Az AT 1A -angiotenzinreceptor karboxil-terminális régiójának szerepe a receptor endocitózisában

Celluláris és Molekuláris Élettan Doktori Program

Az AT 1 A -angiotenzinreceptor karboxil-terminális régiójának szerepe a receptor endocitózisában

Mihalik Balázs

Témavezető: Dr. Hunyady László egyetemi docens

Semmelweis Egyetem Élettani Intézet Budapest 2003

Összefoglalás Az angiotenzin-II peptidhormon élettani hatásait közvetítő AT1-angiotenzinreceptor a Gfehérjéhez kapcsolt receptorok családjába tartozik. E receptorok működésének szabályozásában több folyamat is szerepet játszik. A receptor a hormonkötés hatására bekövetkező aktiválódás után foszforilálódik, majd deszenzitizálódik. A receptor ezt követően endocitózissal a sejt belsejébe kerül. Kísérleteinkben megállapítottuk, hogy a receptor internalizációjában fontos szerepet játszó, a karboxil-terminális részen található szerin és treonin aminosavak különböző nagyságú deléciókkal történő eltávolítása, illetve azok alaninra cserélése a receptor angiotenzinII hatására létrejövő foszforilációjának jelentős csökkenését okozza. Eredményeinkből arra következtettünk, hogy az AT1-receptor karboxil-terminális doménjének foszorilációja szerepet játszhat a receptor endocitózisának szabályozásában. Megállapítottuk, hogy ezen deléciós mutáns receptorok sejtfelszíni receptorszámra vonatkoztatott inozitol-foszfát válasza magasabb, mint a vad típusú receptoré, ami arra utal, hogy a receptor karboxil-terminális szerin és treonin gazdag régiója a receptor deszenzitizációjában is szerepet játszhat. Mivel a receptor internalizációjának pontos mechanizmusa ismeretlen volt, további kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy az AT1-receptor foszforiláció függő endocitózisának mechanizmusában részt vesz-e a receptor monoubikvitinációja, melynek szerepét az élesztő α-faktor receptorának internalizációja során írták le. Mivel az ubikvitináció lizin aminosavakon történik, és élesztőben a folyamatot az ubikvitinálódó lizin közelében található szerin, illetve treonin aminosavak foszforilációja szabályozza, megvizsgáltuk, hogy az AT1-receptor karboxil-terminális intracelluláris doménjének szerin és treonin aminosavakban gazdag régiójában található lizin aminosavak egyenként és csoportosan alaninra történő kicserélése hogyan befolyásolja a receptorendocitózis kinetikáját CHO sejtekben. Kísérleteink azt mutatták, hogy a receptor endocitózisának szabályozásában nem vesz részt a karboxilterminális domén lizinjeihez kapcsolódó ubikvitináció. Ezt a következtetést megerősítették azok a vizsgálatok, melyekben egy internalizációra képtelen deléciós receptor mutánsból (319STOP) és a humán ubikvitin molekulából létrehozott kiméra nem állította helyre az AT1-receptorra jellemző internalizációs kinetikát. Vizsgálataink már folytak, amikor munkacsoportunk kimutatta, hogy az AT1-receptor internalizációja eltérő mechanizmussal megy végbe alacsony (fiziológiás tartományba eső) és magas (10 nmol/l feletti) hormonkoncentráció esetén. Mivel korábbi kísérleteinket alacsony angiotenzin II koncentráció mellett végeztük, ezért megvizsgáltuk, hogy magas (30 nmol/l) angiotenzin-II koncentráció esetén hogyan befolyásolja a receptor internalizációjának kinetikáját a karboxil-terminális lizinek helyettesítése alaninnal. Megállapítottuk, hogy a receptor karboxil-terminális részén található szerinben és treoninban

2

gazdag

régió

ubikvitinációja

ilyen

körülmények

receptorendocitózis kialakulásában.

3

között

sem

játszik

szerepet

a

Summary The type 1 angiotensin II receptor (AT1 receptor) is a G protein-coupled receptor, which mediates the major physiological effects of the octapeptide hormone, angiotensin II. Agonistinduced activation of the AT1 receptor causes phosphorylation, desensitization and internalization of the receptor. Our results demonstrate that elimination of the serine/threoninerich region of the carboxyl-terminal (C-terminal) tail of the receptor abolished its agonistactivated phosphorylation. Truncation of the receptor tail at distinct sites localized the major phosphorylation site of the receptor to a 11 amino-acid segment. The impairment of receptor phosphorylation was correlated with the attenuation of agonist-induced internalization rates of these mutants and the magnitude of inositol phosphate production normalized to an equal number of receptors. These results suggest that agonist-induced internalization and desensitization of the AT1 receptor is associated with phosphorylation of this serine/treonin-rich region. In yeast, hyperphosphorylation of the α-factor pheromone receptor regulates endocytosis of the receptor by monoubiquitylation of its cytoplasmic tail on lysine residues, which process is regulated by phosphorylation of adjacent serine and threonine residues. The role of receptor ubiquitylation in AT1 receptor internalization at subnanomolar angiotensin II concentrations was evaluated by deletion or replacement of lysine residues in its C-terminal serine/threonine-rich region, which is the major site of agonist-induced phosphorylation. Expression of the mutant receptors in CHO cells showed that these modifications had no detectable effect on the angiotensin II-induced endocytosis of the AT1 receptor. Furthermore, fusion of ubiquitin inframe to an internalization-deficient AT1 receptor mutant with a truncated carboxyl-terminal tail did not restore the endocytosis of the resulting chimeric receptor. Substitution of all lysine residues in the serine/threonine-rich region also did not inhibit the internalization of the receptor at saturating angiotensin II concentrations, where endocytosis occurs by a β-arrestin and dynamin independent mechanism. Taken together, these data demonstrate that ubiquitylation of the cytoplasmic serine/threonine-rich region of the AT1 receptor on lysine residues is not required for its agonist-induced internalization, and suggest that endocytosis of mammalian G protein-coupled receptors occur by a different mechanism than that of yeast G protein-coupled pheromone receptors.

4

Tartalomjegyzék ÖSSZEFOGLALÁS ...................................................................................................................................2 SUMMARY.................................................................................................................................................4 TARTALOMJEGYZÉK ...........................................................................................................................5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ...................................................................................................................6 CÉLKITŰZÉSEK ......................................................................................................................................7 IRODALMI ELŐZMÉNYEK...................................................................................................................8 A G-FEHÉRJÉHEZ KAPCSOLT RECEPTOROK SZERKEZETE ÉS MŰKÖDÉSE ....................................................8 A FOSZFORILÁCIÓ SZEREPE A G-FEHÉRJÉHEZ KAPCSOLT RECEPTOROK MŰKÖDÉSÉNEK SZABÁLYOZÁSÁBAN ..................................................................................................................................9 A RECEPTOROK ENDOCITÓZISA ...............................................................................................................12 A KLATRIN-MEDIÁLT RECEPTORENDOCITÓZIS MOLEKULÁRIS MECHANIZMUSA ......................................14 A klatrin és szerepe a receptorinternalizációban ...............................................................................15 Az adapter fehérjék szerepe a receptorinternalizációban ..................................................................17 Dinamin GTP-ázok szerepe a receptorendocitózisban.......................................................................22 A receptor molekula ubikvitinációjának szerepe a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában ............................................................................................................................................................22 A RECEPTORINTERNALIZÁCIÓ SZEREPE A RECEPTOROK ÉRZÉKENYSÉGÉNEK SZABÁLYOZÁSÁBAN ..........28 AZ ANGIOTENZINRECEPTOROK ÁTTEKINTÉSE..........................................................................................30 AZ AT1 ANGIOTENZINRECEPTOR ENDOCITÓZISA .....................................................................................32 AZ AT1A RECEPTOR FOSZFORILÁCIÓJA ....................................................................................................33 MÓDSZEREK ..........................................................................................................................................36 A RECEPTOR MUTÁNSOK LÉTREHOZÁSA..................................................................................................36 A RECEPTOR-UBIKVITIN KIMÉRA LÉTREHOZÁSA .....................................................................................36 MUTÁNS ÉS VAD TÍPUSÚ FEHÉRJÉK KIFEJEZTETÉSE EMLŐS SEJTTENYÉSZETEKBEN .................................37 KÖTÉSI VIZSGÁLATOK .............................................................................................................................38 INOZITOL-FOSZFÁT VÁLASZ MÉRÉSE .......................................................................................................38 A RECEPTOR INTERNALIZÁCIÓJÁNAK MÉRÉSE .........................................................................................38 EREDMÉNYEK.......................................................................................................................................40 AZ AT1-RECEPTOR KARBOXIL-TERMINÁLIS RÉGIÓJÁNAK FOSZFORILÁCIÓJA ÉS ENNEK SZEREPE A RECEPTOR ENDOCITÓZISÁBAN .................................................................................................................40 AZ UBIKVITINÁCIÓ LEHETSÉGES SZEREPE AZ AT1-RECEPTOR ENDOCITÓZISÁBAN...................................45 AZ EREDMÉNYEK MEGBESZÉLÉSE, KÖVETKEZTETÉSEK....................................................55 AZ AT1A-RECEPTOR FOSZFORILÁCIÓJA ÉS ENDOCITÓZISA KÖZÖTT ÖSSZEFÜGGÉS VAN ...........................55 AZ AT1A-RECEPTOR KARBOXIL-TERMINÁLIS RÉGIÓJÁNAK UBIKVITINÁCIÓJA NEM JÁTSZIK SZEREPET A RECEPTOR ENDOCITÓZISÁNAK SZABÁLYOZÁSÁBAN ................................................................................61 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..................................................................................................................67 IRODALOMJEGYZÉK ..........................................................................................................................68 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE................................................................................................83 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK .............................................................................83 AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ........................................................................83

5

Rövidítések jegyzéke

Ang II

angiotenzin-II

AT1AR

patkány 1A típusú angiotenzinreceptor

AT1BR

patkány 1B típusú angiotenzinreceptor

AT1R

egyes típusú angiotenzinreceptor

AT2R

kettes típusú angiotenzinreceptor

CHO

kínai aranyhörcsög petefészek eredetű sejtvonal

CK1α

kazein-kináz 1α

COS-7

majomvese eredetű sejtvonal

DAG

diacil-glicerin

EGFR

epidermális növekedési faktor receptora

ERK1/2

extracelluláris jelre regulálódó protein-kináz 1 és 2

EST-klón

expressed sequence tag cDNS szekvenciát tartalmazó vektor

G-fehérje

heterotrimer GTP-kötő fehérje

GFKR

G-fehérjéhez kapcsolt receptor

GRK

G-fehérjéhez kapcsolt receptor kináz

HA epitóp

influenzavírus hemagglutinin antigénjének epitópja

HEK-293

humán embrionális vese eredetű sejtvonal

IP3

inozitol-triszfoszfát

JNK3

c-Jun amino-terminális kináz 3

kDa

kilodalton

LDL

low density lipoprotein

MAPK

mitogén aktivált protein-kináz

MEK1

MAPK/ERK kináz 1

PKA

protein-kináz A

PKC

protein-kináz C

6

Célkitűzések A hét transzmembrán domént tartalmazó receptorok családjába tartozó AT1-angiotenzin receptor agonista kötés hatására aktiválódik. Az ennek következtében létrejövő folyamatok elindításában főként a receptor intracelluláris régiói játszanak szerepet. Kísérleteink során a receptor karboxil-terminális szerin

és treonin aminosavakban gazdag régiójának a

receptorendocitózis szabályozásában betöltött szerepét vizsgáltuk. Az AT1-receptor és más G-fehérjéhez kapcsolt receptorok működésének vizsgálata számos olyan adatot szolgáltatott, amelyek alapján jogosan lehetett feltételezni, hogy a receptor a karboxil-terminális régió szerin és treonin aminosavain foszforilálódik. Kísérleteink első felében arra kerestük a választ, hogy a receptor agonista stimulálás hatására bekövetkező foszforilációja valóban a karboxil-terminális régió e szerinben és treoninban gazdag szegmensében történik-e, továbbá kimutatható-e kapcsolat a receptor foszforilációja és endocitózisa között? Szintén ismert volt, hogy az endogén AT1-receptor főleg klatrinnal burkolt vezikulák révén kerül endocitózisra, de ennek mechanizmusára vonatkozó irodalmi adatok ellentmondóak voltak. További kísérleteink annak a kérdésnek a megválaszolására irányultak, hogy a receptor karboxil-terminális szerinben és treoninban gazdag régiójának szomszédságában található lizinek,

illetve

azok

ubikvitinációja

részt

vesznek-e

a

receptor

endocitózisának

szabályozásában? Összefoglalva, kísérleteinkben a következő kérdésekre kívántunk választ kapni: •

Az AT1-receptor mely doménjére lehet lokalizálni az agonista stimulálás hatására bekövetkező receptor foszforilációt?

•

Az

AT1-receptor

foszforilációja

összefüggésben

van-e

a

receptor

endocitózisával? •

A receptor molekula karboxil-terminális, szerinben és treoninban gazdag régiójának lizin aminosavai, azok ubikvitinációi szerepet játszanak-e az AT1receptor endocitózisában?

•

Az AT1-receptor nagy agonista koncentráció esetén meginduló β-arresztinektől és dinamintól független endocitózisának mechanizmusában szerepet játszanak-e a receptor karboxil-terminális régiójának lizin aminosavai?

7

Irodalmi előzmények A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezete és működése Az összefoglaló néven G-fehérjéhez kapcsolt receptoroknak (GFKR) nevezett receptorok hatalmas családjába tartozik a ma ismert membránreceptorok többsége, gerincesekben a receptorcsalád eddig több mint ezer tagjáról tudunk. Ezek a receptorok a sejtet ért legkülönbözőbb természetű hatásokra tudnak aktiválódni, legyenek azok akár különböző kémiai felépítésű hormonok, neurotranszmitterek, gáz halmazállapotú anyagok vagy fényenergia. A ligandok széles skálája ellenére a családba tartozó receptorok szerkezete nagyfokú hasonlóságot mutat. A hét, 20-25 hidrofób aminosavból álló transzmembrán α-hélixet három intra- és három extracelluláris hurok kapcsolja össze. A receptorok amino-terminális része extracellulárisan található, míg a karboxil-terminális régió a citoplazmában helyezkedik el. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok közül eddig csak a rodopszin kristályszerkezetét sikerült meghatározni, ami igazolta a hét transzmembrán doménből álló szerkezetet. Kiderült továbbá, hogy a receptor karboxil-terminális régiójának membrán közeli szakaszán egy nyolcadik α-hélix szerkezet is kialakul [1]. A családba tartozó különböző receptorok az amino- és karboxil-terminális régiók és a transzmembrán doméneket összekötő hurkok hosszúságában is jelentősen különbözhetnek. A receptorokat a szekvencia homológia alapján hat receptorcsaládba sorolták be [2]. Az 1-es családba tartozik a legtöbb eddig megismert GFKR, többek közt a rodopszin, az adrenergreceptorok és az AT1R is. A receptorok aminosav szekvenciájában található különböző mértékben konzervált elemek legtöbbször fontos szerepet játszanak a receptorok működésében. A GFKR családba tartozó receptorok agonista kötésének, aktiválódásának és G-fehérjével létrejövő kapcsolatának közös struktúrális alapjai vannak. A kisméretű ligandok, köztük az Ang II, a receptor transzmembrán hélixei által képzett hidrofób ligandkötő zsebbe kötődnek, míg a nagyobb méretű ligandok az extracelluláris hidrofil hurkokhoz és az amino-terminális (extracelluláris) régióhoz is kötődnek [3,4]. A membránhélixek egymáshoz viszonyított térbeli helyzetének megváltozása jelenti azt a konformációt, amelynek hatására specifikus változások történnek a sejtben. Ez az úgynevezett aktív konformáció az, amely az extracelluláris térből érkező jelet átvezeti a sejtmembránon és a sejtválasz megindulását létrehozza. A külső térből érkező jel, az agonista stabilizálja a receptor aktív konformációját, ami a jelátvitel feltétele [4]. Ennek első lépéseként a receptor és specifikus G-fehérjéje között interakció alakul ki, amelyben a legtöbb receptor esetében a második és harmadik intracelluláris hurok szerepét írták le, de néhány receptornál a karboxil-terminális régió fontosságát is hangsúlyozzák [5,6]. A receptor

8

aktív konformációja fokozza a G-fehérje α-alegységén a GDP-GTP kicserélődést, a GTP kötött Gα disszociál a βγ alegységekről. A szabaddá vált GTP-t kötő α és a βγ alegységek enzimek és ioncsatornák aktivitását befolyásolják. Az agonista kötését követően a receptor jelátvitele másodperceken-perceken belül deszenzitizálódik, vagyis érzéketlenné válik a receptor az agonista hatására. További agonista kötődés nem tud intracelluláris jelet generálni. A deszenzitizáció jelenségét a receptor foszforilációja útján megvalósuló receptor - G-fehérje szétkapcsolás okozza, ami egyrészt a másodlagos hírvivők által aktivált kinázok, másrészt a specifikus receptor kinázok működésének következménye [7,8,9]. A GFKR-ok működésére általánosságban jellemző, hogy a deszenzitizáció után a receptorok endocitózissal a sejtek belsejébe kerülnek, ennek a folyamatnak az időskálája perces nagyságrendű.

A foszforiláció szerepe a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok működésének szabályozásában A GFKR reguláció egyik formája az agonista által történő stimulálás hatására a sejtek, szövetek szintjén jelentkező receptor érzékenység csökkenés, ami az agonista hatására adott ismételt válasz csökkent szintjét jelenti. Ez a folyamat összetett mechanizmussal jön létre, melynek három fő összetevője van. Az egyik a receptor és a G-fehérje szétkapcsolása, melyet a receptor deszenzitizációjának neveznek. A másik összetevő a sejtfelszíni receptorok internalizációja a sejten belül található kompartmentekbe, míg a harmadik a sejtben található összes receptorszámnak a csökkenése, amit down-regulációnak neveznek. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok deszenzitizációjának a receptor - G-fehérje kölcsönhatás megszűnését definiálják. A szétkapcsolás a receptor foszforilációjának következménye, mely foszforilációt különböző intracelluláris kinázok katalizálnak [10,11]. A foszforilációban részt vesznek a másodlagos hírvivőktől függő kinázok, mint a protein-kináz A, vagy a protein-kináz C, valamint a receptor specifikus kinázok (GRK). Az

1980-as

évek

közepén

a

korábbról

már

ismert

rodopszin

kinázzal

homológ β−adrenergreceptor kináz leírása (βARK1) előre vetítette egy új kináz család létezését. A később G-fehérjéhez kapcsolt receptor kinázoknak (GRK) elnevezett enzimek családjának ma hét tagját ismerik. A család legelőször megismert tagja, a rodopszin kináz az új nevezéktan szerint a GRK1, míg a βARK1 a GRK2 elnevezést kapta. Ezek a szerin-treonin kinázok specifikusan képesek foszforilálni a hét transzmembrán doménnal rendelkező receptorok agonista által indukált formáját, állapotát [12]. A GRK-k hatásának tulajdonítják a receptor – G-fehérje kapcsolat megszüntetésének fontos lépését,

9

mely a receptor

deszenzitizációhoz vezet. A GRK-k szerkezetére jellemző a nagy mértékben konzervált aminosav szekvenciájú központi, katalitikus domén, amit egy 183-188 aminosavból álló aminoterminálisan elhelyezkedő szubsztrát kötő domén és egy különböző hosszúságú karboxilterminális domén határol. Az amino-terminális domén a receptor felismerésben [13], míg a karboxil-terminális domén a kináz membrán lokalizációjában játszik szerepet [14]. Az utóbbi időben számos olyan fehérjét azonosítottak, melyek interakcióba lépnek a GRK-kal és azok működésének szabályozásában vesznek részt. Ezek a szabályozó proteinek mind az N-, mind a karboxil-terminális doménekhez kapcsolódhatnak, így ma a GRK-ok szerkezetét és funkcióját is jóval komplexebb megvilágításban látjuk [15]. Ezek a kinázok a receptorok karboxil-terminális intracelluláris szekvenciájában, vagy a harmadik intracelluláris hurok szekvenciájában található szerin és treonin aminosavakat foszforilálják [16,7]. A másodlagos hírvivőktől függő kinázok mind az aktivált, mind az agonistát nem kötött, nem aktivált receptort képesek foszforilálni [17]. Ezzel szemben a GRKok családjába tartozó kinázok csak az aktivált receptorokat foszforilálják [18,19,20]. Mindkét típusú foszforiláció következtében a receptor és a G-fehérje közti kapcsolat megszűnik, a receptor deszenzitizálódik. A másodlagos hírvivők által aktivált kinázok segítségével létrejövő receptor foszforilációt heterológ, míg a GRK-k által okozott foszforilációt homológ deszenzitizációnak nevezzük. A homológ deszenzitizáció további hatásaként egy elsősorban a GFKR-okra jellemző adapter fehérje család, a β-arresztinek receptorhoz történő asszociációja válik lehetővé. Ennek következménye az, hogy a receptor sztérikusan is szétkapcsolódik a Gfehérjétől. A β-arresztinek ugyanakkor rendelkeznek olyan doménekkel, melyek a klatrinmediált endocitózisban történő részvételüket teszik lehetővé. A β-arresztinek közreműködése a receptor internalizációban felvetette a receptor foszforilációjának és internalizációjának összefüggését is. A GFKR-ok közül a legrészletesebb vizsgálatokat a β2-adrenerg receptoron végezték, a legtöbb felismerés ennek a receptornak a tanulmányozásából származik. A foszforiláció, mint a receptorinternalizáció szabályozásában szerepet játszó tényező is a β2-adrenerg receptoron végzett vizsgálatok kapcsán merült fel még a nyolcvanas évek közepén [21]. Azonban a receptor foszforiláció hiányos mutánsain, illetve kináz gátlószerekkel végzett vizsgálatok nem támasztották alá ezt a feltételezést. Ugyanakkor más receptorok tanulmányozása arra engedett következtetni, hogy a receptor foszforiláció részt vesz az internalizáció szabályozásában. Az m2-muszkarinos acetilkolinreceptor vizsgálata azt mutatta, hogy a GRK2 kifejeztetése COS-7 sejtekben felgyorsította, míg a kináz domináns negatív mutánsának termeltetése gátolta a receptor endocitózisát [22]. A muszkarinos receptorral elvégzett kísérletek érdekessége volt annak a ténynek a felismerése, hogy a domináns negatív kináz mutánsokkal végzett vizsgálatok

10

nem minden sejttípusban vezetnek azonos eredményre. Ez a jelenség az egyes fehérjék, esetünkben a receptor kinázoknak a különböző sejttípusokban tapasztalható eltérő expressziós szintjével van összefüggésben. A kutatók emiatt találták azt, hogy míg COS-7 sejtekben a GRK2 domináns negatív mutánsa lecsökkentette az endocitózis mértékét, addig BHK-21 és HEK-293 sejtekben nem gátolta a folyamatot [22]. Egy évvel későbbi vizsgálatok szerint a β2adrenerg receptor internalizáció hiányos mutánsának (Y326A) - melynek foszforilációja is kisebb mértékű a vad típusú receptorhoz viszonyítva – nem csak a receptor foszforilációját, hanem az endocitózisát is helyreállította a GRK2 koexpressziója HEK-293 sejtekben [23]. A GRK2 által katalizált receptor foszforilációnak az internalizációban betöltött szerepét kimutatták azóta többek között az endotelin-A [24], V2 vazopresszin [25] és a CCR-5 [26] receptorok esetében is. A GRK családba tartozó különböző enzimek részvétele a receptor foszforilálásban és endocitózisban nem teljesen tisztázott. A β2-adrenerg receptor már említett internalizáció sérült mutánsa esetében a GRK4 kivételével mindegyik kináz (a rodopszin kinázt leszámítva) helyreállította az agonista által történő stimulálás hatására bekövetkező receptorendocitózist, míg a GRK4 termeltetése a sejtekben a konstitutív (ligand kötéstől független) internalizációt növelte meg [27]. A follitropinreceptor foszforilációját viszont csak a GRK2 és -6 domináns negatív mutánsai tudták gátolni, de a receptor endocitózisát egyedül a GRK2 mutáns termeltetése tudta csökkenteni [28]. A különböző receptorokon elvégzett vizsgálatok alapján a GRK mediált foszforiláció fontos szerepet játszik a receptorendocitózis során, de a GRK-k által létrehozott receptor foszforiláció nem elengedhetetlen feltétele az internalizációnak [23]. A főként a β2-adrenerg receptorról szerzett ismeretek alapján a receptor foszforilációnak az endocitózisban betöltött szerepe leginkább egy olyan konformációs állapot stabilizálásában merül ki, mely nagymértékben megnöveli az internalizáció mechanizmusában alapvetően fontos intracelluláris faktorok receptorhoz történő asszociációját. Ezen elképzelés szerint a receptor foszforilációja megnöveli a receptor β-arreszin kötésének affinitását [25], mely kapcsolat a receptort a kialakuló klatrinnal burkolt vezikulákhoz irányítja és azokhoz köti [29]. A legtöbb receptor esetében úgy tűnik, hogy a ligand által aktivált endocitózis szabályozásában a βarresztin és a GRK-k egyszerre, a sejtekben meglévő expressziós szintjeik arányában egymással együttműködve, szinergista módon vesznek részt [30]. Azonban vannak olyan irodalmi adatok is, melyek a β-arresztin előbb ismertetett szerepe ellen szólnak. Így például a szekretinreceptorral végzett kutatások arra utalnak, hogy a PKA segítségével történő foszforiláció az a folyamat, mely a receptor internalizációjának szabályozásában részt vesz [31]. A paratiroidhormon-receptor foszforilációjának vizsgálata

11

pedig arra derített fényt, hogy az agonista által indukált receptorendocitózis a receptor foszforilációja nélkül is megtörténik [32]. A másodlagos hírvivők által aktivált kinázokon és a GRK család kinázain kívül más kinázokat is leírtak, melyek számára a GFKR-ok szubsztrátként szolgálnak. Angol kutatók arról számoltak be, hogy a kazein-kináz 1α képes foszforilálni az m3-muszkarinos acetilkolinreceptor harmadik intracelluláris hurokjának egy szekvenciarészletét. Ez a foszforiláció gátolható egy olyan peptid termeltetésével, mely megfelelt a receptor harmadik intracelluláris hurokjának egy részletével [33,34]. A kazein-kináz 1 által történő foszforiláció funkciójáról még kevés adat áll rendelkezésre, így a receptorendocitózisban betöltött szerepe még nem egyértelmű.

A receptorok endocitózisa A receptorok endocitózisának azt a folyamatot nevezzük, amelynek során a sejtfelszíni receptor a plazmamembránról lefűződő vezikulába záródik, majd a vezikula a receptorral együtt a sejt belsejébe kerül, internalizálódik [35]. A sejtfelszíni receptorok nagy többségére jellemző ez a folyamat. Ennek során a receptorokhoz kötődött anyagok, növekedési faktorok, hormonok, tápanyagok is a sejtek intracelluláris terébe kerülnek. A vírusok egy része is receptorhoz kötődve, endocitózissal jut be a sejtekbe. A tápanyagokat megkötő receptorok endocitózisát általában nem stimulálja a ligand megkötése, hanem attól függetlenül, folyamatosan történik. Ezt nevezzük konstitutív endocitózisnak. Konstitutív endocitózissal veszik föl a sejtek például a transzferrint és az LDL-t. A növekedési faktor- és a hormonreceptorokra azonban a ligand által indukált endocitózis a jellemző, mikor az endocitózis folyamatát a ligand receptorhoz kötése indítja meg [35]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisát kétéltű vörösvérsejteken írták le először. A folyamat felismeréséhez az a megfigyelés vezetett, hogy a sejtfelszíni β2-adrenerg receptorok száma agonista adás hatására lecsökkent és egyidejűleg megnőtt az intracellulárisan elhelyezkedő receptorok száma [36]. A sejtekbe bejutott receptorok mennyiségét a hidrofób és hidrofil ligandok segítségével mért kötés különbségéből lehetett meghatározni [37]. Később a β2-adrenerg receptor intracelluláris vezikulákban történő megjelenését immunhisztokémiai vizsgálatokkal és zöld fluoreszcens fehérjével jelölt receptor élő sejtben történő vizsgálatával egyaránt igazolták [38,39]. A korai vizsgálatok óta eltelt időben számos más receptor endocitózisát is bizonyították [40,41,42]. A plazmamembránról lefűződő vezikulák jellegzetes morfológiája alapján az endocitózis két fő mechanizmusát írták le. A membrán fehérjék internalizációja létrejöhet klatrinnal burkolt

12

és burok nélküli vezikulákkal [43,44]. A klatrin-mediált endocitózis típusra a lefűződő vezikula körül kialakuló burok a jellemző, melynek a klatrin fehérje a fő komponense. A klatrin-mediált endocitózis jelensége jól ismert a tápanyagok felvételét végző receptorok, a növekedési faktorés hormonreceptorok, valamint a neurotranszmitterek endocitózisában [45]. A kutatások arra utalnak, hogy a legtöbb GFKR endocitózisának is ez a fő mechanizmusa [46]. E receptorokban több olyan szekvencia elemet találtak, melyek az AP-2 adapter fehérje (az adapter fehérjék ismertetését lásd: következő fejezet) közvetítésével kapcsolják a receptort a klatrinnal borított struktúrákhoz. Ilyen motívum például a tirozint tartalmazó NPXY, vagy a dileucin szekvencia. Amint azt az előző fejezetben ismertettem, a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok esetében ebben a funkcióban a β-arresztin is szerepet játszik. A nem burkolt vezikulákkal történő endocitózis részleteiről - bár hasonlóan fontos folyamat

-

lényegesen

kevesebb

ismerettel

rendelkezünk,

mint

a

klatrin-mediált

mechanizmusról. Az endocitózisnak ebbe a típusába számos, egymástól meglehetősen nagy mértékben különböző endocitotikus útvonal tartozik a fagocitózistól kezdve a konstitutív plazmamembrán internalizációig. A kisméretű molekulák felvételével járó, nem burkolt vezikulákkal történő endocitotikus folyamatok közös jellemzője, hogy funkcionálisan a sejtmembrán speciális lipid mikrodoménjeihez köthetők. Ezek a lipid raftok a plazmamembrán olyan detergens által nem oldható régiói, melyek lipid összetétele eltér a környező membránétól. Jellemző rájuk a glikoszfingolipidek és a koleszterin nagyobb mennyisége, valamint néhány jellegzetes membránprotein jelenléte [47,48]. Szélesebb körű ismeretekkel a kaveolának nevezett lipid doménről rendelkezünk. Ezek az internalizáció során palack alakú bemélyedések a legtöbb sejttípus membránjában előfordulnak, de különösen sok található az endoteliális sejteken [49]. Jellemző markerjeik a koleszterint kötő kaveolin fehérjék, melyek funkciója vélhetően ezeknek a struktúráknak a fenntartása, vagy létrehozása [50]. A dinamin GTP-áz fehérjét is megtalálták a kaveolákhoz lokalizáltan, mely fehérje a klatrinnal burkolt vezikulák lefűződésében is fontos szerepet játszik. A dinamin kaveoláris jelenléte alapján feltételezik, hogy ez a molekula szerepet játszik a membrán internalizációnak ebben a típusában is [51,52]. Az EGFR-ok nagy része fibroblaszt sejtekben kaveolákhoz lokalizáltan helyezkednek el. Érdekes módon ligand által történő stimulálás hatására klatrinnal burkolt képletekbe helyeződnek át és endocitózisuk nagyrészt a klatrinnal burkolt vezikulákkal történik [53]. A kaveolák és egyéb nem burkolt vezikulák szerepét a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában is leírták [54,55]. Több GFKR vizsgálata során felmerült annak a lehetősége, hogy a receptorok aktiválódásuk után kaveolákba helyeződnek át. Megfigyelések utalnak arra, hogy az A-típusú endothelinreceptor endocitózisában részt vevő klatrin, illetve kaveola mediált endocitotikus útvonalak arányát a plazmamembrán koleszterintartalmának megváltoztatásával

13

befolyásolni lehet [56]. A klatrintól független receptorendocitózis azonban nem jelenti egyértelműen a kaveolák részvételét a folyamatban. Több membránproteinről, köztük az AT1Rról is leírták, hogy internalizációjuk független a dinamin fehérjétől, ami mind a klatrin-mediált, mind a kaveolák által létrejövő endocitózisban szerepet játszik. [57,58,59]. A dinamin-független útvonal mechanizmusa azonban gyakorlatilag ismeretlen. Léteznek olyan endocitózis útvonalak is, melyek lipid raftokhoz kapcsolódnak, de nem igényelnek kaveolin fehérjéket. Az egyik ilyen leírt folyamat a makropinocitózis, melynek során lamellipodiumok összezáródásával nagyméretű endocitotikus vezikulák alakulnak ki. A kialakult makropinoszómák membrán anyaga úgy tűnik, hogy több kompartmenten, főként az endoszóma kompartmenten áthaladva végül visszakerül a sejtmembránba. Ezt a membrán körforgást valószínűleg az ARF6 kis GTP-áz fehérje szabályozza [60,61]. Az utóbbi időben írtak le nem stimulált sejtekben egy konstitutív, klatrin független endocitózis útvonalat [62,63]. Az IL-2 receptor konstitutív endocitózisa limfocitákban normális maradt, mikor a klatrinmediált endocitózist gátolták. Mindez arra utal, hogy az endocitózis ebben az esetben klatrintól független útvonalon jön létre. A részletes vizsgálatok kimutatták, hogy az IL-2 receptornak ez az endocitózisa a kaveoláktól is független [63] azonban a folyamat részletes mechanizmusát még nem sikerült föltárni.

A klatrin-mediált receptorendocitózis molekuláris mechanizmusa A különböző endocitózis mechanizmusok közül a klatrin-mediált endocitózist vizsgálták és vizsgálják a legintenzívebben, így a legtöbb adat is erről áll rendelkezésre. Ez a mechanizmus a rá jellemző vezikulákat burkoló, mind struktúrálisan, mind funkcionálisan meghatározó jelentőségű fehérjéről, a klatrinról kapta a nevét. A klatrin burok számos más fehérjét is „magába zár”, amelyek közül az adapter fehérjék mennyisége a legnagyobb, Talán ez is oka lehet, hogy az endocitózis folyamatában részt vevő fehérjék közül ezekről rendelkezünk a legrészletesebb ismeretekkel. Az adapter fehérjék horgonyozzák a vezikula membránját a klatrin burokhoz, de egyéb, közel sem elhanyagolható funkciókkal is rendelkeznek. Az endocitózis molekuláris történéseit vizsgáló kutatások megállapították, hogy az adapter proteinek kapcsolódnak a növekedésifaktor-receptorok karboxil-terminális intracelluláris részéhez is és a receptorokat ezáltal a klatrin burokhoz rögzítik. Szerepük van továbbá a receptorok olyan membrán mikrodoménekhez vezérlésében, amelyek területén elkezd kialakulni, lefűződni egy vezikula. Ezeken a területeken a klatrin burok egy részlete már jelen van, emiatt klatrinnal burkolt bemélyedéseknek hívják az említett

14

képleteket [64,65]. A GFKR-ok endocitózisában központi szerepet játszó β-arresztinek is adapter jellegű funkciót töltenek be. Az eddigi vizsgálatok alapján az endocitózis szabályozásán túl részt vesznek a deszenzitizáció és mitogén jelátviteli utak szabályozásában is [66,29,67,68,69]. A különböző G-fehérjéhez kapcsolt receptorok klatrin-mediált endocitózisában jelentős eltérések mutatkoznak. Különbözhet a receptorendocitózis sebessége, például az A1 adenozinreceptor lassan internalizál, míg az A3-receptor jóval gyorsabban [70]. A receptorendocitózis kinetikájában tapasztalható eltéréseket a különböző endocitotikus utak eltérő arányai, valamint az endocitotikus út fehérjéinek, mint például a β-arresztinnek, a dinaminnak vagy a GIT1-nek, az ADP ribozilációs faktor GTP-áz aktiváló fehérjéjének jelenléte és mennyisége és a receptorok ezekkel szembeni eltérő affinitási viszonyai is okozhatják [71,72]. A transzferrin- és a β2-adrenerg receptor esetében kimutatták, hogy bár mindkettő internalizációja klatrin-mediált, endocitózisuk túlnyomórészt külön vezikulákban megy végbe, amelyek hőmérséklet érzékenysége és β-arresztin tartalma is eltérő [73]. A különböző receptorok foszforilációjának eltérő mértéke is befolyásolja az internalizáció sebességét [74,75].

A klatrin és szerepe a receptorinternalizációban A klatrin-mediált endocitózis során kialakuló vezikula külső, citoplazmával érintkező felszínén kialakuló burok a klatrin fehérjéből álló oligomer struktúra. A burok létrejöttét a klatrin jellegzetes szerkezete teszi lehetővé. Három azonos, 190 kDa molekulasúlyú klatrin nehézlánc trimerizációjával egy nagyon jellegzetes szerkezetű, háromágú strukturát jön létre, amelyben az „ágak” nagyjából 120°-os szöget zárnak be egymással. Ezt a struktúrát nevezik triszkelionnak. A klatrin triszkelionok tömegének bonyolult oligomerizációjával sokszögű, jellemzően hatszögű rácsos szerkezet képes összeépülni nagy foltokban a plazmamembránon. Ezekből a foltokból, a triszkelionokból álló hatszögek mellé ötszögű rácsozat beépülésével térbeli szerkezet alakulhat ki, ami a membrán külső felületén pontszerű bemélyedésként jelentkezik. Ezt hívják klatrinnal borított bemélyedésnek. Ez tulajdonképpen egy vezikula lefűződésének kezdeménye, további ötszög szerkezetű klatrin polimerizációval gömbszerű váz alakulhat ki. 12 ötszög beépülésével (nyolc hatszög mellé) már létre tud jönni a teljes klatrin burok. A kialakuló struktúrát legszemléletesebben egy labda öt- és hatszögekből álló szerkezetéhez lehetne hasonlítani, ahol a triszkelionok a varrások [64]. Ez a klatrin triszkelionokból kialakuló váz borítja be kívülről a lefűződő vezikulát, ami jellegzetes szerkezete miatt elektronmikroszkópos metszeteken kiválóan azonosítható. A klatrinnal burkolt vezikulák így jól elkülöníthetőek a nem burkolt társaiktól.

15

A klatrin nehézlánc molekulát szerkezetileg és funkcionálisan is három részre lehet tagolni. A karboxil-terminális harmada alkotja a triszkelion központi részét, melyet „hub” doménnek neveztek el [76]. Ez a rész tartalmazza a trimer kialakulásáért felelős szekvencia részletet és a 25 kDa molekulasúlyú klatrin könnyű lánc kötőhelyét. A középső harmad alkotja a triszkelion „ág” disztális részét, míg a harmadik harmad egy globuláris szerkezetű terminális domént hoz létre. Ez utóbbi számos olyan fehérje kötőhelyét tartalmazza, melyek interakcióját kimutatták a klatrinnal [77]. A terminális domént kristályosítani tudták az AP-3 adapter komplexszel, melyet az endoszomális membránokhoz asszociálva találtak meg, valamint a βarresztin klatrin kötő szekvenciáját tartalmazó peptidekkel [78]. A klatrin könnyű láncok a triszkelionok „hub” doménjához kötődnek, mindegyik ághoz egy könnyű lánc kapcsolódik. A klatrin triszkelion és a klatrin burok szerkezetét az 1. ábra mutatja. Emlősökben a könnyű láncoknak két formája van, melyek hatvan százalékos egyezést mutatnak (LCa és LCb). A triszkelionok spontán oligomerizációra képesek, mely in vitro és in vivo körülmények közt is jellemző tulajdonságuk. A könnyű láncok kapcsolódása gátolja a triszkelionok polimerizációját (pontosabban a fiziológiás pH alá csökkenti a polimerizáció optimumát) [76]. Az AP-1 és AP-2 adapter fehérjék ezt a gátló hatást meg tudják szüntetni, így az élettanilag optimális pH-n stimulálják a klatrin oligomerizációt.

1. ábra. A. A klatrin triszkelion szerkezete. B. A klatrin burok felépítése

A klatrin burok kialakulásában központi szerepe van az adapter proteineknek is. Mint a klatrin burok egyik komponense, részt vesznek a klatrin polimerizáció elindításában és fenntartásában, illetve alapvetően fontos funkciójuk a klatrin burok és az endocitózisra kerülő membránproteinek, valamint a vezikula membránja közti kapcsolat kialakítása.

16

Az adapter fehérjék szerepe a receptorinternalizációban A membránfehérjék endocitózisa precízen szabályozott folyamatok sokaságát igényli. A membránról lefűződő vezikulák a struktúrfehérjék közreműködésén kívül számos szabályozó fehérje segítségével alakulnak ki. Ezek közül az egyik és talán a legfontosabb azon proteineknek a csoportja, melyek segítségével a membránreceptorok a kialakuló vezikulába kerülnek. Ezeket a fehérjéket közös elnevezéssel adapter fehérjéknek hívják, mert segítségükkel jön létre kapcsolat a klatrin burok és a membránreceptor között. Az adapter proteineknek két nagy csoportját különböztetik meg, a heterotetramer adapter fehérjék csoportját és a monomer adapterek csoportját. Az előző csoport képviselői az AP ( az angol adaptor protein, vagy assembly polypeptide kifejezések rövidítése alapján) fehérjék, míg az utóbbiak közé az arresztin fehérjék tartoznak.

Az AP-2 adapter fehérje Az adapter fehérjék egyik csoportját a heterotetramer szerkezetű molekulák alkotják, melyek az összes eukarióta sejtben megtalálhatóak. A heterotetramer adapterek családjának jelenleg négy (AP-1 - 4) tagja van, melyek közös jellemzője a hasonló, meglehetősen érdekes szerkezet. Mindegyik ilyen komplex két nehéz, egy közepes és egy könnyű lánccal rendelkezik, melyek molekula tömege 100, 50 és 20 kDa. A heterotetramer szerkezetet két dimer hozza létre, az egyiket az úgynevezett variábilis nagy (az AP-2 esetén ez az α) alegység és a kis (σ) alegység, míg a másikat a konzervált nagy (az AP-2 esetén β2) alegység és a közepes méretű (µ) alegység hoz létre. A két dimert a nagy alegységek közti kölcsönhatások

tartják

össze.

elektronmikroszkópos

Az

felvételek

tanúsága szerint a heterotetramerek szerkezetére három domén jellemző, az egyik a központi domén, a másik az úgynevezett fül domén, míg e kettőt

2. ábra. Az AP-2 adapter fehérje sematikus rajza

egy összekötő domén kapcsolja össze [79].

A

fül

doméneket

a

nagy

alegységek polipeptid láncainak karboxil-terminális végei hozzák létre, a központi domént pedig a nagy alegységek maradék részei, illetve a közepes és kis alegységek polipeptid láncai.

17

Az egész struktúra szimmetrikus szerkezetű [80]. Az AP-2 heterotetramer adapter fehérje szerkezetét a 2. ábra mutatja be. A heterotetramer adapterek családjába tartozó fehérjék a klatrin-mediált vezikula lefűződés és transzport különböző, jól meghatározható színterein szerepelnek. Az elsőként leírt adapter protein komplex, az AP-1 a transz-Golgi hálózat és az endoszóma kompartment közötti transzportban működik közre, az AP-2 komplex a plazmamembrán és az endoszómák közti vezikula mozgásokban vesz részt. Az AP-3 adapter komplexet leginkább az endoszómális membránokhoz asszociálva találták meg, míg az AP-4 a transz-Golgi hálózat vezikuláin található [81]. Az emlősök adapter komplexeiről megállapították, hogy in vitro körülmények közt létre tudják hozni a klatrin-adapter protein burkot [81]. A legnagyobb mennyiségben az AP-2 adapter található meg a sejtekben, így ennek működéséről tudjuk a legtöbbet. Az AP-2 komplexről kimutatták, hogy a β lánca tartalmaz egy jellegzetes szekvencia motívumot, melynek segítségével közvetlen kapcsolatba képes lépni a klatrinnal [80,82]. A közepes lánc alkotta alegységen pedig egy olyan szekvencia részletet azonosítottak, amely azokhoz a dileucin, illetve tirozint tartalmazó szignálokhoz tud kötődni, amelyek általánosan jellemzőek az endocitózisra képes membrán fehérjék nagy részére [83,84]. Az AP-2 funkciója kettős. Egyrészt kapcsolódni tud a klatrinnal, ami a feltételezések szerint a klatrin triszkelionok membránhoz történő lokalizációjában játszik fontos szerepet. Ez feltétele a klatrin burok nukleációjának, vagyis a klatrinnal burkolt bemélyedések kialakulásának illetve a további klatrin polimerizációnak, mely a vezikula körüli klatrin burok létrejöttéhez vezet [85]. Másrészt az adapter komplex kapcsolódik az endocitózis útjára lépő membrán fehérjékkel, így azokat a klatrin burok kialakulásának helyére tudja lokalizálni és az endocitózis során a klatrinhoz tudja rögzíteni azokat. Így az endocitózisra kerülő fehérje, az AP-2 adapter komplex és a klatrin szinte egy egységet képez [81]. A heterotetramer adapter komplexek további jellemzője, hogy egyéb fehérjékhez és a membránok foszfolipidjeihez is tudnak kötődni. Az AP-2 komplex α-alegysége tartalmazza azt a lipid kötésben esszenciális aminosav szekvenciát, amelynek megszüntetése a transzferrin-receptor endocitózisának leállását vonja maga után. Ennek oka az lehet, hogy az adapter fehérje nem jelenik meg a klatrinnal burkolt bemélyedésekben [86]. Az α-alegység fül doménjéhez számos olyan fehérje tud kötődni, melyek az endocitotikus folyamatok szabályozásában játszanak szerepet [87].

A β-arresztinek Az arresztint a retina pálcikáiban írták le először, mint amely a rodopszin deszenzitizációjában játszik szerepet [88]. Később a β2-adrenerg receptor működésének

18

szabályozásában is azonosítottak egy arresztin homológot, ami a β-arresztin nevet kapta [89]. Jelenleg az arresztin család négy tagját ismerjük, amelyek közül a két vizuális arresztin kizárólag a retina fotoreceptoraiban expresszálódik, a β-arresztin-1 és β-arresztin-2 viszont a retinán kívül minden sejtben kifejeződik. Ma az arresztinek jelentőségét több folyamat szabályozásában is felismerték. Elsőként megismert funkciójuk a jelátvitel terminációjában, a deszenzitizációban való részvételük volt. Ennek során a β-arresztinek a foszforilált receptorhoz kötődve sztérikusan is megszüntetik a receptor és a G-fehérje közti kapcsolatot [90,7,9]. A deszenzitizációban játszott szerepük mellett a β-arresztinek részt vesznek a GFKR-ok endocitózisában is. Az erre utaló első kísérleti eredmények a kilencvenes évek közepéről származnak. A β-arresztin expressziójának hatására HEK-293 sejtekben megindult a β2adrenerg receptor egyik internalizációra nem képes mutánsának endocitózisa [29]. COS-7 sejtekben az eredetileg lassú kinetikával történő receptorendocitózist a kutatók fel tudták gyorsítani a β-arresztin-2 termeltetésével [91]. Az adatok azt mutatták, hogy a β2-adrenerg receptor internalizációjában az arresztineknek központi szerepük van. A molekula karboxilterminálisán sikerült azonosítani egy klatrin kötésért felelős régiót, mely hasonlóságot mutat az AP-2 adapter protein hasonló funkciójú régiójával és amely számos más, klatrinnal interakcióba lépő molekulán is megtalálható [7,92,93]. Ezek a megfigyelések tették lehetővé elsőként egy a GFKR-ok internalizációjának molekuláris mechanizmusára vonatkozó elmélet megszületését [66]. Ennek értelmében a nem vizuális arresztinek adapter fehérjeként is funkcionálnak, a foszforilált receptorhoz és a klatrinhoz kötődve a receptort a kialakuló vezikulához rögzítik. Később a klatrin triszkelionon, a nehéz lánc terminális doménjén is azonosítottak olyan szekvencia motívumokat, melyek a β-arresztin megkötésben vesznek részt [78]. A βarresztineken azonosított klatrint és AP-2 adapter fehérjét kötő karboxil-terminális régiók a vizuális arresztinekből hiányoznak [7]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában az arresztinek mellett az AP-2 adapter fehérje részvételét is leírták [94]. Az élesztő két hibrid technikával sikerült interakciót kimutatni a β-arresztin-2 és az AP-2 adapter β-alegysége között, amit HEK-293 sejtekben végzett funkcionális vizsgálatok is igazoltak [94]. A β2-adrenerg receptor internalizációja során a β-arresztin és az AP-2 komplex közti kapcsolat az endocitózis korai lépéseiben szükséges, ez a direkt kapcsolódás független a klatrinhoz történő kötődéstől. Azok az arresztin mutánsok, melyek nem képesek ezt az interakciót létrehozni az AP-2 fehérjével, nem tudják az aktivált receptort a klatrinnal burkolt bemélyedések területére lokalizálni [95]. Jelenlegi ismereteink szerint a β2-adrenerg receptor endocitózisához a β-arresztin, a klatrin, valamint az AP-2 adapter fehérje közti megfelelően szabályozott kölcsönhatásra van szükség.

19

A β-arresztin tehát képes a klatrin burok komponenseihez és a GFKR-okhoz is kapcsolódni, így a molekula a receptort a klatrinnal borított bemélyedésekhez tudja irányítani [96]. Kimutatták, hogy a receptor foszforilációjának nagy szerepe van az arresztinek kötődésének felgyorsításában, a β2-adrenerg receptor foszforilációja in vitro 10-30-szorosára növeli a β−arresztin kötését [97]. A β-arresztinek tehát alapvetően fontos funkciókkal rendelkeznek a GFKR-ok endocitózisának mechanizmusában. A receptor a ligand kötést követően aktiválódik, majd az aktivált receptorok a GRK-k hatására foszforilálódnak. A foszforiláció megnöveli a βarresztinek receptorhoz viszonyított affinitását, ami stabilizálja a receptor - β-arresztin kapcsolatot [25]. Ennek következménye egyrészt a receptor G-fehérje kapcsolat megszűnése, másrészt az, hogy a receptorok a klatrin burok komponenseihez kötődnek a β-arresztineken keresztül. Az így kialakult molekuláris komplexben a β-arresztineken keresztül az aktivált, majd deszenzitizálódott receptor és a klatrin burok között jön létre kapcsolat, aminek következtében a receptor a klatrinnal burokolt bemélyedésekhez irányítódik és rögzül az időközben kialakuló klatrinnal burkolt vezikula vázához [29]. A β−arresztinek szerepét elsőként a β2-adrenerg receptor internalizációjában mutatták ki a β-arresztinek domináns-negatív mutánsainak endocitózist gátló hatása alapján [29]. Azonban a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok nem mindegyikét gátolják ezek a mutánsok. Ez alapján az arresztin „érzékenység” alapján a GFKR-ok endocitózis mechanizmusát két csoportra osztották, arresztintől függő és arresztintől független mechanizmussal internalizáló kategóriákba sorolva őket [59,57]. A korai vizsgálatok alapján az AT1-receptor endocitózisát is az arresztin-független csoportba sorolták [59]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok β-arresztin függő endocitózisához szükség van a dinamin GTP-ázok működésére is, de a β-arresztintől független internalizációs folyamatok egy része dinamintól független mechanizmussal is létrejöhet [98]. Eddig a β-arresztinek klasszikus, a jelátviteli folyamatok kikapcsolásában és az endocitózisban betöltött szerepét ismertettem. Az utóbbi néhány évben azonban egyre gazdagodnak az ismereteink a β-arresztinek egy új funkciójáról, amely a mitogén aktivált protein kináz (MAPK) kaszkádokon keresztül történő jelátvitel szabályozásával van összefüggésben. Az első kísérleti eredmény, mely ebbe az irányba mutatott, a β-arresztin-1 és az Src tirozinkináz közti molekuláris interakció kimutatása volt [99]. Korábban az Src kinázt a Gfehérje βγ alegységéről kiinduló és az EGFR foszforilációján keresztül létrejövő MAPK kaszkád aktiválásért tartották felelősnek [100]. Az Src kinázokról később kimutatták, hogy részt vesznek az endocitózist végző molekula komplex fontos komponenseinek, a klatrinnak és a dinaminnak a foszforilációjában, ezáltal az EGFR és a GFKR-ok endocitózisának

20

szabályozásában is részt vesznek [101,102]. Más vizsgálatok arra utaltak, hogy a β2-adrenerg receptor ERK1/2 aktiváló képessége nemcsak az Src kinázoktól, hanem a receptor internalizációjától is függ [103]. A β-arresztinek szerepe a MAPK kaszkádokon keresztül történő jelátvitel aktiválásában az újabb vizsgálatok fényében központi jelentőségűnek bizonyult. Ebben a jelátviteli rendszerben a β-arresztin több, mint egy adapter fehérje. Sikerült megállapítani, hogy a βarresztin váz fehérjeként funkcionál két MAPK kaszkád rendszer esetében is. A proteináz aktivált receptor 2 (PAR2) agonista által történő stimulálás hatására kialakít egy multiprotein komplexet, mely az aktivált receptort, a β-arresztin-1-et, a Raf-1 és az ERK1/2 kinázokat tartalmazza [67]. A vizsgálatok arra utaltak, hogy az ERK rendszer egy másik kináza, az ERK1/2 fehérjéket foszforiláló MEK1 is tagja a komplexnek. Így tehát a β-arresztinhez az ERK kaszkád hierarchiájában egymás „fölött” elhelyezkedő kinázok kapcsolódnak. COS-7 sejtekben írták le, hogy a β-arresztin-2 molekulához egy másik MAPK, a c-Jun amino-terminális kináz 3 (JNK3) kapcsolódhat, melynek aktiválása az emlős sejtekben számos növekedési, differenciációs és apoptotikus jelenséget indít el. A JNK3 fehérjén kívül sikerült kimutatni a kaszkád hierarchiában a JNK3 fölött álló, azt foszforiláló MKK4 (MAPKK) és ez előbbit foszforiláló ASK1 (MAPKKK) fehérjének a β-arresztinhez történő kapcsolódását is [69]. Hasonló rendszert írtak le az AT1AR esetében is, itt a β-arresztin-2 fehérjéhez a Raf-1 és az ERK2 kináz kapcsolódik, de a komplex része a MEK1 is [68]. Agonista által történő stimulálás hatására az AT1ARral immunprecipitálható β-arresztin, Raf-1 és ERK2 mennyisége is többszörösére növekszik, továbbá COS-7 sejtekben a Raf-1 expresszió növekedésére a βarresztinhez asszociált foszfo-ERK2 mennyisége 30-35 szeresre növekedett [68]. Mind az ERK, mind a JNK3 kaszkád és a β-arresztin által létrehozott komplexre igaz, hogy a GFKR aktiválása a β-arresztin és az aktivált ERK, illetve JNK3 nagymértékű feldúsulásához vezet az endoszóma vezikulákon. A vizsgálatok szerint ennek további következménye az, hogy az aktiválódott MAPK-ok nem jutnak be a sejtmagba, így ezek az enzimek a génexpressziós mintázat megváltoztatása helyett citoszolikus szubsztrátokat foszforilálnak [68,69]. A β-arresztin által biztosított vázhoz kapcsolódnak tehát a MAPK kaszkád komponensei, létrehozva ezáltal egy szignalizációs komplexet. Ennek jelentőségét ma abban látjuk, hogy a reakcióba lépő partnerek egymás közelébe helyezésével hatékonyabbá teszi a fehérjék közti interakciót, biztosítja a jelátviteli folyamat specifikusságát, valamint fenntartja a fehérjék megfelelő sejten belüli lokalizációját [104].

21

Dinamin GTP-ázok szerepe a receptorendocitózisban Az endocitotikus vezikula képződésének utolsó lépése a vezikula leválása a plazmamembránról. A vezikula leválásában igen fontos szerepe van egy 100 kDa molekula tömegű GTP-áz fehérjének, a dinaminnak. E fehérje szerepét eredetileg a Drosophila melanogaster shibire mutánsaiban írták le, ahol a szinaptikus vezikulák lefűződése károsodott a dinamin mutációja következtében [105]. Emlősökben a dinamin három izoformáját írták le, melyek közül a dinamin-1 csak neurális szövetekben, a dinamin-2 minden szövetben, a dinamin-3 pedig a herében és neurális szövetekben expresszálódik [106]. A dinamin homotetramerek formájában található meg a sejtben, de a membránok felszínén a tetramerek in vitro körülmények közt spirál vagy gyűrű alakú szupramolekuláris struktúrákba rendeződnek [107,108,109]. Ezek a struktúrák in vivo is megfigyelhetőek a klatrinnal burkolt bemélyedések nyaka körül [110]. A magasabb rendű struktúrák létrejötte nagymértékben növeli a dinamin GTP-áz aktivitását, ami a vezikulák lefűződéséhez szükséges [111]. A dinamin funkciója még nem teljesen tisztázott, szerepének magyarázatára három modellt állítottak fel. Két modell is azt feltételezi, hogy a dinamin közvetlenül, a GTP-áz aktivitás hatására történő konformáció változása miatt okozza a vezikulák leválását a membránokról [112,113]. A harmadik modell szerint azonban a dinamin szabályozó fehérje és további effektor molekulák működését szabályozva vesz részt a vezikulák membránról történő elszakításában [114].

A receptor molekula ubikvitinációjának szerepe a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában Az első közlemények, amelyek arról tudósítottak, hogy emlős plazmamembrán fehérjékhez ubikvitin molekulák kovalensen kapcsolódnak, az 1980-as évek közepén jelentek meg [115,116]. A sejtfelszíni receptorok ubikvitinációjával kapcsolatban a kilencvenes évek közepétől kezdtek bővülni az ismeretek, mikor egyre több tirozin-kináz receptorról mutatták ki, hogy ligand kötést követő aktiválódásuk során ubikvitinálódnak. Ezek a megfigyelések fölvetették az ubikvitin konjugáció hagyományos, már ismert szerepén túl valamiféle regulációs funkciójának lehetőségét is. Napjainkban számos emlős és élesztő membránreceptorról, transzporterről és ion csatornáról ismert, hogy ubikvitin módosításuk összefüggésben van működésük

szabályozásával

[117,118].

Az

ubikvitin

rendszer

közreműködése

a

receptorműködés szabályozásában az újdonság erejével hatott, és jelentősen átalakította az ubikvitin szerepéről korábban kialakult hagyományos képet.

22

Az ubikvitin egy 76 aminosav hosszúságú polipeptid, mely minden eukarióta sejtben kifejeződik és amely nagy mértékben konzerválódott a törzsfejlődés során (az élesztő és az ember ubikvitinje csak három aminosavnyi eltérést mutat). A korábban feltárt, részleteiben is ismert funkciója szerint, ennek a fehérjének kiemelt szerepe van a sejtek működése szempontjából rendkívül fontos szabályozott protein lebontás proteaszomális komponensében. A szabályozott proteolízis során a sejtek fehérjéinek egy része a citoszolban és a sejtmagban elhelyezkedő hatalmas protein-komplexben, a 26S proteaszómában kerül lebontásra. Itt főként a citoszolban, illetve a sejtmagban található olyan proteinek bomlanak le, melyek mennyisége gyors és pontos szabályozás alatt kell, hogy álljon (pl. a sejtciklust irányító fehérjék, transzkripciós faktorok). A proteaszómák működése elválaszthatatlanul összekapcsolódik az ubikvitin fehérjével, így jogosan szokták az eukarióta sejtek e proteolítikus rendszerét ubikvitinproteaszóma degradációs rendszernek, vagy egyszerűen csak ubikvitin rendszernek nevezni [119,118]. Az ebben a rendszerben lebontásra kerülő fehérjéken egy kovalens módosítás történik, melynek során az ubikvitin molekuláiból álló láncok kapcsolódnak a degradációra kerülő fehérjéhez. Ez a poliubikvitin konjugáció irányítja a degradáció útjára az adott proteint, ezt a jelölést ismeri fel a proteaszóma [119]. Napjainkra már több mint hatvan olyan fehérjét írtak le, amelyekhez ubikvitin lánc kapcsolódik. Az ubikvitináció egy multienzim-rendszer segítségével jön létre, három különböző enzimaktivitás kaszkádszerű működésének eredménye. Ezek sorában az első az E1, vagy ubikvitin aktiváló enzim, a második az E2 vagy ubikvitin konjugáló enzimek (Ubc), míg a harmadik az E3, vagy ubikvitin protein ligáz enzimek csoportja. Az enzimrendszer első tagjának hatására, az ubikvitin karboxil-terminális glicin aminosavja aktiválódik egy ATP-t igénylő lépésben, majd az E1 enzim egyik cisztein oldalláncával tioészter kötést hoz létre. Ezt követően az aktivált ubikvitin az E2 enzim aktív helyének cisztein oldalláncára tevődik. A harmadik lépésben az ubikvitin karboxil-terminális glicin és a szubsztrát fehérje egyik lizin oldalláncának ε-amino csoportja között amid-izopeptid kötés jön létre, melyet az ubikvitin ligáz (E3) enzim katalizál. Az enzimrendszer és az ubikvitin-proteaszóma rendszer vázlata a 3. ábrán látható. Az E1 enzimekből az eukariótákban általában csak egy található, az E2 enzimek száma élesztőben 13, emlősökben legalább 25 [120]. Az E3 enzimek száma folyamatosan nő, egyre több ilyen enzimet karakterizálnak. Ezeknek az enzimeknek nagyon eltérő a felépítése és szerkezete, aminek alapján az E3 enzimeknek már több családját különítették el. Az ubikvitin ligáció és így a protein degradáció specifikusságát úgy tűnik, hogy az E3 ligázok adják, mert képesek felismerni a szubsztrát molekulákat. Sok esetben a szubsztrát és az E3 ligáz kapcsolata indirekt, adapter proteinen keresztül jön létre, néhány esetben a protein ligáz aktivitás nagy, sok

23

alegységből álló fehérje komplexek működéséhez kapcsolódik. Az E3 enzimeknek jelenleg négy fő típusát különböztetik meg [119]. E1

peptidek

SH

Ub

Ub

Ub

26S proteaszóma

E1

E2

Ub

E1 S

Ub

SH

SH E2

S

Ub

Ub E3

fehérje

E2 E2

SH

E3

SH

Ub

Ub

fehérje E2

Ub

S

E3

Ub

Ub fehérje

fehérje

E3

3. ábra. Az ubikvitin-proteaszóma rendszer általános vázlata. A rajz leegyszerüsítve, a lényegi folyamatokat kiragadva mutatja be az ubikvitin-proteaszóma rendszer működését. A fehérjék ubikvitinációja három egymást követő enzimatikus lépés során valósul meg. Az ebben részt vevő enzimek sorában az első az E1, vagy ubikvitin aktiváló enzim, a második az E2 vagy ubikvitin konjugáló enzimek csoportja, míg a harmadik az E3, vagy ubikvitin protein ligáz enzimek csoportja. Az enzimrendszer első tagjának hatására, az ubikvitin karboxil-terminális glicin aminosavja aktiválódik egy ATP-t igénylő lépésben, majd az E1 enzim egyik cisztein oldalláncával tioészter kötést hoz létre. Ezt követően az aktivált ubikvitin az E2 enzim aktív helyének cisztein oldalláncára tevődik. A harmadik lépésben az ubikvitin karboxilterminális glicin és a szubsztrát fehérje egyik lizin oldalláncának ε-amino csoportja között amid-izopeptid kötés jön létre, melyet az ubikvitin ligáz (E3) enzim katalizál. Az ubikvitinált fehérje a 26S proteaszómába kerül, ahol degradálódik. Elsőként az ubikvitinlánc lehasad, majd ezt követően a fehérjék rövid polipeptidekre fragmentálódnak a proteaszómákban. A poliubikvitin lánc egységeire esik szét, a szabaddá vált monomer ubikvitin molekulák új ubikvitinálási reakcióban vehetnek részt. Jelölések az ábrán: Ub – ubikvitin, E1 – ubikvitin aktiváló enzim, E2 – ubikvitin konjugáló enzim, E3 – ubikvitin ligáz enzim, fehérje – az ubikvitin-proteaszóma rendszerben degradációra kerülő fehérje

Az ubikvitináció jellemző tulajdonsága, hogy az azt végző enzimrendszer nemcsak a célfehérje lizin oldalláncait módosítja, hanem az egyszer már izopeptid kötéssel odakapcsolt ubikvitin molekulákhoz jellemzően az ubikvitin 48-as pozíciójában lévő lizin oldalláncán keresztül újabb és újabb ubikvitin egységeket kapcsol. Így akár húsz vagy még több ubikvitin egységből álló poliubikvitin lánc is létrejöhet a lebontásra ítélt fehérje lizin aminosavjain. A

24

vizsgálatok azt mutatták, hogy a protein degradáció szempontjából ezek a poliubikvitin láncok képviselik a valódi szignálokat, melyeknek minimum négy egységből kell állniuk [121]. Az elmúlt években vált világossá, hogy az ubikvitin rendszer funkciója túlmutat a fehérjék degradációján. Sok celluláris folyamat szabályozásában tárták fel az ubikvitin modifikáció szerepét, melyek nem kapcsolódnak a pokiubikvitin láncok által közvetített és a 26S proteaszómához kapcsolt fehérje lebontással [122]. Ezek közül az egyik legérdekesebb és leggyorsabban növekvő terület a plazmamembrán fehérjék működésének és a vezikula transzport folyamatoknak a szabályozása. A kilencvenes évek második felében a molekuláris biológia egyik vezető lapjának hasábjain publikálták azt a közleményt, amely elsőként tudósított a GFKR családba tartozó egyik receptor ubikvitinációjáról és ennek a receptor működésben betöltött alapvető fontosságú szerepéről [123]. A Saccharomyces cerevisiae élesztő szaporodási faktor receptorai közül az αfaktor receptor endocitózisát vizsgálták a kutatók. A receptort az élesztő α-faktor feromonja stimulálja, aminek hatására olyan jelátviteli utak aktiválódnak, melyek az élesztő sejtműködéseit megváltoztatva sejtfúzióra teszik képessé, amit majd a sporuláció követ. Megállapították, hogy az a receptor karboxil-terminális intracelluláris része aktiválódást követően hiperfoszforilálódik, majd ubikvitinálódik. Meglepő módon az ubikvitináció itt csupán egy ubikvitin molekula és nem pedig ubikvitin láncok receptorhoz kapcsolódását jelenti. Ennek a kovalens módosításnak a helyét a karboxil-terminális régió korábban már leírt kilenc aminosavból álló részletében határozták meg (SINNDAKSS), melynek megléte szükséges és elégséges feltétele az α-faktor receptor ligand által indukált endocitózisának [124]. Az ebben a motívumban található Lys337 aminosav argininra cserélése meggátolta a receptor-ligand komplex internalizációját és ubikvitinációját is [123]. A monoubikvitinációnak a receptor internalizációjában betöltött szerepére utal az is, hogy azokban a mutáns élesztő törzsekben, melyekben az ubikvitinációs rendszer különböző enzimjei nem működnek, az α-faktor receptor ligand által indukált endocitózisa gátolt [123]. Az élesztő α-faktor receptorának internalizációjában rendkívül fontos a szerepük a Lys337 aminosavat körülvevő szerineknek is. A SINNDAKSS internalizációs szignál szekvenciában található szerin aminosavak kicserélésével a receptor elveszti mind a ligand indukált monoubikvitináció, mind az endocitózis képességét [123]. Ezek az aminosavak a

receptor

agonista

kötésének

hatására

foszforilálódnak,

ami

feltétele

a

receptor

endocitózisának. A receptor karboxil-terminális régiójának hiperfoszforilációja pozitív regulátora a szomszédos lizin monoubikvitinációjának is [125]. További vizsgálatok kimutatták, hogy az α-faktor receptor internalizációjához a receptor karboxil-terminális régiójának monoubikvitinációja már elegendő szignál. A receptor karboxil-terminális intracelluláris régiójában nyolc lizin aminosav található. Ezek közül a Lys304, mely a legközelebb helyezkedik

25

el a hetedik transzmembrán régióhoz, nem vesz részt az ubikvitinációs reakciókban [123]. Az a receptor mutáns, melynek karboxil-terminális intracelluláris hurokjának kétharmad részét eltávolították, már csak két lizin aminosavat tartalmazott a 304 és 337-es pozíciókban. Ez a mutáns a vad típusú receptorral azonos mértékű endocitózist mutatott, azonban ha a Lys337-es aminosavat argininra cserélték, az internalizáció nagy mértékben lecsökkent. Amennyiben egy nagy mértékben csökkent ligand által indukált endocitózist mutató mutánshoz - melyben többek mellett a Lys337-t argininra cserélték - karboxil-terminálisan hozzákapcsoltak egy ubikvitin fehérjét, visszaállt a receptor endocitózisának mértéke [126]. Ez a megfigyelés egyértelműen jelzi, hogy az internalizációs szignált az ubikvitin fehérje jelenti. A későbbi kísérletekben bebizonyosodott, hogy egyetlen ubikvitin molekula receptorhoz kapcsolódása is elegendő az internalizáció beindításához, még abban az esetben is, ha a receptornak a teljes karboxilterminális régiója hiányzik [127]. Az endocitózisnak az ubikvitináción kívül nincsen más szerkezeti feltétele, a foszforiláció csak az ubikvitin kapcsolódását segíti elő. Ezt bizonyította az is, hogy amikor a vizsgálatokat végző kutatók az élesztő egyik stabil membránproteinjéhez, a Pma1p protonpumpa karboxil-terminális végéhez kapcsoltak egy ubikvitin molekulát, majd a kimérát kifejeztették az élesztőben, az eredetileg stabilan a membránban található fehérje internalizálódni kezdett. A vad típusú protonpumpa fél életideje 11 óránál is több, míg az ubikvitinnal megtoldott kiméra fél életideje három órára csökkent [127]. Ha az ubikvitin Lys48as aminosavát argininra cserélték, és ezzel megakadályozták a poliubikvitin láncok kialakulását, az endocitózis akkor is létrejött [126]. Az újdonság ebben a megfigyelésben épp a monoubikvitináció volt. Korábban az ubikvitin rendszer szerepét a szabályozott protein degradációban írták le, azonban ott poliubikvitin láncok jelentik a szignált, melyek a 26S proteaszómába irányítják a fehérjéket. Az élesztő α-faktor receptora esetében az ubikvitin egy teljesen más területen játszott főszerepet, amely az ubikvitin rendszer funkciójának átértékelését tette szükségessé. Bebizonyosodott, hogy az ubikvitin nem proteolítikus folyamatok szabályozásában is szerepet játszik és melyekben a monoubikvitináció a központi jelentőségű a poliubikvitinációval szemben [122]. Az élesztő másik szaporodási fakora az a-faktor. Ennek receptora szintén a GFKR családba tartozik. A receptorra jellemző egy viszonylag nagy mértékű konstitutív endocitózis. Mind a konstitutív, mind az a-faktor által indukált internalizáció összefüggésben áll az ubikvitinációval [128]. E receptornak is azonosították azt a karboxil-terminális régiójában elhelyezkedő szekvencia részletét, amely a receptor ubikvitinációjáért és internalizációjáért felelős [129]. Megállapították, hogy ez a részlet egy 36 aminosav hosszúságú, PEST-szerű szekvencia. A PEST szekvencia a rövid életidejű fehérjékre jellemző prolin, glutaminsav, szerin és treonin aminosavakban gazdag szekvencia, mely ezeknek az instabil proteineknek a gyors

26

degradációjához

szükséges

[130].

Az

a-faktor

endocitózisára

nem

jellemző

a

monoubikvitináció, sokkal inkább az ubikvitin Lys63-én keresztül megvalósuló di- és poliubikvitináció. Az internalizációra képtelen, PEST-szerű szekvenciájától megfosztott mutáns receptor ismét képessé válik endocitózisra, ha ubikvitin fehérjét kapcsolnak hozzá [131]. A receptor-ubikvitin kimérának ez a tulajdonsága arra utal, hogy a monoubikvitináció is elegendő szignál az endocitózis létrejöttéhez. Az emlősök receptorai közül az endocitózis és ubikvitináció közti kapcsolat szempontjából a növekedésihormon- és az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) a két leginkább tanulmányozott receptor. A növekedésihormon kötődésének hatására a receptor ubikvitinálódik majd megindul az endocitózisa. Mind a két folyamat gátolható olyan sejtekben, melyek nem tartalmaznak intakt ubikvitinációs rendszert [132]. A receptor karboxil-terminális citoplazmatikus részén a kutatók két olyan motívumot tudtak azonosítani, melyek részt vesznek az endocitózisban. Az egyik motívum az ubikvitinációtól függő folyamatban szerepel, ez szabályozza az intakt receptor internalizációját [133], míg a másik egy dileucin motívum. Ez utóbbi csak a részlegesen deletált karboxil-terminális doménnal rendelkező receptor mutánsokban aktív [134]. Érdekes módon az ubikvitináció dependens internalizációs szignál nem tartalmaz lizin aminosavakat. Az eddigiek fényében a kutatók további furcsaságot tapasztaltak a karboxil-terminális részén lizineket nem tartalmazó mutáns növekedésihormonreceptor vizsgálata során. A mutációk gátolták ugyan a receptor mutáns direkt ubikvitinációját, azonban endocitózisának mértéke nem csökkent le. Ugyanakkor ha az ubikvitináció dependens internalizációs motívumban történt mutáció, akkor mind az ubikvitináció, mind az internalizáció gátlódott [133]. Mindez arra utal, hogy az ubikvitináció dependens internalizációs szignálhoz olyan komplexek kötődhetnek, melyek ubikvitinálják a receptort, és ezek a komplexek kapcsolják a receptort az endocitózis folyamatához. Az EGFR ligandjának megkötését követően foszforilálódik, ám a ligand kötés másik hatása a receptor poliubikvitinációja [135]. A vizsgálatok kimutatták, hogy az ubikvitináció összefüggésbe hozható az EGFR ligand kötését követő egyik első protein interakcióval, a c-Cbl nevű adapter fehérje receptorhoz történő asszociációjával. A c-Cbl fehérje fontos szerepet tölt be a receptor működés szabályozásában, a szignalizációs folyamatok egyik negatív regulátorát azonosították benne [136]. Túltermeltetése megnövelte a receptor down-regulációját és szintén megnövelte a ligand kötés hatására bekövetkező receptor ubikvitináció mértékét [137]. Az EGFReceptor ubikvitinációja nagyon fontos szabályozási lépés, amit elsőként az onkogén, virális Cbl mutánsok tumorokat indukáló hatása bizonyított. A v-Cbl fehérjék az EGF downregulációját zavarják meg, mert az endocitózissal a sejtbe került receptort visszairányítja a sejtfelszínre, míg normális körülmények között az internalizált receptorok nagy többsége a

27

lizoszómába kerül, ahol degradálódik [137]. A receptor ubikvitinációja tehát összefügg a sejten belüli endoszómális vándorlással, a lizoszóma felé történő irányítással. Ugyanakkor az is ismert, hogy a receptor ubikvitináció elmaradása az receptor endocitózisának kinetikáját nem változtatja meg. A meglepetést az jelentette, mikor a kutatók megállapították, hogy az ubikvitin receptorhoz kapcsolódásáért maga a c-Cbl a felelős, egyik doménje ubikvitin-ligáz (E3 enzim) aktivitással rendelkezik. Ez a domén a Cbl onkogén változataiban nem, vagy működésképtelen formában található meg, így a receptor ubikvitinációja a Cbl mutánsokat tartalmazó sejtekben erősen csökkent mértékű [138,139]. A receptor ubikvitin módosítása a jelenlegi elképzelés szerint az endoszómális „sorting” során játszik szerepet. A poliubikvitin egy molekuláris jelzés, melynek megléte vagy hiánya meghatározza, hogy a lizoszóma felé menő útvonalra, vagy a plazmamembránba visszatérő útvonalra kerül-e egy receptorokat tartalmazó endoszóma vezikula. Vizsgálataink megkezdésekor az emlősök GFKR-ainak ubikvitinálással történő szabályozásával kapcsolatban mindössze egyetlen adat volt ismert, amely a rodopszin ubikvitinációjáról tudósított [140]. A fototranszdukciós rendszer regulációjának vizsgálata során a pálcikákból sikerült izolálni rodopszin-ubikvitin konjugátumot és szabad ubikvitint [140]. A feltételezések szerint az ubikvitin-rendszer a protein degradáción keresztül a fotoreceptorproteinek mennyiségét szabályozza, vagyis az ubikvitináció az ubikvitin-proteaszóma rendszer működéséhez kapcsolódik.

A receptorinternalizáció szerepe a receptorok érzékenységének szabályozásában A korai vizsgálatok alapján a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisának szerepét a receptorok deszenzitizációjában látták [141]. A vizsgálati módszerek finomodása és az endocitózis mechanizmusának, benne a β-arresztinek szerepének megismerése sok szempontból tarthatatlanná tette az eredeti elképzelést. Sikerült meghatározni a receptorok aktiválódását követő folyamatok kinetikáját, ami alapján világossá vált, hogy a receptorok agonista által történő stimulálás utáni homológ deszenzitizációja a legtöbb esetben perceken belül megtörténik. Ezt a mai tudásunk szerint elsősorban a GRK-ok hatására létrejövő receptor foszforiláció okozza [142,143]. Amint arról már szó esett, a β-arresztinek a legtöbb GFKR esetében legalább kettős funkciót látnak el, részt vesznek a receptor deszenzitizációjában, másrészt szerepet játszanak a receptor endocitózisában. Endocitózisra így olyan receptorok kerülnek, melyek már nem kapcsolódnak a G-fehérjével, vagyis az internalizáció funkciója elsődlegesen nem lehet a receptor deszenzitizációja. Egyre több érv szól azonban amellett, hogy

28

a

receptorendocitózis

szerepét

a

receptorok

érzékenységének

helyreállításában,

a

reszenzitizációban kell keresni. Ez utóbbi folyamat során az endocitózissal a sejt belsejébe került receptorokról az endoszómák savas környezetében leválik a ligand, valamint a foszforilált receptor defoszforilálódik, ezáltal visszanyeri aktiválhatóságát [142]. A defoszforilált receptor ezt követően vagy a lizoszómákba kerül és degradálódik, vagy a reciklizációnak nevezett folyamattal visszajuthat a sejtmembránba ahol újra képes agonista kötés hatására aktiválni a jelátviteli mechanizmust [144,9]. Sikerült kimutatni, hogy a receptorendocitózis specifikus inhibitorokkal történő gátlása megakadályozza a receptorok reszenzitizációját, de nem befolyásolja a receptorok jelátvitelét vagy deszenzitizációját [145]. További bizonyítékot

4. ábra. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisának egyik lehetséges mechanizmusa és ennek szerepe a receptor érzékenységének szabályozásában. A rajz a GFKR-ok endocitózisának folyamatát ábrázolja a β2-adrenerg receptor alapján A ligand megkötése után az aktivált receptorokat G-fehérjéhez kapcsolt receptor kinázok (GRK) foszforilálják, ami elősegíti a β-arresztinek kötődését a receptorhoz. Ezek a fehérjék az aktivált receptort szétkapcsolják a G-fehérjétől, így a receptort deszenzitizálják. A β-arresztin fehérjék emellett a receptort a klatrin burokhoz irányítják, ahol megindul az aktivált receptorok endocitózisra. Az internalizáció során az endocitótikus vezikulákba jutott receptorokról a savas pH hatására leválik az agonista, a receptort intracelluláris foszfatázok defoszforilálják, így a receptor újra aktiválható állapotban visszajuthat a sejtmembránba vagy lizoszómális degradációra kerül. A: agonista, P: foszfátcsoport.

29

jelentett, mikor kiderült, hogy a β2-adrenerg receptor internalizációra nem képes mutánsainak melyek jelátvitele és deszenzitizációja normális - reszenzitizációja gátolt [146]. Mára számos Gfehérjéhez

kapcsolt receptor esetében tudták bizonyították az endocitózis receptor

reszenzitizációban betöltött szerepét [145,147,148].

Az angiotenzinreceptorok áttekintése Az Ang II egy oktapeptid hormon (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), amely a reninangiotenzin rendszer fő effektor hormonja. Az Ang II központi szerepet játszik a szervezet vérkeringésének és só-vízháztartásának szabályozásában. A vesében termelődő renin hatására a angiotenzinogén plazmafehérjéből angiotenzin I keletkezik, melyből a keringési rendszerben az angiotenzin konvertáló enzim hasítja le a biológiailag aktív Ang II-t. Az Ang II a központi idegrendszerben neurotranszmitterként is szerepet játszhat. Az Ang II a célszervek sejtjeinek felszínén található specifikus receptorokhoz kötődik, ennek hatására intracelluláris jelátviteli utak indulnak be. Ezek egyrészt azonnali válaszokat hoznak létre (aldoszteron szekréció, vazokonstrikció, szomjúságérzet), másrészt hosszabb távon sejtproliferációs, differenciálódási és apoptotikus folyamatokat szabályoznak. A renin-angiotenzin rendszer működésének befolyásolásával, az angiotenzin konvertáló enzim gátlókkal és az AT1-receptort blokkoló vegyületekkel kedvező eredményeket értek el a magas vérnyomás és más keringési betegségek kezelésében. Az Ang II sejtfelszíni receptorainak két altípusa különíthető el emberben: az egyes (AT1) és a kettes típusú (AT2) angiotenzin receptor [149]. Mind a két receptor a hét transzmembrán domént tartalmazó receptorok családjába tartozik, melyek közös jellemzője a heterotrimer GTP-kötő fehérjéken, vagy röviden G-fehérjéken keresztül létrehozott jelátvitel. Az Ang II mindkét receptorhoz hasonlóan nagy affinitással kötődik, azonban az AT1- és AT2Rok között farmakológiailag, nem-peptid antagonista kötésük alapján különbséget lehet tenni. A két receptort később molekuláris biológiai módszerekkel is azonosították. Megállapították, hogy az AT1R emlősökben 359, az AT2R 363 aminosavból álló glikozilált fehérje. A két receptor egymással 32-34 % hasonlóságot mutat [150,151,152]. A szerkezeti hasonlóságok ellenére a két receptor funkciója úgy tűnik, alapvetően különbözik. Az AT1-R agonista kötésre bekövetkező aktivációja Gq-fehérjén keresztül intracelluláris Ca2+-jel kialakulásához és PKC aktiválódásához vezet, valamint sejtnövekedési és differenciálódási hatásokat is beindít. Ezzel szemben az AT2R a legtöbb sejtben növekedést gátló hatásokat közvetít, tirozin-foszfatázokat aktivál és apoptózist indukál [149]. Szöveti eloszlásukra is különböző, a hormon ismert célszerveiben az AT1R

30

található meg, míg az AT2R a magzati szövetekben, agyban és a reproduktív szervekben expresszálódik nagyobb mennyiségben [149]. Az AT1R-nak rágcsálókban két, egymással 90 %-ban azonos altípusa, az AT1A és az AT1B receptor ismert [150,153,154]. Az AT1AR altípus főként érfal simaizomsejtekben, májban, vesében, tüdőben és a központi idegrendszerben fordul elő, az AT1B altípus pedig a mellékvesében és a hipofízisben található inkább. Az eddigi vizsgálatok eredményei alapján az AT1A és AT1B receptor altípusok között sincs jelentős farmakológiai és funkcionális különbség [149]. A patkány érfal simaizomsejtből származó AT1AR aminosav szekvenciája az 5. ábrán látható.

31 9

32 3

32 5

33 3

33 8

33 6 33 5

34 2

IC

35 1 35 0

EC

K P C D D Q I R K I G D E A S S N L A M NH2 A E SR G T N Y I K I N R N W R P H Y GV I H DC F T S E E S H L G V AF M N D I Q T S C A H I L F I Y T L V P Y L I C I V Y D V F G D NR VA AM T M I V I A K LG F T L W P S I V H I T P P L L F T K L S V A L Y T I A Q I N I S L L T H LS P L G I A C I I S N L F F VW P A F L Y F V L L D C Y GA A S FP NN F F F S VG A M V F C L F F A 70L L L I F L F G I W L L V NP I I L T I L NS L L N L I I F C T S L V AM C F L S Y V I I VK T SA V F L G T L Y I D R V I I A RY GK I W F I V T V L Y K K K M L DD F A A F T N L Y I L M K K R R V K K R P K H A Y E I Q K N K Y PMK S R L F L Q K KA S S S MN D S P R Y S L T S MK T S L S S H S K A K P P I Y K L L P A S C F E V E COOH

5. ábra. A patkány AT1A-angiotenzinreceptorának aminosav szekvenciája. Piros háttérrel jelöltem azokat az aminosavakat, amelyek vizsgálatát az értekezésben tárgyalt kísérletek során elvégeztük. Az aminosavakat az egybetűs kódjuk jelöli. A plazmamembrán lipid kettősrétegét a két vízszintes vonal jelképezi. EC – extracelluláris tér, IC – intracelluláris tér

Az AT1R a hagyományos jelátviteli útján a Gq/11 családba tartozó heterotrimer Gfehérjéken keresztül foszfolipáz C-β1 enzimet aktivál, ami hasítja a foszfatidilinozitol-4,5biszfoszfátot, ennek hatására inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3) és diacil-glicerin (DAG) keletkezik. Ezeknek a másodlagos hírvivőknek a keletkezése intracelluláris Ca2+-jel kialakulásához és a protein-kináz C aktivációjához vezet. A receptor hagyományos G-fehérjén keresztül létrejövő jelátviteli útja mellett több alternatív jelátviteli útvonalát is leírták, többek között intracelluláris tirozinkinázok, foszfolipáz C-γ1, JAK/STAT útvonal és Akt/PKB

31

aktiválását, valamint a kis G-fehérjék közül a Rho, Ras és Rac aktivitásának szabályozását [149,155,156,157,158,159]. Mindezek mellett a receptor képes MAPK kaszkádok aktiválására is. Ezek közül az ERK1/2, a p38 MAPK és a JNK3 aktiválásához vezető folyamatokról rendelkezünk részletesebb ismeretekkel [160,161,69]. A jelátviteli utak aktivitását a Gfehérjéhez kapcsolt receptorokra általánosan jellemző receptor szintű szabályozás befolyásolja, a gyors deszenzitizáció, valamint hosszú távon a down-reguláció folyamata, a sejtben található összes receptorszám csökkenése [162,163,164].

Az AT1 angiotenzinreceptor endocitózisa Az Ang II sejtekbe történő felvételét több mint 30 évvel ezelőtt írták le endotel és símaizomsejtekben [165,166]. Később kimutatták, hogy a ligand a receptor kötés után a plazmamembrán burkos bemélyedéseiben koncentrálódik, majd endocitózisra kerül. A bejutott vezikulák endoszómákkal fuzionálnak, végül a ligand lizoszóma-szerű kompartmentekben tűnik fel [167,168]. A receptor endocitózisát számos, az AT1R expresszáló sejttípusban leírták [169,170,171,172]. A morfológiai vizsgálatok többsége pedig arra utalt, hogy az endocitózis burkolt vezikulákkal történik. Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal sikerült igazolni, hogy a patkány érfal simaizom és glomerulosa sejtjeiben a bejutott AT 1R a klatrinnal burkolt bemélyedésekben és vezikulákban található [169]. K+-deplécióval vagy fenilarzén-oxid kezeléssel, a klatrin-mediált internalizációs útvonal általános inhibitoraival simaizom, glomerulosa és vese epitel sejtekben gátolni tudták a receptor internalizációját [170,171,173]. Későbbi vizsgálatok HEK-293 sejtekben a kifejeztetett AT1R együttes lokalizációját mutatták ki transzferrinreceptorral [174]. Az AT1AR-t stabilan expresszáló CHO sejtvonalban a receptor endocitózisa gátolható volt hiperozmotikus szacharóz kezeléssel is [175]. Polarizált sejtekben végzett kísérletek viszont azt mutatták, hogy az AT1R endocitózisának több útja is lehetséges egyazon sejtben. Vese proximális tubulussejtben és stabilan transzfektált LLC-PK-C14 sejtekben a receptor endocitózisának kinetikája és mechanizmusa különböző volt az apikális és bazolaterális membránban. Nagyobb endocitózis kinetikát tudtak mérni az apikális membránon, ugyanakkor fenilarzén-oxid kezeléssel és tirozinkináz inhibitorokkal gátolható volt, míg a bazolaterális membránban kifejeződő receptorok endocitózisát ezek a kezelések és szerek nem befolyásolták [172,176]. A kaveolák szerepét is felvetették a receptor endocitózisában. Ennek alapjául azok a megfigyelések szolgáltak, ahol szacharóz gradiens frakcionálás során az AT1R a kaveolinnal, a kaveolák egyik fő fehérjéjével azonos frakcióban jelent meg. Ezen túlmenően a kaveolin és a receptor koimmunprecipitálhatóságát agonista függőnek találták [177]. Annak

32

megállapítása, hogy a kaveolák milyen mértékben vesznek részt az AT1R internalizációjában további vizsgálatokat igényel. Az AT1R klónozása lehetővé tette a vad típusú receptor és mutánsok vizsgálatát olyan sejtvonalakban, amelyek nem rendelkeznek endogén AT1R. Ezek a vizsgálatok azt mutatták, hogy az AT1R agonista adás hatására számos sejttípusban gyorsan felvételre kerül [178,163,179,180]. A nem peptid antagonistákkal ellentétben az AT1R endocitózisát peptid antagonisták is indukálják [175,181], ami azt mutatja, hogy a receptor jelátvitelhez és endocitózishoz vezető aktív konformációi nem egyeznek meg teljesen. Ezt azok a vizsgálatok is alátámasztják, amelyek során a receptor bizonyos mutációiról megállapították, hogy a jelátvitel és az endocitózis folyamatát külön-külön befolyásolták. A második transzmembrán hélixben található Asp74 szubsztitúciója gátolta a G-fehérje aktivációt, de az internalizációt csak minimális mértékben csökkentette [180,182]. Ugyancsak erre utal, hogy a receptor karboxilterminális régiójának szerin és treonin aminosavainak eltávolításával az internalizáció nagy mértékben gátolható, míg a jelátvitel nem változik [178]. Ezekben a vizsgálatokban sikerült azonosítani a receptor karboxil-terminális régiójának szerinben és treoninban gazdag régiójában az endocitózis kinetikáját alapvető mértékben befolyásoló szekvencia részletet. A Ser335-Thr336Leu337 aminosavaknál létrehozott deléciók és alanin cserék a mutáns receptorok internalizációját nagymértékben gátolták [178]. A vizsgálatok alapján úgy tűnik, hogy a receptor endocitózisáért ez a szekvenciarészlet a felelős. Kísérleteink megkezdése előtt az AT1AR internalizációjával foglalkozó kutatások eredményei azt mutatták, hogy a receptor endocitózisa HEK-293 sejtekben a β-arresztin-2 és a dinamin-1 domináns negatív hatású mutánsaival nem gátolható [59]. Vad típusú β-arresztin expressziója azonban fokozta a receptorendocitózist HEK és COS-7 sejtekben és ez a növekedés már gátolható volt domináns-negatív dinaminnal [59]. Ezen adatok alapján a kutatók arra a következtetésre jutottak, hogy az AT1AR endocitózisa β-arresztintől és dinamintól független, de nagy mennyiségű β-arresztin jelenlétében a receptor a β-arresztin- és dinamin-dependens utat is tudja használni. Ez arra utalt, hogy az AT1AR interakcióba tud lépni a β-arresztinnel.

Az AT1A receptor foszforilációja Az AT1AR karboxil-terminális régiójában található nagyszámú szerin és treonin aminosavnak kulcs szerepe lehet a receptor foszforilációjában. A kilencvenes évek közepe táján megindultak az AT1AR esetleges foszforilációja, valamint annak funkciójának és molekuláris hátterének

felderítésére

irányuló

vizsgálatok.

33

A

kérdéskör

tanulmányozását

nagyon

megnehezítette, hogy nem álltak rendelkezésre megbízhatóan működő receptor ellenes antitestek [162]. A korai vizsgálatokban azt találták, hogy a szerin és treonin aminosavakon történő foszforiláció nem stimulálható Ang II-vel, ami a későbbi tanulmányok fényében valószínűleg a nem megfelelő antitestek alkalmazása miatt adódott [183]. A későbbiekben sikerült megbízható antitesteket kifejleszteni, melyek a foszforilációs vizsgálatok kivitelezését lehetővé tették a receptort endogén módon kifejező sejtekben [184,185]. Az epitóppal jelölt receptor molekulák emlős sejtekben történő expressziója jelentette azt a megközelítési módot, amely lehetőséget biztosított az AT1AR foszforilációjának és az abban részt vevő mechanizmusok általános feltárására. Oppermann és munkatársai az influenza vírus hemagglutinin antigénjének epitópjával amino-terminálisan jelölt AT1AR-t fejeztettek ki HEK293 sejtekben [186] és a másodlagos hírvivők által aktivált kinázok (PKC), valamint a GRK-k részvételét vizsgálták a receptor szabályozásában. Protein-kináz C inhibitorok alkalmazásával és GRK-k túltermeltetésével sikerült megállapítaniuk, hogy a receptor foszforilációjában mind a PKC, mind a GRK-k részt vesznek. Munkájukban kimutatták a GRK2, a GRK3 és a GRK5 fontosságát e folyamatok szempontjából [186]. A GRK2 domináns negatív mutánsának kifejeztetése a sejtekben a receptor foszforiláció nagy mértékű csökkenését vonta maga után, ezen túlmenően megakadályozta a receptor deszenzitizációját is [186]. Az AT1AR karboxil-terminális intracelluláris doménjében három PKC konszenzus foszforilációs motívum található (Ser331, Ser338, Ser348) [187]. A PKC indukálásra bekövetkező receptor foszforiláció szinte teljesen megszűnik a karboxil-terminálisan elhelyezkedő 34 aminosav eltávolítása után, amely mind a három PKC konszenzus szekvencia részletet tartalmazza. A konszenzus szekvenciákban végrehajtott szerin-alanin cserék a foszforiláció mértékét lecsökkentik, de nem szüntetik azt meg [187]. További vizsgálatok kimutatták, hogy az Ang II indukálásra bekövetkező és PKC által létrehozott foszforiláció kis agonista koncentrációnál (1 nM) az összes foszforilációnak kb. a felét teszi ki, míg növekvő agonista koncentrációknál ez a részvételi arány jelentősen lecsökken. Más kutatócsoportok is arra a hasonló következtetésre jutottak, hogy a receptor foszforilációjának mechanizmusa agonista koncentráció függést mutat, amelyben kis hormonkoncentrációt alkalmazva a PKC által történő foszforilálás játssza a főszerepet [188] Ennek a foszforilációnak a létrejöttében mind a három PKC konszenzus foszforilációs hely részt vesz, nem tudtak konszenzus szekvenciák között preferenciát megállapítani [187]. Ezek az adatok összhangban vannak más receptorokon végzett megfigyelésekkel, melyek szerint a másodlagos hírvivők által aktivált kinázok (pl. PKA, PKC) közreműködésével létrejövő heterológ deszenzitizáció már viszonylag alacsony hormonkoncentrációk esetén is

34

kialakulhat, míg a GRK-ok által közvetített homológ deszenzitizáció magasabb hormonszintek esetén jön létre. Ez utóbbi mértéke ugyanis a hormont kötött, aktivált receptorok számától függ.

35

Módszerek A receptor mutánsok létrehozása A patkány érfal simaizomból származó 1A típusú angiotenzinreceptort (AT1AR) kódoló cDNS-t pcDNA3.1 eukarióta expressziós vektorba építettük be, mely tartalmazza a plazmid baktériumban történő fenntartásához és sokszorosításához, egyszálú DNS templát készítéséhez és a receptorfehérje eukarióta sejtekben történő expressziójához szükséges szabályozó elemeket. A receptor cDNS-ében a mutációkat irányított mutagenezissel, a Stratagene cég QuikChange Kit-jének segítségével hoztuk létre. A módszer alkalmazásával rendkívül nagy hatékonysággal lehet az előzetesen megtervezett mutációkat bevinni a templát DNS-be. Az irányított mutagenezist PCR készülék felhasználásával hajtottuk végre. Ennek a mutagenezis technikának az alkalmazásához két komplementer, a mutációt vagy mutációkat tartalmazó oligonukleotidot kell használni. Az oligonukleotidokba a később képződő klónok egyszerű szűrését lehetővé tevő restrikciós endonukleáz felismerő helyet is terveztünk. A PCR reakció során a templát DNS szálakra föltapadó, mutációkat tartalmazó oligonukleotidokról a teljes plazmid átíródik. A PCR reakció után a reakció terméket meg kell emészteni Dpn I restrikciós endonukleázzal, amelyre az jellemző, hogy csak abban az esetben hasítja a DNS-t, ha az metilálva van. Mivel az in vitro PCR reakcióban képződött mutáns plazmidok nincsenek metilálva, az endonukleáz nem tudja hasítani azokat, míg a baktériumokban metilálási reakciókon átesett templát plazmidokat és szálakat szétvágja. A restrikciós emésztésen átesett PCR reakció terméket kompetens sejtekbe transzformálva – tapasztalataink szerint - a kinőtt telepek nagy többsége mutáns klónt tartalmaz, ami a DpnI szelektálás hatékonyságát mutatja. Az irányított mutagenezissel létrehozott mutáns receptor cDNS-ek bázis sorrendjét minden esetben szekvenálással ellenőriztük.

A receptor-ubikvitin kiméra létrehozása A receptor kimérát az AT1AR Tyr319 aminosava helyén deléciót szenvedett mutánsa (319STOP) és a humán ubikvitin molekula összekapcsolásával hoztuk létre. A receptor mutáns szinte teljes karboxil-terminális intracelluláris doménje hiányzik, az ubikvitin molekulát ennek helyére, a receptor Lys318 aminosava után kapcsoltuk három glicin közbeiktatásával az ubikvitin amino-terminális metioninját. A két cDNS összekötését rekombináns PCR technikával végeztük. A humán ubikvitin (GenBank Accession: M26880) teljes cDNS-ét tartalmazó EST

36

klónt a Research Genetics cégtől vásároltuk meg. A rekombináns PCR reakció során felsokszoroztuk az ubikvitin cDNS-ét az EST klónról egy olyan primerpárral, mely fölső tagjának 5` vége komplementer volt a patkány AT1AR cDNS-ének sokszorzására használt oligonukleotid pár alsó primerjének 5’ végével. Ez utóbbi primer a receptor cDNS-en a Lys318nak megfelelő bázishármasáig tapadt fel a templát cDNS szálra, ettől az 5’ vég fele volt az előbb említett ubikvitin primerrel komplementer szakasz. Ez a komplementer rész tartalmazta az összekötő glicin aminosavakat. A receptor cDNS-ét sokszorzó primerpár felső tagja a receptor szekvencia nagyjából felénél található EcoR I restrikciós endonukleáz hasító helytől 5’ irányban tapadt fel a templát DNS-re. Az ubikvitint amplifikáló oligonukleotid pár alsó tagja tartalmazott egy Not I restrikciós endonukleáz hasítóhelyet. Az elkészült kiméra cDNS fragmentet az EcoR I és Not I restrikciós enzimekkel történt hasítás után összeligáltuk a patkány AT1AR-ának cDNSét tartalmazó eukarióta expressziós vektor ugyancsak EcoR I és Not I restrikciós enzimekkel kivágott, a vektort és a receptor 5’ részét tartalmazó fragmentjével. Az elkészített kiméra bázissorrendjét szekvenálással ellenőriztük.

Mutáns és vad típusú fehérjék kifejeztetése emlős sejttenyészetekben A mutáns és vad típusú receptorok működésének vizsgálatához a fehérjéket sejtkultúrában fenntartott COS-7 és CHO-K1 sejtekben expresszáltuk. A COS-7 sejteket DMEM, a CHO sejteket Ham’s F-12 médiumban növesztettük, amely 10% borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100 µg/ml streptomycint, és NaHCO3-ot tartalmazott. A 24 lyukú sejtkultúra edényben tenyésztett sejteket 48 órával a kísérletek előtt transzfektáltuk a receptor cDNS-eket tartalmazó eukarióta expressziós plazmidokkal. A transzfekciót LipofectAMINE (Invitrogen Corp.) transzfekciós reagens segítségével végeztük, szérum mentes OPTI-MEM médiumban (1 ml OPTI-MEM, 6 µl LipofectAMINE, 1,25 µg expressziós plazmid). A tanszfektálást követően a sejtek tranziensen fejezik ki a vad típusú, illetve különböző mutáns receptor fehérjéket, ami lehetőséget biztosít a receptor működésének vizsgálatára. A fehérjék expressziója a transzfekciót követő második napon volt maximális, ezért kísérleteinket minden esetben ekkor végeztük.

37

Kötési vizsgálatok A mutáns és vad típusú angiotenzinreceptorok ligandkötési sajátosságait és a sejtfelszíni expresszált receptorok mennyiségét

125

I-izotóppal jelzett [Sar1, Ile8]Ang II (peptid antagonista)

kötés alapján határoztuk meg. A sejtekhez azonos mennyiségű jelzett és növekvő mennyiségű nem jelzett ligandot adtunk Hepessel pufferolt, 1 mg/ml BSA-t tartalmazó DMEM vagy F-12 médiumban, majd 4 °C-on 6 órán át inkubáltuk. A sejtek PBS-es (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaHPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH: 7,4) mosása után a kötött radioaktivitást γspektrometriával határoztuk meg. Az így nyert leszorítási görbék Scatchard analízisével meghatároztuk az egyes mutáns receptorok ligandkötésének affinitását és a sejt felszínén expresszált receptorok számát.

Inozitol-foszfát válasz mérése Az AT1AR mutánsok jelátviteli folyamatot aktiváló képességének hatékonyságára az Ang II hatására létrejövő inozitol-foszfát válasz alapján következtettünk. A transzfektált sejteket a kísérleteket megelőzően 18-24 óráig 3H-inozitol jelenlétében inkubáltuk 20 µCi/ml myo-[23

H]inozitolt (Amersham), 2,5 % borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100 µg/ml

streptomycint tartalmazó médiumban. Az ily módon előjelzett sejteket 30 percig előinkubáltuk 10mM LiCl jelenlétében az inozitol-foszfát átalakulások minimalizálása érdekében. A sejtekhez LiCl-ot tartalmazó Hepessel pufferolt médiumban 1µM Ang II adtunk és 30 percig inkubáltuk 37 °C-on. 10 %-os perklórsavval történő leállítást követően a mintákból az inozitol-foszfátokat tartalmazó vízoldékony frakciót kivontuk, majd az inozitol-foszfátokat ioncserélő Dowex oszlop segítségével elválasztottuk. Az 1 M-os ammónium-formiáttal eluálható inozitol-bisz- és inozitol-triszfoszfátokat tartalmazó frakció radioaktivitását mértük szcintillációs számláló segítségével. Az így kapott inozitol-foszfát válasz nagyságát a sejtfelszíni expresszált receptorok száma is befolyásolja, ezért a kapott inozitol-foszfát válaszokat az expresszált receptorok száma alapján normalizálva is feltüntettük.

A receptor internalizációjának mérése A receptorinternalizáció kinetikájának meghatározásához a sejtekhez 250 µl térfogatban adtunk 125I izotóppal jelzett Ang II-t tartalmazó Hepessel pufferolt médiumot (30-50 pM, illetve

38

100 pM és 30 nM nem jelölt Ang II a magas Ang II koncentráció mellett végzett méréseknél), majd a sejteket 37 °C-on inkubáltuk az ábrákon feltüntetett ideig. Az internalizáció leállításához a mintákat jégre tettük és kétszer 1 ml jéghideg PBS-sel megmostuk. A sejt felszínén kötött ligandot a kötés savas mosófolyadékban (15 mM NaCl, 50 mM ecetsav, 0,5 ml) történő inkubálással (10 perc) távolítottuk el. Mindezt a ligand kötésének savas pH iránti érzékenysége tette lehetővé. Ezután a sejteket SDS/NaOH keverékével szolubilizáltuk az intracelluláris radioaktivitás méréséhez. Az internalizációt az egyes időpontokban mért intracelluláris specifikus kötés és a teljes (extracelluláris + intracelluláris) kötés hányadosaként adtuk meg.

39

Eredmények Az AT1A-receptor karboxil-terminális régiójának foszforilációja és ennek szerepe a receptor endocitózisában Korábbi vizsgálatok arra mutattak rá, hogy a receptor endocitózisáért az AT1AR karboxilterminális régiója felelős [178]. Hasonló következtetésre jutottak a kérdéssel foglalkozó más munkacsoportok is [189,190]. A karboxil- terminális régió szerinben és treoninban gazdag részletében sikerült lokalizálni olyan aminosavakat, melyek jelenléte szükséges volt a receptorendocitózis normális kinetikájához. A szerin és treonin aminosavak ebben a régióban tapasztalható nagy száma felvetette annak a lehetőségét, hogy a foszforiláció fontos szerepet játszhat az internalizáció szabályozásában. Vizsgálatok indultak annak kiderítésére, hogy vajon az AT1AR foszforilációja követelménye-e az endocitózisnak, kimutatható-e összefüggés a receptor foszforilációja és internalizációja között. Ezekbe a munkákba kutatócsoportunk is bekapcsolódott. A receptor foszforilációjával foglalkozó korábbi munkák kimutatták, hogy a receptor foszforilálásában mind a PKC, mind a GRK-k, köztük a GRK2 részt vesz [186]. A foszforiláció részvételét gyanították a receptor deszenzitizáció folyamatában, azonban az internalizáció és a foszforiláció összefüggéséről nem álltak rendelkezésre adatok. Az AT1AR foszforilációját feszegető kérdések megválaszolását rendkívül megnehezítette, hogy nem álltak rendelkezésre megfelelő receptor ellenes antitestek. Az AT1AR foszforilációt addig kimutató csoport epitóppal jelzett receptort használt munkája során, amit HEK-293 sejtben fejeztettek ki [186]. A receptor optimális detektálása érdekében mi is HA epitópot építettünk be az aminosav szekvencia amino-terminális részébe. Ellenőrző vizsgálatok azt mutatták, hogy ez a módosítás nem befolyásolta a receptor funkcióját [191]. A foszforilációs vizsgálatok elkezdésénél bizonyosnak kellett lenni abban, hogy amit a kutatók látnak, az nem műtermék, hanem valóban foszforiláció. A kifejlesztett receptor ellenes antitest által felismert protein azonosnak bizonyult azzal a fehérjével, melyet a HA ellenes antitest ismert fel a HA epitóppal megjelölt receptorral transzfektált COS-7 sejtekből készített preparátumokon. Az epitóppal jelzett receptorok alkalmazhatóságát így teljes mértékben sikerült igazolni. További érvként szolgált az epitóppal jelölt receptor alkalmazása mellett, hogy a rendelkezésre álló receptor ellenes antitest a receptor karboxil-terminális részét ismerte fel, így a karboxilterminális doménjükben deléciókat tartalmazó mutánsok kimutatását nem tette lehetővé. Az AT1AR foszforilációjának megismerését célzó vizsgálatokba ennél a pontnál kapcsolódtunk be. Kísérleteket kezdtünk Dr. Kevin J. Catt NIH-beli munkacsoportjával együttműködve.

40

Feladatom e munkában a HA epitóppal rendelkező patkány AT1AR mutánsok létrehozása és azok funkcionális vizsgálatának elvégzése volt. A foszforilációs kísérleteket Dr. Roger D. Smith végezte. Az AT1AR foszforilációjában fontos szerepet játszó régió feltérképezését célul kitűző kísérletünkben négy receptor mutánst vizsgáltunk. Ezek a korábbi kísérletekben azonosított, a receptor internalizációjában szerepet játszó szekvencia alapján készült deléciós, illetve egy esetben kettős alanin cserét tartalmazó misszensz mutánsok voltak. Mindegyik receptor mutánst az amino-terminális végén elláttuk HA epitóppal. A három deléciós mutáns a 325STOP, 335STOP és a 342STOP jelű receptor volt. Ezek mindegyikénél a mutáns nevében szereplő szám határozza meg azt az aminosav pozíciót, aminek a helyére a terminátor kodont beépítettük. A negyedik mutáns cDNS-ében a Ser335-Thr336 aminosavakat alaninra cseréltük. Ezt a receptor mutánst ST-AA néven említjük majd. A vizsgálatokhoz használt mutánsok sematikus rajza a 6. ábrán látható.

NH2

COOH

ST-AA

A A

342STOP

S T

335STOP

COOH

325STOP

1 35

2 34

6

L S Y R P S DNM S S S A K K

33

5

S T

33

32

31

5

L L KY I P P K A K S H S S L S T KM

9

AT1AR

COOH

COOH

COOH

6. ábra. A patkány AT1A-receptor foszforilációjának vizsgálatához készített receptor mutánsok. Az receptor karboxil-terminális szerin/treonin gazdag régiójának aminosavait ábrázolja a sematikus ábra. A nagyobb méretű körök jelölik az aminosav cserék pozícióit. Az aminosavakat az egybetűs kódjuk jelöli.

COS-7 sejtekben expresszálva,

125

I izotóppal jelzett antagonistával meghatároztuk az

elkészített receptor mutánsok kötési tulajdonságait. A Kd értékekben nem volt eltérés a receptor

41

mutánsok közt, viszont az expressziós szintjük eltért egymástól. A deléciós receptor mutánsok expressziós szintje kisebb volt, mint a vad típusú receptoré. Mindez a foszforilációs kísérletek kvantitatív értékelésének szempontjából jelentett problémát. A foszforilációs reakciókban a membránpreparátumokat normalizálni kellett a receptorszámra, amihez a kötési méréseket mindig a foszforilációs mérésekkel egy időben kellett elvégezni. A vad típusú és a mutáns receptorokat COS-7 sejtekben kifejeztettük és megvizsgáltuk Ang II-vel történő stimulálás

Receptor foszforiláció (az AT1-R %-ában)

hatására bekövetkező foszforilációjukat.

110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

P P P R A S. N. AT1- ST-A STO STO STO 2 5 5 34 33 32

7. ábra. Az AT1A-R karboxil-terminális régió eltávolításával létrehozott, HA epitópot tartalmazó mutánsainak és az ST-AA mutáns agonista által történő stimulálás hatására bekövetkező foszforilációja. 32

A COS-7 sejtekben termeltetett receptor mutánsokat 4 órán keresztül jelöltük Pi-vel, majd 5 percig stimuláltunk 100 nM Ang II-vel. A stimulálás után a sejteket lizáltuk, majd membrán preparálás után a receptor fehérjéket enzimatikusan deglikoziláltuk. A foszforilált receptor fehérjéket Anti-HA antitesttel

történő

immunprecipitálás

után

SDS-gélelektroforézissel

választottuk

el,

majd

phosphoimager-el kvantifikáltuk. Az ábrán négy független kísérlet az AT1A-R-hoz viszonyított foszforilációjának átlaga ± az átlag szórása van feltüntetve. N.S. – nem stimulált AT1A-R.

A vad típusú, illetve a kísérletek során alkalmazott mutáns receptorok esetében a nem stimulált sejtekben minimális mértékű receptor foszforiláció volt kimutatható. 100 nM Ang II hatására erős foszforilációt lehetett tapasztalni a vad típusú receptornál. A vad típus és a mutáns receptorok foszforilációját a 7. ábra mutatja. Az agonista által történő stimulálásra bekövetkező foszforiláció teljesen hiányzott a 325STOP mutánsnál. Ez arra utalt, hogy a Ser326 és az attól disztális szekvencia tartalmazza a receptor agonista által történő stimulálásra foszforilálódó aminosav oldalláncait. Tehát a Ser326 és a karboxil-terminális utolsó aminosav, a Glu359 közötti 13 szerin és treonin a receptor foszforiláció fő helye. A 342STOP deléciós receptor mutáns

42

cDNS-e a Ser342 kodonjának helyén tartalmazza a terminátor kodont. Ennek segítségével 18 aminosavat távolítottunk el a receptorról, ami egyben öt szerin aminosav kiiktatását is jelenti. A 342STOP mutáns foszforilációját megvizsgálva arra a megállapításra jutottunk, hogy ennek a deléciós mutánsnak az agonista által történő stimulálás hatására bekövetkező foszforilációja nem különbözik érdemlegesen a vad típusú receptor foszforilációjának mértékétől. Mindez azt mutatja, hogy a receptor fő foszforilációs helyei a Ser326 és Pro341 aminosavak között helyezkedik, helyezkednek el. A 335STOP deléciós mutáns és az ST-AA alanin helyettesítéses mutáns receptorok foszforilációjának mértékét összehasonlítva azt lehetett megállapítani, hogy ezeknek a mutánsoknak az Ang II-vel történő stimulálásra adott foszforilációjának mértéke megegyezett. Ugyanakkor ennek a foszforilációnak a mértéke a vad típusú receptor stimulálás hatására bekövetkező foszforilációjának csak nagyjából az ötven százaléka volt. Ez tehát azt jelenti, hogy a receptor több szerin/treonin aminosav oldalláncon tud foszforilálódni, amelyek a Ser326 és a Ser338 aminosavat is tartalmazó szegmensben találhatók. A 335STOP deléciós és az ST-AA alanin cseréket tartalmazó (a Ser335 és Thr336 helyeken), de teljes hosszúságú receptor mutáns agonista hatására bekövetkező foszforilációs állapota megegyező, amiből arra lehet következtetni, hogy a receptor fő foszforilációs helye a Ser335 vagy a Thr336, esetleg mindkettő. kísérletsorozatban

alkalmazott

mutánsok

foszforilációs

tulajdonságain

80 Internalizált (a teljes kötés %-ában)

A

70 60 AT1A-R

50

342STOP ST-AA 335STOP

40 30

325STOP

20 10 0

0

5

10

15

20

25

30

Idő (perc)

8. ábra. Az AT1A-R karboxil-terminális régió mutációinak hatása a receptorendocitózisra Az ábrán látható karboxil-terminális deléciókat tartalmazó AT1A-R mutánsokat és az ST-AA mutánst COS-7 sejtekben termeltettük. A sejteket

125

I-Ang II-vel inkubáltuk az ábrán látható

időkig, majd meghatároztuk a jelzett ligand internalizációját. Az internalizált specifikus kötést a teljes specifikus kötés %-ában ábrázoltuk. Az ábrán három független kísérlet átlaga ± átlag szórása van feltüntetve.

43

kívül

meghatároztuk azok stimulálás hatására bekövetkező internalizációjának kinetikáit is. Ezek a kísérletek hasonló eredményt hoztak, mint a korábbi endocitózis vizsgálatok [178]. A 325STOP deléciós receptor mutánsnak gyakorlatilag megszűnt az internalizációja, míg a 342STOP deléciós receptor mutáns agonista által indukált endocitózisa csak kis mértékben károsodott. A 335STOP mutáns receptor nagyon kis mértékű endocitózist mutatott, míg az ST-AA mutáns endocitózisának mértéke a 335STOP és a 342STOP mutánsoké közé esett. A mutáns receptorok internalizációs kinetikáját a 8. ábra mutatja. A kapott eredmények azt mutatják, hogy az AT1AR foszforilációs

helyeinek

eltávolítása összhangban áll az

Inozitol-foszfát válasz (az AT1-R %-ában)

adott

receptor

mutáns

endocitózisra

700

való

képességével.

600

A

receptor

endocitózisa és foszforilációja

500

összefüggést mutat.

400

Ugyancsak

300

megvizsgáltuk a négy receptor mutáns agonista adás hatására

200

bekövetkező

100 0

inozitol-foszfát

generáló képességét. A receptor P P P 1-R T-AA TO TO TO AT S 2S 5S 5S 4 3 2 3 3 3

9. ábra. Az AT1A-R karboxil-terminális delécióinak hatása az inozitol-foszfát válaszra.

mutánsoknak ez a tulajdonsága gyakorlatilag

Azonban a mutáns receptorok expressziós

3

A [H]-inozitollal jelölt COS-7 sejtekben expresszált deléciós és az STAA mutáns AT1A-R-okat 30 percig előinkubáltuk 10 mM-os LiCl oldatban, majd 30 percig stimuláltuk 1 µM Ang II-vel. Az inozitol-

megegyezett.

típusénál

szintje

a

alacsonyabb

Munkacsoportunk

vad volt.

korábbi

foszfátokat a „Módszerek” részben leírtak szerint mértük meg. Az

kísérletei azt igazolták, hogy a

ábrán a különböző mutánsok válaszát azonos receptorszámra

receptorexpresszió

vonatkoztatva tüntettük fel. A receptor mutánsok Bmax értékei a vad típus %-ában, három független kísérlet alapján (± szórás átlaga) a

változása

az

következők voltak: AT1A-R 100±54, ST-AA 73±33, 342STOP 45±24,

válasz

335STOP 47±27, 325STOP 36±22

párhuzamos

szintjének

inozitol-foszfát

nagyságának

eredményezi.

azzal

megváltozását Ha

figyelembe

vettük azt, hogy a receptor mutánsok expressziója különbözött egymástól, és az inozitol-foszfát termelést az egyes mutánsok receptor számához viszonyítottuk, egészen más képet kaptunk. Az azonos receptor mennyiséghez tartozó inozitol-foszfát termelés mértéke a receptor mutánsok közt jelentős eltéréseket mutatott, melyet a 9. ábra mutat be. A vad típusú AT1AR-t alapul véve,

44

a 325STOP receptor mutáns jelátviteli képessége nagyjából ötszörös volt. A mutánsok között a jelátviteli képességük növekedése szerint sorrendet lehetett felállítani. Az adatok ez alapján a vad típus, ST-AA, 342STOP, 335STOP és 325STOP sorrendet mutatták. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy a receptor mutánsok inozitol-foszfát generáló képessége is összefüggésben van a karboxil-terminális régió deléciójának nagyságával.

Az ubikvitináció lehetséges szerepe az AT1A-receptor endocitózisában Kísérleteink kezdetén az AT1AR internalizációjának mechanizmusáról nem álltak rendelkezésre megbízható adatok. Az endocitózist a legtöbben klatrin függőnek gondolták, de voltak olyan vélemények is, melyek alapvetően kaveolákon keresztül képzelték el a folyamatot. Mindkét irányzat hívei komoly érveket tudtak felsorakoztatni elképzeléseik bizonyítására. Egyre több eredmény szólt azonban a receptor klatrin-mediált endocitózisa mellett, viszont ennek mechanizmusáról nagyon ellentmondó adatok láttak napvilágot. Az AT1AR internalizációjának mechanizmusáról az elfogadott nézet a terület vezető kutatócsoportjának munkái alapján alakult ki. Úgy tűnt, hogy az AT1AR nem követi azt az endocitotikus utat, amely a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok modelljévé vált β2-adrenerg receptorra jellemző, endocitózisa független mind a dinamin GTP-áztól, mind a β-arresztinektől [59]. Az AT1AR internalizációs mechanizmusa körül tehát nagy volt a bizonytalanság, ami arra ösztönözte munkacsoportunkat, hogy megvizsgáljunk olyan alternatív endocitotikus utakat, amelyek szerepe az emlős Gfehérjékhez kapcsolt receptoroknál eddig föl sem merült, illetve nem volt bizonyítva. Kutatócsoportunk korábbi vizsgálatainak eredményei arra utaltak, hogy az endocitózis szabályozásában a receptor karboxil-terminális intracelluláris doménje vesz részt [178]. hasonló megállapításra jutottak az ezzel a receptorral foglalkozó más kutatócsoportok is [179]. Ismert volt az is, hogy a receptor endocitózisában a karboxil-terminális szekvencián belül a Ser331Ser338 aminosavak közti régiónak van kitüntetett szerepe [178]. Az előző fejezetben ismertetett eredmények alapján pedig azt is tudtuk, hogy a receptor agonista hatására bekövetkező foszforilációja is ebben a régióban történik. Így a receptor foszforiláció endocitózisban betöltött szabályozó szerepe igen erőteljesen volt feltételezhető. Az élesztő α-faktor receptorának endocitózis szabályozásáról megjelent első közlemény új

aspektust

nyitott

nemcsak

a

G-fehérjéhez

kapcsolt,

hanem

általánosságban

a

membránreceptorok internalizációjának molekuláris mechanizmusát illetően [123]. Az α-faktor receptor agonista kötésre bekövetkező endocitózisát a receptor kovalens módosítása előzi meg, melynek során egy ubikvitin molekula kapcsolódik a receptor karboxil-terminális régiójának

45

egy

kitüntetett

lizin

oldalláncához.

Ez

a

monoubikvitináció

az

α-faktor

receptor

internalizációjának szükséges és egyben elégséges feltétele is. Az ubikvitin kapcsolódását nagymértékben megnöveli a receptor karboxil-terminális régiójában található, endocitotikus motívumként definiált kilenc aminosavból álló szignál szekvencia (SINNDAKSS) szerinjeinek foszforilációja. Az AT1AR internalizációjának szabályozásában fontos szekvencia részlet (STKMSTLS) hasonlóságot mutat az élesztő receptorendocitózis szignáljával. Mindkét receptor esetében megfigyelhető a szerin gazdag szekvenciában egy lizin, az α-faktor receptornál ennek ε-amino csoportja az ubikvitin kapcsolódás fő helye. További fontos hasonlóság a két receptor között ezekben a szignál szekvenciákban az agonista kötés hatására jelentkező, az endocitózist szabályozó foszforiláció [123,192]. Mindezek a hasonlóságok felvetették annak a lehetőségét, hogy az AT1AR esetében is szerepet játszhat az ubikvitin kapcsolódás a receptorendocitózis szabályozásában. Vizsgálatokat kezdtünk tehát annak megállapítására, vajon szerepet játszik-e az AT1AR internalizációjában a karboxil-terminális, szerin/treonin aminosavakban gazdag régió ubikvitinációja. Kísérleteink körébe a Tyr319–től disztálisan található lizineket vontuk be, az attól proximális, de még a karboxil-terminális régióhoz tartozó lizin aminosavak szerepét nem vizsgáltuk. Ennek oka egyrészt az volt, hogy az élesztő receptorinternalizáció szabályozásának megismerésére irányuló kísérletek azt mutatták, hogy a lizinek közvetlen környezetében szerin aminosavaknak kell lenniük, márpedig az AT1AR karboxil-terminális régiójának membránközeli lizinjeinek környezetében nem találhatóak szerinek. Másrészt korábbi vizsgálatokból tudtuk, hogy a Tyr319 aminosavnál végrehajtott karboxil-terminális szekvencia levágás szinte teljesen megszünteti a receptor ligand által indukált endocitózisát [178]. Mindezeken túlmenően munkacsoportunk egyik korábbi munkája arra engedett következtetni, hogy a Tyr319-től proximálisan elhelyezkedő lizinek sokkal inkább a receptorexpresszió szabályozásával állhatnak összefüggésben, mint a receptor internalizációjával [193].

46

Így tehát vizsgálataink tárgyát az az öt lizin alkotta, amelyek az AT1AR karboxilterminális régiójának disztális, szerin és treonin aminosavakban gazdag szekvenciájában találhatóak. Ezek a lizin aminosavak három csoportban helyezkednek el, a lizin csoportok közül

NH2

COOH

A

K

S H S S L S T

K

MS T L S Y R P S DNMS S S A

K K

A

K

K K

Mut2

K

K

A

K K

Mut3

K

K

K

A A

Mut12

A

A

A

K K

Mut123

A

A

A

A A

338STOP

K

K

K

COOH

338STOP K/A

A

A

A

COOH

319STOP

319STOP-Ub

35 0 35 1

A

33 8

Mut1

31 9

33 3

K

32 5

L LKY I P P

32 3

AT1AR

COOH

GGG

ubikvitin

10. ábra. Az AT1A-receptor karboxil-terminális szerin és treonin gazdag régió ubikvitinációjának vizsgálatára tervezett mutációk, valamint a 319STOP-Ub kiméra receptor. A vizsgált régió lizin aminosavait, valamint azok alanin mutációit a nagyobb körök szimbolizálják. Az aminosavakat az egybetűs kódjukkal jelöltük.

kettő a régió amino-terminális részén (Lys323, Lys325), kettő a régió karboxil-terminális részén (Lys350, Lys351), míg egy lizin aminosav (Lys333) nagyjából az általunk vizsgált szakasz közepén található. Ez utóbbi azért különösen érdekes, mert annak a Ser335-Thr336-Leu337 tripletnek a közvetlen közelében található, melynek a receptor endocitózisában elengedhetetlen a szerepe

47

[178]. A receptor általunk vizsgált régiójának lizinjeit irányított mutagenezissel alaninra cseréltük, ily módon a 10. ábrán látható receptor mutánsokat hozva létre. A követhetőség érdekében érdemes elmondani az elnevezések logikáját: a vizsgált régióban található lizin csoportokat jelölik a számok. Az egymás mellett, illetve egymás közvetlen közelében található lizin aminosavakról feltételeztük, hogy ha szerepet játszanak az endocitózist valamilyen formában befolyásoló ubikvitinációban, akkor az a párban található kérdéses aminosavaknál nem fog alapvetően különbözni. Vagyis nem követünk el hibát, ha első körben az egymás melletti lizin aminosavakat egy lépésben cseréljük ki. Úgy gondoltuk, ha szerepet játszanak az internalizáció szabályozásában, akkor egy következő körben elkészített mutáns sorozattal „szétválasztjuk” őket és egyenként próbálunk meg funkciót rendelni hozzájuk. Ily módon a receptor Lys323 és Lys325 aminosava képezte az egyik ilyen csoportot, melyeket egyszerre cseréltünk ki alaninra. Ugyan ilyen elgondolásból a Lys350 és Lys351 aminosavak alkották a másik ilyen csoportot. A Lys333 páratlan, ez képezte a harmadik „csoportot”. A mutánsok elnevezésénél ezen lizin csoportokat, pontosabban az aminosav cserékkel létrehozott alanin csoportokat megszámoztuk, a régió amino-terminális részéről kiindulva rendelve hozzájuk a sorszámokat. Tehát a Mut1 receptor mutánsban a proximális lizin csoportot (Lys323, Lys325) cseréltük ki alaninokra, a Mut2-ben a Lys333 lett alaninra cserélve, míg a Mut3-ban a disztális lizin csoportot (Lys350, Lys351) helyettesítettük alaninnal. A Mut1, Mut2 és Mut3 AT1AR mutánsokat kifejeztettük CHO sejtekben és

125

I izotóppal jelölt Ang II-vel

vizsgáltuk a jelzett ligand endocitózisát a Módszerek fejezetben leírt módon. A kérdéses mutáns receptorok internalizációs kinetikáját megvizsgálva arra a következtetésre jutottunk, hogy az nem különbözik a vad típusú receptor internalizációs kinetikájától. A kísérletek eredményeit a 11A. ábra mutatja be. Az ábrán látható még egy receptor mutáns, a 319STOP internalizációs kinetikája is. Ez egy deléciós mutáns, amelynek cDNS-e a Tyr319 aminosavat kódoló bázis hármas helyett egy ochre terminátor tripletet tartalmaz. A korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy ennek a – karboxil-terminális régiójának nagy részétől megfosztott - deléciós mutánsnak COS-7 sejtekben nagyon kis mértékű a ligand által indukált endocitózisa. Ezt a mutánst kontrollként használtuk a kísérleti rendszerben. Elkészítettük az AT1AR azon mutánsait is, amelyek a vizsgált karboxil-terminális régió lizin csoportjai közül kettőben tartalmaznak alanin cseréket. Úgy gondoltuk, hogy minderre szükség van, hisz az ubikvitináció elvileg bármelyik lizin oldalláncon megtörténhet. Összesen három lizin csoport található a vizsgált régióban, így három ilyen kettős csoport mutánst kellett létrehoznunk ahhoz, hogy mindegyik variációt tudjuk tesztelni. Ezen kívül elkészítettük azt a receptor mutánst is, amely mindhárom csoportban alanint tartalmazott. Ez utóbbi a Mut123 nevet kapta az előzőekben már ismertetett „nevezéktan” alapján. Mindegyik mutánsunkat

48

kifejeztettük CHO sejtekben és mindegyiknek meghatároztuk az internalizációs kinetikáját. A 11. B ábrán a Mut12 és a Mut123 receptor mutánsok adatai láthatóak. A bemutatott görbék azt bizonyítják, hogy a mutánsok endocitózisának mértéke nem tér el a vad típusú receptorétól. A teljesség kedvéért érdemes megemlíteni, hogy ugyanez volt a helyzet a kettős csoport mutánsok másik két variációjánál is (Mut13 és Mut23). A mutánsokkal végzett kísérleteink eredményei azt mutatták, hogy az általunk vizsgált karboxil-terminális régió lizinjei nem kapcsolódnak a receptor endocitotikus folyamatainak szabályozásához.

A Internalizált (a teljes kötés %-ában)

100 80

11.

ábra. Az AT1A-R karboxil-terminális régiójának lizin aminosavai helyett alanint tartalmazó mutánsainak, illetve a 319STOP deléciós mutáns receptor internalizációs kinetikája CHO sejtekben.

60

AT1A-R Mut1 Mut2

40

Mut3 319STOP

A. A Mut1, Mut2, Mut3, és 319STOP receptor mutánsokat

20

0

5

10

15

20

25

CHO

125

I-Ang II-vel inkubáltuk az ábrán látható

időkig. Az internalizált ligand teljes specifikus

30

kötéshez viszonyított %-át tüntettük fel az ábrán.

Idő (perc)

Három független kísérlet átlagát ± az átlag szórását ábrázoltuk.

B

B. A Mut12 és Mut123 mutánsok internalizációs

100 Internalizált (a teljes kötés %-ában)

expresszáltuk

sejtekben. A sejteket fiziológiás koncentrációban adott

0

tranziensen

kinetikája.

A

mutánsokkal

CHO

sejteket

transzfektáltunk, majd 48 óra elteltével határoztuk 80

meg

az

internalizációs

internalizációs görbéket 60

kinetikákat.

Az

125

I-Ang II adása után, az

ábrázolt időpontokban az internalizált jelzett ligand

40

AT1A-R

%-os arányának megmérésével határoztuk meg.

Mut12

Az ábrán három független kísérlet átlagát ± az átlag

Mut123

szórását tüntettük fel.

20 0

0

5

10

15

20

25

30

Idő (perc)

Az élesztő α-faktor receptorának részletes vizsgálata bebizonyította, hogy az élesztő e Gfehérjéhez kapcsolt receptorában a karboxil-terminális domén nyolc lizin aminosavából csak kettő szolgál akceptorként az ubikvitinációt végző rendszer számára [127]. A karboxilterminális régiójának majd két harmadát elvesztett deléciós mutáns endocitózisának kinetikája

49

nem különbözik a vad típusétól. Ez nem is olyan meglepő, hisz tartalmazza a SINNDAKSS Internalizált (a teljes kötés %-ában)

100

motívumot,

amelynek

lizinje az egyik fő ubikvitinációs hely. Az AT1AR

80

338STOP

mutánsa

a

Ser338

kodonja helyén tartalmaz egy terminátor 60

kodont. Ennek a receptor mutánsnak az AT1A-R

40

338STOP

internalizációs kinetikája is megegyezik a

338STOP K/A

vad típuséval [178], jelezve, hogy az

20 0

eltávolított szekvencia nem tartalmaz az endocitózis 0

5

10

15

20

25

30

szabályozásában

nélkülözhetetlen szekvenciát. Az erről a

Idő (perc)

12. ábra. Az AT1A-R 338STOP és 338STOP K/A deléciós mutánsainak internalizációs kinetikája. Az internalizáció mértékét a „Módszerek” fejezetben, illetve

mutánsról

eltávolított

tartalmazza

a

szekvencia

Lys350

és

Lys351

aminosavakat, ami szintén arra utal, hogy

az előző ábrákon leírtak szerint határoztuk meg. Az ábrán

a karboxil-terminális szekvencia disztális

három független kísérlet átlagát ± az átlag szórását

részén található lizin aminosavak nem

tüntettük fel.

vesznek

részt

a

receptor

internalizációjának szabályozásában. Az AT1AR 338STOP mutánsán maradt a vizsgált régió proximális két lizin aminosava (Lys323, Lys325) és az egyedül álló Lys333. Ez utóbbi található abban a környezetben, amiről a korábbi vizsgálatok kimutatták az internalizáció mechanizmusában való részvételét. A 338STOP deléciós receptor mutánsban megmaradt ezen lizin csoportokat is alaninra cseréltük, létrehozva ezzel a 338STOP K/A receptor mutánst. Az új mutánst CHO sejtekben kifejeztettük és megvizsgáltuk a mutáns receptor

125

I izotóppal jelzett Ang II internalizációs képességét.

Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit mutatja be a 12. ábrán. Az ábrán látható, hogy akárcsak a 338STOP mutáns, a 338STOP K/A, az általunk érdekesnek talált szekvencia-régiójában lizint nem tartalmazó deléciós receptor internalizációs kinetikája is hasonló a vad típusú receptoréhoz. Mindez ismét arra utal, hogy a kérdéses karboxil-terminális régió lizinjei nem vesznek részt a receptor endocitózisának szabályozásában. Megpróbáltuk a receptorinternalizáció és az ubikvitináció összefüggést a másik irányból is megközelíteni. Eddig mutációs analízist végeztünk, amelynél a funkció elvesztése jelentené azt a jelenséget, amiből megállapításokat tudunk tenni valamely mechanizmust illetően. A következőkben leírásra kerülő kísérletekben ennek éppen ellenkezőjével próbálkoztunk meg, az elveszett funkció helyreállításával. A funkcióvesztéses mutánsok létrehozása és vizsgálata

50

helyett a funkciónyeréses mutánsok elkészítésével próbáltunk a vizsgálati objektumról információt szerezni. Erre az élesztőben végzett hasonló vizsgálatok sikere szolgáltatott alapot [127]. A korábbi kísérleteinkben már szerepelt 319STOP AT1AR mutánst vettük alapul. Mint emlékszünk rá, ennek karboxil-terminális doménja a Tyr319-nél van „levágva”, így elvesztette a karboxil-terminális régiójának jó háromnegyedét, köztük azokat a szekvencia motívumokat is, amelyek a receptor endocitózisa szempontjából elengedhetetlenül fontosak. Emiatt a 319STOP receptor Ang II kötés hatására gyakorlatilag nem tud internalizálódni [178,189]. Úgy gondolkodtunk, hogy ha az ubikvitin kapcsolódás bármilyen szempontból is lényeges eleme a receptor endocitózisának, akkor azt mesterségesen létrehozva egy internalizáció hiányos AT1AR mutánson, helyre tudjuk állítani annak endocitózis képességét. Ennek a vizsgálatnak az alapját szintén az élesztő α-faktor receptorán végzett kísérletek adták, ahol egy hasonlóan csökkent internalizációjú receptoron az ubikvitin hozzákapcsolása helyreállította annak internalizációs képességét [127]. Ennek a kísérletnek az elvégzésére a 319STOP receptor mutáns megfelelőnek tűnt,

hisz

nem tartalmaz

olyan

szekvencia

determinánst,

amely

az

internalizáció

szabályozásához közvetlenül szükséges, így egy ubikvitin fehérje hozzákapcsolásával tisztán csak az ubikvitin receptorendocitózisban betöltött szerepét tudnánk vizsgálni. A létrejövő kimérával a receptor monoubikvitinációt tudnánk modellezni, a folyamatot, mely az élesztőben α-faktor endocitózisát lehetővé teszi. A 319STOP receptor mutáns karboxil-terminális végéhez fuzionáltuk az ubikvitin fehérjét, létrehozva ezzel egy receptor-ubikvitin kimérát. Az ubikvitin cDNS-ét az EST adatbázisból kerestük ki. Az egész fehérje cDNS-ét tartalmazó klónt is találtunk az adatbázisban, az azt tartalmazó plazmidot pedig kereskedelmi forgalomban meg tudtuk vásárolni. Az így beszerzett plazmid a humán ubikvitin teljes cDNS-ét tartalmazta. A receptor mutáns és az ubikvitin cDNS-ét rekombináns PCR technikával kapcsoltuk össze úgy, hogy a két fehérje közé néhány linker aminosav került (9. ábra), amelyek bázishármasait a PCR oligonukleotidok

tartalmaztak.

Az

új

konstrukciót

szekvenálással

ellenőriztük

és

meggyőződtünk arról, hogy nem csúszott el a leolvasási keret és valóban mindkét eredeti fehérje teljes cDNS szekvenciáját tartalmazza a kiméra. Ezek után még két mutációt bevittünk az ubikvitin szekvenciájába. Az egyik mutáció az ubikvitin Lys48 argininra cserélése, míg a másik a Gly76 alaninra cserélése volt. Ismert,

hogy

az

ubikvitin-proteaszóma

rendszer

a

sejt

szabályozott

protein

degradációjának egyik fő apparátusa. A degradációra a 26S proteaszómában kerül sor és a lebontásra a jelzést a cél fehérjékhez kapcsolódó poliubikvitin lánc jelzi. Ez a poliubikvitin lánc úgy jön létre, hogy a cél fehérje egyik lizin aminosav oldalláncának ε-amino csoportjához

51

izopeptid kötéssel hozzá kapcsolódik egy ubikvitin fehérje a karboxil-terminális glicin aminosavával. Ezután a kapcsolódott ubikvitin fehérje Lys48 aminosav oldalláncához további ubikvitin molekula kapcsolódik, majd annak Lys48-ához egy újabb, majd ahhoz egy még újabb és így tovább. Ily módon akár több tucat ubikvitin molekulából álló láncok jöhetnek létre, melyek degradációs szignált jelentenek. Mi a kiméra receptorunk ubikvitin tagján azért cseréltük ki a Lys48-at argininre, hogy ne tudjon a fuzionáltatott ubikvitin fehérjénél fogva lebontási szignált jelentő ubikvitin lánc létrejönni. Kettős célunk volt ezzel, mert egyrészt mi a monoubikvitinálást szerettük volna vizsgálni, hiszen az endocitózis folyamatában a monoubikvitinálásnak tulajdonítanak szerepet. Másrészt pedig szerettük volna megakadályozni, hogy a kiméra receptorunk a sejtekben a szintetizálódási folyamat során megkapja a degradációs szignált és ki se jusson a sejtmembránba. A másik mutáció amit az ubikvitin fehérjébe bevittünk, a karboxil-terminális utolsó aminosav, a Gly76 aminosav alaninra cserélése volt. A sejtekben az ubikvitin rendszer nem egy statikus, hanem folyamatosan változó, dinamikus rendszer, ahol csupán az ubikvitin összes mennyiségének egyensúlyi szintje állandó. Ha beavatkoznak ebbe az egyensúlyi rendszerbe, akkor az ubikvitinhez kapcsolt folyamatokban súlyos zavar keletkezik. Ilyen zavart lehet elérni például a 26S proteaszómák működésének gátlásával, amire bizonyos anyagok képesek. Ezeket a részben mesterséges, részben természetes bakteriális toxinszármazékokat intenzíven használják az ubikvitin - 26S proteaszóma rendszer kutatásában. Ezeknek a toxinoknak a hatására – ilyen például a laktacisztin vagy az MG-132 nevű vegyület – a 26S proteaszómák működése leáll, az ubikvitin rendszer működése a szabad ubikvitin molekulák képződésénél befagy, így a sejtekben óriási mértékben felhalmozódnak az ubikvitinálódott, lebontásra váró fehérjék. Hasonló problémát okoz a sejtekben mind citoszolikusan, szabad formában létező, mind a proteaszómához kötötten (annak alegységeként) működő deubikvitináló enzimek gátlása. A sejtplazmában található deubikvitináló enzimek az ubikvitinált fehérjékről távolítják el

az

ubikvitint,

ezzel

a

hibásan

degradációra

kijelölt

fehérjék

lebontásának

megakadályozásában vesznek részt s ezzel fontos regulációs lépés megvalósítói. A citoszolikus deubikvitináló enzimek aktivitásához az ubikvitin Gly76 aminosavja szükséges [194]. Mi a kiméra receptorunk ubikvitin tagján kicseréltük ezt a glicin aminosavat, ezzel a deubikvitináló enzimek számára rossz szubsztráttá tettük, lecsökkentettük annak lehetőségét, hogy egy ilyen deubikvitináló enzim eltávolítsa az ubikvitint a receptor mutánsról. Az ubikvitin karboxilterminális glicin aminosavának kicserélése mindezeken felül azt is megakadályozta, hogy a receptor mutánshoz amino-terminálisan kapcsolt ubikvitin a karboxil-terminális glicinjén keresztül esetleg hozzákapcsolódjon egy másik ubikvitin molekulához.

52

Az elkészített 319STOP-Ub kiméra receptort CHO sejtekben termeltettük, majd megvizsgáltuk az internalizációs

Internalizált (a teljes kötés %-ában)

100

kinetikáját. A 80

125

I izotóppal jelölt Ang II

ligand endocitózisát nyomon követve azt

60

tapasztaltuk,

AT1A-R

40

hogy

az

az

ubikvitin

319STOP

hozzákapcsolása

319STOP-Ub

internalizáció

hiányos AT1AR mutánshoz, nem állítja vissza annak endocitózisát. A kísérletek

20

eredménye a 13. ábrán látható. Ezek a 0

0

5

10

15

20

25

megfigyelések

30

megerősítették

korábbi

következtetéseinket arról, hogy az AT1AR

Idő (perc)

13. ábra. A 319STOP deléciós mutáns és a 319STOPUb kiméra AT1A-R internalizációs kinetikája CHO sejtekben. A receptor mutánsokkal tranziensen transzfektált sejteket

monoubikvitinációja nem játszik szerepet a receptor endocitotikus folyamatainak szabályozásában.

feltüntetett

Az AT1AR endocitózis mechaniz-

időtartamokig. Az internalizált jelölt ligand mennyiségét a

musának ubikvitináció függését vizsgáló

125

I-Ang

II-vel

inkubáltuk

az

ábrán

„Módszerek” fejezetben leírtak szerint mértük meg. Az internalizált ligand mennyiségét a teljes specifikus kötés %-

kísérleteink közben munka-csoportunk az

ában ábrázoltuk. Az ábrán három független kísérlet átlagát

internalizáció

± az átlag szórását tüntettük fel.

tanulmányozását is folytatta. Csoportunknak

más

sikerült

mechanizmusának kimutatnia,

hogy

fiziológiás hormonszintek mellett az AT1AR klatrin-mediált endocitózisa dinamin- és β-arresztin függő módon történik. Azonban ez a mechanizmus az élettaninál magasabb, 30 nM-os agonista koncentrációt alkalmazva háttérbe szorul és átveszi a helyét egy β-arresztintől és dinamintól nem függő mechanizmus [195,59]. Kézenfekvő volt azt feltételezni, hogy ugyan élettani koncentráció tartományba eső agonista koncentrációt alkalmazva az ubikvitináció által mediált internalizációs útvonal nem játszik szerepet a receptor endocitózisában, de a magasabb agonista koncentrációknál

előtérbe

kerülve,

domináns

mechanizmusként

szabályozhatja

az

internalizációt. Tehát azt feltételeztük, hogy a β-arresztintől független internalizációs mechanizmus a receptor karboxil-terminális régiójának ubikvitinálódása útján történik. A feltételezés tanulmányozása céljából megvizsgáltuk a Mut123 receptor mutáns (amelynek az általunk vizsgált karboxil-terminális régiójában az összes lizin aminosavat alaninra cseréltük) 30 nM agonista által történő stimulálás hatására létrejövő internalizációs kinetikáját. A 14. ábrán látható, hogy – amint azt laboratóriumunk korábbi kísérletei is kimutatták [195] - a vad típusú receptor internalizációja a magas ligand koncentráció hatására nagy mértékben lecsökkent.

53

Azonban ennél a csökkent értéknél nem volt kisebb a Mut123 receptor mutáns Internalizált (a teljes kötés %-ában)

60

endocitózisa, sőt e mutáns esetében az

50

internalizáció növekedését tapasztaltuk

40

hosszabb inkubációs periódus alatt. Ez az

30

eredmény azt mutatta, hogy a lizinek kicserélése nem csökkentette a receptor

20

AT1A-R

0

internalizációját

Mut123

10

0

5

10

15

20

a receptor ubikvitinálása nem játszik

30

szerepet az AT1AR endocitózisában olyan

Idő (perc)

körülmények között 14. ábra. Az AT1A-R és a teljes hosszúságú, Mut123

megy végbe.

125

I-Ang

II-vel inkubáltuk a megelőző kísérletekhez hasonlóan, de az Ang II koncentrációt 30 nM-ra növeltük meg nem agonista

koncentráció

mellett

segítségével. az

A

30

internalizációs

nM

Ang-II

kinetikát

sem,

mikor

az

β−arresztintől független mechanizmussal

receptor mutáns internalizációs kinetikája 30 nM agonista jelenlétében, CHO sejtekben.

radioaktiv

agonista

koncentrációknál sem. Ez arra utal, hogy

25

A transzfektálás után 48 órával a sejteket 0,03 nM

nagy

a

„Módszerek” fejezetben leírtak szerint mértük meg. Az internalizált ligand mennyiségét a teljes specifikus kötés %ában ábrázoltuk. Az ábrán három független kísérlet átlagát ± az átlag szórását tüntettük fel.

54

Az eredmények megbeszélése, következtetések Az AT1A-receptor foszforilációja és endocitózisa között összefüggés van A GFKR-ok működésének szabályozásában fontos lépést tölt be a receptor foszforilációja. A receptor foszforiláció a GFKR-ok között általános jelenség, így kimutatták már többek közt a β2- és β1-adrenerg receptornál [23,196], az α2Α-adrenerg receptornál [197], a V2 vazopresszin [198], a δ-opioid receptoroknál [199] és a rodopszinnál is [200]. Az AT1AR foszforilációjával foglalkozó korai tanulmányok megállapították, hogy a folyamatban a PKC, GRK2, GRK3 és GRK5 kinázok vesznek részt. [186,184,187]. Ezek a szerin/treonin-kinázok azok, melyekről feltételezték, hogy szerepet játszhatnak a receptor működésének szabályozásában. A receptor karboxil-terminális intracelluláris doménje szerin és treonin aminosavakban gazdag, ami a foszforilációs szabályozás első számú helye lehet. A GFKR-ok családjában általánosságban elmondható, hogy a foszforiláció útján történő szabályozás a receptorok karboxil-terminális doménjének szerin és/vagy treonin aminosavjain valósul meg. Vannak azonban példák arra is, hogy ez a szabályozás a receptor harmadik intracelluláris hurokjához kapcsolt, mint ahogy ezt az m2- vagy az m3-muszkarinos acetilkolinreceptor esetében láthatjuk [201,202]. A foszforiláció útján történő szabályozás a receptor szekvencia tirozin oldalláncain is megvalósulhat. Vannak olyan vizsgálati eredmények, melyek a tirozin foszforiláció receptor működéssel összefüggő jelentősége mellett szólnak. A µopioid receptor karboxil-terminális régiójában található tirozin aminosavak kicserélése lecsökkentette a receptor down-regulációját, amit tirozinkináz inhibitorokkal is el tudtak érni [203]. A B2 bradikinin receptor foszforilációját is ki lehetett védeni tirozinkináz inhibitorokkal, ami szintén a tirozin foszforiláció részvételére utal [204]. Az AT1AR karboxil-terminális régiójában három tirozin aminosav található (Tyr312, Tyr319 és a Tyr339). Korábbi adatok felvetették az AT1AR tirozin aminosavon történő foszforilációjának lehetőségét, azonban ez csak hosszan tartó stimuláció esetén volt kimutatható, a vizsgálatok nem tudták jelentőségét igazolták [205]. A receptor foszforilációjáról szerzett eddigi tudásunk szerint a karboxilterminális tirozin aminosavak nem vesznek részt a receptor foszforilációjában és az endocitózis szabályozásában sem ezek a kritikus aminosavak. Erre utalnak azok az eredményeink, melyek szerint a Ser325 aminosavnál történő deléció megszünteti a foszforilációt, illetve a Ser335-nél végrehajtott deléció és a Ser335/Thr336 alaninra cserélése azonos mértékben csökkenti le a foszforilációt. Kísérleteink tehát rámutattak arra, hogy az AT1AR foszforilációja a karboxil-

55

terminális régió szerin és treonin gazdag régiójában történik. Ez a régió a Ser326 és Ser338 között helyezkedik el és amely öt szerin és két treonin aminosavat tartalmaz. Adataink további pontosításokat tesznek lehetővé. Az Ang II által létrehozott receptor foszforiláció hasonló mértékű volt a 335STOP és az ST-AA mutánsoknál, ami egyben a vad típusú receptorénak nagyjából csak a fele. Mivel a 342STOP deléciós mutáns nem okozott számottevő receptor foszforiláció csökkenést, ezért azt kell feltételeznünk, hogy az ötven százalékos foszforiláció csökkenésért a Ser335 és a Pro341 közötti receptor szekvencia részlet a felelős. Továbbá, mivel az ST-AA receptor mutáns foszforilációs státusza azonos a 335STOP deléciós mutánséval, komoly okunk van azt feltételezni, hogy az imént említett szekvencia részleten belül a foszforiláció kiesést az ST-AA mutánsban kicserélt Ser335 vagy Thr336 okozza, de lehetséges mindkét aminosav részvétele is a folyamatban. A receptor foszforilációjának másik fele pedig a Ser325 és Ser335 közötti szekvenciára esik. Ebben a szekvencia részletben található a Ser331, ami egy PKC konszenzus foszforilációs hely foszfát akceptora. Az AT1AR foszforilációjában a PKC részvétele régóta ismert [186,188]. HEK-293 sejtekben stabilan expresszált AT1AR foszforilációjára a PKC az Ang II koncentrációtól függő hatást mutatott. Kis koncentrációjú Ang II-vel történő stimulálás hatására ez a kináz bizonyult a foszforiláció nagy részét végző kináznak [188]. Nagyobb Ang II koncentrációknál a PKC inhibitorok nem tudták csökkenteni a receptor foszforilációjának mértékét, ami ilyen körülmények közt más kinázok szerepének előtérbe kerülésére utal. A Ser331 aminosav foszforilációban való részvételét mutatja az a megfigyelésünk, hogy a PKC inhibitorként alkalmazott staurosporin nagyjából a felére csökkentette a 335STOP deléciós receptor mutáns agonista által történő stimulálásra adott foszforilációjának mértékét. A Ser325-Ser335 szekvencia részletben a Ser331-et magában foglaló PKC konszenzus foszforilációs helyen kívül még három szerin található, a Ser326, Ser328 és Ser329. Ezek az aminosavak is foszforilálódnak, melyek azonban nem PKC mediált reakciók. Az előbb említettek miatt azt mondhatjuk, hogy e három szerin aminosav által képviselt foszforiláció mértéke elmarad a Ser335/Thr336 aminosavakon létrejövő foszforiláció mögött. A receptor PKC által bekövetkező foszforilációját Qian és munkatársai részleteiben is tanulmányozták. [187]. Az AT1AR karboxil-terminális régiója a Ser331 aminosavon kívül még két PKC konszenzus felismerő helyet tartalmaz, az egyik a Ser338, a másik a Ser348 aminosav [187]. A konszenzus szekvenciák szerinjeit külön-külön és egyszerre is alaninra cserélték és a mutánsok Ang II-re, illetve PMA-ra adott foszforilációját vizsgálták. Mindhárom, a PKC konszenzus szekvenciában szereplő szerin kicserélése esetén az Ang II-re kapott receptor foszforiláció csak mintegy negyven százaléka volt a vad típusénak. A PMA indukció hatására a vad típus és a mutánsok foszforilációja is csökkent, ami arra utal, hogy a PKC-n kívül más

56

kináz is közrejátszik a foszforilációs folyamatokban. A receptor karboxil-terminális régiójában található három PKC foszforilációs hely között nem tudtak fontossági sorrendet kimutatni, mindhárom nagyjából egyformán veszi ki részét a receptor foszforilációból. Megállapították továbbá azt is, hogy a PKC által foszforilált szerin aminosavak alaninra cserélése nem befolyásolta a receptorendocitózist [187]. Ez a megfigyelés arra utal, hogy a PKC által mediált foszforiláció nem vesz részt a receptorinternalizáció szabályozásában. Az AT1AR foszforilációját okozó fő „gyanúsítottak” a GRK családba tartozó kinázok. Azt, hogy a GRK-k részt vesznek a receptor foszforilációjában, elég régóta tudjuk. A GRK2, GRK3 és GRK5 túltermeltetése HEK-293 sejtekben a receptor foszforiláció jelentős növekedéséhez vezet [186]. A GRK2 domináns negatív mutánsának túltermeltetése ugyanebben a sejttípusban a receptor deszenzitizációjának elmaradását vonta maga után. A domináns negatív GRK2 kifejeztetése COS-7 sejtekben a receptor jelentős, mintegy 40%-os foszforiláció csökkenéséhez vezet [206]. A receptor foszforiláció másik részét adó PKC aktivitás hozzájárulását illetően különböző, igen tág határok közt változó adatokat találunk az irodalomban [188,187,206]. Az AT1AR foszforilációjának megismerésére irányuló vizsgálataink azt mutatták, hogy a receptor fő foszforilációs helyeit tartalmazó régió egybe esik azzal a régióval, mely a receptor internalizációjában is központi jelentőségű [178]. Az internalizációban fontos szerepet játszó STL motívum szerinje az a Ser335, amelynél deléciót okozva mind a receptor foszforiláció, mind a receptorinternalizáció a felére esik vissza. Az STL motívum treoninja a Thr336, amelyet a Ser335-el együtt alaninra cserélve, a receptor mutáns (ST-AA) ligand által indukált foszforilációja szintén kb. 50 %-a volt a vad típusú receptorénak. Vizsgálatainkból kitűnik, hogy az AT1AR karboxil-terminális szerinben és treoninban gazdag régiója a receptor foszforilációjának helye. A kísérletekben használt deléciós mutánsok a deléció méretétől függően egyre kisebb mértékű agonista által stimulált foszforilációt mutattak. Az internalizációs kinetikájuk ugyan ilyen arányban csökkent. Az ST-AA mutáns (amely nem deléciós, hanem aminosav helyettesítéses mutáns és ahol a Ser335 és Thr336 aminosavak lettek alaninra cserélve) foszforilációjának mértéke azonos a 335STOP deléciós mutánséval. Ugyanakkor ennek a két mutánsnak az internalizációs kinetikája jelentősen eltér egymástól. Az ST-AA mutáns endocitózisa nagyobb mértékű, mint a 335STOP receptor mutánsé. Az ST-AA mutáns vizsgálatával nyert adatok viszont arra utalnak, hogy az STL motívum szerinje és treoninja foszforilálódik és ez a foszforiláció szerepet játszik a receptorinternalizációban. Ezt a következtetést támasztják alá azok a kísérletek, melyeket Thomas és munkatársai végeztek [207]. Az STL motívum aminosavait egyenként kicserélték savanyú aminosavakra. Ezzel tulajdonképpen hasonló savas környezetet hoztak létre az aminosav szekvencia adott pontján, mint amit a foszforiláció hoz létre. Ezeknek a mutánsoknak az internalizációs kinetikáját

57

megvizsgálva azt tapasztalták CHO sejtekben, hogy a mutánsok endocitózisának mértéke nem tér el a vad típusú receptor endocitózisától [207]. Mikor más munkacsoportok ugyanezeket az aminosavakat alaninra cserélték és a létrehozott receptor mutánsok ligand indukált internalizációját megvizsgálták, a vad típusénál kisebb internalizációs kinetikákat kaptak [178]. Az ST-AA mutáns csökkent internalizációs kinetikáját is helyre lehetett állítani a Ser335 aszpartátra, és a Thr336 glutamátra cserélésével [207]. Ezek az eredmények szintén azt mutatják, hogy az AT1AR karboxil-terminális régiójában a ligand kötés hatására bekövetkező foszforilációs lépések részt vesznek a receptor endocitózisának szabályozásában, felgyorsítják azt. Ma már általánosan elfogadott tény, hogy a GFKR-ok többsége agonista indukálás hatására interakcióba lép a β-arresztinekkel. Ez az interakció a receptorok aktiválásának, valamint az aktiválást követő GRK-ok általi foszforilációjuknak a következménye. A receptorok β-arresztin kötése szétkapcsolja azokat a G-fehérjétől, végleg lehetetlenné téve a jelátvitelt. A βarresztin kötés másik következménye a receptorok klatrin burkolt mélyedésekbe szedődése, amit a GFKR-ok internalizációjában alapvető fontosságú adapter funkció tesz lehetővé. A GRK-knak tulajdonítják azt a foszforilációt, amely megnöveli a β-arresztinek kötődésének affinitását, illetve stabilabbá teszi a receptor – β-arresztin interakciót. Az AT1AR internalizációjában a β-arresztin részvétele igen kérdéses volt. Az elmúlt évben napvilágot látott vizsgálatok nyomán azonban egyre több adat áll rendelkezésre ennek a kérdésnek a tisztázásához. Több irányból történő megközelítéssel, különböző technikák alkalmazásával kapott eredmények azt mutatják, hogy ligand által történő stimulálás hatására a β-arresztin a receptorral asszociál. Konfokális mikroszkópiával, illetve a β-arresztinek domináns negatív hatású mutánsainak a receptorral történő koexpresszáltatásával és az internalizációs kinetika vizsgálatával kapott eredmények vezettek el ide [208,195]. Az AT1AR és a β-arresztin közötti fizikai kapcsolatot koimmunprecipitációs kísérletekkel is sikerült bizonyítani [209,210]. A vizsgálatokat végző kutatóknak az AT1AR karboxil-terminális szekvenciájában deléciókat tartalmazó, illetve csökkent foszforilációs képességű mutánsainak segítségével sikerült rámutatniuk arra, hogy a β-arresztin-1 fizikai interakcióba lép az AT1AR-ral és ez az interakció függ a receptor foszforilációjától és a karboxil-terminális régió hosszától. Ez alapján kimutatták, hogy a β-arresztin-1 és a receptor közötti interakcióban a Thr332, Ser335, Thr336 és Ser338 aminosavaknak van kiemelten fontos szerepük [210]. Ezek az adatok megerősítik vizsgálataink eredményeit a receptor foszforiláció és az internalizáció összefüggéséről, valamint magyarázatot adhatnak az ST-AA és a 335STOP mutáns eltérő foszforilációs és internalizációs tulajdonságaira. A vizsgálati eredményekből az tűnik ki, hogy az internalizáció szabályozásáért

58

több folyamat felelős, a foszforiláció nem kizárolagos ezeknek a sorában. A β-arresztin kötés is nagyon fontos tényező. A két mutáns foszforilációs tulajdonságai hasonlóak, azonban a 335STOP receptorból hiányoznak olyan szerkezeti determinánsok, melyek az endocitózis szabályozásában fontos egyéb faktorok, köztük a β-arresztin kötésében játszanak szerepet. A deléciós receptor mutáns β-arresztin kötése kisebb mértékű lehet, mint az ST-AA mutánsé, ami magyarázhatja az erősen csökkent mértékű internalizációt. A GRK-k közül részletesebb adatok a GRK2 kináz hiányos domináns negatív mutánsának az AT1AR működésére gyakorolt hatásáról állnak rendelkezésre. A GRK család által katalizált receptor foszforiláció konszenzus szekvenciájára vonatkozó információk meglehetősen ellentmondásosak. Szintetikus peptid szubsztrátok alkalmazásával ki lehetett mutatni a GRK-k körében bizonyos preferenciát azokhoz a peptidekhez, amelyekben savas aminosav oldalláncok közel voltak a foszforilációs reakcióban részt vevő szerin vagy treonin aminosavakhoz [211,212]. Ez alapján a GRK mediált receptor foszforiláció struktúrális követelményeként az akceptor szerin vagy treonin szomszédságában található aszparaginsav vagy glutaminsav definiálható. Számos receptoron, így a β2-adrenerg receptoron, az m2muszkarinos acetilkolinreceptoron és a µ-opioid receptoron elvégzett vizsgálatok is ezt támasztják alá. Az AT1AR szekvenciájában a harmadik intracelluláris hurok disztális részén található dupla aszparigansav motívumnak, az Asp236-Asp237 van szerepe a receptor GRK2 által mediált foszforilációjában. A receptor e két aszparaginsavának alaninra, vagy aszparaginra cserélése nagy mértékben, mintegy 60 %-kal lecsökkenti a receptor foszforilációt [206]. E mutánsok esetében nem lehetett a GRK2 kináz deficiens domináns mutánsával további foszforiláció csökkenést elérni. Mikor a PKC-t inhibitorral gátolták, a mutáns foszforilációja tovább csökkent (a domináns negatív GRK2 expressziója mellett is), de a receptor foszforilációja nem tűnt el teljesen [206]. Meglepetésre ezek az aszpartát mutációk nem befolyásolták a receptorinternalizációt, holott a tanulmányozott GFKR-ok többségénél a GRK foszforiláció növeli meg a receptor β-arresztin affinitását, ami az általános esetben az endocitózis feltétele. Tehát ezek a receptor mutánsok azt sugallják, hogy egyrészt a GRK2 által okozott foszforiláció nem az endocitózist szabályozó tényező, másrészt a GRK2 és a PKC kináz aktivitásának gátlása után megmaradt mintegy 20%-os receptor foszforiláció az, amely az internalizáció szabályozása szempontjából fontos. Sajnos azonban semmit sem tudunk annak a kináznak a mibenlétéről, amely ezt a kismértékű, de annál jelentősebb receptor foszforilációt okozza. A receptor foszforiláció és az internalizáció szabályozása szempontjából az irodalmi adatok alapján érdemes megemlíteni egy heparin szenzitív kináz és a kazein-kinázok közreműködésének lehetőségét is.

59

Az AT1AR foszforilációját vizsgálva Tang és munkatársai leírták egy közelebbről nem azonosított, heparin szenzitív kináz részvételét a receptor karboxil-terminális régiójának foszforilálásában [213]. A kutatók vizsgálataik során in vitro foszforilációs kísérleteket végezve jutottak arra a következtetésre, hogy ez a kináz nem azonos a GRK család egyik tagjával sem. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok foszforilációs folyamatainak egyik érdekes fejezete a kazein-kinázokról szól [214]. Az m3-muszkarinos acetilkolinreceptor foszforilációját vizsgálva a kutatók megállapították, hogy a másodlagos hírvivők által által szabályozott kinázok, ebben az esetben a PKC nem vesz részt a receptor foszforilációjában [202]. Gátlószerekkel végzett kísérletekkel sikerült megállapítani, hogy a receptor agonista függő foszforilációját egy a GRKoktól különböző kináz végzi , melyet később a kazein-kináz 1α-ként (CK1α) azonosítottak [34]. A kináz domináns-negatív mutánsának a sejtekben történő túltermeltetése mintegy 50%-os csökkenést okozott a ligand által történő stimulálásra bekövetkező receptor foszforilációban, ami azt bizonyította, hogy a CK1α az egyik fő felelőse az m3-receptor ligand aktiválta foszforilációjának intakt sejtekben is [215]. Az emlősök receptorai közül a mai napig csak az m3-receptorról írták le a kazein-kináz 1 részvételét a foszforilációs folyamatokban. Ugyanakkor az élesztő α-faktor receptorának foszforilációjában a kazein-kináz 1 részvétele szinte biztos. Az élesztő négy CK1 ortológ génnel rendelkezik, ezek közül két gén terméke az (Yck1p és Yck2p), mely membrán lokalizációja folytán részt vehet az α-faktor receptor foszforilásában. Olyan élesztő törzsben, amelyben kitörölték a yck1 gént, a yck2-t pedig hőmérséklet érzékennyé tették, a restriktív hőmérsékleten az α-faktor receptor konstitutív és ligand indukálta foszforilációja is drámaian lecsökkent. Ligand által történő stimulálásra a receptor nem ubikvitinálódott és elvesztette az endocitózis képességét is [125]. Az AT1AR karboxil-terminális szekvenciája is tartalmaz több CK1α konszenzus foszforilációs helyet, ezek közül az egyik az előzőekben már említett, mind a foszforiláció, mind az internalizáció szempontjából fontos STL szekvencia részletre esik [214]. Nem lehet kizárni annak a lehetőségét, hogy a receptorinternalizációt is szabályozó foszforilációjáért a kazein-kináz 1 a felelős. Ennek a kérdésnek a megválaszolása azonban még várat magára. Még egy kinázt érdemes megemlíteni, amely esetleg szerepet játszhat az AT1AR foszforilációjának szabályozásában, ez pedig a kazein-kináz 2. Az elnevezése hasonlóságát kivéve nem hasonlít semmiben a kazein-kináz 1-re, teljesen más a szerkezete és a szubsztrátjai konszenzus szekvenciája is. Azonban a TRH-receptor kapcsán leírták részvételét a receptor foszforilációjában, amely összefüggést mutatott a receptor karboxil-terminális régiójának β−arresztin kötő képességével [216]. A kazein-kináz 2 részvétele az AT1AR internalizációt is befolyásoló foszforilációjában mindezek ellenére kis valószínűségű a kináz konszenzus szekvenciájának hiánya miatt.

60

Az AT1A-receptor karboxil-terminális régiójának ubikvitinációja nem játszik szerepet a receptor endocitózisának szabályozásában Az élesztő α-faktor receptora konstitutív internalizációs tulajdonsággal rendelkezik, de ez az állandó receptorendocitózis sokszorosára növekszik a ligand, az α-faktor kötődés hatására. Az

internalizáció

feltétele

a

receptor

monoubikvitinációja.

Az

ubikvitin

kovalens

kapcsolódásának helyének a SINNDAKSS szekvencia lizinjét határozták meg a kutatók, továbbá azt is megállapították, hogy a lizin ubikvitinációjához a szekvencia szerinjeinek foszforilálódása szükséges. Kísérleteink kezdetén nem volt ismert az AT1AR internalizációs mechanizmusa. A receptor foszforilációjára irányuló kísérletek arra a következtetésre vezettek, hogy a foszforiláció szerepet játszik a receptor endocitózisában, így joggal merülhetett fel a βarresztinek szerepe a receptor deszenzitizációjában és internalizációjában. Mivel a receptor foszforilációját fontosnak tartottuk az internalizációban, viszont a korábbi vizsgálatok alapján úgy tűnt, hogy a β-arresztinek nem játszanak abban szerepet, arra gondoltunk, hogy az élesztőben leírt foszforiláció-függő folyamat, az ubikvitináció lehet az a mechanizmus, amely közreműködhet az AT1AR endocitózisában. Kísérleteink során megvizsgáltuk, hogy az AT1AR karboxil-terminális szerinben és treoninban gazdag régiójában található lizinhez kapcsolt mechanizmusoknak van-e szerepük a receptor endocitózisában. A vizsgálatokba a Tyr319 aminosavtól disztálisan elhelyezkedő lizineket vontuk be, mert korábbi eredményekből tudtuk, hogy az AT1AR internalizációjában a karboxil-terminális régiónak ez a része vesz részt. [178]. A Tyr319 aminosavtól disztálisan a receptor karboxil-terminális szekvenciája öt lizint tartalmaz, melyek három csoportban helyezkednek el. Ezeket a lizineket alaninra cserélve vizsgáltuk a receptor internalizációs kinetikájában bekövetkező változásokat. Azt tapasztaltuk, hogy a lizint kódoló régiók mutációi nem befolyásolták a receptor internalizációját. Vizsgálataink arra utalnak, hogy az AT1AR szerinben és treoninban gazdag karboxil-terminális régiójában található lizinek ubikvitinációja nem játszik szerepet a receptor endocitózisában. Csoportunk több irányban is végzett vizsgálatokat, hogy felderítse az AT1AR internalizációját szabályozó molekuláris mechanizmusokat. Ennek volt egyik ága az ubikvitináció endocitózisban betöltött szerepének vizsgálata, míg a másik a hagyományosnak nevezhető, β-arresztinek által mediált mechanizmus vizsgálata volt. Munkacsoportunk kutatói a receptorendocitózis tanulmányozása során megállapították, hogy a receptor élettanilag releváns hormonkoncentráció mellett bekövetkező endocitózisában a dinamin és a β-arresztin fehérjék részt vesznek [195]. Ezek az adatok magyarázzák meg azt, hogy az élettanilag megfelelően alacsony agonista koncentrációban miért találtuk azt, hogy az AT1AR internalizációjában nem

61

vesz részt a receptor ubikvitinációja. Úgy tűnik, hogy az alacsony hormonkoncentráció tartományban az endocitózis nem függ az ubikvitin molekula receptorhoz kapcsolódásától, mert az internalizáció nagy valószínűséggel a β-arresztin fehérjék részvételével történik. Munkacsoportunk adatai azonban azt mutatták, hogy magas hormonkoncentráció mellett az AT1AR internalizációja már nem függ a dinaminoktól [195]. Ez a megfigyelés indított minket arra a vizsgálatsorozatra, amelynek során a fiziológiásnak elfogadott agonista koncentrációnál nagyobb, 30 nM-os ligandkoncentráció alkalmazása mellett tanulmányoztuk a receptor ubikvitinációnak az endocitózis szabályozásában betöltött szerepét. Annak a mutáns AT1AR-nak azonban, amely szerinben és treoninban gazdag karboxil-terminális régiójában lizint nem tartalmaz, az internalizációs kinetikája nem csökkent le a vad típushoz képest. Megfigyeléseink alapján azt mondhatjuk, hogy a lizin aminosavakhoz kapcsolható folyamatok a nagy agonista koncentrációval stimulált receptor endocitózisában sem vesznek részt. Úgy tűnik tehát, hogy a receptor ubikvitináció sem a fiziológiás, sem az annál nagyobb hormonkoncentráció mellett működő internalizáció mechanizmusában nem vesz részt. Az emlősök GFKR-ainak ubikvitinációjáról, illetve annak funkciójáról nagyon kevés ismerettel rendelkezünk. Az emlősök GFKR-ai közül ubikvitinációt eddig a rodopszinnál [140], a δ-opioid receptornál [217,218], a CXCR4 kemokinreceptornál [219] és a β2-adrenerg receptornál

[220]

mutattak

ki.

Vizsgálataink

megkezdése

előtt

csak

a

rodopszin

ubikvitinációjáról volt tudomásunk, a többi GFKR-al kapcsolatban napvilágott látott megfigyelés mind kísérleteink közben vagy után jelent meg. A rodopszin és a δ-opioid receptor esetében az ubikvitin kapcsolódása a 26S proteaszómán keresztül történő, szabályozott degradációban játszik szerepet. Az egyik legelső megfigyelés a GFKR ubikvitinálással kapcsolatban még a kilencvenes évekből, a rodopszin vizsgálatából származott és a fotoreceptor ubikvitinációját írta le. A folyamat jelentőségét a fotoreceptor degradációjában valószínűsítették. A δ-opioid receptor esetében leírt ubikvitináció szintén a receptor proteaszómán keresztüli degradációjában játszik szerepet. A vizsgálatok szerint az endoplazmatikus retikulumban újonnan szintetizálódott δ-opioid receptorok egyfajta minőségi ellenőrzésen esnek át, a hibásan szintetizálódott, vagy a képződés után hibás térszerkezettel kialakult receptorok a Sec61 translocon segítségével az endoplazmatikus retikulum lumenéből a citoplazmába kerülnek, ahol deglikozilálódnak, majd ubikvitinálódnak. Az ily módon ubikvitinálódott hibás receptorok a 26S proteaszómában kerülnek lebontásra [217]. A µ- és δ-opioid receptorok down-regulációja csökkent mértékű, ha proteaszóma inhibitorokkal

inkubálják

a

sejteket.

Ez

a

beavatkozás

poliubikvitinált

receptorok

felhalmozódásához vezet [218]. A folyamatban szereplő receptor poliubikvitináció agonista független, ami valószínűtlenné teszi az ubikvitin részvételét az opioid receptorok

62

endocitózisában. A δ-opioid receptoron végzett legújabb vizsgálatok szerint a receptor ubikvitinációja nem szükséges sem a receptor internalizációjához, sem a receptor stimulálás hatására bekövetkező degradációjához. A kísérletekben a receptor összes lizinjének kicserélése nem befolyásolta a mutáns receptor endocitózisának kinetikáját, ami megerősíti azt a feltételezést, hogy a receptor internalizációjában az ubikvitiniáció nem játszik szerepet [221]. A CXCR4 kemokinreceptornál az ubikvitin kapcsolódása egészen más jellegű folyamatok szabályozásában szerepel. Ez a receptor agonistával történő stimulálás hatására gyorsan internalizálódik, és a vizsgálatok szerint kevéssé reciklizálódik, azaz az egyszer már internalizált receptor kis valószínűséggel kerül vissza a plazmamembránba [222,223]. Ennél a receptornál agonista függő monoubikvitinációt írtak le aminek a receptor degradációjában van szerepe [219]. A folyamatot valószínűleg a lizinek melletti szerin aminosavak foszforilációi felgyorsítanak. A degradációs motívumban található lizinek kicserélése nem volt hatással a CXCR4 receptor endocitózisára, azonban degradációját gyakorlatilag teljesen megszüntette. Tehát a receptor endocitózisa nem függ ezeknek a lizin aminosavaknak a jelenlététől, viszont a receptor ubikvitinációja és degradációja igen. A receptor degradációjáról kimutatták, hogy az a lizoszómákban történik, ami ebben esetben az ubikvitin rendszer proteaszómáktól független funkciójára utal [219]. A β2-adrenerg receptor ubikvitinációja is a receptor lebomlásához kapcsolódik. A vizsgálatok szerint az agonistával történő stimulálásra ez a receptor is ubikvitináción esik át. Azonban az ubikvitin kapcsolódása a jelek szerint poliubikvitinációt jelent [220]. A β2-adrenerg receptor lizineket nem tartalmazó mutánsának degradációja az agonistával történő stimulálást követő nagy mértékben lecsökkent, azonban a mutációk az internalizáció mértékére nem voltak hatással [220]. Ezek a vizsgálati eredmények azt mutatják, hogy az eddig tanulmányozott emlős GFKRok ubikvitinációja nem vesz részt a ligand által stimulált endocitózis szabályozásában, sem a CXCR4, sem a β2-adrenerg receptor internalizációját nem modulálták a receptorok lizinjeihez kapcsolt folyamatok. Mindkét GFKR-nál az ubikvitin kapcsolódása

a degradációs

folyamatokkal függött össze. Érdemes kihangsúlyozni, hogy nem a 26S proteaszóma-rendszer által biztosított mechanizmussal történt receptor degradációról van szó, hanem attól független, a lizoszómákban zajló fehérje lebontásról. Ezekben az esetekben tehát a receptor ubikvitinációja szabta meg a receptor degradáció mértékét, ami arra utal, hogy az ubikvitin az endocitózissal a sejtbe került receptor lizoszomális lebontásának szabályozásában játszik szerepet. Ennek alapján úgy tűnik, hogy a receptor monoubikvitinációja a lizoszómális degradációs útvonalra irányítja a receptort. Ugyanakkor a β2-adrenerg receptornál a proteaszóma inhibitor jelenlétében nagy mértékű csökkenést tudtak kimutatni a degradáció mértékében, ami a proteaszóma-rendszer

63

részvételére utal ebben a folyamatban [220]. Érdekes módon a proteaszóma inhibitor az adrenerg

receptor

internalizációját

is

gátolta.

Hasonló

jelenséget

tapasztaltak

a

növekedésihormon-receptor esetében is, ahol ugyan ez az inhibitor szintén gátolta mind az internalizációt, mind a receptor degradációt [224]. A proteaszóma inhibítorok ezen gátló hatásainak mechanizmusa még nem ismert. Az EGFR-ról régóta ismert, hogy endocitózisa során poliubikvitinálódik [135]. Amint arról az Irodalmi előzmények című fejezetben már szó volt, a receptor tirozinkinázok, köztük az EGFR egyik fontos szabályozó fehérjéje a c-Cbl multiadaptor protein, amely rendelkezik E3 ubikvitin ligáz aktivitással is [139,138]. Ez az ubikvitin ligáz aktivitás teszi lehetővé az EGFR ubikvitinációját, amely a receptor down-regulációban és ezzel a jelátvitel szabályozásában működik közre. A receptor tirozinkinázok down-regulációja az endoszómákban található internalizált receptorok lizoszómákban történő degradációján keresztül valósul meg. A jelenlegi elképzelések szerint a lizoszómába történő irányítás az a lépés, amelyet az ubikvitináció irányít: az ubikvitinált receptorok a lizoszómába, míg az ubikvitinnel nem módosított receptorok reciklizációra kerülnek. A legújabb vizsgálatok szerint azonban a c-Cbl fehérje nemcsak az EGFR degradációjának, hanem a receptor internalizációjának szabályozásában is részt vesz. Adapter protein funkciójánál fogva az aktivált receptorhoz köti a CIN85 proteint, amely konstitutív asszociációt mutat az endofilin fehérjével [225]. Az endofilin a klatrin burok egyik szabályozó fehérjéje, így a Cbl protein ezen keresztül a receptor internalizációjának szabályozásában is részt tud venni. Az élesztőben számos olyan mutánst írtak le, melyekben a kompartmentek közötti vezikula mozgások szenvednek zavart. Ezeknek egy csoportját alkotják azok a mutánsok, melyek fenotípus jellemzője a késői endoszóma aberráns morfológiája. Ezekben a mutánsokban rendszerint károsodott az endoszóma- valamint a Golgi kompartmentek és a vakuola közti transzport. Az élesztőben a vakuola a magasabb rendű eukarióták lizoszómájának megfelelő képlet. A mutációkat izolálták, karakterizálták és segítségükkel a vakuólába vezető vezikuláris transzport lépések sok részletét sikerült tisztázni. A vizsgálatok arra világítottak rá, hogy a vakuólába kerülő proteinek, legyenek azok akár a sejtmembránról származók, akár vakuóláris enzimek, monoubikvitinálódnak. A monoubikvitináció az a jelzés, amelyet a késői endoszómákon lokalizálható ESCRT-I-nek elnevezett komplex egyes tagjai felismernek és a késői endoszómákról azok lumenébe lefűződő vezikulákba irányítanak, létrehozva ezzel a multivezikuláris testnek nevezett képletet [226]. Ez a képlet a vakuólákkal fuzionálva juttatja a belső vezikulákat és azok tartalmát a degradáció helyszínére. Az ESCRT-I komplex egyes tagjainak leírták az emlős ortológjait, melyek az emlős sejtekben is részt vesznek a multivezikuláris test kialakításában és az abba irányuló transzport irányításában. Az egyik ilyen

64

molekula a TSG101, mely az EGFR lizoszómába irányításának fontos résztvevője [227]. Ez tulajdonképpen felfogható egy ubikvitinreceptornak is, mely felismeri az ubikvitinált membránreceptorokat és a lizoszómális degradáció irányába „küldi” azokat. A közelmúltban írtak le az élesztőben még két ESCRT komplexet, melyek szintén a multivezikuláris test kialakításában és az oda bejutó fehérjék kiválasztásában, transzportjában játszanak szerepet [228,229]. Ez utóbbiak emlős megfelelői még nem ismertek. Mai tudásunk alapján az emlős membránreceptorok ubikvitinációja sokkal inkább az internalizált receptorok endocitózis utáni vezikula vándorlásaival függnek össze, mint azok endocitózisával. Az ubikvitináció szerepe az endocitotikus lépések után, a sejt belsejében válik fontossá, ahol a receptor további sorsát határozhatja meg: degradációra, vagy reciklizációra (a sejtmembránra történő ismételt kijutásra) kerülnek-e. Vizsgálataink arra a megállapításra vezettek, hogy az AT1AR endocitózisának szabályozásában a receptor ubikvitináció nem vesz részt. Kísérleteink eredményei viszont nem zárják ki annak a lehetőségét, hogy az ubikvitináció szerepet játszik az endocitózis utáni vezikula vándorlási folyamatoknak a szabályozásában. Az internalizált AT1AR legnagyobb része a vizsgálatok szerint reciklizációra kerül, vagyis visszahelyeződik a plazmamembránba [174,230]. A receptorok kisebb része viszont a lizoszómákban degradálódik. A nagy Ang II koncentráció mellett végzett vizsgálataink azt mutatják, hogy a Mut123 jelű, az általunk vizsgált karboxil-terminális régióban lizineket nem tartalmazó AT1AR mutánsunk internalizációja hosszabb inkubálási periódus után nagyobb mértékű, mint a vad típusú receptoré. Ez utalhat arra, hogy a jelzett ligand akkumulációja nagyobb mértékű a mutánsnál. Ez adódhat abból, hogy a lizinek hiánya miatt a receptor ubikvitinációja elmarad, így károsodik a lizoszómákba történő irányítás. Ennek következtében a lizoszómákba, így degradációra a vad típusnál kevesebb mutáns receptor kerül. Az ubikvitináció hiánya miatt a receptor degradáció csökkenése nagyobb mértékű reciklizációt eredményezhet, ami a kötőhelyek számát megnövelheti. Ez a kérdés azonban mindenképpen további vizsgálatokat igényel, mint ahogy további kísérletek feladata lesz tisztázni, hogy az ubikvitináció az AT1AR sejten belüli transzportját befolyásolja-e, az endoszóma frakciók közti mozgásban, illetve a receptor reciklizációjában részt vesz-e. Az emlősök GFKR-ainak lizoszómális lebontási folyamata, a receptorok lizoszómába kerülésének mechanizmusa azonban ubikvitin kapcsolódás nélkül is megtörténhet. A δ-opioid receptoron végzett legújabb vizsgálatok arra világítottak rá, hogy a receptor ubikvitinációja nem szükséges sem a receptor internalizációjához, sem a receptor degradációjához. A receptor összes lizinjének kicserélésének hatására az ubikvitinációra képtelen receptor mutáns sem endocitózis kinetikája, sem lizoszómális degradációjának kinetikája nem változott meg. Mindez azt mutatja, hogy a δ-opioid receptor lizoszómális lebomlása a receptor ubikvitinációjától függetlenül

65

valósul meg [221]. Ezzel összhangban, a δ-opioid receptor lizoszómába irányításában kulcs szerepet tulajdonítanak egy újonnan leírt fehérjének, a GASP-nak [231]. Ennek a fehérjének a domináns negatív hatású fragmentje gátolta a receptor lizoszómába történő kerülését, ugyanakkor megnövelte a receptor visszahelyeződését a plazmamembránba. Mindez azt mutatja, hogy a sejten belüli vezikula vándorlások szabályozásában többféle mechanizmus is részt vehet, a különböző GFKR-ek különböző mechanizmusokat használhatnak a lizoszómába történő transzportjukhoz. Az AT1AR fiziológiásnál nagyobb (30 nM) hormonkoncentráció mellett β-arresztintől és dinamintól független internalizációjának mechanizmusa továbbra is ismeretlen. Az eddig leírt folyamatok közül mi az ubikvitináció szerepét vizsgáltuk meg és úgy találtuk, hogy ilyen körülmények között az internalizációért nem ez a mechanizmus felelős. A kaveolákon keresztül történő endocitózis az egyik β-arresztintől független mechanizmus, amely szerepet játszhat az AT1AR internalizációjában. Az A1 adenozin receptor endocitózisa során kimutatták, hogy a receptor karboxil-terminális doménje kapcsolódik a kaveolin-1 fehérjével, ami arra utal, hogy ennek a receptornak az endocitózisában részt vesznek a kaveolák [232]. Habár a kaveolák részvételét az AT1AR endocitózisában még nem sikerült bizonyítani, nem lehet kizárni annak lehetőségét, hogy a receptor nagy agonista koncentráció melletti internalizációs folyamataiban is szerepet játszik ez az endocitózis útvonal. Ugyanakkor az élettaninál nagyobb agonista koncentráció alkalmazása esetén a receptor internalizációjában a munkacsoportunk által kapott vizsgálati eredmények szerint a dinamin nem játszik szerepet [195]. Az irodalmi adatok szerint viszont a kaveolákkal történő endocitózis folyamatában részt vesz a dinamin fehérje [51,52]. A dinamintól független internalizációs folyamatok legtöbbször a klatrintól is független endocitózis mechanizmusok,

melyek

hormonkoncentrációnál

nagyon

tapasztalt

kevéssé β-arresztin

ismertek. és

AT1AR-nál

Az

dinamin

független

mechanizmusának földerítése ezért további vizsgálatokat igényel majd.

66

a

nagy

internalizáció

Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt témavezetőmnek Dr. Hunyady Lászlónak tartozom köszönettel, aki laboratóriumába vett, megteremtette munkám feltételeit és mindvégig irányította, és maximálisan támogatta azt. Köszönöm Dr. Spät Andrásnak, hogy intézetvezetőként és egyben programvezetőként lehetővé tette tudományos tevékenységemet az Intézetben, és figyelemmel kísérte munkámat. Hálás vagyok közvetlen munkatársaimnak Gáborik Zsuzsának, Szaszák Mártának segítségükért, a szakmai eszmecserékért és laborunk baráti hangulatáért. Köszönöm asszisztensnőink Bakacsiné Rácz Judit és Süpeki Katinka odaadó asszisztensi munkáját. Köszönettel tartozom a labor többi tagjának Balla Borbálának, Balogh Katalinnak, Turu Gábornak és különösen Várnai Péternek, valamint az Élettani Intézet valamennyi munkatársának minden segítségért. Köszönöm Dr. Kevin J. Catt-nek és Dr. Adrian J.L. Clark-nak a kísérletes munka anyagi feltételeinek megteremtéséhez nyújtott segítségüket, valamint a kísérletek értékeléséhez és a publikációkhoz nyújtott támogatásukat. Külön köszönettel tartozom Dr. Kevin J. Catt-nek, hogy lehetővé tette azt, hogy laborjában dolgozhassam és mindvégig támogatta munkámat. Köszönöm a cikkekben szereplő azon társszerzők segítségét is akiket itt név szerint nem említek, mert a kísérletes munka olyan részleteiben vettek részt ami a disszertációban nem szerepel.

67

Irodalomjegyzék 1

K. Palczewski, T. Kumasaka, T. Hori, C.A. Behnke, H. Motoshima, B.A. Fox, T. Le, I, D.C. Teller, T. Okada, R.E. Stenkamp, M. Yamamoto, M. Miyano, Crystal structure of rhodopsin: A G proteincoupled receptor, Science 289 (2000) 739-745.

2

J. Bockaert, J.P. Pin, Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success, EMBO J. 18 (1999) 1723-1729.

3

J. Wess, G-protein-coupled receptors: Molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition, FASEB J. 11 (1997) 346-354.

4

U. Gether, B.K. Kobilka, G protein-coupled receptors. II. Mechanism of agonist activation, J. Biol. Chem. 273 (1998) 17979-17982.

5

B.F. O'Dowd, M. Hnatowich, J.W. Regan, W.M. Leader, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Site-directed mutagenesis of the cytoplasmic domains of the human β2-adrenergic receptor. Localization of regions involved in G protein-receptor coupling, J. Biol. Chem. 263 (1988) 15985-15992.

6

E. Kostenis, B.R. Conklin, J. Wess, Molecular basis of receptor/G protein coupling selectivity studied by coexpression of wild type and mutant m2 muscarinic receptors with mutant Gαq subunits, Biochemistry 36 (1997) 1487-1495.

7

J.G. Krupnick, J.L. Benovic, The role of receptor kinases and arrestins in G protein-coupled receptor regulation, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 38 (1998) 289-319.

8

S.K. Böhm, E.F. Grady, N.W. Bunnett, Regulatory mechanisms that modulate signalling by Gprotein-coupled receptors, Biochem. J. 322 (1997) 1-18.

9

S.S. Ferguson, Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling, Pharmacol. Rev. 53 (2001) 1-24.

10 M. Bouvier, W.P. Hausdorff, A. De Blasi, B.F. O'Dowd, B.K. Kobilka, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Removal of phosphorylation sites from the β2-adrenergic receptor delays onset of agonist-promoted desensitization, Nature 333 (1988) 370-373. 11 M.J. Lohse, J.L. Benovic, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Multiple pathways of rapid β2-adrenergic receptor desensitization. Delineation with specific inhibitors, J. Biol. Chem. 265 (1990) 3202-3211. 12 J.L. Benovic, F. Mayor, Jr., R.L. Somers, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Light-dependent phosphorylation of rhodopsin by β-adrenergic receptor kinase, Nature 321 (1986) 869-872. 13 K. Palczewski, J. Buczylko, L. Lebioda, J.W. Crabb, A.S. Polans, Identification of the N-terminal region in rhodopsin kinase involved in its interaction with rhodopsin, J. Biol. Chem. 268 (1993) 6004-6013. 14 J. Inglese, W.J. Koch, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Isoprenylation in regulation of signal transduction by G-protein-coupled receptor kinases, Nature 359 (1992) 147-150. 15 R.B. Penn, A.N. Pronin, J.L. Benovic, Regulation of G protein-coupled receptor kinases, Trends Cardiovasc. Med. 10 (2000) 81-89. 16 S.S. Ferguson, M.G. Caron, G protein-coupled receptor adaptation mechanisms, Semin. Cell Dev. Biol. 9 (1998) 119-127.

68

17 W.P. Hausdorff, M. Bouvier, B.F. O'Dowd, G.P. Irons, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Phosphorylation sites on two domains of the β2-adrenergic receptor are involved in distinct pathways of receptor desensitization, J. Biol. Chem. 264 (1989) 12657-12665. 18 J.L. Benovic, H. Kuhn, I. Weyand, J. Codina, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Functional desensitization of the isolated β-adrenergic receptor by the β-adrenergic receptor kinase: potential role of an analog of the retinal protein arrestin (48-kDa protein), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84 (1987) 8879-8882. 19 M.J. Lohse, J.L. Benovic, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Multiple pathways of rapid β2-adrenergic receptor desensitization. Delineation with specific inhibitors, J. Biol. Chem. 265 (1990) 3202-3211. 20 S. Pippig, S. Andexinger, K. Daniel, M. Puzicha, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, M.J. Lohse, Overexpression of β-arrestin and β-adrenergic receptor kinase augment desensitization of β2adrenergic receptors, J. Biol. Chem. 268 (1993) 3201-3208. 21 D.R. Sibley, R.H. Strasser, J.L. Benovic, K. Daniel, R.J. Lefkowitz, Phosphorylation/dephosphorylation of the β-adrenergic receptor regulates its functional coupling to adenylate cyclase and subcellular distribution, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 83 (1986) 9408-9412. 22 H. Tsuga, K. Kameyama, T. Haga, H. Kurose, T. Nagao, Sequestration of muscarinic acetylcholine receptor m2 subtypes. Facilitation by G protein-coupled receptor kinase (GRK2) and attenuation by a dominant-negative mutant of GRK2, J. Biol. Chem. 269 (1994) 32522-32527. 23 S.S. Ferguson, L. Menard, L.S. Barak, W.J. Koch, A.M. Colapietro, M.G. Caron, Role of phosphorylation in agonist-promoted β2-adrenergic receptor sequestration. Rescue of a sequestrationdefective mutant receptor by βARK1, J. Biol. Chem. 270 (1995) 24782-24789. 24 T. Bremnes, J.D. Paasche, A. Mehlum, C. Sandberg, B. Bremnes, H. Attramadal, Regulation and Intracellular Trafficking Pathways of the Endothelin Receptors, J. Biol. Chem. (2000) 25 R.H. Oakley, S.A. Laporte, J.A. Holt, L.S. Barak, M.G. Caron, Association of β-arrestin with G protein-coupled receptors during clathrin-mediated endocytosis dictates the profile of receptor resensitization, J. Biol. Chem. 274 (1999) 32248-32257. 26 I. Aramori, S.S. Ferguson, P.D. Bieniasz, J. Zhang, B. Cullen, M.G. Cullen, Molecular mechanism of desensitization of the chemokine receptor CCR-5: receptor signaling and internalization are dissociable from its role as an HIV-1 co-receptor, EMBO J. 16 (1997) 4606-4616. 27 L. Menard, S.S. Ferguson, L.S. Barak, L. Bertrand, R.T. Premont, A.M. Colapietro, R.J. Lefkowitz, M.G. Caron, Members of the G protein-coupled receptor kinase family that phosphorylate the β2adrenergic receptor facilitate sequestration, Biochemistry 35 (1996) 4155-4160. 28 M.F. Lazari, X. Liu, K. Nakamura, J.L. Benovic, M. Ascoli, Role of G protein-coupled receptor kinases on the agonist-induced phosphorylation and internalization of the follitropin receptor, Mol. Endocrinol. 13 (1999) 866-878. 29 S.S. Ferguson, W.E. Downey, III, A.M. Colapietro, L.S. Barak, L. Menard, M.G. Caron, Role of βarrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization, Science 271 (1996) 363-366. 30 L. Menard, S.S. Ferguson, J. Zhang, F.T. Lin, R.J. Lefkowitz, M.G. Caron, L.S. Barak, Synergistic regulation of β2-adrenergic receptor sequestration: intracellular complement of β-adrenergic receptor kinase and beta-arrestin determine kinetics of internalization, Mol. Pharmacol. 51 (1997) 800-808. 31 J.K. Walker, R.T. Premont, L.S. Barak, M.G. Caron, M.A. Shetzline, Properties of secretin receptor internalization differ from those of the β2-adrenergic receptor, J. Biol. Chem. 274 (1999) 3151531523.

69

32 N. Malecz, T. Bambino, M. Bencsik, R.A. Nissenson, Identification of phosphorylation sites in the G protein-coupled receptor for parathyroid hormone. Receptor phosphorylation is not required for agonist-induced internalization, Mol. Endocrinol. 12 (1998) 1846-1856. 33 A.B. Tobin, B. Keys, S.R. Nahorski, Identification of a novel receptor kinase that phosphorylates a phospholipase C-linked muscarinic receptor, J. Biol. Chem. 271 (1996) 3907-3916. 34 A.B. Tobin, N.F. Totty, A.E. Sterlin, S.R. Nahorski, Stimulus-dependent phosphorylation of Gprotein-coupled receptors by casein kinase 1α, J. Biol. Chem. 272 (1997) 20844-20849. 35 S. Mukherjee, R.N. Ghosh, F.R. Maxfield, Endocytosis, Physiol. Rev. 77 (1997) 759-803. 36 D.M. Chuang, E. Costa, Evidence for internalization of the recognition site of β-adrenergic receptors during receptor subsensitivity induced by (-)-isoproterenol, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 76 (1979) 3024-3028. 37 T.K. Harden, C.U. Cotton, G.L. Waldo, J.K. Lutton, J.P. Perkins, Catecholamine-induced alteration in sedimentation behavior of membrane bound β-adrenergic receptors, Science 210 (1980) 441-443. 38 M. von Zastrow, B.K. Kobilka, Ligand-regulated internalization and recycling of human β2adrenergic receptors between the plasma membrane and endosomes containing transferrin receptors, J. Biol. Chem. 267 (1992) 3530-3538. 39 L.S. Barak, S.S. Ferguson, J. Zhang, C. Martenson, T. Meyer, M.G. Caron, Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact β2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate, Mol. Pharmacol. 51 (1997) 177-184. 40 N.I. Tarasova, R.H. Stauber, J.K. Choi, E.A. Hudson, G. Czerwinski, J.L. Miller, G.N. Pavlakis, C.J. Michejda, S.A. Wank, Visualization of G protein-coupled receptor trafficking with the aid of the green fluorescent protein - Endocytosis and recycling of cholecystokinin receptor type A, J. Biol. Chem. 272 (1997) 14817-14824. 41 L. Kallal, A.W. Gagnon, R.B. Penn, J.L. Benovic, Visualization of agonist-induced sequestration and down-regulation of a green fluorescent protein-tagged β2-adrenergic receptor, J. Biol. Chem. 273 (1998) 322-328. 42 J. Barlic, M.H. Khandaker, E. Mahon, J. Andrews, M.E. DeVries, G.B. Mitchell, R. Rahimpour, C.M. Tan, S.S. Ferguson, D.J. Kelvin, β-arrestins regulate interleukin-8-induced CXCR1 internalization, J. Biol. Chem. 274 (1999) 16287-16294. 43 I.S. Trowbridge, J.F. Collawn, C.R. Hopkins, Signal-dependent membrane protein trafficking in the endocytic pathway, Annu. Rev. Cell Biol. 9 (1993) 129-161. 44 B.J. Nichols, J. Lippincott-Schwartz, Endocytosis without clathrin coats, Trends Cell Biol. 11 (2001) 406-412. 45 B.M.F. Pearse, M.S. Robinson, Clathrin, adaptors, and sorting, Annu. Rev. Cell Biol. 6 (1990) 151171. 46 P. Tsao, M. von Zastrow, Downregulation of G protein-coupled receptors, Curr. Opin. Neurobiol. 10 (2000) 365-369. 47 K. Simons, E. Ikonen, Functional rafts in cell membranes, Nature 387 (1997) 569-572. 48 D.A. Brown, E. London, Functions of lipid rafts in biological membranes, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14 (1998) 111-136.

70

49 R.G.W. Anderson, K. Jacobson, A Role for Lipid Shells in Targeting Proteins to Caveolae, Rafts, and Other Lipid Domains, Science 296 (2002) 1821-1825. 50 T.V. Kurzchalia, R.G. Parton, Membrane microdomains and caveolae, Curr. Opin. Cell Biol. 11 (1999) 424-431. 51 J.R. Henley, E.W.A. Krueger, B.J. Oswald, M.A. McNiven, Dynamin-mediated Internalization of Caveolae, J. Cell Biol. 141 (1998) 85-99. 52 P. Oh, D.P. McIntosh, J.E. Schnitzer, Dynamin at the Neck of Caveolae Mediates Their Budding to Form Transport Vesicles by GTP-driven Fission from the Plasma Membrane of Endothelium, J. Cell Biol. 141 (1998) 101-114. 53 H. Waterman, Y. Yarden, Molecular mechanisms underlying endocytosis and sorting of ErbB receptor tyrosine kinases, FEBS Lett. 490 (2001) 142-152. 54 M.Y. Chun, U.K. Liyanage, M.P. Lisanti, H.F. Lodish, Signal-transduction of a G-protein-coupled receptor in caveolae - Colocalization of endothelin and its receptor with caveolin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994) 11728-11732. 55 G. Raposo, I. Dunia, C. Delavierklutchko, S. Kaveri, A.D. Strosberg, E.L. Benedetti, Internalization of β-adrenergic-receptor in A431 cells involves non-coated vesicles, Eur. J. Cell Biol. 50 (1989) 340352. 56 Y. Okamoto, H. Ninomiya, S. Miwa, T. Masaki, Cholesterol oxidation switches the internalization pathway of endothelin receptor type A from caveolae to clathrin-coated pits in Chinese hamster ovary cells, J. Biol. Chem. 275 (2000) 6439-6446. 57 R.G. Vickery, M. von Zastrow, Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes, J. Cell Biol. 144 (1999) 31-43. 58 A.G. Roseberry, M.M. Hosey, Internalization of the M2 muscarinic acetylcholine receptor proceeds through an atypical pathway in HEK293 cells that is independent of clathrin and caveolae, J Cell Sci 114 (2001) 739-746. 59 J. Zhang, S.S.G. Ferguson, L.S. Barak, L. Menard, M.G. Caron, Dynamin and β-arrestin reveal distinct mechanisms for G protein-coupled receptor internalization, J. Biol. Chem. 271 (1996) 1830218305. 60 M. Franco, P.J. Peters, J. Boretto, E. van Donselaar, A. Neri, C. D'Souza-Schorey, P. Chavrier, EFA6, a sec7 domain-containing exchange factor for ARF6, coordinates membrane recycling and actin cytoskeleton organization, EMBO J. 18 (1999) 1480-1491. 61 H. Radhakrishna, J.G. Donaldson, ADP-ribosylation factor 6 regulates a novel plasma membrane recycling pathway, J. Cell Biol. 139 (1997) 49-61. 62 B.J. Nichols, A.K. Kenworthy, R.S. Polishchuk, R. Lodge, T.H. Roberts, K. Hirschberg, R.D. Phair, J. Lippincott-Schwartz, Rapid cycling of lipid raft markers between the cell surface and Golgi complex, J. Cell Biol. 153 (2001) 529-541. 63 C. Lamaze, A. Dujeancourt, T. Baba, C.G. Lo, A. Benmerah, A. Dautry-Varsat, Interleukin 2 receptors and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway, Mol. Cell 7 (2001) 661-671. 64 T. Kirchhausen, Clathrin, Annu. Rev. Biochem. 69 (2000) 699-727.

71

65 M. Marsh, H.T. McMahon, The structural era of endocytosis, Science 285 (1999) 215-220. 66 O.B. Goodman, Jr., J.G. Krupnick, F. Santini, V.V. Gurevich, R.B. Penn, A.W. Gagnon, J.H. Keen, J.L. Benovic, β-arrestin acts as a clathrin adaptor in endocytosis of the β2- adrenergic receptor, Nature 383 (1996) 447-450. 67 K.A. DeFea, J. Zalevsky, M.S. Thoma, O. Dery, R.D. Mullins, N.W. Bunnett, β-Arrestin-dependent Endocytosis of Proteinase-activated Receptor 2 Is Required for Intracellular Targeting of Activated ERK1/2, J. Cell Biol. 148 (2000) 1267-1282. 68 L.M. Luttrell, F.L. Roudabush, E.W. Choy, W.E. Miller, M.E. Field, K.L. Pierce, R.J. Lefkowitz, Activation and targeting of extracellular signal-regulated kinases by β-arrestin scaffolds, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 (2001) 2449-2454. 69 P.H. McDonald, C.W. Chow, W.E. Miller, S.A. Laporte, M.E. Field, F.T. Lin, R.J. Davis, R.J. Lefkowitz, β-arrestin 2: a receptor-regulated MAPK scaffold for the activation of JNK3, Science 290 (2000) 1574-1577. 70 G. Ferguson, K.R. Watterson, T.M. Palmer, Subtype-specific kinetics of inhibitory adenosine receptor internalization are determined by sensitivity to phosphorylation by G protein-coupled receptor kinases, Mol. Pharmacol. 57 (2000) 546-552. 71 S.S.G. Ferguson, J. Zhang, L.S. Barak, M.G. Caron, Pleiotropic role for GRKs and β-arrestins in receptor regulation, News Physiol. Sci. 12 (1997) 145-152. 72 R.T. Premont, A. Claing, N. Vitale, J.L. Freeman, J.A. Pitcher, W.A. Patton, J. Moss, M. Vaughan, R.J. Lefkowitz, β2-Adrenergic receptor regulation by GIT1, a G protein-coupled receptor kinaseassociated ADP ribosylation factor GTPase-activating protein, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 95 (1998) 14082-14087. 73 T.T. Cao, R.W. Mays, M. von Zastrow, Regulated endocytosis of G-protein-coupled receptors by a bichemically and functionally distinct subpopulation of clathrin-coated pits, J. Biol. Chem. 273 (1998) 24592-24602. 74 S.R. Murray, C.J. Evans, M. von Zastrow, Phosphorylation is not required for dynamin-dependent endocytosis of a truncated mutant opioid receptor, J. Biol. Chem. 273 (1998) 24987-24991. 75 A. Pizard, A. Blaukat, W. Muller-Esterl, F. Alhenc-Gelas, R.M. Rajerison, Bradykinin-induced internalization of the human B2 receptor requires phosphorylation of three serine and two threonine residues at its carboxyl tail, J. Biol. Chem. 274 (1999) 12738-12747. 76 S.H. Liu, M.L. Wong, C.S. Craik, F.M. Brodsky, Regulation of clathrin assembly and trimerization defined using recombinant triskelion hubs, Cell 83 (1995) 257-267. 77 E. ter Haar, A. Musacchio, S.C. Harrison, T. Kirchhausen, Atomic structure of clathrin: a β−propeller terminal domain joins an alpha zigzag linker, Cell 95 (1998) 563-573. 78 E. ter Haar, S.C. Harrison, T. Kirchhausen, Peptide-in-groove interactions link target proteins to the β-propeller of clathrin, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97 (2000) 1096-1100. 79 J.E. Heuser, J. Keen, Deep-etch visualization of proteins involved in clathrin assembly, J. Cell Biol. 107 (1988) 877-886. 80 T. Kirchhausen, K.L. Nathanson, W. Matsui, A. Vaisberg, E.P. Chow, C. Burne, J.H. Keen, A.E. Davis, Structural and functional division into two domains of the large (100- to 115-kDa) chains of the clathrin-associated protein complex AP-2, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 86 (1989) 2612-2616.

72

81 T. Kirchhausen, Adaptors for clathrin-mediated traffic, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 15 (1999) 705732. 82 W. Shih, A. Gallusser, T. Kirchhausen, A clathrin-binding site in the hinge of the β2 chain of mammalian AP-2 complexes, J. Biol. Chem. 270 (1995) 31083-31090. 83 H. Ohno, J. Stewart, M.C. Fournier, H. Bosshart, I. Rhee, S. Miyatake, T. Saito, A. Gallusser, T. Kirchhausen, J.S. Bonifacino, Interaction of tyrosine-based sorting signals with clathrin-associated proteins, Science 269 (1995) 1872-1875. 84 D.J. Owen, P.R. Evans, A structural explanation for the recognition of tyrosine-based endocytotic signals, Science 282 (1998) 1327-1332. 85 J. Hirst, M.S. Robinson, Clathrin and adaptors, Biochim. Biophys. Acta 1404 (1998) 173-193. 86 I. Gaidarov, J.H. Keen, Phosphoinositide-AP-2 interactions required for targeting to plasma membrane clathrin-coated pits, J. Cell Biol. 146 (1999) 755-764. 87 D.J. Owen, Y. Vallis, M.E. Noble, J.B. Hunter, T.R. Dafforn, P.R. Evans, H.T. McMahon, A structural explanation for the binding of multiple ligands by the alpha-adaptin appendage domain, Cell 97 (1999) 805-815. 88 C. Pfister, M. Chabre, J. Plouet, V.V. Tuyen, Y. De Kozak, J.P. Faure, H. Kuhn, Retinal S antigen identified as the 48K protein regulating light-dependent phosphodiesterase in rods, Science 228 (1985) 891-893. 89 J.L. Benovic, H. Kuhn, I. Weyand, J. Codina, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Functional desensitization of the isolated β-adrenergic receptor by the β-adrenergic receptor kinase: potential role of an analog of the retinal protein arrestin (48-kDa protein), Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 84 (1987) 8879-8882. 90 J.G. Krupnick, V.V. Gurevich, J.L. Benovic, Mechanism of quenching of phototransduction. Binding competition between arrestin and transducin for phosphorhodopsin, J. Biol. Chem. 272 (1997) 18125-18131. 91 J. Zhang, L.S. Barak, K.E. Winkler, M.G. Caron, S.S. Ferguson, A central role for β-arrestins and clathrin-coated vesicle-mediated endocytosis in β2-adrenergic receptor resensitization. Differential regulation of receptor resensitization in two distinct cell types, J. Biol. Chem. 272 (1997) 2700527014. 92 J.G. Krupnick, O.B. Goodman, Jr., J.H. Keen, J.L. Benovic, Arrestin/clathrin interaction. Localization of the clathrin binding domain of nonvisual arrestins to the carboxy terminus, J. Biol. Chem. 272 (1997) 15011-15016. 93 O.B. Goodman, Jr., J.G. Krupnick, V.V. Gurevich, J.L. Benovic, J.H. Keen, Arrestin/clathrin interaction. Localization of the arrestin binding locus to the clathrin terminal domain, J. Biol. Chem. 272 (1997) 15017-15022. 94 S.A. Laporte, R.H. Oakley, J. Zhang, J.A. Holt, S.S. Ferguson, M.G. Caron, L.S. Barak, The β2adrenergic receptor/β-arrestin complex recruits the clathrin adaptor AP-2 during endocytosis, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 96 (1999) 3712-3717. 95 S.A. Laporte, R.H. Oakley, J.A. Holt, L.S. Barak, M.G. Caron, The interaction of β-arrestin with the AP-2 adaptor is required for the clustering of β2-adrenergic receptor into clathrin-coated pits, J. Biol. Chem. 275 (2000) 23120-23126.

73

96 A. Claing, S.A. Laporte, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Endocytosis of G protein-coupled receptors: roles of G protein-coupled receptor kinases and ss-arrestin proteins, Prog. Neurobiol. 66 (2002) 6179. 97 M.J. Lohse, S. Andexinger, J. Pitcher, S. Trukawinski, J. Codina, J.P. Faure, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Receptor-specific desensitization with purified proteins. Kinase dependence and receptor specificity of β-arrestin and arrestin in the β2-adrenergic receptor and rhodopsin systems, J. Biol. Chem. 267 (1992) 8558-8564. 98 O. Vogler, G.S. Bogatkewitsch, C. Wriske, P. Krummenerl, K.H. Jakobs, C.J. van Koppen, Receptor subtype-specific regulation of muscarinic acetylcholine receptor sequestration by dynamin. Distinct sequestration of m2 receptors, J. Biol. Chem. 273 (1998) 12155-12160. 99 L.M. Luttrell, S.S. Ferguson, Y. Daaka, W.E. Miller, S. Maudsley, G.J. Della Rocca, F. Lin, H. Kawakatsu, K. Owada, D.K. Luttrell, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, β-arrestin-dependent formation of β2 adrenergic receptor-Src protein kinase complexes, Science 283 (1999) 655-661. 100 L.M. Luttrell, G.J. Della Rocca, T. van Biesen, D.K. Luttrell, R.J. Lefkowitz, Gβγ subunits mediate Src-dependent phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. A scaffold for G proteincoupled receptor-mediated Ras activation, J. Biol. Chem. 272 (1997) 4637-4644. 101 A. Wilde, E.C. Beattie, L. Lem, D.A. Riethof, S.-H. Liu, W.C. Mobley, P. Soriano, F.M. Brodsky, EGF receptor signaling stimulates SRC kinase phosphorylation of clathrin, influencing clathrin redistribution and EGF uptake, Cell 96 (1999) 677-687. 102 S. Ahn, S. Maudsley, L.M. Luttrell, R.J. Lefkowitz, Y. Daaka, Src-mediated tyrosine phosphorylation of dynamin is required for β2- adrenergic receptor internalization and mitogenactivated protein kinase signaling, J. Biol. Chem. 274 (1999) 1185-1188. 103 Y. Daaka, L.M. Luttrell, S. Ahn, G.J. Della Rocca, S.S. Ferguson, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Essential role for G protein-coupled receptor endocytosis in the activation of mitogen-activated protein kinase, J. Biol. Chem. 273 (1998) 685-688. 104 K.L. Pierce, L.M. Luttrell, R.J. Lefkowitz, New mechanisms in heptahelical receptor signaling to mitogen activated protein kinase cascades, Oncogene 20 (2001) 1532-1539. 105 A.M. van der Bliek, E.M. Meyerowitz, Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic, Nature 351 (1991) 411-414. 106 J.E. Hinshaw, Dynamin and its role in membrane fission, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 16 (2000) 483519. 107 J.E. Hinshaw, S.L. Schmid, Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding, Nature 374 (1995) 190-192. 108 A.B. Muhlberg, D.E. Warnock, S.L. Schmid, Domain structure and intramolecular regulation of dynamin GTPase, EMBO J. 16 (1997) 6676-6683. 109 K. Takei, V. Haucke, V. Slepnev, K. Farsad, M. Salazar, H. Chen, P. De Camilli, Generation of coated intermediates of clathrin-mediated endocytosis on protein-free liposomes, Cell 94 (1998) 131141. 110 K. Takel, P.S. McPherson, S.L. Schmid, P. De Camilli, Tubular membrane invaginations coated by dynamin rings are induced by GTP-gamma S in nerve terminals, Nature 374 (1995) 186-190. 111 D.E. Warnock, J.E. Hinshaw, S.L. Schmid, Dynamin self-assembly stimulates its GTPase activity, J. Biol. Chem. 271 (1996) 22310-22314.

74

112 M.H.B. Stowell, B. Marks, P. Wigge, H.T. McMahon, Nucleotide-dependent conformational changes in dynamin: evidence for a mechanochemical molecular spring, Nat. Cell Biol. 1 (1999) 27-32. 113 S.M. Sweitzer, J.E. Hinshaw, Dynamin undergoes a GTP-dependent conformational change causing vesiculation, Cell 93 (1998) 1021-1029. 114 S. Sever, A.B. Muhlberg, S.L. Schmid, Impairment of dynamin's GAP domain stimulates receptormediated endocytosis, Nature 398 (1999) 481-486. 115 Y. Yarden, J.A. Escobedo, W.J. Kuang, T.L. Yang-Feng, T.O. Daniel, P.M. Tremble, E.Y. Chen, M.E. Ando, R.N. Harkins, U. Francke, ., Structure of the receptor for platelet-derived growth factor helps define a family of closely related growth factor receptors, Nature 323 (1986) 226-232. 116 D.W. Leung, S.A. Spencer, G. Cachianes, R.G. Hammonds, C. Collins, W.J. Henzel, R. Barnard, M.J. Waters, W.I. Wood, Growth hormone receptor and serum binding protein: purification, cloning and expression, Nature 330 (1987) 537-543. 117 L. Hicke, Gettin' down with ubiquitin: turning off cell-surface receptors, transporters and channels, Trends Cell Biol. 9 (1999) 107-112. 118 J.S. Bonifacino, A.M. Weissman, Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 14 (1998) 19-57. 119 A. Hershko, A. Ciechanover, The ubiquitin system, Annu. Rev. Biochem. 67 (1998) 425-479. 120 A.M. Weissman, Themes and variations on ubiquitylation, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (2001) 169178. 121 J.S. Thrower, L. Hoffman, M. Rechsteiner, C.M. Pickart, Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal, EMBO J. 19 (2000) 94-102. 122 L. Hicke, Protein regulation by monoubiquitin, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2 (2001) 195-201. 123 L. Hicke, H. Riezman, Ubiquitination of a yeast plasma membrane receptor signals its ligandstimulated endocytosis, Cell 84 (1996) 277-287. 124 J. Rohrer, H. Benedetti, B. Zanolari, H. Riezman, Identification of a novel sequence mediating regulated endocytosis of the G protein-coupled alpha-pheromone receptor in yeast, Mol. Biol. Cell 4 (1993) 511-521. 125 L. Hicke, B. Zanolari, H. Riezman, Cytoplasmic tail phosphorylation of the alpha-factor receptor is required for its ubiquitination and internalization, J. Cell Biol. 141 (1998) 349-358. 126 J. Terrell, S. Shih, R. Dunn, L. Hicke, A function for monoubiquitination in the internalization of a G protein- coupled receptor, Mol. Cell 1 (1998) 193-202. 127 S.C. Shih, K.E. Sloper-Mould, L. Hicke, Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors, EMBO J. 19 (2000) 187-198. 128 A.F. Roth, N.G. Davis, Ubiquitination of the yeast a-factor receptor, J. Cell Biol. 134 (1996) 661674. 129 A.F. Roth, D.M. Sullivan, N.G. Davis, A large PEST-like sequence directs the ubiquitination, endocytosis, and vacuolar degradation of the yeast a-factor receptor, J. Cell Biol. 142 (1998) 949961.

75

130 S. Rogers, R. Wells, M. Rechsteiner, Amino acid sequences common to rapidly degraded proteins: the PEST hypothesis, Science 234 (1986) 364-368 131 A.F. Roth, N.G. Davis, Ubiquitination of the PEST-like endocytosis signal of the yeast a- factor receptor, J. Biol. Chem. 275 (2000) 8143-8153. 132 G.J. Strous, P. van Kerkhof, R. Govers, A. Ciechanover, A.L. Schwartz, The ubiquitin conjugation system is required for ligand-induced endocytosis and degradation of the growth hormone receptor, EMBO J. 15 (1996) 3806-3812. 133 R. Govers, T. ten Broeke, P. van Kerkhof, A.L. Schwartz, G.J. Strous, Identification of a novel ubiquitin conjugation motif, required for ligand-induced internalization of the growth hormone receptor, EMBO J. 18 (1999) 28-36. 134 R. Govers, P. van Kerkhof, A.L. Schwartz, G.J. Strous, Di-leucine-mediated internalization of ligand by a truncated growth hormone receptor is independent of the ubiquitin conjugation system, J. Biol. Chem. 273 (1998) 16426-16433. 135 Z. Galcheva-Gargova, S.J. Theroux, R.J. Davis, The epidermal growth factor receptor is covalently linked to ubiquitin, Oncogene 11 (1995) 2649-2655. 136 G.D. Jongeward, T.R. Clandinin, P.W. Sternberg, sli-1, a negative regulator of let-23-mediated signaling in C. elegans, Genetics 139 (1995) 1553-1566. 137 G. Levkowitz, H. Waterman, E. Zamir, Z. Kam, S. Oved, W.Y. Langdon, L. Beguinot, B. Geiger, Y. Yarden, c-Cbl/Sli-1 regulates endocytic sorting and ubiquitination of the epidermal growth factor receptor, Genes Dev. 12 (1998) 3663-3674. 138 G. Levkowitz, H. Waterman, S.A. Ettenberg, M. Katz, A.Y. Tsygankov, I. Alroy, S. Lavi, K. Iwai, Y. Reiss, A. Ciechanover, S. Lipkowitz, Y. Yarden, Ubiquitin ligase activity and tyrosine phosphorylation underlie suppression of growth factor signaling by c-Cbl/Sli-1, Mol. Cell 4 (1999) 1029-1040. 139 H. Waterman, G. Levkowitz, I. Alroy, Y. Yarden, The RING finger of c-Cbl mediates desensitization of the epidermal growth factor receptor, J. Biol. Chem. 274 (1999) 22151-22154. 140 M.S. Obin, J. Jahngen-Hodge, T. Nowell, A. Taylor, Ubiquitinylation and ubiquitin-dependent proteolysis in vertebrate photoreceptors (rod outer segments). Evidence for ubiquitinylation of Gt and rhodopsin, J. Biol. Chem. 271 (1996) 14473-14484. 141 D.R. Sibley, R.J. Lefkowitz, Molecular mechanisms of receptor desensitization using the βadrenergic receptor-coupled adenylate cyclase system as a model, Nature 317 (1985) 124-129. 142 S.S. Ferguson, J. Zhang, L.S. Barak, M.G. Caron, Molecular mechanisms of G protein-coupled receptor desensitization and resensitization, Life Sci. 62 (1998) 1561-1565. 143 S.S.G. Ferguson, J. Zhang, L.S. Barak, M.G. Caron, Molecular mechanisms of G protein-coupled receptor desensitization and resensitization, Life Sci. 62 (1998) 1561-1565. 144 K.M. Krueger, Y. Daaka, J.A. Pitcher, R.J. Lefkowitz, The role of sequestration in G protein-coupled receptor resensitization - Regulation of β2-adrenergic receptor dephosphorylation by vesicular acidification, J. Biol. Chem. 272 (1997) 5-8. 145 S. Pippig, S. Andexinger, M.J. Lohse, Sequestration and recycling of β2-adrenergic receptors permit receptor resensitization, Mol. Pharmacol. 47 (1995) 666-676.

76

146 L.S. Barak, M. Tiberi, N.J. Freedman, M.M. Kwatra, R.J. Lefkowitz, M.G. Caron, A highly conserved tyrosine residue in G protein-coupled receptors is required for agonist-mediated β2adrenergic receptor sequestration, J. Biol. Chem. 269 (1994) 2790-2795. 147 A.M. Garland, E.F. Grady, M. Lovett, S.R. Vigna, M.M. Frucht, J.E. Krause, N.W. Bunnett, Mechanisms of desensitization and resensitization of G protein-coupled neurokinin1 and neurokinin2 receptors, Mol. Pharmacol. 49 (1996) 438-446. 148 E. Giannini, F. Boulay, Phosphorylation, dephosphorylation, and recycling of the C5a receptor in differentiated HL60 cells, J. Immunol. 154 (1995) 4055-4064. 149 M. De Gasparo, K.J. Catt, T. Inagami, J.W. Wright, T. Unger, International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors, Pharmacol. Rev. 52 (2000) 415-472. 150 T.J. Murphy, R.W. Alexander, K.K. Griendling, M.S. Runge, K.E. Bernstein, Isolation of a cDNA encoding the vascular type-1 angiotensin II receptor, Nature 351 (1991) 233-236. 151 K. Sasaki, Y. Yamano, S. Bardhan, N. Iwai, J.J. Murray, M. Hasegawa, Y. Matsuda, T. Inagami, Cloning and expression of a complementary DNA encoding a bovine adrenal angiotensin II type-1 receptor, Nature 351 (1991) 230-233. 152 M. Mukoyama, M. Nakajima, M. Horiuchi, H. Sasamura, R.E. Pratt, V.J. Dzau, Expression cloning of type 2 angiotensin II receptor reveals a unique class of seven-transmembrane receptors, J. Biol. Chem. 268 (1993) 24539-24542. 153 K. Sandberg, H. Ji, A.J.L. Clark, H. Shapira, K.J. Catt, Cloning and expression of a novel angiotensin II receptor subtype, J. Biol. Chem. 267 (1992) 9455-9458. 154 S.S. Kakar, J.C. Sellers, D.C. Devor, L.C. Musgrove, J.D. Neill, Angiotensin II type-1 receptor subtype cDNAs: differential tissue expression and hormonal regulation, Biochem. Biophys. Res. Commun. 183 (1992) 1090-1096. 155 M.B. Marrero, B. Schieffer, W.G. Paxton, L. Heerdt, B.C. Berk, P. Delafontaine, K.E. Bernstein, Direct stimulation of Jak/STAT pathway by the angiotensin II AT1 receptor, Nature 375 (1995) 247250. 156 H. Aoki, S. Izumo, J. Sadoshima, Angiotensin II activates RhoA in cardiac myocytes: a critical role of RhoA in angiotensin II-induced premyofibril formation, Circ. Res. 82 (1998) 666-676. 157 B.C. Berk, Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: Pathways activated by specific tyrosine kinases, J. Am. Soc. Nephrol. 10 (1999) S62-S68. 158 S. Eguchi, T. Inagami, Signal transduction of angiotensin II type 1 receptor through receptor tyrosine kinase, Regul. Pept. 91 (2000) 13-20. 159 U. Schmitz, K. Thommes, I. Beier, W. Wagner, A. Sachinidis, R. Dusing, H. Vetter, Angiotensin IIinduced stimulation of p21-activated kinase and c-Jun NH2-terminal kinase is mediated by Rac1 and Nck, J. Biol. Chem. 276 (2001) 22003-22010. 160 S. Eguchi, K. Numaguchi, H. Iwasaki, T. Matsumoto, T. Yamakawa, H. Utsunomiya, E.D. Motley, H. Kawakatsu, K.M. Owada, Y. Hirata, F. Marumo, T. Inagami, Calcium-dependent epidermal growth factor receptor transactivation mediates the angiotensin II-induced mitogen- activated protein kinase activation in vascular smooth muscle cells, J. Biol. Chem. 273 (1998) 8890-8896. 161 S. Eguchi, H. Iwasaki, T. Inagami, K. Numaguchi, T. Yamakawa, E.D. Motley, K.M. Owada, F. Marumo, Y. Hirata, Involvement of PYK2 in angiotensin II signaling of vascular smooth muscle cells, Hypertension 33 (1999) 201-226.

77

162 W.G. Thomas, Regulation of angiotensin II type 1 (AT1) receptor function, Regul. Pept. 79 (1999) 923. 163 T.J. Thekkumkara, J. Du, D.E. Dostal, T.J. Motel, W.G. Thomas, K.M. Baker, Stable expression of a functional rat angiotensin II (AT1A) receptor in CHO-K1 cells: rapid desensitization by angiotensin II, Mol. Cell Biochem. 146 (1995) 79-89. 164 G. Boulay, L. Chrétien, D.E. Richard, G. Guillemette, Short-term desensitization of the angiotensin II receptor of bovine adrenal glomerulosa cells corresponds to a shift from a high to a low affinity state, Endocrinology 135 (1994) 2130-2136. 165 J.B. Richardson, A. Beaulnes, The cellular site of action of angiotensin, Cell. Biol. 51 (1971) 419432. 166 A.L. Robertson, Jr., P.A. Khairallah, Angiotensin II: Rapid localization in nuclei of smooth and cardiac muscle, Science 172 (1971) 1138-1139. 167 C. Bianchi, J. Gutkowska, C. Charbonneau, M. Ballak, M.B. Anand-Srivastava, A. De Léan, J. Genest, M. Cantin, Internalization and lysosomal association of [125I] angiotensin II in norepinephrine-containing cells of the rat adrenal medulla, Endocrinology 119 (1986) 1873-1875. 168 K.M. Anderson, T. Murahashi, D.E. Dostal, M.J. Peach, Morphological and biochemical analysis of angiotensin II internalization in cultured rat aortic smooth muscle cells, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 264 (1993) C179-C188. 169 C. Bianchi, J. Gutkowska, A. De Léan, M. Ballak, M.B. Anand-Srivastava, J. Genest, M. Cantin, Fate of [125I]angiotensin II in adrenal zona glomerulosa cells, Endocrinology 118 (1986) 2605-2607. 170 L. Hunyady, F. Merelli, A.J. Baukal, T. Balla, K.J. Catt, Agonist-induced endocytosis and signal generation in adrenal glomerulosa cells. A potential mechanism for receptor-operated calcium entry, J. Biol. Chem. 266 (1991) 2783-2788. 171 K.K. Griendling, P. Delafontaine, S.E. Rittenhouse, M.A. Gimbrone, Jr., R.W. Alexander, Correlation of receptor sequestration with sustained diacylglycerol accumulation in angiotensin IIstimulated cultured vascular smooth muscle cells, J. Biol. Chem. 262 (1987) 14555-14562. 172 J.R. Schelling, A.S. Hanson, R. Marzec, S.L. Linas, Cytoskeleton-dependent endocytosis is required for apical type 1 angiotensin II receptor-mediated phospholipase C activation in cultured rat proximal tubule cells, J. Clin. Invest. 90 (1992) 2472-2480. 173 M.D.M. Lázari, C.S. Porto, E. Freymüller, L.C. Abreu, Z.P. Picarelli, Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells, Biochem. Pharmacol. 54 (1997) 399-408. 174 L. Hein, L. Meinel, R.E. Pratt, V.J. Dzau, B.K. Kobilka, Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: Evidence for selective sorting of receptor and ligand, Mol. Endocrinol. 11 (1997) 1266-1277. 175 W.G. Thomas, T.J. Thekkumkara, K.M. Baker, Molecular mechanisms of angiotensin II (AT1A) receptor endocytosis, Clin. Exp. Pharmacol. Physiol Suppl 3 (1996) S74-S80. 176 B.N. Becker, H.F. Cheng, K.D. Burns, R.C. Harris, Polarized rabbit type 1 angiotensin II receptors manifest differential rates of endocytosis and recycling, Am. J. Physiol. Cell Physiol. 269 (1995) C1048-C1056. 177 N. Ishizaka, K.K. Griendling, B. Lassegue, R.W. Alexander, Angiotensin II type 1 receptor: relationship with caveolae and caveolin after initial agonist stimulation, Hypertension 32 (1998) 459466.

78

178 L. Hunyady, M. Bor, T. Balla, K.J. Catt, Identification of a cytoplasmic Ser-Thr-Leu motif that determines agonist-induced internalization of the AT1 angiotensin receptor, J. Biol. Chem. 269 (1994) 31378-31382. 179 W.G. Thomas, K.M. Baker, T.J. Motel, T.J. Thekkumkara, Angiotensin II receptor endocytosis involves two distinct regions of the cytoplasmic tail. A role for residues on the hydrophobic face of a putative amphipathic helix, J. Biol. Chem. 270 (1995) 22153-22159. 180 L. Hunyady, A.J. Baukal, T. Balla, K.J. Catt, Independence of type I angiotensin II receptor endocytosis from G protein coupling and signal transduction, J. Biol. Chem. 269 (1994) 2479824804. 181 S. Conchon, C. Monnot, B. Teutsch, P. Corvol, E. Clauser, Internalization of the rat AT1a and AT1b receptors: Pharmacological and functional requirements, FEBS Lett. 349 (1994) 365-370. 182 C. Bihoreau, C. Monnot, E. Davies, B. Teutsch, K.E. Bernstein, P. Corvol, E. Clauser, Mutation of Asp74 of the rat angiotensin II receptor confers changes in antagonist affinities and abolishes Gprotein coupling, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 5133-5137. 183 W.G. Paxton, M.B. Marrero, J.D. Klein, P. Delafontaine, B.C. Berk, K.E. Bernstein, The angiotensin II AT1 receptor is tyrosine and serine phosphorylated and can serve as a substrate for the SRC family of tyrosine kinases, Biochem. Biophys. Res. Commun. 200 (1994) 260-267. 184 R.D. Smith, A.J. Baukal, A. Zolyomi, Z. Gaborik, L. Hunyady, L. Sun, M. Zhang, H.C. Chen, K.J. Catt, Agonist-induced phosphorylation of the endogenous AT1 angiotensin receptor in bovine adrenal glomerulosa cells, Mol. Endocrinol. 12 (1998) 634-644. 185 L. Hunyady, K.J. Catt, A.J. Clark, Z. Gaborik, Mechanisms and functions of AT(1) angiotensin receptor internalization, Regul. Pept. 91 (2000) 29-44. 186 M. Oppermann, N.J. Freedman, R.W. Alexander, R.J. Lefkowitz, Phosphorylation of the type 1A angiotensin II receptor by G protein-coupled receptor kinases and protein kinase C, J. Biol. Chem. 271 (1996) 13266-13272. 187 H. Qian, L. Pipolo, W.G. Thomas, Identification of protein kinase C phosphorylation sites in the angiotensin II (AT1A) receptor, Biochem. J. 343 Pt 3 (1999) 637-644. 188 A.J. Balmforth, F.H. Shepherd, P. Warburton, S.G. Ball, Evidence of an important and direct role for protein kinase C in agonist-induced phsophrylation leading to desensitization of the angiotensin AT1A receptor, Br. J. Pharmacol. 122 (1997) 1469-1477. 189 W.G. Thomas, T.J. Thekkumkara, T.J. Motel, K.M. Baker, Stable expression of a truncated AT1A receptor in CHO-K1 cells. The carboxyl-terminal region directs agonist-induced internalization but not receptor signaling or desensitization, J. Biol. Chem. 270 (1995) 207-213. 190 S. Chaki, D.F. Guo, Y. Yamano, K. Ohyama, M. Tani, M. Mizukoshi, H. Shirai, T. Inagami, Role of carboxyl tail of the rat angiotensin II type 1A receptor in agonist-induced internalization of the receptor, Kidney Int. 46 (1994) 1492-1495. 191 L. Hunyady, H. Ji, G. Jagadeesh, M. Zhang, Z. Gaborik, B. Mihalik, K.J. Catt, Dependence of AT1 angiotensin receptor function on adjacent asparagine residues in the seventh transmembrane helix, Mol. Pharmacol. 54 (1998) 427-434. 192 R.D. Smith, L. Hunyady, J.A. Olivares-Reyes, B. Mihalik, S. Jayadev, K.J. Catt, Agonist-induced phosphorylation of the angiotensin AT1a receptor is localized to a serine/threonine-rich region of its cytoplasmic tail, Mol. Pharmacol. 54 (1998) 935-941.

79

193 Z. Gaborik, B. Mihalik, S. Jayadev, G. Jagadeesh, K.J. Catt, L. Hunyady, Requirement of membraneproximal amino acids in the carboxyl-terminal tail for expression of the rat AT1a angiotensin receptor, FEBS Lett. 428 (1998) 147-151. 194 R.R. Hodgins, K.S. Ellison, M.J. Ellison, Expression of a ubiquitin derivative that conjugates to protein irreversibly produces phenotypes consistent with a ubiquitin deficiency, J. Biol. Chem. 267 (1992) 8807-8812. 195 Z. Gaborik, M. Szaszak, L. Szidonya, B. Balla, S. Paku, K.J. Catt, A.J. Clark, L. Hunyady, βarrestin- and dynamin-dependent endocytosis of the AT1 angiotensin receptor, Mol. Pharmacol. 59 (2001) 239-247. 196 N.J. Freedman, S.B. Liggett, D.E. Drachman, G. Pei, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, Phosphorylation and desensitization of the human β1-adrenergic receptor. Involvement of G protein-coupled receptor kinases and cAMP-dependent protein kinase, J. Biol. Chem. 270 (1995) 17953-17961. 197 M.G. Eason, S.P. Moreira, S.B. Liggett, Four consecutive serines in the third intracellular loop are the sites for β-adrenergic receptor kinase-mediated phosphorylation and desensitization of the α2Aadrenergic receptor, J. Biol. Chem. 270 (1995) 4681-4688. 198 G. Innamorati, H. Sadeghi, A.N. Eberle, M. Birnbaumer, Phosphorylation of the V2 vasopressin receptor, J. Biol. Chem. 272 (1997) 2486-2492. 199 G. Pei, B.L. Kieffer, R.J. Lefkowitz, N.J. Freedman, Agonist-dependent phosphorylation of the mouse delta-opioid receptor: involvement of G protein-coupled receptor kinases but not protein kinase C, Mol Pharmacol 48 (1995) 173-177. 200 H. Kuhn, S.W. Hall, U. Wilden, Light-induced binding of 48-kDa protein to photoreceptor membranes is highly enhanced by phosphorylation of rhodopsin, FEBS Lett. 176 (1984) 473-478. 201 H. Nakata, K. Kameyama, K. Haga, T. Haga, Location of agonist-dependent-phosphorylation sites in the third intracellular loop of muscarinic acetylcholine receptors (m2 subtype), Eur. J. Biochem. 220 (1994) 29-36. 202 A.B. Tobin, S.R. Nahorski, Rapid agonist-mediated phosphorylation of m3-muscarinic receptors revealed by immunoprecipitation, J. Biol. Chem. 268 (1993) 9817-9823. 203 Y. Pak, B.F. O'Dowd, J.B. Wang, S.R. George, Agonist-induced, G protein-dependent and independent down-regulation of the mu opioid receptor. The receptor is a direct substrate for proteintyrosine kinase, J. Biol. Chem. 274 (1999) 27610-27616. 204 Y.J. Jong, L.R. Dalemar, B. Wilhelm, N.L. Baenziger, Human bradykinin B2 receptors isolated by receptor-specific monoclonal antibodies are tyrosine phosphorylated, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 90 (1993) 10994-10998. 205 H. Kai, K.K. Griendling, B. Lassegue, J.D. Ollerenshaw, M.S. Runge, R.W. Alexander, Agonistinduced phosphorylation of the vascular type 1 angiotensin II receptor, Hypertension 24 (1994) 523527. 206 J.A. Olivares-Reyes, R.D. Smith, L. Hunyady, B.H. Shah, K.J. Catt, Agonist-induced signaling, desensitization, and internalization of a phosphorylation-deficient AT1A angiotensin receptor, J. Biol. Chem. 276 (2001) 37761-37768. 207 W.G. Thomas, T.J. Motel, C.E. Kule, V. Karoor, K.M. Baker, Phosphorylation of the angiotensin II (AT1A) receptor carboxyl terminus: a role in receptor endocytosis, Mol. Endocrinol. 12 (1998) 15131524.

80

208 J. Zhang, L.S. Barak, P.H. Anborgh, S.A. Laporte, M.G. Caron, S.S. Ferguson, Cellular trafficking of G protein-coupled receptor/β-arrestin endocytic complexes, J. Biol. Chem. 274 (1999) 10999-11006. 209 P.H. Anborgh, J.L. Seachrist, L.B. Dale, S.S. Ferguson, Receptor/β-arrestin complex formation and the differential trafficking and resensitization of β2-adrenergic and angiotensin II type 1A receptors, Mol. Endocrinol. 14 (2000) 2040-2053. 210 H. Qian, L. Pipolo, W.G. Thomas, Association of β-Arrestin 1 with the type 1A angiotensin II receptor involves phosphorylation of the receptor carboxyl terminus and correlates with receptor internalization, Mol. Endocrinol. 15 (2001) 1706-1719. 211 K. Palczewski, A. Arendt, J.H. McDowell, P.A. Hargrave, Substrate recognition determinants for rhodopsin kinase: studies with synthetic peptides, polyanions, and polycations, Biochemistry 28 (1989) 8764-8770. 212 J.J. Onorato, K. Palczewski, J.W. Regan, M.G. Caron, R.J. Lefkowitz, J.L. Benovic, Role of acidic amino acids in peptide substrates of the β-adrenergic receptor kinase and rhodopsin kinase, Biochemistry 30 (1991) 5118-5125. 213 H. Tang, D.F. Guo, J.P. Porter, Y. Wanaka, T. Inagami, Role of cytoplasmic tail of the type 1A angiotensin II receptor in agonist- and phorbol ester-induced desensitization, Circ. Res. 82 (1998) 523-531. 214 A.B. Tobin, Are we β-ARKing up the wrong tree? Casein kinase 1 α provides an additional pathway for GPCR phosphorylation, Trends Pharmacol Sci. 23 (2002) 337-343. 215 D.C. Budd, J.E. McDonald, A.B. Tobin, Phosphorylation and regulation of a Gq/11- coupled receptor by Casein Kinase 1α, J. Biol. Chem. (2000) 216 A.C. Hanyaloglu, M. Vrecl, K.M. Kroeger, L.E. Miles, H. Qian, W.G. Thomas, K.A. Eidne, Casein kinase II sites in the intracellular C-terminal domain of the thyrotropin-releasing hormone receptor and chimeric gonadotropin- releasing hormone receptors contribute to β-arrestin-dependent internalization, J. Biol. Chem. 276 (2001) 18066-18074. 217 U.E. Petaja-Repo, M. Hogue, A. Laperriere, S. Bhalla, P. Walker, M. Bouvier, Newly synthesized human delta opioid receptors retained in the endoplasmic reticulum are retrotranslocated to the cytosol, deglycosylated, ubiquitinated, and degraded by the proteasome, J. Biol. Chem. 276 (2001) 4416-4423. 218 K. Chaturvedi, P. Bandari, N. Chinen, R.D. Howells, Proteasome involvement in agonist-induced down-regulation of mu and delta opioid receptors, J. Biol. Chem. 276 (2001) 12345-12355. 219 A. Marchese, J.L. Benovic, Agonist-promoted ubiquitination of the G protein-coupled receptor CXCR4 mediates lysosomal sorting, J. Biol. Chem. 276 (2001) 45509-45512. 220 S.K. Shenoy, P.H. McDonald, T.A. Kohout, R.J. Lefkowitz, Regulation of receptor fate by ubiquitination of activated β2- adrenergic receptor and β-arrestin, Science 294 (2001) 1307-1313. 221 M. Tanowitz, M. von Zastrow, Ubiquitination-independent Trafficking of G Protein-coupled Receptors to Lysosomes, J. Biol. Chem. 277 (2002) 50219-50222. 222 A. Amara, S.L. Gall, O. Schwartz, J. Salamero, M. Montes, P. Loetscher, M. Baggiolini, J.L. Virelizier, F. Arenzana-Seisdedos, HIV coreceptor downregulation as antiviral principle: SDF1alpha-dependent internalization of the chemokine receptor CXCR4 contributes to inhibition of HIV replication, J. Exp. Med. 186 (1997) 139-146.

81

223 N.I. Tarasova, R.H. Stauber, C.J. Michejda, Spontaneous and ligand-induced trafficking of CXCchemokine receptor 4, J. Biol. Chem. 273 (1998) 15883-15886. 224 P. van Kerkhof, R. Govers, C.M. Alves Dos Santos, G.J. Strous, Endocytosis and degradation of the growth hormone receptor are proteasome-dependent, J. Biol. Chem. 275 (2000) 1575-1580. 225 P. Soubeyran, K. Kowanetz, I. Szymkiewicz, W.Y. Langdon, I. Dikic, Cbl-CIN85-endophilin complex mediates ligand-induced downregulation of EGF receptors, Nature 416 (2002) 183-187. 226 D.J. Katzmann, M. Babst, S.D. Emr, Ubiquitin-dependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex, ESCRT-I, Cell 106 (2001) 145-155. 227 M. Babst, G. Odorizzi, E.J. Estepa, S.D. Emr, Mammalian tumor susceptibility gene 101 (TSG101) and the yeast homologue, Vps23p, both function in late endosomal trafficking, Traffic. 1 (2000) 248258. 228 M. Babst, D. Katzmann, W. Snyder, B. Wendland, S. Emr, Endosome-Associated Complex, ESCRTII, Recruits Transport Machinery for Protein Sorting at the Multivesicular Body, Dev. Cell 3 (2002) 283229 M. Babst, D. Katzmann, E. Estepa-Sabal, T. Meerloo, S. Emr, Escrt-III. An endosome-associated heterooligomeric protein complex required for mvb sorting, Dev. Cell 3 (2002) 271230 L. Hunyady, A.J. Baukal, Z. Gaborik, J.A. Olivares-Reyes, M. Bor, M. Szaszak, R. Lodge, K.J. Catt, T. Balla, Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor, J. Cell Biol. 157 (2002) 1211-1222. 231 E. Wang, J.G. Pennington, J.R. Goldenring, W. Hunziker, K.W. Dunn, Brefeldin A rapidly disrupts plasma membrane polarity by blocking polar sorting in common endosomes of MDCK cells, J. Cell Sci. 114 (2001) 3309-3321. 232 S. Gines, F. Ciruela, J. Burgueno, V. Casado, E.I. Canela, J. Mallol, C. Lluis, R. Franco, Involvement of caveolin in ligand-induced recruitment and internalization of A(1) adenosine receptor and adenosine deaminase in an epithelial cell line, Mol. Pharmacol. 59 (2001) 1314-1323.

82

Saját közlemények jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Mihalik B, Gáborik Zs, Várnai P, Clark AJL, Catt KJ, Hunyady L Endocytosis of the AT1A angiotensin receptor is independent of ubiquitilation of its cytoplasmic serine/threonine-rich region Int J Biochem Cell Biol. 2003 Közlésre elfogadva I.F.: 3,258 Smith RD, Hunyady L, Olivares-Reyes JA, Mihalik B, Jayadev S, Catt KJ. Agonist-induced phosphorylation of the angiotensin AT1a receptor is localized to a serine/threonine-rich region of its cytoplasmic tail. Mol Pharmacol. 1998 Dec;54(6):935-41. I.F.: 5,428

Az értekezéshez kapcsolódó egyéb közlemények Huszár T, Mucsi I, Antus B, Terebessy T, Jeney C, Masszi A, Hunyady L, Mihalik B, Goldberg HJ, Thekkumkara TJ, Rosivall L: Extracellular signal-regulated kinase and the small GTP-binding protein p21Rac1 are involved in the regulation of gene transcription by angiotensin II. Exp Nephrol. 2001 Mar-Apr;9(2):142-9. I.F.: 1,881 Hunyady L, Ji H, Jagadeesh G, Zhang M, Gaborik Zs, Mihalik B, Catt KJ. Dependence of AT1 angiotensin receptor function on adjacent asparagine residues in the seventh transmembrane helix. Mol Pharmacol. 1998 Aug;54(2):427-34. I.F.: 5,428

83

Gáborik Zs, Mihalik B, Jayadev S, Jagadeesh G, Catt KJ, Hunyady L. Requirement of membrane-proximal amino acids in the carboxyl-terminal tail for expression of the rat AT1a angiotensin receptor. FEBS Lett. 1998 May 29;428(3):147-51. I.F.: 3,581

84

0026-895X/98/060935-07$3.00/0 Copyright © by The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics All rights of reproduction in any form reserved. MOLECULAR PHARMACOLOGY, 54:935–941 (1998).

ACCELERATED COMMUNICATION

Agonist-Induced Phosphorylation of the Angiotensin AT1a Receptor Is Localized to a Serine/Threonine-Rich Region of Its Cytoplasmic Tail ´ ´ ROGER D. SMITH, LASZL O´ HUNYADY, J. ALBERTO OLIVARES-REYES, BALAZS MIHALIK, SUMAN JAYADEV, and KEVIN J. CATT Endocrinology and Reproduction Research Branch, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland 20892 (R.D.S., J.A.O-R., S.J., K.J.C.), and Department of Physiology, Semmelweis University of Medicine, H-1088, Budapest, Hungary (L.H., B.M.) Received July 16, 1998; Accepted September 10, 1998

ABSTRACT The agonist-induced phosphorylation sites of the rat AT1a angiotensin receptor were analyzed using epitope-tagged mutant receptors expressed in Cos-7 cells. Angiotensin II-stimulated receptor phosphorylation was unaffected by truncation of the cytoplasmic tail of the receptor at Ser342 (D342) but was abolished by truncation at Ser325 (D325). Truncation at Ser335 (D335), or double-point mutations of Ser335 and Thr336 to alanine (ST-AA), reduced receptor phosphorylation by ;50%, indicating that in addition to Ser335 and/or Thr336, amino acids within the Ser326-Thr332 segment are also phosphorylated. Agonist-induced phosphorylation of the ST-AA and D335 receptors was partially inhibited by staurosporine, suggesting

The superfamily of GPCRs, which mediate the biological responses of cells to diverse extracellular stimuli such as light, odor, neurotransmitters, biogenic amines, and hormones, has been the subject of intensive study in recent years. The current paradigm of GPCR activation entails an agonist-induced change in receptor conformation that facilitates the exchange of GDP for GTP on the a subunits of cognate heterotrimeric G proteins (reviewed in Hamm,

R.D.S. was supported in part by an International Fellowship (FS/95018) from the British Heart Foundation. L.H. was supported in part by an International Research Scholar’s award from the Howard Hughes Medical Institute and grant FKFP-0776/1997 from the Hungarian Ministry of Culture and Education. J.A.O.-R. was supported by a Pan American Fellowship (NIH/ CONACyt-979004). R.D.S. and L.H. contributed equally to this work.

This paper is available online at http://www.molpharm.org

that the single protein kinase C consensus site in the Ser326Thr332 segment (Ser331) is phosphorylated. The impairment of receptor phosphorylation was broadly correlated with the attenuation of agonist-induced internalization rates (D325 , D335 , ST-AA , D342 , wild-type) and with the increasing rank order of magnitude of inositol phosphate production normalized to an equal number of receptors (D325 . D335 . ST-AA 5 D342 . wild-type). These results demonstrate that agonist-induced phosphorylation of the AT1a receptor is confined to an 11-amino-acid serine/threonine-rich segment of its carboxyl-terminal cytoplasmic tail and implicate this region in the mechanisms of receptor internalization and desensitization.

1998). Activated G protein a subunits, together with liberated bg complexes, modulate the activities of several effector molecules, including enzymes such as adenylate cyclase (via Gi and Gs) and phospholipase C (via Gq/11). However, in many cases the responses of cells to agonists are limited by rapid quenching (or desensitization) of the signals generated by activated GPCRs (Hausdorff, 1990; Bohm, 1997). Activated GPCRs are also internalized (or sequestered) into cells and then may be targeted to lysosomes for proteolytic degradation (Hoxie et al., 1993) or resensitized and recycled back to the plasma membrane, where they become available for further ligand binding (Bohm, 1997). The mechanism of desensitization is believed to result from the phosphorylation of activated GPCRs by GRKs and/or second

ABBREVIATIONS: GPCR, G protein-coupled receptor; Ang II, angiotensin II; AT1a-R, type 1a angiotensin receptor; DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; FBS, fetal bovine serum; GRK, G protein-coupled receptor kinase; HA, hemagglutinin; HEPES, 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid; LB, lysis buffer; PAGE, polyacrylamide gel electrophoresis; PKC, protein kinase C; PNGase, peptide N-glycosidase; SDS, sodium dodecyl sulfate; TPA, 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate. 935

936

Smith et al.

messenger-activated kinases (for reviews, see Inglese et al., 1993; Lefkowitz, 1993). Although GRK-mediated phosphorylation of GPCRs is sufficient for partial receptor desensitization, full desensitization requires the subsequent binding of b-arrestin proteins, which sterically hinder the coupling of receptors to G protein or proteins (Ferguson et al., 1996a, 1996b). Receptorbound b-arrestins also seem to act as molecular adapters in the subsequent internalization of some GPCRs via clathrin-coated pits (Goodman et al., 1996). Resensitization of desensitized GPCRs results from the dephosphorylation of phosphorylated receptors by GPCR phosphatases (Pitcher et al., 1995) and the consequent dissociation of b-arrestin. Although this paradigm of GPCR function is well established, it is based largely on studies of a limited number of receptors, in particular the Gs-coupled b-adrenergic receptor (Ferguson et al., 1995; Freedman et al., 1995; Fredericks et al., 1996; January et al., 1997). In contrast, relatively little is known about the nature and role of agonist-induced phosphorylation in the function of the Gq/11-coupled AT1-R. This has been largely due to the inability to achieve adequate resolution of the phosphorylated AT1-R from additional coprecipitating phosphoproteins in SDS-PAGE. However, the use of an improved technique that removes extraneous phosphoproteins before immunoprecipitation has facilitated the demonstration of agonist-induced phosphorylation of endogenous AT1-Rs in bovine adrenal glomerulosa cells (Smith et al., 1998). Here, we applied this methodology to localize the phosphorylation sites of an epitope-tagged rat AT1a-R transiently expressed in Cos-7 cells. By using a series of truncation mutants, we demonstrate that the major agonistinduced phosphorylation sites of the rat AT1a-R are located in an 11-amino-acid serine/threonine-rich segment between Ser326 and Thr336 of the receptor carboxyl-terminal intracellular region.

Experimental Procedures Materials. DMEM, Pi-free DMEM, inositol-free DMEM, FBS, and antibiotic solutions were from Biofluids (Rockville, MD). Angiotensin II was from Peninsula Laboratories (Belmont, CA). 125I[Sar1,Ile8]Ang II and 125I-Ang II were from Covance Laboratories (Vienna, VA). myo-[2-3H]Inositol was from Amersham (Arlington Heights, IL). 32Pi was from Andotek (Tustin, CA). Protein A-Sepharose was from Oncogene Research Products (Cambridge, MA). PNGase F (E.C. 3.5.1.52) was from Boehringer-Mannheim (Indianapolis, IN). The HA.11 mouse monoclonal antibody was from BAbCo (Berkeley, CA). OptiMEM and LipofectAMINE were from Life Technologies (Gaithersburg, MD). Staurosporine and TPA were from Sigma Chemical (St. Louis, MO). Mutagenesis of the rat AT1a receptor cDNA. The influenza HA epitope (YPYDVPDYA) was inserted after the codons of the amino-terminal first two amino acids (MA) into the cDNA of the rat AT1a receptor subcloned into pcDNAI/Amp (InVitrogen, San Diego, CA) as described previously (Smith et al., 1998). Using the EcoRI site within the coding region and the NotI site 39 from the AT1a-R sequence, previously described mutant (non-HA tagged) rat AT1a receptor sequences (Hunyady et al., 1994) were subcloned into the HA-tagged rat AT1a receptor. Transient expression of HA-AT1a-Rs. Cos-7 cells were seeded at 6 3 105 cells/10-cm dish or 3.7 3 104 cells/24-well culture plate in DMEM containing 10% (v/v) FBS, 100 mg/ml streptomycin, and 100 IU/ml penicillin (Cos-7 medium) and cultured for 3 days before transfection using 0.5 ml (24-well plate) or 5 ml (10-cm dish) of OptiMEM containing 10 mg/ml LipofectAMINE and the required

DNA (1 mg/ml) for 6 hr at 37°. After changing to fresh Cos-7 medium, the cells were cultured for an additional 2 days before use. Binding of 125I-[Sar1,Ile8]Ang II to intact cells was performed as described previously (Hunyady et al., 1996). HA-AT1a-R phosphorylation assay. Transfected Cos-7 cells in 10-cm dishes were metabolically labeled for 4 hr at 37° in Pi-free DMEM containing 0.1% (w/v) BSA and 100 mCi/ml 32Pi. After three washes in KRH [118 mM NaCl, 2.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 10 mM glucose, 0.1% (w/v) BSA, 20 mM HEPES, pH 7.4], cells were incubated in the same medium for 10 min in a 37° water bath. Vehicle or 100 nM Ang II was then added for an additional 5 min. After three washes with ice-cold PBS, cells were drained before scraping into LB (50 mM Tris, pH 8.0, 100 mM NaCl, 20 mM NaF, 10 mM Na pyrophosphate, 5 mM EDTA, 10 mg/ml aprotinin, 10 mg/ml leupeptin, 10 mg/ml soybean trypsin inhibitor, 10 mg/ml pepstatin, 10 mg/ml benzamidine, 1 mM 4-(2-aminoethyl)benzenesulfonyl fluoride, 1 mM okadaic acid) and probe-sonicated (Sonifier Cell Disruptor; Heat Systems Ultrasonics, Plainview, NY) for 2 3 20 sec. After removal of nuclei at 750 3 g, membranes were pre-extracted by the addition of an equal volume of LB containing 2 M NaCl and 8 M urea followed by overnight tumbling at 4°. The membranes then were collected at 200,000 3 g and solubilized in LB1 [LB supplemented with 1% (v/v) Nonidet P-40, 1% (w/v) Na deoxycholate and 0.1% (w/v) SDS] with Dounce homogenization. After clarification at 14,000 3 g, solubilized membranes were incubated with 2% (v/v) protein ASepharose for 1 hr at 4°. The precleared supernatant was incubated overnight at 37° with 10 units/ml PNGase F before immunoprecipitation of deglycosylated HA-AT1a-Rs by the addition of 1 ml of HA.11 antibody and 2% (v/v) protein A-Sepharose overnight at 4°. After washing of the Sepharose-bound immune complexes in LB1 lacking protease inhibitors, 32P-labeled phospho-HA-AT1a-Rs were eluted in Laemmli’s sample buffer for 1 hr at 48° and resolved by SDS-PAGE on a 8–16% gradient resolving gel. Phospho-HA-AT1a-Rs were then visualized and quantified in a PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). To quantify the relative phosphorylation of mutant HA-AT1a-Rs, membrane lysates were normalized to an equal number of HAAT1a-Rs before immunoprecipitation. Cos-7 cells from replicate 10-cm dishes were detached by trypsinization 24 hr after transfection, reseeded into 24-well plates, cultured for an additional 24 hr, and subjected to radioligand binding competition assay using 125I[Sar1,Ile8]Ang II. Bmax values were obtained from Scatchard analysis of the binding data using the LIGAND program. AT1a-R internalization assay. 125I-Ang II was added in serumfree DMEM at 37° to transfected Cos-7 cells in 24-well plates for the indicated times. Incubations were stopped by rapid washing with ice-cold PBS, and acid-released and acid-resistant radioactivities were separated and measured by g-spectrometry as described previously (Hunyady et al., 1994). The percent of internalized ligand at each time point was calculated from the ratio of the acid-resistant specific binding to the total (acid-released plus acid-resistant) specific binding. Inositol phosphates measurements. Transfected Cos-7 cells in 24-well plates were labeled by overnight incubation in inositol-free DMEM containing 0.1% (w/v) BSA, 2.5% (v/v) FBS, antibiotics, and 20 mCi/ml myo-[2-3H]inositol. After washing and preincubation with 10 mM LiCl for 30 min, 1 mM Ang II was added for an additional 30 min. Inositol phosphates were extracted as described (Hunyady et al., 1998) and applied to BioRad AG 1-X8 columns (Hercules, CA). After washing three times with water and twice with 0.2 M ammonium formate, the combined InsP2/InsP3 fractions were eluted with 1 M ammonium formate in 0.1 M formic acid, and radioactivity values were determined by liquid scintillation counting. At the expression levels used in this study, there was a linear relationship between cell surface receptor expression and the magnitude of agonist-stimulated inositol phosphate production (Hunyady et al., 1995).

Phosphorylation Sites of the AT1a Angiotensin Receptor

Results Binding parameters of mutant HA-AT1a-Rs. The rat AT1a-R contains as many as 19 potential serine/threonine phosphorylation sites, 13 of which (11 serine and two threonine) are located in the distal 34-amino-acid segment of its carboxyl-terminal intracellular tail (Fig. 1). Depending on the exact locations of their membrane boundaries, the intracellular loops contain up to three serine and five threonine residues. To localize the major agonist-induced phosphorylation sites to specific regions of the receptor and to explore the role of such phosphorylation in receptor signaling and internalization, a series of truncation mutants was created by introducing stop codons at Ser342 (D342), Ser335 (D335), and Lys325 (D325) of an influenza HA epitope-tagged rat AT1a receptor (HA-AT1a-R) (Fig. 1). The binding parameters of these mutants, together with those of a double-point mutation to alanine at Ser335 and Thr336 (ST-AA), were determined by Scatchard analysis of 125 I-[Sar1,Ile8]Ang II binding to intact Cos-7 cells expressing each receptor (Table 1). Although the Kd values for each mutant receptor were not significantly different from that of the wild-type receptor, their expression levels (especially those of the truncation mutants) were appreciably lower than that of the wild-type receptor (Table 1). To assess the relative degree of phosphorylation of mutant receptors, Bmax values obtained from Scatchard analysis of 125I-[Sar1,Ile8]Ang II binding to intact replicate transfected Cos-7 cells were used to normalize 32P-labeled solubilized membranes to an equal number of HA-AT1a-Rs before immunoprecipitation. Phosphorylation of mutant HA-AT1a-Rs. The photoaffinity-labeled HA-AT1a-R expressed in Cos-7 cells migrates as a diffuse smear of Mr 85,000–145,000 in SDS-PAGE (presumably due to heterogeneity arising from variable degrees of receptor glycosylation; Smith et al., 1998) but shifts to a discrete doublet with Mr ;40,000 after enzymatic deglycosylation. This finding is consistent with the predicted size (41 kDa) of the nonglycosylated AT1 receptor (Murphy et al., 1991). Unlike the less diffuse migration pattern of the photoaffinity-labeled endogenous AT1-R in bovine adrenal glomerulosa cells (which migrates as a broad band of Mr 60,000– 65,000; Smith et al., 1998), the broad migration pattern of the HA-AT1a-R expressed in Cos-7 cells, together with the presence of comigrating nonreceptor phosphoproteins, renders unsatisfactory the quantification of (glycosylated) phosphoHA-AT1a-Rs. For this reason, the solubilized 32P-labeled phospho-HA-AT1a-Rs were subjected to enzymatic deglycosylation with PNGase F (Lemp et al., 1990) before immunoprecipitation and SDS-PAGE. The deglycosylated phospho-HA-

937

AT1a-R doublets were not only more discrete but also separated from the extraneous phosphoproteins and, accordingly, could be more accurately quantified. Using this approach, no basal phosphorylation of the wildtype HA-AT1a-R, or of any of the mutant receptors (data not shown) was detected in control cells. In contrast, treatment of the transfected cells for 5 min with 100 nM Ang II caused marked phosphorylation of the wild-type receptor (Fig. 2). However, the introduction of a stop codon at Lys325 (D325) upstream of the 13 serine/threonine residues of the receptor tail completely abolished receptor phosphorylation. These data indicate that none of the potential intracellular loop sites of the HA-AT1a-R expressed in Cos-7 cells are phosphorylated and that the agonist-induced phosphorylation sites are located exclusively in the receptor intracellular tail downstream of Lys325. To further localize these phosphorylation sites, the carboxyl-terminal 18-amino-acid segment (which contains five serine residues) was removed from the HA-AT1a-R by the introduction of a stop codon at Ser342 (D342). However, this mutant receptor displayed no significant difference in Ang II-induced phosphorylation compared with the wild-type HA-AT1a-R, indicating that the major agonist-induced phosphorylation sites are located upstream of Ser342 in the serine/threonine-rich 13-amino-acid segment between Ser326 and Ser338. To localize these phosphorylation sites, a stop codon was introduced at Ser335 (D335) and its phosphorylation status was compared with that of the ST-AA double-point mutant. Consistent with the incremental reductions in molecular size, sequential truncation of the carboxyl-terminal tail increased the electrophoretic mobility of the deglycosylated phospho-HA-AT1a-Rs in SDS-PAGE with the rank order D335 . D342 . ST-AA 5 wild-type. Although Ang II caused a similar degree of phosphorylation of the D335 and ST-AA receptors, the magnitude of this phosphorylation was ;50% of that of the wild-type and D342 receptors. These data indicate that the HA-AT1a-R is phosphorylated on multiple sites in the Ser326-to-Ser338 segment. Furthermore, the similar degrees of phosphorylation observed for both the D335 and ST-AA mutants, which is consistent with the deduced absence (discussed above) of major phosphorylation sites downstream of Pro341, indicate that Ser335 and/or Thr336 (but not Ser338) is a major site or sites for agonist-induced HAAT1a-R phosphorylation. However, the residual phosphorylation observed with the D335 and ST-AA mutants also indicates the existence of additional phosphorylation sites in the Ser326-to-Thr332 segment. This segment contains a single residue (Ser331) that is situated within a consensus sequence for phosphorylation by

Fig. 1. Amino acid sequences of mutant HA-AT1aRs. Bold, Potential serine and threonine phosphorylation sites; underlined, ST-AA mutation sites; shaded box, 11-amino-acid serine/threonine-rich region that contains the sites of agonist-induced phosphorylation.

938

Smith et al.

PKC. Because PKC is activated by Ang II in target cells (Catt et al., 1993), its role in agonist-induced phosphorylation of the ST-AA and D335 receptors was determined by pretreating cells with a concentration of staurosporine (500 nM) that is sufficient to inhibit PKC but has no effect on GRKs (Oppermann et al., 1996). This reduced agonist-stimulated phosphorylation of the ST-AA and D335 receptors by about 50%, whereas direct activation of PKC (using the phorbol ester TPA) was sufficient to cause partial phosphorylation of each receptor (Fig. 3). These data suggest that Ang II stimulates phosphorylation of the ST-AA and D335 receptors on Ser331 via PKC and that a non-PKC (presumably GRK-dependent) pathway mediates the phosphorylation of an additional site or sites in the Ser326-to-Thr332 segment. Internalization of mutant AT1a-Rs. The effects of truncation of the tail of the AT1a-R and hence sequential removal of its phosphorylation sites were assessed. Although truncation of the AT1a-R at Ser342 (D342) caused little change in TABLE 1 Binding parameters for mutant HA-AT1a-Rs. Intact Cos-7 cells expressing the indicated receptors were subjected to radioligand binding competition assays for 6 hr at 4° using 125I-[Sar1,Ile8]-Ang II; Kd and Bmax values were calculated using the LIGAND program. The Bmax value for the wild-type receptor was 1.61 6 0.87 pmol/mg of protein. The data represent mean values 6 standard error from three independent experiments. Receptor

WT ST-AA D342 D335 D325

Kd

the receptor agonist-induced internalization rate, truncation at Lys325 (D325) almost completely abolished receptor internalization (Fig. 4). Truncation at Ser335 (D335) markedly reduced receptor internalization (although to a slightly lesser extent than that of D325), whereas the ST-AA mutant internalized at a rate that was intermediate between those of the D342 and D335 mutants. Hence, sequential removal of the receptor phosphorylation sites was correlated with incremental impairment of receptor internalization. Inositol phosphate responses of mutant HA-AT1a-Rs. Each of the mutant HA-AT1a-Rs was able to couple to Gq because each receptor stimulated the production of inositol phosphates to a similar extent as the wild-type receptor when expressed in Cos-7 cells (Fig. 5a). However, when these data were normalized to equal receptor expression (derived from Bmax values), it became apparent that the ability of the agonist-activated mutant receptors to stimulate inositol phosphate production was greater than that of the wild-type receptor (Fig. 5b). The rank order of magnitude with which the mutants stimulated inositol phosphates production (D325 . D335 . D342 . wild-type) correlated with the degree of truncation of the receptor tail.

Bmax

nM

% WT

1.48 6 0.34 1.23 6 0.38 1.16 6 0.32 1.14 6 0.25 1.28 6 0.21

100 6 54 73 6 33 45 6 24 47 6 27 36 6 22

WT, wild-type.

Fig. 2. Agonist-induced phosphorylation of mutant HA-AT1a-Rs. A, Cos-7 cells expressing the indicated receptors were labeled with 32Pi for 4 hr before the addition of vehicle or 100 nM Ang II. Membrane lysates normalized to an equal number of receptors were prepared as described in Experimental Procedures. After overnight incubation at 37° in the presence of 10 units/ml PNGase F, deglycosylated HA-AT1a-Rs were precipitated by the anti-HA antibody and resolved by SDS-PAGE. Phosphorylated receptors then were visualized and quantified in a PhosphorImager. B, Quantification of mean 6 standard error HA-AT1a-R phosphorylation from four independent experiments.

Fig. 3. The role of PKC in agonist-induced phosphorylation of mutant HA-AT1a-Rs. Cos-7 cells expressing ST-AA or D335 receptors were labeled with 32Pi for 4 hr and pretreated with vehicle or 500 nM staurosporine (SP) for 10 min before stimulation with 100 nM Ang II or 200 nM TPA for an additional 5 min as indicated. After overnight incubation at 37° in the presence of 10 units/ml PNGase F, deglycosylated HA-AT1a-Rs (which were not normalized to an equal number of receptors) were precipitated by the anti-HA antibody and resolved by SDS-PAGE. Phosphorylated receptors then were visualized in a PhosphorImager.

Fig. 4. Internalization kinetics of mutant AT1a-Rs. Cos-7 cells expressing the indicated receptors were incubated with 125I-Ang II at 37° for the indicated times. Acid-resistant and acid-sensitive binding (cpm) were determined as described in Experimental Procedures, and the internalized (acid-resistant) binding was expressed as percent of the total binding at each time point. The data represent mean 6 standard error values from three to four independent experiments.

Phosphorylation Sites of the AT1a Angiotensin Receptor

Discussion Agonist-induced phosphorylation has been demonstrated for a variety of GPCRs including the b-adrenergic (Ferguson et al., 1995; Freedman et al., 1995; Fredericks et al., 1996; January et al., 1997), a-adrenergic (Eason et al., 1995), d-opioid (Pei et al., 1995), endothelin (Freedman et al., 1997), adenosine (Palmer et al., 1995), vasopressin (Innamorati et al., 1997), and somatostatin (Hipkin et al., 1997) receptors. However, there have been relatively few unequivocal reports of AT1-R phosphorylation. This has been due in large part to the inability to distinguish the immunoprecipitated phosphoAT1-R from more abundant phosphoproteins that either genuinely or spuriously coprecipitate with the receptor (Smith et al., 1998). Despite these problems, unequivocal agonist-induced phosphorylation of a transiently expressed epitopetagged AT1-R (Oppermann et al., 1996), and of a stably expressed (His)6-tagged AT1-R (Balmforth et al., 1997) has been reported in human embryonic kidney 293 cells. We recently developed methodology that allowed us to demonstrate phosphorylation of the endogenous AT1-R in primary cultures of bovine adrenal glomerulosa cells (Smith et al., 1998). Here, we successfully applied this technique to localize the phosphorylation sites of an HA epitope-tagged rat AT1a-R expressed in Cos-7 cells. However, because the expressed receptor migrates as a diffuse smear of Mr 85,000 –145,000 in SDS-PAGE and because this region also contains (despite the use of our improved methodology) some additional nonreceptor phosphoproteins, initial attempts to quantify HA-AT1a-R phosphorylation were unsatisfactory.

Fig. 5. Inositol phosphate responses of mutant HA-AT1a-Rs. [3H]inositol-labeled Cos-7 cells expressing the indicated receptors were preincubated with 10 mM LiCl for 30 min before the addition of vehicle or 1 mM Ang II for an additional 30 min. [3H]Inositol phosphates were measured as described in Experimental Procedures. A, Mean 6 standard error basal and Ang II-stimulated [3H]inositol phosphates from three independent experiments. B, Ang II-stimulated data are normalized to an equal number of receptors. Receptor expression levels are shown in Table 1.

939

We therefore used the enzyme PNGase F (Lemp et al., 1990) to cleave N-linked carbohydrate moieties from solubilized 32P-labeled Cos-7 cell membrane glycoproteins before immunoprecipitation. Interestingly, after this treatment, the deglycosylated phospho-HA-AT1a-R ran as a doublet in SDSPAGE, as did the deglycosylated photoaffinity-labeled receptor (data not shown). Furthermore, immunoblotting with the anti-HA antibody of PNGase F-treated membranes from unstimulated Cos-7 cells expressing the HA-AT1a-R also revealed a doublet with Mr ;40,000 (data not shown). Because these cells were transfected with a single DNA species, it is unclear why the deglycosylated HA-AT1a-R migrates as a doublet in SDS-PAGE. It is possible that the two bands result from a (nonglycosylation) post-translational processing event, such as lipidation, of a subset of receptors. However, this seems unlikely because the only potential attachment site of a lipid anchor to the HA-AT1a-R (at Cys355) is absent from the truncated receptors, yet these also run as doublets in SDS-PAGE (Fig. 2). The use of PNGase F revealed the phospho-HA-AT1a-R as a discrete doublet with Mr ;40,000, which, being free from additional phosphoproteins, was more readily quantified. The data obtained from the various mutant receptors indicated that the major agonist-induced phosphorylation sites of the HA-AT1a-R expressed in Cos-7 cells are located in an 11-amino-acid (Ser326-Th336) segment, which contains five serine and two threonine residues, in the receptor cytoplasmic tail. GRKs seem to phosphorylate the receptor at Ser335 and/or Thr336, as well as an additional site or sites in the Ser326-Thr332 segment, whereas PKC seems to phosphorylate at Ser331. Quantification of the phosphorylation status of additional multiple-point mutant HA-AT1a-Rs should clarify whether these deductions are correct. Previous studies have suggested that the consensus sequence for GRK-mediated phosphorylation of GPCRs consists of a diacidic motif (Fredericks et al., 1996). The cytoplasmic tail of the rat AT1a-R contains only three acidic residues (at Asp343, Glu357 and Glu359) (Fig. 1). However, all three of these acidic residues are absent from the D342 truncation mutant receptor. Because agonist-induced phosphorylation of this receptor was not significantly different from that of the wild-type receptor, it seems that none of these acidic residues represent the consensus sequence for GRK-mediated phosphorylation of the HA-AT1a-R expressed in Cos-7 cells. However, the HA-AT1a-R does contain a diacidic motif (Asp236-Asp237) at the carboxyl-terminal end of its third intracellular loop (Murphy et al., 1991). Future experiments using additional mutant receptors should clarify whether this motif represents the diacidic consensus sequence for GRK-mediated HA-AT1a-R phosphorylation. Should the Asp236-Asp237 motif prove to be a GRK consensus sequence, it would be unique for a GPCR in its not being adjacent to the GRK phosphorylation sites on the cytoplasmic tail but instead being situated on the third intracellular loop. Alternatively, should the Asp236-Asp237 motif prove not to be required for GRK phosphorylation, the GRK consensus sequence of the HA-AT1a-R would instead be unique by virtue of its not being a diacidic motif. Truncations (or mutation) of the cytoplasmic tail of the HA-AT1a-R that caused removal of its phosphorylation sites were correlated with attenuation of the rate of agonistinduced receptor internalization. Thus, although the inter-

940

Smith et al.

nalization rates of both the wild-type and D342 mutant receptors (which exhibited the same degree of phosphorylation) were similar, internalization of the D325 mutant (which did not phosphorylate) was virtually abolished. The internalization rates of the partially phosphorylated ST-AA and D335 mutants were intermediate between those of the wild-type and D325 receptors, although the D335 mutant internalized at a rate that was slower than the ST-AA mutant. The latter finding probably reflects the absence in the D335 (but not the ST-AA) mutant of the Leu337 residue of the Ser335-Thr336Leu337 motif, which we previously identified as a major determinant of AT1a-R internalization (Hunyady et al., 1994). However, the correlation between reduced phosphorylation and impaired internalization of the ST-AA mutant compared with the wild-type receptor indicates that phosphorylation on the Ser335 and/or Thr336 residues of the Ser335-Thr336-Leu337 motif plays a role in internalization. In addition, because the partially phosphorylated D335 mutant internalized slightly faster than the D325 mutant, we cannot rule out the possibility that phosphorylation at an additional site or sites in the Ser326-Thr332 segment also plays a role in the internalization process. However, the putative PKC-mediated phosphorylation of Ser331, indicated by the partial inhibitory effect of staurosporine on the agonist-induced phosphorylation of the D335 and ST-AA receptors, does not seem to play a role in receptor internalization because substitution of this residue for alanine had no effect on the internalization rate of the full-length AT1a-R (Hunyady et al., 1994). Furthermore, because the D325 receptor is not phosphorylated, it is also likely that the previously described role in receptor internalization of a hydrophobic region in the amino-terminal cytoplasmic tail of the AT1-R (Thomas et al., 1995a) operates independently of receptor phosphorylation. It should be noted that receptor phosphorylation and the initial rates of receptor internalization were assessed during the early stages (5 min) of agonist stimulation, whereas inositol phosphate accumulation was measured 20 min after the addition of agonist. Care therefore should be taken in comparing changes in inositol phosphate production with those of receptor phosphorylation and internalization. However, when the inositol phosphate data were normalized to an equal number of receptors, increasing truncation of the cytoplasmic tail of the HA-AT1a-R was correlated with an increased capacity of each receptor for intracellular signal generation. This could result from increased coupling of the mutant receptors to Gq and/or increasing attenuation of receptor desensitization. Because the available data indicate that residues distal to Lys325 in the cytoplasmic tail of the AT1-R are not involved in coupling to Gq (Hunyady et al., 1994; Thomas et al., 1995b; Conchon et al., 1997; Sano et al., 1997; Gaborik et al., 1998), the latter possibility seems more likely. However, although the nonphosphorylated D325 receptor elicited the largest signaling response and the fully phosphorylated wild-type receptor elicited the weakest signaling response, there were discrepancies between the degree of receptor phosphorylation and the magnitude of inositol phosphate production for the other mutant receptors. Thus, although phosphorylation of the wild-type and D342 receptors was similar, the D342 receptor elicited a larger signaling response than the wild-type receptor. Also, although phos-

phorylation of the ST-AA and D335 receptors was similar (but only ;50% of the wild-type and D342 receptors), the D335 receptor elicited a larger signaling response than the ST-AA receptor. These findings suggest that a sequence located in the segment downstream of Pro341 limits agonistinduced signaling at the HA-AT1a-R. If the enhanced signaling observed for the various mutant HA-AT1a-Rs results from impaired receptor desensitization, this putative sequence may be involved in stabilizing the binding of b-arrestin to the phosphorylated HA-AT1a-R. However, because endocytosis of the AT1-R has been shown to be b-arrestin independent (Zhang et al., 1996), the absence of such a motif from the truncation mutants would not affect the internalization rates of these receptors. In conclusion, we demonstrated agonist-induced phosphorylation of an HA epitope-tagged rat AT1a-R transiently expressed in Cos-7 cells. Measurement of the magnitudes of phosphorylation of a series of mutant HA-AT1a-Rs have localized the receptor GRK and PKC phosphorylation sites to an 11-amino-acid serine/threonine-rich segment of its cytoplasmic tail. Phosphorylation of residues in this segment seems to be involved in agonist-induced internalization and desensitization of the HA-AT1a-R. Although internalization of the AT1-R has been shown to be b-arrestin independent (Zhang et al., 1996), our results imply that receptor phosphorylation is still required for this process. The development of a quantitative assay of HA-AT1a-R phosphorylation should permit precise mapping of the receptor phosphorylation sites and identification of the specific consensus sequence or sequences for GRK-mediated phosphorylation. These advances should aid in the elucidation of mechanisms involved in the internalization and desensitization of the AT1-R. Acknowledgments

We thank Yue Zhang for excellent technical assistance. References Balmforth AJ, Shepherd FH, Warburton P, and Ball SG (1997) Evidence of an important and direct role for protein kinase C in agonist-induced phosphorylation leading to desensitization of the angiotensin AT1A receptor. Br J Pharmacol 122:1469 –1477. Bohm SK, Grady EF, and Bunnett NW (1997) Regulatory mechanisms that modulate signalling by G-protein-coupled receptors. Biochem J 322:1–18. Catt KJ, Sandberg K, and Balla T (1993) Angiotensin II receptors and signal transduction mechanisms, in Cellular and Molecular Biology of the ReninAngiotensin System (Raizada MK, Phillips MI, and Sumners C, eds) pp 307–356, CRC Press, Boca Raton. Conchon S, Barrault M-B, Miserey S, Corvol P, and Clauser E (1997) The C-terminal third intracellular loop of the rat AT1A angiotensin receptor plays a key role in G protein coupling specificity and transduction of the mitogenic signal. J Biol Chem 272:25566 –25572. Eason MG, Moreira SP, and Liggett SB (1995) Four consecutive serines in the third intracellular loop are the sites for b-adrenergic receptor kinase-mediated phosphorylation and desensitization of the a2A-adrenergic receptor. J Biol Chem 270: 4681– 4688. Ferguson SSG, Menard L, Barak LS, Koch WJ, Colapietro A-M, and Caron MG (1995) Role of phosphorylation in agonist-promoted b2-adrenergic receptor sequestration. J Biol Chem 270:24782–24789. Ferguson SSG, Barak LS, Zhang J, and Caron, MG (1996a) G-protein-coupled receptor regulation: role of G-protein-coupled receptor kinases and arrestins. Can J Physiol Pharmacol 74:1095–1110. Ferguson SSG, Zhang J, Barak LS, and Caron MG (1996b) G-protein-coupled receptor kinases and arrestins: regulators of G-protein-coupled receptor sequestration. Biochem Soc Trans 24:953–959. Fredericks ZL, Pitcher JA, and Lefkowitz RJ (1996) Identification of the G proteincoupled receptor kinase sites in the human b2-adrenergic receptor. J Biol Chem 271:13796 –13803. Freedman NJ, Liggett SB, Drachman DE, Pei G, Caron MG, and Lefkowitz RJ (1995) Phosphorylation and desensitization of the human b1-adrenergic receptor. J Biol Chem 270:17953–17961.

Phosphorylation Sites of the AT1a Angiotensin Receptor Freedman NJ, Ament AS, Oppermann M, Stoffel RH, Exum ST, and Lefkowitz RJ (1997) Phosphorylation and desensitization of the human endothelin A and B receptors. J Biol Chem 272:17734 –17743. Gaborik Z, Mihalik B, Jayadev S, Jagadeesh G, Catt KJ, and Hunyady L (1998) Requirement of membrane-proximal amino acids in the carboxy-terminal tail for expression of the rat AT1a angiotensin receptor. FEBS Lett 428:147–151. Goodman OB, Krupnick G, Santini F, Gurevich VV, Penn RB, Gagnon AW, Keen JH, and Benovic JL (1996) b-Arrestin acts as a clathrin adaptor in endocytosis of the b2-adrenergic receptor. Nature (Lond) 383:447– 450. Hamm HE (1998) The many faces of G protein signaling. J Biol Chem 273:669 – 672. Hausdorff WP, Caron MG, and Lefkowitz RJ (1990) Turning off the signal: desensitization of beta-adrenergic receptor function. FASEB J 4:2881–2889. Hipkin RW, Friedman J, Clark RB, Eppler CM, and Schonbrunn A (1997) Agonistinduced desensitization, internalization, and phosphorylation of the sst2A somatostatin receptor. J Biol Chem 272:13869 –13876. Hoxie JA, Ahuja M, Belmonte E, Pizarro S, Parton R, and Brass LF (1993) Internalization and recycling of activated thrombin receptors. J Biol Chem 268:13756 – 13763. Hunyady L, Bor M, Balla T, and Catt KJ (1994) Identification of a cytoplasmic Ser-Thr-Leu motif that determines agonist-induced internalization of the AT1 angiotensin receptor. J Biol Chem 269:31378 –31382. Hunyady L, Bor M, Baukal AJ, Balla T, and Catt KJ (1995) A conserved NPLFY sequence contributes to agonist binding and signal transduction but is not an internalization signal for the type 1 angiotensin II receptor. J Biol Chem 270: 16602–16609. Hunyady L, Zhang M, Jagadeesh G, Bor M, Balla T, and Catt KJ (1996) Dependence of agonist activation on a conserved apolar residue in the third intracellular loop of the AT1 angiotensin receptor. Proc Natl Acad Sci USA 93:10040 –10045. Hunyady L, Ji H, Jagadeesh G, Zhang M, Gaborik Z, Mihalik B, and Catt KJ (1998) Dependence of AT1 angiotensin receptor function on adjacent asparagine residues in the seventh transmembrane helix. Mol Pharmacol 54:427– 434. Inglese J, Freedman NJ, Koch WJ, and Lefkowitz RJ (1993) Structure and mechanism of the G protein-coupled receptor kinases. J Biol Chem 268:23735–23738. Innamorati G, Sadeghi H, Eberle AN, and Birnbaumer M (1997) Phosphorylation of the V2 vasopressin receptor. J Biol Chem 272:2486 –2492. January B, Seibold A, Whaley B, Hipkin RW, Lin D, Schonbrunn A, Barber R, and Clark RB (1997) b3-Adrenergic receptor desensitization, internalization, and phosphorylation in response to full and partial agonists. J Biol Chem 272:23871–23879. Lefkowitz RJ (1993) G protein-coupled receptor kinases. Cell 74:409 – 412. Lemp D, Haselbeck A, and Klebl F (1990) Molecular cloning and heterologous

941

expression of N-glycosidase F from Flavobacterium meningosepticum. J Biol Chem 265:15606 –15610. Murphy TJ, Alexander RW, Griendling KK, Runge MS, and Bernstein KE (1991) Isolation of a cDNA encoding the vascular type-1 angiotensin II receptor. Nature (Lond) 351:233–236. Oppermann M, Freedman NJ, Alexander RW, and Lefkowitz RJ (1996) Phosphorylation of the type 1A angiotensin II receptor by G protein-coupled receptor kinases and protein kinase C. J Biol Chem 271:13266 –13272. Palmer TM, Benovic JL, and Stiles GL (1995) Agonist-dependent phosphorylation and desensitization of the rat A3 adenosine receptor. J Biol Chem 270:29607– 29613. Pei G, Kieffer BL, Lefkowitz RJ, and Freedman NJ (1995) Agonist-dependent phosphorylation of the mouse d-opioid receptor: involvement of G protein-coupled receptor kinases but not protein kinase C. Mol Pharmacol 48:173–177. Pitcher JA, Payne ES, Csortos C, DePaoli-Roach AA, and Lefkowitz RJ (1995) The G-protein-coupled receptor phosphatase: a protein phosphatase type 2A with a distinct subcellular distribution and substrate specificity. Proc Natl Acad Sci USA 92:8343– 8347. Sano T, Ohyama K, Yamano Y, Nakagomi Y, Nakazawa, S, Kikyo M, Shirai H, Blank JS, Exton JH, and Inagami T (1997) A domain for G protein coupling in carboxylterminal tail of rat angiotensin II receptor type 1A. J Biol Chem 272:23631–23636. Smith RD, Baukal AJ, Zolyomi A, Gaborik Z, Hunyady L, Sun L, Zhang M, Chen H-C, and Catt KJ (1998) Agonist-induced phosphorylation of the endogenous AT1 angiotensin receptor in bovine adrenal glomerulosa cells. Mol Endocrinol 12:634 – 644. Thomas WG, Baker KM, Motel TJ, and Thekkumkara TJ (1995a) Angiotensin II receptor endocytosis involves two distinct regions of the cytoplasmic tail: a role for residues on the hydrophobic face of a putative amphipathic helix. J Biol Chem 270:22153–22159. Thomas WG, Thekkumkara TJ, Motel TJ, and Baker KM (1995b) Stable expression of a truncated AT1A receptor in CHO-K1 cells. J Biol Chem 270:207–213. Zhang J, Ferguson SSG, Barak LS, Menard L, and Caron MG (1996) Dynamin and b-arrestin reveal distinct mechanisms for G protein-coupled receptor internalization. J Biol Chem 271:18302–18305.

Send reprint requests to: Dr. Kevin J. Catt, ERRB, NICHD, NIH, Bldg. 49, Room 6A-36, 49 Convent Drive, Bethesda, MD 20892-4510. E-mail: catt@helix. nih.gov

The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

Endocytosis of the AT1A angiotensin receptor is independent of ubiquitylation of its cytoplasmic serine/threonine-rich region Balázs Mihalik a , Zsuzsanna Gáborik a , Péter Várnai a , Adrian J.L. Clark b , Kevin J. Catt c , László Hunyady a,∗ b

a Department of Physiology, Faculty of Medicine, Semmelweis University, P.O. Box 259, H-1444 Budapest, Hungary Department of Endocrinology, St. Bartholomew’s and the Royal London School of Medicine and Dentistry, West Smithfield, London, UK c Endocrinology and Reproduction Research Branch, National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20892-4510, USA

Received 12 June 2002; received in revised form 26 September 2002; accepted 7 October 2002

Abstract Agonist-induced internalisation of the rat type 1A (AT1A ) angiotensin II receptor is associated with phosphorylation of a serine/threonine-rich region in its cytoplasmic tail. In yeast, hyperphosphorylation of the ␣-factor pheromone receptor regulates endocytosis of the receptor by facilitating the monoubiquitylation of its cytoplasmic tail on lysine residues. The role of receptor ubiquitylation in AT1A receptor internalisation was evaluated by deletion or replacement of lysine residues in its agonist-sensitive serine/threonine-rich region. Expression of such receptor mutants in CHO cells showed that these modifications had no detectable effect on the angiotensin II-induced endocytosis of the AT1A receptor. Furthermore, fusion of ubiquitin in-frame to an internalisation-deficient AT1A receptor mutant with a truncated carboxyl-terminal tail did not restore the endocytosis of the resulting chimeric receptor. No impairment of receptor internalisation was observed after substitution of all lysine residues in the serine/threonine-rich region at saturating angiotensin II concentrations, where endocytosis occurs by a ␤-arrestin and dynamin independent mechanism. Taken together, these data demonstrate that ubiquitylation of the cytoplasmic serine/threonine-rich region of the AT1A receptor on lysine residues is not required for its agonist-induced internalisation, and suggest that endocytosis of mammalian G protein-coupled receptors (GPCRs) occurs by a different mechanism than that of yeast GPCRs. © 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. Keywords: AT1A angiotensin receptor; Carboxyl-terminal tail; Internalisation; Receptor regulation; Ubiquitin

1. Introduction The type 1 (AT1 ) angiotensin receptor is a seven transmembrane receptor that mediates the major physiological effects of the octapeptide hormone, angiotensin II (Ang II). The rodent AT1 receptor has two ∗ Corresponding author. Tel.: +36-1-266-2755x4041; fax: +36-1-266-6504. E-mail address: [email protected] (L. Hunyady).

closely related subtypes, the AT1A and AT1B receptors, with similar signalling and ligand binding properties and distinct tissue distributions (Hunyady, Balla, & Catt, 1996; De Gasparo, Catt, Inagami, Wright, & Unger, 2000). Ang II binding to AT1 receptors stimulates phospholipase C activation and Ca2+ /protein kinase C signalling via Gq/11 proteins, and other signalling events through small GTP-binding proteins (Hunyady et al., 1996; De Gasparo et al., 2000). Like many other G protein-coupled receptors (GPCRs),

1357-2725/02/$ – see front matter © 2002 Elsevier Science Ltd. All rights reserved. PII: S 1 3 5 7 - 2 7 2 5 ( 0 2 ) 0 0 2 7 7 - 7

2

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

the signalling functions of the AT1A receptor are regulated by phosphorylation, desensitisation, and internalisation of the hormone–receptor complex (Thomas, 1999; Hunyady, Catt, Clark, & Gaborik, 2000; Conchon, Peltier, Corvol, & Clauser, 1998; Vinson et al., 1995). Agonist-induced activation of GPCRs causes phosphorylation of specific serine/threonine residues by GPCR kinases (GRKs), which facilitates the binding of arrestins and promotes desensitisation by uncoupling the receptor from its cognate G proteins (Krupnick & Benovic, 1998; Ferguson, 2001; Claing, Laporte, Caron, & Lefkowitz, 2002). In the case of the AT1A receptor, binding of angiotensin II causes phosphorylation of a serine/threonine-rich domain in the carboxyl-terminal tail of the receptor (Smith et al., 1998; Thomas, Motel, Kule, Karoor, & Baker, 1998) and enhances its association with ␤-arrestins (Qian, Pipolo, & Thomas, 2001). Another function of agonist-stimulated ␤-arrestin binding to mammalian GPCRs is the regulation of receptor internalisation. ␤-Arrestins can serve as adaptor molecules that link the activated receptor to the endocytotic machinery via their C-terminal clathrin and/or AP2 adaptor protein binding domains (Ferguson et al., 1996; Goodman et al., 1996; Laporte et al., 1999). This appears to be the predominant mechanism of AT1A receptor internalisation that is operative at physiological Ang II concentration (Gáborik et al., 2001). In yeast cells, however, agonist-induced phosphorylation of pheromone receptors promotes monoubiquitylation of the receptor at lysine residues, and this covalent modification regulates receptor internalisation (Terrell, Shih, Dunn, & Hicke, 1998). Ubiquitin is a 76-amino-acid polypeptide that is conjugated to target proteins by the formation of an isopeptide bond between its C-terminal glycine residue and the ε-amino groups of lysine residues in the substrate protein by the sequential actions of three enzymes (Hershko & Ciechanover, 1998). The ubiquitylation of cytosolic and nuclear proteins leads to their degradation in proteasomes (Bonifacino & Weissman, 1998). However, ubiquitylation of plasma membrane proteins has been shown to target these molecules to the endocytotic pathway in yeast and in mammalian cells (Bonifacino & Weissman, 1998; Hicke, 1999). In yeast strains with mutations in the ubiquitin conjugating system, the ␣-factor receptor does not undergo ubiquitylation in response to

pheromone exposure and shows multiple defects in its internalisation process (Hicke & Riezman, 1996). Also, endocytosis of the ␣-factor receptor was abolished when all lysine residues in its cytoplasmic tail were mutated. Although many lysine residues in the cytoplasmic tail of the ␣-factor receptor can serve as ubiquitin conjugating sites, its internalisation is dependent on the ubiquitylation of a lysine residue in a well-defined SINNDAKSS endocytosis signal sequence (Hicke & Riezman, 1996). Binding of ␣-factor causes hyperphosphorylation of serine and threonine residues in the carboxyl-terminal cytoplasmic tail of its receptor, and ubiquitylation of the lysine residue in the SINNDAKSS sequence is regulated by phosphorylation of the adjacent serine residues (Hicke, Zanolari, & Riezman, 1998). Fusion of ubiquitin in-frame rescued the impaired internalisation of tail deletion mutant ␣-factor receptors, and stimulated the internalisation of a stable membrane protein (Terrell et al., 1998; Shih, Sloper–Mould, & Hicke, 2000). These studies led to the conclusion that monoubiquitylation of activated ␣-factor receptors can serve as an internalisation signal. A similar mechanism has been described for the receptor of the other yeast mating pheromone, the a-factor. Ubiquitylation and internalisation of the a-factor receptor is regulated by a large PEST-like sequence (Roth, Sullivan, & Davis, 1998). In yeast cells, the internalised pheromone receptors are transported to the lysosome-like vacuole and are inactivated by degradation. Several mammalian transmembrane proteins that are degraded in lysosomes also undergo ubiquitylation at the cell surface. These include the epidermal growth factor (EGF) receptor, the growth hormone receptor, and epithelial Na+ -channels (Bonifacino & Weissman, 1998; Hicke, 1999). Recent studies have suggested that interaction of the ubiquitin moiety in ubiquitylated membrane proteins with components of the endocytic machinery may contribute to the recruitment of endocytosed proteins into clathrin-coated pits (Polo et al., 2002; Soubeyran, Kowanetz, Szymkiewicz, Langdon, & Dikic, 2002). Although the above data demonstrate that ubiquitylation is required for the internalisation of membrane proteins, ubiquitylation of the ␤2 -adrenergic receptor and the CXCR4 chemokine receptor is not required for their internalisation (Shenoy, McDonald, Kohout, & Lefkowitz, 2001; Marchese & Benovic, 2001), and the potential

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

role of this mechanism during endocytosis of other mammalian GPCRs has not been elucidated. At physiological Ang II concentrations agonistinduced internalisation of the AT1A receptor occurs via clathrin-coated pits by a dynamin- and ␤-arrestin-dependent mechanism (Qian, Pipolo, & Thomas, 2001; Gáborik et al., 2001; Anborgh, Seachrist, Dale, & Ferguson, 2000; Kohout, Lin, Perry, Conner, & Lefkowitz, 2001). However, this process appears to be dynamin- and ␤-arrestin independent at saturating Ang II concentrations (Gáborik et al., 2001; Zhang, Ferguson, Barak, Menard, & Caron, 1996). Mutational analysis of the AT1A receptor has shown that a serine/threonine-rich region in its cytoplasmic tail is required for its agonist-induced endocytosis (Hunyady, Bor, Balla, & Catt, 1994b; Thomas, Baker, Motel, & Thekkumkara, 1995a,b), and recent studies have mapped the main agonist-induced phosphorylation sites to this region of the receptor (Smith et al., 1998; Thomas, Motel, Kule, Karoor, & Baker, 1998). This serine- and threonine-rich region (STKMSTLS) in the C-terminal tail of the AT1A receptor also contains a lysine residue and resembles the SINNDAKSS sequence of the ␣-factor receptor (Fig. 1). This similarity between these sequences and the regulatory role of agonist-induced phosphorylation of this region in AT1 receptor endocytosis raised the question whether ubiquitylation of this region has a similar role in receptor internalisation as that of the ␣-factor receptor. The present study was designed to investigate the role of ubiquitylation of these C-terminal lysine residues in the regulation of AT1A receptor endocytosis.

3

Amp (Invitrogen Inc.) eukaryotic expression vector using the QuikChange site directed mutagenesis kit (Stratagene). The 319STOP receptor mutant was created as described previously (Hunyady et al., 1994b). One or more lysine residues in the C-terminal tail of the wild-type and 338STOP mutant AT1A receptor were substituted with alanine as detailed in Section 3. To facilitate the identification of the mutant plasmids by restriction enzyme analysis, the designed oligonucleotides contained silent mutations to add or remove restriction enzyme digestion sites. After an initial screening with restriction enzymes, all mutations were confirmed by sequencing using the ThermoSequenase sequencing kit (Amersham Biosciences). The ubiquitin-tagged 319STOP AT1A receptor mutant was generated by a recombinant polymerase chain reaction (PCR) technique. Full-length human ubiquitin cDNA amplified from a human EST clone (Research Genetics Inc.) was fused to the 3 -terminus of a fragment containing the AT1A receptor cDNA from the EcoRI site to the Lys318 amino acid of the receptor, by PCR. This PCR product was ligated into a pcDNA3.1/AT1A plasmid replacing the wild-type EcoRI/NotI fragment of the AT1A receptor cDNA with the ubiquitin fusion fragment. Between the truncated receptor and the ubiquitin coding sequences there is a short glycine linker sequence as shown in Fig. 1. Mutations in the ubiquitin molecule to convert Lys48 to Arg and Gly76 to Ala were introduced with a QuikChange site-directed mutagenesis kit (Stratagene). The in-frame fusion and the mutations in the ubiquitin sequence were verified by dideoxy sequencing. 2.3. Cell culture and transfection

2. Materials and methods 2.1. Materials Cell culture media, transfection reagents, and fetal bovine serum were purchased from Invitrogen Inc. 125 I-angiotensin II was from Covance. Unless otherwise stated, reagents were obtained from Sigma or Fluka.

CHO K-1 cells were maintained in Ham’s F12 medium containing 10% fetal calf serum (FCS), 100 mg/ml streptomycin and 100 IU/ml penicillin (Invitrogen Inc.). Transient transfections were performed in 24-well plates using Lipofectamine (Invitrogen Inc.) as described previously (Gáborik et al., 2001; Hunyady, Bor, Baukal, Balla, & Catt, 1995). 2.4. Receptor internalisation

2.2. Construction of receptor mutants Mutations were introduced into the sequence of the rat AT1A receptor cDNA cloned into the pcDNA3.1/

Agonist-induced internalisation of the AT1A receptor was determined 48 h after transfection as described previously (Gáborik et al., 2001; Hunyady,

4

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

Fig. 1. Cytoplasmic tail mutants of the rat AT1A receptor. In the schematic representation of the wild-type AT1A receptor, the analysed region within the carboxyl terminus of the receptor is shown by the one letter amino acid codes. The Lys323 , Lys325 , Lys333 , Lys350 and Lys351 residues indicated in bold were mutated to alanine. The 338STOP and 319STOP mutants were generated by inserting STOP codons after Leu337 and Lys318 . The 319STOP-Ub mutant was created by an in-frame fusion of human ubiquitin cDNA to the carboxyl terminus of the 319STOP AT1A receptor mutant with a short linker sequence containing three glycine residues.

Baukal, Balla, & Catt, 1994a). Briefly, cells were incubated in the presence of 125 I-Ang II (30–50 pM or 100 and 30 nM unlabelled Ang II) for the indicated times in HEPES-buffered F12 at 37 ◦ C. The cells were then washed twice with ice-cold PBS and the internalised and surface-bound ligands were

separated by removing the extracellular ligand with an acidic solution. The internalised labelled ligand was removed from the plates by solubilisation of the cells in an SDS/NaOH solution. The acid-sensitive and acid-resistant cell-associated radioactivity was determined by ␥-spectrometry. The internalised

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

specific binding is shown as percent of the total specific binding at each time point.

3. Results Mutant AT1A receptors were created to investigate the role of ubiquitylation of C-terminal lysine residues in receptor endocytosis. Five lysine residues are present in the serine/threonine-rich region of the C-terminal tail of the receptor (Fig. 1), and five additional residues (Lys307 , Lys308 , Lys310 , Lys311 and Lys318 ) are located in the C-terminal tail proximal to this region. A role of ubiquitylation of the latter residues in AT1A receptor internalisation is unlikely, given the lack of adjacent serine and threonine residues. Furthermore, studies in yeast have shown that substitution of the C-terminal tail of the ␣-factor receptor at its proximal region with ubiquitin only supports receptor endocytosis with markedly impaired kinetics (Shih et al., 2000). Earlier work from our group indicated that membrane-proximal lysine residues in the C-terminal tail are important for normal expression of the receptor in COS-7 cells, but these amino acids do not play a major role in the signalling and internalisation of the receptor (Gáborik et al., 1998). Furthermore, truncation of the receptor carboxyl-terminal tail sequence at the Tyr319 residue, which is upstream of the serine/threonine-rich region (Fig. 1), substantially inhibits its agonist-induced internalisation (Hunyady et al., 1994b; Thomas, Thekkumkara, Motel, & Baker, 1995a). For this reason, the present study focused on the five lysine residues in the serine/threonine-rich distal region of the cytoplasmic tail. These lysine residues are distributed in the Cterminal tail at three locations (Fig. 1). Two of them (Lys323 and Lys325 ) are within the N-terminal portion of the serine/threonine-rich region, and two adjacent lysines (Lys350 and Lys351 ) are located in the C-terminal part of this region. A single lysine residue (Lys333 ) is located between these groups adjacent to the Ser335 -Thr336 -Leu337 motif, which is critical for AT1A receptor internalisation (Hunyady et al., 1994b). Substitution of this residue with alanine was previously found to have no major effect on the initial rate of AT1A receptor internalisation (Hunyady et al., 1994b). Double alanine substitutions of the two pairs of lysine residues (Mut1 and Mut3; AT1A re-

5

ceptor mutants are defined in Fig. 1) were created by site-directed mutagenesis. These constructs and the Mut2 receptor were expressed in CHO cells, and the internalisation rate of labelled Ang II was analysed in these cells as described in Section 2. The internalisation of labelled Ang II in these mutants was identical with that of the wild-type AT1A receptor (Fig. 2A). In the yeast system, ubiquitylation occurs at several lysine residues and elimination of individual residues does not detectably alter the endocytosis of the ␣-factor receptor (Terrell et al., 1998). To exclude the possibility that the mutant receptor is ubiquitylated at another lysine residue of the serine/threonine-rich region, combined lysine to alanine mutant AT1A receptors were created. Substitution of three lysine residues with alanine (Mut12) or all five lysine residues with alanine (Mut123) had no detectable effect on the endocytosis of the AT1A receptor (Fig. 2B). These results suggest that clathrin-mediated internalisation of the AT1A receptor does not require ubiquitylation of the lysine residues in the serine/threonine-rich region of the cytoplasmic tail. Although there are eight lysine residues in the ␣-factor receptor tail, only two of these (Lys337 and Lys347 ) serve as a strong ubiquitylation signal. A truncated ␣-factor receptor (345Stop) lacking two-thirds of its cytoplasmic tail was found to internalise with similar kinetics as the wild-type receptor. Substitution of Lys337 in the SINNDAKSS sequence of the truncated receptor to arginine completely abolished internalisation of the receptor–ligand complex, while replacement of another lysine residue (Lys304 ) in the truncated receptor had no effect (Shih et al., 2000). In the case of the AT1A receptor, we have previously shown that deletion of the distal portion of the C-terminal tail by substituting Ser338 with a triplet encoding a STOP codon has no major effect on the internalisation kinetics of the receptor (Hunyady et al., 1994b). Similar to the 345STOP mutant in yeast (Terrell et al., 1998), the 338STOP mutation of the AT1A receptor is adjacent to the serine/threonine-rich region required for receptor internalisation, and eliminates potential distal ubiquitylation sites by removing Lys350 and Lys351 . To further investigate the possible role of receptor ubiquitylation in AT1A receptor internalisation, alanine substitutions of the remaining lysine residues were performed in the deletion mutant receptor. As shown in Fig. 3, substitution

6

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

Fig. 3. Internalisation of the truncated tail mutant AT1A receptor (338STOP) and the 338STOP K/A receptor mutant in CHO cells. Cells were transiently transfected with 338STOP K/A () and 338STOP (䊐) receptor mutants and wild-type (䊉) AT1A receptor. Internalisation of 125 I-Ang II was determined as described in Section 2. Values of total (extracellular plus internalized) specific binding after 30 min incubation at 37 ◦ C for wild-type, 338STOP and 338STOP K/A mutant AT1A receptors were 13.2 ± 2.0, 13.9 ± 2.4 and 12.3 ± 4.1%, respectively, of the added tracer. Data represent the mean ± S.E. of three independent experiments, each performed in duplicate.

Fig. 2. Internalisation kinetics of the full-length and 319STOP tail deletion receptor mutants in CHO cells under physiological ligand concentration. (A) The Mut1 (䊐), Mut2 (䉫), Mut3 (), 319STOP (䊊) AT1A receptor mutants and the wild-type (䊉) receptor were transiently expressed in CHO cells. Cells were incubated with 125 I-Ang II for the indicated periods at 37 ◦ C after 48 h transfection and the internalised radioactivity was determined as described in Section 2. The internalised, labelled ligand was calculated as percent of the total specific binding. Data are shown as mean ± S.E. from three independent experiments each performed in duplicate. (B) Internalisation of transiently expressed AT1A wild-type (䊉) and Mut12 (䊐), Mut123 () mutant receptors in CHO cells. Receptor internalisation was measured after addition of 125 I-Ang II at zero time at 37 ◦ C and internalised binding was determined as described above. Values of total (extracellular plus internalised) specific binding after 30 min incubation at 37 ◦ C for wild-type, Mut1, Mut2, Mut3, Mut12, Mut13, and 319STOP mutant AT1A receptors were 13.2 ± 2.0, 8.1 ± 1.3, 15.5 ± 4.9, 10.9 ± 2.3, 8.3 ± 0.8, 11.8 ± 3.3, and 10.7 ± 3.3%, respectively, of the added tracer. Each point represents the mean ± S.E. of three independent experiments, each performed in duplicate.

of Lys323 , Lys325 and Lys333 in the deletion mutant did not change the internalisation kinetics of labelled Ang II. Thus, similar to the previous set of experiments, removal of all five lysine residues in the serine/threonine-rich region of the cytoplasmic tail of the AT1A receptor had no effect on its endocytosis. To further evaluate the possible function of ubiquitylation of the receptor, we constructed a ubiquitintagged receptor mutant (319STOP-Ub) by fusing human ubiquitin to the carboxyl-terminus of the 319STOP receptor mutant. We have previously shown that the carboxyl-terminal region of the intracellular tail of the AT1A receptor contains sequence determinants required for endocytosis of the receptor (Hunyady et al., 1994b). In the AT1A receptor, truncation of the C-terminal tail by substituting Tyr319 with a STOP codon caused impaired internalisation of the receptor in COS-7 cells (Hunyady et al., 1994b; Thomas et al., 1995a). Similar to the yeast studies, we also introduced two mutations into the ubiquitin molecule. Substitution of arginine for Lys48 was performed to

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

7

remove the main lysine residue required for further ubiquitin attachment, and to prevent the chimeric protein from polyubiquitylation. Also, ubiquitin’s Gly76 residue was replaced by alanine to protect the fusion receptor from the action of de-ubiquitylating enzymes (Shih et al., 2000). Whereas the K48R mutation abolishes polyubiquitylation required for proteasomal degradation of the protein, the G76A mutation prevents removal of the ubiquitin moiety. To investigate the contribution of ubiquitin to AT1A receptor endocytosis, we analysed the internalisation kinetics of this receptor chimera. We hypothesized that in the non-internalised 319STOP AT1A receptor mutant, internalisation should be rescued by attachment of a ubiquitin molecule to its carboxyl-terminal end, as observed for the ␣-factor receptor (Shih et al., 2000), if ubiquitin is involved in the internalisation of the AT1A receptor. However, the internalisation kinetics of the AT1A receptor mutant-ubiquitin chimera did not differ from those of the 319STOP mutant (Fig. 4). This observation further indicated that attachment of

ubiquitin to the receptor does not affect the kinetics of AT1A receptor internalisation. We have previously shown that the mechanism of AT1A receptor differs according to the agonist concentrations (Gáborik et al., 2001). At physiological Ang II concentrations, ␤-arrestin- and dynamindependent endocytosis is the predominant mechanism of AT1A receptor internalisation. However, at saturating hormone concentrations a ␤-arrestin- and dynamin-independent mechanism appears to operate (Gáborik et al., 2001). To test whether receptor ubiquitylation plays a role in the latter mechanism of AT1A receptor internalisation, we analysed the endocytosis of wild-type and Mut123 mutant AT1A receptors at saturating Ang II concentrations. In contrast to previous experiments, in which the concentration of radiolabelled agonist was low (0.03 nM), the labelled Ang II was increased to 0.1 nM and the total Ang II concentration was increased to 30 nM. Internalisation kinetics were analysed under these conditions in CHO cells transiently transfected with Mut123 receptor

Fig. 4. Internalisation kinetics of wild-type AT1A receptor (䊉), 319STOP (䊊) and 319STOP-Ub (䊐) receptor mutants in transiently transfected CHO cells. Cells were incubated with 125 I-Ang II for the indicated periods at 37 ◦ C after 48 h transfection and the internalised radioactivity was determined as described in Section 2. The internalised, labelled ligand was calculated as a percent of total specific binding. Values of total (extracellular plus internalised) specific binding after 30 min incubation at 37 ◦ C for wild-type, 319STOP and 319STOP-Ub mutant AT1A receptors were 15.3 ± 2.9, 5.8 ± 1.3 and 7.0 ± 2.0%, respectively, of the added tracer. Data are shown as mean ± S.E. from three independent experiments, each performed in duplicate.

Fig. 5. Internalisation of the full-length Mut123 () mutant and the wild-type AT1A receptor in the presence of 30 nM radiolabelled agonist. CHO cells were transiently transfected with the appropriate cDNA construct, 48 h after transfection cells were incubated with 125 I-Ang II added to radioinert Ang II to bring the final concentration to 30 nM. Internalisation of labelled ligand was determined as described in Section 2. Values of total (extracellular plus internalised) specific binding after 30 min incubation at 37 ◦ C for wild-type and Mut123 mutant AT1A receptors were 1.5 ± 0.8 and 1.1 ± 0.6%, respectively, of the added tracer. Data represent the mean ± S.E. of three independent experiments, each performed in duplicate.

8

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

mutant and wild-type receptor (Fig. 5). Substitution of all studied lysine residues in the Mut123 mutant AT1A receptor had no inhibitory effect on the initial phase of 125 I-Ang II endocytosis at 30 nM Ang II concentration, and after 2 min the accumulation of the internalised ligand was increased relative to that of the native AT1A receptor (Fig. 5). These data suggest that ubiquitylation of the lysine residues in the serine/threonin-rich region of the carboxyl terminal tail is also not required for ␤-arrestin- and dynamin-independent internalisation of the AT1A receptor.

4. Discussion The present study was performed to evaluate the role of ubiquitylation of the lysine residues in the serine/threonine-rich region of the cytoplasmic tail in internalisation of the AT1A receptor. Our hypothesis was that agonist-induced phosphorylation of the serine/threonine-rich region in the cytoplasmic tail of the AT1A receptor could contribute to its internalisation in part by promoting the ubiquitylation of the receptor on lysine residues, as observed for certain yeast plasma membrane receptors. However, the present data demonstrate that the serine/threonine-rich region in the cytoplasmic tail of the receptor regulates its internalisation by a mechanism that is independent of receptor ubiquitylation. These findings indicate that the dynamin- and ␤-arrestin-dependent endocytosis of the AT1A receptor via clathrin-coated vesicles, which is the predominant mechanism of AT1A receptor internalisation at physiological hormone concentrations (Gáborik et al., 2001; Anborgh, Seachrist, Dale, & Ferguson, 2000; Kohout et al., 2001; Werbonat, Kleutges, Jakobs, & van Koppen, 2000), does not require ubiquitylation of the receptor. At supraphysiological Ang II concentrations, endocytosis of the AT1A receptor occurs by a dynamin and ␤-arrestin independent mechanism (Gáborik et al., 2001; Zhang et al., 1996). Our data on the kinetics of receptor endocytosis at higher (30 nM) Ang II concentration suggest that ubiquitylation of the serine/threonin-rich region of the cytoplasmic tail is also not required for the endocytosis of the AT1A receptor under these conditions. Relatively little is known about the role of ubiquitin in the regulation of endocytosis of GPCRs in

mammalian cells. Among the mammalian GPCRs, rhodopsin (Obin, Jahngen–Hodge, Nowell, & Taylor, 1996), the ␦-opioid receptor (Petaja-Repo et al., 2001), chemokine receptors (Marchese & Benovic, 2001), and the ␤2 -adrenergic receptor (Shenoy et al., 2001) have been reported to be ubiquitylated. However, this process is involved in degradation of these receptors and does not appear to be related to receptor endocytosis. A study on the rod outer segment showed that ubiquitin attachment has a role in regulation of rhodopsin (Obin et al., 1996). This modification caused increased protein degradation but did not promote endocytosis of rhodopsin, which is normally a non-internalising receptor. Recent studies have shown that the ␦-opioid receptor can undergo ubiquitylation, but in this case the polyubiquitin chain is attached before the receptor reaches the plasma membrane (Petaja-Repo et al., 2001). This process might serve to control the quality of newly synthesised receptors by targeting misfolded proteins for proteasomal degradation (Petaja-Repo et al., 2001). In the CXCR4 chemokine and ␤2 adrenergic receptors, ubiquitin attachment seems to be involved in the postendocytotic processing of the receptors (Shenoy, et al., 2001; Marchese & Benovic, 2001). The CXCR4 receptor undergoes agonist-induced monoubiquitylation, but substitution of three lysine residues adjacent to a serine-rich “degradation motif” did not interfere with its endocytosis (Marchese & Benovic, 2001). Inhibition of ubiquitylation of the ␤2 -adrenergic receptor by replacing all of its lysine residues with arginine decreased the rate of receptor degradation but had no effect on receptor internalisation. In mammalian cells, several tyrosine kinase and tyrosine kinase-linked receptors have been shown to undergo ubiquitylation during agonist stimulation (reviewed in Bonifacino & Weissman, 1998; Hicke, 1999). One of the best-characterised examples of the ubiquitylation of a mammalian membrane receptor is that of the growth hormone receptor. Binding of growth hormone induces dimerisation, activation, internalisation and ubiquitylation of its receptor. Studies on cells with a temperature-sensitive defect in ubiquitin conjugation, and cells expressing truncated growth hormone receptors, revealed that the ubiquitin conjugation system, but not ubiquitylation of the receptor per se, is required for agonist-induced internalisation of the growth hormone receptor (Strous, van Kerkhof,

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

Govers, Ciechanover, & Schwartz, 1996; Sachse, van Kerkhof, Strous, & Klumperman, 2001). In contrast to endocytosis of the yeast ␣-factor receptor endocytosis, where ubiquitylation of the receptor itself is required for agonist-induced endocytosis (Shih et al., 2000), in the growth hormone receptor the ubiquitin conjugating enzyme complex may serve as an adaptor that links the receptor to the endocytotic apparatus. Several reports have demonstrated that the agonist-occupied EGF receptor is ubiquitinated at the plasma membrane by the RING domain-containing E3 ligase, c-Cbl, which promotes down-regulation by sorting the activated receptor to lysosomes (reviewed in Thien & Langdon, 2001). Previous studies have reported that although ubiquitylation of the EGF receptor is not involved in its internalisation, ubiquitin attachment to lysine residues of the intracellular region of the receptor promotes its down-regulation by directing the receptor to lysosomes for degradation via sorting to the internal vesicles of multivesicular bodies (Waterman & Yarden, 2001). In yeast, the ESCRT protein complex has been reported to mediate ubiquitylated cargo protein sorting into the vacuole, which is analogous to the lysosome (Katzmann, Babst, & Emr, 2001). A similar complex, which contains at least two mammalian orthologs of the yeast ESCRT-I components, might play a role in EGFR degradation in mammalian cells (Babst, Odorizzi, Estepa, & Emr, 2000). Although our data, in agreement with studies on other mammalian GPCRs, suggest that ubiquitylation is not required for endocytosis of the AT1A receptor, it remains possible that ubiquitylation has other functions in its regulation. In the receptor tyrosine kinases, down-regulation occurs by targeting receptors from the plasma membrane for subsequent sorting to the degradative pathway. The plasma membrane proteins are predominantly degraded in lysosomes, and the function of ubiquitylation is to regulate their sorting to lysosomes rather than to direct them to proteasomal degradation. The ubiquitylated receptors may interact with regulatory proteins that facilitate lysosomal sorting through the late endosome/multivesicular body compartment. Recent studies suggest that ubiquitylated plasma membrane proteins and biosynthetic cargo molecules are targeted by proteins containing specific ubiquitin recognition domains (Babst et al., 2000; Hofmann & Falquet, 2001). The recent identification of GASP as a protein that regulates sorting

9

of the ␦-opioid receptor to the degradative pathway suggests that non-covalent interactions with sorting proteins may also determine the fate of internalised GPCRs (Whistler et al., 2002). Recycling of the AT1A receptor has been reported to differ from that of the ␤2 -adrenergic receptor, because the internalised ␤2 receptor is rapidly recycled back to the cell surface whereas the AT1A receptor is recycled with slower kinetics (Anborgh et al., 2000; Hunyady et al., 2002; Oakley, Laporte, Holt, Barak, & Caron, 1999). Ubiquitylation may be a mechanism for regulation of the recycling properties of the individual GPCRs. As reported for receptor tyrosine kinase receptors, ubiquitin conjugation to GPCRs may be a signal for their lysosomal degradation (Raiborg et al., 2002). In the present study, substitution of all lysine residues in the relevant carboxyl-terminal tail segment caused increased accumulation of radiolabelled Ang II at a saturating (30 nM) hormone concentration, and this was more prominent during prolonged incubation (Fig. 5). Although the reason for this phenomenon is not yet known, it is tempting to speculate that decreased targeting of the receptor to a slow recycling pathway (or to lysosomes) increases rapid recycling, causing enhanced ligand accumulation after longer incubations. In conclusion, the present data indicate that ubiquitylation of the lysine residues in the cytoplasmic tail of the AT1A receptor is not required for agonist-induced endocytosis of the hormone–receptor complex, and suggest that mammalian GPCRs are internalised by a different mechanism than that of the yeast G protein-coupled mating factor receptors. Additional studies will be required to clarify the role of ubiquitylation in the intracellular processing and long-term down-regulation of the AT1A receptor and other mammalian GPCRs.

Acknowledgements The excellent technical assistance of Judit Bakacsiné Rácz and Katinka Süpeki is greatly appreciated. This work was supported in part by a Collaborative Research Initiative grant from the Wellcome Trust (051804/Z/97/Z), and by grants from the Hungarian Science Foundation (OTKA T-032179 and T-034606), the Hungarian Ministry of Welfare (ETT

10

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11

315/2000) and the Hungarian Ministry of Culture and Education (FKFP-0318/1999).

References Anborgh, P. H., Seachrist, J. L., Dale, L. B., & Ferguson, S. S. G. (2000). Receptor/␤-arrestin complex formation and the differential trafficking and resensitization of ␤2 -adrenergic and angiotensin II type 1A receptors. Molcular Endocrinology, 14, 2040–2053. Babst, M., Odorizzi, G., Estepa, E. J., & Emr, S. D. (2000). Mammalian tumor susceptibility gene 101 (TSG101) and the yeast homologue, Vps23p, both function in late endosomal trafficking. Traffic, 1, 248–258. Bonifacino, J. S., & Weissman, A. M. (1998). Ubiquitin and the control of protein fate in the secretory and endocytic pathways. Annual Review of Cell Development Biology, 14, 19–57. Claing, A., Laporte, S. A., Caron, M. G., & Lefkowitz, R. J. (2002). Endocytosis of G protein-coupled receptors: roles of G protein-coupled receptor kinases and ␤-arrestin proteins. Progress in Neurobiology, 66, 61–79. Conchon, S., Peltier, N., Corvol, P., & Clauser, E. (1998). A noninternalized nondesensitized truncated AT1A receptor transduces an amplified ANG II signal. American Journal of Physiology, 274, E336–E345. De Gasparo, M., Catt, K. J., Inagami, T., Wright, J. W., & Unger, T. (2000). International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors. Pharmacological Review, 52, 415–472. Ferguson, S. S. G. (2001). Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling. Pharmacological Review, 53, 1–24. Ferguson, S. S. G., Downey III, W. E., Colapietro, A. M., Barak, L. S., Menard, L., & Caron, M. G. (1996). Role of ␤-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science, 271, 363–366. Gáborik, Z., Mihalik, B., Jayadev, S., Jagadeesh, G., Catt, K. J., & Hunyady, L. (1998). Requirement of membrane-proximal amino acids in the carboxyl-terminal tail for expression of the rat AT1a angiotensin receptor. FEBS Letters, 428, 147–151. Gáborik, Z., Szaszák, M., Szidonya, L., Balla, B., Paku, S., Catt, K. J., Clark, A. J. L., & Hunyady, L. (2001). ␤-arrestinand dynamin-dependent endocytosis of the AT1 angiotensin receptor. Molecular Pharmacology, 59, 239–247. Goodman Jr., O. B., Krupnick, J. G., Santini, F., Gurevich, V. V., Penn, R. B., Gagnon, A. W., Keen, J. H., & Benovic, J. L. (1996). ␤-arrestin acts as a clathrin adaptor in endocytosis of the ␤2 -adrenergic receptor. Nature, 383, 447–450. Hershko, A., & Ciechanover, A. (1998). The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry, 67, 425–479. Hicke, L. (1999). Gettin’ down with ubiquitin: turning off cell-surface receptors, transporters and channels. Trends Cell Biology, 9, 107–112. Hicke, L., & Riezman, H. (1996). Ubiquitination of a yeast plasma membrane receptor signals its ligand-stimulated endocytosis. Cell, 84, 277–287.

Hicke, L., Zanolari, B., & Riezman, H. (1998). Cytoplasmic tail phosphorylation of the ␣-factor receptor is required for its ubiquitination and internalization. Journal of Cell Biology, 141, 349–358. Hofmann, K., & Falquet, L. (2001). A ubiquitin-interacting motif conserved in components of the proteasomal and lysosomal protein degradation systems. Trends in Biochemical Science, 26, 347–350. Hunyady, L., Baukal, A. J., Balla, T., & Catt, K. J. (1994a). Independence of type I angiotensin II receptor endocytosis from G protein coupling and signal transduction. Journal of Biological Chemistry, 269, 24798–24804. Hunyady, L., Bor, M., Balla, T., & Catt, K. J. (1994b). Identification of a cytoplasmic Ser–Thr–Leu motif that determines agonist-induced internalization of the AT1 angiotensin receptor. Journal of Biological Chemistry, 269, 31378–31382. Hunyady, L., Bor, M., Baukal, A. J., Balla, T., & Catt, K. J. (1995). A conserved NPLFY sequence contributes to agonist binding and signal transduction but is not an internalization signal for the type 1 angiotensin II receptor. Journal of Biological Chemistry, 270, 16602–16609. Hunyady, L., Balla, T., & Catt, K. J. (1996). The ligand binding site of the angiotensin AT1 receptor. Trends in Pharmacological Science, 17, 135–140. Hunyady, L., Catt, K. J., Clark, A. J. L., & Gaborik, Z. (2000). Mechanisms and functions of AT1 angiotensin receptor internalization. Regulatory Peptides, 91, 29–44. Hunyady, L., Baukal, A. J., Gáborik, Z., Olivares-Reyes, J. A., Bor, M., Szaszák, M., Lodge, R., Catt, K. J., & Balla, T. (2002). Differential PI 3-kinase dependence of early and late phases of recycling of the internalized AT1 angiotensin receptor. Journal of Cell Biology, 157, 1211–1222. Katzmann, D. J., Babst, M., & Emr, S. D. (2001). Ubiquitindependent sorting into the multivesicular body pathway requires the function of a conserved endosomal protein sorting complex, ESCRT-I. Cell, 106, 145–155. Kohout, T. A., Lin, F. S., Perry, S. J., Conner, D. A., & Lefkowitz, R. J. (2001). ␤-arrestin 1 and 2 differentially regulate heptahelical receptor signaling and trafficking. Proceedings of National Academic Science U.S.A., 98, 1601–1606. Krupnick, J. G., & Benovic, J. L. (1998). The role of receptor kinases and arrestins in G protein-coupled receptor regulation. Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 38, 289–319. Laporte, S. A., Oakley, R. H., Zhang, J., Holt, J. A., Ferguson, S. S. G., Caron, M. G., & Barak, L. S. (1999). The ␤2 -adrenergic receptor/␤-arrestin complex recruits the clathrin adaptor AP-2 during endocytosis. Proceedings of National Academic Science U.S.A., 96, 3712–3717. Marchese, A., & Benovic, J. L. (2001). Agonist-promoted ubiquitination of the G protein-coupled receptor CXCR4 mediates lysosomal sorting. Journal of Biological Chemistry, 276, 45509–45512. Oakley, R. H., Laporte, S. A., Holt, J. A., Barak, L. S., & Caron, M. G. (1999). Association of ␤-arrestin with G proteincoupled receptors during clathrin-mediated endocytosis dictates the profile of receptor resensitization. Journal of Biological Chemistry, 274, 32248–32257.

B. Mihalik et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 1417 (2002) 1–11 Obin, M. S., Jahngen-Hodge, J., Nowell, T., & Taylor, A. (1996). Ubiquitinylation and ubiquitin-dependent proteolysis in vertebrate photoreceptors (rod outer segments). Evidence for ubiquitinylation of Gt and rhodopsin. Journal of Biological Chemistry, 271, 14473–14484. Petaja-Repo, U. E., Hogue, M., Laperriere, A., Bhalla, S., Walker, P., & Bouvier, M. (2001). Newly synthesized human ␦-opioid receptors retained in the endoplasmic reticulum are retrotranslocated to the cytosol, deglycosylated, ubiquitinated, and degraded by the proteasome. Journal of Biological Chemistry, 276, 4416–4423. Polo, S., Sigismund, S., Faretta, M., Guidi, M., Capua, M. R., Bossi, G., Chen, H., De Camilli, P., & Di Fiore, P. P. (2002). A single motif responsible for ubiquitin recognition and monoubiquitination in endocytic proteins. Nature, 416, 451– 455. Qian, H., Pipolo, L., & Thomas, W. G. (2001). Association of ␤-arrestin 1 with the type 1A angiotensin II receptor involves phosphorylation of the receptor carboxyl terminus and correlates with receptor internalization. Molecular Endocrinology, 15, 1706–1719. Raiborg, C., Bache, K. G., Gillooly, D. J., Madshus, I. H., Stang, E., & Stenmark, H. (2002). Hrs sorts ubiquitinated proteins into clathrin-coated microdomains of early endosomes. Nature Cell Biology, 4, 394–398. Roth, A. F., Sullivan, D. M., & Davis, N. G. (1998). A large PEST-like sequence directs the ubiquitination, endocytosis, and vacuolar degradation of the yeast a-factor receptor. Journal of Cell Biology, 142, 949–961. Sachse, M., van Kerkhof, P., Strous, G. J., & Klumperman, J. (2001). The ubiquitin-dependent endocytosis motif is required for efficient incorporation of growth hormone receptor in clathrin-coated pits, but not clathrin-coated lattices. Journal of Cell Science, 114, 3943–3952. Shenoy, S. K., McDonald, P. H., Kohout, T. A., & Lefkowitz, R. J. (2001). Regulation of receptor fate by ubiquitination of activated ␤2 -adrenergic receptor and ␤-arrestin. Science, 294, 1307–1313. Shih, S. C., Sloper-Mould, K. E., & Hicke, L. (2000). Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors. EMBO Journal, 19, 187–198. Smith, R. D., Hunyady, L., Olivares-Reyes, J. A., Mihalik, B., Jayadev, S., & Catt, K. J. (1998). Agonist-induced phosphorylation of the angiotensin AT1a receptor is localized to a serine/threonine-rich region of its cytoplasmic tail. Molecular Pharmacology, 54, 935–941. Soubeyran, P., Kowanetz, K., Szymkiewicz, I., Langdon, W. Y., & Dikic, I. (2002). Cbl-CIN85-endophilin complex mediates

11

ligand-induced downregulation of EGF receptors. Nature, 416, 183–187. Strous, G. J., van Kerkhof, P., Govers, R., Ciechanover, A., & Schwartz, A. L. (1996). The ubiquitin conjugation system is required for ligand-induced endocytosis and degradation of the growth hormone receptor. EMBO Journal, 15, 3806–3812. Terrell, J., Shih, S., Dunn, R., & Hicke, L. (1998). A function for monoubiquitination in the internalization of a G protein-coupled receptor. Molecular Cell, 1, 193–202. Thien, C. B., & Langdon, W. Y. (2001). Cbl: many adaptations to regulate protein tyrosine kinases. Nature Reviews of Molecular Cell Biology, 2, 294–307. Thomas, W. G. (1999). Regulation of angiotensin II type 1 (AT1 ) receptor function. Regulatory Peptides, 79, 9–23. Thomas, W. G., Thekkumkara, T. J., Motel, T. J., & Baker, K. M. (1995a). Stable expression of a truncated AT1A receptor in CHO-K1 cells. The carboxyl-terminal region directs agonist-induced internalization but not receptor signaling or desensitization. Journal of Biological Chemistry, 270, 207–213. Thomas, W. G., Baker, K. M., Motel, T. J., & Thekkumkara, T. J. (1995b). Angiotensin II receptor endocytosis involves two distinct regions of the cytoplasmic tail. A role for residues on the hydrophobic face of a putative amphipathic helix. Journal of Biological Chemistry, 270, 22153–22159. Thomas, W. G., Motel, T. J., Kule, C. E., Karoor, V., & Baker, K. M. (1998). Phosphorylation of the angiotensin II (AT1A ) receptor carboxyl terminus: a role in receptor endocytosis. Molecular Endocrinology, 12, 1513–1524. Vinson, G. P., Ho, M. M., Puddefoot, J. R., Teja, R., Barker, S., Kapas, S., & Hinson, J. P. (1995). Internalisation of the type I angiotensin II receptor (AT1 ) and angiotensin II function in the rat adrenal zona glomerulosa cell. Endocrine Research, 21, 211–217. Waterman, H., & Yarden, Y. (2001). Molecular mechanisms underlying endocytosis and sorting of ErbB receptor tyrosine kinases. FEBS Letters, 490, 142–152. Werbonat, Y., Kleutges, N., Jakobs, K. H., & van Koppen, C. J. (2000). Essential role of dynamin in internalization of M2 muscarinic acetylcholine and angiotensin AT1A receptors. Journal of Biological Chemistry, 275, 21969–21974. Whistler, J. L., Enquist, J., Marley, A., Fong, J., Gladher, F., Tsuruda, P., Murray, S. R., & von Zastrow, M. (2002). Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science, 297, 615–620. Zhang, J., Ferguson, S. S. G., Barak, L. S., Menard, L., & Caron, M. G. (1996). Dynamin and ␤-arrestin reveal distinct mechanisms for G protein-coupled receptor internalization. Journal of Biological Chemistry, 271, 18302–18305.