsgáltuk az alsó végtagot érinto érelzáródás hatását a makro- és a mikrocirkuláció szintjén és összehasonlítottuk az iszkémia és a reperfúzió hatását az egyes izmok anyagcsere állapotára a kétféle izomban. Közismert a rosttípusok iszkémia iránti eltéro érzékenysége, melynek hátterében a kalciumhomeosztázis
rosttípus
függo
jellegzetességei
állhatnak.
Összehasonlítottuk a koffein hatására bekövetkezo [Ca2+]ic szint változás dinamikáját a lassú és a gyors rostokat tartalmazó izmokban. Összefoglalva
elmondhatjuk,
hogy
in
vivo
kísérleteinkben
a
túlnyomóan lassú-típusú rostokat tartalmazó SOL érzékenyebb volt mind a [Ca2+]ic változás, mind pedig a kontraktúra szempontjából koffeinre, mint a túlnyomóan gyors-típusú rostokat tartalmazó EDL.
4
SUMMARY The dynamics of intracellular calcium and tissue metabolism in intact slow- and fast-twitch skeletal muscle fibers. Sándor Bátkai M.D., Scientific advisor: László Ligeti M.D., Ph.D., Semmelweis University,
Institute
of
Human
Physiology
and
Clinical
Experimental Research, 2002. The understanding of the fiber-specific differences under physiological and
pathophysiological
conditions,
e.g.
ischemia-reperfusion, in
skeletal muscle is hampered by the lack of data gained from intact muscles. We describe an in vivo model for studying the dynamics of tissue metabolism and free [Ca2+]i in intact fast-twitch extensor digitorum longus (EDL) and the slow-twitch soleus (SOL) muscles of anesthetized rat. We developed a system based on an intravital microscopy using incident light combined with the Indo-1 ratiometric method in order to measure the microcirculation, metabolic state by tissue fluorescence and free [Ca2+]i combined. Fluorescence images were collected by means of a digital camera. We compared the effect of infrarenal
ischemia
and
reperfusion
on
the
macro-
and
microcirculation as well as tissue metabolism in fibers of different types. We also assessed the dynamics of free [Ca2+]i changes in mammalian slow- and fast-twitch muscles in vivo using caffeine superfusion. We assumed that differences in sensitivity between the two muscle types for this substance reflect differences in intracellular Ca2+ handling in the fibers of which these muscles consist. Caffeine induced a concentration-dependent increase in free [Ca2+]i and revealed differences in caffeine sensitivity between the muscle types, with the SOL being more sensitive. We may conclude that the dynamics of free [Ca2+]i can be assessed reliably in intact mammalian muscle in vivo.
5
1. Bevezetés
A harántcsíkolt izom legfobb jellegzetessége a változatosság. Ennek titka a szerkezetében rejlik, minden egyes izom mozaikszeruen épül fel különbözo tulajdonságú rostokból. Ez minden egyes izomra igaz és ez a nagyfokú heterogenitás nélkülözhetetlen a muködésükhöz. Minden állatfajtában
az
izmoknak
tág
határok
közötti
funkcionális
feladatokkal kell megbirkózniuk. Ha a különféle fajokat hasonlítjuk össze, még tovább szélesedik ez a határ. A funkcionális flexibilitás teremti meg annak a lehetoségét, hogy az izmok képesek elvégezni az olyan feladatokat, mint például a testtartás biztosítása, valamint különbözo hosszúságú és erosségu kontrakciók kialakítása. Ezek lehetnek repetitív szubmaximális vagy, az ezekkel váltakozó eros, maximális összehúzódások. Ez a képesség két faktornak köszönheto: a hatékony és precíz idegi kontroll, valamint az a tény, hogy az egyes izmok különféle rosttípusokból épülnek fel, és ezek a rostok mind önálló tulajdonságokkal rendelkeznek. Az összetevo rostok típusa és aktuális
aránya
határozza
meg
az
izom
általános élettani és
kórélettani tulajdonságait. Nincs két egyforma izom, még egy adott faj egyedei
között
sem.
Minden
izom
egyedinek
tekintheto
a
rostösszetétele alapján. Az
izomélettani
kísérletek
eredményeinek
elemzésénél
sokszor
háttérbe szorulnak a rosttípusok közötti különbségek, ezek nélkül pedig nem tárható fel a harántcsíkolt izom igazi strukturálisfunkcionális komplexitása. Csak az utóbbi 15 évben vált igazán világossá, hogy az izom sokrétuségének alapja a rostok kontraktilis és az
energetikai
apparátusának heterogenitása. Mai szemléletünk
szerint az izomrostok osztályozása miozin alfajtáinak kimutatására épül. Mitöbb bebizonyosodott, hogy a legtöbb miofibrilláris és anyagcsere
folyamatokban
résztvevo
rendelkezik. 6
fehérje
számos
alfajtával
A rostok sokfélesége biztosítja, hogy a harántcsíkolt izmok képesek a legkülönfélébb környezeti hatásokhoz megfeleloen alkalmazkodni. Jelentos különbségeket figyelhetünk meg a különféle izok - többek között - megváltozott oxigén és tápanyagellátáshoz (krónikus hipoxia, isémiás
érzékenység)
valamint
anyagcserezavarokhoz
(diabétesz,
veleszületett enzimdefektusok) történo alkalmazkodásában. A fiziológiai kutatás célja, hogy a vizsgálataink során minél kisebb beavatkozással minél több információt nyerjünk. Az anyagcsere és keringésszabályozási folyamatok rostszintu tanulmányozására számos metodikát dolgoztak ki az elmúlt évtizedben. Az izolált sejteken vagy perfundált szöveteken végzett vizsgálatok eredményei alapvetok a sejtszintu mechanizmusok megértéséhez. De nélkülözhetetlenek az in vivo és különösen intakt modellek olyan kórélettani helyzetekben, amelyek nem modellezhetoek in vitro, például iszkémia, malignus hipertermia, diabetesz. Különösen igaz ez az intracelluláris szabad kalcium élettani és kórélettani szerepének teljes megértésénél.
7
2. Célkituzés
1. Intravitál mikroszkópia felhasználásával olyan kísérleti modell kifejlesztését tuztük ki célul, mely lehetové teszi a szöveti [Ca2+]i -szint változásainak kép formában történo megjelenítését, valamint
a
mikrocirkuláció
tanulmányozását
intakt,
eredeti
állapotának
egyideju
helyzetében
magtartott
patkány harántcsíkolt izmokon. 2. Megvizsgáljuk az alsó végtagot érinto érelzáródás hatását a makro- és a mikrocirkuláció szintjén a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó m. soleus (SOL) és a túlnyomóan gyors rostokat tartalmazó m. extensor digitorum longus (EDL) patkány izmokban. 3. Összehasonlítsuk az iszkémia és a reperfúzió hatását az egyes izmok anyagcsere állapotára a kétféle izomban. 4. Összehasonlítsuk a koffein hatására bekövetkezo [Ca2+]ic szint változás dinamikáját a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó m. soleus (SOL) és a túlnyomóan gyors rostokat tartalmazó m. extensor digitorum longus (EDL) izmokban.
8
3. Irodalmi háttér
3.1. Az emlos vázizomrostok típusai, rostklasszifikáció A emlosök harántcsíkolt izomszövetét érinto anyagcsere -folyamatok molekuláris szintu összefüggéseinek egyre mélyebb ismerete rávilágít az izmokat felépíto különbözo rosttípusok közötti alapveto élettani és kórélettani különbségekre is. 3.1.1 Történeti háttér Az emlosök vázizomzatát felépíto fázisos típusú rostokat jelemzo tulajdonsággaik alapján osztályozhatjuk (1. Táblázat). A múlt század végén ismerték fel, hogy a vázizmokat többféle rosttípus építi fel. 1873-ban Ranvier volt az, aki elsoként különböztetett meg vörös és fehér izmokat (155). Nemsokkal Grützner (1883) és Knoll (1891) fénymikroszkóp
segítségével
„átlátszó”
és
„homályos”
egyedi
izomrostokat írt le a hisztológiai témájú muveikben (96). Néhány évtizeddel késobb Krüger (1952) foglalta össze a két fo vázizomrosttípus szöveti jellegzetességeinek korabeli ismereteit (108). A 20-as évektol folyamatosan fejlodo morfometriai, mikrofotográfiás mérések mellett hisztokémiai, immunhisztokémiai technikák, valamint ezek összekapcsolása
fiziológiai-biomechanikai
mikromódszerekkel,
segítették elo a rosttípusok sokféleségének felismerését és jellemzését (131, 147, 148, 149, 150). Az utóbbi években molekulárbiológiai módszerekkel identifikálták az izmokban található fehérjék különféle változatait és mennyiségi különbségeit. paraméterei
Mai
ismereteink
folyamatos
szerint
átmenettel,
a
rostok
széles
funkcionális
határok
között
változhatnak. Az izomrostok sokfélesége a gének szabályozásán alapszik, ennek két fo mechanizmusát különböztethetjük meg. Az 9
egyik kvalitatív, az izom fehérjéinek nagyon hasonló, de mégis különbözo alfajtáira, az izoformákra épülo mechanizmus. Az egyes izoformák lehetnek ugyanannak a génnek (‘alternative splicing’), vagy egy géncsalád különféle génjeinek (‘isogene’) a termékei. A másik mechanizmus kvantitatív, a génexpresszió mennyiségi szabályozásán keresztül valósul meg. Az egyes géntermékek mennyiségi eltérései új funkcionális és strukturális jelenségeket hozhatnak létre. Az így létrejött variációk száma mégis korlátozott, melynek oka strukturális követelményekben és az expresszió bonyolult szabályozásában rejlik. Az így megfigyelheto kombinációk az egyes fenotípusokban öltenek testet. Mindenféle rosttípus-meghatározás célja, hogy azokat a jellegzetes fehérjekombinációkat mutassa ki, melyekkel az egyes fenotípusok rendelkeznek. 3.1.1.1. Hisztokémiai, enzimatikai módszerek Az izomrostokat osztályozhatjuk az enzimatikus aktivitás alapján. Ezekkel a módszerekkel csak néhány nagy rosttípust-alosztályt tudunk elkülöníteni. A jelenleg használatos hisztokémiai módszerek két párhuzamos enzimaktivitás-meghatározásra épülnek. Az egyik a miofibrilláris aktomiozin trifoszfatáz (miozin ATP-áz) aktivitás, a másik az aerob vagy anaerob metabolikus aktivitás meghatározására épül. Az elobbi módszer kidolgozása Padykula nevéhez fuzodik, a másik Ogata felismerésére alapul (139, 138). A miozin ATP-áz aktivitás alapján - Engel (1962) javaslatára - vezették be két fo rosttípus, az I (kis-) és a II (nagy ATP-áz aktivitású) típusú rost elkülönítését (47). A kimutatási érzékenysége
eljárást alapján
továbbfejlesztették, felosztást
a
az
enzimreakció
késobbiekben
pedig
pH-
tovább
finomították (IIA, IIB, IIC, IIX, IC, IIAB, IIAC) (Brook és Kaiser, 14, 40, 175).
10
A rosttípusok osztályozása alapvetoen a miozin ATP-áz aktivitás meghatározásán alapszik. Bárány alapveto kutatásai alapján a lassú és a gyors izmokban megtalálható miozin fajták a kalciumfüggo miozin ATP-áz aktivitása alapján osztályozhatjuk (8). Kimutatta, hogy
a
miozin ATP-áz aktivitása jól korrelál az egyes rostok kontrakciójának sebességével.
Felismerései
alapján
vált
világossá,
hogy
az
enzimhisztokémiai jellegzetességek kapcsolatba hozhatók az egyes rostok kontraktilis tulajdonságai között milyen kapcsolat van (6, 16). A másik fent említett alapveto enzimhisztohisztokémiai eljárás, melyet a rostok osztályozására alkalmaznak, a specifikus aerob (szukcinát dehidrogenáz, citokróm oxidáz, NADH-reduktáz) és anaerob (glikogén foszforiláz,
glicerofoszfát
dehidrogenáz)
referencia-enzimek
aktivitásának meghatározásán alapul. A rostok aerob enzimaktivitása alapvetoen a mitokondrium mennyiségi különbségeinek felel meg, mely elsosorban a rostok oxidatív kapacitásával függ össze (138, 139). Az enzimhisztokémiai módszerek kombinációja további rosttípus alfajták leírását teszi lehetové. A rostok metabolikus enzimaktivitása aerob-oxidatív és anaerob-glikolitikus kapacitás - alapján a gyors rostokat további két alcsoportra lehetett osztani. A kétféle anyagcsere jellemzo (a miozin ATP-áz aktivitás és a metabolikus enzimaktivitás) jól
korrelál,
ezek
kombinációjával
már
háromféle
rosttípust
különböztethetünk meg. Ezek a gyors glikolitikus (fast-twitch glycolitic FG), a gyors oxidatív-glikolitikus (fast-twitch oxidative -glycolitic FOG) és a lassú oxidatív (slow-twitch oxidative SO) klasszikus altípusok. (6, 143). Ez a felosztás vált a rosttípusok osztályozásának általános alapjává. Néhány szót szentelni kell a klasszifikáció korlátaira is. A ma általánosan használt Brook és Kaiser féle és a metabolikus tipizálás összekapcsolása (SO, FOG és FG) különbözo hisztokémiai módszerek párhuzamos használatán alapul. Hangsúlyozni kell, hogy a miozin 11
ATP-áz és a metabolikus paraméterek kapcsoltságát máig sem tudták igazolni. Nehezen szorítható az osztályozás keretei közé, hogy az I, IIA, IIB
típusú
rostok
aerob
kapacitásában
a
metabolikus
enzimvizsgálatok nagy átfedéseket mutattak ki (132, 133, 157, 145, 146). Az egyes izmok és rostjainak anyagcsere jellemzoit az izom fejlettségi stádiuma, eredete, az állat neme és edzettségi állapota határozza meg. Az ebbol adódó különbségek tovább korlátozzák az osztályozás használatát. A legújabb adatok alapján a rostokban található különbözo miozon nehézlánc alfajták és a rost metabolikus enzimrendszerének aktivitása között sincs szoros összefüggés (148). Az
enzimrendszerek
kimutatására
szolgáló
módszerek
fejlodése
lehetové tette, hogy a fenti klasszifikációt kiegészítve meghatározzák a legkülönbözobb strukturális és funkcionális fehérje mennyiségét és összetételét az egyes rosttípusokban. Az utóbbi években molekuláris biológiai
módszerekkel
azonosították
az
egyes
enzimrendszerek
rostokra jellemzo alfajtáit. Mai ismereteink szerint ezek az alfajták képezik a rostok közötti funkcionális különbségek alapját. A legújabb rosttípus osztályozás
a
miozin
nehéz
lánc
egyes
izoformáinak
elkülönítésén alapszik, ezzel a módszerrel az I. és a II. típusú rostok számos
további
alosztályát
tudták
részletesen.)
12
leírni
(147).
(Lásd
késobb
"Fibrillenstruktur"
Beta (alkali labile, acid stabile)
IIA
L ("világos")
Alpha (savérzékeny, lúgálló)
Formaldehid rezisztens
C ("sötét")
Fehér
IIB
M ("átmeneti")
Alpha-beta (átmeneti)
Formaldehid érzékeny
A ("világos")
Kutya, ember, egér, nyúlt, patkány, majom; hisztológia Aranyhal, ember, galamb, patkány; hisztokémia Ember; hisztokémia (mATP-áz) Patkány; hisztokémia (szukcinát dehidrogenáz aktivitás) Macska, nyúl, patkány; hisztokémia (ATP-áz, formaldehid) Macska, patkány; hizstokémia (mATPáz) Patkány; hisztokémia (mATP-áz)
(módosítva, Berchtold et al. Calcium ion in skeletal muscle Physiol.
Hisztokémiai-ultrastrukturális osztályozás
II Típus
D ("sötét")
Vörös
IIA3
Patkány; immunohisztokémia, biokémia, MHC
Ember, nyúl, patkány; hisztokémia (mATP-áz) Patkány; ultrastruktura Kutya, ló, nyúl, patkány; hisztokémia (mATP-áz, savérzékenység) Patkány; hisztokémia, biokémia, morfometria 2B-MHC
Ember, patkány; hisztokémia, immunohisztokémia, biokémia, SDS-PAGE, RT-PCR
kapcsolat, de az egyes osztályok nem felcserélhetok.
"Felderstruktur" I Típus ATP-áz aktivitás magas
I
IIA2
IIB
2X-MHC
MHC IIB
Egér, patkány, nyúl; hisztokémia, immunohisztokémia, biokémia, MHC, morfometria
13
ATP-áz aktivitás alacsony
Átmeneti IIA1
IID/IIX
2A-MHC
MHC IIX
IIb
Rev. 2000 80:1215-1265)
B ("átmeneti")
I IIA
I-MHC
MHC IIA
IId/IIx
MHC izoforma osztályozás
I
MHC I
IIa
Egér, patkány; fiziológia (kalcium/stroncium aktivációs karakterisztika)
Nyúl; fiziológia
Nyúl, ember, egér; hisztológia, fiziológia Nyúl; biokémia Aranyhörcsög; hisztokémia, biokémia, fiziológia Egér, nyúl; hisztokémia, kluszter analízis
I
Magas miozin ATP-áz aktivitás "Vörös" gyors rángású oxidatív "Fehér" gyors rángású glikolitikus (FG) glikolitikus (FOG)
Fázisos
Élettani - anyagcsereállapot osztályozás
Alacsony miozin ATP-áz aktivitás "Átmeneti" lassú rángású oxidatív (SO)
Gyors, alapvetoen oxidatív (FO)
Tónusos
Lassú, alapvetoen oxidatív (SO)
FR Típusú, gyorsan összehúzódó, "fatigue"-rezisztens
Lassú (pCa 50 pSr50 > 1.0)
Gyors oxidatív Gyors, alapvetoen glikolitikus (FOG) glikolitikus (FG) FF Típusú, gyorsan összehúzódó, "fatigue"érzékeny
S Típusú, lassan összehúzódó, "fatigue"-rezisztens Gyors (pCa 50 pSr50 < 0.7)
1. Táblázat. A különféle rosttípus-osztályozások összefoglalása. Az egyes
osztályokban a csoportok között nincs átfedés. Az osztályozások között van
3.2. Fiziológiás jellegzetességek rostspecificitása Ebben a fejezetben az élettani jellemzok rostspecifikus eltéréseinek hátterét vizsgálom meg – a keringés, az anyagcsere, kalciumszint szabályozás és a kontrakciós tulajdonságok tükrében. 3.2.1. A szöveti vérellátás, a mikrocirkuláció jellegzetességei 1874-ben hívta fel a figyelmet eloször Ranvier a vörös és a fehér izmok megfigyelheto
kapillárishálózatok
eltéréseire
(155).
Izomélettani
szempontból szükséges a harántcsíkolt izomrostok és a szövevényes kapillárishálózat közötti térbeli viszony leírására, ennek többféle megközelítése is létezik. Morfometriás vizsgálatok alkalmazásával olyan
fiziológiás
paramétereket
kaphatunk,
melyek
jellemzik
a
haráncsíkolt izomszövet oxigén- és tápanyagellátásának maximális térbeli potenciálját. Az izomrostok és a kapillárishálózat viszonyát leíró hagyományos paraméterek csak kétdimenziósak, ezeknél az izom kereszt- vagy hosszmetszeti felszínét vesszük alapul. Ilyen jellemzo a kapilláris denzitás, melyet Krogh vezetett be, aki a kapilláris-élettani kutatásaiért Nobel díjjal jutalmaztak (107). A kapilláris denzitás megadja, hogy mennyi az egy adott rosttal érintkezo kapillárisok számának és a rost keresztmetszeti felszínének az aránya. Másik klasszikus méroszám, melyet szintén általánosan használnak, az egységnyi felületen megszámolt kapillárisok és rostok hányadosa. A közelmúltban háromdimenziós
kidolgoztak
bonyolultabb,
heterogenitását
is
a
kapillárishálózatot
figyelembevevo
komplex
modelleket is (123, 124, 125). A kapillárisok és a rostok az izmok jelentos részében nem párhuzamosan futnak, a kapillárisok lefutása a nyugalmi
izomban
spirálszeru,
többszörösen
csavart,
a
keresztmetszeti síkot többször is átmetszi. Ez a bonyolult szerkezet különösen a nagy oxidatív kapacitású vörös izmokban figyelheto meg,
14
ahol a felcsavartság mértéke nem a szarkomérhossz függvénye, hanem a rost oxidatív kapacitásával állítható párhuzamba. A m. soleus és a m. extensor digitorum longus izmok - mint két, jellegzetes, viszonylag homogén rosttípusokat tartalmazó izom - eltéro mikrovaszkuláris architektúráját részletesen leírták, kétdimenziós, újabban pedig háromdimenziós paraméterekkel (1. Ábra) (196, 109) A SOL izomban a rostokra jutó kapilláris elágazódások száma és a rosthosszúságra számított kapillárishosszúság nagyobb, mint az EDLben. Eznkívül az egységnyi rostfelszínek területe és a rostok térfogata is nagyobb ebben az izomtípusban. Nincs viszont különbség az egységnyi
rostfelszínre
vagy
rosttérfogatra
jutó
kapillárisok
hosszúsága, valamint az egységnyi kapillárishosszra jutó kapilláris elágazódások számában.
1. Ábra. Az izomrost és az azt ellátó kapillárisok 3 dimenziós modellje. A tipikus
térbeli
elhelyezkedést
számítógéppel
rekonstruálták.
a)
SOL
(rosthosszúság: 70 µm, rostátmérõ: 60 µm), b) EDL (rosthosszúság: 80 µm, rostátmérõ: 50 µm) (in Kubinova et al. Three-dimensional study of the capillary supply of skeletal muscle fibres using confocal microscopy J Muscle Res Cell Motil 2001;22(3):217-27)
15
A
különbségeket
összefoglalva
a
SOL
kapillárishálózatában
a
különbözo rendu érelemek rövidebbek és több az elágazódás. Ebben az izomtípusban a kapillárishálózat kompaktabb, mint a SOL-ban. A kapillárisok alapveto feladata a szöveti oxigén és tápanyagellátás. Az aerob aktivitású izmokban biztosítani kell a muködésbol adódó nagyfokú oxigénigényt. A glikolitikus izmokban az oxigénellátás biztosítása mellett más feladatok is elotérbe kerülne, például az anyagcseretermékek
elszállítása
–
laktát
-
is
(79,
80).
A
mikrocirkuláció felépítése a rosttípusok eloszlásával áll kapcsolatban. Alapveto
összefüggés
mutatható
ki
az
izomrostok
anyagcsere-
aktivitása és a kapillárishálózat szerkezete között. Az egyes izmokban a közvetlen kapcsolat kimutatása rendkívül bonyolult, tekintettel a fent részletezett, az izmok heterogén rostösszetételre. Az izmokat felépíto rostok közötti kapilláris-ellátottságot két tényezo határozhatja meg, a rost típusa, vagyis az anyagcsere jellemozoi vagy pedig a rost mérete. Ez a sokat vizsgált kérdés, hogy aketto közül melyik a meghatározó, máig sincs igazán eldöntve. (81, 82, 1, 43, 44) A haráncsíkolt izom élettani és kórélettani muködését meghatározza, hogy
a
kapilláris
hálózat
hogyan
képes
adaptálódni
különféle
hatásokra, például fokozott igénybevétel, vagy kóros változásokra úgy, mint krónikus hipoxia, hipertónia, veseelégtelenség, vagy diabétesz (185, 186). A szöveti túlélést alapvetoen az határozza meg, hogy a kapilláris
hálózat
hogyan
képes
újraképzodni,
miként
tud
a
megváltozott körülményekhez igazodva átszervezodni („remodelling”) (188). Ennek megértéséhez meg kell találni azokat a meghatározó tényezoket, amelyek szerepet játszanak. Számos újabb adat arra utal, hogy a harántcsíkolt izmokban az angiogenezis és az oxidatív anyagcserefolyamatok
megváltozása
egymástól
független.
Így
elofordulhat, hogy a kapillarizáció nagyobb lesz egyes glikolitikus izmokban, mint az oxidatív izmokban. Ebbol arra következtethetünk, hogy az izmoban kapilláris hálózat véráramlása elso sorban az 16
anyagcsretermékek eltávolításával áll szoros kapcsolatban, míg az oxigén- és szubsztrátellátástól független (44, 36). Az izmokban a kapilláris-suruség inkább az izomrost méretével mutat összefüggést. 3.2.2. Elektrofiziológiai különbségek 3.2.2.1. Motoros egység Patkány motoros egységek vizsgálata alapján három fo rostosztályt különítettek el az izometrikus összehúzódások ideje alapján: gyors, közepes és lassú (23, 110). E felosztás hátterében az ioncsatornák eltéro eloszlása áll, amit késobb részletesen tárgyalunk. 3.2.2.2. Motoros véglemez A rostok elektrofiziológiai tulajdonságaiban számos rostspecifikus eltérést ismerünk. Bár ezek funkcionális következményei egyelore kevéssé ismertek. Feltuno eltérés figyelheto meg a motoros véglemez méretében, mely a lassú típusú rostokban nagyobb, mint a gyors rostokban. A nagyobb felület lehetové teszi, hogy az akciós potenciál keletkezésénél nagyobb szinaptikus áram alakulhasson ki ezekben a rostokban. A gyors rostokban a Na+-csatornák nagyobb suruségébol következik, hogy az akciós potenciál küszöbértéke alacsonyabb (159) (–lásd 3.2.2.4 Fejezet). Jelentos eltérés figyelheto meg a kifáradási jelenség fellépésében az egyes rostok között. A szarkolemma ingerelhetosége az ismételt ingerléssorozatok során rosttípusonként változik, mely a gyors rostokban lényeges szerepet játszik, míg a lassú rostokban alig (177, 178). Továbbá megfigyelték, hogy az extracelluláris Ca2+ nemcsak a Ca2+csatornákon, hanem a Na+-csatornákon is képes a sejtbe jutni. A két rosttípus közül a gyors rostokban van ennek funkcionális jelentosége. 17
Ezt a jelenséget (slip-mode conductance) ki lehet váltani a csatorna agonista veratridinnel és gátolni tetrodotoxinnal. Ugyanezt a jelenséget kiváltja tartós ingerlés is. 3.2.2.3. A Na+/K+ pumpa A Na+/K+ pumpa a és ß alegységeinek 3-3 alfajtája ismert. Az egyes alfajták
elofordulása
és
a
szöveti
oxidatív
kapacitás
szoros
kapcsolatban áll egymással, rosttípus specificitást mutatnak (84). Az egyes alfajták között viszont nem tudtak funkcionális különbséget kimutatni (48). A SOL és EDL izmokon végzett összehasonlítások alapján a Na+/K+-pumpa surusége hasonlónak mutatkozott, bár a mérések
során
nem
vették
figyelembe
a
rostfelületek
közötti
különbséget. Továbbá a Na+/K+ pumpa mennyiségével egy anyagcsere komponens, az oxidatív potenciál korrelál, nem pedig a rostokra jellemzo kontrakciós sebesség. 3.2.2.4. Nátrium csatorna A
rosttípusok
között
jelentos
elektrofiziológiai
különbségek
mutathatók ki. A harántcsíkolt izom ingerelhetoségét alapvetoen meghatározza
a
membrán
nátrium
csatornáinak
surusége
és
regionális aránya. Harántcsíkolt izomban egyféle Na+-csatornát kódoló gént mutattak ki. A Na+-csatornák a rost membránjában nem egyenletes
oszlanak el, a legmagasabb arányban a véglemezen és
közvetlen környékén találhatók. Hennenan kimutatta, hogy a motoros egység tüzelési frekvenciája nagyobb a IIB típusú rostokban, mint a IIA -ban, és a legkisebb a lassú I típusú rostokban (76). A motoros egység korábban említett fáradási jelensége is hasonló képet mutat: a IIB rostok a legérzékenyebbek, és I típusú rostok a legellenállóbbak. A leadási frekvencia különféle típusai specifikus membrán-ingerelési tulajdonságot követelnek meg a lassú 18
és a gyors rostokban. A gyors rostoknak érzékenyebbnek kell lenniük az ingerlésre, de rövidebb ideig, mint a lassú rostoknak. A lassú rostok viszont alacsonyabb frekvenciájú ingerlésre, de hosszabb ideig kell, hogy érzékenyek maradjanak. Ruff és munkacsoportja - a Na+csatornák eloszlását illetoen- megállapította, hogy a nátriumáram (INa) maximális
amplitúdója
valamint
az
akciós
potenciál
leadási
frekvenciájával közötti szoros kapcsolat jellemzo a rosttípusra (159). A gyors rostok motoros egységének leadási frekvenciája, valamint a Na+csatornák surusége is nagyobb, ennek megfeleloen a IN a nagyobb a gyors rostokban, mint a lassú rostokban ( IIb > IIa > I). Ebbol következik, hogy a nátrium csatorna eloszlása fontos szerepet játszik a rost terheléses alkalmazkodásában. To vábbá, a gyors rostokban nagyobb mértéku depolarizáció szükséges a kontrakció beindításához, mint a lassú rostokban, ehhez pedig nagyobb nátriumcsatornasuruségre van szükség. A csatornaszám szabályozásában fontos szerepet játszik az aktivitás, folyamatos aktivitás hatására ugyanis csökken a Na-csatornát kódoló mRNS mennyisége (137). A INa nagysága nemcsak a Na-csatorna suruségétol, hanem a lassú inaktiváció mértékétol is függ. Lassú rostokban a nyugalmi potenciál értéke pozitívabb, mint a gyors rostokban. Továbbá sikerült kimutatni, hogy a lassú rostok kevésbé érzékenyek a INa inaktivációjára, mint a gyors típusúak. Következtetésképpen elmondhatjuk, hogy a Na-csatorna eloszlása és muködése
döntoen
meghatározza
a
rostfüggo
elektrofiziológiai
különbségeket, hogy a gyors rostok nagy leadási frekvenciával rövid ideig,
míg
lassú
rostok
alacsonyabb
frekvenciával
tartósabban
képesek tüzelni. 3.2.3. Kontraktilis enzimrendszer rostspecifikus eltérései A harántcsíkolt izomrostot felépíto fehérjék egy része alkotja a rost kontraktilis
egységét
a
szarkomért, 19
melynek
finom
szerkezete
közismert. A vastag filamentum fo egysége a miozin, a vékony filamentumot az aktin, a tropomiozin és a troponinkomplex alkotja. 3.2.3.1. Vastag filamentum – miozin nehéz és könnyu lánc A miozin ATP-áz kvantitatív hisztokémiai vizsgálata alapján a három fo rosttípus között nem húzható meg éles határvonal. A napjainkban általánosan
használt
-
mind
élettani,
mind
pedig
kórélettani
szempontból jelentos - rosttípus osztályozás, mint említettük, a miozin molekuláris szintu eltéro összetételének kimutatásán alapul. A miozin bonyolult szerkezetét a két nehézlánc (myosin heavy chain, MHC), ennek fej részéhez kapcsolódó négy könnyulánc (myosin light chain, MLC): egy pár regulátor vagy más néven foszforilálható (LC2), és egy pár alkalikus vagy más néven esszenciális (LC1/3) könnyulánc alkotja (5, 60, 68, 77). Az egyes miozin nehéz lánc izoformák kimutatása bizonyult
a
leghasználhatóbb
elkülöníto
módszernek.
Erre
immunhisztokémiai valamint elektroforetikus eljárásokat használnak. A vázizomrostok elemzése alapján 8 humán MHC-gént és összesen kilenc
különféle
nehézlánc
alfajtát
különítettek
el
(168).
Az
embrionális és neontális alfajták mellett két lassú (HCI és HCIextraocular) és öt gyors (HCIIb, HCIIa, HCIId/x, HCIIextraocular és HCIIm) izoformát mutattak ki. A tiszta rostok mellett megtalálhatók az úgynevezett hibrid rostok is, ezekben általában csak kétféle MHC izoforma fordul elo, viszont ezek aránya széles határok között változhat (IIB/IID, IID/IIA, IIA/I típusú hibrid rostok). A felismert MHC izoformák száma folyamatosan növekszik. Egy általánossá váló nézet szerint annyiféle MHC variáns létezik, ahány motoros egység van, azaz az egy motoros egységhez
tartozó
tartalmaznak.
Más
rostok
immunhisztokémiailag
szóval,
az
érett
rostok
azonos
MHC-t
fenotípusát
a
neuromuszkuláris aktivitás jellege határozza meg. A motoros egység uniformitását,
valamint
a
neuronális
szerepét számos adat támasztja alá. 20
szabályozás
meghatározó
A rosttípusok változatosságát tovább bonyolítja a miozin könnyu lánc izoformák sokfélesége (126, 168). A különféle LC alfajták rostfüggo eloszlását is kimutatták, felnott gyors izomrostok két alkalikus (LC1f és LC3f) és egy foszforilálható (LC2f) alfajtát tartalmaznak, míg a lassú rostokban egy-egy izoforma van jelen (LC1s és LC2s). Bár már sikerült mind a lassú, mind pedig a gyors LC esetében számos alfajtát kimutatni. Megállapították, hogy a lassú alfajta megegyezik a szívizomban találhatóval. A könnyuláncok szerepérol ma még keveset tudunk. A kontrakciós mechanizmus finomszabályozásában játszanak szerepet, bár a tapasztalatok alapján az alfajták variációja alapvetoen nem befolyásolja az egyes rostok tulajdonságait. A MLC a MHC-hez kapcsolódva hozza létre az izomiozint. A LC ialfajták kapcsolódása nem korlátozódik a megfelelo lassú vagy gyors HC-ra, például a három gyors HC alfajta a különféle gyors LC alfajták kapcsolódásával mintegy kilenc féle kombinációt mutattak ki. Ezeken túl, a lassú HC – gyors LC, gyors HC – lassú LC kombinációkat is figyelembe véve elméletileg mintegy hatvan féle izomiozin komplex kialakulása lehetséges. Az egyes rosttípusok mechanikai tulajdonságairól kevés adat áll rendelkezésünkre. A rostok kontraktilis tulajdonsága és a mizin ATPáz aktivitása között közvetlen kapcsolat áll fenn, amit Bárány mutatott ki 1967-ben, bár ez az összefüggés csak a kontrakció sebességére igaz (8). A többi mechanikus paramétert más, a miozintól független, specifikus
tulajdonságok
befolyásolják.
Közvetlen
összefüggést
mutattak ki a rostok rövidülési sebessége és a MHC összetétele között egyes újabb, érett izmokban elvégzett vizsgálatok. Minél nagyobb a gyors alfajták aránya, annál gyorsabb, és fordítva, minél inkább a lassú alfajta dominál, annál lassabb a rövidülési sebesség. Az izomiozin mechanikai tulajdonságairól alkotott képünk rendkívül ellentmondásos. Számos olyan eredmény látott napvilágot, mely különbözo izmok – egymástól csak LC alfajtában eltéro - rostjait hasonlította
össze,
bár
késobb
21
megkérdojelezték
ezeket
az
eredmények,
mert
az
azonosnak
vélt
HC-k
között
finomabb
módszerekkel jelentos különbségeket tudtak kimutatni. 3.2.3.2. Vastag filamentum fehérjék A vastag filamentum struktúráját alkotó kettos hélix felépítésu fehérje, az aktin szekvenciája szigorúan konzervatív. Kétféle alfajtája ismert, a vázizom és a szívizom típusú. A fejlodés során és kórós körülmények között megjelenhetnek speciális alfajták is (11). A szabályozó fehérjék közül a tropomiozin két alegységbol épül fel, melyek szekvenciáját már nagyobb polimorfizmus jellemez. Mind a két fo tropomiozin alegységnek kimutatták a gyors és lassú alfajtáját, ezek aránya azonban izmonként változik. A
troponin
komplex
3
fo
alegységbol
áll:
TN-T,
TN-I,
TN-C;
mindegyiknek van lassú és gyors alfajtája. A TN -C egy Ca2+-köto fehérje,
mely
egy
családba
tartozik
a
kalmodulinnal
és
a
parvalbuminnal. Lassú és gyors alfajtájának Ca2+-köto képessége eltér egymástól, ez az eltérés az egyik fo oka annak, hogy a lassú és a gyors rostokban a kontraktilis apparátus Ca2+-erzékenysége jelentosen különbözik
(34).
A
TN-I
alfajták
közül
csak
a
gyors
típusú
foszforilálható. A TN-T alegységnek, a MHC-hez hasonlóan, számos alfajtája ismert. A gyors típusból hatot – négy gyakori és két ritka – a lassúból kettot ismerünk, bár mRNS szinten valószínuleg ennek töbszöröse is létezik. Az egyes alfajták eloszlásáról nincs egyértelmu képünk. Igazolták a lassú és gyors TN-T és a hasonló MHC alfajták korrelációját, valamint a rostok Ca2+-érzékenysége és a specifikus TNT (és a kapcsolódó specifikus tropomiozin) alfajta expressziója közötti kapcsolatot is (142). A
két
regulátorfehérje,
szerkezetének
integráns
nebulin része,
és
nebulette
újabb
mely
a
megfigyelések
Z-lemez alapján
alfajtáknak tekinthetok. A nebulin haránycsíkolt, míg a nebulett kizárólag szívizomban mutatjató ki. (130) 22
3.2.4. Metabolikus eltérések Az izmok korai felosztása (vörös és fehér) a rostok színe alapján történt, ugyanis a vörös izmokban több a specifikus oxigénköto fehérje, a mioglobin, mint a fehér izmokban. A mitokondriumok mennyiségét illetoen is könnyen kimutatható eltérést találunk. A rosttípusok ismertetésénél bemutattuk azokat a korai hisztokémiai módszereket, melyekkel a rost aerob vagy anaerob jellegét, azaz oxidatív potenciálját határozták meg, ami alapvetoen a mitokondriális aerob oxidatív anyagcsere enzimek mennyiségi eltérésének felel meg. A módszerek fejlodése lehetové tette egyedi rostokon specifikus enzimek qualitatív és quantitatív vizsgálatát. Az anyagcserefunkció vizsgálatának a lényege a specifikus enzimek mennyiségi és minoségi (enzim alfajták) eltérésének kimutatása. Régóta
ismert,
enzimaktivitási nagyobbak
hogy
a
profilja
lehetnek
rosttípusokon nagy
az
egyes
belül
az
különbségeket
egyedi
rostok
mutathat,
rosttípusokon
belül
melyek
kimutatható
variációk mértékénél is. Ez azt jelenti, hogy az egyedi rostok anyagcseréje egy éles határ nélküli folyamatos átmenetet képez („kontinuum”), mint arra már 1971-ben Guth és Yellin felhívta a figyelmet (66). Egy in vitro enzimaktivitás-vizsgálat nem vetheto össze az in vivo anyagcsere folyamatok összetett voltával, mégis egy-egy specifikus enzim aktivitásának vizsgálata rostszinten képet nyújt specifikus anyagcsere tulajdonságokról. Továbbá, ha egyszerre több enzimet
vizsgálunk,
akkor
a
megfeleloen
kiválasztott
enzimek
aktivitási arányából (diszkriminatív aktivitási hányados) olyan nagyon érzékeny
indikátort
kapunk,
melynek
segítségével
kitunoen
elkülöníthetok az egyes anyagcseretípusok az egyedi rostok szintjén. Az
említett
hányadosértékeket
használják
a
lassú
és
gyors
rostpopulációk elkülönítésére (7). Egy ilyen pár egyik eleme az anaerob, a másik pedig az aerob út egy specifikus enzimének felel 23
meg,
például:
foszfofruktokináz/citrát
dehidrogenáz/malát
dehidrogenáz
dehidrogenáz/3-hidroxiacil-CoA
szintáz
páros,
páros,
laktát
gliceraldehid-foszfát
dehidrogenáz
páros.
Egy
másik
módszerrel a nem-egyensúlyi reakciók aránya vizsgálható, például: a hexokináz/foszfofruktokináz páros, a foszfofruktokináz/fruktóz 1,6bifoszfatáz páros, továbbá a laktát dehidrogenáz/adenilát kináz hányados
vizsgálata
alcsoportok
(146).
Ezeken
elkülönítésére
kívül,
további
alkalmas
metabolikus
a
glicerofoszfát
dehidrogenáz/szukcinát dehidrogenáz páros kvantitatív hisztokémia analízise (157). A
miozin-függo
funkcionális
jellegzetességek
és
az
anyagcsere
korrelációja világosan felismerheto, bár a kétféle felosztás közötti közvetlen kapcsolat máig nem nyert igazolást. Néhány enzimnél kimutatták a rostfüggo alfajták jelenlétét. A laktát dehidrogenáz H típusú alegysége túlnyomóan a lassú, míg az M típusú a gyors rostokban fordul elo. Hasonló a helyzet a szénsav anhidráz enzimmel, ennél is kimutatták a lassú és a gyors alfajtákat. Lassú rostokra jellemzo a III típus, mely jól korrelál a megfelelo MHC alfajta jelenlétével (90). Már említettük a mioglobin eltéro mennyiségét az egyes rostokban. A legtöbb mioglobin a FOG típusú, valamivel kevesebb a SO és legkevesebb a FG rostokban figyelheto meg patkányban (105,106). Érdekes,
hogy
az
aerob
oxidatív
enzimek
aktivitásszintje nem
feltétlenül korrelál a mioglobin mennyiségével, ahogy ezt például edzés vagy
alacsonyfrekvenciás
stimuláció
után
a
patkányokban
megfigyelték. Hasonló a helyzet humán izomrostokban is, például az I és II típusú rostok között alig van eltérés mioglobin mennyiségében (134). Röviden ki kell térni a rostok anyagcsere állapotát meghatározó intrinsic és extrinsic tényezokre is. Közismert, hogy a fejlodés korai stádiumában a rostok között sokkal kevesebb a metabolikus eltérés, mint az érett izmokban, a jellegzetes 24
eltérések csak a „használat” során alakulnak ki. A motoros egység vizsgálata alapján megfigyelték, hogy az egy motoros egységhez tartozó rostok biokémiailag hasonlóak, legalábbis kevesebb eltérést mutatnak, mint a különbözo motoros egységhez tartozó rostok (110, 133, 134). Mindezek alapján kijelenthetjük a neuronális hatások, azaz az izomrost ingerlési mintázata elsodlegesen határozza meg a rost metabolikus jellegét, amelyet lokális faktorok (izombeli és motoros egységbeli helyzet, kapillarizáció, metabolitok hozzáférhetosége, aktív és passzív megnyúlás, stb.) erosen befolyásolhatnak. 3.2.5. [Ca2+ ]i homeosztázis rostspecifikus jellegzetességei A Ca2+ filogenetikailag az egyik legosibb intracelluláris hírvivo, mely a baktériumok és a magasabbrenduek szinte minden sejttípusának számos folyamatában részt vesz. Olyan kulcsfontosságú anyagcsereenzimek
muködését
szabályozza,
mint
a
mitokondriális
dehidrogenázok, valamint specifikus kinázokat is aktivál. Beindítja a hormon- és neurotranszmitter-szekréciót, szerepe van az apoptotikus folyamatokban is. Izomsejtekben a kalcium ion áramlása váltja ki a kontrakciós mechanizmust (9, 151). A sejteknek alapveto érdeke, hogy a szabad kalcium szintet a leheto legalacsonyabb szinten tartsák, mivel az ionizált kalcium precipitálni tudja az organikus foszfát vegyületeket, melyek a sejt energiaforrását jelentik. Nyugalmi állapotában az intra- és extracelluláris kalciumszint között az eltérés mintegy húszezerszeres. A Ca2+-ion ellentétben a többi hírvivo molekulával, nem metabolizálható. A
[Ca2+]ic
szabályozásban kulcsszerepet játszanak a különleges
kalciumköto fehérjestruktúrák, ezek teszik lehetové a Ca2+ térbeli és idobeli eloszlásának rendkívül precíz szabályozását. A 2. Táblázatban a harántcsíkolt izom [Ca2+]ic szabályozásában feltételezhetoen szerepet játszó
fehérje
struktúrákat
soroltuk
fel.
Ezeket
a
fehérjéket
funkcionálisan két - puffer és trigger - csoportba oszthatjuk. A trigger 25
fehérjéknél
kalciumbekötodés
hatására
konformációváltozás
következik be, ami effektor molekulákat - például enzimeket vagy ioncsatornákat - modulál, melyek - többek között - a felsorolt sejtszintu feladatokért felelosek. A puffer típusú struktúrák feladata a Ca2+ megkötése és tárolása - a lokális [Ca2+]ic függvényében - bár ezeknek is lehet - még fel nem ismert - trigger funkciójuk. A lokális [Ca2+]ic -t az extracelluláris, a sejtplazma és a belso kalciumszekvesztrációra
képes
organellumok
(endoplazmatikus
retikulum, Golgi rendszer) közötti kalciumáramlás határozza meg a fent említett speciális fehérjék együttmuködésének eredményeképpen. A
különbözo
kapacitású
és
érzékenységu
raktárak
térbeli
elrendezodése biztosítja a [Ca2+]ic változás helyi és átmeneti jellegét. A Ca2+ által közvetített jeltovábbítás alapja a kalciumjel, ami nem más, mint egy szigorúan lokalizált intracelluláris régióban a szabad kalcium szint hirtelen, gyors megemelkedése (kalcium tranziens), mely –pl. oszcilláció formájában- tovaterjedhet. Ez a Ca2+-mobilizáció számos sejtszintu hatással kiváltható, például speciális felszíni receptorokhoz történo
hormonbekötodéssel,
a
fertilizáció
során
bekövetkezo
sejtfúzióval, valamint az izomkontrakció alatt bekövetkezo membrándepolarizációval. A jeltovábbítás mechanizmusát illetoen alapveto jelentoségu volt az a felismerés, hogy ezen [Ca2+]ic -szint emelkedést kiváltó szignálok széles spektrumához speciális, [Ca2+]ic -ot mobilizáló anyagok sokasága kapcsolható. A napjainkig felfedezett anyagok között olyanok szerepelnek, mint az inozitol trifoszfát (IP3), szfingozin 1-foszfát, valamint számos ciklikus és nemciklikus nukleotid-foszfát. Egyre inkább elfogadott az a nézet, mely szerint a sejtekben összetett, térben jól behatárolt Ca2+-raktárak vannak jelen, melyeket komplex, de
jól
elkülönülo
mechanizmusok
szabályoznak.
Ezeknek
a
folyamatoknak a gazdag választéka teszi lehetové, hogy a sokféle hatásra - melyek [Ca2+]ic mobilizációval járnak -, mindig specifikus válaszjelenségek alakulhassanak ki.
26
A
[Ca2+]ic
különös
jelentoségét
izomban
az
a
közismert
tény
magyarázza, hogy a sejt anyagcsere -folyamatainak finomszabályozása mellett a kontrakciós-relaxációs ciklust is vezérli. A rostokban a Ca2+szabályozó rendszer hatalmas, egymással strukturális és funkcionális kapcsolatban lévo fehérje komplexumokból épül fel, melyek az elektromechanikai csatolás (depolarizáció, a feszültségérzékelés és a Ca2+-felszabadulás) lépéseit irányítják. Ennek központja az A és I csík határán a triád, a szarkolemma transzverzális tubulusának és a szarkoplazmatikus
retikulum
(SR)
terminális
cisztájának
a
junkcionális régiója. Itt helyezkedik el a SR és a T-tubulus közti teret áthidaló tetramer szerkezetu rianodin-érzékeny kalcium csatorna (RyR), melyhez több regulátor fehérje (FK506-köto fehérje, kalmodulin) és a junkcionális SR luminális oldalán Ca2+-köto kalszekvesztrin és triadin kapcsolódik. E komplexummal alkot funkcionális egységet a szarkolemmális oldalon a dihidropiridin-receptor (DHPR), egy P-típusú feszültségfüggo kalciumcsatorna. A junkcionális membrán bonyolult struktúráját jellemzi, hogy a szarkolemmális Ca2+-ATP-áz (PMCA) és a Na+/Ca2+-kerrier
specifikusan
a
DHPR-ok
közvetlen
közelében
mutatható ki. A rendszer funkcionális egységének része a SR ATP-áz (SERCA), valamint a szarkolemmális Na+/K+ csatorna mely diffúzan helyezkedik el, túlnyomórészt a junkcionális régiótól távolabb.
27
2+
CaMkötés
Alforma
M
Ca kötés
Gyors
17,000
1
Miofibrilláris Ca
Lassú/Szív
17,000
1
Miofibrilláris Ca
Kalmodulin
17,000
1
S100a
10,000
1
Multifunkcionális Rángás ativáció, más lehetséges funkciók
Parvalbumin Miozin könnyulánc-2 Rianodin receptor Vázizom
12,000 17,000
1 1
RyR1
550,000
1
1
Ca kiáramlás az SR-ból
Szív/Agy Agy
RyR2 RyR3
550,000 550,000
1 1
1 1
Ca kiáramlás az SR-ból 2+ Ca kiáramlás az SR-ból
SERCA1a
110,000
1
1
Ca
Gyors-neonatális Szív, lassú-rost, simaizom
SERCA1b SERCA2a
110,000 110,000
1 1
1 1
Ca transzport a SR-ba 2+ Ca transzport a SR-ba
Simaizom, nem izom típus Nem izom típus Miozin könnyulánc kináz Calpain
SERCA2b SERCA3
1 1 1 1 1
1 1
m P94
110,000 110,000 87,000 80,000 94,000
Ca transzport a SR-ba 2+ Ca transzport a SR-ba Miozin foszforiláció 2+ Ca -dependens proteáz 2+ Ca -dependens proteáz
Könnyulánc
30,000
1
58,000
1
Ca -dependens proteáz, regulator alegység Glikogén metabolizmus
170,000
1
Rianodin receptor regulátor
133,000 125,000 43,000 17,000
1 1 1 1
Rianodin receptor regulátor Rianodin receptor regulátor Rianodin receptor regulátor Calmodulinnal azonos
CaM kináz II a
54,000
1
Ca -függo multifunctionális kináz
Calcineurin A
61,000
1
Calcineurin B
17,000
1
Protein Troponin C
Ca
2+
pump Gyors-felnott
Funkció 2+
2+
érzékelo protein érzékelo protein
2+
Ca transzport Vastag filamentum része 2+ 2+
2+
transzport a SR-ba
2+
2+
2+
Glikogén szintáz kinaz 3 Histidin-gazdag calcium-köto fehérje (HCP) Phosphorylase kinase Alegység a Alegység b Alegység g Alegység d
2+
2+
Gyors
45,000
1
Ca -függo foszfatáz Calmodulin-szeru calcineurin alegység 2+ SR Ca -tároló fehérje
Lassú/Szív
45,000
1
SR Ca -tároló fehérje
Calreticulin
60,000
1
Ca -tároló fehérje, más funkciók
Annexin VI
68,000
1
Ca -dependens foszfolipid kötés
Annexin VII
51,000
1
Ca
Sorcin
22,000
1
Transz-szarkolemmális transzporter
NO szintáz (nNOS)
160,000
1
Relaxációban lehetséges szerep
a-Aktinin
100,000
1
Vékony filamentum része
Dystrophin
500,000
1
Vékony filamentumot szarkolemmához rögzíti
Calsequestrin
2+
2+
2+
2+
csatorna
2. Táblázat. A harántcsíkolt izom muködésében szerepet játszó kalciumköto fehérjék. (módosítva, Berchtold et al. Calcium ion in skeletal muscle Physiol. Rev. 2000 80:1215-1265) 28
3.2.5.1. Kalcium szintet szabályozó receptorok, csatornák Rianodin receptor (RyR) Az
izom
muködését
az
extracelluláris
befolyásolja, a kontrakció
[Ca2+]
lényegében
nem
kezdetén a [Ca2+]ic az SR-bol jut az
intracelluláris térbe. Harántcsíkolt izomszövetben a gyors Ca2+felszabadulásért a SR T-tubulusánál lábszeruen elhelyezkedo RyR felelos. Ez az összetett csatornafehérje az izomélettan egyik legtöbbet tanulmányozott tárgya, muködésérol számos összefoglaló mu jelent meg (166, 135, 122). Nevét onnan kapta, hogy nagy affinitással köti a rianodint,
egy
növényi
szerkezete
sokban
alkaloidát.
hasonlít
egy
A
másik
fehérjekomplex
általános
Ca2+-csatorna,
az
IP 3-
receptoréra, de a két [Ca2+]ic -szint szabályozó rendszer funkcionálisan teljesen elkülönül egymástól. A RyR szoros kapcsolatban áll több más fehérjével, szerkezete és muködése csak e molekulák bonyolult kölcsönhatásának tükrében értheto meg. A RyR és a vele szemközt, szarkolemmálisan elhelyezkedo DHPR funkcionális kapcsolata alkotja az
elektromechanikai
csatolás
alapját.
Bár
ennek
hipotézisét
Schneider és Chandler már 1973-ban felvetette (165), máig sem sikerült pontosan tisztázni az interakció pontos mechanizmusát. (164, 170, 172, 181, 182) Megállapították,
hogy
lassú
rostokban
az
egyes
kontrakciók
alkalmával kevesebb [Ca2+]ic szabadul fel, és így kisebb a kontrakciós ero, mint a gyors rostokban. A korábbi vizsgálatok egyrészrol megállapították, hogy a SR junkcionális régiójában
a lábszeru
képzodmények denzitása a gyors rostokban mintegy kétszerese a lassú rostokénak, miközben a T-tubulusok aránya megegyezett (56). Más részrol, a Ca2+-felszabadító mechanizmus részletes megismerése bebizonyította, hogy e megfigyelés okát nem az olyan korábban megfigyelt eltérésekkel kell magyarázni, mint a felszabadítható szarkoplazmatikus Ca2+ mennyisége, vagy a felszabadulás kinetikája, hanem
a
két
rosttípusban
tapasztalt 29
eltéro
DHPR/RyR
receptorsuruség hányadosával. Ez az érték megadja azoknak a RyR– oknak
az
arányát,
melyeket
közvetlenül
muködésbe
hoz
a
depolarizáció. A hányadost illetoen sok az ellentmondás, de a legújabb – izolált SOL és EDL rostokon mért - adatok alapján a gyors rostokban háromszor több, mint a lassúakban (35, 121). A gyors rostok egységnyi térfogatában több RyR nyílik meg, így nagyobb lesz a membrán-depolarizációra bekövetkezo Ca2+-felszabadulás mértéke, mint a lassúakban. A RyR két alfajtája mutatható ki a harántcsíkolt izomszövetben, a RyR1 a domináns forma, a RyR3 a posztnatális fejlodés után majdnem teljesen eltunik, a késobbi stádiumokban már csak néhány izomrostban mutatható ki (például a lassú oxidatív típusúakban)
(10,
174,
152).
Mindezen
eltérések
funkcionális
következménye a rosttípusok tükrében még ismeretlen. Dihidropiridin receptor (DHPR) A DHPR egy L-típusú Ca2+-csatorna, mely dihidropiridinre érzékeny, elhelyezkedését illetoen a junkcionális szarkolemmában a tetrád elektronmikroszkópos struktúrájának felel meg (35). Feladata, hogy membránfeszültség-változások hatására megnyílik és befelé irányuló lassú
Ca2+-áramot
hoz
létre
a
T-tubulusoknál.
Ez
az
elektromechanikai csatolás elso lépése. Mikroszkópos vizsgálatok alapján a DHPR a T-tubulusok junkcionális részén helyezkedik el, bár nincs kizárva, hogy extrajunkcionálisan is elofordul. A fehérje öt alegységbol (a 1, a2, ß, ?, d) áll, ezek szerkezete jól ismert. A muködés szempontjából az a 1 alegység alapveto fontosságú, ez tartalmazza magát a pórust, a Ca2+-köto helyeket és az organikus Ca2+antagonisták kötohelyét. Napjainkig 2 fo alosztályt és legalább 6 alfajtát különítettek el, ezek közül a harántcsíkolt izomban 3 alfajtát mutattak ki, bár ezek rosttípus-függoségérol nincsenek adataink. Azt biztosan tudjuk, hogy a DHPR rost-térfogatra számított surusége a gyors rostokban három-ötszöröse a lassú rostokban számítottakénak (35). Ennek következtében értheto, hogy a gyors rostokban a DHPR30
függo ionáram mértéke is hasonló arányban magasabb, mint a lassú rostokban,
melynek
membrándepolarizáció
következtében hatására
a
gyors
bekövetkezo
rostokban
Ca2+-felszabadulás
mértéke is nagyobb. SERCA A citoplazmatikus Ca2+ gyors eltávolításért a SR ATP-áz (SERCA) felelos, így muködése meghatározza az izom relaxációját is. A P-típusú ATP-áz szerkezete jól ismert, specifikus doménjeit meghatározták, mint például az ATP és Ca2+-kötohelyet valamint a foszforilációs helyet (118). Optimális esetben egy ATP bontásával két Ca2+-t transzportál a szarkoplazmatikus raktárakba. A SERCA döntoen az SR longitudinális szakaszán helyezkedik el, surusége jellegzetes az egyes rosttípusokra. A rosstípusokra jellemzo eltéréseket Dux foglalta össze (42). Patkány túlnyomóan
gyors
rostokat
tartalmazó
EDL
izmok
SR-ben
gazdagabbak, továbbá az ATP-áz surusége és maximális aktivitása 3-4 szer nagyobb, mint a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó SOL izmokban (31, 32, 41). Az egységnyi rostra jutó teljes SERCA mennyiség lassú-gyors aránya 1:2. Ez az érték jóval alacsonyabb, mint a két rost teljes relaxációs idejének 1:6 arányú különbsége, ami azt sugallja, hogy a re laxáció hosszát nem csak a Ca2+-visszavétel kvantitatív jellege, hanem más paraméterek is befolyásolják, például enzimkinetikai
tulajdonságok,
vagy
a
citoplazmatikus
kalcium-
pufferek eltéro jelenléte (49). Megfigyelték, hogy speciális, úgynevezett „szupergyors” izmokban például a halak úszóhólyagját körülölelo speciális izom rostjaiban – a SERCA és a RYR mennyisége nem egyenlo arányban nagyobb, mint a patkány gyors izmaiban, a SERCA/RYR arány ugyanis ötször nagyobb a „szupergyors izomban”. Ebbol arra lehet következtetni, hogy a nagyfrekvenciájú, nem-tetanizált izomrost-összehúzódásoknál a Ca2+visszavétel kapacitása limitáló tényezové válik (2).
31
Hasonlóan a többi ATP-ázhoz, két alapveto rostspecifikus alfajta és további 1a, 1b és 2a, 2b szubcsoportokat jelenlétét tudták kimutatni. A gyors rostokban alapvetoen a SERCA 1/a és 1/b, lassú rostokban, pedig a szívizomrostokhoz hasonló a SERCA 2/a található meg (13). Az egyes alfajták között, a vizsgált paraméterek alapján (Ca2+, ATP, pH dependencia, Ca2+-felvevo képesség, maximális aktivitás) funkcionális szempontból alig van különbség (116, 117). A Ca2+-szekvesztrációt az egyes rosttípusokban így alapvetoen a Ca2+-ATP-áz surusége határozza meg. A SERCA muködésének és szabályozásának egy újabb rostfüggo jellegzetességére hívta fel a figyelmet Odermatt (136). Széles körben ismert, hogy a szív- és a lassú típusú harántcsíkolt izomszövet rostjaiban a kontraktilitás központi szabályozója a foszfolamban (PLN), egy szabályozó proteolipid, mely együtt expresszálódik a SERCA 2a alfajtával, mely ezekbe n a rostokban domináns. A két fehérje, a PLN transzmembrán alfa-hélixe és a SERCA 2a kölcsönhatása csökkenti a SERCA 2a Ca2+-érzékenységét. Ez a gátló mechanizmus viszont kiküszöbölheto
az
[Ca2+]ic
emelésével
vagy
pedig
a
PLN
foszforilációjával egyaránt. Ezek a folyamatok rámutatnak a PLN kulcsfontosságú szerepére, például a ß-adrenerg agonista hatásokra bekövetkezo pozitív inotrop válaszban. Ezzel párhuzamosan, a gyors típusú harántcsíkolt vázizomrostokban is létezik egy szabályozó proteolipid, a szarkolipin (SLN), mely a SERCA 1 domináns alfajtájával áll szoros kapcsolatba. Ennek a két SERCA-szabályozó fehérje strukturális homologiája és a kódoló gének nagyfokú hasonlósága alapján Odermatt szerint a két proteolipid egy családot alkot. A SLN a SERCA 1 izoformával párhuzamosan a gyors rostokban található meg, míg a lassú típusúakban alig, a szívben pedig egyáltalán nem. A PLN pedig túlnyomó részben a szív és lassú típusú rostokban mutatható ki, gyors típusúakban viszont nem, a SERCA 2a elofordulásával párhuzamosan, mintegy a SLN ellenpárjaként. A hatásaikat tekintve sok a párhuzamos elem. Például a transzmembrán kölcsönhatások 32
révén mind a ketto gátolja a SERCA kalcium-érzékenységét, amit a [Ca2+]ic emelésével meg tudunk szüntetni. Az SLN és a PLN kötohelye máshol
található,
hatásuk
additív.
Az
SLN
nem
modulálható
foszforiláció útján. További különbség, hogy a SLN megemeli a SERCA 1 Vmax –értékét. Ezzel az enzim folyamatos, magasabb szintre beállított stimulációját idézi elo a gyors típusú vázizomrostokban. Ezek a tulajdonságok képezik a kívánalomnak megfelelo Ca2+-mobilizálási képesség bázisát az egyes rosttípusokban. Például a gyors rostokban a nagyfrekvenciájú
Ca2+-fluktuációt követi a kontrakciós-relaxációs
ciklus (33). 3.2.5.2. Kalciumköto struktúrák Kalszekvesztrin A SR lumenében található legfontosabb kalciumköto fehérje a kalszekvesztrin (28, 29, 119). Az SR belsejében elnyújtott szerkezete elsosorban a junkcionális régióhoz közeli helyeken figyelheto meg, míg extrajunkcionálisan
csak
a
hotermelésre
specializálódott
izomrostokban mutatható ki. Kimutatták, hogy a kalszekvesztrin a triadin segítségével funkcionális kapcsolatban áll a RYR-ral. A RYR aktivitása a kalszekvesztrin konformációváltozását okozza. A kalszekvesztrint két különbözo gén kódolja, létezik egy gyors harántcsíkolt és egy szívizomrost alfajta, a ketto aránya eltéro lehet a rostokban. A lassú rostokban a szívi zom-típusú alfajta a teljes mennyiség 25%-át teszi ki. A két alfajta kalciumköto tulajdonságai nagyon hasonlóak (29, 30, 31, 190). Kalretikulin Ez a fehérje az SR lumenében helyezkedik el, nagy affinitással köti a Ca2+-t. Szerkezetében nincs meg az „EF-hand” szekvencia (52, 53, 54), aminosav
sorrendje
több
szakaszon
kalregulin szekvenciájával. 33
homológ
a
májból
izolált
A kalretikulin továbbá mind méretben, lokalizációban, mind pedig szöveti elofordulásban nagyon hasonlít a kalszekvesztrinhez, de immunológiailag kimutatható, hogy két különbözo fehérjérol van szó. Eloször harántcsíkolt izomrostokban észlelték, azóta kimutatták különféle szövetek széles skálájában. Parvalbumin A
parvalbumin,
ahogy
a
nevében
is
megtálalható,
egy
kis
molekulasúlyú, nagy affinitású Ca2+-köto fehérje, mely túlnyomórészt izom és idegsejtekben található meg (70, 71, 72). Emlos vázizomban csak egyféle alfajtája létezik (94, 95). A parvalbumin mennyisége rosttípusonként változik, legnagyobb koncentrációban a gyors típusú rostokban figyelheto meg, míg a lassú típusú vázizom, szív- és simaizom rostokban aligvan, vagy egyáltalán nincs (65). Ez a fehérje volt az elso az „EF-hand” típusú Ca2+-köto fehérjék sorában, mely csoport ma már több mint 150 elemet számlál. A parvalbumin, mely csak a
citoplazmában
található
meg,
kalcium
bekötésére
alig
változtatja meg konformációját és nem ismert enzimatikus funkciója sem. Ezek alapján elmondható, hogy a parvalbumin olyan Ca2+-köto fehérje,
ellentétben
a
Ca-modulátorokkal,
melynek
a
kalcium
pufferolásán kívül jelenleg más funkciója nem ismert. A fehérje két fo Ca2+-köto helyét nyugalmi állapotban Mg2+ köti le, amikor a [Ca2+]ic < 100 nM. A sejt aktivációja során, amikor a [Ca2+]ic µM-os szintre emelkedik,
a
Ca2+
leszorítja
a
Mg 2+-t.
A
parvalbumin
Ca2+-
disszociációs állandójának értéke alacsonyabb, mint a troponin C-é, ezért az izom aktivációja során a Ca2+ eloször a troponin C-hez kötodik, a parvalbumin puffer funkciója csak késéssel jelentkezik. Ennek alapján feltételezheto, hogy a parvalbumin a gyors rostokban alapveto szerepet játszik a relaxáció beindításánál. Az intracelluláris szabad kalcium fo eltávolító mechanizmusa a szarkoplazmatikus kalcium pumpa, mely nagy hatásfokkal és gyorsan távolítja el a kalcium ionokat, miközben depletálja a parvalbumin által képzett 34
átmeneti
Ca2+-raktárt.
Megállapították,
hogy
a
parvalbumin
a
relaxáció idejét a legeroteljesebben poikiloterm állatokban, alacsony homérsékleten tudja befolyásolni, amikor a SERCA nem muködik, (70). Ebben a komplex Ca2+-köto rendszerben a parvalbumin relatív szerepét - melyet meghatároz a parvalbumin Mg2+ disszociációs állandója - az emlosökbol származó izmokban máig nem tudták pontosan tisztázni. Patkányokban kimutatták, hogy a lassú és a gyors rostokban
az
lecsengésének
elektromos
ingerlést
követo
sebessége
mindkét
rosttípusban
parvalbumin
koncentrációjával
sebességének
csökkenését
(78).
figyelték
meg
kalcium
Továbbá, patkány
tranziens
arányos a
a
relaxáció
lassú
típusú
rostjaiban, parvalbumin cDNS injekciójával kiváltott expressziójának hatására. A parvalbumin hatását, nevezetesen a relaxációs ciklus meghosszabbodását sikerült imitálni intracelluláris térbe juttatott EDTA-val a patkány m. soleus rostjaiban. Közismert, hogy az EDTA a parvalbuminéhoz hasonló Mg2+ és Ca2+ disszociációs állandóval rendelkezik (92). További megfigyelések születtek olyan egereken, melyekbol hiányzik a parvalbumint kódoló gén (156, 167). A „knockout” egerek gyors izmaiban a nyugalmi [Ca2+]ic szint értéke kétszer magasabb volt, mint a „vad” társaikban. Továbbá, a stimulációt követo [Ca2+]ic tranziens integrálja és a keletkezo ero nagyobb volt, mint a „vad” típusban. Továbbá a teljes kontrakciós-relaxációs ciklus idejét is hosszabbnak találták a „knock-out” állatokban. Ez összhangban van azzal a régi megfigyeléssel, hogy a parvalbumin mennyisége és a kontrakciós-relaxációs sebesség szoros kapcsolatban áll egymással az izomrostokban. Összefoglalva, a parvalbumin az [Ca2+]ic tér és idobeli eloszlásának finomszabályozója. Az I-lemezhez közeli elhelyezkedése lehetové teszi, hogy megkösse, és gyorsabban hozzáférhetové tegye a SERCA számára a szabad Ca2+-ot. Parvalbumin jelenlétében a kifejtett ero rovására megno a kontrakciós-relaxációs ciklus sebessége. 35
3.2. Rostspecifikus eltérések kórélettani aspektusai A harántcsíkolt izmokat felépíto rostok eltéroen reagálnak a különbözo környezeti
hatásokra.
Tekintettel
a
dolgozat
szuk
kereteire,
a
továbbiakban egy klinikai szempontból rendkívül fontos behásra, a végtagi izmokat érinto iszkémiás károsodásra koncentrálok. Ebben a fejezetben az artériás érelzáródás következtében a harántcsíkolt izmokban fellépo strukturális és funkcionális változásokat foglalom össze. 3.2.1. Iszkémiás érzékenység A
szív,
a
vázizom,
megbetegedéseinek potenciálisan
a
vese
aránya
katasztrofális
és
az
agy
világszerte kórképek
iszkémiás
kiugróan
hátterében
eredetu
magas, többnyire
a egy
szklerotikus érben bekövetkezo elzáródás áll. Vázizom esetében iszkémiás/reperfúziós károsodás gyakran megfigyelheto trauma és kompartment szindróma következményeként is. A harántcsíkolt izom iszkémia-reperfúzió során szerzett károsodását számos aspektusból mélyrehatóan vizsgálták. Egyes modelleken
az iszkémia/reperfúzió
következtében fellépo funkcionális károsodást találták jelentosebbnek, más erdmények alapján az anyagcserezavarra tehetjük a hangsúlyt. Az intakt izmokra vonatkozó ismereteink különösen hiányosak, nem tisztázott, hogy milyen kapcsolatban áll a metabolikus és funkcionális károsodás
egymással.
Az
iszkémiás
érzékenység
rostspecifikus
összefüggéseirol sincs egyértelmu képünk. A funkcionális eltérések a kontraktilis funkció gyengülését jelezték a reperfúziót követo néhány órán belüli (61, 141) és hetekkel késobbi (50, 51, 3) idoszakban. Fish és csoportja kimutatták, hogy az iszkémia idejének növekedése hogyan
fokozza
a
funkcionális
károsodás
mértékét.
Továbbá
kimutatták, hogy a metabolikus eltérések iszkémiás érzékenysége a gyors típusú rostokban nagyobb, mint a lassú típusúakéban (85, 192, 36
193, 194). Ez utóbbi csoport igazolta, hogy a lassú típusú izomrostok ellenállóbbak
az
iszkémia
hatásával
szemben,
nemcsak
az
anyagcserejellemzoket illetoen, hanem funkcionálisan is. Rácz és csoportja megállapították, hogy egy, illetve két órás iszkémiás idoszakot követoen a funkció helyreállása a lassú típusú izmokban gyorsabb volt (153, 154). Ezzel szemben mások a lassú típusú rostokat érzékenyebbnek találták (18, 19, 91), míg voltak olyanok, akik semmilyen rostspecifikus különbséget nem találtak (179, 180). A fennálló nézetkülönbségeket feloldhatók Carvalho és munkacsoportja által a közelmúltban végzett vizsgálatok eredményei alapján. A csoport különbözo hosszúságú iszkémia-reperfúziós modelleket hasonlított össze. Megfigyelték, hogy mind az iszkémia, mind pedig a reperfúzió korai fázisában a rostípusok érzékenysége jelentosen eltéro. A károsodás mérétéke nagyobb volt a gyors típusú rostokból álló izmokban, mint a lassúakban. Az egy órás iszkémiát követo két órás reperfúzió
után
teljes
funkcionális
és
metabolikus
restitúciót
figyelheto meg. Hasonló eredményre jutott 4 órás iszkémia és a reperfúziót illetoen két másik csoport (144, 197), akik egéren vizsgálták meg az iszkémia hatását lassú-oxidatív és gyors glikolitikus rostokon.
Kimutattták,
hogy
a
glikolitikus
rostok
sokkal
érzékenyebbek voltak és a funkció visszatérése is sokkal lassúbb volt, mint az oxidatív rostoknál. Az elmúlt évtizedekben történt kutatások boségesen szolgáltattak kísérletes adatokat arra vonatkozólag, hogy az intracelluláris szabad Ca2+-ionok
felhalmozódása
kórfolyamatokban,
olyan
központi
metabolikus
szerepet
tölthet
elváltozásokat
be
e
indukálva,
melyek eredményeképpen sejtkárosodás jön létre. Ezek a patológiás történések magukba foglalják a membrán degradációt létrehozó Ca2+dependens
foszfolipázok
aktiválódását,
toxikus
zsírsavak
és
lizofoszfolipidek termelodését, a ciklooxigenáz- és lipoxigenáz-rendszer kóros stimulációját, különbözo Ca2+-dependens kinázok és autolitikus 37
enzimek
aktiválódását.
A
magas
[Ca2+]ic -szint
fokozza
a
mitokondriumok kalcium felvételét is, mely egy ponton túl az oxidatív foszforiláció szétkapcsolódásához vezet. Következésképpen a [Ca2+]ic szint patológiás megemelkedése súlyos zavarokat okozhat a sejt másodlagos hírvivo rendszerében, valamint az elektrolit- és energiahomeosztázisban. Az iszkémiás sejtelhalás kalcium-hipotézise szerint a miokardiális infarktusban és a vázizom disztrófiában megfigyelheto fokozott Ca2+beáramlás és a sejtkárosodás között szoros oksági kapcsolat létezik. A
[Ca2+]ic—szint
megváltozásának
iszkémia
és
rostspecifikus
reperfúzió
során
vonatkozásáról
bekövetkezo
nagyon
keveset
tudunk. A kevés munka közül ki kell emelni Green és csoportjának eredményeit. Patkány gyors és lassú izmrostjaiban kimutatták, hogy a különbözo hosszúságú iszkémiák hatására fokozódik a SERCA aktivitása, és ennek idobeli lefolyása függ a rost típusától (62, 63). Munkacsoportunk korábban kimutatta vegyes rostokat tartalmazó izomban, hogy az iszkémia/reperfúzió alatti [Ca2+]ic -szint változások függnek az iszkémia idotartamától, és hogy ezek a [Ca2+]ic -szint változások
tartós
preparátumokban
iszkémia
során
[Ca2+]ic -szint
heterogén
növekedés
jelleguek:
következett
némely be,
míg
másokban az nem volt tapasztalható. Feltételezésünk szerint ezeket a különbözoségeket az iszkémiás inzultusnak kitett izomrostok típusa határozhatja meg.
38
4. Módszerek
A felvázolt kérdések megválaszolására kialakítottunk egy olyan mérorendszert, melyen párhuzamosan vizsgálhatók a mikrocirkuláció, a szöveti véráramlás, a metabolikus állapot és az intracelluláris szabad kalcium szint paraméterei túlnyomóan lassú és túlnyomóan gyors típusú rostokat tartalmazó izmok felszíni rostjaiban. 4.1. Módszertani áttekintés 4.1.1. [Ca2+ ]ic-mérés áttekintése Az [Ca2+]ic szint mérését optikai módszerrel, Indo-1 AM festék segítségével végeztük. A korai, non-invazív [Ca2+]ic mérése speciális festékanyagok, pl. aequorin, obelin Ca2+-függo fluoreszcenciájának detektálásán alapult, és a [Ca2+]ic -koncentráció szemi-kvantitatív megbecsülését tették lehetové különbözo sejttípusokban, szövetekben 0,5 µM-tól néhány µM-ig terjedo tartományban (158). Habár ez a technika csak korlátozottan volt alkalmazható (24), széles körben vált használatossá
sejtszintu
preperátumokban
is
mérésekben,
(104).
Metodikai
így
az
izolált
nehézségek
izomrost-
miatt
ezen
festékeket nem lehet intakt szervek vizsgálatánál felhasználni. Az 1,2bisz-(2-aminofenoxi)-etán-N,N,N’,N’-tetraacetát sav családba tartozó Quin-2, Fura-2, Indo-1, Fluo-3 fluoreszcens festékek bevezetésével jelentosen javult az optikai mérések szelektivitása és szenzitivitása (64). A festékek membrán-permeábilis acetoxi-metilészter (AM) formája különösen jól alkalmazhatónak bizonyult élo sejtrendszerekben, mert a sejten belül az AM csoportok lehasítása révén a festék csapdába esik,
nem
vándorol
el
az
intracelluláris
térbol.
Az
egyetlen
hullámhosszon történo fluoreszcens mérés nagyon érzékeny a mért szöveti térfogat teljes festékanyag-koncentrációjának stabilitására, a 39
szövet nem specifikus optikai tulajdonságainak állandóságára és nem utolsó sorban a kiválasztott szöveti térfogat méretének stabilitására. E feltételek közül igazából egyik sem valósul meg teljesen in vivo körülmények között (37, 115). A megvilágító, illetve a fluoreszcens fény útjába kerülo vérerek elkerülhetetlenül torzítják a mért jelet a lokális vértartalom és a hemoglobin oxigenizáció változásai következtében (21, 69).
Ezen
mutermékek
kiküszöbölésére
a
által
kutatók
okozott
speciális
legfontosabb
korrekciós
hibák
módszereket
fejlesztettek ki az elmúlt évtized során (38, 97). Megjegyzendo, hogy ilyen korrekciós technikák kidolgozásában Intézetünk kutatói alapveto munkát végeztek (37, 38, 46, 67). Abban az esetben, amikor az optikai szöveti
mutermékek
a
fluoreszcens
jelet
jelentos
mértékben
befolyásolják, ezeket a korrekciós módszereket nem használhatjuk. Egy másik megközelítés, LaManna és mts-ai (112) által javasolt több hullámhosszon
vagy
spektrális
információn
alapuló
korrekciós
módszer valamivel sikeresebbnek bizonyult az optikai mutermékek kiküszöbölésére. További megoldást jelenthet a belso standardok használata. Ezek és a fluoreszcens indikátorok közötti jelentos optikai és kémiai különbségek (oldékonyság, kompartmentalizáció, festék kiszivárgás, pH-érzékenység, stb.) azonban alapvetoen korlátozzák az alkalmazásukat.
A
közelmúltban
a
[Ca2+]ic -szint
alkalmas ún. kettos hullámhosszú, excitációs-
detektálására
vagy
emissziós-
hányados meghatározásán alapuló módszert fejlesztettek ki (184). Ez a megközelítés ugyanazon a festékmolekula Ca2+-t köto és szabad formája által kibocsájtott fluoreszcens jelek detektálásán alapszik. Így, ha a jel elég nagy ahhoz, hogy elfogadható jel/zaj viszonyt kapjunk, akkor a fluoreszcens intenzitások abszolút értéke már nem alapveto követelmény, mert a tényleges információ az intenzitás-amplitúdók hányadosaiból származik. Ez az érték pedig már sokkal kevésbé érzékeny
az
elobb
felsorolt
mutermékekre,
mint
maguk
az
intenzitásértékek. A vér és a vérmentes szövet spektrális tulajdonságai közötti jelentos különbség miatt azonban ez a módszer is nagyon 40
érzékeny a hemodinamikai mutermékekre, és így in vivo körülmények között való alkalmazása körültekintést igényel. Igen nagy sikerrel adaptálták viszont a Fura-2 és Indo-1 hányadosképzo technikát izolált szerv-modellekre, mint izolált-perfundált szív (12), vázizom (4) és máj (160). Saját
kísérleteinkben
a
[Ca2+]ic
meghatározására
Indo-1
AM
intracelluláris festéket használtunk (88, 89, 183). Az Indo-1 AM membrán-permeábilis lévén szabadon diffundál a sejtekbe, ahol nemspecifikus észterázok hatására az 5 AM csoport lehasad róla, így ötszörösen negatív vegyértékuvé válik, és csapdába esik a sejten belül. Bár a szabad festék membrán-impermeábilis, az aspecifikus anion pumpák segítségével mégis kiszivároghat a sejtbol, csökkentve az intracelluláris fluoreszcens jel nagyságát. Ezen a nem-specifikus anion pumpák
muködésének
gátlására
különbözo
pumpa-gátlók,
pl.
probenecid, szulfatiazol használhatók. A szabad Indo-1 abszorpciós maximuma 349 nm, míg a Ca2+-Indo abszorpciós maximuma 331 nm, így a megvilágító fény optimális hullámhossza 340 nm lenne, de ha az optikai rendszer nem teszi lehetové az UV gerjesztést, úgy 365 nm-es fény is jól alkalmazható e célra. A Ca2+-kötésben levo Indo-1 emissziós maximuma 380 nm, mi ezt a jelet 400 nm-en detektáljuk, míg a szabad festék emissziós maximuma 480 nm, ezt a jelet pedig 506 nmen mérjük (ugyanis ilyen a hullámhosszúságú szurok vannak forgalomban). Az emissziós maximumoktól eltéro hullámhosszúságú szurok használata, az adott festékek - kötött és szabad - emissziós spektrumát figyelembe véve kb. 5-10%-os jel/zaj viszony csökkenést eredményez. Az Indo-1 disszociációs konstansa 230 nM, így a sejten belüli fiziológiás [Ca2+]ic tartományban (100-800 nM) a hányadosképzo módszer segítségével meghatározott 400/506 nm-es viszonyszám arányos
a
sejten
hányadosérték intracelluláris
belüli
[Ca2+]ic
nagymértékben
koncentrációval.
független
koncentrációjától, 41
a
valamint
Emellett,
festék
a
abszolút
használatával
kiküszöbölhetoek a nem specifikus szöveti suruség-változásokból, a feltöltodés egyenetlenségébol származó mutermékek. 4.1.2. NADH mérés áttekintése Az
iszkémia-reperfúzió
rostszintu
anyagcsere-állapot
vizsgálata
jellemzésére
során
a
szöveti
NADH-mikrofluorometriát
alkalmaztunk. A szöveti fluoreszcencia detektálása betekintést nyújt a mitokondriális szintu sejtenergia-forgalom állapotába. E jelenség felismerésében és a megfigyelésre alkalmas módszerek kifejlesztésében úttöro szerepe volt Chance és munkatársainak (20), akik közül sokan Intézetünkbol
kerültek
energiaforgalomban
a
ki.
A
redukált
mitokondriumban
nikotinamid
zajló
dinukleotid
(NADH)
központi szerepet játszik. A NADH a legfontosabb energiaközvetíto a Krebs-Szentgyörgyi ciklus és a sejtlégzés között. A NADH szintjét a szövet anyagcsere-állapota határozza meg. Ennek következtében a NADH fluoreszcencia a mitokondriális oxigénszükséglet közvetlen indikátora. Szöveti hipoxia során a NADH mennyisége hirtelen megno, mivel O2 hiányban nem tud NAD + -dá oxidálódni. A NAD +/NADH páros fluoreszcencia-spektruma lényegesen eltéro, lehetové téve, hogy a NADH mennyisége kvantitatívan mérheto 465 nm-en az emittált fluoreszcencia-intenzitás segítségével. A szöveti anyagcsere-folyamatok megértésének vágya ösztönözte az olyan módszerek kidolgozását, melyek
lehetové
tették
sejteken,
szövetpreparátumokon,
intakt,
valamint in vivo szerveken a NADH mérését. Az intakt szöveti felszínen a vörösvérsejtek jelentosen módosítják a kapott adatokat , ezért a korrekt interpretáláshoz nélkülözhetetlenek a mérések korrekciójára kidolgozott eljárások használata (69, 127, 38, 101). A NADH mérését széles körben alkalmazzák különféle szervek iszkémiás károsodásának vizsgálatára harántcsíkolt
(agy,
szív,
izom)
de
tesztisz,
bél,
használják
vese,
más,
máj,
bor
valamint
mitokondriális
redox-
potenciálváltozással járó állapotban is. Ilyen többek között az akut 42
transzplantációs szívfunkció
reakció,
tumorbiológia,
anyagcsereállapotának
epilepszia,
vi zsgálata.
A
szepszis,
módszert
az
állatkísérletek mellett már klinikai célra is alkalmazzák a szívizomiszkémia, valamint egyes izombetegségek vizsgálatára. 4.2. A méro rendszer felépítése 4.2.1. Az intravitál-mikroszkóp A kísérleteinknél alkalmazott optikai rendszert laboratóriumunkban fejlesztették ki (183), ezt adaptáltuk az általunk használt modellekhez. A rendszer a következo fo részekbol épül fel: mikroszkóp váz mozgatható tárgyasztallal, megvilágító egység, detektáló egység, analóg és digitális képrögzíto rendszer (2. Ábra).
Topológia
Videokamera
DCCD Kamera
Winview képfeldolgozó rendszer, Princeton Instruments. Inc
506
400
365 400
Interferencia filter
Hg 100 W
Féligátereszto tükör Excitációs filter
Vízimmerziós objektív Olympus 20 x
Felületes izomrostok
2. Ábra. Az epiiluminációs üzemmódban használt fluoreszcens mikroszkóp vázlatos felépítése. A rendszer részletes leírása a Módszerek fejezetben található.
43
A megvilágítás–detektálás epiilluminációs konfigurációban történt. A megvilágító egység egy Zeiss gyártmányú általános lámpaházban elhelyezett HBO 100W/2 típusú DC Hg-goz lámpából, kondenzor egységbol, és interferenciaszurobol (abszorpciós filter: 365 és 405 nm Omega Optical, Brattleboro VT, USA) áll. A mikroszkóp vázában a fény útját
féligátereszto
tükör
bontja
ketté,
a
megvilágító
fény
a
vízimmerziós objektíven (Olympus 20x, 0.5 W, Japán) keresztül vetül az izom felszínére. A visszavert-emittált fényt a tükör a detektáló egység felé tereli el, mely léptetomotoros szuroegységbol (emissziós filter: 365, 400, 465 és 500 nm Omega Optical, Brattleboro VT, USA) és két kamerából áll. A izom felszíni mikrocirkulációját 405 nm-es megvilágításnál emissziós szuro nélkül vizualizáltuk, és egy analóg CCD kamerával (Sony, SPT M102CE Japán) videorekorderre vetük fel és off-line értékeltük ki. A NADH-fluoreszcencia jelét 465 nm-en, a [Ca2+]ic – jelet 400 és 506 nm-en, a szöveti reflektanciát 365 nm-en a másik,
nagyérzékenységu
hutött
DCCD
kamerával
(TE/CCD-
512TKB/1, Princeton Instruments Inc, Princeton, NJ, USA) követtük nyomon. Ennek a hutött digitális kamerának rendkívül nagy és öt nagyságrendig lineáris az érzékenysége az érzékenysége, kituno a stabilitása és szinte zajmentes. Ezen tulajdonságok alapján a fluoreszcens jel erosítése szükségtelennek bizonyult. A kétdimenziós intenzitásjelet (512x512 pixel) digitalizáltuk (16 bit AD-konverter, dinamikus felbontás a sötétáram korrekciót követoen: 150 KHz). A jelzaj viszony tovább növelheto a mintavételi periódus növelésével (1-60 s). Míg a 465 nm-es reflektált jelek mérésére 0,01 s mintavételi periódus is elégséges, addig a fluoreszcens jelek mérésére 10 s szükséges,
a
megfelelo
jel-zaj
viszony
eléréséhez.
A
képeket
számítógépes képfeldolgozó rendszer (Winview, Princeton Instruments Inc, Princeton, NJ, USA) segítségével értékeltük ki.
44
4.2.2. A lézer-Doppler méroegység A kísérletek egy részében (iszkémia-reperfúzió) a szöveti véráramlást az általunk kalciummérésre is kiválasztott felületi izomrégióban lézerDoppler módszerrel mértük meg. Az egység a kialakított mérorendszer moduláris eleme (LD-01, Experimetria Kft. Budapest), széles körben alkalmazzák az izom perfúziójának ellenorzésére. A mérés a Dopplerelv alapján, egy mikrorégiót megvilágító lézersugár segítségével történik. A vörösvérsejtek mozgása a vizsgált területen megváltoztatja a lézersugár interferenciaképét, az interferenciaváltozások mérésével és a kimeno jel frekvencia-analízisével a vörösvérsejtek áramlási sebessége meghatározható. 4.3. A vizsgált paraméterek. 4.3.1. A kapilláris keringés meghatározása Kísérleteinkben
a
mikrocirkuláció
stabilitásának,
valamint
az
iszkémia-reperfúzió mértékének meghatározására a rostok között elhelyezkedo kapillárisokban a vörösvérsejtek áramlási sebességét vizsgáltuk. Az izomfelszínt 405 nm-en világítottuk meg, a vörösvérsejtáramlást videorekorderrel rögzítettük. A képeket off-line dolgoztuk fel, manuális
„frame-by-frame”
technikával.
A
méréseket
mintavételszeruen nyugalmi állapotban, és a beavatkozások alatt (az isémiás és a reperfúziós fázis alatt) 15 percenként végeztük. A mikrocirkuláció kvantitatív jellemzésére egy hat fokozatú (0-5) skálát használtunk, ahol 0: a teljes keringésleállást, 1: egy-egy vörösvérsejt lassú mozgása 2-3: lelassult áramlást, 4: nyugalmi áramlást, 5: hiperémiát jelent. A megítélés szubjektív voltát eliminálandó, a méréseket egyazon személy egyszerre, off-line módon végezte.
45
4.3.2. Szöveti áramlás meghatározása Az aorta ligatúra hatékonyságának ellenorzése céljából megmértük a véráramlást is az izmokban, a lézer-Doppler segítségével, a fentebb leírtak alapján. Az általunk használt konfigurációban a két mérofej, melyeket fixen rögzítettünk a tartólapon, közvetlenül érintkezik a két izom felszínével az „immerziós árok”-ban. A mérofejeket a lézerDoppler
egységhez
száloptikával
illesztettük.
A
kimeno
jelet
számítógéppel dolgoztuk fel (Isosys, Experimetria, Budapest). 4.3.3. Az intracelluláris szabad kalcium szint Az [Ca2+]ic szintet a fent leírt Indo-1 AM mikrofluorometriás módszerrel határoztuk meg A festéket szuperfúzióval juttattuk az intakt izmok felszíni rostjaiba. A [Ca2+]ic -szint változásait a kalciumot köto és a szabad
festékek
aránya
alapján
értékeltük.
A
kísérlet
elején
kiválasztottuk a vizsgált területet, a szöveti autofluoreszcencia értékét rögzítettük (háttér érték), majd a 30 perces feltöltési és 20 perces kimosási fázis után 5 percenként rögzítettük a képeket a két hullámhosszon. E területbol egy jól azonosítható, nagyobb erektol mentes, csak néhány kapillárist tartalmazó régiót választottunk ki a 400/506 nm-es fluoreszcens hányados kvantitatív meghatározására. A mérésre kijelölt terület oldalsó határait az izomrostok széleinek megfeleloen állítottuk be, és mérete általában kisebb volt, mint 100 µm x 100 µm. A koffein hatásának vizsgálatakor az egyes koffeindózisok között megvártuk, amíg az intenzitásértékek visszatértek a nyugalmi szintre. 4.3.4. NADH fluoreszcencia mérése Kísérleteinkben
az
adott
mikrorégióban
kiválasztottunk
2-3
párhuzamos rostot és az egyes rostokban individuálisan megmértük a 46
fluoreszcens intenzitást (365 nm-es abszorpciós és 465 nm-es emissziós
filter).
Az
aktuális
mérési
területeket
kapillárisoktól
megfeleloen távol választottuk ki. Mérési ablak pozícióját képrol képre rostfelülethez igazítva korrigáltuk. A mintavétel 5 percenként történt. A reflektancia jelet párhuzamosan rögzítettük (365 nm-es emissziós filter), amennyiben ennek az értéke megváltozott, a fluoreszcens értékeket kizártuk az értékelésbol. 4.4. Kísérleti modell A méréseket hím Sprague Dawley patkányokon végeztük (110? 10g). 4.4.1. Anesztézia, mutéti elokészítés Az állatok altatása 40 mg/kg testsúly dózisú intraperitoneális pentobarbital
injekcióval
történt
(Nembutal, Sanofi). Az altatás
fenntartására, amennyiben szükség volt rá további pentobarbital injekciókat alkalmaztunk 10 mg/kg dózisban. A preparáláshoz és a mérésekhez az állatokat állandó homérsékleten (37°C) tartott tartólapon helyeztük el. A bal a. carotisba és a v. jugularisba kanült helyeztünk, az artériás kanült vérnyomásmérés céljából Statham P23 Gb nyomásméro fejhez csatlakoztattuk, a vénás kanült folyadékpótlásra használtuk. A vérnyomást folyamatosan monitoroztuk. A kísérletekbol kizártuk azokat a preparátumokat, ahol az artériás középnyomás a kísérlet során tartósan 90 Hgmm alá esett. 4.4.2. Aorta ligatúra Kísérleteink egyik csoportjában az alsó végtagi iszkémia hatását vizsgáltuk a m. soleus és a m. extensor digitorum longus izomokban. Az
altatott
állaton
a
hasüreget
2
cm-es
medián
metszéssel
megnyitottuk, a belso szervek óvatos repozíciójával feltártuk az aorta 47
hasi szakaszát. Az a. renalis leágazása alatti rövid szakaszon az aorta köré 3/0 Vicryl fonalból ligatúrát helyeztünk fel. A fonal két szárát egy 3 cm-es polietilén csobe helyeztük, melyet a hasfal zárása után az öltések között vezettünk ki. A preparálás után kivártuk a vérnyomás stabilizálódását (kb. 30 perc). A folyadékvesztést fiziológiás sóoldat folyamatos perfúziójával kompenzáltuk a kísérlet ideje alatt. 4.4.3. Az izmok preparálása Méréseinket a túlnyomóan gyors típusú rostokat tartalmazó m. extensor digitorum longus és a túlnyomóan lassú típusú rostokat tartalmazó m. soleus izmokon végeztük. 4.4.3.1. Intravitál mikroszkópos preparátum Az izmok feltárása a Tyml és Budreau által kidolgozott m. extensor digitorum longus preparálási technikát módosítottuk és adaptáltuk a m. soleusra is (187). A bal oldalára fektetett állat kinyújtott jobb alsó végtagját proximálisan a térdénél és disztálisan pedig a bokaizületénél rögzítettük. Az izom területe fölött a bort megnyitottuk. A felszínesen elhelyezkedo m. biceps femoris - t óvatosan leválasztottuk mediális tapadása mentén a tibiáról és félrehajtottuk. Az izmot részlegesen takaró m. tibiális anterior félrehajtásával feltártuk a m. extensor digitorum longus felszínének egy részét (5 mm x 10 mm). A m. soleus feltárásánál az izom területe fölött a bort megnyitottuk, és az izom laterális szélét a tapadása mentén óvatosan leválasztottuk a faszciáról. A bort oldalra kifeszítettük és feltártuk a m. soleus felszínét (5 mm x 10 mm). A preparáció és a mérések alatt az izom felszínét 37°C – os fiziológiás
sóoldattal
szuperfundáltuk.
Az
esetleges
vérzéseket
mikrokauterizáltuk, továbbá a preparáció minden esetben az izom felszínének
és
környezetének
érintése
nélkül
történt.
A
kész
preparátum széleinél a félrehúzott bort 5/0 Prolen fonallal a tartólapra 48
szerelt állványhoz rögzítettük, a feltárt rész körül 0,5 cm magasságban szilikonból szivárgásmentes peremet alakítottunk ki. Így a feltárt rostok felett kb. 1 ml térfogatú fiziológiás sóoldattal telt árkot alakítottunk ki, mely immerziós folyadékként, levegozáró rétegként, valamint a szuperfúzióval bejuttatott anyagok érintkezési közegeként (kalciummérésre
használt
festék
és
a
topikálisan
alkalmazott
hatóanyagok) szolgált („immerziós árok”). A preparálás befejezését 20 perces nyugalmi periódus követte. 4.4.3.2. Kontrakúrás küszöb meghatározása A
mérések
egy
részében
az
izomkontraktúra
küszöbértékéit
hasonlítottuk össze in situ a SOL és az EDL izmokon. A méréseket a Rácz és mtsai által kidolgozott technika segítségével végeztük el. Az altatott állatokat állandó homérsékleten tartott (37°C) speciális asztalra helyeztük (Experimetria Kft, Budapest) és a kinyújtott alsó végtagot a térd és a bokaizületnél rögzítettük. Az izmok feltárása a fent részletezett módon történt, a preparálás végén a disztálisan tapadó inat átvágtuk, és selyemfonalat helyeztünk fel rá. Az izmot a fonallal egy eromérohöz rögzítettük. A kísérletek folyamán az izmokat felszínét 37°C – os fiziológiás sóoldattal szuperfundáltuk. A SOL és az EDL izmok
kontrakciós
küszöbét
topikális
koffein
alkalmazásával
határoztuk meg. A koffeinoldat hatására bekövetkezo izometriás feszülést
az
izmokhoz
kapcsolt
kiértékelo
rendszer segítségével
(Experimetria, Budapest) kaptuk meg. Az izom nyugalmi feszülésének értékét 2 g-ra állítottuk be. A fokozatosan emelt koffein koncentrációjú oldatotokat
folyamatosan
szuperfundáltuk,
koncentrációt 10 percig.
49
minden
egyes
4.5. Felhasznált vegyszerek 4.5.1. Indo-1 AM Az Indo-1 AM (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) intakt rostokon történo alkalmazásához a következo elokészítést alkalmaztuk: száraz dimetilszulfoxidban
(1mg/ml)
feloldottuk;
15%
Pluronic
F-127
(mindketto Sigma) és fiziológiás sóoldat hozzáadásával 10 ml - re hígítottuk, így a végso koncentráció 35 µM volt. A rostok festékkel történo feltöltésére kidolgoztunk egy szuperfúziós technikát. A festéket az izom felett képzett immerziós árokba juttattuk, innen szivárgott a felületes szövetrétegbe. A feltöltés ideje 30 perc volt, utána fiziológiás sóoldat szuperfúziójával kimostuk a szövetközti térbol a felesleges festéket (20 perc). A szuperfundált folyadék homérsékletét folyamatosan 37°C –on tartottuk. 4.5.2. A felhasználásra került egyéb vegyszerek, oldatok Szuperfúziós folyadékként és intravénás folyadékpótlásra fiziológiás sóoldatot alkalmaztunk. A koffeint (Richter) fiziológiás sóoldatban oldottuk fel (1, 2, 5, 10, 20, 50, 100 mM). 4.6. Kísérleti protokoll 4.6.1. [Ca2+ ]ic-szint mérések Az Indo-1 festék szöveti kinetikájának meghatározásához a 30 perces feltöltési és 20 perces kimosási fázis után fluoreszcens jelek változásait 5 percenkénti mintavétellel 90 percig követtük. A koffein hatásának vizsgálatakor a dózisokat egymástól függetlenül vizsgáltuk (1, 2, 5, 10, 20, 50 mM) az egyes koncentrációk között megvártuk, míg a [Ca2+]ic szint visszatér a nyugalmi értékre. 50
4.6.2. NADH fluoreszcencia mérése Az iszkémia hatását 1 órás érleszorítás és az azt követo reperfúzió során
tanulmányoztuk.
Ez
az
iszkémia
harántcsíkolt
izomban
reverzibilis károsodást okoz, a funkcionális vizsgálatok szerint az ezt követo 1-2 órás reperfúzió után teljes restitúció jön létre. Mérési pontjaink 15 percenként voltak, a mikrocirkulációt az iszkémia, valamint a reperfúziós fázis elején és végén vizsgáltuk. A szöveti véráramlás mérését párhuzamos kísérletekben vizsgáltuk azonos hosszúságú iszkémiás-reperfúziós ciklus alatt. 4.7. Adatfeldolgozás, statisztikai analízis A festékkel feltöltött szövetben rögzített fluoreszcens jelek a [Ca2+]ic függo
Indo-1
és
a
[Ca2+]ic -független háttér autofluoreszcencia
összegébol állnak. A 400 és 506 nm-en felvett képeket használtuk a [Ca2+]ic –függo hányados meghatározására, míg a 465 nm-es képek – mely hullámhossz izozbesztikus a [Ca2+]ic –függo változásokra nézve segítségével elemeztük az izomrostokból történo festék “szivárgás” mértékét. A kísérlet során sötétárammal is korrigáltunk; a kamera zárt blende nyílása
mellett
felvett
háttérintenzitást
pixelenként
vontuk
le.
Következésképpen, az ily módon korrigált fluoreszcens képek a tényleges fluoreszcencia-intenzitás eloszlást adják meg az adott hullámhosszon. A digitális kamera segítségével 400, 506, 465 és 365 nm hullámhosszúságokon rögzítettük az izom egy elore kiválasztott területének sorozat felvételeit. A fluoreszcens és emittált jelek statisztikai analízisét e területre vonatkozóan végeztük el. A [Ca2+]ic függo 400/506 nm-es hányados kiszámítására korrigált 400 és 506 nm-es képeket használtuk.
51
Az iszkémia és reperfúzió alatti szöveti autofluoreszcencia változást 460 nm-en mérve a NADH fluoreszcenciát kaptuk. Ezeket a képeket is korrigáltuk a sötétárammal szemben. Minden egyedi fluoreszcens képbol a teljes mérési területre vonatkozó átlag és SD értéket számoltunk ki. A statisztikai analízis során egyváltozós variancia-analízist használtunk Duncan post-hoc teszttel kiegészítve,
és
a
statisztikai
szignifikancia-szintet
állapítottuk meg.
52
p<0,05-ben
5. Eredmények
5.1. Iszkémia hatására bekövetkezo változások 5.1.1. Véráramlás az izmokban 5.1.1.1. Szöveti véráramlás A szöveti véráramlás változásait lézer-Doppler módszerrel vizsgáltuk meg 1 órás infrarenális iszkémia és az ezt követo reperfúziós periódus alatt. Méréseinket abban a felületi mikrorégióban végeztük, ahol a kalciumszintet
is
vizsgáltuk.
A
nyugalmi
véráramlás
értéke
hasonlónak bizonyult a kétféle izomtípusban. Az aorta infrarenális szakaszának ligaturája során – az iszkémia alatt-, a reziduális áramlás értéke az egyes izmokban a nyugalmi áramlásának 5,7±4,2 %-a (SOL) illetve 4,2±3,3 %-a (EDL) volt, a két izom között nincs szignifikáns eltérés. A 3-a. Ábrán egy eredeti regisztrátumot ábrázol, ahol egy SOL izom kiválasztott mikrorégiójában mért szöveti áramlást jelenítettük meg, a nyugalmi állapotban (100 %), valamint iszkémia alatt és után. A
kísérletek
következik
be,
legvégén ez
az
szívmegállítással állapot
felel
meg
teljes az
keringésleállást
áramlási
értékek
kalibrálásánál a zéro értéknek. 5.1.1.2. Kapilláriskeringés Az izmok felületes rostjait behálózó egyedi kapillárisok keringését is összevetettük. Az izmok felszínérol készült képeken jól kivehetok a rostok, valamint a kapillárisok a bennük haladó vörösvérsejtekkel. A kapillárisokat és a rostokat mindig párhuzamosan, ugyanabban a felülszíni régióban vizsgáluk. Az 1 órás infrarenalis iszkémia hatását az egyes rostokat közvetlenül ellátó nutritív kapillárisok szintjén 53
hasonlítottuk össze a kétféle izomtípusban. Nem tapasztaltunk különbséget sem a nyugalmi, sem pedig az iszkémiás áramlást illetoen (4-b. Ábra).
A.
B.
5 EDL SOL
Kapilláris keing és
4
3
2
1
0
C
I-0
I-6 0
R-0
R-6 0
3. Ábra. a) Lézer-Doppler regisztrátum egy SOL izomról. A nyugalmi szakaszt iszkémia, ezt reperfúzió követi, a kísérlet végén keringésleállás következik be. b) Kapilláris keingés nyugalomban (C), az isémia (I) és a reperfúzió (R) elején és végén. (SOL n=10, EDL n=10)
54
Mindkét izom felületes kapillárisaiban az áramlás az iszkémia elso percében hirtelen lecsökkent, a hat fokozatú szubjektív skálán mérve a 4. fokozatról az 1. fokozatra. Ez az érték az iszkémiás periódus alatt végig megmarad. Az aortaligatura felengedésekor a kapillárisokban a reperfúzió csak fokozatosan indul be, a kapilláris keringés 30 percnél érte el a kiindulási nyugalmi értéket. Reaktív hiperémia ritkán, a vizsgált izmoknak csak 16 %-ában fordult elo, mind a két izomban hasonló arányban. 5.1.2. Anyagcsere változás A NADH fluoreszcencia értéke nyugalmi körülmények között hasonló mindkét izomtípusban (SOL:3092±200 és EDL:3370±161). A 4. Ábrán a
SOL-ban
és
az
EDL-ben
megfigyelheto
NADH-fluoreszcencia
változást követhetjük az 1 órás infrarenális iszkémia és az azt követo 1 órás reperfúzió alatt. A fluoreszcencia értéke az iszkémia elso percében megemelkedik (SOL: 161±7 %, EDL:153±6 %), majd az EDLben az 1 órás iszkémia alatt nem változik, míg SOL-ban fokozatosan tovább emelkedik 30 perces értékig (SOLmaximum: 180±10 %). A reperfúzió megindulásakor a NADH fluoreszcencia értéke azonnal visszaáll a kiindulási értékre. Az infrarenális (fokális) iszkémia és a teljes keringésleállást követo (globális) iszkémia alatt mért maximális NADH fluoreszcencia-változások között nem volt különbség egyik izomtípusban sem. Az érelzáródás helyétol függoen, a le nem zárt érterületekrol a kollatrális keringés anyagcsere és O2 juttathat el a vizsgált szövethez. Ennek szerepét modellünkben a kapott eredmények alapján kizárhatjuk.
55
EDL SOL
NADH + fluoreszcencia változás
200
*
150
100
Iszkémia
50
min
0
0
30
60
90
120
4. Ábra. Az infrarenális iszkémia és a reperfúzió alatt megfigyelheto NADH fluoreszcencia-változás a SOL és az EDL felszíni rostjaiban. *P<0.05
56
5.2. Kalcium-szint mérése az izmokban 5.2.1. Az Indo-1 szöveti kinetikája Kísérleteink elso fázisában arra kerestünk választ, hogy mennyire töltheto fel az intakt felszíni izomréteg a kalciumköto festékkel és a feltöltés után mennyi ideig marad stabil a fluoreszcens intenzitások hányadosértéke, amikor a mérések nagy biztonsággal elvégezhetok. A feltöltési-kimosási ciklus után a szövet fluoreszcens intenzitása az autofluoreszcencia kétszeresére (400 nm -nél) valamint négyszeresére (506
nm-nél)
növekedett.
Ez
az
intenzitás
az
ido
múlásával
fokozatosan csökkent, ahogy ez a 5. Ábrán jól megfigyelheto. Ennek mértéke az intenzitás felezési ideje, mely mindkét rosttípusban körülbelül 18 perc volt. A mérések folyamán a két intenzitásérték hányadosa nem mutatott 10 %-nál nagyobb ingadozást, ami arra utal, hogy
a
hányadosérték
stabil,
annak
ellenére,
hogy
az
egyes
intenzitásértékek folyamatosan csökkenek.
?
5. Ábra. Indo-1 fluoreszcens-intenzitás 400 (? ), 506 ( ) nm-en és ezek hányadosértéke láthatók az EDL és a SOL felületes rostjaiban. Az intenzitásértékeket a nyugalmi értékre normalizáltuk. A mérés a feltöltésikimosási periódus után indult. (SOL n=6, EDL n=8)
57
EDL
0 mM
2 mM
5 mM
10 mM
SOL
0 mM
2 mM
5 mM
10 mM
6. Ábra. Koffein által kiváltott hányadosváltozás az intakt EDL és SOL izmok felszíni rostjaiban. Az egyes ké peken egy 320x320 mm-es izomfelület látható a párhuzamosan futó rostokkal. A színskála értékeit a korrigált 400 és 506 nm-es fluoreszcens intenzitás-értékekbol számoltuk. A képek tetején látható színskála értékei a relatív Indo-1 hányadosértékeknek felelne k meg. (Koffeinkoncentrációk az óramutatóval megegyezo irányban: 0, 2, 5, 10 mM)
58
5.2.2. A koffein által kiváltott fluoreszcens hányadosváltozás A következo ábrasorozaton (6. Ábra) a növekvo koffeinkoncentrációk hatására
bekövetkezo
hányadosérték-változás
dinamikáját
hasonlíthatjuk össze a kétféle izomban. Az egyes felvételeken egy-egy 320x320 µm-es felületes izmréteg látható. Könnyen felismerhetok a párhuzamosan futó izomrostok, a rostok között futó fekete csík egy-egy kapillárisnak felel meg. A mikroere k lefutásának alapján a kétféle izom jól elkülönítheto egymástól. A méréseknél használt területet mindig úgy választottuk ki, hogy ne legyenek benne nagyobb erek. A képeken használt színskála értékei
a
400
és
506
nm-en mért normalizált fluoreszcencia
hányadosértékeinek felel meg. A
7. Ábrán bemutatjuk a SOL és EDL izmokban megfigyelt
intenzitásváltozások átlagát a koffeinkoncentráció függvényében. Az egyes értékek a koffeinadagolás utáni legnagyobb hányadosváltozások átlaga. A kétféle izom rostjai között szignifikáns eltérést találtunk. A SOL
rostjai
már
alacsonyabb
koffeinkoncentrációnál
kiváltanak
[Ca2+]ic -szint változást. Továbbá, a nagyobb koncentrációk által kiváltott kalciumszint növekedések mértéke is szignifikánsan eltért, a SOL-ban magasabb, mint az EDL rostjaiban megfigyelheto változás. (1 mmol: SOL 54±22%, EDL –3±3%; 2 mmol: SOL 33±17%, EDL 9±5%; 5 mmol: SOL 85±36%, EDL 10±3%; 10 mmol: SOL 115±114%, EDL 36±4%; 20 mmol: SOL 144±45%, EDL 18±3%).
59
2.5
*
? I400/500
1.5 * * *
0.5
1
2
5
10
20
-0.5
edl
sol
Koffein [mM]
7. Ábra. Koffein által kiváltott Indo-1 hányadosváltozások intakt SOL és EDL felületes rostjaiban. (SOL n=5, EDL n=5; P<0,05 SOL vs EDL)
6
Izmok száma
5 4 3 2 1 0 1
2
5
10
edl
20
sol
50
100
150
Koffein [mM]
8. Ábra. Koffein kontraktúrát kiváltó küszöbkoncentráció-értékek intakt SOL és EDL izmokban (SOL n=9, EDL n=8). Az ordináta az összehúzódó izmok számát jelöli.
60
5.3. A koffein hatása az izomfeszülésre A koffein által kiváltott kontraktúra szintén eltéro érzékenységet mutatott (8. Ábra). A két izom kontraktúra-küszöbértéke között mintegy tízszeres különbséget mutattunk ki. (EDL: 50 mM, SOL: 5 mM)
61
6. Megbeszélés
6.1. Metodikai kérdések Kutatásunk
célja
az
eltéréseinek
feltárása
intakt volt
a
harántcsíkolt
izom
mikrocirkuláció,
az
rostspecifikus intracelluláris
kalciumszint változás és a rostok anyagcseréjének a szempontjából. 6.1.1. Izmok kiválasztása Laboratóriumunkban egy korábban kifejlesztett transzilluminációs mikroszkóp
segítségével
részletesen
tanulmányoztuk
a
m.
Spinotrapezius anyagcseréjét és keringését. Ez az izom könnyen preparálható,
néhány
izomrétgbol
áll,
így
kiválóan
alkalmas
átvilágításra, viszont rosttösszetétele kevert. Célul tuztük ki, hogy adaptáljuk ezt a mérorendszert olyan homogén izmok vizsgálatára, amelyek segítségével a rosttípus függo jelenségeket tanulmányozhatunk. A kiválasztott két izom a m. soleus, mely túlnyomórészt lassú és a m. extensor digitorum longus, mely túlnyomórészt gyors típusú rostokat tartalmaz (83, 120). Az izmok a bor alatt a felszínhez viszonylag közel helyezkednek el, a bor és az izmokat körülvevo kötoszövetes réteg megnyitásával jól feltárhatók. Egy korábban, a m.extensor digitorum longus kipreparálására leírt módszert (187) módosítva alkalmaztuk
a m. soleus feltárására. A
preparálás rövid, az izmok 20 perc alatt feltárhatók. A beavatkozás során
nincs
sebészeti
trauma,
érintetlenül hagyja.
62
a
preparálás
az
izomrostokat
6.1.2. Epiiluminációs intravitálmikroszkópia A kiválasztott izmok, ellentétben a m. spinotrapezius–sal, vérellátása és beidegzése nemcsak az izom eredésénél és tapadásánál be és kilépo ereken keresztül történik, hanem közvetlenül, az izmokat körülvevo más izmokból is. Ez azt jelenti, hogy ezek az izmok nem emelhetok ki környezetükbol anélkül, hogy maradandóan károsodnának így ezek az izmok
nem
vizsgálhatók
átvilágítással.
Ezért
módosítottuk
a
mérorendszer optikai részét, ezeket az izmokat beeso fénnyel, epiilluminációval világítjuk meg. Az új rendszerünk felépítése látható a 2. Ábrán. A megvilágító fény és a felszínrol reflektált, vagy emittált fénysugár egyetlen, a vizsgált terület fölé helyezett objektíven keresztül halad. Az objektív az izomfelszínt beborító fiziológiás sóoldatba merül, mely folyadékréteg nemcsak az izmot védi a kiszáradástól és az oxigén károsító hatásától, hanem egyben immerziós folyadékként is szolgál. A készülék tehát alkalmas in situ , környezetében érintetlenül meghagyott
izmok
intracelluláris
felszínén
a
felszíni
rostok
kalciumszint-változásának,
anyagcsere -
valamint
és
ezekkel
párhuzamosan az ellátó kapillárishálózat tanulmányozására. 6.1.3. Intracelluláris kalciumszint mérése Az
izomrostok
rostfelszínt
feltöltése
betakaró
szuperfúzióval,
közvetlenül
folyadékrétegbol
történt.
a Az
szabad Indo-1
koncentrációját és a feltöltési idot úgy választottuk meg, hogy az izomrostok
kello
mértékben
feltöltodjenek,
az
egyes
rostokban
megfelelo kalciumjelet kapjuk. Figyelembe kell venni, hogy a rostok vékonysága és a rostkötegeket körülvevo kötoszöveti réteg akadályozza a penetrációt. Az Indo-1 festék intenzitása mind a szabad mind pedig a kötött hullámhosszon fokozatosan csökkent, többek között a rostokban muködo aktív pumparendszer, valamint az UV sugárzásra 63
bekövetkezo festékbomlás, az úgynevezett „photobleaching” hatására. A kalciumszint mérésére használt hányadosérték viszont legalább 90 percig stabil maradt. A rostokat csak a mérésekhez szükséges ideig világítottuk meg UV fénnyel, a sugárzás citotoxikus hatása és az említett „photobleaching” effektus miatt. Rendszerünkkel csak lassú [Ca2+]ic változás detektálható, az egyes hányadosértékek méréséhez szükséges ido kb. 30 másodperc, ez az idobeli felbontás határa. A koffein hatása néhány perc alatt alakul csak ki, a kiváltott [Ca2+]ic tranziens lefutási ideje 3-4 nagyságrenddel kisebb, mint az izom elektromos ingerlésével létrehozott jelváltozás. A kiválasztott festék és az optikai rendszer kombinációja így jól használható a koffein hatására
bekövetkezo
intarcelluláris
kalciumszint-emelkedés
nyomonkövetésére. 6.2. Az izomrost-típusok összehasonlítása
Korábbi kísérleteinkben történt megfigyeléseink, melyeket a heterogén rostösszetételu m. spinotrapezius-on végeztünk, azt mutatják, hogy rövid
ideju
iszkémia
nem
okoz
szignifikáns
változásokat
a
vázizomrostok [Ca2+]ic szintjében, míg a Ca2+-homeosztázis heterogén rendellenességei figyelhetok meg tartós iszkémia kapcsán, azaz kifejezett
[Ca2+]ic -szint
emelkedés
némely
preparátumban
és
korlátozott növekedés másokban. Továbbá, úgy tunik, hogy a tartós iszkémia alatt létrejövo [Ca2+]ic -szint változások és a reperfúziós áramlás mintázatok között kapcsolat áll fenn. Ezek az eredményeink ara utalnak, hogy az izomsejtek legalább 30 percig képesek teljesen tolerálni az O2 és tápanyagok hiányát anélkül, hogy [Ca2+]ic -szint emelkedéséhez vezeto folyamatok indukálódnának. Habár az iszkémia megkezdését
követoen
perceken
belül
megno
a
szöveti
autofluoreszcencia, mely az intramitokondriális NAD+/NADH tartalom redukciójának következménye, ez a látszólagos energiahiány nem változtatja meg a Ca2+ pumpák és csatornák funkcióját, és ezért Ca2+ic 64
felhalmozódás nem következik be az iszkémia elso 30 percében. A tartós iszkémia alatt bekövetkezo Ca2+-homeosztázis-beli különbségek magyarázata a megfigyelt szövetterületen elhelyezkedo izomrostok eltéro típusa lehet. A spinotrapezius izom mind lassú (oxidatív), mind gyors
(glikolitikus)
izomrostokat
tartalmaz,
melyek
O2
iránti
érzékenysége jelentosen eltér (18, 61, 62, 85). Azokban az esetekben, ahol az iszkémia alatt szignifikáns [Ca2+]ic -szint emelkedés következett be, a fluoreszcens képeket valószínuleg foként lassú izomrostokat tartalmazó területrol rögzítettük. Mivel ezekben a rostokban az ATP zöme aerob körülmények között a mitokondriumokban képzodik, az O2-hiány
gyorsan
vezet
a
nagy-energiájú
foszfát-termelés
károsodásához. Ez az állapot ugyanakkor megnyilvánul a normális intracelluláris milio fenntartásáért felelos ioncsatornák és pumpák funkciózavaraiban is. Következésképpen, az O2-hiány [Ca2+]ic -szint emelkedéshez vezet ezekben a rostokban. Azokban az esetekben viszont, ahol 1 vagy 2 óra idotartamú iszkémia nem hozott létre jelentosebb [Ca2+]ic -szint emelkedést, a vizsgált terület foként gyors típusú izomrostokat tartalmazó szövet részben helyezkedhetett el. E rostok jelentos glikolítikus kapacitásuk révén elegendo ATP termelésre lehetnek
képesek,
mely
az
O2-hiány
ellenére
fenntarthatja
az
ioncsatornák és pumpák normálishoz közeli muködését.
6.2.1. Iszkémia hatása az izomrostok anyagcseréjére A túlnyomóan gyors rostokat tartalmazó EDL és a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó SOL izmok iszkémiás érzékenységét vizsgáltuk in vivo NADH fluoreszcencia mérés segítségével, a lokális keringés változásainak összefüggésében. A nyugalmi fluoreszcencia-értékek hasonlónak találtuk a kétféle izomban. Az 1 órás iszkémia során viszont a fluoreszcencia-változás maximumértéke a szignifikánsan magasabb volt a SOL, mint az EDL felületi rostjaiban. Igazoltuk, hogy 65
az 1 órás iszkémia maximális fluoreszcencia-emelkedést okoz mindkét izomban, mivel nem volt különbség az infrarenélis iszkémiás és a teljes
keringésleállás
után
megfigyelheto
fluoreszcens
intenzitásemelkedés között. A reperfúzió alatt a fluoreszcencia értéke az elso percben visszatért a nyugalmi szintre, nem volt különbség a kétféle izom viselkedésében. Az általunk kapott iszkémiás NADH fluoreszcencia-változás hasonló az irodalomból ismert korábbi eredményekhez. A m. gracilis 1 órás iszkémiája során azonos nagyságrendu 130,8±26,4 % emelkedést tapasztaltak, a reperfúzió elején pedig a fluoreszcencia visszatért az alapértékre (189). Korábbi eredmények alapján kövtekeztetni lehetett, hogy a két izom anyagcseréje eltéro. Izolált izmokban anoxia hatására a NADH fluoreszcencia emelkedése a SOL-ban 37 %-os, az EDL-ben 62
%-os
volt
(195).
Hasonló
eredményeket
paktak
biokémiai
módszerekkel is, a redoxpotenciál a SOL-ban 181 %-kal, az EDL-ben 66 %-kal emelkedett (162). Rövid ideju tetániás ingerlés során szintén megfigyelheto a NADH fluoreszcencia-változás rostspecifikus eltérése, SOL-ban 275 %-os, míg EDL-ben 124 %-os intenzitásváltozást tapasztaltak (39). Az így kapott változások abszolút értékei az eltéro metodika miatt nem vethetok össze, de a nagyságrendet illetoen kísérleteinkben az intakt izmokon hasonló in vivo eredményeket kaptunk. A két izom közötti eltérés egyik legkézenfekvobb magyarázata, hogy a SOL
rostjaiban
a
mitokondrium-tartalom nagyobb, így több a
redukálható mitokondriális NAD + mennyisége is. Ismert továbbá, hogy a SOL-rostjaiban a nikotinamid adenin-dinukleotidok oxidáltabb állapotban
vannak,
mint
az
EDL-rostjaiban,
valamint
a
SOL
rostjaiban az elektrontranszport-rendszer kapacitása is nagyobb (162). Az iszkémiás értékek különbözosége mellett megfigyeltük, hogy a SOLban a kezdeti hirtelen emelkedés után tovább fokozódik a NADH fluoreszcencia. Ez a jelenség felveti annak a lehetoségét, hogy a SOL lassú típusú rostjaiban a redox-potenciál értéke többlépcsos. Erre 66
magyarázatot adhat, hogy a keringésleállás elején fellépo oxigénhiány után a különféle szubsztrát „pool”-ok mobilizációja más és más sebességgel történik (39). Mivel a mitokondriális enzimaktiválás kalciumfüggo folyamat és közismert, hogy iszkémia az [Ca2+]ic szint megváltozásával jár (88), egy másik kézenfekvo magyarázat szerint a két izom eltéro viselkedése hátterében az [Ca2+]ic -szint szabályozás rostspecificitása áll. Az isémiában a szöveti keringés teljes leállását figyeltük meg mindkét izomban, az aorta infrarenális szakaszának lezárása a szöveti áramlást 5.7±4.2 %-ra (SOL) illetve 4.2±3.3 %-ra (EDL) csökkentette, míg a mérési területen nem volt kimutatható kapilláris keringés. A szöveti áramlás teljes mértékben helyreállt a reperfúziókor, míg a mikrocirkuláció csak fokozatosan indult újra. A reperfúzió végére megközelítette a nyugalmi értéket. Nem találtunk összefüggést a reperfúzió alatt az egyes mikrorégiókban megfigyelt keringésváltozás és a NADH értékek között. 6.2.2. A [Ca2+ ]ic-szint változás rostspecifikus eltérései Kísérleteink további célja volt, hogy összehasonlítsuk a két, eltéro típusú
izom
rostjaiban
az
intracelluláris
Ca2+-felszabadulás
jellegzetességeit. Erre koffein használata bizonyult a legalkalmasabbnak. Ez a növényi eredetu alkaloida régóta használatos az izommuködés kutatásában. Többek között az izomélettani kutatásokban Kovács és munkatársai (25, 26, 104) végeztek úttöro munkát. A koffein a RyR-on hatva [Ca2+]ic felszabadulást idéz elo a SR-ból, és ennek következtében Ca2+-aktivált izomösszehúzódást
idéz
elo
(kontraktúrát)
a
feszültségfüggo
elektromechanikai-kapcsolás kikerülésével. Ezen túl, a koffein számos más hatással is rendelkezik. Fokozza a kontrakciós erot, úgy, hogy érzékenyíti a keresztkötodési ciklusban résztvevo kontraktilis fehérjék Ca2+-kötését, valamint hat a szarkoplazmatikus kalcium pumpára és 67
gátolja a foszfodiészteráz hatását. Alacsony koncentrációban a koffein legfontosabb
hatása,
hogy
potencírozza
a
Ca2+-indukált-Ca2+
felszabadulás (CICR). (98, 99, 100, 111, 169, 171, 172) Kísérleteinkben
kimutattuk,
hogy
mindkét
típusú
intakt
izom
rostjaiban a [Ca2+]ic -szint emelkedése - a kontraktúra kiváltásához viszonyítva
-
sokkal
alacsonyabb
koffein-koncentrációk
alkalmazásánál bekövetkezik. Korábbi kísérletekbol közismert, hogy a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó SOL és a túlnyomóan gyors rostokat tartalmazó EDL nem egyformán húzódik össze a koffein hatására. Azt is megállapították, hogy a két izom összehúzódásának eltéro koffeinérzékenységét nem magyarázza meg sem az egyes izmok közti méretbeli különbségek, sem a koffein diffúziójából, sem pedig az izmok rostkötegein belüli egyedi rostok kontrakciós válaszának eltéro szinkronizációjából adódó különbségek (87). A két izom kontraktúrás küszöbértékei közötti különbséget mi nagyobbnak találtunk, mint egyes korábbi munkák (169), ami elsosorban az eltéro kísérleti körülményekkel magyarázható meg. A kontraktilis funkciót szabályozó elemek rostspecificitása jól ismert. Kimutatták, hogy a I. típusú rostok kontraktilis apparátusa érzékenyebb koffeinre, mint a II. típusúaké a patkány
izomokban
(15).
Ebben
szerepe
lehet
az
olyan
különbségeknek is, mint amilyenek az egyes troponin-C alfajták kalciumköto-képességének jellegzetességeibol
rosttípusonként
adódnak
(22).
Továbbá
megfigyelheto
kimutatták,
hogy
a
parvalbumin az EDL-rostokban jóval nagyobb koncentrációban fordul elo, mint a SOL-ban. Így a parvalbumin pufferhatása hozzájárulhat a a [Ca2+]ic -szint változás által indukált folyamatok kinetikájában megfigyelheto eltérésekhez (65). Megállapítottuk, hogy már a szubkontraktúrás koffeinkoncentrációk is jelentos
[Ca2+]ic -szint
izomrostjaiban.
Ezek
változást az
idéznek
eredményeink 68
elo
a
patkány
összhangban
intakt
vannak
a
korábbi, izolált rostokon mért értékekkel. Békából izolált gyors-típusú rostokon
a
[Ca2+]ic -szint
emelkedéshez
szükséges
koffein-
küszöbkoncentráció 0,4 mM (100), patkányból izolált SOL és EDL rostokon pedig 0,2 és 1,0 mM-t kaptak (58). Ezek az in vitro eredmények hasonlóak az általunk kapott eredményekhez (SOL: 1,0 mM, EDL: 2,0 mM), melyeket intakt izmok rostjaiban mértünk. Ebbol arra
következtethetünk,
hogy
az
általánosan
használt
in vitro
modellekben az izmok koffeinérzékenysége nem változik meg. Összefoglalva
elmondhatjuk,
hogy
in
vivo
kísérleteinkben
a
túlnyomóan lassú-típusú rostokat tartalmazó SOL érzékenyebb volt mind a [Ca2+]ic változás, mind pedig a kontraktúra szempontjából koffeinre, mint a túlnyomóan gyors-típusú rostokat tartalmazó EDL. Az [Ca2+]ic -szint szabályozása lassú és gyors típusú rostokban sok szempontból különbözik. Ismert, hogy a Ca2+-felszabadulás kinetikája gyorsabb az EDL-bol, mint a SOL-ból izolált nyúzott rostokban (17, 163, 176), SR-vezikulumokban (114) és az intakt rostokban (35, 113) is. Jelentos különbséget találtak a kalcium által indukált kalciumfelszabadulás (CICR) mechanizmusában is a kétféle rosttípus között. Amíg
koffein
intracelluláris
Ca2+-hullámokat
indukált
a
SOL
rostjaiban, addig a koffeinre kevésbé érzékeny EDL-ben ez nem figyelheto meg, amiból arra a következtetésre jutottak, hogy a CICRmechanizmus hiányzik a gyors rostokban (140). Kimutatták, hogy a Ca2+-felszabadulásban kulcsszerepet játszó RyR a különféle típusú rostokban strukturálisan is és funkcionálisan is eltér egymástól (34, 56). A RyR által mediált kalciumválasz nem csak a meglévo receptorsuruségtol
függ,
hanem
az
egyes
receptor
izoformák
elofordulási arányától. A koffein fokozza az elsosorban harántcsíkolt izomban eloforduló RyR1 kalcium szenzitivitását és a nyitott állapot valószínuségének megtalálható,
mértékét.
mennyisége
Ez
az
izoforma
rosttípusonként
mindkét
különbözo.
rostban A
RyR1
denzitása 2-3-szor nagyobb SOL-ban, mint az EDL-ben. A RyR3 69
viszont nagyon érzékeny az [Ca2+]ic szint emelkedésére, mely hatás a receptor nyitott állapotának valószínuségét fokozza, ugyanakkor nem, vagy legalábbis sokkal kevésbé érzékeny koffeinre, mint az RyR1. A RyR3 a gyors típusú EDL rostokban egyáltalán nem fordul elo, viszont a SOL rostjaiban kimutatható, de a RyR1-nél csak 20-50-szer kisebb koncentrációban (31, 55). Bár a RyR alfajták eloszlási különbsége a kétféle rosttípus között jelentosnek tunhet, a kontraktúra kiváltásában az általunk megfigyelt egy nagyságrendu eltérést nem magyarázza kelloképpen a kétféle RyR kalcium-érzékenységében kimutatható különbség. A RyR3
koffeihatásban játszott szerepét azok a kísérletek is
megkérdojelezik, melyeket RyR3 génhiányos („knock-out”) egereken végeztek.
A
normális
izompreparátumokban
és az
a
„knock-out”
elektro-mechanikai
állatokból kapcsolat
izolált ugyanis
semmilyen különbséget nem mutattott (86). Magyrázatul szolgálhat viszont az a megfigyelés, hogy a kétféle izom rostjainak SR-ban a nyugalmi kalcium-tartalom eltéro. EDL esetén az SR telítettsége nem éri el a maximum 50 %-át, míg SOL esetén ez az érték több mint 80 % (57, 129). Az SR kalcium-tartalmának meghatározó szerepére utalnak azok a kísérletek is, melyekben a mechanikailag nyúzott rostokon az SR fiziológiás szinten túli töltése a kalcium-válasz koffein-érzékenységének fokozódásával járt. Bár ez utóbbi eredmények elemzésénél figyelembe kell venni, hogy nyúzott rostokon végzett kísérletekben [Ca2+]ic -szintet, nem mechanikai választ tudunk mérni (140).
Összefoglalva, kísérleteinkben leírtuk a túlnyomóan gyors rostokat tartalmazó EDL és a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó SOL rostjaiban a mikrocirkuláció és az anyagcsere állapot kapcsolatát, valamint bemutattuk az 1 órás iszkémia – 1 órás reperfúzió okozta 70
mitokondriális redoxpotenciál változásokat. Továbbá, sikerült in vivo igazolni
a
[Ca2+]ic -szint
változás
rosttípus-függo
patkány SOL és EDL izom intakt rostjaiban.
71
jellegzetességeit
7. Következtetések
1. Nagyérzékenységu fluoreszcens kamerával kombinált intravitál mikroszkóp felhasználásával lehetové tettük a szöveti [Ca2+]ic szint és a NADH-anyagcsereállapot változásainak kép formában történo megjelenítését, valamint a mikrocirkuláció állapotának egyideju
tanulmányozását
intakt,
eredeti
helyzetében
magtartott patkány m. soleus és m. extensor digitorum longus izmaiban. 2. Az infrarenális aorta ligatúrája reziduális áramlás nélküli teljes isémiát okoz mindkét alsóvégtagi izomban, a SOL-ban és az EDL-ben is. 3. Egy órás infrarenális iszkémia hatására a NADH fluoreszcencia megemelkedik, ennek mértéke a lassú és a gyors rostokat tartalmazó izmokban eltéro. Az ezt követo reperfúzió kezdetén az
anyagcsere-állapot
mindkét
izomban
normalizálódott,
függetlenül a megfigyelt mikrocirkulációs válaszoktól. 4. A koffein által kiváltott mechanikai válasza küszöbértéke egy nagyságrenddel eltért a kétféle izom rostjaiban. 5. Koffein
már
dózisfüggo
a
prekontrakturás
[Ca2+]ic -szint
koncentrációtartományban
változásokat
okoz.
A
változás
érzékenysége és dinamikája is nagyobb volt a túlnyomóan lassú rostokat tartalmazó m. soleusban.
72
8. Köszönetnyilvánítás
Szeretném megköszönni a Semmelweis Egyetem Klinikai Kísérleti Kutató
és
Humán
Élettani
Intézet
minden
munkatársának
támogatását és segítségét. Külön köszönettel tartozom Intézetünk elozo tanszékvezetojének, Dr. Monos Emil professzor úrnak, aki tudományos diákkörös koromtól kezdve hosszú éveken keresztül jó szándékkal ösztönözte, segítette munkámat, támogatta ösztöndíj lehetoségeimet. Köszönöm Intézetünk jelenlegi tanszékvezetojének, Dr. Kollai Márk professzor úrnak, hogy érdeklodo támogatásával mögöttem állt, és biztosította a feltételeket e munka
befejezéséhez.
Hálával
tartozom
Dr.
Ligeti
László
témavezetomnek, hogy az elmúlt években folyamatos érdeklodésével ösztönzött
a
kísérletes
munkám
minél
sikeresebb
elvégzésére,
valamint azt, hogy a PhD disszertációm elkészítése során támogatását nem
feladva
serkentett
a
munka
befejezésére.
Köszönöm
legközvetlenebb munkatársaimnak, Dr. Tóth Andrásnak, Dr. Ivanics Tamásnak, Dr. Ruttner Zoltánnak, és Dr. Miklós Zsuzsannának, akik folyamatosan
segítettek
és
együttmuködtek
velem
a
kísérletes
munkában, a publikációk elkészítésében, és így alapveto szerepük volt abban, hogy ez a disszertáció elkészülhessen. Köszönöm volt és jelenlegi külföldi együttmuködo kollegáknak, Dr. Robert Reneman, Dr. Dick Slaaf professzor uraknak a Maastricht University-rol segíto támogatásukat, kooperációjukat. Külön megköszönöm jelenlegi témavezetomnek, Dr. Kunos György professzor úrnak a segítséget és a lehetoséget, hogy ez a munka elkészüljön. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm feleségem, Bátkai Carole és gyermekeim, Morgane, Bottyán és Kloé, valamint édesanyám türelmét és a segítségét, melyet a disszertáció elkészítése során tanúsítottak.
73
9. Rövidítések ATP
adenozin trifoszfát
AM
acetoxi-metilészter
ATP-áz
adenozin trifoszfatáz
[Ca2+]ic
intracelluláris szabad kalcium
CCD
„charge coupled device”
cDNS
„complementary” dezoxiribonukleinsav
CICR
kalcium indukált kalcium felszabadulás
CoA
koenzim A
CaM
kalmodulin
DHPR
dihidropiridin receptor
EDL
musculus extensor digitorum longus
EDTA
„ethylenediaminetetraacetic acid”
FG
gyors glikolitikus („fast glycolitic”)
FO
gyors oxidatív („fast oxydative”)
FOG
gyors oxidatív glikolitikus („fast oxydative glycolitic”)
IP3
inositol trifoszfát
MHC
miozin nehészlánc („myosin heavy hain”)
MLC
miozin könnyulánc („myosin light hain”)
mRNS
„messenger” ribonukleinsav
NAD+/NADH
nikotinamid dinukleotid/redukált nikotinamid dinukleotid
NOS
„nitric oxide” szintáz
PLN
foszfolamban
PMCA
szarkolemmális kalcium ATP-áz
RyR
rianodin receptor
SERCA
szarkoplazmatikus retikulum-kalcium pumpa
SLN
szarkolipin
SO
lassú oxidatív („slow oxydative”)
SOL
musculus soleus
SR
szarkoplazmatikus retikulum 74
TN
Troponin
75
10. Irodalomjegyzék
1. Ahmed SK, Egginton S, Jakeman PM, Mannion AF, Ross HF. 1997. Is human skeletal muscle capillary supply modelled according to fibre size or fibre type? Exp. Physiol 82:231-4 2. Appelt D, Shen V, Franzini -Armstrong C. 1991. Quantitation of Ca ATPase, feet and mitochondria in superfast muscle fibres from the toadfish, Opsanus tau. J Muscle Res. Cell Motil. 12:543-52
3. Awerbuck D, Luong V, Plyley MJ, McKee NH. 1994. Skeletal muscle form and function after 4 hr ischemia-hypothermia. J Surg. Res. 57:480-6
4. Baker AJ, Brandes R, Schreur JH, Camacho SA, Weiner MW. 1994. Protein and acidosis alter calcium-binding and fluorescence spectra of the calcium indicator indo-1. Biophys. J 67:1646-54 5. Bar A, Pette D. 1988. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS Lett. 235:153-5 6. Barnard RJ, Edgerton VR, Furukawa T, Peter JB. Histochemical, biochemical and contractile properties of red, white and intermediate fibers. Am.J.Physiol 220,
410-414.
1972.
Ref Type: Generic 7. Bass A, Brdiczka D, Eyer P, Hofer S, Pette D. 1969. Metabolic differentiation of distinct muscle types at the level of enzymatic organization. Eur. J Biochem 10:198-206 8. Bárány M. 1967. ATPase activity of myosin correlated with speed of muscle shortening. J Gen Physiol 50:197-218 9. Berchtold MW, Brinkmeier H, Muntener M. 2000. Calcium ion in skeletal muscle: its crucial role for muscle function, plasticity, and disease. Physiol Rev. 80:1215-65
76
10. Bertocchini F, Ovitt CE, Conti A, Barone V, Scholer HR, Bottinelli R, Reggiani C, Sorrentino V. 1997. Requirement for the ryanodine receptor type 3 for efficient contraction in neonatal skeletal muscles. EMBO J 16:6956-63 11. Bottinelli R, Reggiani C. 2000. Human skeletal muscle fibres: molecular and functional diversity. Prog. Biophys. Mol. Biol. 73:195-262 12. Brandes R, Figueredo VM, Camacho SA, Massie BM, Weiner MW. 1992. Suppression of motion artifacts in fluorescence spectroscopy of perfused hearts. Am. J Physiol 263:H972-H980
13. Brandl CJ, Green NM, Korczak B, MacLennan DH. 1986. Two Ca2+ ATPase genes: homologies and mechanistic implications of deduced amino acid sequences. Cell 44:597-607 14. Brooke MH, Kaiser KK. 1970. Muscle fiber types: How many and what kind? Arch Neurol 23:369-79 15. Brownell AK, Szabo M. 1982. The in-vitro caffeine contracture test: influence of the muscle histochemical profile on test results. Can. Anaesth. Soc. J. 29:218-21
16. Burke RE, Levine DN, Tsairis P, Engel WK. 1971. Mammalian motor units. Science 174:709-12
17. Carroll S, Nicotera P, Pette D. 1999. Calcium transients in single fibers of low-frequency
stimulated
fast- twitch
muscle
of
rat.
Am. J. Physiol
277:C1122-C1129 18. Carvalho AJ, McKee NH, Green HJ. 1996. Metabolic and contractile responses of fast- and slow-twitch rat skeletal muscles to ischemia. Can. J Physiol Pharmacol. 74:1333-41
19. Carvalho AJ, McKee NH, Green HJ. 1997. Metabolic and contractile responses of fast and slow twitch rat skeletal muscles to ischemia and reperfusion. Plast. Reconstr. Surg. 99:163-71
77
20. Chance B, Schoener B. 1959. Localization and kinetics of reduced pyridine nucleotide in living cells by microfluorometry. J Biol. Chem. 234:3044-50
21. Chance B, Cohen P, Jobsis F., Schoener B. 1962. Intracellular oxidationreduction states in vivo. Science 137:499-508
22. Choisy S, Huchet-Cadiou C, Leoty C. 2000. Differential effects of 4-chloro-mcresol and caffeine on skinned fibers from rat fast and slow skeletal muscles. J Pharmacol. Exp. Ther. 294:884-93 23. Close R. 1967. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of rat. J. Physiol 193:45-55 24. Cobbold
PH,
Rink
TJ.
1987.
Fluorescence
and
bioluminescence
measurement of cytoplasmic free calcium. Biochem J 248:313-28 25. Csernoch L, Kovacs L, Nilius B, Szucs G. 1990. Caffeine and the myoplasmic calcium removal mechanisms in cut frog skeletal muscle fibres. Gen. Physiol Biophys. 9:251-66
26. Csernoch L, Szentesi P, Kovacs L. 1999. Differential effects of caffeine and perchlorate on excitation- contraction coupling in mammalian skeletal muscle. J. Physiol 520 Pt 1:217-30 27. Damiani E, Salvatori S, Zorzato F, Margreth A. 1986. Characteristics of skele tal muscle calsequestrin: comparison of mammalian, amphibian and avian muscles. J. Muscle Res. Cell Motil. 7:435-45
28. Damiani E, Heilmann C, Salvatori S, Margreth A. 1989. Characterization of high-capacity low-affinity calcium binding protein of liver endoplasmic reticulum: calsequestrin-like and divergent properties.
Biochem. Biophys.
Res. Commun. 165:973-80
29. Damiani E, Salvatori S, Margreth A. 1990. Characterization of calsequestrin of avian skeletal muscle. J. Muscle Res. Cell Motil. 11:48-55
78
30. Damiani E, Margreth A. 1990. Specific protein-protein interactions of calsequestrin with junctional sarcoplasmic reticulum of skeletal muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172:1253-9 31. Damiani E, Margreth A. 1994. Characterization study of the ryanodine receptor and of calsequestrin isoforms of mammalian skeletal muscles in relation to fibre types. J. Muscle Res. Cell Motil. 15:86-101
32. Damiani E, Larsson L, Margreth A. 1996. Age-related abnormalities in regulation of the ryanodine receptor in rat fast-twitch muscle. Cell Calcium 19:15-27 33. Damiani E, Sacchetto R, Margreth A. 2000. Variation of phospholamban in slow-twitch muscle sarcoplasmic reticulum between mammalian species and a link to the substrate specificity of endogenous Ca(2+)-calmodulindependent protein kinase. Biochim. Biophys. Acta 1464:231-41 34. Danieli -Betto
D,
Betto
R,
Midrio
M.
1990.
Calcium
sensitivity
and
myofibrillar protein isoforms of rat skinned skeletal muscle fibres. Pflugers Arch. 417:303-8
35. Delbono O, Meissner G. 1996. Sarcoplasmic reticulum Ca2+ release in rat slow- and fast-twitch muscles. J Membr. Biol. 151:123-30
36. Deveci D, Marshall JM, Egginton S. 2001. Relationship between capillary angiogenesis, fiber type, and fiber size in chronic systemic hypoxia. Am. J. Physiol Heart Circ. Physiol 281:H241-H252 37. Dora E, Kovach AG. 1977. Factors influencing the correction factor used to eliminate the apparent NADH fluorescence changes caused by alterations in cerebrocortical blood content. Adv. Exp. Med. Biol. 94:113-8
38. Dora E, Gyulai L, Kovach AG. 1984. Determinants of brain activationinduced cortical NAD/NADH responses in vivo. Brain Res. 299:61-72
39. Duboc D, Muffat-Joly M, Renault G, Degeorges M, Toussaint M, Pocidalo JJ. 1988. In situ NADH laser fluorimetry of rat fast- and slow-twitch muscles during tetanus. J Appl. Physiol 64:2692-5
79
40. Dubowitz V, Brooke MH. 1973. Muscle biopsy: a modern approach. In Major problems in neurology, ed. JD Walton, London: Saunders
41. Dux
L,
Martonosi
A.
1984.
Membrane
crystals
of
Ca2+-ATPase
in
sarcoplasmic reticulum of fast and slow skeletal and cardiac muscles. Eur. J. Biochem. 141:43-9 42. Dux L. 1993. Muscle relaxation and sarcoplasmic reticulum function in different muscle types. Rev. Physiol Biochem Pharmacol. 122:69-147 43. Egginton S, Hudlicka O, Brown MD, Walter H, Weiss JB, Bate A. 1998. Capillary growth in relation to blood flow and performance in overloaded rat skeletal muscle. J. Appl. Physiol 85:2025-32
44. Egginton S, Hudlicka O. 2000. Selective long-term electrical stimulation of fast glycolytic fibres increases capillary supply but not oxidative enzyme activity in rat skeletal muscles. Exp. Physiol 85:567-73 45. Egginton
S,
Zhou
AL,
Brown
MD,
Hudlicka
O.
2001.
Unorthodox
angiogenesi s in skeletal muscle. Cardiovasc. Res. 49:634-46 46. Eke A, Hutiray G, Kovach AG. 1979. Induced hemodilution detected by reflectometry for measuring microregional blood flow and blood volume in cat brain cortex. Am. J Physiol 236:H759-H768
47. Engel WK. 1962. The essentiality of histo- and cytochemical studies of the skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neuorology 12:778-84 48. Ewart HS, Klip A. 1995. Hormonal regulation of the Na(+)-K(+)-ATPase: mechanisms underlying rapid and sustained changes in pump activity. Am. J. Physiol 269:C295-C311
49. Ferguson DG, Young EF, Raeymaekers L, Kranias EG. 1988. Localization of phospholamban in smooth muscle using immunogold electron microscopy. J Cell Biol. 107:555-62
80
50. Fish JS, McKee NH, Pynn BR, Kuzon WM, Jr., Plyley MJ. 1989. Isometric contractile function recovery following tourniquet ischemia. J Surg. Res. 47:365-70 51. Fish JS, McKee NH, Kuzon WM, Jr., Plyley MJ. 1993. The effect of hypothermia on changes in isometric contractile function in skeletal muscle after tourniquet ischemia. J Hand Surg. [Am. ] 18:210-7
52. Fliegel L, Burns K, Opas M, Michalak M. 1989. The high-affinity calcium binding protein of sarcoplasmic reticulum. Tissue distribution, and homology with calregulin. Biochim. Biophys. Acta 982:1-8 53. Fliegel L, Burns K, MacLennan DH, Reithmeier RA, Michalak M. 1989. Molecular cloning of the high affinity calcium-binding protein (calreticulin) of skeletal muscle sarcoplasmic reticulum. J Biol. Chem. 264:21522-8
54. Fliegel L, Michalak M. 1991. Fast-twitch and slow-twitch skeletal muscles express the same isoform of calreticulin. Biochem Biophys. Res. Commun. 177:979-84 55. Franck JP, Morrissette J, Keen JE, Londraville RL, Beamsley M, Block BA. 1998. Cloning and characterization of fiber type -specific ryanodine receptor isoforms in skeletal muscles of fish. Am. J. Physiol 275:C401-C415
56. Franzini -Armstrong C, Protasi F. 1997. Ryanodine receptors of striated muscles: a complex channel capable of multiple interactions. Physiol Rev. 77:699-729 57. Fryer MW, Neering IR. 1986. Relationship between intracellular calcium concentration and relaxation of rat fast and slow muscles. Neurosci. Lett. 64:231-5
58. Fryer MW, Neering IR. 1989. Actions of caffeine on fast- and slow-twitch muscles of the rat. J. Physiol 416:435-54
59. Fryer MW, Stephenson DG. 1996. Total and sarcoplasmic reticulum calcium contents of skinned fibres from rat skeletal muscle. J. Physiol 493 ( Pt 2):357-70
81
60. Galler S, Hilber K, Gohlsch B, Pette D. 1997. Two functionally distinct myosin heavy chain isoforms in slow skeletal muscle fibres. FEBS Lett. 410:150-2 61. Gardner VO, Caiozzo VJ, Long ST, Stoffel J, McMaster WC, Prietto CA. 1984. Contractile properties of slow and fast muscle following tourniquet ischemia. Am. J Sports Med. 12:417-23
62. Green HJ, McKee NH, Carvalho AJ, Dossett-Mercer JC. 1996. Ischemiainduced alterations in sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-ATPase activity in rat soleus and EDL muscles. Am. J Physiol 271:C1942-C 1948 63. Green HJ, McKee NH, Carvalho AJ, Phillips SM. 1997. Reductions in sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase activity in rat skeletal muscles of different fibre composition with ischemia and reperfusion. Can. J Physiol Pharmacol. 75:78-82 64. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. 1985. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol. Chem. 260:3440-50
65. Gundersen K, Leberer E, Lomo T, Pette D, Staron RS. 1988. Fibre types, calcium -sequestering proteins and metabolic enzymes in denervated and chronically stimulated muscles of the rat. J. Physiol 398:177-89 66. Guth L, Yellin H. 1971. The dynamic nature of the so-called "fiber types" of nammalian skeletal muscle. Exp. Neurol 31:227-300 67. Gyulai L, Chance B, Ligeti L, McDonald G, Cone J. 1988. Correlated in vivo 31P-NMR and NADH fluorometric studies on gerbil brain in graded hypoxia and hyperoxia. Am. J Physiol 254:C699-C708
68. Hamalainen N, Pette D. 1995. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc. Res. Tech. 30:381-9
69. Harbig K, Chance B, Kovach AG, Reivich M. 1976. In vivo measurement of pyridine nucleotide fluorescence from cat brain cortex. J Appl. Physiol 41:480-8
82
70. Heizmann
CW,
Berchtold
MW,
Rowlerson
AM.
1982.
C orrelation
of
parvalbumin concentration with relaxation speed in mammalian muscles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 79:7243-7 71. Heizmann CW, Celio MR, Billeter R. 1983. A new myofibrillar protein characteristic of type I human skeletal muscle fibres. Eur. J. Biochem. 132:657-62
72. Heizmann CW. 1984. Parvalbumin, a relaxing factor in muscle and a neuronal marker in brain. Prog. Clin. Biol. Res. 168:205-10
73. Heizmann CW. 1986. Intracellular calcium-binding proteins: structure and possible functions. J. Cardiovasc. Pharmacol. 8 Suppl 8:S7-12
74. Heizmann CW. 1988. Calcium-binding proteins of the EF-type. J. Cardiovasc. Pharmacol. 12 Suppl 5:S30-S37
75. Heizmann CW, Schafer BW. 1990. Internal calcium -binding proteins. Semin. Cell Biol. 1:277-82
76. Henneman E, Harris D. 1976. Identification of fast and slow firing types of motoneurons in the same pool. Prog. Brain Res. 44:377-82
77. Hilber K, Galler S, Pette D. 1997. Functional differences of myosin heavychain isoforms in skeletal muscle. Naturwissenschaften 84:201-4
78. Huber B, Pette D. 1996. Dynamics of parvalbumin expression in lowfrequency-stimulated fast- twitch rat muscle. Eur. J. Biochem. 236:814-9
79. Hudlicka O, Aitman T, Heilig A, Leberer E, Tyler KR, Pette D. 1984. Effects of different patterns of long-term stimulation on blood flow, fuel uptake and enzyme activities in rabbit fast skeletal muscles. Pflugers Arch. 402:306-11 80. Hudlicka O, Tyler KR. 1984. The effect of long-term high-frequency stimulation on capillary density and fibre types in rabbit fast muscles. J. Physiol 353:435-45
81. Hudlicka O. 1991. What makes blood vessels grow? J. Physiol 444:1-24
83
82. Hudlicka O, Brown MD, Egginton S, Dawson JM. 1994. Effect of long-term electrical stimulation on vascular supply and fatigue in chronically ischemic muscles. J. Appl. Physiol 77:1317-24 83. Hudlicka O. 1995. Fibre composition of rabbit tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles. J. Anat. 186 ( Pt 2):447 84. Hundal HS, Marette A, Ramlal T, Liu Z, Klip A. 1993. Expression of beta subunit isoforms of the Na+,K(+)-ATPase is muscle type -specific. FEBS Lett. 328:253-8
85. Idstrom JP, Soussi B, Elander A, Bylund-Fellenius AC. 1990. Purine metabolism after in vivo ischemia and reperfusion in rat skeletal muscle. Am. J Physiol 258:H1668-H1673 86. Ikemoto T, Komazaki S, Takeshima H, Nishi M, Noda T, Iino M, Endo M. 1997. Functional and morphological features of skeletal muscle from mutant mice lacking both type 1 and type 3 ryanodine receptors. J Physiol 501 ( Pt 2):305-12 87. Isaacson A, Hinkes MJ, Taylor SR. 1970. Contracture and twitch potentiation of fast and slow muscles of the rat at 20 and 37 C. Am. J. Physiol 218:33-41 88. Ivanics T, Miklos Z, Ruttner Z, Batkai S, Slaaf DW, Reneman RS, Toth A, Ligeti L. 2000. Ischemia/reperfusion-induced changes in intracellular free Ca2+ levels in rat skeletal muscle fibers--an in vivo study. Pflugers Arch. 440:302-8 89. Ivanics T, Miklos Z, Dezsi L, Ikrenyi K, Toth A, Roemen TH, Van der Vusse GJ, Ligeti L. 2001. Concomitant accumulation of intracellular free calcium and arachidonic acid in the ischemic-reperfused rat heart. Mol. Cell Biochem. 226:119-28 90. Jeffery S, Kelly CD, Carter N, Kaufmann M, Termin A, Pette D. 1990. Chronic stimulation-induced effects point to a coordinated expression of carbonic anhydrase III and slow myosin heavy chain in skeletal muscle. FEBS Lett. 262:225-7
84
91. Jennische E. 1985. Ischaemia-induced injury in glycogen-depleted skeletal muscle. Selective vulnerability of FG-fibres. Acta Physiol Scand. 125:727-34
92. Johnson JD, Jiang Y, Rall JA. 1999. Intracellular EDTA mimics parvalbumin in the promotion of skeletal muscle relaxation. Biophys. J 76:1514-22
93. Klenerman L, Lowe NM, Miller I, Fryer PR, Green CJ, Jackson MJ. 1995. Dantrolene sodium protects against experimental ischemia and reperfusion damage to skeletal muscle. Acta Orthop. Scand. 66:352-8 94. Klug G, Wiehrer W, Reichmann H, Leberer E, Pette D. 1983. Relationships between early alterations in parvalbumins, sarcoplasmic reticulum and metabolic enzymes in chronically stimulated fast twitch muscle. Pflugers Arch. 399:280-4 95. Klug GA, Leberer E, Leisner E, Simoneau JA, Pette D. 1988. Relationship between parvalbumin content and the speed of relaxation in chronically stimulated rabbit fast-twitch muscle. Pflugers Arch. 411:126-31
96. Knoll P. 1891. Uber protoplasmaarme und protoplasmareiche Musculatur. Denkschr Kais Akad Wiss Wien Math Naturwiss Cl 58:633-700
97. Kobayashi S, Nishiki K, Kaede K, Ogata E. 1971. Optical consequences of blood substitution on tissue oxidation- reduction state microfluorometry. J Appl. Physiol 31:93-6 98. Konishi M, Kurihara S, Sakai T. 1984. The effects of caffeine on tension development and intracellular calcium transients in rat ventricular muscle. J. Physiol 355:605-18
99. Konishi M, Kurihara S, Sakai T. 1985. Change in intracellular calcium ion concentration induced by caffeine and rapid cooling in frog skeletal muscle fibres. J. Physiol 365:131-46 100. Konishi M, Kurihara S. 1987. Effects of caffeine on intracellular calcium concentrations in frog skeletal muscle fibres. J. Physiol 383:269-83
85
101. Koretsky AP, Katz LA, Balaban RS. 1987. Determination of pyridine nucleotide fluorescence from the perfused heart using an internal standard. Am. J Physiol 253:H856-H862 102. Kovacs L, Schneider MF. 1977. Increased optical transparency associated with excitation--contraction coupling in voltage-clamped cut skeletal muscle fibres. Nature 265:556-60
103. Kovacs L, Rios E, Schneider MF. 1983. Measurement and modification of free calcium transients in frog skeletal muscle fibres by a metallochromic indicator dye. J. Physiol 343:161-96 104. Kovacs L, Szucs G. 1983. Effect of caffeine on intramembrane charge movement and calcium transients in cut skeletal muscle fibres of the frog. J. Physiol 341:559-78
105. Krenacs T, Molnar E, Dobo E, Dux L. 1989. Fibre typing using sarcoplasmic reticulum
Ca2+-ATPase
and
myoglobin
immunohistochemistry
in
rat
gastrocnemius muscle. Histochem J 21:145-55 106. Krenacs T, Stiller D, Krenacs L, Bahn H, Molnar E, Dux L. 1990. Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2(+)-ATPase as a marker of muscle cell differentiation: immunohistochemical investigations of rhabdomyosarcomas and
enhancement
of
the
immunostaining
after
sodium
methoxide
pretreatment. Acta Histochem 88:159-66
107. Krogh K. 1922. The Anatomy and Physiology of Capillaries. Yale University Press, 1922 Yale University Press.
108. Kruger. 1952. Tetanus und Tonus der quergestreiften Skelettmuskeln der Wirbeltiere und des Menschen. Leipzig: Geest und Portig.
109. Kubinova L, Janacek J, Ribaric S, Cebasek V, Erzen I. 2001. Three dimensional study of the capillary supply of skeletal muscle fibres using confocal microscopy. J. Muscle Res. Cell Motil. 22:217-27
110. Kugelberg E. 1973. Histochemical composition, contraction speed and fatiguability of rat soleus motor unit. J. Neurol. Sci. 20:177-98
86
111. Kurihara S, Konishi M, Sakai T. 1984. Changes in [Ca2+]i induced by rapid cooling of single skele tal muscle fibres treated with low concentration of caffeine. Adv. Exp. Med. Biol. 170:565-8 112. LaManna JC, Pikarsky SM, Sick TJ, Rosenthal M. 1985. A rapid-scanning spectrophotometer designed for biological tissues in vitro or in vivo. Anal. Biochem 144:483-93
113. Laszewski-Williams B, Ruff RL, Gordon AM. 1989. Influence of fiber type and muscle source on Ca2+ sensitivity of rat fibers. Am. J. Physiol 256:C420C427 114. Lee YS, Ondrias K, Duhl AJ, Ehrlich BE, Kim DH. 1991. Comparison of calcium re lease from sarcoplasmic reticulum of slow and fast twitch muscles. J Membr. Biol. 122:155-63
115. Ligeti L, Mayevsky A, Ruttner Z, Kovach AG, McLaughlin AC. 1997. Can the Indo-1 fluorescence approach measure brain intracellular calcium in vivo? A multipa rametric study of cerebrocortical anoxia and ischemia. Cell Calcium 21:115-24
116. Lytton J, Westlin M, Burk SE, Shull GE, MacLennan DH. 1992. Functional comparisons between isoforms of the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum family of calcium pumps. J Biol. Chem. 267:14483-9 117. Lytton J, Nigam SK. 1992. Intracellular calcium: molecules and pools. Curr. Opin. Cell Biol. 4:220-6 118. MacLennan DH. 1990. Molecular tools to elucidate problems in excitationcontraction coupling. Biophys. J 58:1355-65 119. Maier A, Leberer E, Pette D. 1986. Distribution of sarcoplasmic reticulum Ca-ATPase and of calsequestrin in rabbit and rat skeletal muscle fibers. Histochemistry 86:63-9
120. Maltin CA, Delday MI, Baillie AG, Grubb DA, Garlick PJ. 1989. Fiber-type composition of nine rat muscles. I. Changes during the first year of life. Am. J. Physiol 257:E823-E827
87
121. Margreth A, Damiani E, Tobaldin G. 1993. Ratio of dihydropyridine to ryanodine receptors in mammalian and frog twitch muscles in relation to the mechanical hypothesis of excitation- contraction coupling. Biochem. Biophys. Res. Commun. 197:1303-11
122. Marks AR. 1996. Expression and regulation of ryanodine receptor/calcium release channel. Trends in Cardiovascular Medicine 6:136
123. Mathieu-Costello O, Suarez RK, Hochachka PW. 1992. Capillary-to-fiber geometry and mitochondrial density in hummingbird flight muscle. Respir. Physiol 89:113-32 124. Mathieu-Costello O, Szewczak JM, Logemann RB, Agey PJ. 1992. Geometry of blood-tissue exchange in bat flight muscle compared with bat hindlimb and rat soleus muscle. Am. J. Physiol 262:R955-R965
125. Mathieu-Costello O. 1993. Comparative aspects of muscle capillary supply. Annu. Rev. Physiol 55:503-25
126. Matsuda G. 1983. The light chains of muscle myosin: its structure, function, and evolution. Adv. Biophys. 16:185-218
127. Mayevsky A, Ziv I. 1991. Oscillations of cortical oxidative metabolism and microcirculation in the ischaemic brain. Neurol Res. 13:39-47
128. McAllister RM, Amann JF, Laughlin MH. 1993. Skeletal muscle fiber types and their vascular support. J. Reconstr. Microsurg. 9:313-7
129. Meldolesi J, Volpe P, Pozzan T. 1988. The intracellular distribution of calcium. Trends Neurosci. 11:449-52
130. Moncman CL, Wang K. 1998. Effects of thiol protease inhibitors on myoblast fusion and myofibril assembly in vitro. Cell Motil. Cytoskeleton 40:354-67
131. Moss RL, Diffee GM, Greaser ML. 1995. Contractile properties of skeletal muscle fibers in relation to myofibrillar protein isoforms. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol. 126:1-63
88
132. Nemeth PM, Pette D. 1980. The interrelationship of two systems of fiber classification in rat EDL muscle. J. Histochem. Cytochem. 28:193
133. Nemeth PM, Pette D, Vrbova G. 1981. Comparison of enzyme activities among single muscle fibres within defined motor units. J. Physiol 311:489-95
134. Nemeth PM, Lowry OH. 1984. Myoglobin levels in individual human skeletal muscle fibers of different types. J Histochem Cytochem. 32:1211-6
135. Niggli E. 1999. Localized intracellular calcium signaling in muscle: calcium sparks and calcium quarks. Annu. Rev. Physiol 61:311-35
136. Odermatt A, Becker S, Khanna VK, Kurzydlowski K, Leisner E, Pette D, MacLennan DH. 1998. Sarcolipin regulates the activity of SERCA1, the fasttwitch skeletal muscle sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. J. Biol. Chem. 273:12360-9
137. Offord J, Catterall WA. 1989. Electrical activity, cAMP, and cytosolic calcium regulate mRNA encoding sodium channel alpha subunits in rat muscle cells. Neuron 2:1447-52 138. Ogata T, Mori M. 1964. Histochemical study of oxidative enzymes in vertebrate muscles. J Hitochem Cytochem 12:171-182. J.
Histochem.
Cytochem. 12:171-82
139. Padykula HA, Gautier GF. 1955. Factors affecting the activity of adenosine triphosphatase and other phosphatases as measured by histochemical techniques. J. Histochem Cytochem 3:161-167. J. Histochem. Cytochem. 3:161-7
140. Pagala MK, Taylor SR. 1998. Imaging caffeine -induced Ca2+ transients in individual fast-twitch and slow-twitch rat skeletal muscle fibers. Am. J Physiol 274:C623-C632 141. Patterson S, Klenerman L, Biswas M, Rhodes A. 1981. The effect of pneumatic tourniquets on skeletal muscle physiology. Acta Orthop. Scand. 52:171-5
89
142. Perry SV. 1998. Troponin T: genetics, properties and function. J Muscle Res. Cell Motil. 19:575-602
143. Peter JB, Barnard RJ, Edgerton VR, Gillespie CA, Stempel KE. 1972. Metabolic profiles of three fiber types of skeletal muscle in guinea pigs and rabbits. Biochemistry 11:2627-33 144. Petrasek PF, Walker PM. 1994. A clinically relevant small-animal model of skeletal muscle ischemia- reperfusion injury. J Invest Surg. 7:27-38 145. Pette D. 1984. J.B. Wolffe memorial lecture. Activity-induced fast to slow transitions in mammalian m uscle. Med. Sci. Sports Exerc. 16:517-28 146. Pette D. 1985. Metabolic heterogeneity of muscle fibres. J. Exp. Biol. 115:179-89 147. Pette D, Staron RS. 1990. Cellular and molecular diversities of mammalian skeletal muscle fibers. Rev. Physiol Biochem. Pharmacol. 116:1-76 148. Pette D, Peuker H, Staron RS. 1999. The impact of biochemical methods for single muscle fibre analysis. Acta Physiol Scand. 166:261-77 149. Pette D, Staron RS. 2000. Myosin isoforms, muscle fiber types, and transitions. Microsc. Res. Tech. 50:500-9 150. Pette D. 2001. Historical Perspectives: plasticity of mammalian skeletal muscle. J. Appl. Physiol 90:1119-24 151. Pozzan T, Rizzuto R, Volpe P, Meldolesi J. 1994. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiol Rev. 74:595-636 152. Protasi F, Takekura H, Wang Y, Chen SR, Meissner G, Allen PD, FranziniArmstrong C. 2000. RYR1 and RYR3 have different roles in the assembly of calcium release units of skeletal muscle. Biophys. J. 79:2494-508
153. Racz
IB,
Sarkadi
L,
Hamar
J.
1996.
The
functional
damages
ischemic/reperfused skeletal muscle. Acta Physiol Hung. 84:205-16
90
of
154. Racz IB, Illyes G, Sarkadi L, Hamar J. 1997. The functional and morphological damage of ischemic reperfused skeletal muscle. Eur. Surg. Res. 29:254-63 155. Ranvier L. 1874. Du spectre produit par les muscles stries. Arch Physiol T6:274-81 156. Raymackers JM, Gailly P, Schoor MC, Pette D, Schwaller B, Hunziker W, Celio MR, Gillis JM. 2000. Tetanus relaxation of fast skeletal muscles of the mouse made parvalbumin deficient by gene inactivation. J. Physiol 527 Pt 2:355-64 157. Reichmann H, Pette D. 1982. A comparative microphotometric study of succinate dehydrogenase activity levels in type I, IIA and IIB fibres of mammalian and human muscles. Histochemistry 74:27-41
158. Ridgway EB, Ashley CC. 1967. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys. Res. Commun. 29:229-34
159. Ruff RL. 1992. Na current density at and away from end plates on rat fastand slow- twitch skeletal muscle fibers. Am. J Physiol 262:C229-C234
160. Ruttner Z, Ligeti L, Reinlib L, Hines K, McLaughlin AC. 1993. Monitoring of intracellular free calcium in perfused rat liver. Cell Calcium 14:465-72
161. Ruttner Z, Ivanics T, Slaaf DW, Reneman RS, Ligeti L, Toth A. 2000. A novel model for the in vivo monitoring of uterine microcirculation and intracellular free calcium changes in rat. Microvasc. Res. 59:213-20 162. Sahlin K, Katz A. 1986. The content of NADH in rat skeletal muscle at rest and after cyanide poisoning. Biochem J 239:245-8 163. Salviati G, Volpe P. 1988. Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum of skinned fast- and slow- twitch muscle fibers. Am. J Physiol 254:C459-C465 164. Sarkozi S, Szegedi C, Szentesi P, Csernoch L, Kovacs L, Jona I. 2000. Regulation of the rat sarcoplasmic reticulum calcium release channel by calcium. J. Muscle Res. Cell Motil. 21:131-8
91
165. Schneider MF, Chandler WK. 1973. Voltage dependent charge movement of skeletal muscle: a possible step in excitation-contraction coupling. Nature 242:244-6 166. Schneider MF. 1994. Control of calcium release in functioning skeletal muscle fibers. Annu. Rev. Physiol 56:463-84 167. Schwaller B, Dick J, Dhoot G, Carroll S, Vrbova G, Nicotera P, Pette D, Wyss A, Bluethmann H, Hunziker W, Celio MR. 1999. Prolonged contractionrelaxation cycle of fast-twitch muscles in parvalbumin knockout mice. Am. J Physiol 276:C395-C403 168. Sellers JR, Goodson HV, Wang F. 1996. A myosin family reunion. J Muscle Res. Cell Motil. 17:7-22 169. Shah AJ, Pagala MK, Subramani V, Venkatachari SA, Sahgal V. 1988. Effect of fiber types, fascicle size and halothane on caffeine contractures in rat muscles. J. Neurol. Sci. 88:247-60
170. Shirokova N, Gonzalez A, Ma J, Shirokov R, Rios E. 1995. Properties and roles of an intramembranous charge mobilized at high voltages in frog skeletal muscle. J. Physiol 486 ( Pt 2):385-400 171. Shirokova N, Rios E. 1996. Caffeine enhances intramembranous charge movement
in
frog
skeletal
muscle
by
increasing
cytoplasmic
Ca2+
concentration. J. Physiol 493 ( Pt 2):341-56
172. Shirokova N, Rios E. 1996. Activation of Ca2+ release by caffeine and voltage in frog skeletal muscle. J. Physiol 493 ( Pt 2):317-39
173. Shirokova N, Garcia J, Pizarro G, Rios E. 1996. Ca2+ release from the sarcoplasmic reticulum compared in amphibian and mammalian skeletal muscle. J. Gen. Physiol 107:1-18 174. Sorrentino V, Reggiani C. 1999. Expression of the ryanodine receptor type 3 in skeletal muscle. A new partner in exci tation-contraction coupling? Trends Cardiovasc. Med. 9:54-61
92
175. Staron
RS.
1997.
Human
skeletal
muscle
fiber
types:
delineation,
development, and distribution. Can. J Appl. Physiol 22:307-27
176. Stephenson
DG,
Forrest
QG.
1980.
Different
isometric
force -[Ca2+]
relationships in slow and fast twitch skinned muscle fibres of the rat. Biochim. Biophys. Acta 589:358-62 177. Stephenson DG, Lamb GD, Stephenson GM, Fryer MW. 1995. Mechanisms of excitation-contraction coupling relevant to skeletal muscle fatigue. Adv. Exp. Med. Biol. 384:45-56
178. Stephenson DG, Lamb GD, Stephenson GM. 1998. Events of the excitationcontraction-relaxation (E-C-R) cycle in fast- and slow-twitch mammalian muscle fibres relevant to muscle fatigue. Acta Physiol Scand. 162:229-45 179. Sternbergh WC, III, Adelman B. 1992. Skeletal muscle fiber type does not predict sensitivity to postischemic damage. J Surg. Res. 53:535-41 180. Sternbergh WC, III, Adelman B. 1992. The temporal relationship between endothelial cell dysfunction and skeletal muscle damage after ischemia and reperfusion. J Vasc. Surg. 16:30-9
181. Szentesi P, Jacquemond V, Kovacs L, Csernoch L. 1997. Intramembrane charge movement and sarcoplasmic calcium release in enzymatically isolated mammalian skeletal muscle fibres. J. Physiol 505 ( Pt 2):371-84 182. Szentesi P, Kovacs L, Csernoch L. 2000. Deterministic inactivation of calcium release channels in mammalian skeletal muscle. J. Physiol 528:447-56 183. Toth A, Ivanics T, Ruttner Z, Slaaf DW, Reneman RS, Ligeti L. 1998. Quantitative assessment of [Ca2+]i levels in rat skeletal muscle in vivo. Am. J Physiol 275:H1652-H1662
184. Tsien RY, Rink TJ, Poenie M. 1985. Measurement of cytosolic free Ca2+ in individual small cells using fluorescence microscopy with dual excitation wavelengths. Cell Calcium 6:145-57
93
185. Tyml K, Budreau CH. 1988. Heterogeneity of microvascular response to ischemia in skeletal muscle. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 7:205-21
186. Tyml K, Mathieu-Costello O, Budreau CH. 1990. Microvascular response to ischemia, and tissue structure, in normal and atrophied skeletal muscle. Microvasc. Res. 39:223-39 187. Tyml K, Budreau CH. 1991. A new preparation of rat extensor digitorum longus muscle for intravital investigation of the microcirculation. Int. J. Microcirc. Clin. Exp. 10:335-43
188. Tyml K, Mathieu-Costello O, Budreau CH. 1992. Distribution of red blood cell velocity in capillary network, and endothelial ultrastructure, in aged rat skeletal muscle. Microvasc. Res. 44:1-13 189. van der LL, Coremans A, Ince C, Bruining HA. 1998. NADH videofluorimetry to monitor the energy state of skeletal muscle in vivo. J Surg. Res. 74:155-60 190. Volpe P, Alderson-Lang BH, Madeddu L, Damiani E, Collins JH, Margreth A. 1990. Calsequestrin, a component of the inositol 1,4,5-trisphosphatesensitive Ca2+ store of chicken cerebellum. Neuron 5:713-21
191. Wada M, Hamalainen N, Pette D. 1995. Isomyosin patterns of single type IIB, IID and IIA fibres from rabbit skeletal muscle. J. Muscle Res. Cell Motil. 16:237-42 192. Welsh DG, Lindinger MI. 1993. Energy metabolism and adenine nucleotide degradation in twitch- stimulated rat hindlimb during ischemia-reperfusion. Am. J Physiol 264:E655-E661
193. Welsh DG, Lindinger MI. 1996. L-type Ca2+ channel and Na+/Ca2+ exchange inhibitors reduce Ca2+ accumulation in reperfused skeletal muscle. J Appl. Physiol 80:1263-9 194. Welsh DG, Lindinger MI. 1997. Metabolite accumulation increases adenine nucleotide degradation and decreases glycogenolysis in ischaemic rat skeletal muscle. Acta Physiol Scand. 161:203-10
94
195. Wendt IR, Chapman JB. 1976. Fluorometric studies of recovery metabolism of rat fast- and slow- twitch muscles. Am. J Physiol 230:1644-9
196. Williams DA, Segal SS. 1992. Microvascular architecture in rat soleus and extensor digitorum longus muscles. Microvasc. Res. 43:192-204
197. Woitaske MD, McCarter RJ. 1998. Effects of fiber type on ischemiareperfusion injury in mouse skeletal muscle. Plast. Reconstr. Surg. 102:205263 198. Yellin H, Guth L. 1970. The histochemical classification of muscle fibers. Exp. Neurol 26:424-32
95
11. Saját közlemények jegyzéke
Az értekezés témájával összefüggo közlemények
1. Batkai S, Racz IB, Ivanics T, Toth A, Hamar J, Slaaf DW, Reneman RS, Ligeti L. 1999. An in vivo model for studying the dynamics of intracellular free calcium changes in slow- and fast-twitch muscle fibres. Pflugers Arch. 438:665-70 2. Ivanics T, Miklos Z, Ruttner Z, Batkai S, Slaaf DW, Reneman RS, Toth A, Ligeti L. 2000. Ischemia/reperfusion-induced changes in intracellular free Ca2+ levels in rat skeletal muscle fibers--an in vivo study. Pflugers Arch. 440:302-8
Egyéb közlemények
1. Offertaler L, Mo F, Batkai S, LIU J, Begg M, Razdan RK, Martin BR, Bukoski RD, Kunos G. 2002. Selective ligands and cellular effectors of a G proteincoupled
endothelial
cannabinoid
receptor
Mol.
Pharm.
(Accepted
for
publication) 2. Kunos G, Batkai S, Offertaler L, Mo F, Liu J, Karcher J, Harvey-White J. 2002. The quest for a vascular endothelial cannabinoid receptor . Chem. Phys. Lipids (In press)
3. Bukoski RD, Batkai S, Jarai Z, Wang Y, Offertaler L, Jackson WF, Kunos G. 2002.
CB(1)
receptor
antagonist
SR141716A
inhibits
Ca(2+)-induced
relaxation in CB(1) receptor-deficient mice. Hypertension 39:251-7
4. Kunos G, Batkai S. 2001. Novel physiologic functions of endocannabinoids as revealed through the use of mutant mice. Neurochem. Res. 26:1015-21
96
5. Wagner JA, Jarai Z, Batkai S, Kunos G. 2001. Hemodynamic effects of cannabinoids: coronary and cerebral vasodilation mediated by cannabinoid CB(1) receptors. Eur. J. Pharmacol. 423:203-10 6. Batkai S, Jarai Z, Wagner JA, Goparaju SK, Varga K, Liu J, Wang L, Mirshahi F, Khanolkar AD, Makriyannis A, Urbaschek R, Garcia N, Jr., Sanyal AJ, Kunos G. 2001. Endocannabinoids acting at vascular CB1 receptors mediate the vasodilated state in advanced liver cirrhosis. Nat. Med. 7:827-32
7. Darblade B, Batkai S, Causse E, Gourdy P, Fouque MJ, Rami J, Arnal JF. 2001. Failure of L-nitroarginine to inhibit the activity of aortic inducible nitric oxide synthase. J. Vasc. Res. 38:266-75 8. Szabo G, Batkai S, Dengler TJ, Bahrle S, Stumpf N, Notmeyer W, Zimmermann R, Vahl CF, Hagl S. 2001. Systolic and diastolic properties and myocardial blood flow in the heterotopically transplanted rat heart during acute cardiac rejection. World J. Surg. 25:545-52 9. Di M, V, Goparaju SK, Wang L, Liu J, Batkai S, Jarai Z, Fezza F, Miura GI, Palmiter RD, Sugiura T, Kunos G. 2001. Leptin-regulated endocannabinoids are involved in maintaining food intake. Nature 410:822-5
10. Kunos G, Jarai Z, Batkai S, Goparaju SK, Ishac EJ, Liu J, Wang L, Wagner JA. 2000. Endocannabinoids as cardiovascular modulators. Chem. Phys. Lipids 108:159-68 11. Arnal JF, Batkai S, Elhage R, Darblade B, Rami J, Maret A, Bayard F. 1999. [Effect of estrogens on arterial physiology and mechanisms of their atherosclerosis-protective effect in animals]. Therapie 54:339-46
12. Szabo G, Bahrle S, Batkai S, Stumpf N, Dengler TJ, Zimmermann R, Vahl CF, Hagl S. 1998. L-arginine: effect on reperfusion injury after heart transplantation. World J. Surg. 22:791-7
13. Szabo G, Batkai S, Bahrle S, Dengler TJ, Vahl CF, Zimmermann R, Hagl S. 1998.
Effects
of
nitric
oxide
synthesis
on
reperfusion
injury
and
catecholamine responsiveness in a heterotopic rat heart-transplantation model. J. Cardiovasc. Pharmacol. 31:221-30
97
14. Tiefenbacher CP, Tweddell A, Batkai S, Zimmermann R, Tillmanns H, Kubler W. 1997. Endothelin does not contribute to the attenuation in myocardial function and blood flow after repetitive ischemia in the rat heart. J. Vasc. Res. 34:447-54
15. Tiefenbacher
CP,
Ebert
M,
Niroomand
F,
Batkai
S,
Tillmanns
H,
Zimmermann R, Kubler W. 1997. Inhibition of elastase improves myocardial function after repetitive ischaemia and myocardial infarction in the rat heart. Pflugers Arch. 433:563-70
98
