Doktori értekezés
Az autofágia szerepe a Myc-indukálta sejtnövekedésben
Nagy Péter
Biológia Doktori Iskola, iskolavezető: Prof. Erdei Anna, DSc Molekuláris Sejt- és Neurobiológia Doktori Program, programvezető: Prof. Sass Miklós, DSc Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar
Témavezető: dr. Juhász Gábor, PhD. tudományos főmunkatárs Készült: Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar Anatómiai, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék Budapest, 2013
Tartalomjegyzék 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE .......................................................................................................... 3 2. BEVEZETÉS .................................................................................................................................... 5 2.1. AZ AUTOFÁGIA .................................................................................................................................. 5 2.2. SEJTNÖVEKEDÉS ÉS AUTOFÁGIA ...................................................................................................... 12 2.3. MODELLSZERVEZET: DROSOPHILA MELANOGASTER ....................................................................... 14 2.4. GENOMLÉPTÉKŰ VIZSGÁLATOK AUTOFÁG GÉNEK KERESÉSE CÉLJÁBÓL .......................................... 18 2.5. MYC: TRANSZKRIPCIÓS FAKTOR ÉS ONKOGÉN ................................................................................. 19 2.6. AZ AUTOFÁGIA MODULÁCIÓJA RÁKSEJTEKBEN ............................................................................... 23 3. CÉLKITŰZÉSEK .......................................................................................................................... 26 4. EREDMÉNYEK............................................................................................................................. 27 4.1. GÉNEXPRESSZIÓS VÁLTOZÁSOK VIZSGÁLATA AZ ÉHEZTETÉSSEL INDUKÁLT AUTOFÁGIA SORÁN .... 27 4.2. AUTOFÁG GÉNEK KERESÉSE IN VIVO TELJES GENOM SZŰRÉSSEL ..................................................... 31 4.3. A MYC SZÜKSÉGES A BAZÁLIS ÉS AZ ÉHEZTETÉSSEL INDUKÁLT AUTOFÁGIÁHOZ ............................ 35 4.4. A MYC OVEREXPRESSZIÓ MEGNÖVELI A SEJTEK MÉRETÉT ÉS AUTOFÁGIÁT INDUKÁL ..................... 37 4.5. A MYC OVEREXPRESSZIÓ MEGNÖVELI AZ AUTOFÁG LEBONTÁS MÉRTÉKÉT .................................... 39 4.6. AZ AUTOFÁGIA SZÜKSÉGES A MYC-INDUKÁLT SEJTNÖVEKEDÉSHEZ ............................................... 42 4.7. A MYC OVEREXPRESSZIÓ NÖVELI AZ ANTIOXIDÁNS VÁLASZT......................................................... 46 4.8. A P62 ÉS AZ ANTIOXIDÁNS AKTIVITÁS SZÜKSÉGES A MYC-INDUKÁLT SEJTNÖVEKEDÉSHEZ ........... 48 4.9. AZ ANTIOXIDÁNS VÁLASZ ÉS AZ AUTOFÁGIA EGYMÁSSAL PÁRHUZAMOSAN SZÜKSÉGESEK A MYCINDUKÁLT SEJTNÖVEKEDÉSHEZ ............................................................................................................. 52 4.10. A MYC OVEREXPRESSZIÓ HASONLÓ KINETIKÁVAL AKTIVÁLJA AZ AUTOFÁGIÁT ÉS AZ ANTIOXIDÁNS VÁLASZT ................................................................................................................................................ 52 4.11. A MYC-INDUKÁLT UPR (UNFOLDED PROTEIN RESPONSE) SZÜKSÉGES A MEGNÖVEKEDETT MÉRTÉKŰ SEJTNÖVEKEDÉSHEZ ÉS AZ AUTOFÁGIÁHOZ ........................................................................... 55 5. AZ EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA ......................................................................................... 59 5.1. GÉNEXPRESSZIÓS VIZSGÁLATOK ..................................................................................................... 59 5.2. A MYC-INDUKÁLT SEJTNÖVEKEDÉS VIZSGÁLATA ........................................................................... 60 6. ÖSSZEFOGLALÁS ....................................................................................................................... 65 7. SUMMARY .................................................................................................................................... 66 8. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ..................................................................................................... 67 9. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS ........................................................................................................ 78 10. MELLÉKLETEK ......................................................................................................................... 80 11. REFERENCIÁK .......................................................................................................................... 94 12. INTERNETES REFERENCIÁK ............................................................................................... 106 13. PUBLIKÁCIÓK ......................................................................................................................... 107
2|
1. Rövidítések jegyzéke ↑: overexpresszió (túltermeltetés) 4EBP: eIF4E-binding protein (eIF4E-kötő fehérje) AEL: after egg laying (peterakás után) Akt/PKB: protein kinase B AMP: adenosine monophosphate AMPK: AMP-activated protein kinase (AMP-aktivált protein kináz) ATF6: activating transcription factor 6 Atg: autophagy-related ChIP: chromatin immunoprecipitation dpi: dot per inch EDTP: egg-derived tyrosine phosphatase eIF2α: elongation initiation factor 2α (elongációs iniciációs faktor 2α) ER: endoplazmatikus retikulum FDR: false discovery rate FIP200: focal adhesion kinase [FAK] family interacting protein of 200 kD Foxo: forkhead box, subgroup O Gadd34: growth arrest and DNA damage-inducible protein Gene IC 50 effect: a drog 50%-os koncentrációja esetén tapasztalt hatás GFP: green fluorescent protein GO: Gene Ontology GstD: glutathione S transferase D HIF-1: hypoxia inducible factor 1 Hsc70: heat shock protein cognate 70 IM10: immune-induced molecule 10 IMP: inosine 5'-monophosphate IRE1: inositol-requiring enzyme-1 JNK: c-Jun N-terminal kinase Keap1: Kelch-like ECH-associated protein 1 Lamp-2A: lysosomal associated membrane protein-2A (lizoszóma asszociált membrán fehérje-2A) L3, L4: 3. és 4. longitudinális (hosszanti) szárnyvéna LTR: Lysotracker Red mCherry: monomeric Cherry 3|
mTORC1: mammalian target of rapamycin complex1 Nrf2: NF-E2 related factor-2 PCV: posterior cross vein (hátsó kereszt véna) PERK: PKR-like ER-localized eIF2α kinase (PKR-szerű ER-lokalizált eIF2α kináz) PI3K: phosphatidyl inositol 3 kinase PIP2: phosphatidil inositol 4,5 bisphosphate prApe1: proforma Aminopeptidase1 pTEF-b: positive transcription elongation factor b PTEN: phosphatase and tensin homolog Rack1: receptor of activated protein kinase C 1 (receptor aktivált protein kináz C 1) Ref(2)P: refractory to sigma P RGB: Red Green Blue RNSi: RNS interferencia S6k: P70-S6 kinase SAGE: serial analysis of gene expression TBP: TATA-box binding protein (TATA-box kötő fehérje) TFIIE: transcription factor IIE (transzkripciós faktor IIE) TRRAP: transformation/transcription domain-associated protein TSC1/2: tuberous sclerosis complex 1/2 UAS: upstream activating sequence ULK1: unc-51-like kinase 1 UPR: unfolded protein response (hibás konformációjú fehérjék által kiváltott válasz) Vha: Vacuolar H+ ATPase Vps: vacuolar protein sorting WHO: World Health Organization Xbp1: X-box binding protein (X-box kötő fehérje)
4|
2. Bevezetés 2.1. Az autofágia Általánosan autofágiának nevezzük mindazon folyamatokat a sejtekben, melyek során a sejt saját anyagai a lizoszómába (élesztők és növények esetén a vakuólumba) szállítódnak. Az autofágiának három fő útvonalát különböztetjük meg: mikroautofágia, chaperon-mediált autofágia és makroautofágia (1. ábra). Mikroautofágia
során
a
multivezikuláris
testek
képződésére
jellemző
membrándinamikához hasonlóan a lizoszómák/endoszómák membrán invaginációjakor a lebontandó citoplazmás anyagok bekerülnek az adott organellumba. A chaperon-mediált autofágia során bizonyos KFERQ-szekvenciával rendelkező citoplazmatikus szubsztrátok a Hsc70 és egyéb ko-chaperonok segítségével a lizoszómákon található Lamp-2A fehérjéhez kötnek, majd a lizoszómákba jutnak (Mizushima és Komatsu 2011). A folyamat létezésére in vitro, valamint újabban humán sejttenyészeti adatok utalnak. A makroautofágia (mostantól az egyszerűség kedvéért autofágia) evolúciósan konzervált lizoszómális lebontó útvonal, mely során a citoplazma bizonyos elemei kettős membránnal határolt autofagoszómákba csomagolódnak (1. ábra). Az autofagoszómák tartalma az endo/lizoszómális kompartment elemeivel történő fúzió után a savas környezetben aktív emésztőenzimek hatására lebomlanak. A lebontás után keletkező anyagok újrahasznosulnak energiatermelő és szintetikus folyamatok során. Az autofágia alapszinten minden eukarióta sejtben működik, és nélkülözhetetlen szerepe van a sérült, elöregedett sejtorganellumok, valamint a hibás konformációjú fehérjék és aggregátumaik eltávolításában. A különböző stresszhatások kivédésében központi szerepe van az autofágia folyamatának, így elősegítve a sejtek túlélését (Mizushima és mtsai. 2008).
5|
1. ábra Az autofágia három fő útvonala (Mizushima és Komatsu 2011) Részben az autofágia felel a sejtek homeodinamikájának fenntartásáért, így nem meglepő, hogy a csökkent autofág aktivitás számos humán betegség kialakulásában szerepet játszik. A hibás, elöregedett organellumok, illetve a nem megfelelő konformációjú fehérjék autofágia hiányában felhalmozódnak a sejtekben, amely így különböző neurodegenerációs betegségek kialakulásához vezet (Juhasz és mtsai. 2007; Mizushima és mtsai. 2008; Simonsen és mtsai. 2008). Az autofágia neurodegenerációs betegségekben betöltött szerepét igazolja, hogy a Huntington betegség Drosophila modelljében a poliglutamin fehérjeaggregátumok autofágia révén eltávolítódhatnak a sejtekből (Ravikumar és mtsai. 2004; Williams és mtsai. 2006; Winslow és Rubinsztein 2008). Az Alzheimer-kór esetén a létrejövő autolizoszómák nem emésztenek megfelelően, így hozzájárulhatnak a disztrófiás neuritek kialakulásához (Ling és Salvaterra 2009; Moloney és mtsai. 2010). A sérült, elöregedett mitokondriumok megemelkedett oxidatív stresszt idéznek elő a sejtekben. Autofágia defektus esetében ezek a mitokondriumok nem eliminálódnak a sejtekből. Az ilyenkor fokozott mértékben felszabaduló reaktív oxigén 6|
gyökök rendkívül genotoxikusak, mutációkat okozhatnak a sejtekben, melyek gyakran tumor progresszióhoz vezetnek (Kongara és Karantza 2012). Az autofágia tumorszuppresszor funkciójával ellentétesen szerepet játszhat a tumorigenezis kezdeti lépéseiben is (Wei és mtsai. 2011). Az autofágia a lebontott anyagok reciklizációja révén energiatermelő és bioszintetikus folyamatok fokozása által segítheti a tumoros sejtek növekedését és túlélését a vaszkularizáció bekövetkezte előtt. Későbbi stádiumú tumorokban
az
megemelkedett
egészséges szintű
sejtekhez
autofág
képest
lebontás
megnövekedett
szolgáltathat
glikolízishez
megfelelő
a
mennyiségű
alapanyagot. Ezekben a tumorsejtekben csökken a mitokondriális energiatermelés jelentősége. A sejtek csökkent oxigénigény mellett glikolízis révén jutnak energiához és a tumoros sejtekre jellemző gyakori sejtosztódásokhoz szükséges szintetikus folyamatok során felhasználható építőkövekhez (Warburg 1956; Lock és mtsai. 2011). Az autofágia tumorprogresszió és tumorszuppresszor folyamatok során felismert kétélű tulajdonsága miatt rendkívül fontos, hogy felismerjük és pontosan azonosítsuk azokat a tényezőket a tumorok kialakulása során, amelyek terápiás célpontként hatásos eszközei lehetnek a tumorok elleni küzdelemben. Az Atg6/Beclin1 mono-allélikus delécióját kimutatták mell-, prosztata- és petefészek tumorok 40-75%-ában. Közismert az is, hogy léteznek olyan onkogén fehérjék, melyek a TOR kináz hiperaktivitását idézik elő, aminek következtében az autofágia állandó gátlás alatt áll (Aita és mtsai. 1999; Maiuri és mtsai. 2009). A nem vaszkularizált tumorok esetében a tumoros sejtek mikrokörnyezetére a hipoxia, valamint az alacsony glükóz- és egyéb tápanyag ellátottság jellemző. Ilyen mikrokörnyezeti tényezők ER stresszt idézhetnek elő, aminek következtében aktiválódik az autofágia, hozzájárulva a tumorsejtek túléléséhez és különböző tumorellenes kezelésekkel szembeni érzéketlenséghez, ami jelentősen csökkenti a terápia hatékonyságát. Az ER-ben történik számos fehérje funkcióképes konformációjának kialakítása, valamint itt raktározódnak nagy mennyiségben az egyéb fehérjék
konformációjának
funkciójához szükséges Ca
kialakításában 2+
szerepet
játszó
chaperon
fehérjék
ionok. Nem megfelelő ER funkció esetén tehát
megnövekszik a sejtekben a hibás konformációjú fehérjék szintje, ami megfelelő válaszokat (UPR - Unfolded Protein Response) vált ki a sejtekben. UPR során három különböző útvonalon is aktiválódhat az autofágia: 1. a PERK foszforiláció által inaktiválja az eIF2α-t, ami az autofágia aktiválását és a transzláció gátlását okozza; 2. az IRE1 aktiválja a JNK fehérjét, ami egy stressz-aktiválta kináz, és ismert funkciója, hogy az autofág indukciót serkenti; 3. az ATF6/Xbp1 útvonalon keresztül is aktiválódhat az 7|
autofágia. Úgy tűnik tehát, hogy az ER stressz által kiváltott autofágia kompenzációs folyamatként segíti a sejtek túlélését a hibás konformációjú fehérjék lebontásával, aminek eredményeképpen csökkenti a stresszhatások mértékét, valamint a lebontás által építőköveket szolgáltat energiatermelő- és szintetikus folyamatok számára (Schleicher és mtsai. 2010; Suh és mtsai. 2012; Bristol és mtsai. 2013). Humán betegségekben azonosított szerepe miatt mindenképpen szükséges, hogy az autofágia folyamatát minél pontosabban ismerjük. Szükségszerű az autofág struktúrák kialakításában részt vevő központi gének és működésük felderítése, valamint a folyamat szabályozását irányító molekuláris mechanizmusok minél részletesebb ismerete. Az autofágia szerepének azonosítása különböző fiziológiás folyamatokban, vagy patológiás elváltozások során kialakuló sejtbiológiai jelenségek során, nélkülözhetetlen ahhoz, hogy jövőbeni terápiás célpontokat azonosítsunk és kezeléseket dolgozzunk ki. Az autofagoszómák kialakulásában központi szereppel rendelkező, ~20 ATG (autophagy-related) gént élesztőben azonosították először (Tsukada és Ohsumi 1993; Thumm és mtsai. 1994; Harding és mtsai. 1995; Harding és mtsai. 1996; Klionsky és mtsai. 2003). Az ATG génekről képződő fehérjék különböző komplexeket alkotnak és megtalálhatóak a PAS-ban (pre-autofág struktúra). Legelőször élesztőben mutatták ki, hogy az Atg fehérjék komplex hierarchikus kapcsolati rendszer alapján toborzódnak a szelektív szállítmány, a prApe1 aggregátumnál létrejövő PAS területére, és így vesznek részt az autofagoszómák képződésében (Suzuki és mtsai. 2007; Suzuki és Ohsumi 2007; Suzuki és Ohsumi 2010). Nemrégiben C. elegans és emlős szövettenyészeti rendszerekben is feltérképezték az autofagoszómák kialakulásában szerepelő Atg géntermékek hierarchikus kapcsolati rendszerét (Itakura és Mizushima 2010; Lu és mtsai. 2011). Széles körben elfogadott és ismert tény, hogy az autofág folyamatok iniciációjában (2. ábra) meghatározó szerepe van az Atg1 kináz komplexnek (állatok esetén alegységei az Atg1/ULK1, Atg13, FIP200 és Atg101) (Orian és mtsai. 2003; Mizushima 2010). Az iniciációs lépést követi a nukleáció, melyhez elengedhetetlen egy autofágia-specifikus III. típusú foszfatidil-inozitol 3-kináz komplex megfelelő működése (Atg14, Vps34, Vps15, Atg6/Beclin1) (Cao és Klionsky 2007; Juhasz és mtsai. 2008; Zhong és mtsai. 2009; Noda és mtsai. 2011; Obara és Ohsumi 2011). A lipid
kináz
komplex
működése
szükséges
a
pre-autofág
struktúrák
(PAS)
kialakulásához, melyekhez feltehetően az Atg9 transzmembrán fehérje szállít prekurzor vezikulákat (Mari és mtsai. 2010; Ohashi és Munro 2010; Kakuta és mtsai. 2012; Orsi 8|
és mtsai. 2012). Az Atg9 az Atg2 és az Atg18 fehérjék segítségével ciklizál a preautofág struktúrák (PAS) és a különböző lehetséges membránforrások, mint a Golgi és az endoszómák, között (Munakata és Klionsky 2010). Végül az autofagoszómák kialakulásához szükséges két ubiquitin szerű konjugációs rendszer megfelelő működése, melyek az Atg8a C-terminális lipidációjáért felelősek. Az Atg7 E1-szerű enzime az Atg8a és Atg12 fehérjéknek, melyet az Atg3 és Atg10 E2-szerű aktivitása követ. A konjugációs rendszer működésének eredményeként az Atg12 kovelensen kapcsolódik az Atg5-höz és egy nagyméretű fehérjekomplexbe szerelődik, melynek az Atg16 is a tagja (Hanada és mtsai. 2007; Geng és Klionsky 2008; Fujioka és mtsai. 2010; Romanov és mtsai. 2012; Walczak és Martens 2013). Ez a komplex járul hozzá az Atg8a lipidációjához, ezáltal az izoláló membránhoz és az autofagoszóma membránba való kapcsolódásához foszfatidil-etanolamin horgonyon keresztül (Kabeya és mtsai. 2004; Weidberg és mtsai. 2010). Az Atg8a lipidációja előtt az Atg4 cisztein proteáz egy C-terminális glicint követően hasítja az Atg8a-t, amely így válik konjugációra alkalmassá (Fujita és mtsai. 2008; Satoo és mtsai. 2009). Az Atg8a reciklizálódik a külső membránról, míg a belső membránhoz kapcsolt Atg8a lebomlik a lizoszómával való fúzió után (Chen és Klionsky 2011).
9|
2. ábra Az autofágia sematikus folyamata és molekuláris mechanizmusa
10 |
A PAS kialakulásának két központi kérdése, hogy hol jön létre, és hogy milyen membránforrásokból származik. Az egyik modell szerint a PAS de novo keletkezik és az Atg9 által különböző forrásokból szállított lipidek hozzáadásával növekszik. A másik modell szerint a PAS az ER-ből eredeztethető omegaszómákból alakul ki az ER-hez kapcsoltan. Leírták ugyanakkor, hogy az ER, a Golgi, az endoszómák, a mitokondriumok és akár a plazmamembrán is szolgáltathat membránforrást a PAS kialakulása során (Axe és mtsai. 2008; Hailey és mtsai. 2010; Chen és Klionsky 2011; Mizushima és Komatsu 2011). Az élesztőben jól meghatározott helyen alakul ki a PAS: a sejtekben megtalálható nagy vakuóla mellett lokalizálódó prApe1 jelöli ki a PAS helyét (Hutchins és Klionsky 2001). Többsejtűekben eddig azonban nem sikerült ilyen pontosan meghatározni a PAS kialakulásának helyét. Az autofág lebontás szelektivitásának kérdése központi fontosságú, vagyis hogy a lebontásra kerülő anyagok véletlenszerűen csomagolódnak-e az autofagoszómákba vagy irányítottan. Ismerünk néhány fehérjét (pl.: p62/Ref2P, Alfy/blue cheese), melyek a lebontásra ítélt anyagok kijelölését végzik. A p62 két különböző doménje által képes kötni az ubiquitinhez és az Atg8a-hoz egyaránt. Az ubiquitin lebontásra ítélt fehérjékhez konjugálódik különböző enzimrendszerek segítségével. Az ubiquitin kapcsolt fehérjék ezután már kötnek a p62-höz, ami a korai autofág struktúrák felszínén nagy számban megtalálható Atg8a-hoz köti az ubiquitinilált fehérjéket. A lebontásra ítélt fehérjék egy része ezzel a szelektív mechanizmussal kerül be az autofagoszómákba, majd bontódik le az autolizoszómákban (Pankiv és mtsai. 2007; Filimonenko és mtsai. 2010; Ichimura és Komatsu 2010; Tung és mtsai. 2010; Itakura és Mizushima 2011; Johansen és Lamark 2011). A p62 egy nagyléptékű Drosophila sejttenyészetben vizsgált fehérje kölcsönhatásokat térképező vizsgálat alapján (Guruharsha és mtsai. 2011) kölcsönhathat más autofágiában szerepet játszó fehérjékkel is, mint például az Atg101, Atg14, Atg18, Vps34. Ez arra utalhat, hogy a p62 szelektív lebontást elősegítő funkcióján kívül egyéb, állványfehérje (scaffold) feladatokkal is rendelkezik a korai autofág struktúrák kialakítása során.
11 |
2.2. Sejtnövekedés és autofágia Az
anabolikus
és
katabolikus
folyamatok
egyensúlya
nagymértékben
meghatározza a sejtek növekedését. Az anabolikus folyamatok túlsúlya a katabolikus aktivitással szemben a sejt növekedését idézi elő, amihez rengeteg „alapanyag” szükséges. Ezért logikus, hogy a katabolikus folyamatok túlsúlya esetén a sejtek növekedése gátolt, míg az anabolikus folyamatok túlsúlya esetén a sejtek képesek a növekedésre.
Az
anabolikus
folyamatokhoz
nélkülözhetetlen
a
sejtekben
megemelkedett bioszintetikus aktivitás. Ehhez szükséges minél több fehérje előállítása, tehát a transzláció aktiválása. A transzlációhoz szükséges riboszómák szintézise szigorú ellenőrzés alatt áll a sejtben. Kimutatták, hogy a tumorszuppresszor p53 és Rb, valamint a CyclinD és Myc onkogének közvetlenül szabályozzák riboszómák biogenezisét, így központi szerepük van a sejtek növekedésében (Jorgensen és Tyers 2004; Neufeld 2010). Az autofagoszómák kialakulásában szerepet játszó autofág gének szigorú szabályozás alatt állnak az mTORC1 komplex által, melynek tagja az mTOR kináz, ami a sejtek növekedési útvonalainak központi szabályozója (Neufeld 2004; Jewell és Guan 2013). Növekedési faktorok folyamatos jelenléte esetén az inzulin receptorról induló jelátvitel során az I. típusú PI3K által aktiválódik az Akt/PKB, ami feltételezések szerint gátolja a TSC1/2 tumorszuppresszor komplex működését. A PTEN a PI3K antagonistájaként gátolja az Akt aktiválódását (Sarbassov és mtsai. 2005; Avruch és mtsai. 2006; McCubrey és mtsai. 2012). A PI3K/TOR jelátvitel működése révén aktiválódó mTOR közvetlenül foszforilálja az Atg1 kinázt, ami az Atg1 kináz komplexet inaktiválja (Chan 2009). Növekedési faktorok jelenlétében és megfelelő intracelluláris aminosav és energiaellátottság esetén tehát az mTOR aktivitása gátolja az autofág folyamatokat (Alers és mtsai. 2012; Inoki és mtsai. 2012). Az aktív mTOR amellett, hogy gátolja az autofágia iniciációját, foszforiláción keresztül aktiválja az S6K fehérjét, valamint gátolja a 4EBP fehérjét. Ezek következtében a sejtben megnövekszik a riboszómák aktivitása, ami a transzláció aktiválását idézi elő (Jastrzebski és mtsai. 2007). Energiahiány, tápanyaghiány vagy növekedési faktorok hiánya esetén az mTOR aktivitása gátolt, aminek következtében az Atg1 kináz komplex felszabadul a gátlás alól, és így az autofágia indukálódik. Az autofág lebontás révén a sejtekben a tápanyagés energiahiányos környezeti tényezők esetén is megfelelő építőkövek keletkeznek bioszintetikus és energiatermelő folyamatok számára, ami a sejtek túléléséhez vezet. 12 |
Kimutatták, hogy az
mTOR
egy lizoszómák felszínéhez
kapcsolódó
fehérjekomplexben található aktív formájában, amikor gátolja az autofágiát. Aminosavak hiányában disszociál a lizoszómák felszínéről, ekkor indukálódik az autofágia. Tenyésztett sejtekben az autofág lebontás révén az autolizoszómában keletkező aminosavak hatására az mTOR reaktiválódik. Az mTOR tehát a lizoszómák felszínéhez kapcsolódva központi szerepet játszik a sejtek növekedési útvonalainak és az autofágia szabályozásának integrációjában (Zoncu és mtsai. 2011; Efeyan és mtsai. 2013). Összességében sejtnövekedést
és
elmondható,
az
autofágiát.
hogy
a
TOR
Növekedési
ellentétesen
faktorok
szabályozza
hiányában,
a
valamint
energiahiányos környezeti feltételek esetén a TOR inaktiválódik, így nem gátolja az autofágiát, viszont csökkent működésének eredményeként a transzláció gátolt a sejtben. Növekedési faktorok jelenlétében, vagy megfelelő energiaellátottságú állapot esetén a TOR gátolja az autofágiát és aktiválja a transzlációt, ami a sejtek növekedéséhez vezet. A TOR kináz folyamatos gátlása vagy funkcióvesztése esetén a sejtek egyrészt hiperautofágiát mutatnak, másrészt növekedésük is gátolt, ezek eredménye a kis sejtméret (Neufeld 2012).
13 |
2.3. Modellszervezet: Drosophila melanogaster Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) a genetikai kutatások ideális és széles körben alkalmazott modellszervezete. A teljes genom nukleotidszekvenciája ismert. A Drosophila kutatók által használt online adatbázisban (flybase.org) rengeteg, egyre bővülő információ áll rendelkezésre arról is, hogy az egyes gének transzkripciója és transzlációja során mikor, hol és milyen géntermékek keletkeznek. Az egyre elterjedtebben használt in vitro sejttenyészeti vizsgálati rendszerekben gyorsan és hatékonyan kivitelezhetőek drogkezelések és géncsendesítési kísérletek. A Drosophila modell bizonyos előnyei ugyanakkor vitathatatlanok. A célzott genetikai manipulációk által előidézett fenotípusok ugyanis sok szempontból hatékonyabban tanulmányozhatóak in vivo. Így például információkat gyűjthetünk a mutációk és overexpressziók szervezet szintű, fiziológiás, különböző szöveteket érintő hatásáról is.
3. ábra A Drosophila életciklusa (forrás: http://drosi.wordpress.com/drosophilamelanogaster/)
A Drosophila teljes átalakulással fejlődő (Holometabola) rovar, fejlődése során három lárvastádiumot különíthetünk el (3. ábra). A harmadik lárvastádium végén a lárvák zsírtestjében intenzív autofágia indukálódik. Az autofág lebontás révén felszabaduló aminosavak, cukrok, zsírsavak megfelelő alapanyagot szolgáltatnak energiatermelő és szintetikus folyamatok számára az egyedfejlődés eme fontos fázisában (metamorfózis), mely során a diploid imaginális sejtcsoportok osztódása és differenciálódása révén kialakul az imágó. A harmadik lárvastádium elején a jól táplált állatok zsírtestjében aminosav éheztetés hatására nagymértékben megnő az autofág aktivitás, emiatt jól tanulmányozható ebben az egyedfejlődési szakaszban is. A zsírtest 14 |
szintén kiválóan alkalmas a sejtnövekedés tanulmányozására, mert a poliploid sejtekben a DNS replikációs ciklusokat nem követi citokinézis. A zsírtest a lárvák legnagyobb szerve, ami boncolással könnyen hozzáférhető, ezért egyszerűen vizsgálható. Különböző folyamatok genetikai hátterének megismerése szempontjából igen hasznos, hogy a Drosophila genetikaliag könnyen manipulálható, és alacsony kromoszómaszámmal rendelkezik (4 pár). Rutinszerűen alkalmazott technikák lehetővé teszik mutánsok és transzgén állatok létrehozását, vagyis bármilyen DNS szakasz tetszőlegesen beépíthető a Drosophila genomba. A térben és időben szabályozott génexpresszió az UAS/Gal4 rendszer alkalmazásával lehetséges (Duffy 2002). A tetszőleges promóter szekvencia szabályozása alatt álló Gal4 képes az UAS elemekhez
kötni,
ezzel
aktiválja
az
UAS
szabályozása alatt álló szekvenciák expresszióját. A Gal4 promótere meghatározza, hogy ezen transzkripciós
faktor
expressziója
milyen
szövetekben, mikor, milyen hatásokra kapcsoljon be. A Gal4 hatására bekapcsoló UAS transzgének lehetnek
fluoreszcens
riporterek
vagy
RNS
interferencia általi géncsendesítésre használt DNS szakaszok. 4. ábra Az UAS/Gal4 és az Flp/FRT rendszer működése
Az UAS/Gal4 rendszer további genetikai elemekkel bővíthető: ilyen például az Flp/FRT (Flp recombinase target) rendszer (4. ábra),
melynek alkalmazásával genetikai mozaik állatok hozhatóak létre (Duffy 2002). A hősokk promóter szabályozta Flp (flippáz enzim) bizonyos sejtekben hősokk nélkül is átíródik a promóter lötyögő (leaky) expressziója következtében és kivágja az ún. FRT szekvenciák által határolt DNS szakaszokat a genomból (jelen esetben a neutrális CD2 fehérjét kódoló szakaszt). Ezután a konstitutív aktin promóter szabályozása alatt álló Gal4 íródik át a CD2 helyett. A Gal4 kötődik az UAS szekvenciákhoz, így beindítva egyrészt a rekombinációt jelző riporter, továbbá egyéb UAS által szabályozott transzgén kifejeződését (például domináns negatív hatást okozó vagy RNS interferencia közvetített géncsendesítést kiváltó szekvencia expressziója). A rekombinációs esemény következtében a vad típusú sejtektől eltérő genetikai állománnyal rendelkező klónsejtek 15 |
jönnek létre. A rendszer előnye, hogy a klónsejtekben kialakuló fenotípus könnyen tanulmányozható, ugyanis a klónokat vad típusú sejtek veszik körbe. Ezzel a rendszerrel nagymértékben kiküszöbölhető a különböző állatok közötti variabilitás, és ezáltal pontosabban és könnyebben vizsgálhatjuk gének funkcióját. Gének funkciójának vizsgálatakor az adott gén hiányában létrejövő fenotípus elemzése igen fontos. A funkcióvesztés vizsgálatához különböző mutánsok (P-elem inszerciós mutánsok, pontmutációk, deléciók), illetve géncsendesítéses kísérleteket végezhetünk. Napjainkban gének funkcionális analízise esetén gyakran alkalmazott technika az RNS interferencia jelenségén alapuló géncsendesítés. A folyamat a sejt saját RNS feldolgozó rendszerén alapszik, ami a génkifejeződés során képződő RNS-ek stabilitását, féléletidejét szabályozza. Az RNS interferencia igen fontos a különböző idegen RNS-ekkel szemben történő védekezésben, így például elsődleges védelmi szereppel rendelkezik különböző vírusokkal törénő fertőzések esetén (Bagasra és Prilliman 2004; Cerutti és Casas-Mollano 2006). Az RNS interferencia folyamata során az RNS-ek bizonyos szakaszaihoz rövid, komplementer RNS szekvenciák kötődnek. Ez a transzláció gátlásához és az RNS degradációjához vezet. Az RNS interferencia által okozott géncsendesítés tehát poszt-transzkripcionális szinten történik, vagyis a folyamat hatására gátlódik a funkcionális fehérje létrejötte az adott génről. A folyamat egyik központi eleme a Dicer, ami a komplementer kettős szálú RNS-ekből létrehozza azokat a rövid RNS-eket, amik a génexpresszió gátlását váltják ki (Kurreck 2009). Ezt az RNS feldolgozó rendszert „vették kölcsön” a kutatók, hogy a mesterségesen bejuttatott transzgénikus DNS-ről képződő, interferáló RNS-ek által célzottan lecsökkentsék (csendesítsék) bizonyos fehérjék szintjét a sejtben, így könnyen vizsgálható a gén funkcióvesztéses fenotípusa. A kísérleti rendszertől függően napjainkra bőséges géncsendesítési eszköztár áll rendelkezésünkre. Az in vitro és in vivo rendszerekben alkalmazott géncsendesítés közötti egyik legnagyobb különbség, hogy az RNS interferenciát közvetítő transzgén hogyan kerül a sejtekbe. Az in vitro sejttenyészeti technikák esetén egyszerű transzdukció és aktiválás után bizonyos idővel már vizsgálható a hatás. Drosophila esetén az RNS interferenciát kiváltó DNS szakaszt tartalmazó transzgén a genomba integrálódva található meg. A genomi integráció történhet random, ám ez nem a legideálisabb, ugyanis az inszerció géneket inaktiválhat vagy letalitást okozhat. Az RNS interferencia transzgén genomi inszerciója előre meghatározott kromoszómális platformokra is történhet. Ebben az esetben a random integráció esetleges mutagén 16 |
hatása kiküszöbölődik, és a transzgén expressziója is megbízhatóan magas, mivel a kromoszómális környezet nem befolyásolja a transzgén átíródásának intenzitását. Természetesen az RNS interferencia transzgénről képződő RNS-ek által közvetített géncsendesítés hatékonysága a specifitás, az RNS mennyisége és a feldolgozó rendszerek hatékonysága miatt különböző lehet. Drosophila esetében több különböző RNS interferencia könyvtár érhető el: a VDRC (Vienna Drosophila Research Center) központban egy P-elem inszerciós (GD) és egy phiC31, helyspecifikus inszerciós (KK) könyvtárakat (Dietzl és mtsai. 2007); DGRC (Drosophila Genetic Resource Center, Japan) esetén egy P-elem inszerciós könyvtárat; TRiP esetén (Transgenic RNAi Project, Bloomington, USA) pedig mind szomatikus, mind pedig csírasejtekre optimalizált (mikroRNS alapú), helyspecifikusan integrált könyvtárakat is használhatunk. A RNS interferencia általi géncsendesítés során figyelembe kell venni a technikai korlátokat: 1. fontos, hogy az RNS interferencia hatását milyen hosszú idő után vizsgáljuk; 2. gyenge expresszió esetén a géncsendesítés hatásfoka alacsony lehet, vagyis nem távolítódik el minden célzott RNS a sejtből; 3. a kialakult fenotípus vizsgálata során figyelembe kell venni az esetleges off-target hatásokat is, ami abból adódhat, hogy a géncsendesítés során nem csak a célzott RNS-ek kerülnek lebontásra; 4. hosszú féléletidejű fehérjék esetén hiába csökken az RNS-ek mennyisége a géncsendesítés hatására, a fehérjeszint nem feltétlenül fog jelentősen változni. Az offtarget hatások optimalizálása a különböző könyvtárak megjelenésével nagymértékben fejlődött. A legmegbízhatóbb információt az nyújtja, ha különböző könyvtárak ugyanazon gén csendesítését okozó vonalait is leteszteljük, és lehetőleg az RNS interferencia által létrejött fenotípust mutánsok vizsgálatával is megerősítjük (Ma és mtsai. 2006; Booker és mtsai. 2011; Mohr és Perrimon 2012).
17 |
2.4. Genomléptékű vizsgálatok autofág gének keresése céljából A különböző molekuláris biológiai vizsgáló módszerek fejlődésével lehetővé vált gének funkciójának, kifejeződésének egyre gyorsabb és nagyobb léptékű vizsgálata. A DNS microarray alapú technológiák lényege, hogy gyorsan, szimultán vizsgálható tetszőleges számú gén kifejeződési mintázata különböző biológiai mintákon. Így könnyen és rövid idő alatt vizsgálhatjuk, hogy különböző mutációk, környezeti hatások, kezelések hatására milyen gének fejeződnek ki a sejtben és milyen mértékben. Fontos azonban, hogy a DNS alapú microarray vizsgálatok során nyert információk csupán arról szólnak, hogy a kérdéses génről képződik-e mRNS. Vagyis a gének funkciójára vonatkozó adatokat nem kapunk. A technika további limitációja, ha a különböző kezelésekre adott válasz nem transzkripcionális szintű szabályozás által történik. Ilyenkor a génkifejeződési mintázat megváltozása nem nyújt információt a válaszreakcióról, ami bekövetkezhet például poszt-transzlációs módosítások révén. A különböző kezelések hatására bekövetkező transzkripcionális változások microarray alapú korrelációs analízise azonban megfelelő alapot nyújthat további in vivo kísérletek számára, mint azt korábbi autofág gének azonosítását célzó vizsgálatok is bemutatták (Juhasz és mtsai. 2007). Az
RNS
interferencia
könyvtárak
lehetővé
teszik,
hogy
gének
funkcióvesztésének hatását in vivo teszteljük. A gének nagy részére elérhetőek már transzgénikus RNS interferencia vonalak, így lehetővé válik, hogy autofágiában szerepet játszó géneket kereső kísérleteket genomléptékben végezzünk. A szűrés (screen) lényege, hogy megvizsgáljuk minél több gén funkcióvesztésének hatását az autofág folyamatok során. A genom szűrés pozitív „találatai” ígéretes alanyai lehetnek további vizsgálatoknak, melyek a különböző funkciók feltárását célozzák meg.
18 |
2.5. Myc: transzkripciós faktor és onkogén A Myc egy basic helix-loop-helix leucin cippzár (bHLH LZ) szerkezetű transzkripciós faktor. Az aktív transzkripciós komplex a Max fehérjével heterodimer formában gének promóter régiójában vagy első intronjában található ún. E-boxokhoz kötve aktiválja gének kifejeződését. A heterodimer N-terminális régiója számos fehérjével kölcsönhatásba lép: ilyen például a TRRAP, ami a GCN5 hiszton acetilázt toborozza az aktív transzkripciós komplexhez. Ilyenkor köt a DNS-hez a TBP vagy a TFIIE fehérje, amik az aktív transzkripciós gépezet tagjai. A Mad-Max komplex viszont gátolja az E-box által szabályozott génátírást, mert hiszton deacetilázokat toboroz és zárt kromatinstruktúrát hoz létre, ami megakadályozza a transzkripciós faktorok DNShez kötését (Orian és mtsai. 2003; Dang és mtsai. 2006). A Myc szintje nagymértékben megnő mitogén stimulusok, pl. növekedési faktorok
hatására,
és
osztódásban,
sejtnövekedésben
szerepet
játszó
gének
transzkripcióját aktiválja. A Myc mutáns legyek kisebbek a vadtípusú legyekhez képest, és méretüket tekintve hasonlítanak a Minute mutáns legyekre, melyekben riboszómális alegységet kódoló gének dózisának csökkenése miatt csökkent mértékű a transzláció. A legyek azért kisebbek, mert a sejtek kisebbek, ami arra utal, hogy a Myc-nek központi szerepe van a sejtek és így az élőlény megfelelő méretének szabályozásában (Schmidt 1999; Bellosta és Gallant 2010). Rengeteg tumoros betegség (prosztatarák (Sato és mtsai. 1999; Kaltz-Wittmer és mtsai. 2000), gyomorrák (Shibuya és mtsai. 1985; Hara és mtsai. 1998), melanoma (Chana és mtsai. 2001; Kraehn és mtsai. 2001), vastagbélrák (Smith és mtsai. 1993; Augenlicht és mtsai. 1997), mellrák (Kreipe és mtsai. 1993; Xu és mtsai. 2010) stb.; lásd 1. táblázat) esetén kimutatták, hogy kialakulásuk kapcsolatba hozható a Myc onkogénnel. Az túlzott Myc expresszió által kiváltott tumoros betegségek adatbázisa online elérhető: myccancergene.org (1. táblázat) (Zeller és mtsai. 2003). A Mycasszociált tumorok által okozott regisztrált halálesetek száma huszadik század közepe óta folyamatosan növekszik (5. ábra). Mindenképpen szükséges tehát a Myc „biológiájának” és tumoros transzformációt előidéző működésének minél részletesebb megértése a jövőbeni preventív és gyógyító terápiák kidolgozása céljából.
19 |
1. táblázat Túlzott mértékű Myc expresszió különböző tumor típusokban (forrás: http://myccancergene.org)
Vizsgált esetek száma
Túlzott mértékű Myc expresszió előfordulása (%)
melanóma
399
68,3
vastagbél
653
57,3
petefészek
277
39,0
neuroblasztóma
721
38,0
húgyhólyag
286
34,3
prosztata
858
32,5
gyomor
578
29,6
mell
4150
29,1
mielóma
993
20,7
Tumor típus
5. ábra Öt gyakori tumortípus által okozott regisztrált halálesetek száma az 1950es évektől napjainkig. A folyamatos vonal a regisztrált halálesetek számának változását jelöli évről-évre. A szaggatott vonal a halálesetek számának változási trendjét 20 |
jelöli. A regisztrált esetek nőkre vonatkoznak mindenféle korosztályból. Forrás: WHO Cancer Mortality Database; http://www-dep.iarc.fr/WHOdb/WHOdb.htm.
Tumorok
igen
nagy részében
szabályozatlan,
megemelkedett
a
Myc
transzkripciós faktor expressziója. Ezt okozhatja a gén amplifikációja, különböző kromoszómális átrendeződések, a 3’ nem transzlálódó régió deléciója, vagy retrovirális inszerció. Mivel a Myc egy transzkripciós faktor, és a gének promóter régiójában található konzervált CACGTG szekvenciákhoz, az ún. E-boxokhoz kötve szabályozza a transzkripciót, ezért kézenfekvő annak vizsgálata, hogy milyen gének promótereiben találhatóak E-boxok. A Myc célgének ismeretében információkat nyerhetünk arról, hogy milyen biológiai folyamatokat szabályoz a Myc transzkripcionálisan. Számos tanulmány létezik normális működésű vagy éppen tumoros sejtvonalak esetében arról, hogy
a
Myc
milyen
gének
expresszióját
kontrollálja
bennük.
Különböző
megközelítésekkel, módszerekkel vizsgálták a genomban a Myc szabályozása alatt álló géneket (pl.: SAGE, ChIP, Myc gátlás/overexpresszió utáni microarray analízis). Azt találták, hogy a Drosophila-tól az emlősökig az összes gén nagyjából 15%-a Myc reszponzív. A Myc-reszponzív gének között a legkülönbözőbb funkcióval rendelkezőek találhatóak meg, és a sejtciklus szabályozásában, metabolizmusban, riboszóma biogenezisben, fehérje szintézisben, mitokondriális funkciókban szerepet játszók vannak túlnyomó többségben (Li és mtsai. 2003; O'Connell és mtsai. 2003; Schmidt 2004; Hulf és mtsai. 2005; Dang és mtsai. 2006). A metabolizmusban szerepet játszó gének funkciója kiemelt jelentőséggel bír a tumorsejtek működésében. A tumorsejtek oxigénhiányos (hypoxiás) környezetben aerob glikolízis révén jutnak energiához, és a tumoros sejtekre jellemző gyakori sejtosztódásokhoz
szükséges
szintetikus
folyamatok
során
felhasználható
építőkövekhez. A tumorsejtekben megfigyelhető magas szintű glikolízist és az azt követő citoszolikus tejsavas fermentáció dominanciáját leírójuk után Warburgeffektusnak nevezzük (Warburg 1956). A HIF-1 transzkripciós faktor hypoxia esetén glikolitikus enzimek kifejeződését aktiválja. Érdekes, hogy a HIF-1 E-box szerű szekvenciákhoz köt, illetve a Myc is képes a HIF-1 célgénjeinek aktiválására (Doe és mtsai. 2012). De vajon melyek azok a gének, amelyek a szabályozatlan Myc expresszió kialakulásakor a tumoros transzformáció irányába terelik a sejteket? A kérdés megválaszolása igen nehéz, hiszen ismert, hogy tumoros transzformáció esetén több 21 |
egymás hatását segítő esemény vezet az elváltozáshoz. Nehéz kiemelni egy-egy ilyen gént, aminek központi szerepe lehet a tumorok kialakulásában. Az onkogén Myc esetében is ugyanez a helyzet, hiszen rengeteg gén transzkripcióját szabályozza. Nemrégiben kimutatták, hogy tumorsejtekben a megnövekedett Myc expresszió következtében csak az eleve aktívan átíródó génekről képződő mRNS-ek szintje emelkedik meg. Tehát nem arról lehet szó, hogy a tumoros transzformációt elindító, a fiziológiástól eltérő genetikai program kapcsol be. A Myc az általa szabályozott aktívan átíródó gének promóter régióiban dúsul fel szabályozatlan expresszió esetén, és ez okozza az RNS polimeráz II fokozott pTEF-b általi foszforilációját, ami a megemelkedett transzkripciós aktivitáshoz vezet (Lin és mtsai. 2012; Littlewood és mtsai. 2012; Nie és mtsai. 2012). Tumorsejtek esetén azt is megfigyelték, hogy függnek a transzformációt előidéző gén hibás működésétől (az onkogéntől), amit onkogén-addikciónak neveztek el. A tumoros állapot fenntartásában az onkogén-addikción kívül fontos szerepe van a tumor szuppresszor gének folyamatos gátlásának is, amit tumor szuppresszor hiperszenzitivitásnak nevezünk. Az onkogén hatása az onkogén gátlásával általában megszűnik és a sejtek apoptotikus útra kerülhetnek, tehát függnek az onkogén működésétől. A Myc transzkripciós faktor gátlása - mint lehetséges tumor terápiás célpont - nehezen kivitelezhető, mivel nincs könnyen célba vehető aktív centruma. Ismert az is, hogy a Myc nélkülözhetetlen a normális (nem rákos) sejtek működéséhez, növekedéséhez. Megfigyelték azonban, hogy nem onkogén funkciójú, tehát normálisan működő gének is bizonyos esetekben nélkülözhetetlenek a tumorsejtek növekedéséhez, túléléséhez. Ezen gének nem halmoznak onkogén mutációkat, és kontroll sejtekben funkciójuk nem létfontosságú, mégis elengedhetetlen szerepük van a bizonyos onkogének által létrehozott fenotípus fenntartásában. Ezt a jelenséget hívjuk nemonkogén-addikciónak (Luo és mtsai. 2009). Ennek hátterében az állhat, hogy a tumorsejtek sokkal nagyobb mértékben igénylik az adott gén funkcióját működésükhöz, mint a normális sejtek. A tumorsejtek nem-onkogén-addikciójának felismerése ígéretes célpontja lehet tumorterápiáknak, melyek során a nem-onkogén útvonal gátlásával a tumorsejtek osztódása megakadályozható.
22 |
2.6. Az autofágia modulációja ráksejtekben Az
autofágia
tumorszuppresszor
és
tumorsejtek
túlélését
is
biztosító
ellentmondásos tulajdonságai ellenére ígéretes célpont rákellenes terápiák során. Megfigyelték, hogy kemoterápia vagy sugárterápia esetén a pusztuló ráksejtekben nagymértékben megnövekszik az autofágia (Shen és mtsai. 2012). Az apoptózisra képtelen tumorsejtekben az autofágia hiperaktiválása ígéretes célpontja lehet a különféle terápiákkal szembeni tumorsejt rezisztencia elleni küzdelemben. Ezzel ellentétben ismert, hogy az autofágia szerepet játszhat a tumorprogresszióban és a tumorsejtek túlélésében is, hiszen eltávolítja a felesleges, működésképtelen organellumokat és a lebontás által hasznos metabolitokkal „tölti fel” a sejtet. (Rosenfeldt és Ryan 2011). Az autofágia aktiválásának vagy gátlásának lehetősége új távlatokat nyithat a rákterápiás kezelések kidolgozásában. A 2. táblázat néhány példát mutat a rákterápia során alkalmazható, az autofágiát moduláló lehetséges kezelésekről. Jól látható, hogy a különböző ágensek különféle molekuláris célpontok ellen irányulnak, melyek központi szereppel rendelkeznek az autofágia szabályozásában. Azonban ezen eredmények részben tumorsejtvonalakon folytatott kísérletekre alapulnak, ezért mindenképpen szükségesek további in vivo vizsgálatok is. A choloroquine egy lizoszomotropikus ágens, mely az autofágia késői lépését, a lizoszómális lebontást gátolja. A kemoterápiás kezelések hatékonyságának növelésére használt chloroquine kombinatorikus alkalmazása egyéb standard tumorkezelésekkel nagymértékben hozzájárulhat a kezelések hatékonyságának növeléséhez (3. táblázat) (Li és mtsai. 2013).
23 |
2. táblázat Néhány reprezantatív példa a ráksejtekben autofágiát moduláló ágensekről. Mind az autofágia gátlásának, mind az autofágia indukciójának lehet túlélést vagy pusztulást segítő funkciója. Ez feltehetően az adott sejttípustól függ. Ágens
Célpont
Osztály
Tumortípus
A kezelés hatása a sejtre nézve
Rapamycin
mTORC1
mTORC1 inhibitor
Malignus glióma
pusztulást segítő
Everolimus
mTORC1
mTORC1 inhibitor
Prosztata rák
pusztulást segítő
Perifosine
Akt
Akt inhibitor
Triciribine
Akt
Akt inhibitor
Metformin
AMPK
AMPK aktivátor
Melanóma
pusztulást segítő
Bortezomib
Proteaszóma
Proteaszóma inhibitor
Prosztata rák
túlélést segítő
PI3K
PI3K inhibitor
Vastagbélrák
túlélést segítő
Glioblasztóma
túlélést segítő
Mellrák
túlélést segítő
Referencia
Autofágiát indukál
Krónikus mielogén leukémia Akut limfoblasztikus leukémia
túlélést segítő túlélést segítő
(Takeuchi és mtsai. 2005) (Cao és mtsai. 2006) (Tong és mtsai. 2012) (Evangelisti és mtsai. 2011) (Tomic és mtsai. 2011) (Zhu és mtsai. 2010)
Autofágiát gátol 3-metiladenin CQ, HCQ Bafilomycin A1
Lizoszóma Lizoszomotropikus ágens Vakuoláris ATPáz
Vakuoláris ATPáz inhibitor
(Liu és mtsai. 2011) (Liu és mtsai. 2011) (Amaravadi és mtsai. 2007)
24 |
3. táblázat Példák a klinikai tesztfázisban levő chloroquine hatását vizsgáló kezelésekre (http://clinicaltrials.gov)
Mellrák
Klinikai próba azonosító NCT01292408
Vastagbélrák
NCT01206530
Melanóma
NCT00962845
HCQ HCQ, capacitabine, oxaliplatin, bevacizumab HCQ
Mielóma
NCT00568880
HCQ, bortezomib
I/II
Prosztata rák Kissejtes tüdőrák
NCT01480154
HCQ, MK2206
I
NCT00969306
HCQ, A-CQ 100
I
Tumortípus
Drog
Klinikai fázis II II 0
25 |
3. Célkitűzések Autofág gének expressziójának vizsgálata microarray alapú technikával. Autofágiában szerepet játszó gének keresése in vivo genom szűréssel. A Myc funkcióvesztés hatásának vizsgálata az autofágia során. A Myc overexpresszió hatásának vizsgálata poliploid lárvális és diploid lárvális és adult szövetekben. Az autofágia, az UPR és az antioxidáns válasz jelentőségének vizsgálata a Myc overexpresszió indukálta sejtnövekedés során.
26 |
4. Eredmények 4.1. Génexpressziós változások vizsgálata az éheztetéssel indukált autofágia során A központi autofág gének expressziójának microarray alapú vizsgálata során 86±4 h AEL korú jól táplált- és éheztetett lárvák génexpresszióját hasonlítottam össze bioinformatikai módszerekkel (Erdi és mtsai. 2012). Azokat a géneket tekintettem szabályozottnak, melyek expressziószintje minimum kétszeres változást mutatott éheztetés hatására p<0,05 értékkel. A chipen reprezentált 13613 gén közül 1584 gén expressziója emelkedett meg és 1235 gén expressziója csökkent éheztetés hatására, tehát összesen 2819 gén (nagyjából a vizsgált gének 21%-a) expressziója változott meg éheztetés hatására. A 20 legmagasabb expressziószint növekedést mutató gén (1. melléklet) között van az IM10, ami egy antimikrobiális fehérje. Az inzulin növekedési jelátvitel gátolt éheztetés során, aminek következtében aktiválódik a Foxo transzkripciós faktor (Juhasz és mtsai. 2007). Az IM10 és hasonló immuneffektor molekulák transzkripcióját a Foxo szabályozza (Becker és mtsai. 2010). A CG7224 egy másik nagy expressziószint növekedést mutató gén, ami egy 118 aminosav méretű fehérjét kódol. Mivel éheztetés hatására 41-szeresére növekedett a génről átíródó mRNS-ek szintje, ezért Sirup-nak neveztük el (starvation-upregulated protein). Egy másik gén a Rack1 mRNS szintje éheztetés hatására 4,1-szeresére nőtt éheztetett, vad típusú lárvákban a microarray vizsgálatok alapján. Továbbá, a QT-PCR kísérletek alapján a Rack1 mRNS szint 21,6szeresére növekedett a lárvális zsírtestben éheztetés hatására. Az expressziós vizsgálatokat követően kimutattuk a Rack1 autofágiában betöltött lehetséges szerepét, aminek részletes leírása Érdi Balázs doktori munkájában szerepel (Erdi és mtsai. 2012). A 20 legnagyobb mértékű expressziószint csökkenést mutató gének (2. melléklet) közt található például az oxidoreduktázt kódoló CG15615 és a CG15155, ami acil csoport transzferáz aktivitással rendelkezik. Éheztetés hatására a sejtben megnő a tápanyagok szintjének csökkenésekor aktiválódó gének aktivitása (a gén ontológiai rendszerezés alapján a GO:0031667 csoportba tartozó gének), aktiválódik az autofágia (GO:0048102), és megnő a stresszhatásokra adott
védekezési reakcióban részt vevő gének kifejeződése 27 |
(GO:0006950,
GO:0006952).
(GO:0005975:
szénhidrát
Számos
metabolikus
metabolizmus;
folyamat
GO:0046040:
IMP
is
aktiválódik
metabolizmus;
GO:0005976: poliszacharid metabolizmus). Gén ontológiai analíziseim alapján az is elmondható, hogy éheztetés hatására a sejtben csökken a transzláció mértéke (GO:0006412), lecsökken a bioszintetikus folyamatok intenzitása (GO:0016053: szerves savak; GO:0006633: zsírsavak; GO:0009059: makromolekulák; GO:0006221: pirimidin nukleotidok; GO:0009108: koenzimek; GO:0051188: kofaktorok) és csökken az autofágia gátlásában szerepet játszó gének kifejeződése (GO:0010507). Az Atg génekről elmondható, hogy nagy részük megnövekedett expressziót mutat éheztetés hatására, tehát autofág indukciókor transzkripcionálisan szabályozódik a szintjük Drosophila sejtekben. Az Atg1 kináz komplex tagjai: a FIP200, az Atg1 és az Atg101 enyhe expressziószint növekedést mutatnak, közülük a FIP200 szintje növekszik meg a legnagyobb mértékben (6. ábra, A). Az Atg13 szintje nem változik éheztetés hatására. Ez összhangban van azzal a megfigyeléssel, miszerint az Atg13 folyamatosan lebomlik az ubiqutin-proteaszóma rendszer által. Az Atg13 autofágia indukció hatására az Atg101 fehérjéhez kötve stabilizálódik, tehát a fehérje szintje poszt-transzlációsan szabályozott (Hosokawa és mtsai. 2009; Mercer és mtsai. 2009). Az autofágiára specifikus lipid kináz komplex tagjait kódoló gének (Atg6, Atg14, Vps15, Vps34) expressziója csupán enyhe változást mutat éheztetés hatására (6. ábra, A). Érdekes hogy az EDTP - mely egy lipid foszfatázt kódol, ami antagonizálja a Vps34 aktivitását és így gátolja az autofág folyamatok végbemenetelét (Vergne és mtsai. 2009) - mutatta a legnagyobb expressziószint változást éheztetés hatására. Ez egy negatív visszacsatolásos szabályozási lépés létezésére utalhat, mely az autofágia hiperaktivációjának ellenében hat. A pre-autofagoszómális membrán reciklizáló komplex tagjai mutatták a legnagyobb expressziószint növekedést éheztetés hatására (6. ábra, A). Az Atg fehérjék között az Atg9 az egyetlen transzmembrán fehérje, ami vezikulákat szállít a PAS-hoz. Az Atg9 reciklizációja a PAS és a különböző membránforrások között az Atg2 és az Atg18 segítségével történik. Az ubiqutin-szerű konjugációs rendszerek tagjainak fele nem mutatott emelkedett expressziót, míg az Atg4a, az Atg7, az Atg8b és az Atg16 expressziója
28 |
enyhén megnövekedett éheztetés hatására. A legmagasabb expressziószint növekedést az Atg8a esetében tapasztaltuk az összes Atg gén közül (6. ábra, A). Az Atg8a szelektíven lebomlik az autofágia során. Az autofágiának további szubsztrátjai is léteznek: ilyen például a p62/Ref(2)P fehérje, ami ubiquitinált fehérjéket és Atg8a-t köt, így teszi lehetővé a fehérjeaggregátumok szelektív lebontását, mely során önmaga is lebomlik. Az éheztetés során mutatott expressziószint növekedés valószínűleg a lebontás által csökkenő p62 szintet kompenzálja. Egy másik autofág szubsztrát, a Blue cheese/Alfy esetében csak enyhe expressziószint növekedést tapasztaltunk. A teljes lárvákban megfigyelt génexpressziószint változásokat, melyeket microarray alapú technikával vizsgáltunk, szemikvantitatív real-time PCR (QT-PCR) vizsgálatokkal is meg akartuk erősíteni. A QT-PCR vizsgálatok során a microarray alapú vizsgálatokhoz hasonlóan 86±4 h AEL korú jól táplált- és éheztetett lárvákban vizsgáltuk gének szintjének változását, azzal a különbséggel, hogy a QT-PCR esetén a vizsgálatok csupán a lárvákból kipreparált zsírtest mintákon történt. A QT-PCR kísérlet megerősítette a microarray alapú vizsgálatok legfontosabb eredményeit. Az Atg1 kináz komplex valamint az autofágia specifikus lipid kináz komplex tagjai közül az EDTP mutatta a legnagyobb expressziószint növekedést (6. ábra, B). A microarray kísérlethez hasonlóan az Atg8a mutatta a legnagyobb mértékű indukciót éheztetés hatására. A pre-autofagoszómális membrán reciklizáló komplex tagjainak expressziója is nagymértékben megnőtt éheztetés hatására. Érdekes különbségek is adódtak a microarray és a QT-PCR kísérletek eredményei között. Az egyik például, hogy míg a microarray vizsgálat esetében az Atg5 nem mutatott szignifikáns expressziószint növekedést, addig a QT-PCR vizsgálat eredménye szerint szignifikánsan megnövekszik az Atg5 kifejeződése éheztetés hatására (6. ábra, B). A különbségek adódhatnak a különböző technikák alkalmazásából kifolyólag, de a teljes lárva vagy kipreparált zsírtest minták közötti biológiai különbségek is okozhatják az eltéréseket.
29 |
6. ábra A központi Atg gének expressziójának vizsgálata. A Microarray alapú vizsgálat során azt tapasztaltuk, hogy a központi Atg gének expressziója a legtöbb esetében megnő éheztetés hatására teljes lárvákban. B Szemikvantitatív real-time PCR vizsgálatokkal megerősítettük a gének expressziójának növekedését lárvális zsírtestmintákon. A fekete-fehér kiemelés az expresszió-szint növekedés mértékét jelzi (A), a piros kiemelés a statisztikailag nem szignifikáns eredményeket mutatja (A, B).
30 |
4.2. Autofág gének keresése in vivo teljes genom szűréssel Az in vivo genom szűrés (screen) során két hallgató társammal karöltve vizsgáltuk nagyjából 7100 konzervált gén funkcióvesztéses fenotípusát a lárvális zsírtest sejtjeiben genetikai mozaik állatokban. A genom szűrés során 84%-os gén megtalálási valószínűséggel dolgoztunk az inzulin/TOR/Atg útvonalban szereplő gének (pozitív kontroll csoport) vizsgálata alapján, kevesebb mint 2%-os fals pozitív ráta mellett, extracelluláris fehérjéket kódoló, feltehetően nem sejt-autonóm szerepű gének (negatív kontroll csoport) vizsgálata alapján.
7. ábra A genom szűrés folyamata Balra alul gátló, jobbra alul pedig serkentő fenotípusra látunk példát. Az elsődleges szűrés során a teszttörzsből (ez direkt „r4” promóter szabályozása alatt expresszálja az mCherry-Atg8a-at a zsírtest sejtekben, és rendelkezik a klonális analízis kivitelezéséhez szükséges genetikai elemekkel) származó szüzeket kereszteztük az RNS interferencia általi géncsendesítést előidéző, transzgénikus hímekkel (7. ábra). Éheztetés hatására vizsgáltuk az mCherry-Atg8a jeleket a GFP-vel jelölt RNS interferencia klónokban a környező kontroll sejtekhez hasonlítva. Kétféle kategóriába osztottuk
a
kontroll
sejtektől
eltérő
mCherry-Atg8a
fenotípust
kialakító
funkcióvesztéses fenotípusokat: 1. kevesebb, kisebb méretű mCherry-Atg8a pötty; 2. 31 |
több, nagyobb mCherry-Atg8a pötty. Az egyes csoportba olyan gének kerültek, melyeknek valószínűsíthetően az autofág struktúrák kialakításában van szerepük (7. ábra, Atg6 RNSi). A második csoportban megtalálható gének hiányában felhalmozódott az mCherry-Atg8a az RNS interferencia klónokban, ami arra utalhat, hogy ezek a gének az autofágia gátlásában játszanak szerepet (7. ábra, Raptor RNSi). A genom szűrés során az elsődleges riporter teszttel (7. ábra) azonosított több mint ezer gén vizsgálatát másodlagos tesztekkel folytattuk. A csak mCherry-vel jelölt Atg8a riporter csupán arról ad információt, hogy a sejtekben kialakulnak-e autofág struktúrák. Ezek azonban lehetnek autofagoszómák vagy autolizoszómák is. Ugyan a kialakult struktúrák között viszonylag jól szelektálhatunk azok mérete és intenzitása alapján (kisebb, halványabb: autofagoszóma; nagyobb, fényesebb: autolizoszóma), azonban további vizsgálatokra van szükség a pontos identitás meghatározásához. Az autofág flux vizsgálatára alkalmaztunk egy tandem fluoreszcensen jelölt, mCherryGFP-Atg8a teszttörzset. Az autolizoszómák savas beltartalmában a GFP gyorsan inaktiválódik. Így tehát, ha kialakulnak emésztő autolizoszómák a sejtben, akkor csak az mCherry jelet látjuk. Hibás flux esetén, ha csak autofagoszómák alakulnak ki vagy az autolizoszómák nem emésztenek megfelelően, a GFP nem inaktiválódik, ilyenkor sárga jeleket lehet látni a sejtben (8. ábra, E, H). Ezen kívül a savas autolizoszómák jelenlétét az eddigi riporter alapú tesztektől eltérően vitális festéssel is vizsgáltuk. A Lysotracker Red festék a savas beltartalmú, emésztő autolizoszómákat festi a sejtben (Klionsky és mtsai. 2012) (8. ábra, C, F, I).
32 |
8. ábra A genom szűrés találatainak csoportosítása. A-C Az Atg-szerű csoportba sorolt gének hiányában nem alakulnak ki mCherry és/vagy GFP-Atg8a pozitív valamint Lysotracker Red-del jelölődő pöttyök. D-F Az autofagoszóma csoportba sorolt gének hiányában kisméretű mCherry- és GFP-Atg8a pozitív autofagoszómák alakulnak ki, de nem képződnek Lysotracker-re pozitív, savas, emésztő autolizoszómák. G-I Az autolizoszóma csoportba sorolt gének hiányában nagyméretű mCherry és GFP Atg8a pozitív autolizoszómák alaklunak ki, melyek gyengébben jelölődnek Lysotracker festékkel. A piros nyílhegyek autolizoszómákat, a fehér nyílhegyek autofagoszómákat, a sárga nyílhegyek a nem emésztő autolizoszómákat jelölik. Skála (A panelen): 20 µm.
Olyan gének szűrésére koncentráltunk elsősorban, amik szükségesek az autofágiához és különböző csoportokba osztottuk a kandidáns géneket. Három különböző csoportot hoztunk létre. Az első csoportba (Atg-szerű csoport; 8. ábra, A, B, C) olyan RNSi vonalak kerültek (78 gén), melyek szükségesek voltak az Atg8a preautofagoszómális jelenlétéhez. Ezekben a sejtekben nem láthatunk egyik riporterrel sem jelet. Ilyenek például a központi autofág gének, amelyek többségét vakon, azaz a transzformáns számhoz tartozó gén ismerete nélkül is sikerült azonosítani a szűrés során. A második csoportba (autofagoszóma csoport; 8. ábra, D, E, F) olyan géneket osztottunk (47 gén), melyek hiányában a kialakult autofagoszómák feltehetően nem képesek lizoszómákkal fúzionálni. Ezekben a sejtekben sárga apró mCherry-GFP-Atg8a (mCherry és GFP dupla pozitív) jelet láthatunk. Ezen kívül nincs Lysotracker Red pozitív struktúra a sejtben, ami arra utal, hogy az autofagoszómák kialakulnak, de nem képesek lizoszómákkal fúzionálni és savas autolizoszómákat létrehozni. Ebbe a csoportba tartoznak például a C-típusú Vps (Vacuolar protein sorting) komplex tagjai, melyek egyike a Vps16a (közlésre elküldve). Azt találtuk továbbá, hogy a Syntaxin 17, az Ubisnap (SNAP-29) és a VAMP7 által alkotott SNARE fehérjekomplex is szükséges az autofagoszómák és lizoszómák fúziójához. Kimutattuk továbbá, hogy a Syntaxin 17 által mediált fúzió és az azt követő lizoszómális lebontás szükséges az idegsejtek normális működéséhez (Takats és mtsai. 2013). Ezek a kísérletek Takáts Szabolcs doktori disszertációjában lesznek bemutatva. A harmadik csoportba (autolizoszóma csoport; 8. ábra, G, H, I) olyan gének kerültek (88 gén), amik hiányában sérült az autolizoszómális lebontás. Ezekben a sejtekben nagyméretű sárga mCherry-GFP-Atg8a (mCherry és GFP dupla pozitív) jelet láthatunk. A struktúrák gyakran legalábbis halványan jelölődnek Lysotracker Red festékkel, az autolizoszómák hibás savasodása, vagy egyéb mechanizmusok hibája miatt. Ide tartoznak a lizoszómák savasodásáért felelős Vha gének (Vacuolar H+ ATPase), mint a Vha16-1. A géntermékeik által 33 |
alkotott proton pumpa hozza létre a lizoszómális hidrolázok működéséhez szükséges savas környezetet. Ebbe a csoportba osztottuk az ubiquitin-proteaszóma rendszer működésében szerepet játszó géneket is. A proteaszóma RNS interferencia sejtekben tapasztalt fenotípusok részletes vizsgálata során azonban kiderült, hogy itt nem az autofág lebontás hibájáról van szó, hanem a nagymértékben felhalmozódó p62 aggregátumokhoz kötődnek az overexpresszált Atg8a riporter molekulák, hasonlóan a p62 és Atg8a riporterek együttes túltermeltetéséhez (Pircs és mtsai. 2012). Kimutattuk ugyanis, hogy a ubiquitin-proteaszóma rendszer hibás működése a sejtekben hiperautofág fenotípust hoz létre (Low és mtsai. 2013). Ezek a kísérletek munkatársaim, Pircs Karolina és Varga Ágnes doktori disszertációiban kerülnek részletes bemutatásra.
34 |
4.3. A Myc szükséges a bazális és az éheztetéssel indukált autofágiához A genom RNS interferencia szűrés egyik pozitív találata a Myc gén volt. A Myc homozigóta null mutáns lárvák az első lárvastádium során elpusztulnak. Zsírtestükben az éheztetés hatására jóval kevesebb Lysotracker Red pozitív autolizoszóma alakul ki (9. ábra, A-C). Ultrastruktúrális vizsgálatok során kimutattuk, hogy a Myc mutáns lárvák középbelében nem találhatóak autofagoszómák és autolizoszómák (9. ábra, D, E) (Nagy és mtsai. 2013).
9. ábra A Myc mutánsban sérült az autofágia. A Éheztetés hatására Lysotracker pozitív autolizoszómák alakulnak ki az L1 stádiumú kontroll lárvák zsírtestében. B A Myc homozigóta L1 stádiumú lárva zsírtestében kevesebb Lysotracker pozitív autolizoszóma alakul ki éheztetés hatására. C A kísérletek kiértékelése (A-B). D Számos kettős membránnal határolt autofagoszóma (ap) és denz autolizoszóma (al) található kontroll állatok bélsejtjében. E A Myc mutáns lárva bélsejtjében nem láthatók sem autofagoszómák, sem autolizoszómák. Az A, B panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála (A, B paneleken): 20 µm.
A Myc RNS interferencia klónokban, melyek méretüket tekintve jelentősen kisebbek, mint az őket körülvevő kontroll sejtek, gyakorlatilag nem alakulnak ki éheztetés
hatására
savas
autolizoszómák,
sem
az
anti-Atg8a-val
jelölhető
autofagoszómák (10. ábra, A, C, D, F). A Myc RNS interferencia klónokban felhalmozódik az autofág szubsztrát p62 nagyméretű fehérjeaggregátumok formájában, ami a bazális autofágia hibájára utal (10. ábra, G, I, J) (Pircs és mtsai. 2012). A Mad 35 |
kompetitíven köt a Myc transzkripciót aktiváló kölcsöható partneréhez (Max), és inaktív transzkripciós komplexet (Mad-Max) alakít ki, így gátolva az E-box szabályozása alatt álló gének átírását. Vagyis a Mad overexpresszió gátolja a Myc által szabályozott génkifejeződést (Lymboussaki és mtsai. 1996; Foley és mtsai. 1998). Mad-et overexpresszáló sejtklónokban éheztetés hatására szinte nem alakulnak ki savas autolizoszómák és nincsenek anti-Atg8a pozitív autofág struktúrák (10. ábra, B, C, E, F). Mad overexpresszió hatására a p62 fehérje felhalmozódik jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtest sejtjeiben (10. ábra, H, I, J). A Myc funkcióvesztés és a Mad overexpresszió által létrehozott fenotípus alapján levonható a következtetés, hogy a Myc
transzkripciós
programja
szükséges
az
autofág
folyamatok
normális
végbemeneteléhez.
10. ábra A Myc „program” szükséges a bazális és az éheztetéssel-indukált autofágiához. A A Myc csendesítése gátolja a Lysotracker pozitív autolizoszómák kialakulását a Lamp1-GFP-vel jelölt zsírtest klónokban összehasonlítva a környező kontroll sejtekkel. B A Mad overexpressziója gátolja a Lysotracker festődést a Lamp1GFP pozitív klónsejtekben. C Az A és B paneleken látható kísérletek kiértékelése. D A Myc csendesítése a Lamp1-GFP klónokban gátolja az anti-Atg8a pozitív struktúrák kialakulását. E A Mad overexpressziójának hatására nem alakulnak ki anti-Atg8a 36 |
struktúrák a Lamp1-GFP pozitív klónsejtekben. F A D és E paneleken látható kísérletek kiértékelése. G Lamp1-GFP pozitív klónsejtekben a Myc csendesítésének hatására felhalmozódik a p62. H Mad-et overexpresszáló Lamp1-GFP klónsejtekben felhalmozódott a p62. I, J A G és H paneleken látható kísérletek kiértékelése. A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A klónsejtek határait zöld vonallal jelöltem. A, B, D, E Éheztetett harmadik stádiumú lárvákból készített fotók. G, H Jól táplált, harmadik stádiumú lárvákból készített fotók. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.05). Skála: 20 µm.
4.4. A Myc overexpresszió megnöveli a sejtek méretét és autofágiát indukál A Myc klonális overexpressziójának hatására a zsírtest sejtek majdnem kétszeres méretűre nőttek az őket körülvevő kontroll sejtekhez képest (11. ábra, A). Jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtest sejtjeiben (melyekben fiziológiásan nem figyelhető meg magas szintű autofágia) a Myc overexpresszió autofágiát indukál: megemeli a Lysotracker Red pozitív autolizoszómák számát, továbbá az mCherry-Atg8a pozitív és az anti-Atg8a-val jelölhető autofág struktúrák jelenlétét (11. ábra, B-E). Western blot vizsgálattal kimutattuk, hogy a Myc-et overexpresszáló lárvák zsírtest sejtjeiben megemelkedik az autofagoszóma-asszociált, lipidált Atg8a (Atg8a-II) szintje (11. ábra, F), ami további egyértelmű bizonyítéka, hogy a Myc overexpresszió autofágiát indukál. Ultrastruktúrális vizsgálatokkal igazoltuk a Myc-et overexpresszáló, jól táplált zsírtest sejtekben autofagoszómák és autolizoszómák képződését (11. ábra, G; nagyobb méretű képek: lásd 3. melléklet). A diploid imaginális szárnydiszkusz patched doménjében Myc-et overexpresszáló sejtekben is nagymértékben megnő az autofágia szintje. A domén mérete is nagyobb a kontroll patched domén méretéhez képest, ami a sejtek túlnövekedésére utal (11. ábra, H, I).
37 |
11. ábra A Myc overexpresszió megnöveli a sejtek méretét és autofágiát indukál. A A Myc-et overexpresszáló GFP pozitív sejtklónok nagyobbra nőnek, mint az őket körülvevő kontroll sejtek. B-D Jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtest sejtjeiben Myc overexpresszió hatására megemelkedik a Lysotracker (B), az mCherry-Atg8a (C) és az anti-Atg8a (D) pozitív struktúrák száma. E A B, C és D paneleken bemutatott kísérletek kiértékelése. F A Myc zsírtest specifikus expressziójakor (2. és 3. kromoszómáról egyaránt) megnövekszik a zsírtest sejtekben az aktivált Atg8a-II szintje a tubulinhoz képest a kontrollra normalizálva. A kontroll esetben az Atg8a-II/Tubulin arányt 1-nek vettük. G A Myc zsírtest-specifikus expressziójakor jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtestében rengeteg tipikus autofagoszóma (ap) és autolizoszóma (al) jelenik meg. H, I A diploid imaginális discusok patched doménjében overexpresszált 38 |
Myc megnöveli az mCherry-Atg8a pozitív struktúrák számát, valamint a domén méretét egyaránt (I) a kontroll discusokhoz hasonlítva (H). A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A klónsejtek határait zöld vonallal jelöltem. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal jelöltem (** p˂0.01). Skála (A, B, C, D, H, I paneleken): 20 µm.
4.5. A Myc overexpresszió megnöveli az autofág lebontás mértékét A fentebb (11. ábra) bemutatott mikroszkópos autofágia vizsgálatokat - melyek szerint a Myc overexpresszió aktiválja az autofágiát - mindenképpen indokolt további kísérletekkel is igazolni. Ugyanis a fentebb alkalmazott módszerek arról nyújtanak információt, hogy a sejtekben megnövekedett számban találhatóak autofág struktúrák. Az autofágia vizsgálata során nagyon fontos a lebontás mértékének vizsgálata is, ami a folyamat normális végbemenetelére utal. Ennek eldöntésére kétféle módszer létezik: egyrészt meg kell vizsgálni a már korábban (8. ábra) bemutatott, tandem fluoreszcensen jelölt úgynevezett flux riporterrel a kialakuló pöttyök pixel intenzitás eloszlását. A flux riporter tehát megmutatja, hogy a sejtben kialakulnak-e vagy sem az emésztő autolizoszómák. Az autofágia aktiválásának eldöntésére alkalmazott konvencionális vizsgálati módszer a bafilomycin A1-gyel vagy chloroquine-nel történő kezelés. Ezek hatására vizsgálható az Atg8a lipidáció vagy a fluoreszcensen jelölt Atg8a pöttyök felhalmozódása (Mizushima és mtsai. 2010). A bafilomycin feltételezések szerint valamiképpen gátolja az autofagoszómák és lizoszómák fúzióját. A chloroquine a lebontásban szerepet játszó emésztőenzimek működéséhez szükséges savas pH-t neutralizálja, mivel felhalmozódik a lizoszómákban. Bafilomycin vagy chloroquine kezelés hatására tehát a lipidált Atg8a vagy éppen a fluoreszcensen jelölt Atg8a felhalmozódik a sejtekben. Ha a kérdéses génhiány vagy overexpresszió esetén is elvégezzük a bafilomycin kezelést, és a kontroll sejtek bafilomycin kezeléshez képest nagyobb mértékű Atg8a felhalmozódást tapasztalunk, akkor az megbízhatóan jelzi, hogy az autofágia aktiválódott. Jól táplált kontroll lárvák zsírtest klónsejtjeiben csak ritkán találhatóak mCherry és GFP dupla pozitív Atg8a pöttyök (12. ábra, A, E), melyek a bazális autofágia során kialakuló autofagoszómákat jelölik. A pixel intenzitás eloszlás a riporter háttér jelölését mutatja be, hiszen jelen esetben nem alakulnak ki pöttyök. A korrelációs koefficiens ebben az esetben magas a diffúz háttérjelölődés miatt (12. ábra, A’). Ha kontroll jól
39 |
táplált lárvákat chloroquine-t tartalmazó tápon tartjuk, akkor a zsírtest sejtekben mCherry és GFP dupla pozitív Atg8a pöttyök kialakulását figyelhetjük meg (12. ábra, B, E). Ezek a bazális autofágia folyamán létrejövő, de a drogkezelés miatt nem emésztő autolizoszómákat jelölik. A pixel intenzitás eloszlás korrelációja persze ebben az esetben alig változik (12. ábra, B’). Myc-et overexpresszáló, jól táplált lárvák zsírtest sejtjeiben a kontroll lárvákhoz képest (12. ábra, A) nagymértékű mCherry pozitív Atg8a pötty felhalmozódást tapasztaltunk (12. ábra, C, E). Mivel ezek a pöttyök csak mCherry pozitívak, ezért a pixel intenzitás eloszlás korreláció ennek megfelelően nagymértékben lecsökken (12. ábra, C’). Ezzel szemben a jól táplált, harmadik stádiumú, chloroquinenel kezelt, Myc-et overexpresszáló klónsejtek mérete a kontroll sejtekéhez hasonló méretű volt és bennük a kontroll kezelt, és a nem kezelt de Myc-et overexpresszáló lárvákhoz képest is nagyobb mértékű volt az mCherry és GFP dupla pozitív Atg8a pöttyök felhalmozódása (12. ábra, D, E). A pixel intenzitás korreláció ennek megfelelően ismét magas értéket mutatott (12. ábra, D’). A Myc overexpresszió autofágiát aktiváló hatását Western blot alapú fehérje kimutatással is igazoltuk. Az mCherry-GFP-Atg8a riporter az autofágia folyamata során minden egyes lebontási ciklusban bekerül a savas autolizoszómákba, ahol az mCherry és a GFP lehasítódik az Atg8a-ról. Az ilyenkor keletkező szabad mCherry vagy GFP kimutatásával megbízhatóan vizsgálható az autofág lebontás mértéke. Ez fontos információt nyújt a folyamat megfelelő végbemeneteléről és annak intenzitásáról. A Myc overexpresszió a kontroll lárvákhoz hasonlítva jelentősen megnövelte a szabad mCherry szintjét jól táplált lárvák zsírtestében: a 2. kromószómáról expresszáló Myc 18,4-szeresére, míg a 3. kromoszómáról expresszáló Myc 8,4-szeresére növelte a szabad mCherry szintjét a kontrollhoz hasonlítva (12. ábra, F). A fent bemutatott eredmények ergyértelműen bizonyítják, hogy a Myc overexpresszió aktiválja az autofágiát és nagymértékben megnöveli a lebontás mértékét.
40 |
12. ábra A Myc overexpresszió által indukált autofágia során megnövekszik a lebontás mértéke. A Jól táplált lárvák zsírtest klónsejtjeiben csak ritkán láthatóak mCherry pozitív autofág struktúrák. B Chloroquine kezelés hatására mCherry és GFP dupla pozitív autofág struktúrák halmozódnak fel jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtest klónsejtjeiben. C Myc overexpresszió hatására mCherry pozitív, GFP negatív autofág struktúrák halmozódnak fel jól táplált harmadik strádiumú lárvák zsírtest 41 |
sejtjeiben. D Chloroquine kezelés hatására mCherry és GFP pozitív struktúrák halmozódnak fel a Myc-et overexpresszáló sejtekben. E Az A-D paneleken bemutatott kísérletek kvantifikálása. F A Myc overexpresszió hatására a kontroll lárvákhoz hasonlítva megnövekszik a szabad mCherry szintje a zsírtest sejtekben. A kontroll esetben a szabad mCherry/Tubulin arányt 1-nek vettük. A’-D’ Az A-D paneleken bemutatott képek pixel intenzitás eloszlását és korrelációját (Pearson korrelációs koefficiens) bemutató dot-plotok láthatóak. A megfelelő panelek zöld (GFP) és piros (mCherry) csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála (A, B, C, D paneleken): 20 µm.
4.6. Az autofágia szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez A Myc overexpresszió hatására megnövekedett autofág aktivitást látva meg akartuk vizsgálni, hogy vajon a folyamat szükséges-e a a sejtek Myc-indukálta túlnövekedéséhez. Myc-et overexpresszáló lárvák zsírtest klónjainak nagymértékű növekedését teljes mértékben gátolta a chloroquine kezelés (13. ábra, A, K). A chloroquine kezelés a két kópia Myc-et expresszáló klónok túlnövekedését is sikeresen gátolta (13. ábra, N, O). FIP200 null mutáns lárva Myc-et overexpresszáló zsírtest sejtjei is a környező kontroll sejtekhez hasonló mértékben növekedtek (13. ábra, B, K). Ezek után további RNS interferencia általi géncsendesítés vagy domináns negatív allélek overexpressziója által okozott funkcióvesztés sejtméret fenotípusát vizsgáltuk: FIP200 (13. ábra, C), Atg1 (13. ábra, D), Atg9 (13. ábra, F), Atg18a (13. ábra, G) RNS interferencia, és domináns negatív Atg1 (13. ábra, E) vagy Vps34 (13. ábra, H) kooverexpressziójának hatására a Myc-et overexpresszáló zsírtest sejtek nem nőttek nagyobb mértékben, mint az őket körülvevő kontroll sejtek (13. ábra, K). Nem meglepő módon ehhez hasonló hatást tapasztaltunk Myc RNS interferencia (13. ábra, I) vagy Mad overexpresszió (13. ábra, J) eredményeképpen is (13. ábra, K). Az autofágia gátlása FIP200, Atg1, Atg9, Atg18a RNSi vagy Vps34 domináns-negatív allél felhasználásával önmagában nem befolyásolja a zsírtest sejtek méretét (13. ábra, L). A Myc RNSi és a Mad overexpresszió csökkentik a zsírtest sejtek méretét, hiszen a Myc szükséges a sejtek normális növekedéséhez.
42 |
13. ábra Az autofágia szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a zsírtestben. A Chloroquine kezeléssel gátolható a Myc-indukált sejt túlnövekedés. B FIP200 mutáns háttéren nem nőtték túl a kontroll sejteket a Myc-et overexpresszáló sejtek. Az autofágia gátlását előidéző FIP200 (C), Atg1 (D), Atg9 (F) és Atg18a (G) RNSi vagy Atg1 (E) és Vps34 (H) domináns negatív allélek hatására a Myc overexpresszáló sejtek a kontroll sejtekhez hasonló mértékben növekedtek. I, J A Myc RNSi (I) illetve a Mad overexpresszió (J) és Myc overexpresszió eredményeként a sejtek normális mértékben növekedtek. K Az A-J paneleken bemutatott sejtnövekedést vizsgáló kísérletek kiértékelése. L A FIP200, az Atg1, az Atg9 és az Atg18a RNSi, valamint a domináns negatív Vps34 allél önmagában nincs hatással a sejtek növekedésére. Az Atg1 domináns negatív allél, a Myc RNSi és a Mad overexpresszió hatására csökken a sejtek mérete. A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
43 |
A Myc-et overexpresszáló diploid szárnydiszkuszok patched doménje a méretét (14. ábra, E) és az autofágia szintjét (14. ábra, F) tekintve a kontroll állatokéhoz (11. ábra, H; 14. ábra, E, F) volt hasonló, ha az autofágiát gátoltuk Myc-et overexpresszáló sejtekben Atg1 (14. ábra, A), FIP200 (14. ábra, B) és Atg18a (14. ábra, C) RNS interferencia vagy domináns negatív Vps34 allél (14. ábra, D) ko-overexpressziója által. A legyek szárnyában található hármas (L3) és négyes (L4) véna közötti (14. ábra, G) távolság mérésével is vizsgálható a Myc overexpresszió sejtnövekedést serkentő hatása. A hármas és négyes véna közötti szárnyterületen az imaginális discusok patched doménjéből származó sejtek találhatóak (14. ábra, G). A Myc overexpresszió megnövelte az L3-L4 közötti távolságot a kontroll vénatávolsághoz viszonyítva (14. ábra, H). Az autofágia gátlása Atg1, FIP200, Atg18a RNS interferencia vagy domináns negatív Vps34 allél együttes overexpressziója által Myc overexpresszió esetén az L3-L4 távolságot a kontrollokban látott vénatávolsághoz hasonló méretűre csökkentette (14. ábra, H). Az Atg8a mutáns háttéren overexpresszált Myc nem növelte meg az L3-L4 távolságot, de az mCherry-Atg8a overexpressziója esetén (mutáns menekítő kísérlet) az L3-L4 távolság ismét megnövekedett (14. ábra, H). Az autofágia gátlása önmagában nem befolyásolja az L3-L4 véna távolságot (14. ábra, I).
44 |
14. ábra Az autofágia szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a szárnyban. Az Atg1 RNSi (A), a FIP200 RNSi (B) és az Atg18a RNSi (C) vagy a Vps34 domináns negatív (D) allél és a Myc overexpresszió együttesen a kontroll lárvák patched doménjeihez hasonló fenotípust idéztek elő az imaginális szárnydiszkuszban, mind a domén méretét (E), mind az abban található mCherry-Atg8a struktúrák számát (F) tekintve. G Az imaginális szárnydiszkuszok mCherry pozitív patched doménjeiben található sejtek megfelelnek a kifejlett egyed szárnyában található L3-L4 véna közötti sejteknek. H Az Atg1 RNSi, a FIP200 RNSi és az Atg18a RNSi valamint a domináns Vps34 allél és Myc overexpresszió együttes hatására az L3-L4 vénatávolság a kontroll méretéhez hasonlóra csökkent. Atg8a mutáns háttéren a Myc overexpresszió hatására nem növekedett meg az L3-L4 véna távolsága. Az mCherry-Atg8a ko-overexpressziója mellett azonban a Myc overexpresszió megnövelte az L3-L4 vénatávolságot Atg8a mutáns legyekben is. I Az Atg1 RNSi, a FIP200 RNSi és a domináns negatív Vps34 allél hatására önmagában nem változik meg az L3-L4 vénatávolság. Az Atg18a RNSi hatására kicsit megnőtt az L3-L4 vénatávolság. A’-D’ A megfelelő panelek piros 45 |
csatornáinak információja fekete-fehérben van kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
A Myc overexpresszió sejtnövekedésre gyakorolt hatását egy másik szárny tesztrendszer segítségével is vizsgáltuk (Rintelen és mtsai. 2001). Az apterus-Gal4 mediált Myc overexpresszió a szárny apikális sejtrétegében növeli meg a Myc szintjét, és okozza a sejtek nagymértékű növekedését. Az apikális sejtrétegben található sejtek így „túlnövik” az alattuk található szárnyréteg sejtjeit, és ennek eredményeként a szárny lefelé konyul a kontrollhoz képest (15. ábra, A, B). Autofágia gátlás vagy p62 RNS interferencia hatására a Myc-et overexpresszáló apikális sejtek viszont nem növekedtek nagyobb mértékben mint az alattuk található sejtek, így egyenes szárny alakult ki (15. ábra, C-E).
15. ábra A Myc-indukált sejt túlnövekedés gátlása szárnyban. A szárny apikális rétegében overexpresszált Myc miatt a felső sejtsor rétegei túlnövik az alsó sejtsor sejtjeit, ezért a kontrollhoz (A) képest a szárny lefelé fog konyulni (B). Atg8a mutáns háttéren (C), domináns negatív Vps34 allél (D) vagy Atg18a (E) és p62 (F) RNSi hatására a Myc-et overexpresszáló felső szárnyréteg sejtjei nem növik túl az alsó réteg normális sejtjeit.
4.7. A Myc overexpresszió növeli az antioxidáns választ Emlős modelleken végzett kísérletekben kimutatták, hogy az autofágia szubsztrátjaként ismert p62 fehérje szükséges a tumorigenezishez és folyamatosan aktiválja az Nrf2 transzkripciós faktort. A p62 ugyanis köt a Keap1 fehérjéhez, így az Nrf2 felszabadul a Keap1 gátlása alól és a sejtmagban az antioxidáns válaszhoz 46 |
szükséges gének transzkripcióját aktiválja (Jain és mtsai. 2010; Komatsu és mtsai. 2010). Mi is azt találtuk, hogy Myc overexpresszió hatására megemelkedik a p62 és az ubiquitinált fehérjék szintje a zsírtest sejtekben (16. ábra, A, B), annak ellenére, hogy az autofágia
szintje
rendszerint
negatív
korrelációt
mutat
a
p62
szintjével.
Immunprecipitációs kísérlettel igazoltuk, hogy a humán p62-höz hasonlóan a Drosophila p62 is köt a Keap1-hez (16. ábra, C). Ezzel összhangban a Myc overexpresszió által megnövelt p62 szint megemeli az Nrf2 dependens transzkripciós riporterek (GstD-lacZ, GstD-GFP) kifejeződését mind a zsírtest klónokban (16. ábra, D), mind szárnydiszkuszok patched doménjében (16. ábra, E, F). A Myc overexpresszió által megnövelt antioxidáns válasz ismét lecsökkent a p62 és az Nrf2 Drosophila homológja, a cnc RNS interferencia hatására (16. ábra, G, H).
16. ábra A Myc overexpresszió következtében p62 és ubiquitinált fehérjék halmozódnak fel, és aktiválódik az antioxidáns válasz. A Myc-et overexpresszáló poliploid zsírtest sejtekben megnő a p62 pozitív pöttyök száma. B A Myc zsírtestspecifikus expressziójakor (2. és 3. kromoszómáról egyaránt) megnövekszik a zsírtest sejtekben a p62 szintje. A kontroll esetben a p62/Tubulin arányt 1-nek vettük. Az ubiquitinált fehérjék is felhalmozódnak a Myc zsírtest-specifikus overexpressziójakor. C A HA-Atg9-cel ellentétben a HA-Keap1 ko-immunoprecipitálódik a Drosophila FLAG-p62-vel. D Myc overexpresszió hatására drasztikusan megnő a lacZ kapcsolt gstD transzkripciós riporter mennyisége zsírtest sejtklónokban. E-H Myc-et overexpresszáló diploid imaginális szárnydiszkuszokban (F) jelentősen növekszik a gstD-GFP jel erőssége a kontroll (E) szárnydiszkuszhoz hasonlítva a patched domén területén. G, H p62 RNSi (G) és Nrf2/cnc RNSi (H) hatására a Myc overexpresszió nem vezet a gstD-GFP jel erősödéséhez diploid imaginális szárnydiszkuszokban. A megfelelő panelek piros (anti-p62, gstD-lacZ, mCh) és zöld (GFP) csatornáinak 47 |
információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A klónsejtek határait zöld vonallal jelöltem az A panelen. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
4.8. A p62 és az antioxidáns aktivitás szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez A p62 RNS interferencia hatására a Myc-et overexpresszáló a szárny felső rétegében található sejtek nem nőtték túl a szárny alsó rétegének sejtjeit (15. ábra, F). Mind a p62 (17. ábra, A-C), mind az Nrf2/cnc (17. ábra, D-F) és a Maf1 (17. ábra, G), ami az Nrf2 kölcsönható partnere, RNS interferencia általi csendesítése gátolta a Myc overexpresszió sejtnövekedést serkentő hatását zsírtest klónokban (17. ábra, P). A Keap1 és a Myc ko-overexpressziója is normális méretű sejtek kialakulásához vezetett zsírtest klónokban (17. ábra, H-I, P). A Keap1 (17. ábra, J) csendesítése az Nrf2 kooverexpresszióhoz (17. ábra, L) hasonlóan nem okozott változást a Myc overexpresszió indukált sejtnövekedés megemelkedett szintjében (17. ábra, P). A p62 funkcióvesztés fenotípusát mind az Nrf2 overexpressziója (17. ábra, M), mind a Keap1 csendesítése (17. ábra, K) menekítette a Myc-et ko-overexpresszáló sejtekben, így a Myc-et overexpresszáló sejtek ismét nagyra nőttek (17. ábra, P). Ez az episztázis analízis igazolja, hogy a p62 az antioxidáns útvonal aktiválása révén szükséges a Myc-indukált túlnövekedéshez. Az antioxidáns útvonal tagjainak csendesítése vagy overexpressziója, ami az antioxidáns aktivitás gátlását okozza, önmagában nem volt hatással a zsírtest klónok növekedésére (17. ábra, Q).
48 |
17. ábra Az antioxidáns válasz az autofágiával párhuzamosan szükséges a Mycindukált sejtnövekedéshez a zsírtestben. Az antioxidáns válasz gátlását okozó p62 RNSi (A-C), Nrf2/cnc RNSi (D-F), Maf RNSi (G) és Keap1 overexpresszió (H-I) gátolta a Myc overexpresszáló sejtek nagymértékű növekedését. A Keap1 RNSi önmagában (J) nincs hatással a Myc-indukált sejtnövekedésre, ezzel szemben a p62 RNSi Myc-indukált sejtnövekedés gátló hatását szuppresszálta (K). Az Nrf2/cnc Myckel való ko-overexpressziója (L) nincs hatással a Myc-indukált sejtnövekedésre, de az Nrf2/cnc overexpresszió hatására a p62 RNSi sejtek ismét nagyra nőttek Myc kooverexpresszió esetén (M). Ezzel szemben az Nrf2/cnc és Myc ko-overexpresszió hatására sem nőttek nagyra a FIP200 RNSi (N) és domináns negatív Vps34-et expresszáló (O) sejtklónok. P Az A-O paneleken bemutatott sejtnövekedést vizsgáló kísérletek kiértékelése. Q A p62, Nrf2/cnc, Maf illetve Keap1 RNSi valamint az Nrf2/cnc és a Keap1 overexpressziója önmagában nincs hatással a zsírtest sejtek 49 |
növekedésére. A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
A p62 (18. ábra, A) és az Nrf2/cnc (18. ábra, B) funkcióvesztés valamint a Keap1 overexpresszió (18. ábra, C) nem gátolta a Myc overexpresszió hatására megemelkedett autofágiát szárnydiszkuszok patched doménjében (18. ábra, E). Ennek ellenére a vadtípushoz hasonló méretűre csökkentette a patched domén méretét (18. ábra, D). Az L3-L4 vénatávolság a Myc-et overexpresszáló szárnyakban a kontrollhoz volt hasonló méretű a p62 és Nrf2/cnc funkcióvesztés, valamint Keap1 ko-overexpresszió során (18. ábra, F). A Keap1 csendesítése és az Nrf2 ko-overexpressziója megnövelte a Myc overexpresszió során az L3-L4 vénatávolságot p62 funkcióvesztés során (18. ábra, F). Az antioxidáns útvonal tagjainak csendesítése vagy overexpressziója önmagában nem vagy csak nagyon enyhe hatással volt az L3-L4 vénatávolság méretére (18. ábra, G).
50 |
18. ábra A p62 és az antioxidáns válasz szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a szárnyban. A p62 (A) és az Nrf2/cnc (B) RNSi, valamint a Keap1 overexpresszió (C) és a Myc overexpresszió együttesen a kontroll lárvák patched doménjeihez hasonló fenotípust idéztek elő az imaginális szárnydiszkuszban a domén méretét tekintve, azaz nem volt túlnövekedés (D), de az autofágiát nem gátolták (E). F A p62 és az Nrf2/cnc RNSi, valamint a Keap1 overexpresszió a kontrollhoz hasonló méretűre csökkentette az L3-L4 vénatávolságot Myc overexpresszió esetén. A Keap1 RNSi és az Nrf2/cnc overexpresszió hatására a Myc overexpresszió miatt megnövekedett L3-L4 vénatávolság alakult ki p62 RNSi szárnyakban. G A p62 és az Nrf2/cnc RNSi és a Keap1 overexpresszió önmagában nincs hatással az L3-L4 vénatávolságra. Az Nrf2/cnc overexpresszió és a Keap1 RNSi nagyon enyhe mértékben csökkenti az L3-L4 51 |
vénatávolságot. A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01, illetve * p˂0.05). Skála: 20 µm.
4.9. Az antioxidáns válasz és az autofágia egymással párhuzamosan szükségesek a Myc-indukált sejtnövekedéshez Az Nrf2/cnc overexpresszió menekítette a Myc-indukált sejtnövekedés során a p62 funkcióvesztés fenotípusát (17. ábra, M). Ez arra utal, hogy a p62 és az Nrf2/cnc egy genetikai útvonal tagjaiként szabályozzák az antioxidáns választ, ami szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez. Továbbá a p62 az Nrf2/cnc-től upstream helyezkedik el a genetikai útvonalban. Az Nrf2/cnc overexpresszió ezzel ellentétben nem menekítette a FIP200 (17. ábra, N) és a Vps34 (17. ábra, O) funkcióvesztés fenotípusát a Myc overexpresszió indukált sejtnövekedés során (17. ábra, P). Ez arra utal, hogy az autofágia és az antioxidáns válasz útvonalak egymástól párhuzamosan szükségesek a Myc overexpresszió indukált sejtnövekedéshez.
4.10. A Myc overexpresszió hasonló kinetikával aktiválja az autofágiát és az antioxidáns választ Fentebb bemutatott kísérletek (11. ábra, 12. ábra, 16. ábra, 17. ábra) során igazoltuk, hogy a konstitutív Myc expresszió mind poliploid, mind diploid sejtekben egymással párhuzamosan aktiválja az autofágiát és az antioxidáns választ. Érdemes azonban megvizsgálni az aktiváció kinetikáját. Ehhez olyan expressziós rendszerre van szükség, ahol a Myc expressziója valamilyen aktivációs hatásra nagymértékben megnövekszik az aktivációs stimulus előtti állapothoz képest. Drosophila-ban széles körben használt a hősokk promóter által szabályozott Gal4 forrás. Az aktiváció (hősokk) után tranziensen kifejeződő Myc hatását vizsgáltuk mind az autofágiát és mind az antioxidáns választ tekintve. A hősokk promóter által szabályozott Gal4 különböző mértékben fejeződik ki a zsírtest sejtekben, ezért különböző Myc és riporter kifejeződés alakul ki a különböző sejtekben. Ezért láthatunk különböző intenzitású kifejeződési mintázatokat a 19. ábra A és B panelein. Érdemes megjegyezni továbbá, hogy az aktivációt jelentő hősokk stimulust követően egyre több sejtben és egyre magasabb szintű expresszió figyelhető meg. 52 |
A hősokk után 8 órával már szórványosan megfigyelhetőek mCherry és GFP dupla pozitív Atg8a-val jelölődő autofagoszómák a Myc aktivált overexpressziója esetén (19. ábra, A), míg a kontroll lárvák zsírtest sejtjeiben nemigen láthatunk autofagoszómákat. Szignifikáns különbség azonban csupán 12 órával a hősokk után figyelhető meg az mCherry pozitív autolizoszómák számában a Myc overexpresszió esetén a kontrollhoz viszonyítva. A hősokkot követően 18 óra elteltével ez a különbség tovább nőtt az mCherry pozitív autolizoszómák számában. Ezek alapján elmondható, hogy a Myc 12 órával a magas expressziót kiváltó hősokk stimulus után aktiválja az autofág folyamatokat. A tranziens Myc expresszió által indukált antioxidáns választ a GstD-GFP genomi promóterről kifejeződő riporter alkalmazásával vizsgáltuk. A képek azonos expozíciós idővel készültek az összehasonlíthatóság kedvéért. A Myc expressziót aktiváló hősokk után 12 órával majdnem a kétszeresére nőtt a GstD-GFP átlag pixel intenzitás a vizsgált zsírtest sejtekben. Az autofág indukcióhoz hasonlóan a GstD-GFP átlag pixel intenzitása alapján 18 órával a hősokk után az antioxidáns válasz is tovább emelkedett a Myc overexpresszió hatására a kontrollhoz képest. Az antioxidáns válasz tehát az autofágiához hasonló aktivációt mutat. Összefoglalva elmondható, hogy az autofágia és az antioxidáns válasz mintegy 12 órával a tranziens Myc expressziót aktiváló hősokk stimulus után hasonló kinetikát mutatva aktiválódik.
53 |
19. ábra A Myc overexpresszió által indukált autofágia és antioxidáns válasz aktiválódásának kinetikája. A A Myc expressziójának indukálása után 12 órával nagy számban kialakulnak mCherry-Atg8a pozitív autofág struktúrák zsírtest sejtekben, míg a kontroll esetben nem láthatunk mCherry-Atg8a jelet. B 12 órával a Myc expresszió aktiválását követően a GstD-GFP antioxidáns riporter expressziója nagymértékben megnövekszik a kontroll állatokéhoz képest. A B panelen látható képek azonos expozíciós idővel készültek mindegyik genotípus és időpont esetén. A megfelelő panelek piros és zöld csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb 54 |
láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
4.11. A Myc-indukált UPR (Unfolded Protein Response) szükséges a megnövekedett mértékű sejtnövekedéshez és az autofágiához A Myc-et overexpresszáló sejtekben a megnövekedett autofágia ellenére felhalmozódik a p62 fehérje (16. ábra, A és B). Az UPR (Unfolded Protein Response) esetén kimutatták, hogy a p62 szintje megemelkedik (Liu és mtsai. 2012). A Myc overexpresszió hatására a lárvák zsírtestében megnövekszik az ubiquitinált fehérjék szintje is (16. ábra, B), ami feltételeztük hogy az UPR aktiválódásához vezet. Az UPR által kiváltott ER stressz hatására az ER-ben a PERK (PEK-nek is nevezik: pancreatic eIF2α kinase) foszforilálja az eIF2α-t. Ezzel összhangban azt láttuk, hogy a Myc overexpresszió hatására megnövekszik a foszforilált eIF2α szintje a zsírtest sejtekben (20. ábra, A, B). A Myc overexpresszió hatására tehát a felhalmozódó hibás konformációjú fehérjék által aktivált stresszválasz (Unfolded Protein Response) során ER stressz alakul ki a sejtben. Ezt egy független teszttel (Sone és mtsai. 2013), az Xbp1-GFP riporterrel is igazoltunk (20. ábra, C, D).
55 |
20. ábra A Myc overexpresszió hatására aktiválódik az ER stressz. A A Myc zsírtest specifikus expressziójának hatására megnő a P-eIF2α szintje a sejtekben. A kontroll esetben a P-eIF2α/Tubulin arányt 1-nek vettük. B Myc-et overexpresszáló GFP pozitív zsírtest sejtklónokban megnő a P-eIF2α szintje a környező kontroll sejtekhez képest. C-D A Myc overexpresszió megnöveli az Xbp1-GFP riporter mennyiségét (D) szárnydiszkuszok patched doménjében a kontroll lárvákéhoz hasonlítva (C). A piros és zöld csatornák információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. Skála: 20 µm.
Az ER stressz különböző útvonalakon képes aktiválni a sejtekben az autofágiát. Azt láttuk, hogy az ER stressz egyik jelátviteli rendszerének PERK overexpresszió általi genetikai aktiválásakor jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtest sejtjeiben drasztikus mértékben aktiválódik az autofágia, az mCherry-Atg8a (21. ábra, A) és Lysotracker Red (21. ábra, B) tesztek alapján (21. ábra, C).
56 |
21. ábra A PERK overexpresszió indukálja az autofágiát. A Lamp1-GFP pozitív zsírtest sejtklónokban túltermeltetett PERK aktiválja az mCherry-Atg8a (A) és a Lysotracker (B) pozitív struktúrák kialakulását jól táplált harmadik stádiumú lárvák sejtjeiben. C Az A, B paneleken bemutatott kísérletek kiértékelése. A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A klónsejtek határait zöld vonallal jelöltem. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
Ez mechanisztikus információt nyújt arról, hogy a Myc overexpresszió hatására beinduló UPR részeként a PERK képes az autofág folyamatok aktiválására. A PERK genetikai útvonal Myc-indukált sejtnövekedésben betöltött lehetséges szerepének igazolására megvizsgáltuk, hogy milyen hatással van a Myc-indukált sejtnövekedésre az útvonal genetikai manipulációja azaz a PERK RNS interferencia vagy a Gadd34 overexpresszió. A Gadd34 kölcsönhat a PP1-gyel, ami az eIF2α defoszforilációját okozza, így antagonizálja a PERK jelátvitelt. A PERK RNS interferencia (22. ábra, A) és a Gadd34 overexpressziója (22. ábra, B) gátolta a Myc overexpresszió indukált nagymértékű zsírtest sejtnövekedést (22. ábra, C). PERK géncsendesítés (22. ábra, D) vagy Gadd34 overexpresszió (22. ábra, E) hatására a Myc-et overexpresszáló diploid imaginális discusok patched doménjének mérete a kontrollhoz hasonló méretűre csökkent (22. ábra, F). Továbbá szignifikánsan csökkent a doménben található mCherry-Atg8a pöttyök száma (22. ábra, G), ami a Myc-indukált autofágia gátlására utal. Az L3-L4 vénatávolság a Myc overexpresszáló szárnyakban a kontrollhoz vált hasonló méretűvé a PERK funkcióvesztés, valamint Gadd34 ko-overexpresszió során (22. ábra, H). Az ER stressz jelátviteli útvonalainak önmagában történő manipulációja (PERK RNS interferencia, Gadd34 overexpresszió) nem volt hatással a zsírtest klónok 57 |
növekedésére (22. ábra, I), ám enyhén csökkentette az L3-L4 vénatávolság méretét (22. ábra, J).
22. ábra Az UPR során aktiválódó PERK útvonal szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez. A Myc-et overexpresszáló zsírtest sejtek PERK RNSi (A) vagy Gadd34 overexpresszió (B) hatására az őket körül vevő kontroll sejtekhez hasonló mértékben növekedtek (C). A PERK RNSi (D) és a Gadd34 (E) overexpresszió és a Myc overexpresszió együttesen a kontroll lárvák patched doménjeihez hasonló fenotípust idéztek elő az imaginális szárnydiszkuszban, mind a domén méretét (F), mind az abban található mCherry-Atg8a struktúrák számát (G) tekintve. A PERK RNSi (H) és a Gadd34 overexpresszió hatására (H) az L3-L4 vénatávolság a kontrollhoz hasonló méretűre csökkent (H). A PERK útvonal gátlását előidéző genetikai manipulációk önmagukban nem voltak hatással a zsírtest sejtek növekedésére (I), míg enyhén csökkentették az L3-L4 között található szárnyrész méretét (J). A megfelelő panelek piros csatornáinak információja fekete-fehérben lett kiemelve a jobb láthatóság kedvéért. A statisztikailag szignifikáns eltérések csillagokkal vannak jelölve (** p˂0.01). Skála: 20 µm.
58 |
5. Az eredmények megvitatása 5.1. Génexpressziós vizsgálatok Az éheztetéssel indukált autofágia során bekövetkező génexpressziós változások követésére teljes genom microarray chipen vizsgáltuk a gének szintjének változását. Általánosságban elmondható, hogy az éheztetés által előidézett környezeti stressz esetén az energiafelhasználó, sok energiát igénylő bioszintetikus folyamatok gátlódnak, hiszen nem áll rendelkezésre elegendő mennyiségű tápanyag és energia a folyamatok végbemeneteléhez.
Ezzel
szemben
az
energiatermelő,
újrahasznosító
lebontó
folyamatok aktiválódnak, köztük az autofágia is, mely központi szereppel rendelkezik a sejtek és élőlények környezeti stresszre adott túlélési válaszában. A központi autofág gének többsége rendre megnövekedett expressziót mutatott éheztetés hatására, ám eltérő mértékben. Az esetek nagy részében a kiboncolt zsírtest mintákon végzett QT-PCR kísérletek során nagyobb mértékű változást tapasztaltunk, mint a chip kísérlet esetén. A legnagyobb expressziószint növekedést az Atg8a esetén tapasztaltuk, ami érthető, hiszen az autofág folyamatok során nélkülözhetetlen, központi szereppel rendelkezik. Az Atg8a fehérje limitálja ugyanis az autofagoszómák keletkezését és méretét, mivel az beburkolja az autofagoszóma külső és belső membránját is (Abeliovich és mtsai. 2000). Az Atg8a esetében tapasztalt kiugróan magas expressziószint növekedés amiatt is történhet, mert a fehérje minden egyes autofág lebontási ciklusban degradálódik. Emiatt fontos, hogy az éheztetéssel indukált autofágia nagymértékű indukciójakor folyamatosan megfelelő mennyiségű Atg8a legyen elérhető. Érdekes, hogy a pre-autofagoszómális membrán reciklizáló komplex mutatta a legnagyobb átlagos expressziószint növekedést a központi autofág gének által alkotott funkcionális csoportok közül. Az autofágia indukciójakor nagy mennyiségű membrán szükséges az autofagoszómák megfelelő kialakulásához. Az Atg9 vezikulákat szállít különféle organellumokból a pre-autofág struktúrákhoz, a komplex többi tagja pedig többek között az Atg9 megfelelő reciklizálásáért felelős. A komplex tagjainak éheztetés hatására bekövetkező nagymértékű expressziószint növekedése érthető tehát, hiszen az ilyenkor beinduló autofág folyamatok rendkívül sok membrán jelenlétét igénylik. Ehhez pedig szükséges a membrán vezikulák megfelelő szállítása is, amit a
59 |
pre-autofagoszómális
membrán
reciklizáló
komplex
tagjainak
megnövekedett
transzkripciója következtében keletkező fehérjék biztosíthatnak.
5.2. A Myc-indukált sejtnövekedés vizsgálata Számos tanulmány során kimutatták, hogy a Myc rengeteg háztartási gén megfelelő expressziójához szükséges, ezért nélkülözhetetlen szerepe van a sejtek növekedésében és osztódásában (Pierce és mtsai. 2004; Eilers és Eisenman 2008; Soucek és Evan 2010). Ezzel összhangban azt tapasztaltuk, hogy Myc funkcióvesztés és Mad overexpresszió hatására - összehasonlítva az őket körülvevő kontroll sejtekkel kisméretű sejtek jönnek létre. Kimutattuk, hogy ezekben a kisméretű sejtekben felhalmozódik a p62, ami a bazális autofágia hibáját mutatja a “Myc program” sérülésének következtében (Pircs és mtsai. 2012). Ezenkívül a Myc szükséges az éheztetéssel indukált autofágiához is, hiszen éheztetés hatására gátolt a savas, emésztő autolizoszómák, és az Atg8a-ra pozitív autofagoszómák keletkezése Myc funkcióvesztés vagy Mad overexpresszió során (Nagy és mtsai. 2013). Munkánk publikálását követően nem sokkal jelent meg egy humán sejttenyészeti tanulmány, ahol szintén kimutatták, hogy a Myc szükséges az autofágiához (Toh és mtsai. 2013). A Myc overexpresszió endoreplikációval növekedő sejtekben drámai mértékben megnöveli a sejtmag és a sejtek méretét egyaránt (Pierce és mtsai. 2004), (23. ábra, A). A sejtek növekedési útvonalai és az autofágia szabályozása rendszerint ellentétesen történik. A növekedési útvonalak aktivitása esetén az autofágia gátolt a sejtekben, míg aktív autofág folyamatok esetében a sejtek növekedési útvonalai gátlódnak (Neufeld 2012). A növekedés és autofágia ellentétes szabályozási mechanizmusainak ellenére azt tapasztaltuk, hogy a nagyra nőtt Myc-et overexpresszáló sejtekben nagymértékben megnőtt az autofág lebontás mértéke (23. ábra, D) (Nagy és mtsai. 2013). Az autofág lebontás mértékének és a sejtekben megfigyelhető p62 aggregátumok általában negatív korrelációjának ellenére a Myc-et overexpresszáló sejtekben nagymértékben megnőtt a p62 szintje (23. ábra, D), ami valószínűleg az UPR aktiválódásának köszönhető.
60 |
23. ábra Genetikai kölcsönhatások összefoglalása a Myc-indukált sejtnövekedés során A A Myc overexpresszió sejt-autonóm módon megnöveli a sejtek méretét. B A PERK jelátvitel, az autofágia, a p62 és az Nrf2/cnc jelátvitel gátlása következtében a Myc-et overexpresszáló sejtek nem növik túl a kontroll sejteket. C Az Nrf2/cnc overexpressziója visszaállítja a nagyméretű sejt fenotípust a p62 funkcióvesztéses sejtekben, ezzel szemben nincs menekítő hatása az autofágia hibás működésekor. D A Myc overexpresszió aktiválja az UPR-t, aminek következtében a PERK által aktiválódik az autofágia és aktiválódik az Nrf2/cnc is a p62 fehérjén keresztül.
A Myc overexpresszió hatására indukálódik a sejtekben az UPR, ami megnövekedett antioxidáns aktivitást okoz a megemelkedett szintű p62 miatt (23. ábra, D). A felhalmozódó p62 ugyanis köti a Keap1-et, így az Nrf2/cnc felszabadul annak gátlása alól és a sejtmagban az antioxidáns válaszban részt vevő gének transzkripcióját aktiválja. Ezt alátámasztja, hogy p62 vagy Nrf2 funkcióvesztés hatására gátlódik a transzkripcionális antioxidáns riporterek Myc overexpresszió indukálta kifejeződése. Kimutatták, hogy az Nrf2 által aktivált transzkripciós programnak - mely során a sejtekben aktiválódnak az antioxidáns és detoxifikáló folyamatok - fontos szerepe van a Ras onkogén irányított tumorigenezisben is (DeNicola és mtsai. 2011). Az UPR következtében ER stressz alakul ki a sejtekben és PERK függő módon aktiválódik az autofágia (23. ábra, D). Emlős rendszerekben az autofágia hibás működésének következtében felhalmozódó p62, melynek az autofág lebontás szelektivitásában van 61 |
fontos szerepe, az antioxidáns aktivitás növekedéséhez és tumorok kialakulásához vezet (Takamura és mtsai. 2011). Vizsgálataink alapján úgy tűnik, hogy mind az autofágia, mind az antioxidáns útvonal, mint sejtvédelmi funkciók egyszerre is aktiválódhatnak, és egymástól párhuzamosan szükségesek a Myc-indukált sejtnövekedés fenntartásában (23. ábra, B, C). Feltételezések szerint az autofágia és az antioxidáns aktivitás tumor szuppresszor funkcióval bír normális sejtekben és a tumorigenezis kezdeti szakaszában, ezzel szemben aktivitásuk előnyös az aggresszív, malignáns tumorsejtek számára (Cheong és mtsai. 2012; White 2012). Kisebb méretű szolid tumorokban a még nem kialakult megfelelő érhálózat következtében hypoxia alakul ki és a tápanyagok szintje sem megfelelő. Úgy gondolják, hogy ezek a tumorok mikrokörnyezetéből eredő stresszhatások indukálják az UPR-t és az autofágiát a sejtekben, és ezzel hozzájárulnak a tumorsejtek túléléséhez (Wang és Kaufman 2012). Kimutattuk, hogy a szabályozatlan Myc expresszió - jelen esetben overexpresszió - a tumorsejtekben sejt-autonóm módon aktiválja az UPR-t, az autofágiát és az antioxidáns útvonalat. Ezek a folyamatok tehát a szabályozatlan Myc expresszió hatására aktiválódnak és feltehetően nélkülözhetetlen szerepük van humán tumorsejtek növekedésében, csakúgy mint az általunk vizsgált Drosophila sejtek növekedésében. Ennek bizonyítéka például, hogy chloroquine kezelés hatására, amikor a lizoszómális lebontás gátolt, csökkent a tumorok térfogata egy Mycdependens limfóma model vizsgálata során (Amaravadi és mtsai. 2007; Maclean és mtsai. 2008). Másrészről nemrég kimutatták, hogy a Myc overexpesszió indukálja az ER stresszt és az autofágiát, és ezek az útvonalak a tenyésztett sejtek túléléséhez szükségesek. Ezzel összhangban, a Myc overexpresszió az autofágia PERK-dependens aktiválása révén elősegíti a tumorok kialakulását egér modellben (Hart és mtsai. 2012). Vizsgálataink alapján úgy tűnik, hogy a Myc overexpresszió következtében kiváltott UPR által aktivált autofágia és antioxidáns aktivitás nem csupán ahhoz szükséges, hogy a sejtek ne pusztuljanak el, hanem nélkülözhetetlen a Myc-indukált megnövekedett mértékű sejtnövekedéshez is (23. ábra, D). Fontos megjegyezni, hogy a PERK útvonal, az autofágia vagy az antioxidáns útvonal működésének gátlását előidéző genetikai és egyéb manipulációk a normális sejtek növekedésére nem voltak hatással. A Myc gyógyszerekkel történő gátlása bonyolult. A Wellcome Trust Sanger Institute (UK) által kivitelezett Cancer Genome Project során - mely a Wellcome Trust Sanger Institute (UK) és a Center for Molecular Therapeutics, Massachusetts General Hospital Cancer Center (USA) közötti kollaboráció eredménye - többek között 62 |
különböző Myc-asszociált tumorsejtvonalak életképességét is vizsgálták különböző drogkezelések hatására (Yang és mtsai. 2013). A 24. ábra bemutatja azokat a gyógyszerhatóanyagokat,
melyek
hatással
voltak
a
Myc
tumorsejtvonalak
életképességére. Jól látható, hogy nagyon kevés kezelés esetében tapasztaltak valamilyen hatást.
24. ábra Myc tumorsejtvonalak életképességét befolyásoló drogok. (forrás: http://www.cancerrxgene.org) A Myc-indukált tumorsejt növekedés gátlása azonban kivitelezhető lenne olyan sejtbiológiai folyamatok gátlásával, melyek nélkülözhetetlenül szükségesek a tumorsejtek növekedéséhez, ám szerepük nélkülözhető a normális sejtekben. Ezeket nevezzük nem-onkogén addikciós folyamatoknak, melyeket jelenleg kevéssé ismerünk csupán (Luo és mtsai. 2009). Jelen tanulmány eredményei azt mutatják, hogy az UPR, az autofágia és az antioxidáns útvonal tipikus nem-onkogén addikciós folyamatok. Ezen útvonalak specifikus gátlásával növelni lehetne a Myc-asszociált tumorok kezelésének hatékonyságát. További hatékony kezelési lehetőség lehetne az autofágia és az antioxidáns útvonal egyszerre megvalósuló, kombinált gátlása, ugyanis eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a két útvonal egymással párhuzamosan szükséges a Mycindukált sejtnövekedéshez. Az onkogén kollaboráció egyik klasszikus példája a Myc overexpresszió és a Ras hiperaktivitásának szinergisztikus hatása a sejtek növekedésére és osztódására (Weinberg 2007). Kimutatták, hogy az onkogén Ras serkenti a sejtek növekedését és osztódását és megemelkedik az autofágia szintje az intenzíven osztódó sejtekben. Azokban a sejtekben ugyanis amelyekben nincs autofágia indukció az onkogén Ras 63 |
szeneszcenciát vált ki. Valószínűsíthető tehát, hogy a Myc-indukált autofágia is fontos szereppel bírhat az onkogén Ras és Myc együttműködése során. A személyre szabott terápiák esetében nagy előnyt jelentene, ha a számos ráktípus esetén megfigyelhető, megemelkedett UPR, autofágia és antioxidáns válasz hatását célzó, azok gátlását okozó szereket tudnánk alkalmazni. A klinikumban már használatos például a chloroquine, ami nem specifikus autofágia gátlószer hiszen az endoszómális lebontást is gátolja. Újabb, egyre specifikusabb gátlószerek fejlesztése is folyamatban van különböző Atg fehérjékkel szemben (Cheong és mtsai. 2012). Az autofágia szerepe a tumorok kialakulása folyamán kontextus függő, mivel eltérő szerepe lehet a tumor iniciációban és progresszióban. A terápiás kezelések fontos kérdése lehet tehát azon betegek azonosítása, akik valószínűsíthetően pozitívan regálnának a fentebb említett gyógyszerekkel történő kezelésekre. Egyetlen teszt sem alkalmas jelenleg arra, hogy megbízhatóan
kimutassa
az
autofágia
szintjét
klinikai
mintákon,
hiszen
a
megnövekedett autofagoszóma kialakulás vagy a csökkent mértékű autofagoszóma érés és autolizoszómális lebontás egyaránt az autofág struktúrák felhalmozódását okozzák (Klionsky és mtsai. 2012). Eredményeink alapján úgy tűnik, hogy a megemelkedett Myc szint alkalmas biomarkere lehetne rákbetegek kezelése során autofágia gátlószerek terápiás alkalmazásának.
64 |
6. Összefoglalás Az autofágia egy evolúciósan konzervált lizoszómális lebontó útvonal, melynek során az autofagoszómákba becsomagolódott citoplazma részletek, organellumok, fehérjék a lizoszómákkal való fúzió után lebomlanak. A lebontás után keletkező monomerek újrahasznosulnak energiatermelő vagy bioszintetikus folyamatokban. Számos fiziológiás folyamat és patológiás elváltozás esetén kimutatták az autofágia szerepét. Tumorok kialakulása során az autofágia kettős szereppel bír: egyrészt tumorszuppresszor funkcióval rendelkezik, másrészt segítheti tumorsejtek túlélését a tumorigenezis kezdeti fázisában. In vivo teljes genom szűrés során autofágiában szerepet játszó géneket kerestünk genetikai mozaik lárvák zsírtest sejtjeiben. Igazoltuk, hogy az egyik találat, a Myc transzkripciós faktor szükséges az éheztetéssel indukált autofág folyamatok végbemeneteléhez. Számos tumortípus esetében ismert, hogy kialakulásukban központi szerepe van a szabályozatlan Myc expressziónak, mely az esetek túlnyomó részében a Myc rendkívül magas kifejeződését jelenti. Kísérleteinkben bizonyítottuk, hogy a Myc overexpresszió megnöveli a sejtek méretét valamint aktiválja az autofágiát és az antioxidáns aktivitást. A Myc overexpresszió során a sejtekben felhalmozódnak az ubiquitinált és p62 pozitív fehérjeaggregátumok, melyek stresszválaszt aktiválnak a sejtben. Igazoltuk, hogy az aktiválódó ER stressz a PERK jeláltviteli útvonalon keresztül indukálja az autofágiát. Azt találtuk, hogy az autofágia és az antioxidáns válasz egymással párhuzamosan aktiválódnak a Myc overexpresszió hatására. Különböző poliploid és diploid sejtek vizsgálata során bizonyítottuk, hogy a Myc-indukált túlnövekedéshez szükséges az autofágia, az antioxidáns aktivitás, a p62 valamint a PERK jelátviteli útvonal megfelelő működése. Különböző tumorterápiák esetén a kezelések gyakran nem elég hatékonyak. A Myc-asszociált tumorok esetében az onkogén gátlása eddig kivitelezhetetlennek bizonyult. A nem onkogén addikciós útvonalak gátlása (jelen esetben: autofágia, antioxidáns- és PERK jelátvitel) szolgálhat megoldásként, hiszen ezek a folyamatok csupán a tumorsejtek túlnövekedéséhez szükségesek és gátlásuk nincs hatással az egészséges sejtek növekedésére. Személyre szabott terápiák esetén az emelkedett Myc expresszió esetleg biomarkerként szolgálhatna autofág és antioxidáns útvonal gátlószerek alkalmazására. 65 |
7. Summary Autophagy is an ancient lysosomal degradation pathway. Cargo delivered by autophagy is degraded in acidic autolysosomes and recycled for reuse in biosynthetic or other processes. Autophagy has a central role in many pathological and physiological processes such as neurodegenerative diseases, aging and cancer. Autophagy has a dual role in tumorigenesis. Autophagy may be a tumorsuppressor pathway because it protects cells from reactive oxygen species by removing damaged mitochondria. In contrast autophagy promotes tumor cell survival during tumorigenesis. We carried out an in vivo whole genome RNAi screen in mosaic larval fat bodies for genes involved in autophagy in Drosophila. We identified Myc as a physiological regulator of basal and starvation-induced autophagy. Deregulated expression (usually high-level overexpression) of Myc is observed in different types of tumors. Myc overexpression leads to overgrowth of cells in Drosophila tissues. We found that forced Myc expression highly increases autophagic degradation rate and antioxidant activity. Unfolded protein response (UPR) is activated by accumulated ubiquitinated proteins and p62 during Myc overexpression. Mechanistically, Myc overexpression increases unfolded protein response, which leads to PERK-dependent autophagy induction. In addition, we showed that the autophagy and antioxidant pathways are required in parallel for excess cell growth driven by Myc. Genetic or pharmacological inhibition of UPR, autophagy or p62/Nrf2 signaling prevents Mycinduced overgrowth, while these pathways are dispensable for proper growth of control cells. Inhibition of Myc in cancer has proven difficult. UPR, autophagy and antioxidant responses may be considered as potential non-oncogene addiction pathways: strictly required for Myc-induced overgrowth but dispensable for the growth and viability of normal cells. Elevated Myc levels may even turn out to be useful as a biomarker before therapeutic application of inhibitors for key autophagy, UPR or antioxidant proteins in cancer patients.
66 |
8. Anyagok és módszerek Microarray A microarray során kapott teljes adatsorok elérhetőek a www.ebi.ac.uk/arrayexpress címen az alábbi azonosítószám alatt E-MEXP-3352. Minden genotípus esetében négy microarray chip-et alkalmaztunk: két-két független (biológiai replika) táplálkozó valamint éheztetett lárvákból származó minta és minden táplálkozó-éheztetett mintára a megfelelő festékek felcserélésével használt chip (technikai replika). 86±2 órás jól táplált illetve PBS-ben éheztetett lárvákból pontosan 30 mg mennyiséget gyűjtöttünk és fagyasztottunk le RNAlater (Sigma) oldatban. Az RNS-ek izolálása NucleoSpin RNA II izoláló kit (Macherey-Nagel, 740955) segítségével történt. Az RNS mintákat -80°C-on 30 U Prime RNase inhibitor (Fermentas, EO0382) oldatban tárolták. A próbakészítés 1 µg RNS reverz transzkripciója által történt 10 µl térfogatban Oligo(dT) és ArrayScript enzim felhasználásával, majd a másodlagos cDNS szintézise következett 50 µl térfogatban DNS polimeráz és RNázH felhasználásával. Az amino-allyl módosított RNS-ek szintézise in vitro transzkripcióval történt aaUTP és T7 enzim keverék használatával (Ambion, AM1753). 6 µg aRNS jelölése 10 µl térfogatban történt Cy5 és Cy3 festékekkel (GE Healthcare, PA23001, PA25001), ezt a jelölt aRNS-ek visszaizolálása követte (Macherey-Nagel, 740955; aktivitás és koncentrációmérés: NanoDrop 3.1.0, Rockland). 4x44k formátumú Agilent microarray chip-en (G2519F021791) vizsgáltuk a génexpressziós mintázat változását éheztetés hatására. A hibridizáció 60°C-on 30 percig történt, amit 25 µl GE hibridizációs pufferrel állítottak le (Agilent, 5188-5242). A jelölt minták 48 µl térfogatú mennyisége került a microarray hibridizációs kamrákba (Agilent, G2534A). Centrifugálás, inkubálás (65°C 17 óra) és mosás (Agilent, 5188-5327) után történt a szkennelés 543 nm (Cy3) és 633 nm (Cy5) hullámhosszon Agilent szkennerbe beépített XDR (Extended Dynamic Range) funkcióval, mely 5 mm-es felbontást tesz lehetővé. A microarray képek kiértékelése Feature Extraction Agilent (ver.9.5.1.1.) szoftverrel történt kétszínű expressziós protokoll alkalmazásával (GE2_v5_95_Feb07). Az összes nyers eredmény Lowess módszerrel lett normalizálva. További többszörös korrekciót eredményező BenjaminiHochberg módszerrel kaptuk meg a fals negatív rátát. Bioinformatikai analízis 67 |
A GO analízist a DAVID Bioinformatics Resources 6.7 online alkalmazás segítségével készítettem el (http://david.niaid.nih.gov). Az analízishez a beviteli adatok között olyan gének FBgn azonosítói szerepeltek, melyek éheztetés hatására p<0,05 szignifikancia mellett legalább kétszeres expressziószint növekedést vagy csökkenést mutattak. A csökkenést és növekedést mutató gének listái külön kerültek feltöltésre. Alapbeállítások mellet megvizsgáltam, hogy milyen biológiai folyamatokhoz tartozó GO csoportok vannak jelen a beviteli listákban (functional annotation clustering). Mivel a legtöbb génre több alternatív oligo is megtalálható a teljes genom chipen, ezért az összes szignifikáns expressziószint változást mutató értéket figyelembe vettük, és a 6. ábra A paneljén található változások átlagot mutatnak. Az így kapott értékeket JcolorGrid szoftver felhasználásával jelenítettem meg. BLASTP keresés során kerestem az élesztő gének Drosophila és humán homológjait és a legmagasabb értékű találat szerepel az 6. ábra A paneljén.
QT-PCR Az RNS mintákat táplálkozó illetve éhező állatok lárvális zsírtestjéből készítettük (4 független minta), mind esetén. Két mikrogramm RNS reverz transzkripciójával állítottuk elő a cDNS mintákat 30 ml végtérfogatban (Applied Biosystems, 4322171; profil: 10 perc szobahőmérsékleten, 2 óra 37°C-on, 5 perc jégen, majd végül 10 perc 75°C-on). Vízzel történő higítás (30 ml) után 1 ml reakciós elegyet használtunk a QTPCR reakcióhoz templátként FastStart SYBR Green Master keverékkel együtt (Roche, 04673484001), 250 nM-os primer (4. táblázat) végkoncentráció mellett (profil: 15 perc 95°C, 45 ciklus 95°C 15 mp, 60°C 25mp és 72°C 25mp). A relatív expressziós szintek GAPDH mRNS-hez lettek normalizálva. Kétoldali, kétmintás, egyenlőtlen varianciájú Student-féle t-teszt alkalmazásával számítottuk ki a p-értékeket. 4. táblázat A QT-PCR során alaklmazott primer szekvenciák Primer szekvenciák (5'-3') Forward
Reverse
Atg1
TCGCAGCCAATTAGCGTAAA
AATGTCACTGCTCACACTGCTCTT
Atg13
GCAGCCCACGCCATCTAC
GGTGCGGGTCAGCGATAT
FIP200
GCAGTGGGCCACTCGACTT
CCCTCCGTCGGCTCAACT
68 |
Atg101
CCTTTCCGCAGGAGTCGAT
TTCTCGTGCTTGATCAGATCCA
Atg6
TGCTCGGCGAGAATCGA
GGTGTCCCAGAAAAACTTAAATCC
Atg14
CGAGCGACGCGATGAATT
GTCCGGGTATTTAGGTAGGTTCTTC
Vps15, ird1
TTGGAGGGCATCAAGAAGACA
CCCGCTGAAAGGGTAAACAA
Vps34
GCACTTGGACAACCTCTTGCT
CCAGAATGTAGCCGAAATCGA
EDTP
GCGAATGCGGGAATTGG
GGCACGGCGAATCTTTGA
Atg2
GATGACGATGTGCCCTTCCT
CGATGGTCTCTGCGAACTTCT
Atg9
GGGCAGCACTCCCTTGAAT
CGTGCAAATAGAGGGCACTGA
Atg18a
TGACTGCTGGCGAGGTACAG
TGGGCGGGAATCATGGT
Atg18b
AGCCACGTCTGCTGATTGC
CCCGTTCCGCAGGAAACT
Aut1
AATTCCTGATAACGCGCAATG
CCTCGCCGACGTATTCCAT
Atg4a
TCACTGCCAACAACAAATGAAAC
TGGCAGCAACGGCAATG
Atg4b
TCCGCAGCAGATCGATGA
GTTCTCCACCGCGTCCAT
Atg5
GGAGGGCCAGATAGGCATATG
CGGCTTAATGCCCACGAT
Atg7
CCCTGGAAATTCGCTCAAAG
GGATACTCCGGGTCGTGTCA
Atg8a
CGACAAGATCCGTCGCAAAT
CGCCTTGGGAGCCTTCTC
Atg8b
GACAAGATCCGGCGCAAGTA
TTCGGCGCCTTTTCCA
Atg12
GGCAATGTGCCCATCATCA
CTGTATCCAGCCGACTGTCTTG
Atg16
CCGTGGAGCGCATGGT
GCCAATGTCCCAAAGTTTGAC
blue cheese
TCGTATCTGGTGCGGCTAGA
AGTGTCCGCCCTGCAACTT
ref(2)P
GCCCTCCCAGAATTACACCAT
TAACTGGCGCTCCTGGAAA
Törzsek fenntartása A törzseket standard élesztő/kukoricaliszt/agar táptalajon 25°C-on, 60%-os páratartalom alatt, 12 óra sötét- illetve 12 fényperiódus mellett tartottuk. A standard táptalaj elkészítése az alábbiak szerint történik: 12 g agarport 1 liter csapvízben feloldunk, majd felforraljuk, és az oldathoz 100 g „szárazkeveréket” adunk. Ezt addig keverjük, amíg csomómentes nem lesz. A „szárazkeverék” előállítása során az alábbiakat kevertük össze: 120 g glükóz, 36 g szacharóz, 320 g kukoricaliszt és 2,7 g CaCl2. Ezután 25 g élesztőkivonatot adunk a csomómentes keverékhez, majd az egészet újra felforraljuk. Miután az elegy kézmelegre hűlt 10 ml Nipagin antibiotikumot és 1,7 ml fenil-fenol oldatot adtunkhozzá, amit így már a csövekbe önthettünk. A törzsek hosszútávú tárolása 18 °C-on történt. A kísérletek jó része 25 °C-on zajlik, a kiszáradás elkerülése érdekében néha a táptalajt vízzel kell locsolni. Drosophila törzsek, genetika 69 |
Az RNSi klónok spontán keletkeznek hs-Flp, Act>CD2>Gal4 és UAS-RNSi (vagy más UAS szabályozása alatt álló szekvencia) lárvákban (UAS-GFPnls vagy mCD8-GFP maker jelöli a klónsejteket), amikor a Flp rekombináz kihasítja az FRT szekvenciák által határolt DNS régiót. Ilyenkor beindul a konstitutív aktin promóter által a Gal4 expresszió, ami az UAS szekvenciákhoz kötődve beindítja az UAS-kapcsolt transzgének működését. A Myc overexpressziót teljes zsírtestben kollagén specifikus (cg) Gal4 forrás kapcsolta be. Ezeket a zsírtesteket vizsgáltuk elektronmikroszkóposan és Western blot alapú fehérjekimutatással. A hősokk irányított (hs) Gal4 forrást a Myc által indukált autofágia és antioxidáns válasz időbeli aktiválódásának kinetikai vizsgálatakor alkalmaztuk. A patched (ptc) Gal4 forrás a lárvális imágó szárny korongokban fejeződik ki egy meghatározott csíkban és az adult szárny L3 és L4 vénája közötti területen, míg az apterous (ap) Gal4 a szárny apikális sejtrétegében expresszál. A zsírtesteket a peterakás utáni 84-90 órás lárvákból izoláltuk a különböző vizsgálatokra, amikor lehetséges volt. A Myc null mutáció L1-es stádiumban letálitást idéz elő, ezért ebben az esetben a kontroll lárvák is L1 stádiumúak voltak az összehasonlíthatóság miatt. Az imaginális szárny korongok 108-120 órás lárvákból lettek izolálva, míg a kifejlett imágó szárnyait 3-7 napos korban vizsgáltuk. A felhasznált Drosophila törzsek: Keap1[i1, KK107052], p62[i1, KK108193], cnc[i1, KK108127], FIP200[i, KK104864], Atg18a[i, KK105366], Atg1[i, GD16133], PERK[i, GL00030]
(Vienna Drosophila RNAi Center), p62[i3, HMS00938], p62[i2,
HMS00551], cnc[i2, JF02006], cnc[i3, HMS00650], Atg9[i, JF02891], Myc[i, JF01761], Maf[i, JF02008], UAS-Keap1[/2, EY15427], UAS-cnc[EY17502], UAS-Myc (2. kromoszóma), w[1118] (kontroll), ap-Gal4, cg-Gal4, (Bloomington Drosophila Stock Center), Myc[4], UAS-Mad (Peter Gallant) (Pierce és mtsai. 2004), UASKeap1[/1], Keap1[i2, dsRNA], gstD-GFP, gstD-LacZ (Dirk Bohmann) (Sykiotis és Bohmann 2008), UAS-mGadd34, UAS-PERK (Stefan Marciniak) (Malzer és mtsai. 2010), UAS-Xbp1-GFP[HG] (Hyung Don Ryoo), ptc-Gal4 (Mihály József), UAS-Myc (3. kromoszóma), UAS-mCherry-Atg8a, UAS-mCherry-GFP-Atg8a (Tom Neufeld), UAS-Atg1[DN] (Scott és mtsai. 2007), UAS-Vps34[DN] (Juhasz és mtsai. 2008), Atg8a[d4] (Pircs és mtsai. 2012), FIP200[d130]. UAS-Myc-et sejtklónokban expresszáló stabil törzs az alábbi törzsek felhasználásával készült: hs-Flp[22]; UASDcr2; Act>CD2>Gal4, UAS-GFPnls, r4-mCherry-Atg8a (Pircs és mtsai. 2012) illetve hs-Flp[22]; UAS-Lamp1-GFP; Act>CD2>Gal4, UAS-Dcr2 (Pircs és mtsai. 2012). A 70 |
sejtméret episztázis analízis során a következő törzset használtuk: hsFlp[22]; Act>y+>Gal4, UAS-GFPnls; UAS-Myc kivéve a FIP200 mutáns lárvák esetében használt törzs: hs-Flp[22], Act>CD2>Gal4, UAS-mCD8-GFP (X kromoszómára rekombinálva), és ptc-Gal4, UAS-mCherry-Atg8a, UAS-Myc (2. kromoszómára rekombinálva). Molekuláris klónozás, sejttenyésztés, immunoprecipitáció A Drosophila p62 kódoló szekvenciája PCR amplifikáció után (a PB1 domén nem lett amplifikálva, ezzel ugyanis megelőzhető a p62 aggregációja önmagával) pUAST3xFLAG vektorba került ligálásra. A teljes Atg9 és Keap1 kódoló szekvenciát amplifikáció után a pUAST-3xHA vektorba ligáltuk. A D.Mel-2 sejteket penicillin és streptomycin tartalmú Express Five Serum-Free médiumban tartottuk. A sejteket egyenlő mennyiségű metallothionein-Gal4, UAS-FLAG-p62 és UAS-HA-Atg9 vagy UAS-HA-Keap1 plazmidokkal transzfektáltuk TransIT-2020 (Mirus) felhasználásával. 48 órával később 1mM CuSO4 hozzáadásával és egy éjszakán át történő inkubáció során indukáltuk a sejtekben a fehérjeexpressziót. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze, majd kétszer PBS-ben mostuk és jégen lizáltuk lízis pufferben (0.5% Triton-X100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 mM TRIS-HCl pH 8), ami proteáz és foszfatáz inhibitort is tartalmazott (Sigma). Ezután 10 percig centrifugáltuk a lizátumot 10,000 g-n egy Eppendorf 5430R centifugában 4°C-on, majd a tisztított felülúszóhoz hozzáadtunk 30 µl anti-HA gyöngyöt (Sigma). 4°C-on 2 órát inkubáltuk a gyöngyöt és a felülúszót, majd összegyűjtöttük a gyöngyöket 30 másodpercig tartó 5000 g-n történő centrifugálással, lízis pufferben mostuk és végül 30 µl Laemmli pufferben forraltuk.
Western blot Különböző fehérje profilok meghatározása céljából a kiválasztott minta (teljes lárva, preparált zsírtest) 10 mg-jához 100 µl PBS-t, 100µl Laemmli mintafelvivő oldatot és 1:100 proteáz inhibitort adtunk, 5 percig 100°C-on forraltuk, homogenizáltuk végül lecentrifugáltuk és a fehérjepreparátumot steril Eppendorf csőbe pippettáztuk. Egyenlő mennyiségű fehérjemintát vittünk fel és szeparáltunk 8%-os vagy 10%-os SDSpoliakrilamid gélen, majd mobilizáltuk Immobilon-P PVDF membránra (Millipore) futtató pufferben (0,025 M Trizma base, 0,2 M Glycin, 10% metanol). A membránokat 71 |
1 óráig blokkoltuk kazein CBB pufferben (0,5% kazein (Sigma) 0,1 M Trizma base-ben oldva) és 3x5 percig mostuk TBST-ben (0,025 M Trizma base pH 7,5 HCl oldattal beállítva, 0,9% NaCl, 0,1% Tween 20). Ezt követően a membránokat egy óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk az elsődleges ellenanyag 1:1 TBST/CBB oldatában és 3x10 percig mostuk TBST-ben. A membránokat egy óráig inkubáltuk az alkalikus foszfatázzal konjugált másodlagos ellenanyagok 1:5000 higítású oldatában (kecske antinyúl, anti-egér (Millipore), nyúl anti-patkány (Sigma) 1:1 TBST/CBB oldatban). A blotokat 3x10 percig mostuk TBST-ben majd 5 percig alkalikus foszfatáz pufferben (100 mM Trizma base, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,05% Tween 20, pH 7,5 HCl oldattal beállítva). A blotok előhívása 1:50 higítású NBT-BCIP (Sigma) pufferrel történt. Immunfestés A kiforditott lárvákat a zsírtest immunjelölése céljából (96-108 órás lárvák) 3,7% paraformaldehid PBS-ben fixáltuk 4°C-on egy éjszakán keresztül. Reggel a mintákat 2 óráig PBS-ben mostuk, majd 15 percig permeabilizáltuk PBTX-DOC (PBS 0,1% Triton X-100 and 0,05% nátrium deoxycholát) oldatban és 3 órán át blokkoltuk 3%-os kecske szérum PBTX-DOC-ban. A blokkolás után a mintákat egy éjszakán át inkubáltuk 4°Con az elsődleges ellenanyag oldatban (1% kecske szérum PBTX-DOC-ban). A mintákat 3x30 percig mostuk PBTX-DOC-ban, majd szobahőmérsékleten 4 órán át inkubáltuk a másodlagos ellenanyag oldatban (1% kecske szérum PBTX-DOC-ban). Végül a mintákat 3x20 percig mostuk PBTX-DOC és 2x20percig PBS oldatban. Ellenanyag higítások Elsődleges: patkány anti-mCherry (WB 1:5,000), patkány anti-Atg8a (IF 1:300), nyúl anti-Atg8a (WB 1:5,000), nyúl anti-p62 (IF 1:2,000, WB 1:5,000) (Pircs és mtsai. 2012), egér anti-tubulin (WB 1:1,000, clone AA4.3-s, DSHB), egér anti-LacZ (IF 1:100, clone 40-1a-s, DSHB), csirke anti-GFP (IF 1:1,500, Invitrogen), nyúl antiphospho-eIF2α (IF 1:100, WB 1:1,000, Cell Signaling Technologies), nyúl antiubiquitin (1:500, DAKO). Másodlagos: alkalikus foszfatáz-konjugált kecske anti-egér (WB 1: 5,000, Millipore), nyúl anti-patkány (WB 1: 5,000, Sigma), és Alexa 488 kecske
72 |
anti-csirke, Alexa 546 kecske anti-nyúl, Alexa 568 kecske anti-patkány, Alexa 568 kecske anti-egér (IF 1:1,500, Invitrogen). Phalloidin festés A kifordított lárvákat (96-120 órás lárvák) 3,7% paraformaldehid PBS-ben szobahőmérsékleten fixáltuk 40-60 percig. A mintákat 2x5 percig mostuk PBS-ben, majd 3x5 percig PBTX-DOC (PBS 0,1% Triton X-100 és 0,05% nátrium deoxycholát) oldatban. Egy éjszakán át a mintákat 20% Phalloidin Alexa 633 oldatban (1% kecske szérumban) 4°C-on inkubáltuk, majd reggel 3x20 percig PBTX-DOC és 2x15 percig PBS oldatokban mostuk. Elektronmikroszkópos vizsgálatok Az ultrastruktúrális vizsgálatokra kiválasztott szöveteket egy éjszakán át fixáltuk 4°Con 3,2% paraformaldehid, 1% glutáraldehid, 1% szacharóz, 0,028% Cacl2 0,1N nátrium-kakodilát oldatban (pH=7,4). Ezután 1 óráig fixáltuk a mintákat 0,5% ozmiumtetroxid oldatban és ágyaztuk Durcupan (Fluka) gyantába a gyártó által ajánlott protokollt követve. A lemetszett 70 nm-es metszeteket Reynold-féle citráttal festettük, és Olympus Morada 11 megapixeles kamerával felszerelt JEOL JEM-1011 mikroszkóppal fotóztuk iTEM szoftver (Olympus) felhsználásával. Lárvális szövetek vizsgálata, mikroszkópia A lárvákból kiboncolt zsírtesteket 100 µM Lysotracker Red (Invitrogen) vitális festékben inkubáltuk 10 percig. Fluoreszcens vizsgálatok esetében az elkészített preparátumokat 50% PBS/glicerin 0,2µM DAPI (Sigma) oldattal fedtük le. A képeket ApoTome2 konfokális grid-del felszerelt Zeiss Axioimager M2 mikroszkóppal és AxioVs40 4.8.2.0 szoftverrel készítettük. A mikroszkóp Plan-NeoFluar 20x 0.5 NA és 40x 0.75 NA objektívekkel és Axiocam Mrm kamerával felszerelt. A felnőtt szárnyakat Zeiss Lumar sztereomikroszkóppal fotóztuk, Axiocam Icc kamerával és AxioVs40 4.8.2.0 szoftverrel. A DAPI jelet Adobe Photoshop-ban néhány esetben pirosra színeztük a jobb láthatóság kedvéért.
73 |
Az autofágia és az antioxidáns válasz aktivációjának időfüggés vizsgálata Jól táplált harmadik stádiumú lárvákat két órán át 37°C-on tartottuk, mely elegendően magas hősokk promóter által szabályozott Gal4 fehérje szintet biztosít ahhoz, hogy a Myc nagymértékben kifejeződjön. A lárvákat 4, 8, 12 valamint 18 órával a hősokk végeztével mikroszkóposan vizsgáltuk. A hősokk után a lárvákat 25°C-on tartottuk. Az antioxidáns válasz kvantifikálása esetén 354x354 pixel nagyságú területen Adobe Photoshop-ban vizsgáltuk az átlagos pixel intenzitást, mely a Histogram nevű ablakban található meg a szórással együtt. Az antioxidáns aktivitás vizsgálata esetén a mikroszkópos képek azonos expozíciós idővel készültek. Chloroquine kezelés Egy napos petéztetés után az első stádiumú lárvákat összegyűjtöttük és 3 mg/ml végkoncentrációban chloroquine-t tartalmazó tápra helyeztük át. A kezelés hatásának vizsgálata három nappal később történt. Éheztetés Harmadik stádiumú lárvákat 20%-os szacharóz oldatban tartottunk 180-240 percig.
Denzitometria A Western blotok digitalizálása Epson Photo 4990 szkenner felhasználásával történt 600 dpi felbontásban úgy, hogy a háttér megmaradjon. A denzitometriás kiértékelés ImageJ (NIH) szoftver felhasználásával történt. A kérdéses futási oszlopok kijelölése után (Rectangular Selection) a pixelintenzitási hisztogramok elkészítése az alábbi módon történt: Analyze> Gels > Plot lanes. A kérdéses intenzitás csúcsokat egy egyenes vonallal (Line Tool) különítettük el a háttértől. Ezután megmértük a kérdéses csúcs alatti terület nagyságát (Wand Tool), ami megmutatja, hogy az adott jel milyen intenzitású. Ez az érték fejezi ki az adott fehérje mennyiségét. Az értékeket mindig az adott mintában megtalálható tubulin mennyiségére normalizáltuk. A paneleken bemutatott értékek a változás mértékét mutatják be a kontroll sejtlizátumokhoz képest.
74 |
Pixelintenzitás-eloszlás korrelációjának meghatározása A pixel intenzitás eloszlás korrelációjának vizsgálata az RGB három csatornás kép zöld és piros csatornájának fekete-fehér 8 bit-es képének ImageJ-ben való megnyitása után a Plugins> Colocalisation analysis> Intensity Correlation Analysis parancssort követve történt. Az analízis során a zöld és piros csatornákról készített képeken található pixelek egy dot plot-on kerülnek ábrázolásra, ezek láthatóak a 12. ábra A’-D’ panelein. Mikroszkópos képek kiértékelésének esetében a Pearson korrelációs koefficiens 1-hez közeli értéke a zöld és piros csatornán készült képeken lévő pixelek magas szintű korrelációját, míg a 0-ához közleli értékek az alacsony korrelációt mutatják. Mikroszkópos képek elemzése A mikroszkópos képek kiértékelése ImageJ szoftverrel történt. Az adult szárny értávolságának meghatározásakor az L3 és L4 véna közti távolságot minden esetben a posterior hátsó keresztvéna (PCV) hosszához hasonlítottuk (14. ábra, G). A klonális kísérletek esetében az RGB képet betöltöttük ImageJ-ben és RGB Stack típusúra változtattuk meg. Ezután beállítottuk a threshold-ot a megfelelő csatornán. Ekkor jelöltük ki a vizsgálni kívánt struktúrákat. Ezt mind a GFP pozitív klónsejt, mind a GFP negatív kontroll sejt (ami minden esetben a klónsejttel azonos mikroszkópos felvételről származik) esetében elvégeztük. Először a GFP pozitív klónsejt mellett található random módon kiválasztott kontroll sejtet körberajzoltunk a Freehand Selection eszközzel, majd a kiválasztott területen található kijelölt struktúrákat az alábbi prancssort követve analizáltuk: Analyze> Analyze Particles> Show> Masks. A struktúrák számát feljegyeztük a kiértékelési összesítésből és Microsoft Excel-ben összesítettük a különböző mérések eredményeit. Az eredményeket minden esetben az adott sejt méretére normalizáltuk. Ez a következőképpen történt: ha a Myc RNSi klónsejt például 2 anti-Atg8a pöttyöt tartalmazott és a sejt mérete a kontroll sejt 25%-a volt, akkor a normalizált anti-Atg8a pöttyszám 8. Ezek szerint a normalizálás csökkenti a különbséget abban az esetben, ha a klónsejt kisebb, mint a mellette található kontroll sejt. A Myc overexpresszió esetében, amikor a klónsejt jelentősen nagyobb, mint a kontroll sejt, a normalizálás ismételten csökkenti a különbséget a klónsejt és a kontroll sejt között az autofág struktúrák számát tekintve. Annak ellenére, hogy az
75 |
eredményeinket normalizáltuk a sejtméretre, a különbségek szignifikancia szintje minden esetben p<0,01 alatt volt. A sejtméret vizsgálatok során a GFP pozitív zsírtest sejteket körberajzoltuk ImageJ (NIH) szoftverben és feljegyeztük a sejtméretet. Olyan sejteket választottuk, melyek sejtmagja nagyjából a fotózási fókuszsíkban volt található. Ehhez hasonlóan választottuk ki véletlenszerűen a GFP pozitív klónsejt melletti kontrollként szolgáló GFP negatív sejtet is. Egy adatpontot a GFP pozitív és GFP negatív sejt méretének hányadosa szolgáltatott. Abban az esetben, amikor a klónsejt a zsírtest szövet szélén helyezkedett el, a kontroll sejtet is a szövet széléről válsztottunk. A Myc null mutáns esetében 400x400 pixel méretű véletlenszerűen választott területeken vizsgáltuk a Lysotracker pöttyök számát.
Statisztika Az adatsorok statisztikai elemzése SPSS Statistics Version 20 (IBM) szoftver felhasználásával történt. A 4. melléklet tartalmazza az analízis eredményeit. A minták elemszámát (n) - mely a vizsgált állatokat mutatja genotípusonként - ugyancsak a mellékletben tüntettem fel. A mozaik analízisek esetében egy állatból 3 GFP pozitív és az ugyanarról a mikroszkópos felvételről származó kontrollként szolgáló 3 GFP negatív sejtet értékeltem ki. Továbbá egy imaginális szárnydiszkusz valamint egy felnőtt szárny került kiértékelésre állatonként. Az elsődleges adatsorok normalitásának tesztelése után a megfelelő statisztikai teszt alkalmazásával vizsgáltuk az adatsorok közötti eltéréseket. Normál eloszlású adatsorok páros összehasonlítása esetében Student-féle t-teszt, míg nem normál eloszlású adatsorok páros összehasonlítása esetén Mann-Whitney-féle u-teszt alkalmazásával vizsgáltuk az adatsorok közti eltérések szignifikanciáját. Normál eloszlású adatsorok többszörös összehasonlítása esetén ANOVA, míg nem normál eloszlású adatsorok többszörös összehasonlítása esetében Kruskal-Wallis analízis alkalmazásával vizsgáltuk az adatsorok közti eltérés szignifikanciáját. A p<0,01 értékű szignifikáns különbséget (**) jelöli, míg a p<0,05 értékű szignifikáns különbséget (*) jelöli. Néhány esetben a képeken látható box-plotok medián értékeket ábrázolnak, 25%-os interkvartilisekkel illevte maximum és minimum értékekkel. Az oszlopdiagramok átlagértékeket mutatnak szórásokkal kiegészítve. Az időbeli aktiválást mutató görbék átlagértékeket és szórást
76 |
mutatnak. A kísérletek eredményeinek kvantifikálása és statisztikai elemzése is a 4. mellékletben található. Szürke háttér jelzi a nem szignifikáns eltéréseket.
77 |
9. Köszönetnyílvánítás Mindenek előtt rengeteg köszönettel tartozom témavezetőmnek Juhász Gábornak, akitől rendkívül sokat tanultam doktorandusz éveim alatt. A szűk kutatóműhelyi környezetben mutatott egyedülálló professzionalitása és a kutatás folyamán soha nem lankadó lelkesedése, szorgalma és munkához való hozzáállása örök példát mutat számomra. Köszönöm neki állandó támogatását, a mindennapos megbeszélésekre szánt időt és áldozatos munkáját. Köszönöm továbbá, hogy a korábbi szakmai sikerei által elnyert - Magyarországon ritkaságnak számító - Wellcome Trust kutatói pályázatára alapozva lehetővé tette, hogy frissen alapított laborjában töltsem doktorandusz éveimet. Köszönöm Pircs Karolina, Varga Ágnes doktorandusz hallgatótársaim mindennapos munkáját, valamint a teljes genom szűrés két és fél éve alatti türelmét, munka iránti alázatát és szorgalmát. A velük alkotott csapatban öröm dolgozni, melynek során lelkiismeretes és a végletekig pontos munkájukkal nagyban hozzájárultak számos eredmény eléréséhez. Rengeteget tanultam tőlük a csapatmunka összekovácsoló erejéről és az idő leghasznosabb, magas produktivitású kihasználásáról. Ezt is köszönöm nekik! Köszönettel tartozom Pircs Karolinának barátságáért és lojalitásáért. Köszönöm a labor összes további kutatással foglalkozó tagjának Takáts Szabolcsnak, Kárpáti Manuélának, Hegedűs Krisztinának és Varga Katának áldozatos
munkáját.
Külön
köszönöm
Hegedűs
Krisztinának
a
ko-
immunoprecipitációs kísérletek elvégzését, valamint Takáts Szabolcsnak az állandó bíztató szavakat és megbeszéléseket. Köszönöm laborunk technikai asszisztensének Pálfia Saroltának mindenre kiterjedő figyelmes és svájci óra pontosságú mindennapos munkáját. Nélküle nehezen működne laborunk és a sikeres kísérletek kivitelezése is nehezebb lenne. Köszönöm Széplaki Szilvia Drosophila törzsek fenntartásában nyújtott segítségét. Köszönöm Szatmári Zsuzsannának a mindennapos beszélgetéseket valamint a statisztikai analízis elvégzésében nyújtott segítségét. Köszönöm Zvara Ágnesnek, az MTA SZBK kutatójának a microarray és a QTPCR kísérletek elvégzését. Köszönöm Érdi Balázsnak a microarray kísérletek, valamint a Rack1 téma során elvégzett munkáját.
78 |
Köszönöm Sass Miklós tanár úrnak - az Anatómia, Sejt- és Fejlődésbiológiai Tanszék korábbi vezetőjének - a Molekuláris sejt- és neurobiológia Doktori Program vezetésének folyamán elvégzett munkáját. Köszönöm Tom Neufeld, Peter Gallant, Dirk Bohmann, Stefan Marciniak és Mihály József kutatóknak valamint a Vienna Drosophila RNAi Center-nek és a Bloomington Drosophila Stock Center-nek, hogy a kísérletek elvégzéséhez szükséges Drosophila törzseket rendelkezésemre bocsájtották. Köszönettel tartozom feleségemnek Resch Anitának állandó türelméért valamint bíztató szavaiért és kitartásáért. Köszönöm Dávid fiamnak, hogy minden reggel egy hatalmas mosollyal ébreszt.
79 |
10. Mellékletek 1. melléklet Gén neve CG34226 CG7587 Drs CG31698 CG15404 Sgs5 Sgs7 Sgs3 CG34279 Cyp4e3 Sgs8 Sgs1 Eig71Ee Sur-8 CG6770 IM10 CG7224 CG31741 Fbp1 CG13813
FBgn azonosító FBgn0085255 FBgn0038523 FBgn0010381 FBgn0051698 FBgn0031512 FBgn0003375 FBgn0003377 FBgn0003373 FBgn0085308 FBgn0015035 FBgn0003378 FBgn0003372 FBgn0004592 FBgn0038504 FBgn0032400 FBgn0033835 FBgn0031971 FBgn0051741 FBgn0000639 FBgn0036956
fold change 291,897 288,812 266,196 253,998 143,454 142,969 108,494 96,884 81,574 81,075 80,831 75,969 67,142 57,624 45,495 45,254 40,998 40,557 38,317 37,437
p érték 1,494E-03 8,562E-04 9,278E-03 2,277E-03 2,125E-03 7,575E-04 5,815E-03 3,062E-03 1,084E-03 4,758E-04 1,529E-03 3,033E-03 2,833E-03 2,421E-03 9,035E-03 1,688E-03 2,661E-03 5,084E-05 4,754E-04 2,848E-04
p érték2 6,106E-03 8,562E-04 6,434E-03 1,534E-03 3,285E-03 7,575E-04 5,815E-03 3,062E-03 1,155E-03 4,758E-04 1,596E-03 2,858E-03 1,818E-03 2,421E-03 9,035E-03 1,688E-03 2,820E-02 5,641E-05 4,754E-04 2,848E-04
korrigált p érték 4,851E-02 1,873E-02 4,977E-02 2,397E-02 3,489E-02 1,809E-02 4,726E-02 3,370E-02 2,137E-02 1,526E-02 2,448E-02 3,249E-02 2,617E-02 2,980E-02 6,025E-02 2,515E-02 2,123E-03 7,931E-03 1,526E-02 1,285E-02
fold change -56,084 -53,217 -36,965 -36,337 -31,639 -30,387 -23,224 -22,784 -22,107 -21,900 -20,725 -20,171 -19,686 -19,093 -17,407 -17,350 -17,120 -15,500 -14,823 -14,456
p érték 9,392E-04 1,550E-04 2,511E-04 7,359E-08 5,560E-04 9,787E-04 2,727E-04 1,824E-05 5,151E-05 4,386E-04 7,302E-04 5,965E-04 4,953E-04 9,700E-04 3,000E-05 5,084E-04 3,676E-03 8,290E-02 7,428E-04 1,168E-03
p érték2 1,052E-04 1,550E-04 1,958E-04 7,359E-08 5,560E-04 7,894E-04 1,367E-03 1,824E-05 2,060E-05 1,747E-04 3,639E-04 8,956E-04 4,953E-03 9,700E-04 7,783E-05 4,084E-04 1,891E-03 8,750E-02 7,428E-04 1,168E-03
korrigált p érték 9,232E-03 1,047E-02 1,117E-02 2,371E-03 1,618E-02 1,825E-02 2,290E-02 5,937E-03 6,028E-03 1,063E-02 1,395E-02 1,914E-02 4,335E-02 1,995E-02 8,488E-03 1,444E-02 2,669E-02 2,405E-01 1,799E-02 2,146E-02
2. melléklet Gén neve CG31272 CG3523 CG10598 CG15615 CG3348 CG15155 CG4563 CG5278 CG10560 CG1441 CG33110 CG9521 obst-A CG12607 CG15253 CG17290 CG33511 CG12116 CG11659 CG5157
FBgn azonosító FBgn0051272 FBgn0027571 FBgn0003057 FBgn0034159 FBgn0040609 FBgn0032669 FBgn0035006 FBgn0038986 FBgn0039325 FBgn0033464 FBgn0053110 FBgn0030588 FBgn0031097 FBgn0035545 FBgn0028948 FBgn0034201 FBgn0053511 FBgn0030041 FBgn0038731 FBgn0036575
80 |
3. melléklet A 11. ábra, G paneljéhez tartozó nagyobb átnázeti képek. Jól táplált harmadik stádiumú lárvák zsírtestében nincsenek autofág struktúrák (A). Myc overexpresszió hatására (B) viszont negy mennyiségben megtalálhatóak autofagoszómák (ap) és autolizoszómák (al) a zsírtestben.
81 |
4. melléklet A kísérletek kvantifikálásának, statisztikai elemzésének összefoglalása 9. ábra A Myc mutánsban sérült az autofágia. Panel C
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
9A
kontroll
8
28,500
8,877
igen
9B
myc -/-
8
4,500
4,967
igen
3,716E-10
t teszt
p érték
teszt
< 0,000001
u teszt
10. ábra A Myc „program” szükséges a bazális és az éheztetéssel-indukált autofágiához. n
medián
szórás
normalitás
kontroll
7
8,000
2,614
igen
Myc[i]
7
0,000
1,534
nem
kontroll
7
9,000
2,468
igen
Mad↑
7
0,000
3,204
nem
1,000E-06
u teszt
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
6
61,000
28,962
igen
Myc[i]
6
14,992
4,276
igen
3,752E-07
t teszt
kontroll
6
56,500
21,243
igen
Mad↑
6
14,302
2,865
igen
5,454E-08
t teszt
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
7
21,000
12,342
igen
Myc[i]
7
91,768
30,146
nem
< 0,000001
u teszt
kontroll
7
17,000
7,545
igen
Mad↑
7
104,441
44,469
igen
2,006E-08
t teszt
Panel C 10A 10B
Panel F 10D 10E Panel I 10G 10H
82 |
n
medián
szórás
normalitás
kontroll
7
4,000
1,024
nem
Myc[i]
7
10,000
2,989
nem
kontroll
7
4,000
1,261
igen
Mad↑
7
6,000
1,590
Panel J 10G 10H
p érték
teszt
< 0,000001
u teszt
igen
3,009E-04
t teszt
p érték
teszt
< 0,000001
u teszt
< 0,000001
u teszt u teszt
11. ábra A Myc overexpresszió megnöveli a sejtek méretét és autofágiát indukál. n
medián
szórás
normalitás
kontroll
7
0,000
0,814
nem
Myc↑
7
36,764
15,273
igen
kontroll
7
0,000
0,676
nem
Myc↑
7
48,603
16,726
igen
kontroll
7
10,000
7,978
nem
Myc↑
7
51,555
25,213
igen
< 0,000001
Panel G
n
AP% average
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
13
0,000
0,000
nem
Myc(2)↑
13
0,461
0,294
nem
7,173E-05
u teszt
Myc(3)↑
13
0,240
0,310
nem
7,173E-05
u teszt
AL% average
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel E 11B 11C 11D
kontroll
13
0,000
0,000
nem
Myc(2)↑
13
0,548
0,254
nem
1,923E-07
u teszt
Myc(3)↑
13
0,449
0,172
nem
1,923E-07
u teszt
83 |
12. ábra A Myc overexpresszió által indukált autofágia során megnövekszik a lebontás mértéke. Panel E
chloroquine
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
12A
kontroll
-
30,000
0,000
0,914
nem
12B
kontroll
+
15,000
6,000
3,041
nem
< 0,000001
u teszt
12C
Myc↑
-
20,000
24,556
8,309
igen
< 0,000001
u teszt
12D
Myc↑
+
20,000
65,000
17,158
nem p érték
12C
Myc↑
-
20,000
24,556
8,309
yes
12D
Myc↑
+
20,000
65,000
17,158
nem
< 0,000001
u teszt
p érték 12B
kontroll
+
15,000
6,000
3,041
nem
12D
Myc↑
+
20,000
65,000
17,158
nem
< 0,000001
p érték
teszt
u teszt
13. ábra Az autofágia szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a zsírtestben. Panel K
n
medián
szórás
normalitás
11A
Myc↑
11
1,690
0,312
igen
13A
chloroquine,Myc↑
9
1,010
0,064
igen
0,000E+00
ANOVA
13B
FIP200 -/-,Myc↑
8
0,985
0,060
igen
0,000E+00
ANOVA
13C
FIP200[i],Myc↑
9
1,030
0,083
igen
0,000E+00
ANOVA
13D
Atg1[i],Myc↑
9
1,030
0,084
igen
0,000E+00
ANOVA
13E
Atg1[DN],Myc↑
9
0,960
0,123
igen
0,000E+00
ANOVA
13F
Atg9[i],Myc↑
9
1,000
0,129
igen
0,000E+00
ANOVA
13G
Atg18a[i],Myc↑
8
1,075
0,075
igen
0,000E+00
ANOVA
13H
Vps34[DN],Myc↑
9
1,030
0,150
igen
0,000E+00
ANOVA
84 |
13I
Myc[i],Myc↑
9
1,035
0,057
igen
0,000E+00
ANOVA
13J
Mad↑,Myc↑
9
0,950
0,104
igen
0,000E+00
ANOVA
Panel L
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
FIP200[i]
7
1,022
0,068
igen
5,586E-01
t teszt
Atg1[i]
7
1,013
0,034
igen
9,543E-01
t teszt
Atg9[i]
7
1,028
0,060
nem
9,044E-01
u teszt
Atg18a[i]
7
0,991
0,057
igen
9,900E-01
t teszt
Atg1[DN]
7
0,580
0,127
igen
5,09E-03
t teszt
Vps34[DN]
7
0,988
0,038
igen
9,944E-01
t teszt
Myc[i]
7
0,452
0,090
igen
2,384E-09
t teszt
Mad↑
7
0,340
0,116
igen
6,538E-04
t teszt
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel O 12M
Myc2x ↑
15
1,722
0,241
igen
12N
Myc2x ↑ chloroquine
10
1,025
0,083
igen
8,067E-27
t teszt
p érték
teszt
14. ábra Az autofágia szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a szárnyban. Panel E
n
medián
szórás
normalitás
11H
kontroll
25
17,490
1,663
igen
11I
Myc↑
17
20,400
4,073
igen
1,000E-06
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
11I
Myc↑
17
20,400
4,073
igen
14A
Atg1[i],Myc↑
11
16,860
1,786
igen
4,300E-05
ANOVA
14B
FIP200[i],Myc↑
10
16,260
1,822
igen
1,000E-06
ANOVA
85 |
14C
Atg18a[i],Myc↑
10
17,750
2,593
igen
8,800E-05
ANOVA
14D
Vps34[DN],Myc↑
11
17,590
1,620
igen
3,280E-04
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel F 11H
kontroll
13
0,210
0,162
igen
11I
Myc↑
11
1,730
0,952
igen
< 0,000001
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
11I
Myc↑
11
1,730
0,952
igen
14A
Atg1[i],Myc↑
11
0,570
0,144
igen
< 0,000001
ANOVA
14B
FIP200[i],Myc↑
10
0,855
0,363
igen
7,000E-06
ANOVA
14C
Atg18a[i],Myc↑
10
0,600
0,260
igen
< 0,000001
ANOVA
14D
Vps34[DN],Myc↑
11
0,640
0,185
igen
< 0,000001
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel H 14H
kontroll
19
1,160
0,027
igen
14H
Myc↑
25
1,400
0,141
nem
< 0,0001
n
medián
szórás
normalitás
p érték
14H
Myc↑
25
1,400
0,141
nem
14H
Atg1[i],Myc↑
26
1,180
0,077
nem
< 0,0001
14H
FIP200[i],Myc↑
17
1,220
0,064
igen
< 0,0001
14H
Vps34[DN],Myc↑
17
1,120
0,074
igen
< 0,0001
14H
Atg18a[i],Myc↑
20
1,250
0,073
igen
< 0,0001
14H
Atg8a -/-;Myc↑
24
1,280
0,059
igen
< 0,0001
KruskalWallis teszt KruskalWallis KruskalWallis KruskalWallis KruskalWallis KruskalWallis
86 |
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt t teszt
14H
Atg8a -/-;Myc↑
24
1,280
0,059
igen
14H
Atg8a -/-;mCherry-Atg8a;Myc↑
16
1,580
0,096
igen
8,52026E-11
Panel I
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
19
1,160
0,027
igen
Atg1[i]
18
1,200
0,112
igen
2,496E-01
ANOVA
FIP200[i]
13
1,190
0,100
igen
8,433E-01
ANOVA
Vps34[DN]
19
1,180
0,033
igen
9,994E-01
ANOVA
Atg18a[i]
21
1,260
0,107
igen
1,569E-03
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
7
27,000
8,382
igen
Myc↑
7
77,207
25,208
igen
2,425E-10
t teszt
p érték
teszt
16. ábra A Myc overexpresszió következtében p62 és ubiquitinált fehérjék halmozódnak fel, és aktiválódik az antioxidáns válasz. Panel A 16A
17. ábra Az antioxidáns válasz az autofágiával párhuzamosan szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a zsírtestben. Panel P
n
medián
szórás
normalitás
11A
Myc↑
11
1,690
0,312
igen
17A
p62[i1],Myc↑
9
0,960
0,079
igen
0,000E+00
ANOVA
17B
p62[i2],Myc↑
9
1,040
0,066
igen
0,000E+00
ANOVA
17C
p62[i3],Myc↑
9
0,990
0,083
igen
0,000E+00
ANOVA
17D
cnc[i1],Myc↑
9
0,991
0,063
igen
0,000E+00
ANOVA
87 |
17E
cnc[i2],Myc↑
9
1,040
0,056
igen
0,000E+00
ANOVA
17F
cnc[i3],Myc↑
8
1,110
0,126
igen
0,000E+00
ANOVA
17G
Maf[i],Myc↑
8
1,035
0,051
igen
0,000E+00
ANOVA
17H
Keap1↑1,Myc↑
9
1,030
0,107
nem
0,000E+00
u teszt
17I
Keap1↑2,Myc↑
8
1,030
0,083
igen
0,000E+00
ANOVA
17J
Keap1[i1],Myc↑
9
1,610
0,156
igen
8,732E-02
ANOVA
17K
p62[i3],Keap1[i2],Myc↑
9
1,600
0,260
igen
5,485E-01
ANOVA
17L
cnc↑,Myc↑
8
1,520
0,210
igen
9,130E-04
ANOVA
17M
cnc↑,p62[i1],Myc↑
9
1,562
0,279
igen
1,000E+00
ANOVA
17N
cnc↑,FIP200[i],Myc↑
8
1,039
0,081
igen
0,000E+00
ANOVA
17O
cnc↑,Vps34[DN],Myc↑
9
1,040
0,083
igen
0,000E+00
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
17C
p62[i3],Myc↑
9
1,005
0,144
igen
17K
p62[i3],Keap1[i2],Myc↑
9
1,610
0,284
igen
0,000E+00
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt ANOVA
15A
p62[i1],Myc↑
9
0,940
0,075
igen
15M
cnc↑,p62[i1],Myc↑
9
1,785
0,352
igen
0,000E+00
Panel Q
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
p62[i1]
7
1,015
0,077
igen
9,97E-01
t teszt
p62[i2]
7
0,996
0,068
igen
9,61E-01
t teszt
p62[i3]
7
0,986
0,051
igen
8,55E-01
t teszt
cnc[i1]
7
1,036
0,049
igen
7,273E-01
t teszt
cnc[i2]
7
0,989
0,047
igen
9,55E-01
t teszt
cnc[i3]
7
1,026
0,082
nem
8,754E-01
u teszt
cnc↑
7
1,005
0,045
igen
9,75E-01
t teszt
88 |
Maf[i]
7
0,981
0,047
igen
9,964E-01
t teszt
Keap1[i1]
7
0,984
0,060
igen
8,92E-01
t teszt
Keap1[i2]
7
0,990
0,062
igen
9,70E-01
t teszt
Keap1↑1
7
0,974
0,067
igen
8,687E-01
t teszt
Keap1↑2
7
1,008
0,044
igen
9,21E-01
t teszt
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
18. ábra A p62 és az antioxidáns válasz szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez a szárnyban. Panel D 11H
kontroll
25
17,490
1,663
igen
11I
Myc↑
17
20,400
4,073
igen
4,108E-06
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
11I
Myc↑
17
20,400
4,073
igen
18A
p62[i1],Myc↑
10
14,925
2,227
nem
3,906E-05
u teszt
18B
cnc[i1],Myc↑
10
15,950
1,317
igen
2,350E-06
ANOVA
18C
Keap1↑1,Myc↑
13
17,446
2,758
igen
6,336E-05
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel E 11H
kontroll
13
0,210
0,162
igen
11I
Myc↑
11
1,730
0,952
igen
0,000E+00
ANOVA
18A
p62[i1],Myc↑
10
1,840
0,393
igen
0,000E+00
ANOVA
18B
cnc[i1],Myc↑
10
2,100
0,402
igen
0,000E+00
ANOVA
18C
Keap1↑1,Myc↑
13
1,954
0,394
igen
0,000E+00
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
1,000E+00
ANOVA
11I
Myc↑
11
1,730
0,952
igen
18A
p62[i1],Myc↑
10
1,840
0,393
igen
89 |
18B
cnc[i1],Myc↑
10
2,100
0,402
igen
9,998E-01
ANOVA
18C
Keap1↑1,Myc↑
13
1,954
0,394
igen
1,000E+00
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel F 18F
kontroll
19
1,160
0,027
igen
18F
Myc↑
25
1,400
0,141
nem
< 0,0001
n
medián
szórás
normalitás
p érték
KruskalWallis teszt
18F
Myc↑
25
1,400
0,141
nem
18F
p62[i1],Myc↑
12
1,217
0,132
igen
6,510E-03
18F
Keap1↑1,Myc↑
16
1,104
0,055
igen
< 0,0001
18F
cnc[i1],Myc↑
13
1,240
0,116
igen
3,993E-04
18F
Keap1[i1],p62[i2],Myc↑
8
1,376
0,039
igen
9,981E-01
18F
cnc↑,p62[i1],Myc↑
14
1,402
0,101
nem
9,947E-01
n
medián
szórás
normalitás
p érték
KruskalWallis KruskalWallis KruskalWallis KruskalWallis KruskalWallis teszt
18F
p62[i1],Myc↑
12
1,217
0,132
igen
18F
Keap1[i1],p62[i2],Myc↑
8
1,376
0,039
igen
1,628E-03
t teszt
18F
cnc↑,p62[i1],Myc↑
14
1,402
0,101
nem
8,116E-11
u teszt
Panel G
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
19
1,160
0,027
igen
p62[i1]
19
1,179
0,032
igen
9,987E-01
ANOVA
cnc[i1]
15
1,163
0,024
igen
1,000E+00
ANOVA
Keap1↑1
14
1,118
0,051
nem
7,065E-01
u teszt
90 |
cnc↑
12
1,118
0,042
igen
1,887E-02
ANOVA
Keap1[i1]
15
1,137
0,048
igen
9,581E-03
ANOVA
p62[i2]
14
1,128
0,024
igen
3,336E-01
ANOVA
19. ábra A Myc overexpresszió által indukált autofágia és antioxidáns válasz aktiválódásának kinetikája. Panel A
eltelt órák az indukció után
4
8
12
18
kontroll
n
12
12
12
12
átlag
0,155
0,220
0,171
0,212
szórás
0,364
0,416
0,379
0,411
normalitás
nem
nem
nem
nem
n
12
12
12
12
átlag
0,189
0,705
16,604
24,603
szórás
0,393
1,953
15,380
20,772
normalitás
nem
nem
nem
nem
p érték
1,000E+00
1,000E+00
< 0,0001
< 0,0001
Myc↑
teszt
Kruskal-Wallis Kruskal-Wallis Kruskal-Wallis Kruskal-Wallis
Panel B
eltelt órák az indukció után
4
8
12
18
kontroll
n
10
10
10
10
átlag
111,368
94,875
118,474
121,038
szórás
21,518
24,622
20,713
26,328
normalitás
igen
igen
igen
igen
n
10
10
10
10
átlag
115,972
108,242
197,822
223,152
szórás
21,220
23,330
35,273
30,721
Myc↑
91 |
normalitás
igen
igen
igen
igen
p érték
1,000E+00
4,307E-01
0,000E+00
0,000E+00
teszt
ANOVA
ANOVA
ANOVA
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
kontroll
8
0,000
0,000
nem
PERK↑
8
101,490
12,902
igen
kontroll
7
0,000
0,000
nem
PERK↑
7
34,425
10,309
21. ábra A PERK overexpresszió indukálja az autofágiát. Panel C 21A 21B
p érték
teszt
< 0,000001
u teszt
igen
< 0,000001
u teszt
p érték
teszt
22. ábra Az UPR által aktivált PERK útvonal szükséges a Myc-indukált sejtnövekedéshez. Panel C
n
medián
szórás
normalitás
11A
Myc↑
11
1,690
0,312
igen
22A
PERK[i],Myc↑
9
1,0477
0,062
igen
0,000E+00
ANOVA
22B
Gadd34↑,Myc↑
9
1,0180
0,079
igen
0,000E+00
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel F 11H
kontroll
25
17,490
1,663
igen
11I
Myc↑
17
20,400
4,073
igen
2,000E-06
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
11I
Myc↑
17
20,400
4,073
igen
22D
PERK[i],Myc↑
10
16,151
1,356
igen
2,000E-06
ANOVA
22E
Gadd34↑,Myc↑
10
15,934
1,431
igen
2,000E-06
ANOVA
92 |
Panel G
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
11H
kontroll
13
0,210
0,162
igen
11I
Myc↑
11
1,730
0,952
igen
< 0,000001
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
11I
Myc↑
11
1,730
0,952
igen
22D
PERK[i],Myc↑
10
0,680
0,138
igen
4,000E-06
ANOVA
22E
Gadd34↑,Myc↑
10
0,873
0,154
igen
6,100E-05
ANOVA
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
Panel H 22H
kontroll
19
1,160
0,027
igen
22H
Myc↑
25
1,400
0,141
nem
< 0,0001
n
medián
szórás
normalitás
p érték
22H
Myc↑
25
1,400
0,141
nem
22H
PERK[i],Myc↑
23
1,107
0,046
igen
< 0,000001
22H
Gadd34↑,Myc↑
20
1,126
0,042
igen
< 0,000001
Panel I
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
PERK[i]
7
1,010
0,067
igen
9,880E-01
t teszt
Gadd34↑
7
0,978
0,051
igen
9,211E-01
t teszt
Panel J
n
medián
szórás
normalitás
p érték
teszt
kontroll
19
1,160
0,027
igen
PERK[i]
12
1,137
0,019
igen
6,748E-03
ANOVA
Gadd34↑
12
1,119
0,014
igen
1,020E-04
ANOVA
KruskalWallis teszt KruskalWallis KruskalWallis
93 |
11. Referenciák Abeliovich, H., W. A. Dunn, Jr., J. Kim and D. J. Klionsky (2000). "Dissection of autophagosome biogenesis into distinct nucleation and expansion steps." J Cell Biol 151(5): 1025-1034. Aita, V. M., X. H. Liang, V. V. Murty, D. L. Pincus, W. Yu, E. Cayanis, S. Kalachikov, T. C. Gilliam and B. Levine (1999). "Cloning and genomic organization of beclin 1, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 17q21." Genomics 59(1): 59-65. Alers, S., A. S. Loffler, S. Wesselborg and B. Stork (2012). "Role of AMPK-mTOR-Ulk1/2 in the regulation of autophagy: cross talk, shortcuts, and feedbacks." Mol Cell Biol 32(1): 211. Amaravadi, R. K., D. Yu, J. J. Lum, T. Bui, M. A. Christophorou, G. I. Evan, A. Thomas-Tikhonenko and C. B. Thompson (2007). "Autophagy inhibition enhances therapy-induced apoptosis in a Myc-induced model of lymphoma." J Clin Invest 117(2): 326-336. Augenlicht, L. H., S. Wadler, G. Corner, C. Richards, L. Ryan, A. S. Multani, S. Pathak, A. Benson, D. Haller and B. G. Heerdt (1997). "Low-level c-myc amplification in human colonic carcinoma cell lines and tumors: a frequent, p53-independent mutation associated with improved outcome in a randomized multi-institutional trial." Cancer Res 57(9): 1769-1775. Avruch, J., K. Hara, Y. Lin, M. Liu, X. Long, S. Ortiz-Vega and K. Yonezawa (2006). "Insulin and amino-acid regulation of mTOR signaling and kinase activity through the Rheb GTPase." Oncogene 25(48): 6361-6372. Axe, E. L., S. A. Walker, M. Manifava, P. Chandra, H. L. Roderick, A. Habermann, G. Griffiths and N. T. Ktistakis (2008). "Autophagosome formation from membrane compartments enriched in phosphatidylinositol 3-phosphate and dynamically connected to the endoplasmic reticulum." J Cell Biol 182(4): 685-701. Bagasra, O. and K. R. Prilliman (2004). "RNA interference: the molecular immune system." J Mol Histol 35(6): 545-553. Becker, T., G. Loch, M. Beyer, I. Zinke, A. C. Aschenbrenner, P. Carrera, T. Inhester, J. L. Schultze and M. Hoch (2010). "FOXO-dependent regulation of innate immune homeostasis." Nature 463(7279): 369-373. Bellosta, P. and P. Gallant (2010). "Myc Function in Drosophila." Genes Cancer 1(6): 542-546. Booker, M., A. A. Samsonova, Y. Kwon, I. Flockhart, S. E. Mohr and N. Perrimon (2011). "False negative rates in Drosophila cell-based RNAi screens: a case study." BMC Genomics 12: 50. Bristol, M. L., S. M. Emery, P. Maycotte, A. Thorburn, S. Chakradeo and D. A. Gewirtz (2013). "Autophagy inhibition for chemosensitization and radiosensitization in cancer: do the preclinical data support this therapeutic strategy?" J Pharmacol Exp Ther. Cao, C., T. Subhawong, J. M. Albert, K. W. Kim, L. Geng, K. R. Sekhar, Y. J. Gi and B. Lu (2006). "Inhibition of mammalian target of rapamycin or apoptotic pathway induces autophagy and radiosensitizes PTEN null prostate cancer cells." Cancer Res 66(20): 10040-10047. Cao, Y. and D. J. Klionsky (2007). "Physiological functions of Atg6/Beclin 1: a unique autophagyrelated protein." Cell Res 17(10): 839-849. Cerutti, H. and J. A. Casas-Mollano (2006). "On the origin and functions of RNA-mediated silencing: from protists to man." Curr Genet 50(2): 81-99. Chan, E. Y. (2009). "mTORC1 phosphorylates the ULK1-mAtg13-FIP200 autophagy regulatory complex." Sci Signal 2(84): pe51. Chana, J. S., R. Grover, G. D. Wilson, D. A. Hudson, M. Forders, R. Sanders and A. O. Grobbelaar (2001). "The prognostic importance of c-myc oncogene expression in head and neck melanoma." Ann Plast Surg 47(2): 172-177.
94 |
Chen, Y. and D. J. Klionsky (2011). "The regulation of autophagy - unanswered questions." J Cell Sci 124(Pt 2): 161-170. Cheong, H., C. Lu, T. Lindsten and C. B. Thompson (2012). "Therapeutic targets in cancer cell metabolism and autophagy." Nat Biotechnol 30(7): 671-678. Dang, C. V., K. A. O'Donnell, K. I. Zeller, T. Nguyen, R. C. Osthus and F. Li (2006). "The c-Myc target gene network." Semin Cancer Biol 16(4): 253-264. DeNicola, G. M., F. A. Karreth, T. J. Humpton, A. Gopinathan, C. Wei, K. Frese, D. Mangal, K. H. Yu, C. J. Yeo, E. S. Calhoun, F. Scrimieri, J. M. Winter, R. H. Hruban, C. IacobuzioDonahue, S. E. Kern, I. A. Blair and D. A. Tuveson (2011). "Oncogene-induced Nrf2 transcription promotes ROS detoxification and tumorigenesis." Nature 475(7354): 106109. Dietzl, G., D. Chen, F. Schnorrer, K. C. Su, Y. Barinova, M. Fellner, B. Gasser, K. Kinsey, S. Oppel, S. Scheiblauer, A. Couto, V. Marra, K. Keleman and B. J. Dickson (2007). "A genomewide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila." Nature 448(7150): 151-156. Doe, M. R., J. M. Ascano, M. Kaur and M. D. Cole (2012). "Myc posttranscriptionally induces HIF1 protein and target gene expression in normal and cancer cells." Cancer Res 72(4): 949-957. Duffy, J. B. (2002). "GAL4 system in Drosophila: a fly geneticist's Swiss army knife." Genesis 34(1-2): 1-15. Efeyan, A., R. Zoncu, S. Chang, I. Gumper, H. Snitkin, R. L. Wolfson, O. Kirak, D. D. Sabatini and D. M. Sabatini (2013). "Regulation of mTORC1 by the Rag GTPases is necessary for neonatal autophagy and survival." Nature 493(7434): 679-683. Eilers, M. and R. N. Eisenman (2008). "Myc's broad reach." Genes Dev 22(20): 2755-2766. Erdi, B., P. Nagy, A. Zvara, A. Varga, K. Pircs, D. Menesi, L. G. Puskas and G. Juhasz (2012). "Loss of the starvation-induced gene Rack1 leads to glycogen deficiency and impaired autophagic responses in Drosophila." Autophagy 8(7): 1124-1135. Evangelisti, C., F. Ricci, P. Tazzari, F. Chiarini, M. Battistelli, E. Falcieri, A. Ognibene, P. Pagliaro, L. Cocco, J. A. McCubrey and A. M. Martelli (2011). "Preclinical testing of the Akt inhibitor triciribine in T-cell acute lymphoblastic leukemia." J Cell Physiol 226(3): 822831. Filimonenko, M., P. Isakson, K. D. Finley, M. Anderson, H. Jeong, T. J. Melia, B. J. Bartlett, K. M. Myers, H. C. Birkeland, T. Lamark, D. Krainc, A. Brech, H. Stenmark, A. Simonsen and A. Yamamoto (2010). "The selective macroautophagic degradation of aggregated proteins requires the PI3P-binding protein Alfy." Mol Cell 38(2): 265-279. Foley, K. P., G. A. McArthur, C. Queva, P. J. Hurlin, P. Soriano and R. N. Eisenman (1998). "Targeted disruption of the MYC antagonist MAD1 inhibits cell cycle exit during granulocyte differentiation." EMBO J 17(3): 774-785. Fujioka, Y., N. N. Noda, H. Nakatogawa, Y. Ohsumi and F. Inagaki (2010). "Dimeric coiled-coil structure of Saccharomyces cerevisiae Atg16 and its functional significance in autophagy." J Biol Chem 285(2): 1508-1515. Fujita, N., M. Hayashi-Nishino, H. Fukumoto, H. Omori, A. Yamamoto, T. Noda and T. Yoshimori (2008). "An Atg4B mutant hampers the lipidation of LC3 paralogues and causes defects in autophagosome closure." Mol Biol Cell 19(11): 4651-4659. Geng, J. and D. J. Klionsky (2008). "The Atg8 and Atg12 ubiquitin-like conjugation systems in macroautophagy. 'Protein modifications: beyond the usual suspects' review series." EMBO Rep 9(9): 859-864. Guruharsha, K. G., J. F. Rual, B. Zhai, J. Mintseris, P. Vaidya, N. Vaidya, C. Beekman, C. Wong, D. Y. Rhee, O. Cenaj, E. McKillip, S. Shah, M. Stapleton, K. H. Wan, C. Yu, B. Parsa, J. W. Carlson, X. Chen, B. Kapadia, K. VijayRaghavan, S. P. Gygi, S. E. Celniker, R. A. Obar and S. Artavanis-Tsakonas (2011). "A protein complex network of Drosophila melanogaster." Cell 147(3): 690-703. 95 |
Hailey, D. W., A. S. Rambold, P. Satpute-Krishnan, K. Mitra, R. Sougrat, P. K. Kim and J. Lippincott-Schwartz (2010). "Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation." Cell 141(4): 656-667. Hanada, T., N. N. Noda, Y. Satomi, Y. Ichimura, Y. Fujioka, T. Takao, F. Inagaki and Y. Ohsumi (2007). "The Atg12-Atg5 conjugate has a novel E3-like activity for protein lipidation in autophagy." J Biol Chem 282(52): 37298-37302. Hara, T., A. Ooi, M. Kobayashi, M. Mai, K. Yanagihara and I. Nakanishi (1998). "Amplification of c-myc, K-sam, and c-met in gastric cancers: detection by fluorescence in situ hybridization." Lab Invest 78(9): 1143-1153. Harding, T. M., A. Hefner-Gravink, M. Thumm and D. J. Klionsky (1996). "Genetic and phenotypic overlap between autophagy and the cytoplasm to vacuole protein targeting pathway." J Biol Chem 271(30): 17621-17624. Harding, T. M., K. A. Morano, S. V. Scott and D. J. Klionsky (1995). "Isolation and characterization of yeast mutants in the cytoplasm to vacuole protein targeting pathway." J Cell Biol 131(3): 591-602. Hart, L. S., J. T. Cunningham, T. Datta, S. Dey, F. Tameire, S. L. Lehman, B. Qiu, H. Zhang, G. Cerniglia, M. Bi, Y. Li, Y. Gao, H. Liu, C. Li, A. Maity, A. Thomas-Tikhonenko, A. E. Perl, A. Koong, S. Y. Fuchs, J. A. Diehl, I. G. Mills, D. Ruggero and C. Koumenis (2012). "ER stress-mediated autophagy promotes Myc-dependent transformation and tumor growth." J Clin Invest 122(12): 4621-4634. Hosokawa, N., T. Sasaki, S. Iemura, T. Natsume, T. Hara and N. Mizushima (2009). "Atg101, a novel mammalian autophagy protein interacting with Atg13." Autophagy 5(7): 973979. Hulf, T., P. Bellosta, M. Furrer, D. Steiger, D. Svensson, A. Barbour and P. Gallant (2005). "Whole-genome analysis reveals a strong positional bias of conserved dMycdependent E-boxes." Mol Cell Biol 25(9): 3401-3410. Hutchins, M. U. and D. J. Klionsky (2001). "Vacuolar localization of oligomeric alphamannosidase requires the cytoplasm to vacuole targeting and autophagy pathway components in Saccharomyces cerevisiae." J Biol Chem 276(23): 20491-20498. Ichimura, Y. and M. Komatsu (2010). "Selective degradation of p62 by autophagy." Semin Immunopathol 32(4): 431-436. Inoki, K., J. Kim and K. L. Guan (2012). "AMPK and mTOR in cellular energy homeostasis and drug targets." Annu Rev Pharmacol Toxicol 52: 381-400. Itakura, E. and N. Mizushima (2010). "Characterization of autophagosome formation site by a hierarchical analysis of mammalian Atg proteins." Autophagy 6(6): 764-776. Itakura, E. and N. Mizushima (2011). "p62 Targeting to the autophagosome formation site requires self-oligomerization but not LC3 binding." J Cell Biol 192(1): 17-27. Jain, A., T. Lamark, E. Sjottem, K. B. Larsen, J. A. Awuh, A. Overvatn, M. McMahon, J. D. Hayes and T. Johansen (2010). "p62/SQSTM1 is a target gene for transcription factor NRF2 and creates a positive feedback loop by inducing antioxidant response element-driven gene transcription." J Biol Chem 285(29): 22576-22591. Jastrzebski, K., K. M. Hannan, E. B. Tchoubrieva, R. D. Hannan and R. B. Pearson (2007). "Coordinate regulation of ribosome biogenesis and function by the ribosomal protein S6 kinase, a key mediator of mTOR function." Growth Factors 25(4): 209-226. Jewell, J. L. and K. L. Guan (2013). "Nutrient signaling to mTOR and cell growth." Trends Biochem Sci 38(5): 233-242. Johansen, T. and T. Lamark (2011). "Selective autophagy mediated by autophagic adapter proteins." Autophagy 7(3): 279-296. Jorgensen, P. and M. Tyers (2004). "How cells coordinate growth and division." Curr Biol 14(23): R1014-1027.
96 |
Juhasz, G., B. Erdi, M. Sass and T. P. Neufeld (2007). "Atg7-dependent autophagy promotes neuronal health, stress tolerance, and longevity but is dispensable for metamorphosis in Drosophila." Genes Dev 21(23): 3061-3066. Juhasz, G., J. H. Hill, Y. Yan, M. Sass, E. H. Baehrecke, J. M. Backer and T. P. Neufeld (2008). "The class III PI(3)K Vps34 promotes autophagy and endocytosis but not TOR signaling in Drosophila." J Cell Biol 181(4): 655-666. Juhasz, G., L. G. Puskas, O. Komonyi, B. Erdi, P. Maroy, T. P. Neufeld and M. Sass (2007). "Gene expression profiling identifies FKBP39 as an inhibitor of autophagy in larval Drosophila fat body." Cell Death Differ 14(6): 1181-1190. Kabeya, Y., N. Mizushima, A. Yamamoto, S. Oshitani-Okamoto, Y. Ohsumi and T. Yoshimori (2004). "LC3, GABARAP and GATE16 localize to autophagosomal membrane depending on form-II formation." J Cell Sci 117(Pt 13): 2805-2812. Kakuta, S., H. Yamamoto, L. Negishi, C. Kondo-Kakuta, N. Hayashi and Y. Ohsumi (2012). "Atg9 vesicles recruit vesicle-tethering proteins Trs85 and Ypt1 to the autophagosome formation site." J Biol Chem 287(53): 44261-44269. Kaltz-Wittmer, C., U. Klenk, A. Glaessgen, D. E. Aust, J. Diebold, U. Lohrs and G. B. Baretton (2000). "FISH analysis of gene aberrations (MYC, CCND1, ERBB2, RB, and AR) in advanced prostatic carcinomas before and after androgen deprivation therapy." Lab Invest 80(9): 1455-1464. Klionsky, D. J., F. C. Abdalla, H. Abeliovich, R. T. Abraham, A. Acevedo-Arozena, K. Adeli, L. Agholme, M. Agnello, P. Agostinis, J. A. Aguirre-Ghiso, H. J. Ahn, O. Ait-Mohamed, S. Ait-Si-Ali, T. Akematsu, S. Akira, H. M. Al-Younes, M. A. Al-Zeer, M. L. Albert, R. L. Albin, J. Alegre-Abarrategui, M. F. Aleo, M. Alirezaei, A. Almasan, M. Almonte-Becerril, A. Amano, R. Amaravadi, S. Amarnath, A. O. Amer, N. Andrieu-Abadie, V. Anantharam, D. K. Ann, S. Anoopkumar-Dukie, H. Aoki, N. Apostolova, G. Arancia, J. P. Aris, K. Asanuma, N. Y. Asare, H. Ashida, V. Askanas, D. S. Askew, P. Auberger, M. Baba, S. K. Backues, E. H. Baehrecke, B. A. Bahr, X. Y. Bai, Y. Bailly, R. Baiocchi, G. Baldini, W. Balduini, A. Ballabio, B. A. Bamber, E. T. Bampton, G. Banhegyi, C. R. Bartholomew, D. C. Bassham, R. C. Bast, Jr., H. Batoko, B. H. Bay, I. Beau, D. M. Bechet, T. J. Begley, C. Behl, C. Behrends, S. Bekri, B. Bellaire, L. J. Bendall, L. Benetti, L. Berliocchi, H. Bernardi, F. Bernassola, S. Besteiro, I. Bhatia-Kissova, X. Bi, M. Biard-Piechaczyk, J. S. Blum, L. H. Boise, P. Bonaldo, D. L. Boone, B. C. Bornhauser, K. R. Bortoluci, I. Bossis, F. Bost, J. P. Bourquin, P. Boya, M. Boyer-Guittaut, P. V. Bozhkov, N. R. Brady, C. Brancolini, A. Brech, J. E. Brenman, A. Brennand, E. H. Bresnick, P. Brest, D. Bridges, M. L. Bristol, P. S. Brookes, E. J. Brown, J. H. Brumell, N. Brunetti-Pierri, U. T. Brunk, D. E. Bulman, S. J. Bultman, G. Bultynck, L. F. Burbulla, W. Bursch, J. P. Butchar, W. Buzgariu, S. P. Bydlowski, K. Cadwell, M. Cahova, D. Cai, J. Cai, Q. Cai, B. Calabretta, J. CalvoGarrido, N. Camougrand, M. Campanella, J. Campos-Salinas, E. Candi, L. Cao, A. B. Caplan, S. R. Carding, S. M. Cardoso, J. S. Carew, C. R. Carlin, V. Carmignac, L. A. Carneiro, S. Carra, R. A. Caruso, G. Casari, C. Casas, R. Castino, E. Cebollero, F. Cecconi, J. Celli, H. Chaachouay, H. J. Chae, C. Y. Chai, D. C. Chan, E. Y. Chan, R. C. Chang, C. M. Che, C. C. Chen, G. C. Chen, G. Q. Chen, M. Chen, Q. Chen, S. S. Chen, W. Chen, X. Chen, Y. G. Chen, Y. Chen, Y. J. Chen, Z. Chen, A. Cheng, C. H. Cheng, Y. Cheng, H. Cheong, J. H. Cheong, S. Cherry, R. Chess-Williams, Z. H. Cheung, E. Chevet, H. L. Chiang, R. Chiarelli, T. Chiba, L. S. Chin, S. H. Chiou, F. V. Chisari, C. H. Cho, D. H. Cho, A. M. Choi, D. Choi, K. S. Choi, M. E. Choi, S. Chouaib, D. Choubey, V. Choubey, C. T. Chu, T. H. Chuang, S. H. Chueh, T. Chun, Y. J. Chwae, M. L. Chye, R. Ciarcia, M. R. Ciriolo, M. J. Clague, R. S. Clark, P. G. Clarke, R. Clarke, P. Codogno, H. A. Coller, M. I. Colombo, S. Comincini, M. Condello, F. Condorelli, M. R. Cookson, G. H. Coombs, I. Coppens, R. Corbalan, P. Cossart, P. Costelli, S. Costes, A. Coto-Montes, E. Couve, F. P. Coxon, J. M. Cregg, J. L. Crespo, M. J. Cronje, A. M. Cuervo, J. J. Cullen, M. J. Czaja, M. D'Amelio, A. Darfeuille-Michaud, L. M. Davids, F. E. Davies, M. De Felici, J. F. de Groot, C. A. de 97 |
Haan, L. De Martino, A. De Milito, V. De Tata, J. Debnath, A. Degterev, B. Dehay, L. M. Delbridge, F. Demarchi, Y. Z. Deng, J. Dengjel, P. Dent, D. Denton, V. Deretic, S. D. Desai, R. J. Devenish, M. Di Gioacchino, G. Di Paolo, C. Di Pietro, G. Diaz-Araya, I. DiazLaviada, M. T. Diaz-Meco, J. Diaz-Nido, I. Dikic, S. P. Dinesh-Kumar, W. X. Ding, C. W. Distelhorst, A. Diwan, M. Djavaheri-Mergny, S. Dokudovskaya, Z. Dong, F. C. Dorsey, V. Dosenko, J. J. Dowling, S. Doxsey, M. Dreux, M. E. Drew, Q. Duan, M. A. Duchosal, K. Duff, I. Dugail, M. Durbeej, M. Duszenko, C. L. Edelstein, A. L. Edinger, G. Egea, L. Eichinger, N. T. Eissa, S. Ekmekcioglu, W. S. El-Deiry, Z. Elazar, M. Elgendy, L. M. Ellerby, K. E. Eng, A. M. Engelbrecht, S. Engelender, J. Erenpreisa, R. Escalante, A. Esclatine, E. L. Eskelinen, L. Espert, V. Espina, H. Fan, J. Fan, Q. W. Fan, Z. Fan, S. Fang, Y. Fang, M. Fanto, A. Fanzani, T. Farkas, J. C. Farre, M. Faure, M. Fechheimer, C. G. Feng, J. Feng, Q. Feng, Y. Feng, L. Fesus, R. Feuer, M. E. Figueiredo-Pereira, G. M. Fimia, D. C. Fingar, S. Finkbeiner, T. Finkel, K. D. Finley, F. Fiorito, E. A. Fisher, P. B. Fisher, M. Flajolet, M. L. Florez-McClure, S. Florio, E. A. Fon, F. Fornai, F. Fortunato, R. Fotedar, D. H. Fowler, H. S. Fox, R. Franco, L. B. Frankel, M. Fransen, J. M. Fuentes, J. Fueyo, J. Fujii, K. Fujisaki, E. Fujita, M. Fukuda, R. H. Furukawa, M. Gaestel, P. Gailly, M. Gajewska, B. Galliot, V. Galy, S. Ganesh, B. Ganetzky, I. G. Ganley, F. B. Gao, G. F. Gao, J. Gao, L. Garcia, G. Garcia-Manero, M. Garcia-Marcos, M. Garmyn, A. L. Gartel, E. Gatti, M. Gautel, T. R. Gawriluk, M. E. Gegg, J. Geng, M. Germain, J. E. Gestwicki, D. A. Gewirtz, S. Ghavami, P. Ghosh, A. M. Giammarioli, A. N. Giatromanolaki, S. B. Gibson, R. W. Gilkerson, M. L. Ginger, H. N. Ginsberg, J. Golab, M. S. Goligorsky, P. Golstein, C. Gomez-Manzano, E. Goncu, C. Gongora, C. D. Gonzalez, R. Gonzalez, C. Gonzalez-Estevez, R. A. GonzalezPolo, E. Gonzalez-Rey, N. V. Gorbunov, S. Gorski, S. Goruppi, R. A. Gottlieb, D. Gozuacik, G. E. Granato, G. D. Grant, K. N. Green, A. Gregorc, F. Gros, C. Grose, T. W. Grunt, P. Gual, J. L. Guan, K. L. Guan, S. M. Guichard, A. S. Gukovskaya, I. Gukovsky, J. Gunst, A. B. Gustafsson, A. J. Halayko, A. N. Hale, S. K. Halonen, M. Hamasaki, F. Han, T. Han, M. K. Hancock, M. Hansen, H. Harada, M. Harada, S. E. Hardt, J. W. Harper, A. L. Harris, J. Harris, S. D. Harris, M. Hashimoto, J. A. Haspel, S. Hayashi, L. A. Hazelhurst, C. He, Y. W. He, M. J. Hebert, K. A. Heidenreich, M. H. Helfrich, G. V. Helgason, E. P. Henske, B. Herman, P. K. Herman, C. Hetz, S. Hilfiker, J. A. Hill, L. J. Hocking, P. Hofman, T. G. Hofmann, J. Hohfeld, T. L. Holyoake, M. H. Hong, D. A. Hood, G. S. Hotamisligil, E. J. Houwerzijl, M. Hoyer-Hansen, B. Hu, C. A. Hu, H. M. Hu, Y. Hua, C. Huang, J. Huang, S. Huang, W. P. Huang, T. B. Huber, W. K. Huh, T. H. Hung, T. R. Hupp, G. M. Hur, J. B. Hurley, S. N. Hussain, P. J. Hussey, J. J. Hwang, S. Hwang, A. Ichihara, S. Ilkhanizadeh, K. Inoki, T. Into, V. Iovane, J. L. Iovanna, N. Y. Ip, Y. Isaka, H. Ishida, C. Isidoro, K. Isobe, A. Iwasaki, M. Izquierdo, Y. Izumi, P. M. Jaakkola, M. Jaattela, G. R. Jackson, W. T. Jackson, B. Janji, M. Jendrach, J. H. Jeon, E. B. Jeung, H. Jiang, J. X. Jiang, M. Jiang, Q. Jiang, X. Jiang, A. Jimenez, M. Jin, S. Jin, C. O. Joe, T. Johansen, D. E. Johnson, G. V. Johnson, N. L. Jones, B. Joseph, S. K. Joseph, A. M. Joubert, G. Juhasz, L. Juillerat-Jeanneret, C. H. Jung, Y. K. Jung, K. Kaarniranta, A. Kaasik, T. Kabuta, M. Kadowaki, K. Kagedal, Y. Kamada, V. O. Kaminskyy, H. H. Kampinga, H. Kanamori, C. Kang, K. B. Kang, K. I. Kang, R. Kang, Y. A. Kang, T. Kanki, T. D. Kanneganti, H. Kanno, A. G. Kanthasamy, A. Kanthasamy, V. Karantza, G. P. Kaushal, S. Kaushik, Y. Kawazoe, P. Y. Ke, J. H. Kehrl, A. Kelekar, C. Kerkhoff, D. H. Kessel, H. Khalil, J. A. Kiel, A. A. Kiger, A. Kihara, D. R. Kim, D. H. Kim, E. K. Kim, H. R. Kim, J. S. Kim, J. H. Kim, J. C. Kim, J. K. Kim, P. K. Kim, S. W. Kim, Y. S. Kim, Y. Kim, A. Kimchi, A. C. Kimmelman, J. S. King, T. J. Kinsella, V. Kirkin, L. A. Kirshenbaum, K. Kitamoto, K. Kitazato, L. Klein, W. T. Klimecki, J. Klucken, E. Knecht, B. C. Ko, J. C. Koch, H. Koga, J. Y. Koh, Y. H. Koh, M. Koike, M. Komatsu, E. Kominami, H. J. Kong, W. J. Kong, V. I. Korolchuk, Y. Kotake, M. I. Koukourakis, J. B. Kouri Flores, A. L. Kovacs, C. Kraft, D. Krainc, H. Kramer, C. Kretz-Remy, A. M. Krichevsky, G. Kroemer, R. Kruger, O. Krut, N. T. Ktistakis, C. Y. Kuan, R. Kucharczyk, A. Kumar, R. Kumar, S. Kumar, M. Kundu, H. J. Kung, T. Kurz, H. J. Kwon, A. R. La Spada, F. Lafont, T. Lamark, J. Landry, 98 |
J. D. Lane, P. Lapaquette, J. F. Laporte, L. Laszlo, S. Lavandero, J. N. Lavoie, R. Layfield, P. A. Lazo, W. Le, L. Le Cam, D. J. Ledbetter, A. J. Lee, B. W. Lee, G. M. Lee, J. Lee, J. H. Lee, M. Lee, M. S. Lee, S. H. Lee, C. Leeuwenburgh, P. Legembre, R. Legouis, M. Lehmann, H. Y. Lei, Q. Y. Lei, D. A. Leib, J. Leiro, J. J. Lemasters, A. Lemoine, M. S. Lesniak, D. Lev, V. V. Levenson, B. Levine, E. Levy, F. Li, J. L. Li, L. Li, S. Li, W. Li, X. J. Li, Y. B. Li, Y. P. Li, C. Liang, Q. Liang, Y. F. Liao, P. P. Liberski, A. Lieberman, H. J. Lim, K. L. Lim, K. Lim, C. F. Lin, F. C. Lin, J. Lin, J. D. Lin, K. Lin, W. W. Lin, W. C. Lin, Y. L. Lin, R. Linden, P. Lingor, J. Lippincott-Schwartz, M. P. Lisanti, P. B. Liton, B. Liu, C. F. Liu, K. Liu, L. Liu, Q. A. Liu, W. Liu, Y. C. Liu, Y. Liu, R. A. Lockshin, C. N. Lok, S. Lonial, B. Loos, G. Lopez-Berestein, C. Lopez-Otin, L. Lossi, M. T. Lotze, P. Low, B. Lu, Z. Lu, F. Luciano, N. W. Lukacs, A. H. Lund, M. A. Lynch-Day, Y. Ma, F. Macian, J. P. MacKeigan, K. F. Macleod, F. Madeo, L. Maiuri, M. C. Maiuri, D. Malagoli, M. C. Malicdan, W. Malorni, N. Man, E. M. Mandelkow, S. Manon, I. Manov, K. Mao, X. Mao, Z. Mao, P. Marambaud, D. Marazziti, Y. L. Marcel, K. Marchbank, P. Marchetti, S. J. Marciniak, M. Marcondes, M. Mardi, G. Marfe, G. Marino, M. Markaki, M. R. Marten, S. J. Martin, C. Martinand-Mari, W. Martinet, M. Martinez-Vicente, M. Masini, P. Matarrese, S. Matsuo, R. Matteoni, A. Mayer, N. M. Mazure, D. J. McConkey, M. J. McConnell, C. McDermott, C. McDonald, G. M. McInerney, S. L. McKenna, B. McLaughlin, P. J. McLean, C. R. McMaster, G. A. McQuibban, A. J. Meijer, M. H. Meisler, A. Melendez, T. J. Melia, G. Melino, M. A. Mena, J. A. Menendez, R. F. Menna-Barreto, M. B. Menon, F. M. Menzies, C. A. Mercer, A. Merighi, D. E. Merry, S. Meschini, C. G. Meyer, T. F. Meyer, C. Y. Miao, J. Y. Miao, P. A. Michels, C. Michiels, D. Mijaljica, A. Milojkovic, S. Minucci, C. Miracco, C. K. Miranti, I. Mitroulis, K. Miyazawa, N. Mizushima, B. Mograbi, S. Mohseni, X. Molero, B. Mollereau, F. Mollinedo, T. Momoi, I. Monastyrska, M. M. Monick, M. J. Monteiro, M. N. Moore, R. Mora, K. Moreau, P. I. Moreira, Y. Moriyasu, J. Moscat, S. Mostowy, J. C. Mottram, T. Motyl, C. E. Moussa, S. Muller, K. Munger, C. Munz, L. O. Murphy, M. E. Murphy, A. Musaro, I. Mysorekar, E. Nagata, K. Nagata, A. Nahimana, U. Nair, T. Nakagawa, K. Nakahira, H. Nakano, H. Nakatogawa, M. Nanjundan, N. I. Naqvi, D. P. Narendra, M. Narita, M. Navarro, S. T. Nawrocki, T. Y. Nazarko, A. Nemchenko, M. G. Netea, T. P. Neufeld, P. A. Ney, I. P. Nezis, H. P. Nguyen, D. Nie, I. Nishino, C. Nislow, R. A. Nixon, T. Noda, A. A. Noegel, A. Nogalska, S. Noguchi, L. Notterpek, I. Novak, T. Nozaki, N. Nukina, T. Nurnberger, B. Nyfeler, K. Obara, T. D. Oberley, S. Oddo, M. Ogawa, T. Ohashi, K. Okamoto, N. L. Oleinick, F. J. Oliver, L. J. Olsen, S. Olsson, O. Opota, T. F. Osborne, G. K. Ostrander, K. Otsu, J. H. Ou, M. Ouimet, M. Overholtzer, B. Ozpolat, P. Paganetti, U. Pagnini, N. Pallet, G. E. Palmer, C. Palumbo, T. Pan, T. Panaretakis, U. B. Pandey, Z. Papackova, I. Papassideri, I. Paris, J. Park, O. K. Park, J. B. Parys, K. R. Parzych, S. Patschan, C. Patterson, S. Pattingre, J. M. Pawelek, J. Peng, D. H. Perlmutter, I. Perrotta, G. Perry, S. Pervaiz, M. Peter, G. J. Peters, M. Petersen, G. Petrovski, J. M. Phang, M. Piacentini, P. Pierre, V. Pierrefite-Carle, G. Pierron, R. Pinkas-Kramarski, A. Piras, N. Piri, L. C. Platanias, S. Poggeler, M. Poirot, A. Poletti, C. Pous, M. Pozuelo-Rubio, M. Praetorius-Ibba, A. Prasad, M. Prescott, M. Priault, N. Produit-Zengaffinen, A. Progulske-Fox, T. Proikas-Cezanne, S. Przedborski, K. Przyklenk, R. Puertollano, J. Puyal, S. B. Qian, L. Qin, Z. H. Qin, S. E. Quaggin, N. Raben, H. Rabinowich, S. W. Rabkin, I. Rahman, A. Rami, G. Ramm, G. Randall, F. Randow, V. A. Rao, J. C. Rathmell, B. Ravikumar, S. K. Ray, B. H. Reed, J. C. Reed, F. Reggiori, A. Regnier-Vigouroux, A. S. Reichert, J. J. Reiners, Jr., R. J. Reiter, J. Ren, J. L. Revuelta, C. J. Rhodes, K. Ritis, E. Rizzo, J. Robbins, M. Roberge, H. Roca, M. C. Roccheri, S. Rocchi, H. P. Rodemann, S. Rodriguez de Cordoba, B. Rohrer, I. B. Roninson, K. Rosen, M. M. RostRoszkowska, M. Rouis, K. M. Rouschop, F. Rovetta, B. P. Rubin, D. C. Rubinsztein, K. Ruckdeschel, E. B. Rucker, 3rd, A. Rudich, E. Rudolf, N. Ruiz-Opazo, R. Russo, T. E. Rusten, K. M. Ryan, S. W. Ryter, D. M. Sabatini, J. Sadoshima, T. Saha, T. Saitoh, H. Sakagami, Y. Sakai, G. H. Salekdeh, P. Salomoni, P. M. Salvaterra, G. Salvesen, R. 99 |
Salvioli, A. M. Sanchez, J. A. Sanchez-Alcazar, R. Sanchez-Prieto, M. Sandri, U. Sankar, P. Sansanwal, L. Santambrogio, S. Saran, S. Sarkar, M. Sarwal, C. Sasakawa, A. Sasnauskiene, M. Sass, K. Sato, M. Sato, A. H. Schapira, M. Scharl, H. M. Schatzl, W. Scheper, S. Schiaffino, C. Schneider, M. E. Schneider, R. Schneider-Stock, P. V. Schoenlein, D. F. Schorderet, C. Schuller, G. K. Schwartz, L. Scorrano, L. Sealy, P. O. Seglen, J. Segura-Aguilar, I. Seiliez, O. Seleverstov, C. Sell, J. B. Seo, D. Separovic, V. Setaluri, T. Setoguchi, C. Settembre, J. J. Shacka, M. Shanmugam, I. M. Shapiro, E. Shaulian, R. J. Shaw, J. H. Shelhamer, H. M. Shen, W. C. Shen, Z. H. Sheng, Y. Shi, K. Shibuya, Y. Shidoji, J. J. Shieh, C. M. Shih, Y. Shimada, S. Shimizu, T. Shintani, O. S. Shirihai, G. C. Shore, A. A. Sibirny, S. B. Sidhu, B. Sikorska, E. C. Silva-Zacarin, A. Simmons, A. K. Simon, H. U. Simon, C. Simone, A. Simonsen, D. A. Sinclair, R. Singh, D. Sinha, F. A. Sinicrope, A. Sirko, P. M. Siu, E. Sivridis, V. Skop, V. P. Skulachev, R. S. Slack, S. S. Smaili, D. R. Smith, M. S. Soengas, T. Soldati, X. Song, A. K. Sood, T. W. Soong, F. Sotgia, S. A. Spector, C. D. Spies, W. Springer, S. M. Srinivasula, L. Stefanis, J. S. Steffan, R. Stendel, H. Stenmark, A. Stephanou, S. T. Stern, C. Sternberg, B. Stork, P. Stralfors, C. S. Subauste, X. Sui, D. Sulzer, J. Sun, S. Y. Sun, Z. J. Sun, J. J. Sung, K. Suzuki, T. Suzuki, M. S. Swanson, C. Swanton, S. T. Sweeney, L. K. Sy, G. Szabadkai, I. Tabas, H. Taegtmeyer, M. Tafani, K. Takacs-Vellai, Y. Takano, K. Takegawa, G. Takemura, F. Takeshita, N. J. Talbot, K. S. Tan, K. Tanaka, D. Tang, I. Tanida, B. A. Tannous, N. Tavernarakis, G. S. Taylor, G. A. Taylor, J. P. Taylor, L. S. Terada, A. Terman, G. Tettamanti, K. Thevissen, C. B. Thompson, A. Thorburn, M. Thumm, F. Tian, Y. Tian, G. Tocchini-Valentini, A. M. Tolkovsky, Y. Tomino, L. Tonges, S. A. Tooze, C. Tournier, J. Tower, R. Towns, V. Trajkovic, L. H. Travassos, T. F. Tsai, M. P. Tschan, T. Tsubata, A. Tsung, B. Turk, L. S. Turner, S. C. Tyagi, Y. Uchiyama, T. Ueno, M. Umekawa, R. Umemiya-Shirafuji, V. K. Unni, M. I. Vaccaro, E. M. Valente, G. Van den Berghe, I. J. van der Klei, W. van Doorn, L. F. van Dyk, M. van Egmond, L. A. van Grunsven, P. Vandenabeele, W. P. Vandenberghe, I. Vanhorebeek, E. C. Vaquero, G. Velasco, T. Vellai, J. M. Vicencio, R. D. Vierstra, M. Vila, C. Vindis, G. Viola, M. T. Viscomi, O. V. Voitsekhovskaja, C. von Haefen, M. Votruba, K. Wada, R. Wade-Martins, C. L. Walker, C. M. Walsh, J. Walter, X. B. Wan, A. Wang, C. Wang, D. Wang, F. Wang, G. Wang, H. Wang, H. G. Wang, H. D. Wang, J. Wang, K. Wang, M. Wang, R. C. Wang, X. Wang, Y. J. Wang, Y. Wang, Z. Wang, Z. C. Wang, D. G. Wansink, D. M. Ward, H. Watada, S. L. Waters, P. Webster, L. Wei, C. C. Weihl, W. A. Weiss, S. M. Welford, L. P. Wen, C. A. Whitehouse, J. L. Whitton, A. J. Whitworth, T. Wileman, J. W. Wiley, S. Wilkinson, D. Willbold, R. L. Williams, P. R. Williamson, B. G. Wouters, C. Wu, D. C. Wu, W. K. Wu, A. Wyttenbach, R. J. Xavier, Z. Xi, P. Xia, G. Xiao, Z. Xie, D. Z. Xu, J. Xu, L. Xu, X. Xu, A. Yamamoto, S. Yamashina, M. Yamashita, X. Yan, M. Yanagida, D. S. Yang, E. Yang, J. M. Yang, S. Y. Yang, W. Yang, W. Y. Yang, Z. Yang, M. C. Yao, T. P. Yao, B. Yeganeh, W. L. Yen, J. J. Yin, X. M. Yin, O. J. Yoo, G. Yoon, S. Y. Yoon, T. Yorimitsu, Y. Yoshikawa, T. Yoshimori, K. Yoshimoto, H. J. You, R. J. Youle, A. Younes, L. Yu, S. W. Yu, W. H. Yu, Z. M. Yuan, Z. Yue, C. H. Yun, M. Yuzaki, O. Zabirnyk, E. Silva-Zacarin, D. Zacks, E. Zacksenhaus, N. Zaffaroni, Z. Zakeri, H. J. Zeh, 3rd, S. O. Zeitlin, H. Zhang, H. L. Zhang, J. Zhang, J. P. Zhang, L. Zhang, M. Y. Zhang, X. D. Zhang, M. Zhao, Y. F. Zhao, Y. Zhao, Z. J. Zhao, X. Zheng, B. Zhivotovsky, Q. Zhong, C. Z. Zhou, C. Zhu, W. G. Zhu, X. F. Zhu, X. Zhu, Y. Zhu, T. Zoladek, W. X. Zong, A. Zorzano, J. Zschocke and B. Zuckerbraun (2012). "Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy." Autophagy 8(4): 445-544. Klionsky, D. J., J. M. Cregg, W. A. Dunn, Jr., S. D. Emr, Y. Sakai, I. V. Sandoval, A. Sibirny, S. Subramani, M. Thumm, M. Veenhuis and Y. Ohsumi (2003). "A unified nomenclature for yeast autophagy-related genes." Dev Cell 5(4): 539-545. Komatsu, M., H. Kurokawa, S. Waguri, K. Taguchi, A. Kobayashi, Y. Ichimura, Y. S. Sou, I. Ueno, A. Sakamoto, K. I. Tong, M. Kim, Y. Nishito, S. Iemura, T. Natsume, T. Ueno, E. 100 |
Kominami, H. Motohashi, K. Tanaka and M. Yamamoto (2010). "The selective autophagy substrate p62 activates the stress responsive transcription factor Nrf2 through inactivation of Keap1." Nat Cell Biol 12(3): 213-223. Kongara, S. and V. Karantza (2012). "The interplay between autophagy and ROS in tumorigenesis." Front Oncol 2: 171. Kraehn, G. M., J. Utikal, M. Udart, K. M. Greulich, G. Bezold, P. Kaskel, U. Leiter and R. U. Peter (2001). "Extra c-myc oncogene copies in high risk cutaneous malignant melanoma and melanoma metastases." Br J Cancer 84(1): 72-79. Kreipe, H., H. Feist, L. Fischer, J. Felgner, K. Heidorn, L. Mettler and R. Parwaresch (1993). "Amplification of c-myc but not of c-erbB-2 is associated with high proliferative capacity in breast cancer." Cancer Res 53(8): 1956-1961. Kurreck, J. (2009). "RNA interference: from basic research to therapeutic applications." Angew Chem Int Ed Engl 48(8): 1378-1398. Li, X., H. L. Xu, Y. X. Liu, N. An, S. Zhao and J. K. Bao (2013). "Autophagy modulation as a target for anticancer drug discovery." Acta Pharmacol Sin 34(5): 612-624. Li, Z., S. Van Calcar, C. Qu, W. K. Cavenee, M. Q. Zhang and B. Ren (2003). "A global transcriptional regulatory role for c-Myc in Burkitt's lymphoma cells." Proc Natl Acad Sci U S A 100(14): 8164-8169. Lin, C. Y., J. Loven, P. B. Rahl, R. M. Paranal, C. B. Burge, J. E. Bradner, T. I. Lee and R. A. Young (2012). "Transcriptional amplification in tumor cells with elevated c-Myc." Cell 151(1): 56-67. Ling, D. and P. M. Salvaterra (2009). "A central role for autophagy in Alzheimer-type neurodegeneration." Autophagy 5(5): 738-740. Littlewood, T. D., P. Kreuzaler and G. I. Evan (2012). "All things to all people." Cell 151(1): 1113. Liu, D., Y. Yang, Q. Liu and J. Wang (2011). "Inhibition of autophagy by 3-MA potentiates cisplatin-induced apoptosis in esophageal squamous cell carcinoma cells." Med Oncol 28(1): 105-111. Liu, X. D., S. Ko, Y. Xu, E. A. Fattah, Q. Xiang, C. Jagannath, T. Ishii, M. Komatsu and N. T. Eissa (2012). "Transient aggregation of ubiquitinated proteins is a cytosolic unfolded protein response to inflammation and endoplasmic reticulum stress." J Biol Chem 287(23): 19687-19698. Lock, R., S. Roy, C. M. Kenific, J. S. Su, E. Salas, S. M. Ronen and J. Debnath (2011). "Autophagy facilitates glycolysis during Ras-mediated oncogenic transformation." Mol Biol Cell 22(2): 165-178. Low, P., A. Varga, K. Pircs, P. Nagy, Z. Szatmari, M. Sass and G. Juhasz (2013). "Impaired proteasomal degradation enhances autophagy via hypoxia signaling in Drosophila." BMC Cell Biol 14(1): 29. Lu, Q., P. Yang, X. Huang, W. Hu, B. Guo, F. Wu, L. Lin, A. L. Kovacs, L. Yu and H. Zhang (2011). "The WD40 repeat PtdIns(3)P-binding protein EPG-6 regulates progression of omegasomes to autophagosomes." Dev Cell 21(2): 343-357. Luo, J., N. L. Solimini and S. J. Elledge (2009). "Principles of cancer therapy: oncogene and nononcogene addiction." Cell 136(5): 823-837. Lymboussaki, A., A. Kaipainen, E. Hatva, I. Vastrik, L. Jeskanen, M. Jalkanen, S. Werner, F. Stenback and R. Alitalo (1996). "Expression of Mad, an antagonist of Myc oncoprotein function, in differentiating keratinocytes during tumorigenesis of the skin." Br J Cancer 73(11): 1347-1355. Ma, Y., A. Creanga, L. Lum and P. A. Beachy (2006). "Prevalence of off-target effects in Drosophila RNA interference screens." Nature 443(7109): 359-363. Maclean, K. H., F. C. Dorsey, J. L. Cleveland and M. B. Kastan (2008). "Targeting lysosomal degradation induces p53-dependent cell death and prevents cancer in mouse models of lymphomagenesis." J Clin Invest 118(1): 79-88. 101 |
Maiuri, M. C., E. Tasdemir, A. Criollo, E. Morselli, J. M. Vicencio, R. Carnuccio and G. Kroemer (2009). "Control of autophagy by oncogenes and tumor suppressor genes." Cell Death Differ 16(1): 87-93. Malzer, E., M. L. Daly, A. Moloney, T. J. Sendall, S. E. Thomas, E. Ryder, H. D. Ryoo, D. C. Crowther, D. A. Lomas and S. J. Marciniak (2010). "Impaired tissue growth is mediated by checkpoint kinase 1 (CHK1) in the integrated stress response." J Cell Sci 123(Pt 17): 2892-2900. Mari, M., J. Griffith, E. Rieter, L. Krishnappa, D. J. Klionsky and F. Reggiori (2010). "An Atg9containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis." J Cell Biol 190(6): 1005-1022. McCubrey, J. A., L. S. Steelman, W. H. Chappell, S. L. Abrams, G. Montalto, M. Cervello, F. Nicoletti, P. Fagone, G. Malaponte, M. C. Mazzarino, S. Candido, M. Libra, J. Basecke, S. Mijatovic, D. Maksimovic-Ivanic, M. Milella, A. Tafuri, L. Cocco, C. Evangelisti, F. Chiarini and A. M. Martelli (2012). "Mutations and deregulation of Ras/Raf/MEK/ERK and PI3K/PTEN/Akt/mTOR cascades which alter therapy response." Oncotarget 3(9): 954-987. Mercer, C. A., A. Kaliappan and P. B. Dennis (2009). "A novel, human Atg13 binding protein, Atg101, interacts with ULK1 and is essential for macroautophagy." Autophagy 5(5): 649-662. Mizushima, N. (2010). "The role of the Atg1/ULK1 complex in autophagy regulation." Curr Opin Cell Biol 22(2): 132-139. Mizushima, N. and M. Komatsu (2011). "Autophagy: renovation of cells and tissues." Cell 147(4): 728-741. Mizushima, N., B. Levine, A. M. Cuervo and D. J. Klionsky (2008). "Autophagy fights disease through cellular self-digestion." Nature 451(7182): 1069-1075. Mizushima, N., T. Yoshimori and B. Levine (2010). "Methods in mammalian autophagy research." Cell 140(3): 313-326. Mohr, S. E. and N. Perrimon (2012). "RNAi screening: new approaches, understandings, and organisms." Wiley Interdiscip Rev RNA 3(2): 145-158. Moloney, A., D. B. Sattelle, D. A. Lomas and D. C. Crowther (2010). "Alzheimer's disease: insights from Drosophila melanogaster models." Trends Biochem Sci 35(4): 228-235. Munakata, N. and D. J. Klionsky (2010). ""Autophagy suite": Atg9 cycling in the cytoplasm to vacuole targeting pathway." Autophagy 6(6): 679-685. Nagy, P., A. Varga, K. Pircs, K. Hegedus and G. Juhasz (2013). "Myc-Driven Overgrowth Requires Unfolded Protein Response-Mediated Induction of Autophagy and Antioxidant Responses in Drosophila melanogaster." PLoS Genet 9(8): e1003664. Neufeld, T. P. (2004). "Genetic analysis of TOR signaling in Drosophila." Curr Top Microbiol Immunol 279: 139-152. Neufeld, T. P. (2010). "TOR-dependent control of autophagy: biting the hand that feeds." Curr Opin Cell Biol 22(2): 157-168. Neufeld, T. P. (2012). "Autophagy and cell growth--the yin and yang of nutrient responses." J Cell Sci 125(Pt 10): 2359-2368. Nie, Z., G. Hu, G. Wei, K. Cui, A. Yamane, W. Resch, R. Wang, D. R. Green, L. Tessarollo, R. Casellas, K. Zhao and D. Levens (2012). "c-Myc is a universal amplifier of expressed genes in lymphocytes and embryonic stem cells." Cell 151(1): 68-79. Noda, T., K. Matsunaga and T. Yoshimori (2011). "Atg14L recruits PtdIns 3-kinase to the ER for autophagosome formation." Autophagy 7(4): 438-439. O'Connell, B. C., A. F. Cheung, C. P. Simkevich, W. Tam, X. Ren, M. K. Mateyak and J. M. Sedivy (2003). "A large scale genetic analysis of c-Myc-regulated gene expression patterns." J Biol Chem 278(14): 12563-12573. Obara, K. and Y. Ohsumi (2011). "PtdIns 3-Kinase Orchestrates Autophagosome Formation in Yeast." J Lipids 2011: 498768. 102 |
Ohashi, Y. and S. Munro (2010). "Membrane delivery to the yeast autophagosome from the Golgi-endosomal system." Mol Biol Cell 21(22): 3998-4008. Orian, A., B. van Steensel, J. Delrow, H. J. Bussemaker, L. Li, T. Sawado, E. Williams, L. W. Loo, S. M. Cowley, C. Yost, S. Pierce, B. A. Edgar, S. M. Parkhurst and R. N. Eisenman (2003). "Genomic binding by the Drosophila Myc, Max, Mad/Mnt transcription factor network." Genes Dev 17(9): 1101-1114. Orsi, A., M. Razi, H. C. Dooley, D. Robinson, A. E. Weston, L. M. Collinson and S. A. Tooze (2012). "Dynamic and transient interactions of Atg9 with autophagosomes, but not membrane integration, are required for autophagy." Mol Biol Cell 23(10): 1860-1873. Pankiv, S., T. H. Clausen, T. Lamark, A. Brech, J. A. Bruun, H. Outzen, A. Overvatn, G. Bjorkoy and T. Johansen (2007). "p62/SQSTM1 binds directly to Atg8/LC3 to facilitate degradation of ubiquitinated protein aggregates by autophagy." J Biol Chem 282(33): 24131-24145. Pierce, S. B., C. Yost, J. S. Britton, L. W. Loo, E. M. Flynn, B. A. Edgar and R. N. Eisenman (2004). "dMyc is required for larval growth and endoreplication in Drosophila." Development 131(10): 2317-2327. Pircs, K., P. Nagy, A. Varga, Z. Venkei, B. Erdi, K. Hegedus and G. Juhasz (2012). "Advantages and limitations of different p62-based assays for estimating autophagic activity in Drosophila." PLoS One 7(8): e44214. Ravikumar, B., C. Vacher, Z. Berger, J. E. Davies, S. Luo, L. G. Oroz, F. Scaravilli, D. F. Easton, R. Duden, C. J. O'Kane and D. C. Rubinsztein (2004). "Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease." Nat Genet 36(6): 585-595. Rintelen, F., H. Stocker, G. Thomas and E. Hafen (2001). "PDK1 regulates growth through Akt and S6K in Drosophila." Proc Natl Acad Sci U S A 98(26): 15020-15025. Romanov, J., M. Walczak, I. Ibiricu, S. Schuchner, E. Ogris, C. Kraft and S. Martens (2012). "Mechanism and functions of membrane binding by the Atg5-Atg12/Atg16 complex during autophagosome formation." EMBO J 31(22): 4304-4317. Rosenfeldt, M. T. and K. M. Ryan (2011). "The multiple roles of autophagy in cancer." Carcinogenesis 32(7): 955-963. Sarbassov, D. D., S. M. Ali and D. M. Sabatini (2005). "Growing roles for the mTOR pathway." Curr Opin Cell Biol 17(6): 596-603. Sato, K., J. Qian, J. M. Slezak, M. M. Lieber, D. G. Bostwick, E. J. Bergstralh and R. B. Jenkins (1999). "Clinical significance of alterations of chromosome 8 in high-grade, advanced, nonmetastatic prostate carcinoma." J Natl Cancer Inst 91(18): 1574-1580. Satoo, K., N. N. Noda, H. Kumeta, Y. Fujioka, N. Mizushima, Y. Ohsumi and F. Inagaki (2009). "The structure of Atg4B-LC3 complex reveals the mechanism of LC3 processing and delipidation during autophagy." EMBO J 28(9): 1341-1350. Schleicher, S. M., L. Moretti, V. Varki and B. Lu (2010). "Progress in the unraveling of the endoplasmic reticulum stress/autophagy pathway and cancer: implications for future therapeutic approaches." Drug Resist Updat 13(3): 79-86. Schmidt, E. V. (1999). "The role of c-myc in cellular growth control." Oncogene 18(19): 29882996. Schmidt, E. V. (2004). "The role of c-myc in regulation of translation initiation." Oncogene 23(18): 3217-3221. Scott, R. C., G. Juhasz and T. P. Neufeld (2007). "Direct induction of autophagy by Atg1 inhibits cell growth and induces apoptotic cell death." Curr Biol 17(1): 1-11. Shen, S., O. Kepp and G. Kroemer (2012). "The end of autophagic cell death?" Autophagy 8(1): 1-3. Shibuya, M., J. Yokota and Y. Ueyama (1985). "Amplification and expression of a cellular oncogene (c-myc) in human gastric adenocarcinoma cells." Mol Cell Biol 5(2): 414-418. 103 |
Simonsen, A., R. C. Cumming, A. Brech, P. Isakson, D. R. Schubert and K. D. Finley (2008). "Promoting basal levels of autophagy in the nervous system enhances longevity and oxidant resistance in adult Drosophila." Autophagy 4(2): 176-184. Smith, D. R., T. Myint and H. S. Goh (1993). "Over-expression of the c-myc proto-oncogene in colorectal carcinoma." Br J Cancer 68(2): 407-413. Sone, M., X. Zeng, J. Larese and H. D. Ryoo (2013). "A modified UPR stress sensing system reveals a novel tissue distribution of IRE1/XBP1 activity during normal Drosophila development." Cell Stress Chaperones 18(3): 307-319. Soucek, L. and G. I. Evan (2010). "The ups and downs of Myc biology." Curr Opin Genet Dev 20(1): 91-95. Suh, D. H., M. K. Kim, H. S. Kim, H. H. Chung and Y. S. Song (2012). "Unfolded protein response to autophagy as a promising druggable target for anticancer therapy." Ann N Y Acad Sci 1271: 20-32. Suzuki, K., Y. Kubota, T. Sekito and Y. Ohsumi (2007). "Hierarchy of Atg proteins in preautophagosomal structure organization." Genes Cells 12(2): 209-218. Suzuki, K. and Y. Ohsumi (2007). "Molecular machinery of autophagosome formation in yeast, Saccharomyces cerevisiae." FEBS Lett 581(11): 2156-2161. Suzuki, K. and Y. Ohsumi (2010). "Current knowledge of the pre-autophagosomal structure (PAS)." FEBS Lett 584(7): 1280-1286. Sykiotis, G. P. and D. Bohmann (2008). "Keap1/Nrf2 signaling regulates oxidative stress tolerance and lifespan in Drosophila." Dev Cell 14(1): 76-85. Takamura, A., M. Komatsu, T. Hara, A. Sakamoto, C. Kishi, S. Waguri, Y. Eishi, O. Hino, K. Tanaka and N. Mizushima (2011). "Autophagy-deficient mice develop multiple liver tumors." Genes Dev 25(8): 795-800. Takats, S., P. Nagy, A. Varga, K. Pircs, M. Karpati, K. Varga, A. L. Kovacs, K. Hegedus and G. Juhasz (2013). "Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila." J Cell Biol 201(4): 531-539. Takeuchi, H., Y. Kondo, K. Fujiwara, T. Kanzawa, H. Aoki, G. B. Mills and S. Kondo (2005). "Synergistic augmentation of rapamycin-induced autophagy in malignant glioma cells by phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B inhibitors." Cancer Res 65(8): 33363346. Thumm, M., R. Egner, B. Koch, M. Schlumpberger, M. Straub, M. Veenhuis and D. H. Wolf (1994). "Isolation of autophagocytosis mutants of Saccharomyces cerevisiae." FEBS Lett 349(2): 275-280. Toh, P. P., S. Luo, F. M. Menzies, T. Rasko, E. E. Wanker and D. C. Rubinsztein (2013). "Myc inhibition impairs autophagosome formation." Hum Mol Genet. Tomic, T., T. Botton, M. Cerezo, G. Robert, F. Luciano, A. Puissant, P. Gounon, M. Allegra, C. Bertolotto, J. M. Bereder, S. Tartare-Deckert, P. Bahadoran, P. Auberger, R. Ballotti and S. Rocchi (2011). "Metformin inhibits melanoma development through autophagy and apoptosis mechanisms." Cell Death Dis 2: e199. Tong, Y., Y. Y. Liu, L. S. You and W. B. Qian (2012). "Perifosine induces protective autophagy and upregulation of ATG5 in human chronic myelogenous leukemia cells in vitro." Acta Pharmacol Sin 33(4): 542-550. Tsukada, M. and Y. Ohsumi (1993). "Isolation and characterization of autophagy-defective mutants of Saccharomyces cerevisiae." FEBS Lett 333(1-2): 169-174. Tung, Y. T., W. M. Hsu, H. Lee, W. P. Huang and Y. F. Liao (2010). "The evolutionarily conserved interaction between LC3 and p62 selectively mediates autophagy-dependent degradation of mutant huntingtin." Cell Mol Neurobiol 30(5): 795-806. Vergne, I., E. Roberts, R. A. Elmaoued, V. Tosch, M. A. Delgado, T. Proikas-Cezanne, J. Laporte and V. Deretic (2009). "Control of autophagy initiation by phosphoinositide 3phosphatase Jumpy." EMBO J 28(15): 2244-2258. 104 |
Walczak, M. and S. Martens (2013). "Dissecting the role of the Atg12-Atg5-Atg16 complex during autophagosome formation." Autophagy 9(3): 424-425. Wang, S. and R. J. Kaufman (2012). "The impact of the unfolded protein response on human disease." J Cell Biol 197(7): 857-867. Warburg, O. (1956). "On the origin of cancer cells." Science 123(3191): 309-314. Wei, H., S. Wei, B. Gan, X. Peng, W. Zou and J. L. Guan (2011). "Suppression of autophagy by FIP200 deletion inhibits mammary tumorigenesis." Genes Dev 25(14): 1510-1527. Weidberg, H., E. Shvets, T. Shpilka, F. Shimron, V. Shinder and Z. Elazar (2010). "LC3 and GATE16/GABARAP subfamilies are both essential yet act differently in autophagosome biogenesis." EMBO J 29(11): 1792-1802. Weinberg, R. A. (2007). The biology of cancer. New York, Garland Science. White, E. (2012). "Deconvoluting the context-dependent role for autophagy in cancer." Nat Rev Cancer 12(6): 401-410. Williams, A., L. Jahreiss, S. Sarkar, S. Saiki, F. M. Menzies, B. Ravikumar and D. C. Rubinsztein (2006). "Aggregate-prone proteins are cleared from the cytosol by autophagy: therapeutic implications." Curr Top Dev Biol 76: 89-101. Winslow, A. R. and D. C. Rubinsztein (2008). "Autophagy in neurodegeneration and development." Biochim Biophys Acta 1782(12): 723-729. Xu, J., Y. Chen and O. I. Olopade (2010). "MYC and Breast Cancer." Genes Cancer 1(6): 629-640. Yang, W., J. Soares, P. Greninger, E. J. Edelman, H. Lightfoot, S. Forbes, N. Bindal, D. Beare, J. A. Smith, I. R. Thompson, S. Ramaswamy, P. A. Futreal, D. A. Haber, M. R. Stratton, C. Benes, U. McDermott and M. J. Garnett (2013). "Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC): a resource for therapeutic biomarker discovery in cancer cells." Nucleic Acids Res 41(Database issue): D955-961. Zeller, K. I., A. G. Jegga, B. J. Aronow, K. A. O'Donnell and C. V. Dang (2003). "An integrated database of genes responsive to the Myc oncogenic transcription factor: identification of direct genomic targets." Genome Biol 4(10): R69. Zhong, Y., Q. J. Wang, X. Li, Y. Yan, J. M. Backer, B. T. Chait, N. Heintz and Z. Yue (2009). "Distinct regulation of autophagic activity by Atg14L and Rubicon associated with Beclin 1-phosphatidylinositol-3-kinase complex." Nat Cell Biol 11(4): 468-476. Zhu, K., K. Dunner, Jr. and D. J. McConkey (2010). "Proteasome inhibitors activate autophagy as a cytoprotective response in human prostate cancer cells." Oncogene 29(3): 451462. Zoncu, R., L. Bar-Peled, A. Efeyan, S. Wang, Y. Sancak and D. M. Sabatini (2011). "mTORC1 senses lysosomal amino acids through an inside-out mechanism that requires the vacuolar H(+)-ATPase." Science 334(6056): 678-683.
105 |
12. Internetes referenciák http://drosi.wordpress.com/drosophila-melanogaster http://myccancergene.org http://clinicaltrials.gov http://www.cancerrxgene.org http://www-dep.iarc.fr/WHOdb/WHOdb.htm
106 |
13. Publikációk
Erdi B*, Nagy P*, Zvara A, Varga A, Pircs K, Menesi D, Puskas LG, Juhasz G. Loss of the starvation-induced gene Rack1 leads to glycogen deficiency and impaired autophagic responses in Drosophila. Autophagy. 2012; 8(7) 1124–1135. *megosztott első szerző
Pircs K, Nagy P, Varga A, Venkei Z, Erdi B, Hegedus K, Juhasz G. Advantages and limitations of different p62-based assays for estimating autophagic activity in Drosophila. PLOS One. 2012; 7(8): e44214.
Takats S, Nagy P, Varga A, Pircs K, Karpati M, Varga K, Kovacs A, Hegedus K, Juhasz G. Autophagosomal Syntaxin17-dependent lysosomal degradation maintains neuronal function in Drosophila. Journal of Cell Biology. 2013; 201(4):531-9.
Low P, Varga A, Pircs K, Nagy P, Szatmari Zs, Sass M, Juhasz G. Impaired proteasomal degradation enhances autophagy via hypoxia signaling in Drosophila. BMC Cell Biology. 2013; 14(1):29
Nagy P, Varga A, Pircs K, Hegedus K, Juhasz G. Myc-Driven Overgrowth Requires Unfolded Protein Response-Mediated Induction of Autophagy and Antioxidant Responses in Drosophila melanogaster. PLoS Genet 2013; 9(8): e1003664.
107 |
