Az endothelin szerepe a diabeteses nephropathia kialakulásában

Az endothelin szerepe a diabeteses nephropathia kialakulásában

dr. Máttyus István

Semmelweis Egyetem Budapest, I. sz. Gyermekklinika

2005.

Tartalomjegyzék

Rövidítések jegyzéke

4 oldal

1. Bevezetés

5

2. Irodalmi áttekintés

6

2.1. Az endothelinek szintézise, receptorai, termelődését befolyásoló tényezők, élettani szerepe

6

2.1.1. Endothelin szintézis

8

2.1.2. Endothelin receptorok

9

2.1.3. Az endothelin termelődését szabályozó tényezők

10

2.1.4. Az endothelinek élettani szerepe

12

2.1.5. Az endothelinek szerepe különböző kórállapotokban

13

2.1.6. Endothelin antagonisták a klinikai gyakorlatban

15

2.2. Diabeteses nephropathia

17

2.2.1. Gyakoriság

17

2.2.2. Strukturális változások

17

2.2.3. Funkcionális változások

18

2.2.4. A diabeteses nephropathia szakaszai, klinikai lefolyása

21

2.2.5. A diabeteses nephropathia megelőzése, kezelése

22

2.3. Endothelin szerepe a diabeteses szövődmények kialakulásában

25

3. Célkitűzések

30

4. Alkalmazott módszerek és vizsgált populációk

32

4.1. Alkalmazott módszerek

32

4.2. Vizsgált populációk

34

5. Eredmények

37

5.1. A minták stabilitásának vizsgálata

38

5.2. Az endothelin ürítés diurnalis ingadozásának vizsgálata

38

5.3. Egészséges gyermekek renalis endothelin-1 ürítése az életkor függvényében

38

5.4. Érett újszülöttek renalis endothelin ürítése az első 9 életnapon

40

5.5. Koraszülöttek vizelettel történő endothelin ürítése

42

5.6. A diuresis hatása a renalis endothelin ürítésre

44

2

oldal 5.7. 1-es típusú diabetes mellitusos gyermekek renalis endothelin ürítése stabil állapotban

47

5.8. Diabeteses gyermekek renalis endothelin ürítése fizikai terhelést követően

48

5.9. Vizelettel történő endothelin ürítés diabeteses ketoacidosisban

48

6. Statisztikai analízis

54

7. Megbeszélés

55

7.1. Renalis endothelin ürítés egészséges gyermekekben

55

7.2. Koraszülöttek renalis endothelin ürítése

56

7.3. Renalis endothelin ürítés diabeteses gyermekekben stabil állapotban 57 7.4. Vizelettel történő endothelin ürítés fizikai terhelést követően stabil állapotú diabeteses gyermekekben

61

7.5. Renalis endothelin ürítés diabeteses ketoacidosisban

62

8. Összefoglalás

64

9. Új megállapítások

65

10. Az értekezéssel kapcsolatos saját pubikációk jegyzéke

67

11. Irodalomjegyzék

68

12. Köszönetnyilvánítás

81

13. Summary – angol nyelvű összefoglaló

82

3

Rövidítések jegyzéke

ET: Endothelin ANP: atrialis natriuretikus peptid ETA: endothelin A receptor ETB: endothelin B receptor GFR: glomerularis filtrációs ráta THP: Tamm-Horsfall protein A-1-MG: alfa-1 microglobulin ECE: endothelin konvertáló enzim ACE: angiotensin konvertáló enzim GBM: glomerularis bazalmembrán RPF: renalis plasma flow IGF: insulin like growth factor = somatomedin AGE: glikolizációs végtermék TNF-α: tumor necrosis factor-α ANG II: angiotensin II RIA: radioimmunoassay TGF-β: transforming growth factor β AT1: angiotensin 1 receptor NO: nitrogénmonoxid cAMP: ciklikus adenozin monofoszfát cGMP: ciklikus guanozin monofoszfát mRNS: messenger ribonukleinsav PDGF: thromocyta növekedési faktor

4

1. Bevezetés A

diabetes

glomerulotubularis

mellitusos

betegek

vesekárosodás,

mely

jelentős

hányadánál

meghatározott

alakul

stádiumokon

ki át

progressiv krónikus

veseelégtelenséghez vezet. A vesebetegség a diabetes kezdetét követően néhány évvel indul, folyamatos progressziója nehezen befolyásolható. Kialakulására vonatkozó ismereteink egyre gyarapodnak, de a folyamat még nem minden részletében tisztázott. Strukturálisan a glomerularis bazalmembrán megvastagodása, a mesangium tömegének növekedése és a glomerularis capillarisok elzáródása figyelhető meg. E szövődmény létrejöttében számos faktor játszik szerepet. Az endothelin a jelenleg ismert egyik legerősebb vazokonstrikciót okozó peptid, az érfal összehúzásán kívül számos egyéb hatása is ismert. E hatások közül kiemelendő az érfal permeabilitas és a mitosis fokozása. Biztosan szerepet játszik a diabeteses nephropathia kialakulásában, de e folyamat részletei még nem teljesen ismertek. Vizsgálataink során 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő gyermekek vizeletét analizáltuk, kutatva a vizeletben ürülő endothelin-1 mennyiségének változásait és az ürülést befolyásoló tényezőket. Eredményeinkből levonható következtetések alapján közelebb juthatunk a diabeteses nephropathia kialakulásának megismeréséhez és therapiás befolyásolásához is.

5

2. Irodalmi áttekintés Az 1980-as évek közepén Hickey és munkatársai (1) kimutattak egy endothelsejtek által termelt peptidet, mely coronaria vazokonstrikciót váltott ki. Vasoconstrictor hatása a norepinephrinéhez viszonyítva közel 100-szorosnak bizonyult. 1988-ban Yanagisawa és mtsai (2) izoláltak és részletesen leírtak három hasonló szerkezetű 21 aminosavból álló peptidet, és ezeket endothelineknek nevezték el. Az endothelinek két diszulfid hidat tartalmaznak, szerkezetük hasonlít az egyik viperaméreg felépítéséhez. A részletes szerkezeti vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy a biológiai aktivitáshoz feltétlenül szükséges a két diszulfid híd, a hidrofób karboxil terminális és a hajtűszerű szerkezet (3). Tudásunk robbanásszerűen gyarapszik az endothelin biológiáját és egyes betegségekben betöltött szerepét illetően. Számos

faktor

befolyásolja

a

termelődését

és

vasomotor-tónust

meghatározó

és

sejtproliferációt kiváltó hatása révén szerepet játszik különböző vascularis betegségek pathomechanizmusában, így szerepe van a diabeteses nephropathia kialakulásában is. 2.1. Az endothelinek szintézise, receptorai, termelődését befolyásoló tényezők, élettani szerepe Az endothelin-1 a nagyerek endothel sejtjein kívül képződik a leukocytákban, a macrophagokban, az érfal simaizom sejtekben, a központi idegrendszer neuronjaiban és astrocytáiban, az endometrium sejtjeiben, a hepatocytákban, és a Sertoli sejtekben (4,5). A vesében az endothelen kívül a glomerularis és tubularis epithel valamint a mesangialis sejtek is szintetizálják (6,10). Kifejezett vasoconstrictor hatása mellett chronotrop és inotrop hatású is, neurotransmitter és bronchus constrictiót okoz, fokozza az erek permeabilitását, mitogén, gátolja a vese gyűjtőcsatornákban a natrium reabszorpciót, számos hormon és cytokin szintézisét befolyásolja (6,7). Az endothelin-1 e hatásait specifikus receptorok aktiválása révén váltja ki (8,9). Az endothelin-2 és endothelin-3 a 2-es és 6-os pozícióban levő aminosavakban különböznek az endothelin-1-től (1.ábra). Endothelin-2 nagyobb mértékben a vesében és a bélben, kisebb mennyiségben a myocardiumban, a placentában és az uterusban képződik. Speciális élettani hatásai egyelőre nem ismertek. Az endothelin-3 az endothelin-1hez hasonlóan kimutatható a plazmából, de eredete pontosan nem tisztázott. Jelentősebb mennyiségben az agyban, kisebb mértékben a tüdőben, a vesében és a gastrointestinalis tractusban található. Az endothelin-4 az endothelin 1-től 3, endothelin 2-től 1 aminosavban különbözik. A bél mucosa, tüdő és vese epithel sejtekben képződik. EtA és EtB receptorokhoz

6

egyaránt kötődik. Bélfal simaizom összehúzó aktivitása erősebb mint az ET-1-é.

Létezik a bélfal simaizom-összehuzó hatását illetően specifikus antagonistája, mely szerkezetét tekintve egy calcium-csatorna blokkoló. Endothelin 4 a humán ET-2 megfelelője patkányban és egérben. Először ileum mucosából izolálták. Főleg a bélfal gyulladásos és immun reakcióiban van szerepe shock és ischaemia kapcsán (10).

7

2.1.1. Endothelin szintézis A különböző endothelin géneket az emberi genomban különböző kromoszómákon találjuk. Az endothelin-1 gén a 6-os kromoszóma második exonján van és egy 212 aminosavból álló peptidet, a preproendothelint kódolja. A promoter régió CAAT és TATA szekvenciákat tartalmaz, melyek a transzkripciót szabályozzák és további cis részek szolgálnak a szabályozó impulzusok hatásainak érzékelésére. Ezek között van egy GATA-2 protein kötő hely, mely az endothel sejtek basalis endothelin-1 termelésében játszik szerepet, valamint egy szakasz, mely a c-fos és c-jun heterodimer proteineket köti. E promoter régiók segítségével számos faktor tudja befolyásolni az endothelin-1 gén transzkripcióját, ugyanakkor az endothelin-1 mRNS transzlációjára is hatással lehetnek (11,12). Az intracellularis calcium (Ca2+) szint emelkedése és a protein kinase C aktiválása cjun protein szintézist eredményez, mely indukálja a prepro-endothelin-1 mRNS transzlációját. A preproendothelin-1-et egy endopeptidase bontja és így keletkezik a „big endothelin”-nek nevezett 38 aminosavból álló intermedier. A szintetizált big endothelin-1-et a sejt mikrotubularis rendszere juttatja el a sejt felszínére. Innen a big endothelin-1 bejut a plazmába, ahol szintje jól mérhető, bizonyos kórállapotokban, mint pl. a szívelégtelenség, kifejezetten emelkedett. A big endothelin-1 hatásossága az endothelin-1 hatásosságának csak 1/100 része. A sejt felszínén illetve a plazmában egy specifikus endothelin konvertáló enzimnek (ECE) nevezett membránhoz kötött metalloprotease bontja a big endothelint a Tryp21-Val22 között, így képződik a hatásos endothelin (13). ECE knockout egerekben azonban az endothelin-1 plasma szint csak 1/3-ával csökkent, ez arra utalt, hogy egy ECE-től független metabolikus út is létezik (14). Ennek alapján kétféle endothelin-1 képző enzimet is sikerült találni: egy ECE-től eltérő metalloproteaset és egy az érfal simaizomzatában és a mastocytákban található chymaset. Az endothelin convertáló enzimek nem csak a big endothelin-1-gyel lépnek reakcióba, hanem több más peptidet is hidrolizálnak, például a bradykinint, P-reaktiv substance-t és az inzulint. Az endothel sejtek az endothelint mind luminalis, mind kontraluminalis irányban képesek leadni, bizonyos szövetekben koncentrációja jelentősen meghaladhatja a plazmában mérhetőt. Wagner és mtsai (15) kimutatták, hogy endothel sejtek esetében mind a bazális, mind a stimulált szekréció 80 %-a basolateralis irányú. A frissen szintetizált endothelin azonnal kötődhet így az érfal simaizom receptoraihoz parakrin módon, a kis távolság miatt a szükséges hatáshoz jóval kisebb szubsztrátmennyiség is elegendő.

8

Az endothelin-2, 3 és 4 szintézise hasonlóképpen zajlik, de tekintettel klinikai jelentőségére, az endothelin 1-el kapcsolatosan állnak rendelkezésre részletes adatok. 2.1.2. Endothelin receptorok Az endothelin hidrofil vegyület, emiatt nem képes a sejtmembránon átjutni, így kötődnie kell egy specifikus sejtfelületi receptorhoz. A receptor expressziója szabja meg a sejt endothelin hatására adott válaszát. A különböző szerkezetű endothelinek, és a radioligand kötési kísérletek alapján már kezdetben valószínű volt, hogy többféle endothelin receptor létezik (16,17). Emberben két endothelin receptort lehetett identifikálni, melyeket endothelin A és B receptornak neveztek el (ETA, ETB) (8,18). Az endothelin A receptorhoz az endothelin-1 és endothelin-2 kötődik kifejezettebben, az endothelin-3 kevésbé, a B receptorhoz mindhárom endothelin affinitása hasonló. Mindkettő a sejtmembránban van, hét transzmembrán domainből áll. Az endothelin-A és endothelin-B receptorok szintéziséhez szükséges mRNS számos szövetben kimutatható, e receptorok expressziója szabja meg az endothelin adott szövetre illetve sejtre kifejtett hatását (19). Endothelin-A receptor kimutatható az érfal és a bronchusok simaizomsejtjeiben, a myocardiumban és a mesangialis sejtekben (19,20). Endothelin-B receptor detektálható számos szervben a kisebb erek endothel-sejtjeiben, az agyban, a glia és plexus choroideus sejtjeiben, a vesetubulusok epitheljében és a myocardiumban. A vesében endothelin-A mRNS expressziót az artériákban és a mesangialis sejtekben lehetett észlelni, legnagyobb mennyiségben az afferens és efferens arteriolák falában. Endothelin-B-re utaló jeleket a külső velő belső rétegeiben, feltehetően a vasa rectanak megfelelően, valamint a vesekéregben a glomerulusok területén mutattak ki (9,19). Az endothelin receptorok inracellularisan G protein utján továbbítják az információt. Az aktivált endothelin receptort az effector szervvel összekötő sejten belüli jelátadás a diacilglicerol-foszfolipáz

C - foszfatidilinositol mechanizmussal történik, mely folyamat

eredménye az intracellularis Ca2+ szint emelkedése. Endothelin-A receptor esetében simaizomsejtben ez vazokonstrikciót eredményez (21). A vazokonstrikció fennáll az endothelin-1 - A receptor kötődés megszűnése után is, valószínűleg azért, mert az intracellularis Ca2+ szint magas marad. Nitrogénmonoxid (NO) hatására a vazokonstrikció időtartama rövidül, mert csökkenti az intracellularis Ca2+ szintet (22). Diacilglicerol és Ca2+ stimulálják a protein kinase C-t, mely az endothelin mitogén hatását mediálja, sejtproliferációt eredményez (23).

9

Endothelin-B receptor aktiválódása az A receptorhoz hasonlóan a foszfolipase-C inositol-trifoszfát-diacylglicerol mechanizmussal az intracellularis calciumot mobilizálja. Az endothelin-B receptor inhibitor G proteinhez kapcsolódik, amely bizonyos sejtekben a cAMP képződést gátolja. Endothelin B receptor aktiválódása fokozza a NO és prosztaciklin leadást, csökkenti az apoptózist, gátolja az endothel sejtekben az ECE expresszióját, növeli a keringő endothelin-1 tüdőben történő lebontását. Endothelin-3 Endothelin-B receptorhoz kötődése esetén átmeneti vazodilatáció következik be. A vazodilatáció NO és prosztaciklin termelődés, valamint a kálium-csatornák aktiválódásának hatására jön létre (24) (2.ábra). Endothelin-B receptorok endothelin-3 által történő aktiválódása feltétlenül szükséges bizonyos neuralis precursorokból képződő sejtek fejlődéséhez (25). A bőr melanocytái és a bélfal ganglionsejtjei nem fejlődnek ki, ha az endothelin-B receptorok nem működnek vagy ha nem termelődik endothelin-3. Inaktív endothelin-B receptor gén esetén egerekben aganglionalis megacolon alakult ki a bőrön látható terjedelmes fehér foltok kíséretében, emberen az endothelin-B receptor mutációja kapcsán a Hirschprung betegség egyik hereditaer formáját igazolták (26). Endothelin A receptor hiánnyal született egerek is jellegzetes komplex fejlődési rendellenességet mutatnak. Az endothelin-B receptorok kimutathatók az endothel sejteken, itt szerepük van egy olyan pozitív autokrin visszacsatolásban, mely során az endothelin-1 saját génjének expresszióját szabályozza (27). 2.1.3. Az endothelin termelődését szabályozó tényezők Az endothelin receptorok és az endothelin termelődésének szabályozása gyakran szorosan összekapcsolódik. Így például hypoxia vagy ciklosporine hatására gyorsan fokozódik az endothel sejtekben az endothelin-1, az érfal simaizmokban az endothelin-A receptor képződése (4). Ciklikus AMP, epidermal growth factor és az ösztrogének bizonyos szövetekben emelik az endothelin-A receptorok számát; a pitvari natriuretikus hormon, angiotensin II és a fibroblast growth factor az endothelin-B receptorok számát növelik („upreguláció”). Ugyanakkor az endothelinek, angiotensin-II, transforming growth factor β csökkentően hatnak az endothelin-A receptorokra, a cAMP és katecholaminok az endothelinB receptorokra („down-reguláció”) (28).

10

2. ábra: Az endothelin és a NO kölcsönhatása

Az endothelin gén expresszióját, a peptid termelődését különböző tényezők befolyásolják normális és pathológiás körülmények között. Endothel sejttenyészetben az endothelin-1 transzkripcióját fokozzák az arginin-vasopressin, bradykinin, epinephrin, ciklosporin A, etanol és a phorbol észterek (protein kinase C aktivátorok) (6,19). Ferri és mtsai (29) igazolták, hogy endothel sejttenyészetben az inzulin dózisfüggő mértékben stimulálta az endothelin-1 termelődését 24 órán át. E hatást fiziológiás inzulin koncentráció kapcsán is meg lehetett figyelni. Az acut enyhe hypoxiát az endothel és renalis epithel sejtek fokozott endothelin termelése kísérte (30). Endotoxin injekciót követően a renalis működészavar tüneteit anti-endothelin-1 antitestekkel antagonizálni lehetett (31). Angiotensin II stimulálta legnagyobb mértékben az endothel sejtek endothelin termelését (32). Az endothelin termelődését fokozó faktorok többsége protein kinase C aktivátor, szabályozó hatásukat e reguláló enzim működésének fokozása útján fejtik ki. Számos tényező ismert, melyek az endothelin szintézisét gátolják. A NO több ponton is kifejt ilyen hatást az intracellularis Ca2+ szint csökkentése, valamint az endothelin receptor - ligand affinitás mérséklése révén (7,33). Endothelin-2 is gátolja az endothelin-1 szintézisét azáltal, hogy az

11

endothelin-B receptor aktiválása NO és prosztaciklin termelést vált ki. Az endothelin-1 is tud az endothelin-B receptorhoz kötődni jelentősebb mértékű szintézis esetén, és az így fokozott NO képződés fontos tényezője az endothelin-1 aktivitás terminálásának. Az endothelin-1 termelődést gátolhatja az endothelin convertáló enzim antagonizálása is (7,13). A fentiek mellett az endothelin egy szokatlan módon saját szintézisét is szabályozza, a korábban említett B receptorok segítségével: Hunley és mts (7) endothelin-1 stimulálást követően gyors és tartós prepro-endothelin-1 gén expressziót figyeltek meg, melyet csak endothelin-B antagonistával tudtak felfüggeszteni. Ez arra utal, hogy ha egy endothelin B receptorral rendelkező sejtet megfelelő inger ért, és képes endothelin-1 szintézisre, további újabb stimulus nélkül is képes folyamatos endothelin termelésre. Bizonyos betegségekben, így diabetesben is ennek a mechanizmusnak szerepe lehet abban, hogy aktivált endothel és mesangialis sejtek folyamatosan és fokozott mértékben szintetizálnak endothelint. Az endothel és mesangialis sejtek az endothelin-1-et nem secretoros granulumokban raktározzák, hanem azt speciális inger hatására szintetizálják néhány perc alatt. Az mRNS felezési ideje 15-20 perc között van, az endothelin-1 felezési ideje a plazmában 4-7 perc. Így az érfalat alkotó sejtek gyorsan be tudják állítani a szervezet számára szükséges vasomotor tónust. 2.1.4. Az endothelinek élettani szerepe Az endothelin igen erős vasoconstrictor hatással rendelkező peptid, érfal összehúzó hatása közel 100-szorosa a norepinephrinének. Ha azonban laboratóriumi állatoknak bolusban nanomolaris mennyiségben adunk endothelin-1, -2 illetve-3 injekciót, a vérnyomás csökken azáltal, hogy specifikus (B) receptorukhoz kötődve az endothel sejtekből a prosztaciklin és NO leadást fokozzák. Embereken ha az alkar keringésébe nagy mennyiségű endothelin-1-et vagy 3-at juttatnak, az endothelin-B receptor aktiválódásnak megfelelően először átmeneti vazodilatációt lehet megfigyelni, majd tartós vazokonstrikció következik. A tartós és dózisdependens vérnyomás emelkedést a vesék, a mesenterium és a harántcsíkolt izmok artériáinak és arterioláinak konstrikciója okozza, a pulmonalis keringés reakciója jóval gyengébb. Kisebb mennyiségű endothelin intravénás infúziója kifejezett renalis vazokonstrikciót okoz a szisztémás vérnyomás érdemi változása nélkül (34). A rendelkezésre álló adatok szerint az emberi vese erei különösen érzékenyen reagálnak az endothelin-1-re. A vérnyomás szabályozását illetően feltételezhető, hogy számos vazoaktív peptid és növekedési faktor végső mediátora az endothelin-1. Erre utal, hogy például az angiotensin-II

12

cardialis hypertrophiát kiváltó hatását az endothelin-1 termelődés gátlásával fel lehet függeszteni (35). Ugyanakkor az endothelin-1 is stimulálja az angiotensin I - angiotensin II átalakulást és az angiotensin II által kiváltott aldosteron termelést. A vasodilatátor NO és prosztaciklin gátolják az endothelin-1 termelést cyclikus GMP képződés fokozása révén, valamint gátolják az endothelin-indukálta vazokonstrikciót és mitogenezist is. Ez arra utal, hogy antagonista hatásukat mind az endothelin szintézis, mind az endothelin hatás gátlása révén fejtik ki. E mechanizmusoknak az atherosclerosis kialakulásában van szerepe (28). Az endothelin-3 az endothelin-B receptorok aktiválása révén az endothelsejtek NO képzését fokozza, így vesz részt az értónus szabályozásában. Az endothelin-1 és endothelin-3 fokozzák számos prosztaglandin termelődését is, szerepük van a gyulladásos reakciókban, a leukocyták adhéziójában, a szövetek proliferációjának szabályozásában (7).

2.1.5. Az endothelinek szerepe különböző kórállapotokban Az endothelin felfedezését követően számos kutató vizsgálta koncentrációját a szérumban illetve a plazmában különböző kórállapotokban, az eredmények gyakran ellentmondóak voltak. Az endothelin felezési ideje néhány perc, a tüdőkapillárisokban a neutralis endopeptidáz bontja endothelin-B receptor kötődést követően. Az endothelint az endothel sejtek szintetizálják, de többnyire a bazolaterális és nem a luminális oldalon (14,37). Helyi koncentrációja jóval nagyobb lehet, mint a keringésbe kerülő, hatása döntően autokrin és parakrin. Bizonyos pathológiás helyzetben plazma szintje emelkedik, de hatását számos tényező befolyásolja (receporok mennyisége, típusa, lekötöttsége, receptor utáni sejten belüli információ átadó rendszer állapota, NO szint). Az endothelin hatás többnyire tartós, kísérletes körülmények között a plazma szint normalizálódását követően is sokáig megfigyelhető. Mindezek alapján érthető, hogy a plazmában mérhető koncentráció nem korrelál az egyes sejtekben illetve szövetekben mérhető aktivitással. A plazma koncentrációt alapvetően az érlumenbe történő szintézis és a lebontás egyensúlya határozza meg. Az endothelin igen erős vasoconstrictor hatását figyelembe véve hypertonia bizonyos eseteiben magasabb plazma endothelin szintet várnánk. Ezt egyértelműen azonban csak igen ritka endothelin termelő tumor esetén tudták igazolni (38). Atherosclerosisban az érfalban mérhető endothelin koncentráció kifejezetten emelkedik (39). Myocardialis infarktust követően a plazma endothelin koncentráció megemelkedik (40), az endothelin szintjéből a

13

prognózisra is lehet következtetni (41). Congestiv cardiomyopathiás betegek plazma endothelin-1 koncentrációja korrelációt mutatott a bal kamra diastoles végnyomással, a pulmonalis hypertensióval és a bal pitvari nyomással (42,43). Intracerebralis vérzést követően a liquorban emelkedett endothelin-1 és endothelin-3 szint mérhető, állatkísérletekben az endothelin receptor antagonisták protektiv hatásúnak bizonyultak (44). Pulmonalis hypertensióban szenvedő betegek tüdőereinek endothel sejtjeiben fokozott endothelin-1 expressió mérhető (45). Számos vascularis betegségben tehát az endothelin-1 pathofiziológiai szerepe egyértelmű. A postischaemiás vesekárosodás esetén kutyákon végzett kísérletek során vese arteria leszorítást követően endothelin receptor antagonisták hatására fokozódott a glomerularis filtráció, a vese vérátáramlás és a natrium-exkréció (46). A BQ 123 egy peptid, mely selectiven az endothelin A receptorokhoz kötődik. A Bosentan nem peptid természetű molekula, egyaránt kapcsolódik az endothelin A és B receptorokhoz. Patkányokban vesetransplantációt követően az endothelin receptor antagonista BQ 123 és Bosentan adásával meg lehetett előzni a hideg ischaemia által kiváltott vesekárosodást (47). A ciklosporin és több immunszupresszív szer fokozzák az érfal-endothel sejtek endothelin leadását és a vesében található endothelin receptorok érzékenységét is növelik. Patkányokban ciklosporin-A intravénás beadását követően a plasma endothelin szint jelentős növekedést mutatott és a vérnyomás is emelkedett (48). Endothelin antiszérummal (48) valamint endothelin A illetve endothelin A és B receptor antagonistákkal ki lehetett védeni a ciklosporin által indukált renalis vazokonstrikciót (49, 50, 51). Ezen adatok is arra utalnak, hogy az endothelin-1-nek szerepe van a krónikus ciklosporin adás által kiváltott nephrotoxicitás kialakulásában (52, 53). A nephrotoxikus hatás lehet egyes esetekben mérsékelt fokú GFR csökkenés, de kialakulhat progresszív hegesedés is. A vesetubulus sejtek endothelin-1 leadását fokozzák a kontrasztanyagok (54). Kontrasztanyag beadása után a veseartériákban rövid ideig tartó vazodilatációt tartós vazokonstrikció követ, hasonló jelenség figyelhető meg endothelin-1 infúzió kapcsán is. A vizeletben ürülő endothelin-1 mennyisége szignifikánsan emelkedett gyermekekben angiográfia után az ismert tubularis markerekkel (α1-mikroglobulin, N-acetyl-β-D-glucosaminidase, villin) együtt (55).

E kontrasztanyag-

hatást is ki lehetett védeni endothelin A/B receptor antagonistákkal (56, 57). További vesebetegségekben is feltételezhető az endothelin szerepe állatkísérletek alapján, mint például az NZB/WF1 egerek emberi lupust modellező immunbetegségében. Géntransmissziós állatkísérletek során humán endothelin-1 promoter régióját viselő egerek

14

veséi több endothelint szintetizálnak. Ezekben az állatokban a szisztémás vérnyomás változatlan szintje mellett vesekárosodás tüneteit lehet megfigyelni (58). Patkánykísérletek során endothelin receptor antagonisták javították a vesefunkciót és megvédték a vesét a glomerularis és tubulointersticiális károsodástól (59,60). Ugyanakkor az endothelin receptor antagonisták adása mellett sem normalizálódik mindig a proteinuria. Ez arra utalhat, hogy az endothelin-1 mennyiségének növekedése nem oka, hanem inkább következménye a fokozott glomerularis fehérjevesztésnek. Lokálisan termelődött endothelin-1-nek szerepe van a ductus arteriosus születést követő elzáródásában (61). Ha prostaglandin E2-vel gátoljuk a helyben képződő endothelin-1 szintézist és hatást, nyitva tartható a ductus. A nyitott ductust viszont zárni lehet indomethacinnal részben az endogén prostanoidok által aktivált endothelin-1 útján. Homozigóta endothelin-1 hiányban szenvedő egerek súlyos craniofacialis fejlődési rendellenességekkel születnek. Ez arra utal, hogy az endothelin-1 fontos szerepet játszik bizonyos embrionalis szövetek kifejlődésében.

2.1.6. Endothelin antagonisták a klinikai gyakorlatban Az első, humán medicinában is kipróbált endothelin antagonista a Streptomyces misakiensis által termelt természetes melléktermék volt, mely gyengén kötődött a megfelelő receptorokhoz. A későbbiekben számos endothelin A és B receptorra szelektív illetve nem szelektív peptid szerkezetű antagonistát fejlesztettek ki. E molekulákat azonban a keringésben és a gastrointestinalis traktusban lebontják a peptidase enzimek, és a vér-agy gáton sem jutnak át. E problémák miatt a nem peptid szerkezetű vegyületek kerültek előtérbe és az utóbbi időben néhány ilyen molekulát már a klinikai gyakorlatban is ki tudtak próbálni. BQ 123 és Bosentan lokális infuzióját követően az alkar ereinek vazodilatációját, a véráramlás fokozódását lehetett tapasztalni. Bosentan szájon át történő adása mellett esszenciális hypertoniás betegek vérnyomása szignifikáns csökkenést mutatott a szimpatikus idegrendszer vagy a renin-angiotensin rendszer aktiválódása nélkül. Az endothelin receptor antagonisták feltehetően gátolják a hypertonia által kiváltott szervkárosodást. Binet és mtsai (62) arról számoltak be, hogy Bosentan adásával mérsékelni lehetett a ciklosporin által kiváltott vesevérátáramlás-csökkenést. Ugyanakkor az SB 209670 (nem-szelektív endothelin A/B receptor blokkoló) nem csökkentette coronarographia céljából adott kontrasztanyag nephrotoxikus hatását (63).

15

Congestiv cardiomyopathiában és bal szívfél elégtelenségben szenvedő betegekben Bosentan és BQ-123 egyaránt javították a kardiális funkciót (64). Pulmonalis hypertensió esetén Bosentan csökkentette az arteria pulmonalisban mérhető tensiót, valamint az erek és a tüdő károsodásának mértékét. A folyamatban levő preklinikai és klinikai tanulmányok alapján az endothelin antagonistáknak szerepe lesz egyes cardiovascularis betegségek és veseműködés-zavarok kezelésében. Így várhatóan alkalmazzák majd atherosclerosis, subarachnoidalis vérzés esetében, illetve progressziv vesekárosodás - ezen belül a diabeteses nephropathia megelőzésére. Természetesen még számos vizsgálat és állatkísérlet hátra van ahhoz, hogy e molekulákat a klinikumban alkalmazzuk. Az angiotensin konvertáló enzim (ACE) gátlás analógiájára elképzelhető az ECE gátlók alkalmazása is. Az endothelin esetében azonban több különböző (legalább három) enzim képes a big endothelin hidrolízisére, valamint az ECE aktivitású fehérjék más peptideket is bontanak- pl. az inzulint is, emiatt az ECE gátlás az angiotensint konvertáló enzim gátlásánál összetettebb feladat.

16

2.2. Diabeteses nephropathia

A diabeteses nephropathia a diabetes mellitusos betegek jelentős hányadánál kialakuló progresszív glomerolutubularis vesekárosodás, mely a betegség indulása után adott idővel kezdődik és meghatározott stádiumokon át krónikus veseelégtelenséghez vezet. 2.2.1. Gyakoriság: A fejlett ipari országokban a diabeteses nephropathia a chronikus veseelégtelenség leggyakoribb oka (65, 66). Világszerte, és így hazánkban is a diabeteses betegek és ezzel párhuzamosan a diabetes kapcsán kialakult uraemia miatt chronikusan dializáltak száma egyre nő, 1982 és 1992 között Európában arányuk 11%-ról 17 %-ra emelkedett a dializis állomások kezeltjei között. Ez a veseszövődmény jelentkezhet mind az 1-s, mind a 2-s típusú diabeteseseken. Azon diabeteses betegeknél, akiknél a betegség 20 éves életkor előtt kezdődött, a halálesetek 42%-át a nephropathia következtében kialakult veseelégtelenség okozta (67). 25 éve tartó betegség esetén a proteinuria gyakorisága 46%. A kreatinin clearance beszűkülésének valószínűsége 5 éve észlelhető proteinuria kapcsán 59%. (68) A proteinuria kezdete után 10 évvel a végállapotú veseelégtelenség incidenciája 50%, 15 év után 75% (67). 2.2.2. Strukturális változások: Diabetesben már a betegség kezdetén kimutatható a glomerulusok és a vese hypertrophiája. A vese hypertrophia mértéke korrelál a GFR-rel (69), az inzulin kezelés során a glomerulus térfogata csökken (69). Az első szerkezeti változás diabetesesben a glomerularis bazalmembrán (GBM) megvastagodása. Ez a jelenség lényegében minden betegnél kialakul a diabetes kezdetétől számított 1,5 - 2,5 év múlva (70). Ezt követi a mesangium térfogatának növekedése, mely eltérés arányos a veseműködési zavar mértékével (70). A mesangium tömegének növekedése és a glomerularis kapillárisok elzáródása a filtrációs felület csökkenését eredményezi (71). Kezdetben a glomerulus hypertrophiája kompenzálja ezt a mechanizmust, de ez a kompenzáció előbb-utóbb kimerül (72). A glomerularis bazalmembrán egyre vastagabb lesz, a mesangium tömegének növekedése folytatódik és fokozatosan alakul ki a focalis illetve diffuz glomerulosclerosis. Legalább 20 éve fennálló diabetes esetén találkozhatunk a végállapotú

veseelégtelenség

klinikai

képével.

Szövettani

glomerulusok túlnyomó többsége sclerotikus, elzáródott.

17

vizsgálattal

ilyenkor

a

2.2.3. Funkcionális változások: A vese működésében és szerkezetében kialakuló változások elindító tényezője a hyperglycaemia. Kezdetben a veseerek vasodilatatiója és hyperfiltratio jelentkezik. Ez a jelenség határozottabban megfigyelhető frissen diagnosztizált betegeknél és a metabolizmus jelentősebb mértékű megváltozása kapcsán. A GFR mértékét a következő faktorok határozzák meg: A renalis plasma flow (RPF) alapvetően befolyásolja az ultrafiltrációs nyomást, fokozódása diabetes mellitusos betegekben kimutatható. A második tényező a szisztémás onkotikus nyomás, mely a plasma protein koncentráció alapján számolva normális. A harmadik meghatározó faktor a glomerularis transkapillaris hydrostatikus nyomáskülönbség. Ez állatkísérletekben mérhető, emberen a filtrációs frakció emelkedéséből következtethetünk növekedésére. A negyedik tényező a glomerularis ultrafiltrációs koefficiens, amit a glomerulus kapillárisok áteresztő képessége és filtrációs felülete határoz meg. Már a diabetes kezdetén kimutatható a glomerularis kapillárisok teljes felületének növekedése valamint a hiperfiltráció mind a diabeteses állatmodellekben, mind a diabeteses emberekben (73). A hiperfiltráció oki szerepét a diabeteses nephropathia pathogenezisében napjainkban is vitatják, tartós fennállása a vese állapotát rontja. Állatkísérletek bebizonyították, hogy a glomerularis hypertensió és nem önmagában a hiperfiltráció felelős az elváltozások kialakulásáért. A feltételezett pathomechanizmus a következő: a megnövekedett nyomás következtében több makromolekula jut át a bazalmembránon, ez a mesangialis sejtek túlterhelését,

epitheliumsejt-károsodást

és

tubularis

proteinterhelés

eredményeként

tubulointerstitialis gyulladást okoz (73). A nagyobb nyomás hatására alakváltozást szenvedő, feszülő mesangialis sejtek fokozzák az extracellularis matrix produkciót és hypertrophizálnak. Az extracellularis matrix felhalmozódását nagy mértékben fokozza a hyperglycaemia. A hiperfiltráció hyperglykaemiával való összefüggésére utal, hogy a GFR és a HbA1C között jó korrelációt lehet kimutatni (74). Kialakulásában számos hormon illetve hormon hatású anyag, mint a prostaglandinok, az atrialis natriuretikus peptid (ANP), glucagon, Angiotensin II (ANG II), somatomedinek (IGF I) is szerepet játszanak (75). A proximalis tubulusban megfigyelhető fokozott glukóz és natrium reabsorpció megváltoztatja a tubuloglomerularis

visszacsatolást.

A

serum

glukóz

szint

csökkentése,

az

anyagcserefolyamatok normalizálása esetén a GFR is csökken (76). A sejtet környező folyadék magas glukóz koncentrációja számos cellularis funkciót befolyásol. A magas glukóz koncentráció megváltoztatja az endothel sejt alakját, bazalmembrán megvastagodást és vasokonstrikciót okoz. A mesangialis sejtek matrix-anyag

18

szintézise fokozódik. Tartós hyperglycaemia hatására glykozilációs végtermékek (advanced glycosylation end products = AGEs) keletkeznek (77). Az AGE-k képződése kétlépcsős folyamat, a kötődés eleinte reversibilis majd a későbbiekben lassú irreverzibilis kémiai reakciók eredményeképpen a létrejövő glykozilációs végtermékek a különböző proteinek amino csoportjaihoz kovalens kötéssel kapcsolódnak, és így számos keresztkötés révén kiterjedt protein-hálók alakulnak ki. Ha ez a szerkezet magába foglal olyan hosszú élettartamú molekulákat is, mint például a kollagén rostok, akkor tartós szerkezetváltozás lesz a következmény. Az így átalakult makromolekulák specifikusan képesek kötődni az edothel és mesangium sejtekhez, valamint a monocytákhoz. A kollagén és a mátrix proteinek megváltozása csökkenti az endothel sejtek adhézióját és osztódását, fokozza a mesangialis sejtek növekedését (77), elősegíti a lipoproteinek és immunkompexek adhaesióját a monocytákhoz. Az endothelsejtek működésének megváltozása érinti az endothelin szintézist is. A glykozilációs végtermékek szerepét erősítette meg az a megfigyelés, mely során e termékek képződését gátló aminoguanidine adásával a mesangium növekedését és az albuminürítés fokozódását állatkísérletekben meg lehetett akadályozni (78). A vesében jelentős hyperglycaemia esetén az aldose reductase enzim hatására a glukózból sorbitol képződik. Az intracellularis sorbitol mennyiségének növekedése a myoinositol szint csökkenéséhez vezet (79). Napjainkban a sorbitol pathway aktiválódásának szerepét a diabeteses nephropathia kialakulásában elsősorban a sejt redox rendszerének megváltoztatásával és az így létrejövő oxidativ termékek hatásával magyarázzuk. A diabetes szövődményeinek kialakulásában jelentős szerepe van a protein kinase C enzimnek is. Ez az enzim a sejten belüli jelátadásban játszik fontos szerepet. Hyperglycaemiában kimutatható volt aktivitásának növekedése érfal simaizom és endothel sejtekben (80). A β2 izoforma szerepére utal, hogy patkánykísérletek során specifikus inhibitorának orális alkalmazása kapcsán a protein kinase C gátlás mértékével párhuzamosan a GFR, a renalis albuminürítés és a retina keringése normalizálódott (81). A mesangium, az endothel és a glomerularis epithel sejtek számos olyan anyagot szintetizálnak, melyek elősegíthetik a glomerulosclerosist, az extracellularis matrix mennyiségének fokozódását és a kóros sejtdifferenciálódást. A legfontosabbak közülük a következők: Cytokinek - mint a transzformáló béta növekedési faktor (TGF-β), a thrombocyta növekedési faktor (PDGF), a tumor nekrosis faktor-α (TNF-α), az endothel növekedési faktor, hepatocyta növekedési faktor és fibroblast növekedési faktor.

19

Érfal tónusát fokozó peptidek: angiotensin II és az endothelinek. Arachidonsavból képződő vegyületek: prostaglandinok és thromboxanok. Somatomedinek (IGF-I) E faktorok fokozott szintézisére utal a diabeteses állatok vesesejtjeiben észlelhető fokozott mRNS tartalom, valamint magas glukóztartalmú közegben inkubált mesangiumsejttenyészetek elemzése. Utóbbiak vizsgálata során kimutatható, hogy az IGF-1 által stimulált proteinszintézis

fokozódik,

ugyanakkor

a

proteoglikán-szintézis

csökken.

Ennek

következménye a már korábban megfigyelt relatív proteoglikán-hiány, mely eltérés részben felelős a glomerulus áteresztőképességének megváltozásáért, a proteinuria kialakulásáért (82). Az extracellularis matrix képződésének fokozódását okozzák a glikozilációs végtermékek is. A diabeteses nephropathia kialakulásában szerepe van a növekedési hormonnak (GH) és az IGF-I-nek is. Amennyiben szintézisüket somatostatin analógokkal gátolták, a jellegzetes vese elváltozások csak enyhébb formában jelentek meg (83). TGF-β fokozza az extracellularis matrix, azon belül a fibronectin és a IV típusú kollagén képződését. Magas glukóz koncentráció esetén a szintéziséhez szükséges mRNS szintje emelkedik a mesangialis és tubulus hámsejtekben (84). Fokozott termelődését több kutatócsoport is igazolta diabeteses nephropathia esetén. A kutatások előrehaladásával az angiotensin II veseelváltozások kialakulásában betöltött szerepe egyre jobban tisztázódik. Ez a peptid jelentős, nanomolaris koncentrációban secretálódik a tubulus lumenbe. Csökkent plazma renin aktivitás esetén is a localis renalis renin-angiotensin rendszer fokozott mértékben működik. Tubulus hámsejtekben az angiotensinogén gén közelében glukóz érzékeny szakaszokat lehetett kimutatni, e régió aktiválódása magas vércukorszint esetén a gén expresszióját fokozhatja. Az angiotensin II olyan, a diabeteses vesekárosodás kialakulása szempontjából jelentős folyamatokat befolyásol, mint a fibrogenezis, a sejtnövekedés, a monocyták és macrophagok aktiválása. Angiotensin-1 receptor (AT1) kötődést követően G protein - adenilate cyclase aktiválódása útján a proximalis tublus hámsejteket modellező LLC-PK1 sejtek hipertrófiáját okozza (85). ANG II a TGF-β transkripcióját fokozza. Angiotensin converting enzim gátlókkal a TGF-β receptorok expresszióját lehetett csökkenteni, egyúttal a hypertrophia és az albuminuria mértéke is csökkent (86). ANG II mitogén hatású, stimulálja a mesangialis sejtek proliferációját. E hatást nagyrészt interleukin-6 és endothelin-1 mediálásával váltja ki, AT1 receptor aktiválódása révén. Az AT2 receptorok ingerlése épp ellenkezőleg gátolja a sejtproliferációt és apoptózist okoz.

20

Az ANG II tehát fokozza a matrix képződést, valamint csökkenti a marix lebontását. Tubulointerstitialis fibrozist, az interstitium és a glomerulusok sclerosisát okozza, e hatások kivédhetők ACE gátlóval vagy AT1 receptor antagonistákkal. Az endothel sejtek AT2 receptorainak ingerlése révén fokozza a cytokinek expresszióját és aktiválja a monocytákatmacrophagokat. Az angiotensin II diabeteses nephropathia kialakulásában betöltött szerepére utal az a megfigyelés is, hogy angiotensin-converting enzim gátló kezelés késleltette illetve megállította a nephropathia és microalbuminuria kialakulását mind normotensiv (87.88), mind hypertensiv (89) betegek esetén. Az atrialis natriuretikus peptidnek is szerepet tulajdonítanak mind a hiperfiltráció (90), mind a microalbuminuria (91) kialakulásában. 2.2.4. A diabeteses nephropathia szakaszai, klinikai lefolyása A diabeteses nephropathia első tünete a microalbuminuria. Diabetesben az elektrosztatikus barrier károsodik (92), a fehérje szelektivitás romlik. A glomerularis barrier szelektivitásának romlása, és a GFR növekedése a filtrált proteinmennyiség fokozódásához vezet. A vizelettel ürülő albumin mennyisége normális esetben nem haladja meg a napi 30 mg-ot. Microalbuminuriáról akkor beszélünk, ha az albumin napi ürítése 30 és 300 mg közötti. 1-es típusú diabetesben szenvedő betegek 15-20 %-ában a betegség kezdetétől számított 5-15 év múlva lehet a mikroalbuminuriát igazolni (67), kimutatása a nephropathia és a cardiovasularis szövődmények progressziója szempontjából prediktiv értékű (90). Perzistáló, tesztcsíkkal is kimutatható albuminuria (300 mg-ot meghaladó napi fehérjeürítés) már a definitív nephropathiára utal. Ebben az állapotban a GFR a vesekárosodás mértékével párhuzamosan folyamatosan csökken. A legtöbb betegben a proteinuria kialakulását követően a GFR fokozatosan csökkenni kezd. A GFR romlásának átlagos mértéke l ml/min/hó, és így a betegek 50 %-a a proteinuria kezdetétől számított 7 év múlva jut el a végállapotú veseelégtelenségig (93). Az albuminuria általában együtt jelentkezik retinopathiával, coronaria betegséggel és lábszárfekéllyel. Nephropathiás inzulin dependens diabetes mellitusos betegek 90-95%-ának retinopathiája is van, 2-es típusú diabetesben ez az arány kisebb .

21

Számos adat bizonyítja, hogy a vesekárosodás kialakulásához a hyperglycaemia önmagában nem elegendő, másik rizikó tényező előfordulása is szükséges a nephropathia valamint a cardiovascularis szövődmények megjelenéséhez (94). Ezen egyéb tényezők közül legfontosabb a hypertonia. A genetikai faktorok szerepére utal, hogy bizonyos diabeteses családokban a nephropathia halmozottan fordul elő. A vérnyomás-szabályozásban és a cardiovascularis betegségek kialakulásában szerepet játszó, a nephropathia kialakulását illetve progresszióját befolyásoló gének közé tartoznak a natrium-proton pumpát, a glomerulus basal membrán komponenseit és a renin-angiotensin rendszer alkotórészeit kódoló gének (95). A hypertonia szerepének pontos tisztázása nehéz feladat, mert egyaránt lehet oka és következménye is a vesebetegségnek. A hosszú időn át jelentkező magas vércukor értékek mellett a hypertonia számít a legfontosabb tényezőnek a vesekárosodás és a micro-és macrovascularis eltérések kialakulásában. Ugyanakkor az alacsony vérnyomás protektiv faktornak tűnik még gyakori jelentős hyperglycaemiával járó esetekben is (96). 1-es típusú diabetesben a magas vérnyomás már meglévő vesekárosodásra utal, ugyanakkor 2-es típusú diabetesben jelen lehet albuminuria nélkül is. Az inzulin resistencia hatására fokozódik a renin-angiotensin rendszer és a sympathicus idegrendszer aktivitása, a pitvari natriuretikus faktor secretiója csökken. Nő az intravascularis térfogat, fokozódik a pulzustérfogat. A hypertonia első jele legtöbbször az éjszakai tensiócsökkenés mérséklődése illetve elmaradása (97), e jelenség létrejöttében a diabeteses autonom neuropathiának is szerepe van. A systoles és diastoles vérnyomás emelkedése sokszor együtt mutatkozik a GFR beszűkülésével. A hyperlipidaemia is határozott összefüggést mutat a nephropathia és a kardiovascularis szövődmények kialakulásával. Barker irta le először, hogy az alacsony születési súly a későbbiekben, többnyire a felnőtt korban számos betegségre hajlamosít. E kórképek közé tartozik a diabetes mellitus, és a cardiovascularis megbetegedések (98). Megfigyelése szerint a vascularis eredetű vesebetegségek gyakrabban jelentkeznek mind a normoglicaemiás, mind a diabeteses populációban. Feltételezhető, hogy a kisebb méretű vesékben a glomerulusok száma kisebb, ennek következtében a nyomásgrádiens nagyobb, bár a születési súly és a vesenagyság közötti pozitiv korrelációt Nyengaard és munkatársai nem tudták igazolni (99). 2.2.5. A diabeteses nephropathia megelőzése, kezelése Minthogy a diabeteses nephropathia kialakulásának két fő rizikó tényezője a tartós hyperglycaemia és az emelkedett vérnyomás, az anyagcsere egyensúlyban tartásával, a

22

normotensió biztosításával a szövődmények kialakulása lassítható, esetleg megakadályozható (100,101,102). A microalbuminuria megjelenését követően, még normotensiv állapotban az egyébként antihypertensiv gyógyszerek, (angiotensin converting enzim gátlók, béta blokkolók) adása mellett az albuminuria mértéke csökkent (68.103,104). A hypertonia kialakulásában jelentős szerepet játszik a natrium-retenció. A szervezet natrium-készletének

fokozódását

segíti

a

fokozott

glukóz-rebsorpcióhoz

társuló

megnövekedett natrium-visszaszívás, valamint a renin-angiotensin rendszer és a szimpatikus idegrendszer aktiválódása. Natriumszegény diéta és kis adagú diuretikumok segítségével elérhető a szervezet natriumkészletének és ezáltal az extracellularis térfogatnak a csökkenése (105). AZ ACE gátlók és a calcium antagonisták proteinuriát és vérnyomást csökkentő hatását natrium restrictióval fokozni lehet. Antihypertensivumok

hatására

a

vérnyomáscsökkenés

mértékével

arányosan

mérséklődik az albuminuria (100). Ez a hatás jól megfigyelhető, ha az alkalmazott gyógyszerek között ACE-gátló is szerepel, és a tensiót a normális értékek közelében sikerül stabilizálni (89). A vesekárosodást leginkább az ACE-gátlókkal ás a calcium anatagonistákkal lehet mérsékelni (89,106). A béta-blokkolók használatával főképpen a kardiális szövődmények rizikóját csökkenthetjük (107). Bíztató eredményekről számoltak be normotensiv 1-es típusú diabeteses betegek ACE-gátló kezeléséről is; a microalbuminuria mértéke alacsony (1,25 mg) és normális (5 mg) dózisú ramipril therapia mellett egyaránt szignifikáns mértékben csökkent (88). Nem hypertoniás, 1-es típusú diabeteses betegek esetén tartósan (3 éven át) alkalmazott perindopril kezelést követően az albumin ürítésének mennyisége jelentősen mérséklődött és a diabeteses nephropathia kialakulására utaló GFR változásokat sem lehetett megfigyelni (87). Az ACE-gátlók hatása tehát nem csak a vérnyomás normalizálása, a haemodinamika megváltoztatása révén következik be, hanem közvetlenebb módon a localis angiotensin-II szint csökkenés útján is, antiproliferativ hatásként. Ez a megfigyelés jól magyarázható az ANG II fibrogenesist, sejtnövekedést, macrophag aktiválást befolyásoló hatásának mérséklésével. ACE gátlók adása csökkentette a podocytaszám-veszteséget és a podocyták hipertrófiáját (108). Angiotensin receptor blokkolók alkalmazása csökkenti az endothelin szintézist és ezáltal nem csak a hypertonia kezelésében, hanem az endothelin által kiváltott szöveti reakciók mérséklésében is szerepe van (109). A nephropathiára utaló albuminuria mértéke is szignifikánsan csökkent már néhány nap losartan kezelést követően (110). Ez a jelenség arra utal, hogy a proteinuria létrejöttében a renin- angiotensin rendszer vérnyomást és renalis

23

haemodinamikát befolyásoló hatása számottevőbb, mint a glomerularis bazalmembrán szerkezetei változásai. A veseelégtelenség kialakulását lassíthatja a fehérjebevitel korlátozása. 0,8 g/kg/nap fehérjefogyasztás mellett a proteinuria jelentős csökkenését lehetett megfigyelni (111,112). A diabeteses nephropathia kezdeti szakaszában célszerű a napi fehérjebevitelt 0,75-0,85 g/ kg között tartani. A plazma lipid frakciók arányának a megváltozása a kardiovascularis szövődmények lehetőségét

fokozza

(113).

A

máj

VLDL

particulum

szintézisének

fokozódása

hypertrigliceridaemiához vezet (114). Az össz koleszterin és az LDL koleszterin emelkedése dializált betegek esetében sokszor előjelzi a cardiális eredetű halál bekövetkeztét (115). Az ACE gátlók csökkenthetik a plasma cholesterin szintjét részben a proteinuria mérséklése révén, újabb adatok szerint a hyperglicaemiát is előnyösen befolyásolják. A komplex kezelési lehetőség ellenére napjainkban is számos diabeteses betegnél alakul ki végállapotú veseelégtelenség. A diabeteses nephropathia pathomechanizmusának egyre pontosabb megismerése révén lehetőség nyílik új típusú gyógyszerek alkalmazására is. Ilyenek a thromboxan és kinin receptor antagonisták és az endothelin antagonisták is.

24

2.3. Endothelin szerepe a diabeteses szövődmények kialakulásában Az endothelin szintje jól mérhető radioimmunasay (RIA) módszerrel a plazmában, értéke 1 és 5 pmol/l (2,5 - 12,5 pg/ml) közötti általában, és még pathológiás állapotban is ritkán haladja meg a 25 pmol/l-t (62,5 pg/ml-t). Az endothel sejt által szintetizált endothelin-1 többsége nem a lumimalis hanem a basolateralis felszínen távozik a sejtből és közvetlenül kapcsolódik az érfal simaizmok endothelin receptoraihoz. A plazmaszint változásai a szintézis fokozódására vagy csökkenésére utalnak, de lehetnek az elimináció megváltozásának következményei is. Igy a plazmaszint értékéből csak megközelítő következtetést vonhatunk le a szintézisre vonatkozóan. Diabeteses betegek plazma endothelin szintjéről különböző adatokat találunk az irodalomban. 1-es típusú diabetesben beszámolnak emelkedett (116,117) és csökkent (118) értékekről, 2-es típusú diabeteses betegek esetében olvashatunk magasabb (119) és változatlan (120) endothelin szintekről szóló beszámolókat. E látszólagos ellentmondásokat a betegek metabolikus állapotában, a vascularis szövődményekben és a mérési módszerekben fennálló különbségek okozhatják. Az anyagcsere állapot fontosságát hangsúlyozza az a beszámoló is mely a metabolizmus egyensúlyba kerülésével párhuzamosan az endothelin szint normalizálódását írja le (121). In vitro aorta falon végzett kísérletek során 2 héttel a diabetes indukcióját követően már az endothelin-1-re adott vasoconstrictor válasz fokozódását lehetett észlelni (121, 122). Ezt a változást a Ca2+ csatornák működése által befolyásolt kontrakció-változás vagy a protein kinase C aktiválódása okozhatja. Az endothel diszfunkció kialakulása és a plasma lipid koncentráció emelkedése kapcsán ez a fokozott vasoconstrictor válasz lassan mérséklődik (121). Ez a jelenség arra utal, hogy az érfal simaizom reaktivitás a diabetes fennállásának idejétől is függ. Módosulhat továbbá az ETA illetve ETB receptorok száma vagy funkciója. In vivo végzett állatkísérletek során az ET-1 által kiváltott hatás attól függ, hogy az adott ér melyik típusú endothelin receptort milyen számban tartalmazza (123). Általánosságban azt mondhatjuk, hogy ET-1 adására átmeneti vérnyomásesés, majd lassú és tartós vérnyomás emelkedés következik (2). A pressor válaszban a bőr, a splanchnikus erek, a coronariák, a tüdő- és veseerek vesznek részt. Diabeteses patkányokon a vese és mesenterikus erek ET-1-re adott pressor reakciójának fokozódását és csökkenését egyaránt meg lehetett figyelni. Humán megfigyelések során a vasoconstrictor válasz hiányát észlelték (124). Ismert tény, hogy diabetes kezdetén különböző erekben a vérátáramlás fokozódik. E jelenség

25

hátterében az ET-1 által kiváltott basalis vasoconstrictor tónus csökkenése feltételezhető. Az anyagcsere normalizálásával a diabetes által kiváltott ET-1 szint is a normál tartományba tért vissza (121). Egyelőre túlságosan kevés adat áll rendelkezésre ahhoz, hogy pontosan meg tudjuk határozni az endothelin-1 által kiváltott hemodinamikai változásokat diabetes esetén. Az mindenesetre nagyon valószínű, hogy e változások függenek a diabetes időtartamától és az érfalak állapotától. Összefoglalva megállapítható, hogy diabetesben a plazma ET-1 szintje megváltozik, e változás mértéke és iránya azonban számos tényezőtől függ, és emiatt egyes betegeknél különböző lehet. A plazma szint változásánál fontosabb a helyi, különböző szövetekben mérhető ET-1 koncentráció meghatározása, erre vonatkozóan még számos vizsgálatra van szükség. A plazmában és az egyes sejtek közvetlen környezetében mérhető ET-1 szintek módosulása mellett minden bizonnyal változik az ET receptorok expresszivitása és a sejten belüli jelátadás mértéke is. E változások eredményeként kezdetben vasomotor-tónus csökkenés, majd az anyagcsere-elváltozás tartós fennállása esetén vazokonstrikció következik be. E haemodinamikai változások a különböző szerveket illetve az egyes értípusokat nem azonos mértékben érintik. A hyperglycaemia hatására bekövetkező változások az endothelsejtek működésében nem egyértelműek, megfigyelték az endothelin-1 termelődésének csökkenését és növekedését egyaránt (125). Magas glukóz koncentráció hatására részben az intracellularis Ca2+ koncentráció csökkenése révén az ET-1 által kiváltott simaizom illetve pericyta kontrakció csökken a receptor expresszió mértékétől függetlenül. Hyperglicaemiában megfigyelték az endothelin convertáló enzim 1c izoformájának fokozott expresszióját (126). Magas koncentrációjú glukóz és C-reaktiv protein (CRP) együttes inkubációja fokozta a CRP proatherogén hatását (127). Oliver és munkatársai (128) kimutatták, hogy endothel sejtekből álló sejttenyészetben az inzulin fokozza az endothelin-1 gén expresszióját. Emellett az inzulin fiziológiás koncentrációban növeli az endothel sejtek és az érfal simaizmok ET-1 leadását (129), hyperinsulinaemia hatására emelkedik a plasma ET-1 koncentrációja (130). Az inzulin az ET receptorra is hat, tartós

inkubációja az ETA receptor expresszióját fokozza (131). A

simaizomsejtek ET-1 reaktivitása az inzulinhatás időtartamától és az endothelint termelő endothelsejtek állapotától is függ. Ennek a jelenségnek elsősorban a hyperinsulinaemiával járó 2-es típusú diabetesben lehet jelentősége.

26

Az endothelin hatás gátlásával csökkenteni lehetett a glikozilációs végtermékek szintjét diabeteses betegeken (132). A plazmában mérhető lipoproteinek szintje a diabetes beállításától függően emelkedik. Plazma lipid szint növekedése kapcsán az endothelsejtek és a vér endothelin szintje fokozódik, ugyanakkor a lipidek befolyásolhatják a szövetek ET-1 reaktivitását (130). Az LDL lipoprotein oxidált formája jelentős szerepet játszik az endothelsejt funkciózavar és az atherogenezis kialakulásában. Az endothelsejtek lecitinszerű oxidált LDL receptora oxidativ stressz hatására aktiválódik ez úton is növelve az endothelin szintézist (133). A

hyperglycaemia

fokozza

a

nitrogénmonoxid

szintézisét,

a

diabeteses

anyagcserezavar azonban gátolja a sejtek NO leadását és NO-ra adott reakcióját. Az ET-1 és a NO szoros kölcsönhatása következtében ezek a változások is befolyásolják az ET hatást. A vese számos sejtje tud ET-1-et szintetizálni. Endothelin-1 hatására a veseerek és a mesangialis sejtek kontrahálnak, a só és víz visszaszívás csökken, az extracellularis matrix mennyisége nő. Diabetesben a mesangialis sejtek mérete, szerkezete, működése is megváltozik, endothelin-1 szintézisük fokozódik (134). Az ET-1 pathologiás koncentrációban kifejezett mértékű renalis vazokonstrikciót okoz, ugyanakkor a szisztémás vérnyomás csak kissé emelkedik (135). Diabeteses betegeknek adagolt ETA receptor antagonista lassította a kreatinin clearance folyamatos csökkenését. Ugyanez a molekula mérsékelte a proteinuriát és diabeteses patkányokban csökkentette a glomerulusokban az extracellularis matrix komponensek mRNS expressióját (136). 2-es típusú diabeteses albuminuriás betegek 24 órás vizelet endothelin-1 ürítését emelkedettnek találták Lee és munkatársai (137). A vesekárosodásra utaló microalbuminuria megjelenése előtt a plasma ET-1 szint emelkedését lehetett megfigyelni (138).

Az

endothelin-antagonista Bosentan adásával gátolni lehetett a vizelettel ürülő protein, collagénI és fibronectin exkréció fokozódását diabeteses patkányokon (139). A vese strukturális károsodásának mérséklődését lehetett megfigyelni endothelin A receptor gátló LU 135252 adását követően diabeteses patkányokon.(140). Endothelin receptor blokád diabeteses nephropathiát mérséklő hatását írják le Khan és munkatársai is (141). A hypertonia diabeteses betegeken nagyon gyakori. Essentialis hypertoniában szenvedő betegek vérnyomását bosentannal (nem szelektiv ETA-ETB receptor antagonista) csökkenteni lehetett, ennek alapján feltételezhető, hogy az endothelin számos egyéb tényező mellett diabeteses betegek hypertensiójában is szerepet játszik.

27

A diabeteses betegek halálát gyakran a vascularis szövődmények okozzák. Az endothelfunkció károsodása simaizom proliferációhoz vezet. Atherosclerosisban a plasma endothelin-1 koncentráció emelkedik, atherosclerotikus emberi arteriákban az ET-1 peptid expressiójának fokozódása figyelhető meg (142). Endothelin receptor antagonistával csökkenteni lehetett a neo-intima képződést és az atheromák kialakulását (143). 2-es típusú diabeteses betegekben atherosclerotikus macroangiopathia esetén emelkedett plasma endothelin-1 szint mérhető (144). Az endothelin antagonisták sejtproliferációt gátló hatása alapján

feltételezhető,

hogy

segítségükkel

a

diabeteses

betegek

atherosclerotikus

szövődményeit kedvezően lehet befolyásolni. A perifériás idegek vérellátásának csökkenése következtében az endoneurialis hypoxia idegvezetési problémákat okoz. ET-1 által okozott tartós vazokonstrikció hatására az axonok ischaemiás károsodást szenvedhetnek. Diabeteses patkányok idegvezetési zavarát javítani lehetett ETA receptor antagonistával, az ellátó erekben a vérátáramlás növekedett (145). Egyidejű ETB antagonista hatás esetén ez a változás nem következett be. E kísérletek arra utalnak, hogy az endothelinnek szerepe van a diabeteses neuropathia kialakulásában is. Az ET-1-nek jelentős szerepe van a retina vérellátásának fenntartásában, képződésének

zavara

a

vérellátás

károsodását

okozhatja.

Hyperglycaemia

esetén

megfigyelhető az endothelin képződésének és a periciták endothelin reaktivitásának csökkenése

(146). Endothelin intravitrealis injekciója a retinában a keringést lassította,

ugyanakkor a lassult keringést endothelin konvertáló enzim gátlóval gyorsítani lehetett. Diabeteses patkányok retinájában a normál kontrollokhoz képest kétszeres mennyiségű preproET mRNS-t lehetett mérni. Humán megfigyelésekről még kevés adatunk van; diabeteses retinopathiás betegek üvegtestjében csökkent endothelin koncentrációt találtak (147). Diabeteses betegek myocardialis infarktusát és acut cerebralis keringészavarát az angiopathia mellett az acut vazokonstrikció által kiváltott hypoxia is okozhatja. E folyamatban szintén szerepe van az endothelinnek, e kórképekben a plazmában is emelkedett endothelin-1 szint mérhető. Diabetesben a metabolikus változások közvetlenül és közvetett módon is befolyásolják az endothel és érfal simaizom sejtek működését, az ET-1 termelődést és hatást. Diabeteses betegek

megfigyelése

és

az

állatkísérletek

eredményeinek

értékelése

kapcsán

megállapíthatjuk, hogy az endothelin szerepet játszik a diebetes szövődményeinek kialakulásában. Az érfal simaizmainak tónusát, valamint sejtproliferációt befolyásoló hatása

28

révén résztvesz a macro és microangiopathia kialakulásában. Alapvetően ezen érelváltozások eredményeképpen alakul ki számos szerv, így a retina és a vesék károsodása is. Amint a diabetes szövődményei kialakulásának pathomechanizmusát egyre jobban megismerjük, mind közelebb kerülünk e komplikációk megelőzéséhez és gyógyításához is. Számos szerző bíztató kísérletekről számolt be endothelin receptor antagonisták alkalmazása kapcsán. A diabeteses nephropathia pathomechanizmusának pontosabb megismerése révén lehetőségünk nyílik kialakulásának illetve progressziójának gátlására is. E kezelési módszerek továbbfejlesztése és továbbiak kidolgozása segíthet a számos ember életét megnehezítő és megrövidítő szövődmények leküzdésében.

29

3. Célkitűzések Saját vizsgálataink és irodalmi adatok alapján a vizelettel ürülő endothelin szinte teljes mennyisége a vesében képződik, mértékéből következtethetünk a renalis endothelin szintézisre. Az endothelin hatásait ismerve (vazokonstrikció, sejtproliferatio) feltételezhető, hogy szerepet játszik a diabeteses nephropathia kialakulásában. Célunk annak a kérdésnek a vizsgálata volt, hogy különbözik-e, és ha igen, milyen mértékben a vizeletben ürülő endothelin mennyisége diabeteses gyermekekben az egészségesekhez viszonyítva. Megfigyeléseinket kiterjesztettük olyan állapotokra is, ahol a vese vérátáramlását, az endothelin képződését befolyásoló tényezők változása befolyással lehet az endothelin termelődésére. Ilyen állapotnak tekintettük a diabeteses ketoacidosist és a fizikai terhelést. Egészséges gyermekek, újszülöttek és koraszülöttek renalis endothelin- kiválasztásáról még nem álltak rendelkezésre irodalmi adatok, így szükségessé vált a normális tartomány meghatározása. Az összegyűjtött minták endothelin koncentrációját több hét mélyhűtőben történt tárolást követően mértük meg, ehhez szükséges volt a minták stabilitásának vizsgálata is. Számos hormon és hormonszerű anyag plazma koncentrációja és vizelettel ürülő mennyisége diurnalis ingadozást mutat, így szükséges volt azt is megvizsgálni, hogy a renalis endothelin-ürítés mutat-e ilyen ingadozást. Minden vizelettel ürülő anyag mennyiségét számos élettani tényező is befolyásolja, mint az életkor, a pillanatnyi diuresis mértéke. Ezért e tényezők endothelin ürítésre gyakorolt hatását is meg kell vizsgálni ahhoz, hogy megfelelően tudjuk értékelni a kapott eredményeket. Vizsgálati célunk tehát a következő volt: 1. A minták stabilitásának vizsgálata 2. Az endothelin ürítés diurnalis ingadozásának vizsgálata 3. Egészséges gyermekek vizelettel történő endothelin ürítésének meghatározása az életkor függvényében 4. Érett újszülöttek renalis endothelin ürítésének meghatározása 5. Koraszülöttek renalis endothelin ürítésének meghatározása 6. A diuresis renalis endothelin ürítésre kifejtett hatásának vizsgálata 7. 1-es típusú diabetes mellitusos gyermekek renalis endothelin ürítésének meghatározása 8. A vizelettel történő endothelin ürítés mérése diabeteses ketoacidosisban

30

9. Fizikai terhelés befolyásának vizsgálata diabeteses gyermekek renalis endothelin exkréciójára.

31

4. Alkalmazott módszerek és vizsgált populációk Az endothelin a vizeletben jól mérhető koncentrációban ürül. Ahhoz azonban, hogy a vizeletben mérhető endothelin-ürítés változásait meg tudjuk ítélni, szükség volt normál tartomány megállapítására, valamint arra, hogy milyen mértékben befolyásolja e paramétert az életkor és a diuresis. Egyensúlyi állapotban és különböző pathofiziológiás helyzetekben a nephron egyes szakaszainak működését a következő paraméterek meghatározásával tudjuk megítélni: a glomerularis filtrációs ráta (GFR) kiszámításával a filtráció mértékét határozhatjuk meg. A proximalis

tubulus

működésére

többek

között

az

α1-mikroglobulin

ürítésből

következtethetünk, a distalis tubulus funkcióját a Tamm-Horsfall Protein (THP) ürítése tükrözi. Bizonyos betegcsoportoknál e paramétereket is meghatározva komplexebb képet kaptunk a nephron egyes szakaszainak működéséről. Az endothelin ürítésre vonatkozó mérések eredményét így az egyes nephron szakaszok működésére vonatkozó adatokkal összehasonlíthatjuk és következtetéseket vonhatunk le a vizeletben mérhető endothelin eredetére vonatkozóan is. 4.1. Alkalmazott módszerek A vizeletminták több órás, a legtöbb esetben 24 órás gyűjtésből származtak. A mintákat levétel után rögtön a gyűjtés befejezéséig 4 oC -on tároltuk, a gyűjtött vizeleteket a mérésig -25 oC -on tartottuk. A fagyasztás és felolvasztás nem befolyásolta a mérési eredményeket.

A. Endothelin-1 koncentrációjának mérése a vizeletben a kereskedelemben kapható radioimmunoassay segítségével (RPA 555, Amersham). A vizeletből a baktériumokat és alakos elemeket fagyasztás előtt baktérium szűrővel távolítottuk el (pórusnagyság 0,2 μm). A vizeletminták mérését 100 μl anyagból

közvetlenül a minta felolvasztása és

szobahőmérsékletre melegítése után végeztük. A standard oldatsort pufferrel történő sorozatos kétszeresre higítással állítottuk elő, majd minden standardból és mintából 2-2 csőbe 100 μl-t pipettáztunk, ezt követően 100 μl antiszérumot adtunk hozzá. Alapos összekeverést követően az így kapott oldatokat 4 órán át 2-8 oC közötti hőmérsékleten inkubáltuk. Az inkubálás után minden mérendő anyaghoz 100 μl

32

125

I-al jelzett endothelint

adtunk, majd 16-24 órát inkubáltuk 2-8 oC közötti hőmérsékleten. Ezt követően 250 μl második antitestet tartalmazó reagenst adtunk az oldatokhoz. 10 percig tartó szobahőmérsékleten történő inkubálás után a mágneses szeparálás következett. A mágnessel kötött anyagról leöntöttük a fennmaradt oldatot, majd a csövecskéket gamma scintillációs számlálóba helyeztük. A páros méréseket követően meghatároztuk a beütésszámok átlagát, majd a kötött/nem kötött hányados meghatárázása után a standard görbe segítségével kiszámoltuk az egyes minták endothelin koncentrációját. Amprep 500 mg C2 gél oszlopon sósavas-metanolos-vizes oldatokkal végzett extrakciós folyamat a vizelet endothelin koncentrációját ellentétben a serum vagy plasma endothelin tartalom méréssel nem módosította (148, saját megfigyelések).

B. A vizelet kreatinin meghatározáshoz a módosított Jaffé módszert alkalmaztuk úgynevezett „kinetikus ablak” technikával, mely szinte teljesen kizárja az interferencia lehetőségét. E módszernél csak nagyon magas (>1,000 mg/dl) glukóz koncentrációnál észlelhető interferencia. Annak tisztázására, hogy nagyon magas glukóz koncentrációknál és ketoacidosisban fellép-e interferencia kinetikus Jaffé módszerünknél, ketoacidosisos betegeink vizeletéből enzimatikus módszerrel is meghatároztuk a kreatinin szintet. A két eljárás között a különbség +7±1,6 % volt (átlag ± SEM), nem szignifikáns. Az adatok feldolgozásakor a Jaffé módszer eredményeit használtuk fel.

C. α1- microglobulin meghatározása vizeletből enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) módszerrel.

D. Tamm-Horsfall Protein szint meghatározása vizeletből szintén ELISA technikával történt (149).

E. Diuresis meghatározása: a vizeletgyűjtés időtartama az 1, 2, 5 csoportoknál 24 óra volt, a 4, 6 csoportoknál 2-12 óra. Koraszülöttek és újszülöttek esetében a vizeletmintákat speciális gyűjtőzsák segítségével vettük, amennyiben valamely okból tartós katéter volt felvezetve,

katéteren

át

gyűjtöttük.

A

gyűjtés

időtartama

3-8

óra

volt.

Az

összehasonlíthatóság céljából a vizeletürítés adatokat 24 órára vonatkoztattuk.

F. Glomerularis filtrációs ráta (GFR) meghatározása: a jól ismert képlet segítségével (endogen kreatinin clearence = percdiuresis x vizelet kreatinin koncentráció / plazma kreatinin koncentráció) meghatározhatjuk a GFR értékét, amennyiben a vizsgálati alany megfelelő mértékben hydrált állapotban van. Kiszámításához az eddigi adatok mellett szükséges még a serum kreatinin szint ismerete. E méréseket olyan beteg gyermekeknél végeztük, akiktől betegségük miatt egyéb paraméterek vizsgálata céljából is vettünk vért.

33

4.2. Vizsgált populációk (zárójelben az alkalmazott módszerek betűjele)

1. 37 egészséges gyermek. A vizsgálatokat Németországban és Magyarországon egyaránt végeztük, emiatt mindkét országban gyűjtöttünk mintákat a normális kontrollokhoz is. E 37 gyermek közül 24 Freiburgban él, átlag életkoruk ±SEM: 10,8 ±1,2 év, tartomány 2,917 év. A 13 Budapesten lakó gyermek átlag életkora ±SEM: 8,9 ±1,1 év, tartomány 3,1-15 év. Tekintettel, hogy a két csoport endothelin-ürítése és egyéb eredményei között sem volt különbség, egy csoportba soroltuk őket. (A, B, E)

2. 10 onkológiai betegségben szenvedő gyermek. Átlag életkoruk ± SEM: 9,4 ± 1,3 év, tartomány 3,4- 16 év. Ők a különböző tumor kezelési protokolloknak megfelelő cytostatikus kezelésben részesültek, de a legutolsó immunsupressziv kezelés óta legalább 28 nap telt el. E gyermekeket a kezelés előtti napon vizsgáltuk, majd a kezelés napján, amikor a therapiás protokoll részeként 3 l/m2/24 óra víz diuresisben illetve 3 l/m2/24 óra víz diuresisben és 0,3-1 mg/kg/24 ó furosemid kezelésben részesültek. A diuresis fokozásának a célja a nephrotoxicitás megelőzése volt, különös tekintettel ifosfamide vagy cyclophosphamide therápia kapcsán. A cytostatikumokat csak a diuresis bevezetését követően adták. A mi vizsgálatunk ideje alatt e betegek még nem kaptak cytostatikus szert. (A,B,E)

3. A Freiburgi Gyermekklinikán kezelt 14 koraszülött, gestatiós kor ± SEM: 31,2 ± 3,4 hét (tartomány: 25-36 hét), születési súly ± SEM 1720 ± 215 g (tartomány: 960- 2600 g). A 30. gesztációs hét előtt született igen kis súlyú koraszülöttek különböző típusú légzészavarban szenvedtek és emiatt folyamatos pozitív légúti nyomás (CPAP) illetve kontrollált lélegeztetési therápiában részesültek. Az első vizsgált vizeletminta a megszületést követően ürített 2. vizelet volt. Több órás vizeletgyűjtést az első és a 7. életnapon végeztünk.( A, B, E)

4. 26 érett, egészséges újszülött, akiket a Semmelweis Egyetem I. Sz. Női Klinikáján ápoltak. Gestatiós koruk 39-41 hét, születési súlyuk átlaga ± SEM 3230 ± 380 g, (tartomány 25503850 g). Több órás vizeletgyűjtést követően határoztuk meg az endothelin ürítést természetes úton születetteknél az első 5 életnapon (16 újszülött) és császármetszéssel születetteknél az első 9 életnapon (10 újszülött). ( A, B, E)

34

5. 10 1-es típusú diabeteses gyermek ketoacidotikus állapotban. Átlag életkoruk (±SEM) 12,9±2,6 év (tartomány 9,7-16 év). Átlagos vér pH értékük 7,08±0,03 (6,96-7,22), a BE 25,1±3,4, a vércukor szintjük 485 ± 128 mg/dl (24,7 ± 6,5 mmol/l). E gyermekek vizeletét 12 nappal a ketoacidosis rendeződése után újra megvizsgáltuk, akkor már anyagcsere állapotuk egyensúlyban volt (vércukor 126 ± 14 mg/dl, = 6,4 ± 0,7 mmol/l, pH 7,39 ±0,02). (A, B, C, D, E, F)

6. 15 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő gyermek stabil metabolikus állapotban. Átlag életkoruk ± SEM 12,7 ± 4,2 év (tartomány: 9,3-15,5 év). A diabetes mellitus fennállása idejének átlaga ± SEM 5,13 ± 1,12 év volt (tartomány: 0,1 - 14 év). Vér fructosamine szintjük átlaga ± SEM 2,2 ± 0,18 mmol/l (tartomány: 2,11-2,39 mmol/l, a normális értékek 2,0 mmol/l alattiak). Vércukor értékük átlaga ± SEM 8,3 ± 1,3 mmol/l volt (tartomány 5,6 - 10,8 mmol/l), csak 6 gyermek vizeletében ürült glucose átlagosan 0,9 g/nap mennyiségben (tartomány: 0,11 - 2,2 g), acetont egyikük vizelete sem tartalmazott. A szérum kreatinin szint átlaga 77 μmol/l, tartománya 58-110 μmol/l, a vér pH értéke is normális volt (átlag 7,40, tartomány 7,38 - 7,42). (A, B, C, D, E, F)

7. 11 1-es típusú diabetesben szenvedő gyermek viszonylagos metabolikus egyensúlyban. A betegek átlag életkora ± SEM 13,3 ± 0,98 év volt, tartomány: 6,7-17,2 év. A diabetes mellitus fennállása idejének átlaga ± SEM 6,35 ± 1,2 év volt (tartomány: 0,3 - 12,4 év), a diabetes kialakulásakor átlagos életkoruk 6,5 év volt (tartomány: 0,8-12 év). A vizsgálat idején 9 gyermek már a pubertásban volt. Naponta 4x kaptak inzulin injekciót az intenzifikált kezelésnek megfelelően. Átlagos fructosamin szintjük 2,3 ± 0,2 mmol/l volt, a tartomány 2,15-2,42-ig terjedt. A vizsgálat idején átlagos vércukor szintjük 8,6 mmol/l volt, a tartomány 5,6-10,8 mmol/l. 7 beteg a vizelettel nem ürített cukrot, a többi 4-nek a glukóz ürítése átlagosan 1 g/24 óra volt (tartomány: 0,13-2 g/24 ó). Mikroalbuminuriát (vizelet albumin exkréció ≥ 30mg/nap) 3 betegnél lehetett kimutatni, egyikük vizelete sem tartalmazott acetont. A szérum kreatinin szint (átlag 82, tartomány 60-105 μmol/l ) és a GFR (átlag 112, tartomány 80-140 ml/min/1,73m2) valamint a vér pH értéke minden beteg esetén normális volt. A fizikai terhelés hatásának vizsgálata céljából 10 percig 2 Watt/kg teljesítményű

kerékpár

ergometriás

gyakorlatot

végeztek,

ezt

követően

ismét

meghatároztuk náluk a korábban is mért paramétereket. (A, B, E) A vizsgálatok megfeleltek az emberi jogok Helsinki nyilatkozatában megfogalmazottaknak.

35

36

5. Eredmények Az endothelint számos a vesében megtalálható sejt - endothel, epithel - képes szintetizálni. Frakcionált excretiója gyakran meghaladja a 100 %-ot, ürített mennyisége nem mutat összefüggést a plasma koncentrációval vagy a glomerularis filtráció mértékével. Ezek alapján jogosan feltételezhető, hogy a

filtrált mennyiség túlnyomó része a proximalis

tubulusokban visszaszívódik, a vizeletben mért endothelin a renalis, leginkább a belső velőállomány gyűjtőcsatornáinak hámsejtjeiben zajló szintézis eredménye (3. ábra). 3. ábra: a vizeletben mérhető enzimek és peptidek származási helye

37

5.1. A minták stabilitásának vizsgálata Az endothelin a vizeletben jól mérhető koncentrációban ürül. A minták 12 %-ában a méréseket 6 hónap múlva megismételtük, így az endothelin-szint variabilitását 10 %-nál kisebbnek találtuk. Első mérés: ürítés átlag 55,8 ng/24 ó (25-75 percentil: 49,4-62,3), második mérés: 51,7 ng/24 ó (46,8-61,9). Ez arra utal, hogy a minta mélyhűtött állapotban legalább fél évig stabil. 5.2. Az endothelin ürítés diurnalis ingadozásának vizsgálata A renalis endothelin-ürítés esetleges diurnalis ingadozásának meghatározása céljából 10 egészséges gyermeknél megvizsgáltuk, hogy a nappali és éjszakai endothelin-ürítés között kimutatható-e különbség. A következő adatokat kaptuk: nappali ürítés átlag:54,5 ng/24ó (2575 percentil: 47,5-68,1), éjszakai ürítés: 58,25 (52,9-66,8) ng/24 ó. A két eredmény között nincs szignifikáns különbség. 5.3. Egészséges gyermekek renalis endothelin-1 ürítése az életkor függvényében Ahhoz, hogy gyermekkorban a vizelettel ürülő endothelin-1 változásait különböző kórállapotokban meg tudjuk ítélni, szükségünk volt az egészséges gyermekek renalis endothelin ürítésének meghatározására. Más vizelettel ürülő anyaghoz hasonlóan az endothelin mennyisége is valószínűleg függ az életkortól, a vese érettségétől és méretétől. Az irodalomban mindezidáig nem találhatóak adatok az endothelin ürítés életkorra vonatkoztatott normál értékeiről. Ezért első vizsgálatsorozatunkban a renalis endothelin ürítés normál tartományát határoztuk meg újszülöttekben és 2-17 éves gyermekekben két különböző európai országban (150). A mintagyűjtés egy része Németországban, másik része Magyarországon történt. A két különböző országban végzett anyaggyűjtés oka a következő: ez a munka két egyetemi gyermekklinika együttműködése eredményeként született, számos esetben a mérendő anyag hosszú utat tett meg a mintavételtől a meghatározásig. Ugyan a gyűjtési módszer és a tárolás mindenhol végig azonos volt, mégsem lehetett kizárni a mintavételben véletlenszerűen kialakuló különbségek illetve a szállítás befolyását a végső eredményt illetően. 24 német gyermek 24 órás endothelin ürítése 35,5±3,08 ng volt, testfelületre korrigálva 50,8±2,95 ng/1,73 m2. A 13 budapesti gyermek endothelin ürítése 39,1±4,9 ng/24 ó, testfelültre számítva 61,3±6,4 ng/24ó/1,73m2. A két csoport közötti látszólagos csekély

38

különbség nem bizonyult szignifikánsnak. Ezért a továbbiakban e két csoportot egynek vettük. Így a közös excretio mértéke 59,3±3,68 ng/24ó/1,73 m2 értéket adta. Az egészséges gyermekek napi endothelin ürítése az életkorral szignifikáns összefüggést mutatott. A regressziós egyenlet a következő: 24 órás ET ürítés (ng) = 1,91 x kor (évek) + 19,77 (r=0,48; p<0,01). (151)

A következő ábrán láthatjuk e gyermekek 1,73 m2 testfelületre korrigált ET ürítését az életkor függvényében endothelin (ng/24ó x 1.73 m2)

150

100

50

0 0

5

10

15

20

életkor (év)

4. ábra: egészséges gyermekek 24 órás endothelin ürítése 1,73 m2 testfelületre korrigálva y = 1,09x + 69,27; r = -0,22; NS Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy az egészséges gyermekek napi renalis endothelin ürítése az életkorral, azaz a testméretekkel szignifikáns korrelációt mutat, ugyanakkor ha az endothelin ürítést 1,73 m2 testfelületre korrigáljuk, egy állandó értéket kapunk.

39

5.4. Érett újszülöttek renalis endothelin ürítése az első 9 életnapon Érett újszülöttek vizeletében az endothelin-1 koncentráció a megszületés napján átlagosan 75 pg/ml volt, majd 1 napig még emelkedett, utána csökkent és a 6. napra érte el a későbbi 35 pg/ml körüli normál értéket (5. ábra).

endothelin koncentráció (pg/ml) 200 175 150 125 100 75 50 25 0 -1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

életkor (nap)

5. ábra: vizelet endothelin-1 koncentráció az életkor függvényében újszülötteknél

40

A vizelet kreatinin koncentráció is hasonló görbét irt le (6.ábra),

kreatinin koncentráció (mg/dl) 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

életkor (nap) 6. ábra: a vizelet endothelin-1 koncentrációja újszülötteknél az első 9 életnapon Az endothelin/kreatinin hányados érdemi változást nem mutatott (7. ábra). endothelin/kreatinin (pg/mg) 100 80 60 40 20 0 -1

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

életkor (nap)

7. ábra: endothelin/kreatinin koncentráció hányadosa újszülöttek vizeletében az első életnapokon

41

A hüvelyi úton és császármetszéssel született újszülöttek vizeletében mérhető endothelin koncentráció alakulás között nem lehetett különbséget kimutatni. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a szülési stressz nem befolyásolja az újszülöttek renalis endothelin ürítését (8. ábra).

8. ábra: hüvelyi úton és császármetszéssel született újszülöttek vizelet endothelin koncentrációja az első életnapokon 5.5. Koraszülöttek vizelettel történő endothelin ürítése Koraszülöttek vizeletében az első életnapon az egy napra számított endothelin ürítés fordított arányt mutatott a gestatiós korral, a legéretlenebbek esetén volt a legmagasabb és fokozatosan csökkent az újszülöttkori normál értékre (9. ábra) (151). A vizelet endothelin koncentráció ugyan kisebb volt az alacsonyabb gestatiós korúaknál (10. ábra), a jóval magasabb diuresis következtében az ürített mennyiség azonban nagyobbnak bizonyult. Tekintettel, hogy e betegek a későbbiekben meglehetősen inhomogén csoportot alkottak és különböző problémák (légzészavar, infekciók, agyvérzés) miatt többféle kezelésben

42

részesültek, a további napok során a számos tényező (pl. dopamin-infuzió, hypoxia) által befolyásolt endothelin ürítésüket nem határoztuk meg.

endothelin (ng/24ó*1,73m2) 250

200

150

100

50

0 24

29

34

39

gesztációs kor (hét)

9. ábra: 1 napra, 1,73m2 testfelelületre számított vizelet endothelin ürítés koraszülöttekben a gesztációs kor függvényében r =0,29

43

10. ábra: vizelet endothelin koncentráció koraszülöttekben a gesztációs kor függvényében r = 0,41 p<0,05 5.6. A diuresis hatása a renalis endothelin ürítésre A vizeletürítés egyik legjellemzőbb paramétere az időegység alatt ürített vizelet mennyisége. A diuresis mértéke számos anyag ürítését befolyásolja, így megvizsgáltuk, hogy befolyással van-e a renalis endothelin ürítésre is (151). 10 olyan gyermek vizeletét vizsgáltuk, akik onkológiai betegség miatt részesültek forszírozott diuresisben. Cytostatikus hatású gyógyszert utoljára a mérések előtt 28 nappal, vagy még régebben kaptak. A vizsgálatok végzése alatt egyik beteg sem kapott cytostatikumot. Első vizsgálatainkat a diuretikus kezelés előtti napon végeztük, majd az

44

eredményeket a következő napiakkal hasonlítottuk össze, amikor a gyermekek 3 liter/m2/24 óra folyadék mennyiséget kaptak. 6 beteg a forszírozott vízbevitel mellett még 0,3-1 mg/kg /24 ó adagú Furosemidet is kapott. A folyadékterhelés az onkológiai therapiás protokoll része volt és minden beteg egyben saját kontrolljának is számított. A folyadékterhelés előtt a gyermekek diuresise 701±141 ml/24 óra volt, ez az érték a fokozott folyadékbevitel mellett 2867±340 ml/24 órára emelkedett. A kreatinin koncentráció a vizeletben a diuresis növekedésével arányosan csökkent 82 ±11 mg/dl-ről 20±3,8 mg/dl-re. Az endothelin koncentráció csökkent ugyan 73,6±4,8 pg/ml-ről 40,7±3,1 pg/ml-re, de az endothelin ürítés fokozódott 51,7±10 pg/min/1,73m2 -ről 151±13,2 illetve Furosemide adása kapcsán 112±12,6 pg/min/1,73 m2- re (11.ábra). A statisztikai számítások során mindegyik változás szignifikánsnak bizonyult.

11. ábra: vizelet endothelin ürítés változása gyermekekben víz terhelés illetve víz terhelés + Furosemide hatására. *:p<0,05, **:p<0,01,

45

Az endothelin-1 renalis exkréciója és a diuresis között minden vizsgált csoportban jó korrelációt találtunk. Az egészségesekben a korrelációs együttható 0,92 volt (p<0,001), a tumoros betegekben 0,95 (p<0,001), folyadék terhelést követően 0,88 (p<0,01) (12.ábra).

Endothelin (ng/24ó)

1000

100

Egészséges gyermek Diuresis előtt

10

Diuresis alatt Újszülött

1

0,1 0,001

0,01

0,1 1 Diuresis (ml/perc)

10

12. ábra: 24 órás endothelin ürítés és a diuresis összefüggése egészséges újszülötteknél és nagyobb gyermekeknél forszírozott diuresis előtt és alatt

Összefoglalva: a vizelettel ürített endothelin-1 mennyisége arányos volt a diuresissel, mind normális mind forszírozott folyadékbevitel esetén. A percdiuresis növekedése az ürített ET-1 mennyiségének szignifikáns fokozódását eredményezte, ugyanakkor a kreatinin-ürítés változatlan maradt. Korábban már említettük, hogy a filtrált endothelin közel 100 %-a a vesetubulusokban visszaszívódik, az ürített mennyiség szinte teljes mennyisége renalis szintézis eredménye. Ennek alapján arra következtethetünk, hogy a diuresis fokozódása a renalis endothelin szintézis növekedésével jár együtt.

46

5.7. 1-es típusú diabetes mellitusos gyermekek renalis endothelin ürítése stabil állapotban 11 metabolikusan stabil állapotú inzulin dependens diabeteses gyermek vizelettel történő endothelin ürítését vizsgáltuk (150). A diabeteses gyermekek egyéb betegségben nem szenvedtek. A normális veseműködésről a serum kreatinin, GFR, vizelet üledék és a vesék és hólyag ultrahang vizsgálata segítségével győződtünk meg. A diabeteses gyermekek diuresise szignifikánsan magasabb volt, mint az egészségeseké

(p<0,001):

az

egészségeseké

983±72,

a

cukorbetegeké

2152±240

2

ml/24óx1,73m volt (13.ábra).

13. ábra: egészséges és diabeteses gyermekek renalis endothelin ürítése kerékpár ergometriás gyakorlat előtt és után, ***:p<0,001

47

A 13. ábrán látható hogy a diabeteses gyermekek 24 órára számított endothelin ürítése szignifikánsan magasabb volt (p<0,001) az egészséges kontrollokkal összehasonlítva. (96,2±3,5 vs 37,2±2,9 ng/24 óra). Ha az értékeket 1,73 m2 testfelületre korrigáljuk, a különbség hasonló marad: 113,5±10,6 vs 59,3±3,7 ng/24ó/1,73m2, p<0,001. E betegek esetén a diabetes időtartama és az endothelin-1 ürítés között nem tudtunk összefüggést kimutatni. 5.8. Diabeteses gyermekek renalis endothelin ürítése fizikai terhelést követően A renalis endothelin kiválasztást számos tényező befolyásolja, ezek közé tartozhat a fizikai teljesítmény fokozódása. Kerékpár ergometria során fokozódik a szimpatikus aktivitás diabeteses gyermekekben is, a tubularis proteinek excréciója növekszik. Az előbb vizsgált stabil állapotú diabeteses gyermekeknél megmértük a renalis endothelin ürítését fizikai terhelést követően: 10 percig 2 Watt/kg teljesítményű kerékpár ergometriát végeztek. Az ergometria hatására a pulzusszám és a vérnyomás egyaránt megemelkedett; pulzus: 87±6,7/percről 139±11,2/percre (p<0,001), vérnyomás /Riva Rocci/ : 106±9,2 / 72±5,4 Hgmm-ről 128±10,4 / 83±7,4 Hgmm-re (p<0,05). Az általunk vizsgált diabeteses gyermekekben a kerékpár ergometria formájában alkalmazott fizikai terhelés a renalis endothelin ürítést nem befolyásolta, a 24 órára számított ürítés értéke nem változott - előtte 96,2±3,5 ng, utána 98,1±4,1 ng volt. Hasonló eredményt kaptunk, ha az endothelin ürítést 1,73m2 testfelületre vonatkoztattuk: 113,5±10,6 ng/24 ó volt előtte és 115±12,4 volt ergometriás gyakorlat után (13. ábra). Az endothelin és kreatinin ürítés hányadosa látszólag mutatott egy enyhe csökkenést: 133±22,1 pg/mg vs 116,1±24,2 pg/mg, ez a változás azonban nem szignifikáns. 5.9. Vizelettel történő endothelin ürítés diabeteses ketoacidosisban Diabeteses ketoacidosisban az osmotikus diuresis jelentős mértékű víz- és sóveszteséghez, hypovolaemiához vezet. A szervezet a normálishoz közeli vérnyomást a perifériás erek resistenciájának jelentős fokozásával tudja fenntartani. Az egyre kifejezettebb folyadékhiány kapcsán a vesefunkció beszűkül, csökken a vesék vérátáramlása és a glomerulus filtráció. Az acidosis és az elektrolit eltérések tovább rontják a veseműködést, tubularis funkciózavarokat lehet kimutatni. A hypovolaemia kapcsán kialakuló perifériás vazokonstrikciót

a sympatikus idegrendszer, a renin-angiotensin-aldosteron rendszer, a

48

vasopressin és különböző prostaglandinok mediálják (99). E kompenzáló mechanizmusok gátolják illetve késleltetik a keringési és veseelégtelenség kialakulását. Az endothelinnek e folyamatban betöltött esetleges szerepét megelőzően nem vizsgálták. 10 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő gyermek renalis endothelin ürítését, vizelet kreatinin értékét, valamint szintén vizeletből a proximalis tubularis marker α1mikroglobulin és a Henle-kacs működését jelző, kizárólag a felszálló vastag segmentumban secretálódó 95 kilodalton molekulasúlyú glycoprtotein Tamm-Horsfall protein mennyiségét (THP) határoztuk meg diabeteses ketoacidosis állapotában majd 12 nappal később a metabolikus állapot stabilizálódását követően (152). Kontrollként 15, metabolikusan stabil állapotú diabeteses gyermek szolgált. A GFR enzimatikus módszerrel is meghatározott kreatinin clearance alapján számolva diabeteses ketoacidosisban 59,2±3,4 ml/min*1,73m2 értéke szignifikánsan alacsonyabb volt (p<0,001), mint a ketoacidosist követő 108±12,2 ml/min*1,73m2, és a kontroll 123,2±9,8 ml/min/1,73m2. (14. ábra). GFR (ml/perc x 1.73 m2) 140

**

120 100 80

*** 60 40 20 0 ketoacidosis

ket. Után

diabeteses kontrollok

14. ábra: GFR értéke diabeteses ketoacidosisban és ketoacidosist követően **:p<0,01, ***:p<0,001

49

A proximalis tubulus működését jellemző α1-microglobulin szintje szignifikánsan emelkedett ketoacidosisban (p<0,001), mint a 15. ábrán láthatjuk: 180±202mg/24 ó /1,73m2 a ketoacidosis utáni 30±12 illetve a kontrollok 8,2±1,2 mg/24 ó /1,73m2 értékével szemben.

A-1-MG 10000

*** 1000

100

***

*** **

**

**

10

1 mg/24ó ketoacidosis

mg/24ó x 1.73 m2 ketoacidosis után

mg/g krea

diabeteses kontrollok

15. ábra: α1-microglobulin renalis ürítése diabeteses ketoacidosisban, **:p<0,01, ***:p<0,001 A distalis tubularis marker, a Tamm-Horsfall protein (THP) szintje ketoacidosisban alacsony volt, 6,2±2,4 mg/24 ó szemben a ketoacidosis utáni 37±4,5 mg/24 ó értékkel.(16. ábra) A distalis tubulus működésének teljes mértékű normalizálódásához a 12 nap nem volt elegendő, a kontroll diabeteses gyermekek THP ürítése ennél is szignifikánsan magasabb (p<0,001), 92,3±27,2 mg/24 ó volt. Hasonló különbségeket regisztráltunk, ha a THP ürítés mértékét 1,73 m2 testfelületre korrigáltuk: ketoacidosisban 8,3±2.6, ketoacidosis után 41,4±10,2 a kontrolloknál 149,3±41,4 mg/24 ó /1,73m2 volt (p<0,001).

50

16. ábra: THP renalis ürítése diabeteses ketoacidosisban **: p<0,01 , *** : p<0,001

A vizelettel történő endothelin ürítés másképpen viselkedett, mint az előbb említett tubularis markerek. Mértékét nem befolyásolta az egyébként számos vizelettel ürülő anyag mennyiségét nagymértékben megváltoztató ketoacidosis: (17. ábra) a kezdeti 92±21,4 ng/24 óra értéktől érdemben nem különbözött a 12 nappal későbbi 79,1±23,3 illetve a kontrollok 98,4±17,6 ng/24 óra értéke. Mint a korábban említett tubularis markerek esetében, itt sem változtatott a viszonyokon az endothelin-ürítés 1,73 m2 testfelületre történő korrekciója: 97,6±25,4 majd 98,9±22,3 szemben a kontroll 114,2 ng/24 ó /1,73m2 értékekkel.

51

Endothelin

*

400

300

200

100

0 mg/24ó ketoacidosis

mg/24ó x 1.73 m2 ketoacidosis után

mg/g krea

diabeteses kontrollok

17. ábra: endothelin renalis ürítése diabeteses ketoacidosisban, * : p<0,05 Ha az endothelin ürítést a GFR-hez viszonyítjuk, egy szignifikáns emelkedést észlelhetünk ketoacidosis alatt, értéke 0,82±0,24 pg/min mely eltérés normalizálódik az anyagcsere egyensúlyba jutását követően, 0,48±0,19 pg/min-ra (p<0,001) (20.ábra). Hasonló változást figyelhetünk meg, ha az értékeket 1,73 m2 testfelületre korrigáljuk: ketoacidosisban mérhető 1,65±0,98 pg/min/1,73 m2 értékről 0,56±0,34 pg/min/1,73 m2 -re csökken (p<0,001) (18.ábra).

52

Endothelin 3,5

***

3 2,5 2

***

1,5 1 0,5 0 pg/min/GFR ketoacidosis

pg/min x 1.73 m2/GFR ketoacidosis után

diabeteses kontrollok

18. ábra: GFR-re vonatkoztatott renalis endothelin ürítés diabeteses ketoacidosisban ***:p<0,001

Diabeteses ketoacidosisban a vizelettel ürülő α1-microglobulin mennyisége fokozódik, ez a proximalis tubulus károsodására utal. A distalis tubulus működészavarát a THP ürítés jól mérhető csökkenése jelzi. A vese vérátáramlásának mérséklődése a GFR beszűkülését eredményezi, a renalis endothelin ürítés azonban változatlan marad.

53

6. Statisztikai analízis Az adatokat átlag ± SEM, illetve medián (25 – 75 percentilis) formában adtam meg. Az adatok normalitását Kolmogorow-Smirnoff teszttel vizsgáltam. A minták stabilitásának, illetve az endothelin ürítés diurnális ingadozásának összehasonlítására Wilcoxon Rank sum tesztet alkalmaztam. A német és magyar gyerekek 24órás renális endothelin ürítését Mann-Whitney próbával hasonlítottam össze. A 24-órás endothelin ürítés és az életkor közötti összefüggést Spearman-korrelációval vizsgáltam. A diurézisnek a renális endothelin ürítésre gyakorolt hatásának vizsgálatakor Friedmann-tesztet, majd pedig Holm-féle post hoc analízist használtam. Az endothelin-1 renális exkréciója és a diurézis közötti összefüggést Spearmann-korrelációval határoztam meg. Az 1-es típusú diabetesben szenvedő, valamint az egészséges gyermekek diurézisét, 24 órás endothelin ürítését Mann-Whitney próbával hasonlítottam össze. A diabetes időtartama és az endothelin-1 ürítés közötti össszefüggést Spearman-korrelációval vizsgáltam. Diabeteses gyermekeknél a fizikai aktivitás hatására kialakuló pulzusszám és vérnyomás változását, valamint az endothelin és a kreatinin ürítést Wilcoxon Rank sum teszttel vizsgáltam. A ketoacidózis alatt- és után meghatározott GFR, alfa-mikroglobulin, Tamm-Harsfall protein és endothelin koncentrációkat Wilcoxon Rank sum teszttel, a kontroll diabeteses betegekben mért értékekhez való viszonyukat Mann-Whitney teszttel hasonlítottam össze. A szignifikancia határa p<0,05 volt. Az analízist SPSS szoftver segítségével végeztem.

54

7. Megbeszélés 7.1. Renalis endothelin ürítés egészséges gyermekekben Irodalmi adatok alapján diabetesben a hyperglycaemia direkt módon és a glikozilációs végtermékek képződése útján is befolyásolja az endothelint szintetizáló sejtek működését, az endothelin szintézis fokozódik. Ha ez a fokozódás jelentős, akkor a megnövekedett szint mérhető a különböző testfolyadékokban, human vonatkozásban a vérben és/vagy a vizeletben. A plasma endothelin-1 koncentrációja egészséges egyénekben 1 és 5 pmol/l (2,5 – 12,5 pg/ml) között van, még pathológiás helyzetben is ritkán haladja meg a 25 pmol/l-t (62,5 pg/ml). A peptid farmakológiai hatásának megítélésére a plasmakoncentráció mérése nem megfelelő, mert az endothelsejtek által termelt endothelin jelentős hányada parakrin módon közvetlenül az abluminalis oldalon a símaizmok felé jut ki a sejtből. A vesében képződő endothelinnek is csak egy része kerül be a vérkeringésbe. Diabeteses állatokon végzett kísérletek során a metabolizmus helyreállításával a korábban magas plazma endothelin szint is normalizálódott. A vese egyes részeiben zajló endothelin szintézis meghatározásához a különböző

nedvek,

szövetek

endothelin-tartalmának

mérése

ad

információt.

A

veseműködéssel kapcsolatos vizsgálatok céljából ezért választottuk a vizelettel ürülő endothelin mennyiségének meghatározását. A vizeletben ürülő endothelin közel 100 %-ban a vesében, többnyire a velőállomány tubulussejtjeiben szintetizálódik, a filtrált endothelin a proximalis tubulusban a többi peptiddel együtt szinte teljes mértékben visszaszívódik. A plazmában mérhető endothelin analógiájára a vizeletben ürülő endothelin is csak részben jellemzi a szintézis mértékét; a nem a nephron lumenébe leadott peptid mennyiségét nem tudjuk meghatározni A nephront alkotó illetve annak környezetében található sejtek közül endothelin-szintézisére képesek a glomerulus mesangium, endothel és epithel, a distalis tubulus hámsejtjei, a vasa recta és egyéb erek endothelsejtjei és legnagyobb mértékben a gyűjtőcsatornák hámsejtjei. A vizeletben mérhető endothelin elméletileg származhat mindegyik említett sejtből, de ha figyelembe vesszük, hogy a

proximalis tubulusban a filtrált peptidek legnagyobb része

visszaszívódik, akkor megállapíthatjuk, hogy a glomerulusban képződött endothelin számottevő mértékben nem jut be a nephron distalisabb szakaszaiba. A vizelettel ürülő endothelin szintje könnyen mérhető, az eredmények jól reprodukálhatóak. Technikailag ez a legkönnyebben alkalmazható módszer, mely a vese

55

endothelin szintéziséről információt ad, ezért választottuk vizsgálataink alapjául a vizelet endothelin meghatározását. Az egészséges gyermekek napi endothelin ürítése az életkorral szignifikáns összefüggést mutatott. Érett újszülöttek esetében a vizelet endothelin-1 koncentráció a megszületés napján mérhető magasabb értékről l napig még emelkedett, majd a 6. napra érte el a későbbiekben normál értéknek tekinthető tartományt. 7.2. Koraszülöttek renalis endothelin ürítése Koraszülöttekben a veseerek ellenállása nagyobb, mint érett újszülöttekben. Figyelembe véve, hogy az endothelin egy igen erős vasoconstrictor hatású peptid, a fokozott endothelin exkréció a medullaris erek tónusát fokozza. A 28. gesztációs hét előtt születettek legtöbbje gépi lélegeztetésben részesül, így „egyensúlyi állapotban” igen nehéz normál értékeket meghatározni. Ezért vizsgáltuk a születés utáni órákban 2. alkalommal ürített vizeletet, ezt ugyanis a koraszülött therapiájával összefüggő tényezők még vélhetően csak kismértékben befolyásolták. Betegeinknél a respirátornak vagy a fizikai stressznek is szerepe lehetett a magasabb endothelin szintek kialakításában Koraszülöttek renalis endothelin ürítésének vizsgálata hasonló eredményre vezetett mint a diabeteses gyermekeké: a vizeletben az időre született újszülöttekhez viszonyítva magasabb endothelin exkréciót lehetett mérni. E jelenség hátterében részben hasonló mechanizmusok állhatnak, mint a cukorbeteg gyermekek esetében. Jól ismert, hogy a koraszülöttek renalis ANG II szintje fokozott, az angiotensin IInek az RPF és a diuresis fenntartásában jelentős szerepe van. Figyelembe véve, hogy az endothelin szintézist legerősebben fokozó anyag az ANG II, arra következtethetünk, hogy koraszülöttekben ez a peptid fokozza a renalis endothelin szintézist. Ezzel magyarázható, hogy a koraszülöttek vizeletében az endothelin ürítést magasabbnak találtuk. Az endothelinnek szerepe van a diuresis fenntartásában a vese fejlődésében, a sejtek szaporodásában és feltehetően a sejtközötti állomány megfelelő kialakulásában is. Az emelkedett intrarenalis endothelin szint okozhatja a vese arteriolák tartós konstrikcióját, ezáltal szerepet játszhat a veseerek fokozott ellenállásának fenntartásában is. A gesztációs idő előrehaladtával a renalis endothelin szintézis és ezzel párhuzamosan az endothelin ürítés fokozatosan csökken, míg eléri az érett újszülöttnek megfelelő értéket. A koraszülöttek gyors növekedést, fejlődést mutató veséjében az endothelinnek szerepe van a sejtproliferációban és a megfelelő diuresis fenntartásában.

56

7.3. Renalis endothelin ürítés diabeteses gyermekekben stabil állapotban Diabetesben a fokozott filtrációval párhuzamosan növekszik a glucose, a natrium és a víz visszaszívása, és mint vizsgálatainkban is igazoltuk, emelkedik a diuresis is. A vizelettel ürülő endothelin mennyisége függ a diuresistől, annak növekedése emeli az endothelin ürítést. Diabeteses gyermekek vizeletében jelentősen fokozott endothelin ürítést mértünk. Tekintettel, hogy a vizelettel ürülő endothelin szinte teljes mértékben a vesében szintetizálódik, az excretió fokozódása arra utal, hogy diabetesben a renalis endothelin szintézis is növekszik. Vizsgálataink során nem találtunk összefüggést a renalis endothelin ürítés mértéke és a betegség fennállásának ideje között, azaz az endothelin exkréció az anyagcsere megváltozása, a vércukorszint jelentős emelkedése kapcsán gyorsan növekszik és egy tartósan magasabb szintre áll be. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a korábban részletezett mechanizmusok révén az endothelin szintézis fokozódásának közvetlen kiváltó tényezője a magasabb vércukor szint. A magas vércukor szint szerepére utal az a megfigyelés is, hogy állatkísérletek során az anyagcsere normalizálódását követően az emelkedett endothelin szint a normálisra csökkent. A hyperglycaemia következtében megváltozik az endothelint szintetizáló sejtek működése is, ami e vasoconstrictor hatású peptid szintézisének tartós növekedéséhez vezet. Tekintettel arra, hogy a fokozott renalis endothelin ürítés már a diabetes kezdeti szakaszában és minden beteg esetében megfigyelhető, elvethetjük azt a feltételezést, hogy az endothelin szintézis fokozódása a már megbetegedett vese működészavarának következménye lenne. A tartósan fokozott endothelin szintézis egyéb rizikó faktorok együttes fennállása esetén vélhetően hozzájárul a diabeteses nephropathia kialakulásához. Önmagában azonban az endothelin szintézis fokozódása nem szükségszerűen vezet a vese megbetegedéséhez, mert a nephropathia csak a betegek kb. 30 %-ában alakul ki, míg a renalis endothelin ürítés minden diabeteses gyermek esetében növekedett. Vizsgálataink nem adnak alapot arra, hogy a fokozott endothelin ürítés forrását megállapítsuk, de elméletileg a következő lehetőségek vannak: A glomerulus mesangialis sejtjei kulcsszerepet játszanak a diabeteses nephropathia kialakulásában (73,77,82,84). Szerkezeti- és alakváltozásuk, valamint az általuk szintetizált anyagok elősegítik mind hiperfiltráció és albuminuria, mind a glomerulosclerosis kialakulását. A glomerularis mesangialis sejtek képesek endothelint szintetizálni, ugyanakkor a membránjukon található ETB receptor hatására autokrin módon az újonnan képződött

57

endothelin tovább fokozza saját szintézisét, a localis endothelin koncentrációját jelentősen megemelve. Az ETB receptor aktiválódása az endothel sejt NO szintézisét is serkenti. A NO gátolja az endothelin receptorhoz kapcsolódását és a további endothelin szintézist, ezáltal lassítva az autoindukciós folyamatot. Az ETB receptorok ismételt illetve tartós aktiválódása eredményeként jelentkező magasabb endothelin szint (egyéb, korábban említett tényezőkhöz hasonlóan) a környező sejtek proliferációját, a matrixanyag akkumulációját okozza. A glomerularis kapillárisok endothel sejtjeit hasonló hatások érik, mint a mesangiumot: a magas glukóz koncentráció, glikozilációs végtermékek, cytokinek és legfőképpen ANG-II. E hatások eredményeként az endothelin-1 szintézis fokozódik, az extracellularis térbe jutó molekulák az ETB receptorokhoz kapcsolódva autoindukció révén az endothelin szint további gyors növekedését és NO képződést váltanak ki. A NO szerepet játszik a hiperfiltráció kialakulásában és fenntartásában, az endothelin a matrixképződésben, sejproliferációban. A glomerulus epithel sejtjei (podocyták) diabeteses nephropathiában szintén szerkezeti változást szenvednek: lábnyúlványaik kiszélesednek, a szomszédos lábnyúlványok közötti filtrációs rés szűkül, majd a sejtek száma csökken. Cytokinek és prostaglandinok szintézisére képesek. Kimutatható bennük az endothelin szintéziséhez szükséges mRNS is, ugyanakkor membránjukon endothelin receptorokat egyelőre nem találtak. Ezek alapján kijelenthetjük, hogy aktívan résztvesznek a nephropathia kialakulásában, de ETB receptor hiányában autoindukcióra nem képesek, endothelin termelésük az endothel és mesangialis sejtekhez viszonyítva nem jelentős. Alak illetve méretváltozásuk nem az endothelin-1 receptor által mediált contractio következménye. Számuk a nephropathia előrehaladtával csökken, pusztulásukban szerepe van feltehetően az ANG-II AT2 receptorai stimulációjának is. Az arteriola afferens hyalinosisa figyelhető meg diabeteses nephropathiában, ez a jelenség az általános microangiopathia részének tekinthető és mértéke jól korrelál a glomerulopathia progressziójával, az elzáródott glomerulusok arányával. Belső felszínét alkotó endothel sejtek a többi érhez hasonlóan képesek endothelin szintézisre. A belőlük paracrin módon leadott peptid a símaizmok ETA receptorához kapcsolódva vasosonstrictiót vált ki, szerepe van a basalis értónus fenntartásában. Ha az endothelin szintézis fokozódna, ez az érátmérő és a vérellátás csökkenéséhez vezetne, ami a GFR csökkenését eredményezné. Diabetesben kezdetben éppen a hiperfiltráció jellemző a veseerek dilatációja, a renalis plasma flow (RPF) növekedése és egyéb tényezők, mint a prosztaglandin szintézis és a

58

tubuloglomerularis visszacsatolás megváltozása következtében. Feltételezhetjük, hogy e területen is hasonló jelenségek játszódnak le, mint a glomerulusokban, azaz az endothel sejtek endothelin szintézise fokozódik. A localisan termelődő endothelinnek szerepe van a matrix felhalmozódásban, a sejtproliferációban, hosszabb távon az arteriolák elzáródásában. A diabetes kezdeti szakaszában az endothelin vazokonstrikciót kiváltó hatását egyéb kompenzációs mechanizmusok ellensúlyozzák. A hiperfiltráció feltételezett mediátorai a következők: a magas glukózkoncentráció, a ketontestek, az inzulin és a glukagon, a növekedési hormon (GH), prostaglandinok, ANP, NO valamint a vese és a glomerulusok megnagyobbodása. A hiperfiltrációt kiváltó mechanizmusok kimerülésével a betegség előrehaladtával az erek beszűkülése, az RBF és RPF csökkenése egyre kifejezettebbé válik. A vesét ellátó erek falában szintetizálódó endothelin csak igen kis mértékben jelenik meg a vizeletben, a vizeletben ürülő endothelin mennyiségét a plazma endothelin szint illetve a GFR nem befolyásolja. A renalis endothelin ürítés diabeteses betegeknél megfigyelt fokozódásában tehát a vérellátást biztosító erek endothel sejtjeinek fokozott endothelin szintézise nem játszik szerepet. Az

efferens

arteriola

szerkezete,

beleértve

a

juxtaglomerularis

régiót

is,

hasonlóképpen változik meg, mint az afferens arterioláé. A nephropathia előrehaladtával hyalinosis figyelhető meg, a matrix felszaporodása elektronmikroszkóppal jól követhető microalbuminuriás IDDM-ben szenvedő betegeken (153). A juxtaglomerularis régióban képződő reninnek jelentős szerepe van a funkcionális és szerkezeti változások kialakulásában, a főleg intrarenalis, localis ANG II szint emelése révén. Az ANG II -nek további, a nephropathia kialakulásában fontos hatása van: fokozza a fibrogenezist, sejtnövekedést, sejthypertrophiát vált ki. Az endothelin-1 termelődését fokozza, annak legerősebb stimulátora. Szintetizálódik endothelin-1 helyben az endothel sejtekben is, de az efferens arteriola döntő szerepe az endothelin szintézis szempontjából az ANG II serkentő hatása révén a vese egyéb részein- főleg a glomerulus és a distalis tubulus- gyűjtőcsatorna területén mutatkozó stimuláció. Az endothelin, a korábban részletezett többi tényezővel együtt a matrix felszaporodását, a hyalinozis kialakulását okozza. A proximalis tubulusban szívódik vissza a filtrált Na+, a bikarbonát, az aminosavak és fehérjék jelentős része,

valamint a glukóz. Diabetesben a fokozott mértékben filtrálódó

glukóz mennyisége meghaladja a proximalis tubulus transportmaximumát, ezért megjelenik a vizeletben. A glukóz ozmotikus hatása révén vele együtt jelentős mennyiségű Na+ és víz is kerül a szűrletbe. A proximalis tubulusban a bazalmembrán megvastagodása már a korai

59

szakban a glomerulus bazalmembrán hasonló elváltozásaival párhuzamosan mutatkozik. Ez az eltérés a glomerulosclerosis progressziójával egyre kifejezettebbé válik. Az interstitialis matrix felszaporodása észlelhető már IDDM -os betegeknél a betegség kezdeti szakaszában is, ez a glomerulusokban zajló folyamatokhoz hasonló pathomechanizmusra utal. A glomerulusban képződő mediátorok a szűrlettel és részben a vérkeringéssel is eljutnak a tubulusokhoz, ugyanakkor a nagy mennyiségben főképpen a gyűjtőcsatornákban képződő endothelin is ide kerülhet. Az itt található hám és intersticiális sejtek is rendelkeznek ET receptorokkal, azonban az endothelin helybeli szintézise valószínűleg nem jelentős. A proximalis tubulus hámsejtek endothelin receptorának ingerlése a Na+ visszaszívás csökkenését váltja ki, ezáltal diuretikus hatású. Ez a tényező is hozzájárul a diabetesben megfigyelhető polyuriához. A Henle-kacs hámsejtjeinek membránján ETB receptorokat lehet kimutatni, de e sejtekben helyi endothelin szintézisre utaló mRNS-t nem találtak (137). Ide az endothelin a tubulus lumenében áramló folyadékkal és a vérárammal valamint a vasa recta endothelsejtjeiből az intercellularis folyadékkal jut. Hatása hasonló a nephron többi részén észlelhetőhöz, a sejtközötti állomány felszaporodását váltja ki. Ennél speciálisabb, a transzportfolyamatokat érintő hatást egyelőre nem tudtak kimutatni. A distalis tubulus hámsejtjei nagyobb számú ETB AT1 és vasopressin (V2) receptort tartalmaznak. E receptorok aktiválódása különböző hatású. Az AT1 ingerlése G proteinadenilát cyclase aktiválódása útján sejtproliferációt vált ki, a V2 aktiválódás hasonló mechanizmussal a lumen felőli oldalon aquaporin-2 szintézis stimulálása révén a víz és urea permeabilitás jelentős fokozódását eredményezi. ETB receptor hatására a cAMP szint csökken, ez antagonizálja a vasopresszin antidiuretikus hatását és diuresist okoz. A distalis tubulus hámsejtjei maguk is képesek endothelin szintézisre, de esetükben az ETB receptor ingerlése autoindukciót nem vált ki, ez a reakció a mesangium és endothel sejtekre jellemző. Az itt képződött endothelin részben távozik a szűrlettel, részben a már említett mechanizmus útján receptor kötődést követően a víz visszaszívását gátolja. A vesében a legnagyobb mennyiségű endothelin-1 szintézisére a gyűjtőcsatornák hámsejtjei képesek, ezt mRNS vizsgálatok egyértelműen igazolták (29). A vizeletben ürülő endothelin-1 túlnyomó része innen származik. Az itt képződő vasoaktív peptid részben a vizeletbe kerül, jelentős hányada azonban a sejtek basolateralis felszínén át az interstitialis térbe lép és ott fejti ki a hatását illetve a vérérammal távozik. A gyűjtőcsatornák hámsejtjein hasonló receptorokat találunk, mint a distalis tubulus epithelen. E sejteknek is jelentős szerepe

60

van a víz visszaszívásban, víz-permeabilitásukat az arginin-vasopressin (AVP) fokozza, az endothelin-1 csökkenti. Döntően e két peptid localis szintjének, illetve receptoraik expresszivitásának és ingerületi állapotának aránya határozza meg a visszaszívott víz mennyiségét. Kimutattuk, hogy 1-es típusú diabeteses gyermekek vizeletében az endothelin-1 ürítés szignifikánsan magasabb, mint az egészséges gyermekekében. A renalis endothelin ürítés növekedéséből arra következtethetünk, hogy diabetesben az endothelin szint a vese gyűjtőcsatorna hámsejtek basolateralis környezetében is nő, ETB receptorok ingerlése révén diuretikus hatást idézve elő. Az endothelin ürítéssel arányosan a diuresis növekedése figyelhető meg diabeteses betegeken. A vizelet-kiválasztás növekedésének nem egyetlen, de egyik jelentős tényezője az endothelin szintézis fokozódása. Az endothelin és a korábban részletezett mediátorok hatására a sejtközötti állomány is felszaporodik, és az idő előrehaladtával a diabetes nephropathiára jellemző hyalinozis a gyűjtőcsatornákban is progresszív módon kialakul. Az endothelin szintézis és ürítés növekedése éppen úgy, mint a diuresis fokozódása már a diabetes kezdeti szakaszán megfigyelhető, mértéke nem mutat összefüggést a betegség időtartamával. 7.4. Vizelettel történő endothelin ürítés fizikai terhelést követően stabil állapotú diabeteses gyermekekben A renalis endothelin excréciót számos tényező befolyásolhatja, így a fizikai aktivitás fokozódása is. Kerékpár ergometria kapcsán növekszik a szimpatikus aktivitás, a vizeletben megemelkedik a tubularis proteinek ürítése. Vizsgálataink során a kerékpár ergometria nem befolyásolta a renalis endothelin ürítést, ugyanakkor a pulzusszám és a vérnyomás emelkedése a szimpatikus aktivitás növekedését jelezték. Ez a megfigyelés is arra utal, hogy a szimpatikus aktivitás fokozódása nem befolyásolja a vesék endothelin exkrécióját. Az endothelin ürítés viselkedése eltér a fizikai aktivitás illetve tubulus károsodás kapcsán fokozottan ürülő tubularis proteinekétől. A tubularis proteinek a glomerulusokban filtrálódnak, majd nagyrészt a tubulusokban visszaszívódnak. Ürülésük változik a GFR illetve a tubulus funkciók változása esetén. A vizelettel ürülő endothelin legnagyobb része viszont a vesében szintetizálódik és a gyűjtőcsatornákban kerül a vizeletbe. Így érthető, hogy ürülését más tényezők befolyásolják, mint a tubularis proteinekét.

61

7.5. Renalis endothelin ürítés diabeteses ketoacidosisban Diabeteses ketoacidosisban speciális pathofiziológiai helyzet alakul ki. Az ozmotikus diuresis jelentős fokú víz-és sóvesztéssel jár, a beteg hypovolaemiássá válik. A vérnyomás fenntartását a perifériás értónus fokozódása biztosítja. A volumenvesztés progressziójával párhuzamosan a GFR és a RPF csökken, a vesefunkció romlik. Az acidosis és az elektrolit eltérések fokozzák a veseműködési zavart, a tubularis funkciók károsodása detektálható. A hypovolaemia hatására aktiválódik a renin-angiotensin-aldosteron rendszer, a szimpatikus idegrendszer, emelkedik a vasopressin és különböző prostaglandinok plazma szintje (152). Ha a vizeletet vizsgáljuk, az α1-microglobulin szintje diabeteses ketoacidosisban szignifikánsan emelkedik. Ez a fehérje a glomerulusban filtrálódik és proximalis tubulusban reabsorbeálódik. A proximalis tubulus működési zavara esetén a vizelet pH értéktől függetlenül renalis ürülése megnő. A Tamm-Horsfall protein a distalis tubulusban szintetizálódik, e nephron szakasz károsodása esetén ürülése csökken, így diabeteses ketoacidosisban is. Ezek az eltérések a későbbiekben normalizálódnak, mindkét változás az adott nephron segmentek, azaz a proximalis és distalis tubulusok átmeneti jellegű károsodására utal. Ha a vizelettel ürülő endothelin jelentős része e nephron szakaszokon szintetizálódna, akkor a renalis excretió csökkenését várhatnánk. Vizsgálataink során diabeteses ketoacidosisban a vizelettel ürített endothelin-1 mennyisége nem változott. Az endothelin ürítés mértéke a GFR-hez illetve kreatinin

ürítéshez viszonyítva viszont

emelkedett- mert ez a két paraméter szignifikánsan csökkent. Ennek alapján arra következtethetünk, hogy diabeteses betegek veséjében az endothelin szintézis fokozott mértékű és állandó még a jelentős anyagcsere változásokkal járó diabeteses ketoacidosisban is. Megfigyeléseink megerősítik azt a feltételezést, hogy a vizelettel ürülő endothelin túlnyomó része a gyűjtőcsatornákban szintetizálódik, e szempontból a proximalis és distalis tubulus szerepe nem jelentős. Az endothelin a vasopressin hatását antagonizálva szerepet játszik az emelkedett szintű diuresis fenntartásában. Ha figyelembe vesszük, hogy az endothelin szintézist az angiotensin II erősen fokozza és a ketoacidosisban az angiotensin II szintje emelkedik, azt is feltételezhetjük, hogy az endothelin 1 látszólag állandó, fokozott szintézisének fenntartásában az ANG II is résztvesz. Diabeteses ketoacidosisban a glukóz koncentráció igen magas. Az endothelin ürítés ugyanakkor állandó, azaz nem csökken, de nem is emelkedik. Ha a renalis endothelin szintézis és excretió arányos lenne a vércukor szinttel, ketoacidosis esetén igen magas

62

értékeket kellene mérnünk. Vizsgálataink alapján azonban a ketoacidosisban illetve a későbbi anyagcsere-egyensúly állapotában azonos mértékűnek mutatkozó endothelin ürítés arra utal, hogy a renalis endothelin szintézis nem korrelál a plazma glukóz koncentrációval. Diabetesben tehát az endothelint szintetizáló sejtek a vércukor szint emelkedése következtében a korábban említett mechanizmusok útján egy magasabb működési szintre állnak be, de ez a fokozott szintézis tovább már nem növelhető.

63

8. Összefoglalás Összefoglalva, egészséges gyermekekben a vizelettel történő renalis endothelin ürítés mennyisége az életkorral, azaz a testméretek növekedésével szignifikáns összefüggést mutatott, ugyugyanakkor az egységnyi testfelszínre korrigált érték állandó maradt. Érett újszülöttekben a vizelet endothelin koncentráció kezdeti magasabb érték után átlagosan 6 nap alatt érte el a normális szintet. Koraszülöttek renalis endothelin ürítése fokozott, fordított arányt mutat a gesztációs korral. A vizelettel ürített endothelin-1 mennyisége arányos volt a diuresissel. Diabeteses gyermekek vizelettel történő endothelin ürítése szignifikánsan magasabb volt az egészséges gyermekekhez viszonyítva, ugyanakkor ketoacidosisban mértéke már nem emelkedett tovább. 1-es típusú diabetes mellitusban az emelkedett glukózkoncentráció, a glikozilációs végtermékek, az ANG II, egyes cytokinek és prostaglandinok hatására már a betegség kezdetén a nephront alkotó minden sejtben növekszik az endothelin-1 szintézis. Ez az emelkedés konstans jellegű, jól mérhető a vizeletben is. A magasabb endothelin mennyiség szerepet játszik a sejtközötti matrix és a sejtes elemek felszaporodásában, hosszabb távon a hyalinosis kialakulásában. Az endothelin a cAMP aktiválódás útján ható vasopressint antagonizálva diuretikus hatású és folyamatosan fokozott vizeletürítést tart fenn, míg a GFR beszűkülés olyan jelentős nem lesz, hogy a kompenzációs mechanizmusok kimerülésével a diuresis csökkenését eredményezi. Az endothelin szintézist legjobban fokozó angiotensin II képződésének gátlásával e mechanizmusok jelentős mértékben lassíthatók. Az ACE gátlók therapiás hatása természetesen nem csak az endothelin képződés csökkentése révén jön létre, de ennek a mechanizmusnak jelentős szerepe van az észlelhető eredményekben. Hasonló kísérletek folynak endothelin receptor antagonistákkal is, várható, hogy a jövőben therapiás alkalmazásukra sor kerül. A diabeteses nephropathia kialakulásában számos részlet még továbbra sem tisztázott, ismereteink gyarapodásával az elképzelt mechanizmusokat is időnként újra kell értelmeznünk. Az endothelin 1 is egy olyan tényező, mely az utóbbi évek folyamán került látótérbe. Vizsgálataink is megerősítették azt a tényt, hogy renalis szintézise 1-es típusú diabetes mellitusban fokozódik és megnövekedett mennyiségének szerepe van a diabeteses nephropathia kialakulásában. A pathomechanizmus számos eleme már ismert, az újabb tényezők megismeréséhez további vizsgálatok szükségesek.

64

9. Új megállapítások 1. Az irodalomban elsőként határoztuk meg, 2,9 és 17 év közötti egészséges gyermekek vizelet endothelin exkréciójának normál tartományát: átlag ± SEM: 59,3 ± 3,7 ng/24óx1,73m2.

2. Elsőként mutattuk ki, hogy a fiatalabb gyermekek endothelin exkréciója alacsonyabb, mint az idősebb gyermekeké. A vizelet endothelin kiválasztás abszolút mennyisége az életkorral korrelál, ugyanakkor a testfelszínre korrigált érték állandó marad. Ez arra utal, hogy az endothelin ürítésben észlelt különbségek egészséges gyermekek esetében a test illetve vesemérettől függenek.

3. Kimutattuk, hogy koraszülöttek egységnyi testfelszínre számított endothelin exkréciója emelkedett, az igen kis súlyúaké kifejezettebben.

4. Kimutattuk, hogy forszírozott diuresis hatására a vizelettel történő endothelin ürítés szignifikánsan emelkedik, ugyanakkor a kiválasztott kreatinin mennyisége változatlan marad. E jelenséget valószínűleg a vesében történő endothelin szintézis fokozódása okozza.

5. Elsőként mutattuk ki, hogy a vizeletben ürülő endothelin mennyisége szoros korrelációt mutat nemcsak a forszírozott, hanem a normális diuresissel is. Ez a korreláció érett újszülöttekben, egészséges és diabeteses gyermekekben egyaránt megfigyelhető.

6. Az irodalomban elsőként mutattuk ki, hogy 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő gyermekeknél stabil metabolikus állapotban szignifikánsan magasabb renalis endothelin ürítés mérhető, mint az egészséges kontrolloknál. Ugyanakkor a diuresis mértéke is magasabb, azaz a fokozott endothelin ürítés emelkedett diuresissel jár együtt.

7. Diabeteses ketoacidosisban az irodalomban elsőként mutattuk ki, hogy gyermekekben a súlyos metabolikus zavar ellenére a 24 órás endothelin ürítés nem változik sem a kontroll csoporthoz (egyensúlyban levő diabeteses gyermekek), sem ugyanazon betegeken a 12 nappal később normális vércukor és pH értékek mellett végzett mérésekhez viszonyítva. A kreatinin ürítés, a GFR, a proximalis és distalis tubularis funkciók ketoacidosisban jelentős mértékű redukciót mutatnak, e változások arra utalnak, hogy a vese vérátáramlása, a glomerularis filtráció mértéke, a vesék excretiós képessége csökken.

8. Elsőként igazoltuk, hogy diabeteses ketoacidosisban a Tamm Horsfall Protein (THP) excretio csökken, majd az anyagcsere állapot normalizálódásával párhuzamosan újra

65

emelkedik. Ez a változás a Henle kacs felszálló ágának és a distalis tubulus kezdeti szakaszának a diabeteses ketoacidosis alatti reversibilis károsodására utal. Ugyanakkor a megnövekedett vizeletürítéssel párhuzamosan diabeteses gyermekekben a THP össz exkréció jelentősen meghaladja az egészséges gyermekekben észlelt értéket.

9. Igazoltuk, hogy diabeteses ketoacidosisban a proximalis tubularis funkció markere, az α1mikroglobulin vizelettel történő ürítése szignifikánsan emelkedik, majd az állapot stabilizálódását követően közel normalizálódik. Ez reverzibilis proximalis tubularis diszfunkcióra utal.

10. Kimutattuk, hogy diabeteses gyermekekben végzett fizikai terhelést követően (kerékpár ergometria 2 watt/kg 10 percig) nem változik a vizelettel történő endothelin ürítés. Ez amellett szól, hogy a fizikai munka kapcsán aktivizálódó szimpatikus idegrendszer nem befolyásolja a renalis endothelin exkréciót.

66

10. Az értekezéssel kapcsolatos saját publikációk jegyzéke 1. Máttyus I, Miltényi M, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Hentschel M, Brandis M, Tulassay T (1994) Endothelin excretion during ketoacidosis does not correlate with tubular dysfunction. Pediatr Nephrol 8: 304-308

IF:0,772 cit:2

2. Máttyus I, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Hentschel M, Brandis M, Miltényi M, Tulassay T (1994): Renal excretion of endothelin in children is influenced by age and diuresis. Acta Paediatr Scand 83: 468-472.

IF:0,852 cit:7

3. Máttyus I, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Brandis M, Miltényi M, Tulassay T (1995) Renal excretion of endothelin l is elevated in children with diabetes mellitus type I both in stable condition and after physical exercise. Acta Paediatr Scand 85: 1058-1061

IF:0,765

cit:4

4. Máttyus I, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Brandis M, Miltényi M, Tulassay T (1997) Renal excretion of endothelin in children. Pediatr Nephrol 11: 513-521

IF:1,031 cit:4

Abstractok:

5. Máttyus I, Miltényi M, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Hentschel M, Brandis M, Tulassay T: (1992) Die renale Excretion von Endothelin 1-21 wahrend diabetischer Ketoacidose bei Kindern. (abstr) Monatschr Kinderheilk 140: 138

6. Máttyus I, Miltényi M, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Tulassay T, Brandis M: (1992) Renal excretion of endothelin 1-21 during diabetic ketoacidosis and physical exercise. (abstr) Pediatr Nephrol 6: C128

7. Zimmerhackl LB, Schwarz A, Leititis J, Brandis M: (1992) Renal excretion of endothelin 1-21 is influenced by age, diuresis, renal disease and ciklosporine. (abstr) Pediatr Nephrol 6: C130

8. Miltényi M, Zimmerhackl L B, Máttyus I, Szabó A, Schwarz A, Brandis M: (1992) The early phase of diabetic nephropathy: metabolism dependent tubular dysfunction/ impairment. (abstr) Pediatr Nephrol 6: C127

67

11. Irodalomjegyzék 1. Hickey KA, Rubanyi G, Paul RJ, Highsmith RF (1985) Characterisation of a coronary vasoconstrictor produced by cultured endothelial cells. Am J Physiol 248: C550-C556

2. Yanagisawa M, Kurihara H, Kimura S, Tomobe Y, Kobayashi Y, Mitsui Y, Yazaki Y, Goto K, Masaki T (1988) A novel potent vasoconstrictor peptide produced by vascular endothelial cells. Nature 332: 411-415

3. Kimura S, Kasuya Y, Sawamura T, Shinmi O, Sugita Y, Yanagisawa M, Goto K, Masaki T (1988) structure-activity relationship of endothelin: importance of C-terminal moiety. Biochem Biophys Res Commun 156: 1182-1186

4. Simonsom MS (1993) Endothelins: multifunctional renal peptides. Physiol Rev 73: 375411

5. Rubanyi GM, Polokoff MA (1994) Endothelins: molecular biology, biochemistry, pharmacology, physiology, and pathophysiology. Pharmacol Rev 46: 325-415

6. Kon V, Badr KF (1991) Biological actions and pathophysiologic significance of endothelin in the kidney - editorial review. Kidney Int 40: 1-12

7. Hunley TE, Iwasaki S, Homma T, Kon V (1995) Nitric oxide and endothelin in pathophysiological settings. Pediatr Nephrol 9: 235-244

8. Sakurai T, Yanagisawa M, Takuwa Y, Miyazaki H, Kimura S, Goto K, Masaki T (1990) Cloning of a cDNA encoding a non-isopeptide-selective subtype of the endothelin receptor. Nature 348: 732-735

9. Arai H, Hori S, Aramori I, Ohkubo H, Nakinishi S (1990) Cloning and expression of a cDNA encoding an endothelin receptor. Nature 348: 732-735

10. Ujiie K, Terada Y, Nonoguchi H, Shinihara M, Tomita K, Marumo F (1991) Endothelin 1 mRNA and endothelin-1 production among the rat nephron segments. J Am Soc Nephrol 2: 420

11. Inoue A, Yanagisawa M, Takuwa Y, Mitsui Y, Kobayashi M, Masaki T (1989) The human preproendothelin-1 gene. J Biol Chem 264: 14954-14959

12. Hu RM, Chuang MY, Prins B (1994) High density lipoproteins stimulate the production and secretion of endothelin-1 from cultured bovine aortic endothelial cells. J Clin Invest 93: 1056-1062

68

13. Xu D, Emoto N, Giaid A, Slaughter C, Kaw S, deWit D, Yanagisawa M (1994) ECE-1: a membrane bound metalloprotease that catalyzes the proteolytic activation of big endothelin-1. Cell 78: 473-485

14. Yanagisawa H, Yanagisawa M, Kapur RP (1998) Dual genetic pathways of endothelinmediated intercellular signaling revealed by targeted disruption of endothelin converting enyzme-1 gene. Development 125: 825-836

15. Wagner OF, Christ G, Wojta J, Vierhapper H, Parzer S, Nowotny PF, Schneider B, Waldhaus W, Binder BR (1992) Polar secretion of endothelin-1 by cultured endothelial cells. J Biol Chem 267: 16066-16068

16. Davenport AP, Nunez DJ, Hall JA (1989) Autoradiographical localization of binding sites for porcine (125J) endothelin-1 in humans, pigs and rats: functional relevants in humans. J Cardiovasc Pharmacol 13: S 166-S 170

17. Hori S, Komatsu Y, Shigemoto R (1992) Distinct tissue distribution and cellular localisation of two messenger ribonucleic acids encoding different subtypes of rat endothelin receptores. Endocrinology 130: 1885-1895

18. Terada Y, Tomita K, Nonoguchi H, Marumo F (1992) Different localization of two types of endothelin receptor mRNA in microdissected rat nephron segments using reverse transcription and polymerase chain reaction. J Clin Invest 90: 107-112

19. Kon V, Fogo A (1993) Endothelin: potential role in development and disease. Pediatr Nephrol 7: 876-880

20. Takeda M, Breyer MD, Noland TD, Homma T, Hoover LR, Inagami T, Kon V (1992) Endothelin-1 receptor antagonist: effects on endothelin- and ciklosporine-treated mesangial cells. Kidney Int 41: 1713-1719

21. Simonson MS, Dunn MJ (1990) Cellular signaling by peptides of the endothelin gene family. FASEB J 4: 2989-3000

22. Goligorsky MS, Tsukahara H, Magazine H, Andersen TT, Malik AB, Bahou WF (1994) Termination of endothelin signaling: role of nitric oxide. J Cell Physiol 158: 485-494

23. Simonson MS, Herman WH (1993) Protein kinase C and protein tyrosine kinase activity contribute to mitogenic signaling by endothelin-1: cross talk between G protein-coupled receptors and pp60c-src. J Biol Chem 268: 9347-9357

24. Hirata Y, Emori T, Eguchi S (1993) Endothelin receptor subtype B mediates synthesis of nitric oxide by cultured bovine endothelial cells. J Clin Invest 91: 1367-1373

69

25. Baynash AG, Hosoda K, Giaid A (1994) Interction of endothelin-3 with endothelin-B receptor is essential for development of epidermal melanocytes and enteric neurons. Cell 79: 1277-1285

26. Puffenberger EG, Hosoda K, Washington SS (1994) A missense mutation of the endothelin-B receptor gene in multigenic Hirschprung’s disease. Cell 79: 1257-1266

27. Iwasaki S, Homma T, Matsuda Y, Kon V (1995) Endothelin receptor subtype B mediates autoinduction of endothelin-1 in rat mesangial cells. J Biol Chem 270: 6997-7003

28. Levin ER (1995) Endothelins N Engl J Med 333: 356-363 29. Ferri C, Pittoni V, Piccoli A, Laurenti O, Cassone MR, Bellini C, Properzi G, Valesini G, De Mattia G, Santucci A (1995) Insulin stimulates endothelin-1 secretion from human endothelial cells and modulates its cirulating levels. J Clin Endocrinol Metab 80: 829-835

30. Nir A, Clavell AL, Heublein D, Aarhus LL, Burnett JC (1994) Acute hypoxia and endogenous renal endothelin. J Am Soc Nephrol 4: 1920-1924

31. Morise Z, Ueda M, Aiura K, Endo M, Kitajima M (1994) Pathophysiologic role of endothelin-1 in renal function in rats with endotoxin shock. Surgery 115: 199-204

32. Imai T, Hirata Y, Emori T, Ohta K (1992) Induction of endothelin-1 gene by angiotensin and vasopressin in endothelial cells. Hypertension 19: 753-757

33. Goligorsky MS, Tsukahara H, Magazine H, Andersen TT, Malik AB, Bahou WF (1994) Termination of endothelin signaling: role of nitric oxyde. J Cell Physiol 158: 485-494

34. Sorensen SS, Madsen JK, Pedersen EB (1994) Systemic and renal effect of intravenous infusion of endothelin-1 healthy human volunteers. Am J Physiol 266: F411-418

35. Ito H, Hirata Y, Adachi S (1993) Endothelin-1 is an autocrine/paracrine factor in the machanism of angiotensin-induced hypertrophy in cultured rat cardiomyocytes. J Clin Invest 92: 398-403

36. Abassi ZA, Tate J, Golomb E, Keiser HR (1992) Role orf neutral endopeptidase in the metabolism of endothelin. Hypertension 20: 89-95

37. Uchida S, Horie M, Yanagisawa M, Matsushita Y, Korokawa K, Ogata E (1991) Polarized secretion of endothelin-1 and big ET-1 in MDCK cells is inhibited by cell Na+ flux and disrupted by NH4Cl. J Cardiovas Pharmacol 13: S166-S170

38. Yokokawa K, Tahara H, Kohno M (1991) Hypertension associated with endothelinsecreting malignant hyemangioendothelioma. Ann Intern Med 114: 213-215

70

39. Lerman A, Edwards BS, Hallett JW, Heublein DM, Sandberg SM, Burnett JC (1991) Circulating and tissue endothelin immunreactivity in advanced atherosclerosis. N Engl J Med 325: 997-1001

40. Miyauchi T, Yanagisawa M, Tomizawa T (1989) Increased plasma concentrations in endothelin-1 and big endothelin-1 in acute myocardial infarction. Lancet: 53-54

41. Pacher R, Stanek B, Hulsmann M (1996) Prognostic impact of big endothelin-1 plasma concentrations compared with invasive hemodynamic evaluation in severe heart failure. J Am Coll Cardiol 27: 633-641

42. McMurrayJJ, Ray SG, Abdullah I, Dargie HJ, Morton JJ (1992) Plasma endothelin in chronic heart failure. Circulation 85: 1375-1379

43. Wei CM, Lerman A, Rodenheffer RJ, Heublein DM (1994) Endothelin in human congestive heart failure. Circulation 89: 1580-1586

44. Ferro C, Webb D (1996) The clinical potential of endothelin receptor antagonists in cardiovascular medicine. Drugs 51: 12-27

45. Giaid A, Yanagisawa, Langleben D (1993) Expression of endothelin-1 in the lungs of patients with pulmonary hypertension. N Engl J Med 328: 1732-1739

46. Brooks DP, DePalma PD, Gellai M (1994) Nonpeptide endothelin receptor antagonists III. Effect of SB 209670 and BQ123 on acute renal failure in anesthetized dogs. J Pharmacol Exp Ther 271: 1-7

47. Buyukgebiz O, Aktan AO, haklar G (1996) BQ 123, a specific endothelin (ETA) receptor antagonist, prevents ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation. Transplant Int 9: 201-207

48. Kon V, Sugiura M, Inagami T, Harvie BR, Ichikawa I, Hoover RL (1990) Role of endothelin in ciklosporine-induced glomerular dysfunction. Kidney Int 37: 1487-1491

49. Kivlighn SD, Gabel RA, Siegl PKS (1994) Effects of BQ-123 on renal function and acute ciklosporine-induced renal dysfunction. Kidney Int 45: 131-136

50. Brooks DP, Contino LC (1995) Prevention os ciklosporine A-induced renal vazokonstrikción by the endothelin receptor antagonist SB 209670. Eur J Pharmacol 294: 571-576

51. Kon V, Hunley TE, Fogo A (1995) Combined antagonism of endothelin A/B receptors links

endothelin

to

vazokonstrikción

whereas

Transplantation 60: 89-95

71

angiotensin

II

affects

fibrosis.

52. Benigni A, Perico N, Ladny J (1990) Increased urinary excretion of endothelin-1 and its precursor, big-endothelin, in rats chronically treated with ciklosporine. Transplantation 52: 175-177

53. Mesa H, Zimmerhackl HB, Hoschötzky H, Brandis M (1993) Ciklosporine is more toxic at the apical than at basolateral side of cell membrane of renal epithelial cells (LLC-PK1) and its toxicity is enhanced by endothelin (abstract). Clin Invest 23: 22

54. Heyman SN, Clark BA, Kaiser N, Spokes K, Rosen S, Brezis M, Epstein B (1992) Radiocontrast agents induce endothelin-release in vivo and in vitro. J Am Soc Nephrol 3: 58-65

55. Hentschel M, Gildein P, Brandis M, Zimmerhackl LB (1995) Endothelin-1 is involved in the contrast media induced nephrotoxicity in children with congenital heart disease. Clin Nephrol 43: S12-S15

56. Pollock DM, Polakowski JS (1995) Beneficial effect of ETA receptor blockade in radiocontrast-induced nephropathy in the rat. J Am Soc Nephrol 6: 667 (abstr)

57. Oldroyd SD, Haylor JL, Morcos SK (1995) Bosentan, an orally active endothelin antagonist: effect on the renal response to contrast media. Radiology 196: 661-665

58. Hocher B, Thone-Reineke C, Rohmeiss P (1997) Endothelin-1 transgenic mice develop glomerulosclerosis, intestinal fibrosis, renal cysts but not hypertension. J Clin Invest 99: 1380-1389

59. Nabakov A, Amann K, Wagner J, Gehlen F, Munter K, Ritz E (1996) Influence of specific and non-specific endothelin receptor antagonists on renal morphology in rats with surgical renal ablation. Nephrol Dial Transplant 11: 514-520

60. Benigni A, Colosio V, Brena C, Bruzzi I, Bertani T, Remuzzi G (1998) Unselective inhibition of endothelin receptors reduces renal dysfunction in experimental diabetes. Diabetes 47: 450-456

61. Coceani K, Kelsey ZL (1991) Endothelin-1 release from lamb ductus arteriosus: relevance to postnatal closure of the vessel. Can J Physiol Pharmacol 69: 218-221

62. Binet I, Wallnofer A, Weber C, Jones R, Thiel G (1999) Renal hemodinamics and pharmacokinetics of bosentan with and without ciklosporine A. Nephrol Dial Transplant 14: 165-174

63. Wang A, Bashore T, Holcslav T,

(1998) Randomized prospective doble blind

multicentre trial of endothelin receptor antagonist in the prevention of contrast nephrotioxicity. J Am Soc Nephrol 9: 137 A

72

64. Lüscher TF, Barton M (2000) Endothelins and endothelin receptor antagonists: therapeutic considerations for a novel class of cardiovascular drogs. Circulation 102: 24342440

65. Suzuki Y, Arakawa M (1995) The treatment of the uraemic diabetic. Are we doing enough? A view from Japan. Fumitake Gejyo Collaborate Study Group Nephrol Dial Transplant 10 (Suppl 7): 47-55

66. Raine Ae (1995) The rising tide of diabetic nephropathy: The warning before the flood? Nephrol Dial Transplant 10: 462-467

67. Ismail N, Becker B, Strzelczyk P, Ritz E (1999) Renal disease and hypertension in noninsulin-dependent diabetes mellitus. Kidney Int 55: 1-28

68. Hasslacher C, Ritz E, Wahl P, Michael C (1989) Similar risks of nephropathy in patients with type I or type II diabetes mellitus. Nephrol Dial Transplant 4: 859-863

69. Wiseman MJ, Saunders AJ, Keen H, Viverti G (1985) Effect of blodd glucose control on increased glomerular filtration rate and kidney size in insulin-dependent diabetes. N Eng J Med 312: 617-621

70. Mauer SM, Steffes MV, Ellis EN, Sutherland DE, Brown DM, Goetz FC (1984) Structural-functional relationships in diabetic nephropathy. J Clin Invest 74: 1143-1155

71. Mogensen CE, Christensen CK (1985) Blood pressure changes and renal function in incipient and overt diabetic nephropathy. Hypertension 7: II64-II73

72. Bilous RW, Mauer SM, Sutherland DE, Steffes MV (1989) Mean glomerular volume and rate of development of diabetic nephropathy. Diabetes 38: 1142-1147

73. Remuzzi G, Ruggenenti P, Benigni A (1997) Understanding the nature of renal disease progression. Kidney Int 51: 2-15

74. Myers BD, Nelson RG, Williams GW, Benett PH, Hardy SA, Berg RL, Loon N, Knowler WC, Mitch WE (1991) Glomerular function in Pima indians with noninsulin-dependent diabetes mellitus of recent onset. J Clin Invest 8: 534-530

75. DeCosmo S, Earle K, Morocutti A, Walker J, Ruggenenti P, Remuzzi G, Viverti GC (1993) Glucose-induced changes in renal haemodinamics in preinuric type 1 (insulindependent) diabetic patients: Inhibition by acetylsalicylic acid infusion. Diabetologia 36: 622- 627

73

76. Christiansen JS, Gammelgaard J, Tronier B, Svendsen PA, Parving HH (1982) Kidney function and size in diabetics before and during initial insulin treatment. Kidney Int 21: 683-688

77. Crowley ST, Brownlee M, Edelstein D (1991) Effects of nonenzymatic glycosylation on mesangial matrix on proliferation of mesangial cells. Diabetes 40: 540-547

78. Soules-Liparota T, Cooper ME, Papazoglou D (1991) Retardation by aminoguanidine of development of albuminuria, mesangial expansion, and tissue fluorescecnce in streptozotocin-induced diabetic rat. Diabetes 40: 1328-1334

79. Greene D (1988) The pathogenesis and prevention of diabetic neuropathy and nephropathy. Metabolism 37: 25-29

80. Porte D, Schwartz M (1996) Diabetes complications: Why is glucose potentially toxic? Science 272: 699-700

81. Ishii H, Jirousek MR, Koya D (1996) Amelioration of vascular dysfunctions in diabetic rats by an oral PKC inhibitor. Science 272: 728-731

82. Moran A, Brown DM, Kim Y (1991) Effects of IgF-1 and glucose on protein and proteoglycan synthesis by human fetal mesangial cells in culture. Diabetes 40: 1346-1354

83. Gronbaek H, Nielsen B, Frystik J (1996) Effect of lanreotide, a somatostatin analogue on diabetic renal hypertrophy, kidney and serum IgF-1 and IgF binding proteins. Exp Nephrol 4: 295-303

84. Ziyadeh FN, Chen Y, Davila A (1992) Self limited stimulation of mesangial cell growth in high glucose: Autocrine activation of TGF-β reduces proliferation but increases mesangial matrix. Kidney Int 42: 647-656

85. Wolf G, Zahner G, Mondorf U (1993) Angiotensin II stimulates cellular hypertrophy of LLC-PK1 cells throgh the AT1 receptor. Nephrol Dial Transplant 8: 128-133

86. Hill C, Logan A, Sheppard MC, Thomas C (1998) Effect of ACE inhibition on the altered itrarenal TGF-β system in experimental diabetes. Nephrol Dial Transplant 13: 1076-1077

87. Jerums G, Allen TJ, Campbell DJ, Cooper ME, Gilbert RE, Hammond JJ, Raffael J, Tsalamandris C (2001) Long-term comparison between perindopril and nifedipine in normotensive patients with type 1 diabetes and microalbuminuria. Am J Kidney Dis 37:890-899

88. O’Hare P, Bilbous R, Mitchell T, O’Callaghan CJ, Viberti GC (2000) The Ace-Inhibitor Trial to Lower Albuminuria in Normotensive Insulin-Dependent Subjects Study Group

74

Low-dose ramipril reduces microalbuminuria in type 1 diabetic patients without hypertension: results of a randomized controlled trial. Diabetes Care 23: 1823-1829

89. Lewis JB, Berl T, Bain RP, Rohde RD, Lewis EJ (1999) Effect of intensive blood pressure control on the course of type 1 diabetic nephropathy. Collaborative Study Group. Am J Kidney Dis 34: 951-954

90. Mau Pedersen M, Christiansen JS, Pedersen EB, Mogensen CE (1992) Determinants of intra-individual variation in kidney function in normoalbuminuric insulin-dependent diabetic patients: importance of atrial natriuretic peptide and glicaemic control. Clinical Science 83: 445-451

91. Lutterman JA, Vervoort G, Wetzels JFM, Berden JHM, Smits P (1998) Increased albuminuric response to infusion of atrial natriuretic peptide in normoalbuminuric Type I diabetes. Diabetologia 41: A39

92. Wahl P, Deppermann D, Hasslacher C (1982) Biochemistry of glomerular basement membrane of the normal and diabetic human. Kidney Int 21: 744-749

93. Tuttle KR, Stein JH, DeFronzo RA (1990): The natural history of diabetic nephropathy. Semin Nephrol 10: 184-193

94. Mogensen CE (1998) Combined high blood pressure and glucose in type 2 diabetes: double jeopardy (editorial). Brit Med J 317: 693-694

95. Chowdhury TA, Kumar S, Barnett AH, Bain SC (1995) Naphropathy in type 1 diabetes: The role of genetic factors. Diabet Med 12: 1059-1067

96. Mogensen C.E:(1999) Microalbuminuria, blood pressure and diabetic renal disease: origin and development of ideas Diabetologia 42: 263-285

97. Madácsy L., Yasar A., Tulassay T., Körner A., Kelemen J., Hóbor M., Miltényi M. (1994) Relative nocturnal hypertension in children with insulin-dependent diabetes mellitus. Acta Paediatr 83: 414-417

98. Barker DJ., Hales CN, Fall CH, Osmond C, Philipps K, Clark PM: (1996)Type 2 (noninsulin-dependent) diabetes mellitus, hypertension and hyperlipidaemia (syndrome X): relation to reduced fetal growth. Diabetologia 36(1): 62-70.

99. Nyengaard JR, Bendtsen TF, Mogensen CE (1996) Low birth weight - is it aasociated with few and small glomeruli in normal persons and NIDDM patients? Diabetologia 39: 1634-1637

75

100. Morgensen CE, Keane WF, Bennett PH, Jerums G, Parving HH, Passa P, Steffes MV, Striker GE, Viberti GC (1995) Prevention of diabetic renal disease with special reference to microalbuminuria. Lancet 346: 1080-1084

101. Ohkubo Y, Kishikawa H, Araki E, Miyata T, Isami S, Motoyoshi S, Kojima Y, Furuyoshi N, Shichiri M (1995) Intensive insulin therapy prevents the progression of diabetic maicrovasular complications in Japanese patients with non-insuline-dependent diabetes mellitus: A randomized prospective 6-year study. Diabetes Res Clin Pract 28: 103-117

102. Mathiesen ER, Homel E, Hansem HP, Parving HH (1998) Preservation of normal GFR in type 1 diabetic patients with microalbuminuria under long-term (8years) ACE inhibition. Nephrol Dial Transplant 13: 1062

103. Peterson JC, Adler S, Burkart JM, Greene T, Hebert LA, Hunsicker LG, King AJ, Klahr S, Massry SG, Seifter JL (1995) Blood pressure control, proteinuria, and the progression of renal disease. The Modificalion Diet in Renal Disease Study. Ann Intern Med 123: 754762

104. Christensen CK, Mogensen CE (1987) Antihypertensive treatment: long-term reversal of progression of albuminuria in incipient diabetic nephropathy. A longitudinal study of renal function . J Diab Comp 1: 45-52

105. Curb JD, Pressel SJ, Cutler JA, Savage PJ, Applegate WB, Black H, Camel G, Davis BR, Frost PH, Gonzalez N, Guthrie G, Oberman A, Rutan GH, Stamler J (1996) Effect of diuretic-based antihypertensive treatment on cardiovascular disease risk in older diabetic patients with isolated systolic hypertension. Systolic Hypertension in the Elderly Program Cooperative Research Group. JAMA 276: 1886-1892

106. Kasiske BL, Kalil RS, Ma JZ, Liao M, Keane WF (1993) Effect of antihypertensive therapy on the kidney in patients with diabetes: A meta-regression analysis. Ann Intern Med 118: 129-138

107. Koch M, Thomas B, Tschope W, Ritz E (1993) Survival and predictors of death in dialysed diabetic patients. Diabetologia 36: 1113-1117

108. Gross ML, El-Shakmak A, Szabo A, Koch A, Kuhlmann A, Munter K, Ritz E, Amann K (2003) ACE-inhibitors but not endothelin receptor blockers prevent podocyte loss in early diabetic nepropathy. Diabetologia 46: 856-868

76

109. Zanchetti A, Ruilope L M (2002) Antihypertensive treatment in patients with type-2 diabetes mellitus: what guidance from recent controlled randomized trials? J Hypertens 20: 2099-2110

110. Buter H, Navis G, Dullaart RP, de Zeeuw D, de Jong PE (2001) Time course of the antiproteinuric and renal haemodynamic responses to losartan in microalbuminuric IDDM. Nephrol Dial Transplant 16: 771-775

111. Raal FJ, Kalk WJ, Lawson M, Esser JD, Buys R, Fourie L, Panz VR (1994) Effect of moderate dietary prtotein restriction on the progression of overt diabetic nephropathy: A 6mo prospective study. Am J Clin Nutr 60: 579-585

112. Toeller M, Buyken A, Heitkamp G, Bramswig S, Mann J, Milne R, Gries FA, Keen H (1997) Protein intake and urinary albumin excretion rates in the EURODIAB IDDM Complications Study. Diabetologia 40: 1219-1226

113. Sármán B, Farkas K, Tóth M, Somogyi A (2000) Circulating plasma endothelin-1, plasma lipids and complications in type 1 diabetes mellitus. Diab Nutrition and Metabol Clin Exper 13: 142-148

114. Groop PH, Elliott T, Ekstrand A, Franssila-Kallunki A, Friedman R, Viberti GC, Taskinen MR (1996) Multiple lipoprotein abnormalities in type I diabetic patients with renal disease. Nephron 45: 974-979

115. Eschope W, Koch M, Thomas B, Ritz E (1993) Serum lipids predict cardiac death in diabetic patients on maintenance hemodialysis: results of a prospective study. The German Study Group Diabets Uraemia. Nephron 64: 354-358

116. Takahashi K, Ghatei MA, Lam HC, O’Hallaran DJ, Bloom SR (1990) Elevated plasma endothelin in patients with diabetes mellitus. Diabetologia 33: 306-310

117. Haak T, Jungmann E, Felber A, Hillmann U, Usadel KH (1992) Increased plasma levels of endothelin in diabetic patients with hypertension. Am J Hypertens 5: 161-166

118. Malamitsi-Puchner A, Economou E, Katsouyanni K, Karachaliou F, Delis B, Bartsocas CS (1996) Endothelin 1-21 plasma concentrations in children and adolescents with insulin dependent diabetes mellitus. J Paediatr Endocrinol Metab 9: 463-468

119. Morise T, Takeuchi Y, Kawano M, Koni I, takeda R (1995) Increased plasma levels of immunoreactive endothelin and von Willebrand factor in NIDDM patients. Diab Care 18: 87-89

77

120. Kanno K, Hirata Y, Shichiri M, Marumo F (1991) Plasma endothelin-1 levels in patients with diabetes mellitus with or without vascular complication. J Cardiovasc Pharmacol 17 (Suppl 7): S475-S476

121. Hopfner RL, Misurski D, Wilson TW, McNeill JR, Gopalakrishan V (1998) Insulin and vanadate restore decreased plasma endothelin concentrations and exaggerated vascular responses to normal in the streptozotocin diabetic rat. Diabetologia 41: 1233-1240

122. Hopfner RL, McNeill JR, Gopalakrishnan V (1999) Endothelin plasma levels and endothelin-1 evoked vascular responses at different temporal stages of diabetes in streptozotocin diabetic rats. Eur J Pharmacol 374: 221-227

123. Haynes WG, Webb DJ (1998) Endothelin as a regulator of cardiovascular function in health and disease. J Hypertens 16: 1081-1098

124. Nugent AG, McGurk C, Hayes JR, Johnston GD (1996) Impaired vazokonstrikción to endothelin-1 in patients with NIDDM. Diabetes 45: 105-107

125. Hopfner RL, Gopalakrishnan V (1999) Endothelin: emerging role in diabetic vascular complications. Diabetologia 42: 1383-1394

126. Keynan.S, Khamaisi M, Dahan R, Barnes K, Jackson CD, Turner AJ, Raz I (2004) Increased expression of endothelin – converting enzyme - 1c isoform in response to high glucose levels in endothelial cells. J Vasc Res 41: 131-140

127. Verma S, Wang CH, Weisel RD, Badivala MV, Li SH, Fedak PW, Li RK, Mickle DA (2003) Hyperglycaemia potentiates the proatherogenic effects of C-reactive protein: reversal with rosiglitazone. J Mol Cell Cardiol 35: 417-419

128. Oliver FJ, de la Rubia G, Feener EP (1991) Stimulation of endothelin-1 gene expression by insulin in endothelial cells. J Biol Chem 266: 23251-23256

129. Ferri C, Pittoni V, Piccoli A (1995) Insulin stimulates endothelin-1 secretion from human endothelial cells and modulates its circulating levels in vivo. J Clin Endocrinol Metab 80: 829-835

130. Piatti PM, Monti LD, Conti M (1996) Hypertrigliceridaemia and hyperinsulinaemia are potent inducers of endothelin-1 release in humans. Diabetes 45: 316-321

131. Hopfner RL, Hasnadka RV, McNeill JR, Wilson TW, Gopalakrishnan V (1998) Insulin increases endothelin-1 evoked intracellular free Ca2+ responses by increased ETA receptor expression in aortic smooth muscle cells. Diabetes 47: 937-944

78

132. Strippoli GF, Di Paolo S, Cincione R., Di Palma AM., Teutonico A., Grandalioano G, Shena FP, Gesualdo L (2003) Clinical and therapeutic aspects of diabetic nephropathy J Nephrol 16: 487-499

133. Sakurai K, Sawamura T (2003) Stress and vascular responses: endothelial dysfunction via lecitin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1: close relationships with oxidative stress J Pharmacol Sciences 91: l82-186

134. Sorokin A, Kohan DE (2003) Physiology and pathology of endothelin-1 in renal mesangium. Am J Physiol- Renal Fluid & Electrolite Physiology 285: F579-589

135. Sorenson SS, Madsen JK, Pedersen EB (1994) Systemic and renal effect of intravenous infusion of endothelin-1 in healthy human volunteers. Am J Physiol 266: F411-F418

136. Nakamura T, Ebihara I, Fukui M, Tomino Y, Koide H (1995) Effect of a specific endothelin receptor A antagonist on mRNA levels for extracellular matrix components and growth factors in diabetic glomeruli. Diabetes 44: 895-899

137. Lee YJ, Shin SJ, Tsai JH (1994) Increased urinary endothelin-1 like immunoreactivity in NIDDM patients with albuminuria. Diabetes Care 17: 263-266

138. De Mattia G, Cassone-Faldetta M, Bellini C (1998) Role of plasma and urinary endothelin-1 in early diabetic and hypertensive nephropathy. Am J hypertens 11: 983-988

139. Cosenzi A, Bernobich E, Trevisan R, Milutinobvic N, Borri A, Bellini G (2003) Nephroprotective effect of bosentan in diabetic rats. J Cardiovas Pharmacol 42: 752-756

140. Gross ML, Ritz E, Schoof A, Helmke B, Parkman A, Tulp O, Munter K, Amann K (2003) Renal damage int he SHR/N-cp type 2 diabetes model: comparison of an angiotensin-converting enzyme inhibitor and endothelin receptor blocker Lab Invest 83: 1267-1277

141. Khan ZA, Chakrabarti S (2003) Endothelins in chronic diabetic complications Can J Physiol Pharmacol 81: 622-634

142. Winkles JA, Alberts GF, Brogi E, Libby P (1993) Endothelin-1 and endothelin receptor mRNA expression in normal and atherosclerotic human arteries. Biochem Biophys Res Commun 191: 1081-1088

143. Maramo G, Palazessi S, Bernucci P, Grigioni M, Formigari R, Ballerini L (1998) ETA/ETB receptor antagonist bosentan inhibits neo-intimal development in collared carotid arteries of rabbits. Life Sci 63: PL259-PL266

79

144. Perfetto F, Tarquini R, Tapparini L, Tarquini B (1998) Influence of non-insulin dependent diabetes mellitus on plasma endothelin-1 levels in patients with advanced atherosclerosis. J Diabetes Complications 12: 187-192

145. Cameron NE, Dines KC, Cotter MA (1994) The potential contribution of endothelin-1 to neurovascular abnormalities in streptozotocin diabetic rats. Diabetologia 37: 1209-1215

146. Chakravarthy U, McGinty A, McKillop J, Anderson P, Archer DB, Trimble ER (1994) Altered endothelin-1 induced contraction and second messenger generation in bovine retinal microvascular pericytes cultured in high glucose medium. Diabetologia 37: 36-42

147. Ogata M, naruse M, Iwasaki N (1998) Immunoreactive endothelin levels in the vitreous are decreased in diabetic patients with proliferative retinopathy. J Cardiovasc Pharmacol 31 (Suppl 1): S378-S379

148. Ohta K, Hirato Y, Shichiri M, Kanno K, Emori T, Tomita K, Marumo F (1991) Urinary excretion of endothelin-1 in normal subjects and patients with renal disease. Kidney Int 39:307-311

149. Zimmerhackl LB, Pfleiderer S, Kinne R, Manz F, Schuler G, Brandis M (1991) TammHorsfall-Protein excretion as a marker of ascending limb transport indicates early renal tubular damage in diabetes mellitus type I. J Diabetic Complications 5: 112-114

150. Máttyus I, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Brandis M, Miltényi M, Tulassay T (1995) Renal excretion of endothelin l is elevated in children with diabetes mellitus type I both in stable condition and after physical exercise. Acta Paediatr Scand 85: 1058-1061

151. Máttyus I, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Hentschel M, Brandis M, Miltényi M, Tulassay T (1994): Renal excretion of endothelin in children is influenced by age and diuresis. Acta Paediatr Scand 83: 468-472

152. Máttyus I, Miltényi M, Zimmerhackl LB, Schwarz A, Hentschel M, Brandis M, Tulassay T (1994) Endothelin excretion during ketoacidosis does not correlate with tubular dysfunction. Pediatr Nephrol 8: 304-308

153. Oesterby R, Bangstad HJ, Nyberg G (1995) A quantitative ultrastructural study of juxtaglomerular arterioles in IDDM patients with micro- and normoalbuminuria. Diabetologia 38: 1320-1327

80

12. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Miltényi Miklós Professzor Úrnak, hogy gyermekgyógyászi pályámon és a nephrológiai irányú kutatásokban elindított. Tulassay Tivadar Professzor Úrnak, hogy munkámban végig támogatott és segített, lehetővé tette e dolgozat megírását. Mathias Brandis és L.B.Zimmerhackl Professzor Uraknak, a Freiburgi Gyermekklinika orvosainak és asszisztenseinek, hogy külföldi kutatásaimban támogattak és segítettek. Dr Körner Anna adjunktus asszonynak hogy témavezetőként e dolgozat megírásában segített, konkrét javaslataival formálta, javítgatta munkámat. Madácsy László Professzor Úrnak, hogy tanácsaival támogatta dolgozatomat. Az I. Gyermekklinikán dolgozó kollégáknak segítségükért, tanácsaikért.

81

Summary In healthy children renal endothelin excretion showed a significant correlation with age and body size. If endothelin excretion was corrected to body surface, it was constant. In term newborns the endothelin concentration of urine was high after birth and decreased to the normal level on the 6th day of life. The renal endothelin excretion of preterm infants is elevated, shows a negative correlation with gestational age, and a positive correlation with diuresis. In diabetic children renal endothelin excretion was significantly higher than in healthy children, with no further elevation in diabetic ketoacidosis ( = DKA). In type 1 diabetes mellitus due to the stimulatory effect of the elevated blood glucose, the advanced glycosylation end products, angiotensin II, cytokins and prostaglandins enhance the synthesis of endothelin-1 in almost every cell of the nephron already at the beginning of the disease. The elevation of endothelin sythesis can be detected as elevated urinary excretion, and it seems to be constant. The higher amount of endothelin plays an important role in extracellular matrix production, cellular hyperplasia and hyalinosis. Endothelin, antagonising vasopressin by activating cAMP has a diuretic effect and maintains elevated diuresis until the decrease of GFR lowers urinary output. By antagonising of angiotensin II synthesis the progress of these processions can be inhibited. Partly the effect of ACE inhibition works via inhibition of endothelin synthesis. Endothelin receptor antagonists seem to be also effective in inhibition of development of diabetic nephropathy. Our investigations suggest that elevated renal synthesis of endothelin-1 has a role in the development of diabetic nephropathy. The pathogenesis of diabetic nephropathy is not completely cleared yet. Endothelin-1 is a pathogenic factor, getting in the focus during the last years. Our investigations showed, that the renal synthesis of endothelin-1 is enhanced in diabetes mellitus type 1, and it plays a role in the pathogenesis of diabetic nephropathy.

82