Az asztroglia és a kötőszövet kapcsolata

Az asztroglia és a kötőszövet kapcsolata Doktori (PhD) értekezés

dr. Szabó Adrienn Témavezető: dr. Kálmán Mihály

Hivatalos bírálók: Dr. Glasz Tibor Dr. Deli Mária Szigolati bizottság tagjai: Elnök: Prof. Vígh Béla Titkár: Dr. Magyar Attila Tagok: Dr. Demeter Kornél Dr. Gerics Balázs Dr. L Kiss Anna

Semmelweis Egyetem Szentághotai János Doktori Iskola Budapest 2009

Tartalomjegyzék 1.Bevezetés

5. old.

2. Irodalmi háttér

6. old.

2.1. Gliasejtek oszályozása és jellemzése

6. old.

2.1.1. Asztroglia

6. old.

2.1.2. Az asztroglia módosulatai

7. old.

2.1.3. Oligodendroglia

8. old.

2.1.4. Mikroglia

8. old.

2.1.5. A perifériás idegrendszeri glia

9. old.

2.1.6. Az asztroglia markerei

9. old.

2.1.6.1. A GFAP (glial fibrillary acidic protein)

9. old.

2.1.6.2.Glutamin szintetáz és S100 protein.

10. old.

2.1.6.3. Vimentin és nesztin

11. old.

2.1.7.Gliafejlődés

11. old.

2.2. Az extracelluláris mátrix (ECM)

13. old.

2.2.1.Az extracelluláris mátrix komponensei

14. old.

2.2.1.1. Hialuronsav

14. old.

2.2.1.2. Proteoglikánok

14. old.

2.2.1.3. Adhéziós glikoproteidek: laminin és fibronektin 14. old. 2.3. Sejt és kötöszövet kapcsolata

16. old.

2.3.1. Integrinek

16. old.

2.3.2. A disztrofin-disztroglikán komplex

18. old.

2.3.2.1. A disztroglikán

18. old.

2.3.2.2. A disztrofin és izoformái

19. old.

2.3.2.3. Egyéb komponensek

21. old.

2.3.3 A lamina basalisról általában

22. old.

2.3.4 Lamina basalisok az agyban

23. old.

2.3.4.1. Asztrociták és az agyburok

23. old.

2.3.4.2. A perivaszkularis glia és a vér-agy gát

24. old.

2.4. Vaszkularizáció

26. old.

2.5. Reaktív gliózis

27. old. 2

3. Célkítűzések

28. old.

4. Módszerek

29. old.

4.1. Kísérleti állatok

29. old.

4.1.1. Műtét

29. old.

4.1.2. Feldolgozás

29. old.

4.2. Immunhisztokémiai reakció

29. old.

4.3. Képalkotás

31. old.

5.Eredmények:

32. old.

5.1 Intakt, kifejlett állatok

32. old.

5.1.1. Laminin

32. old.

5.1.2. Disztroglikán

32. old.

5.1.3. Disztrofin

35. old.

5.2. Fejlődő állatok

44. old.

5.2.1. A 12-15. embrionális napok

44. old.

5.2.2. A 16. embrionális naptól újszülöttkorig

45. old.

5.2.3. Az ötödik posztnatális napig

45. old.

5.2.4. A hetedik posztnatális napig

45. old.

5.2.5. A 12. posztnatális napig

48. old.

5.2.6. Gliovaszkuláris kapcsolatok megjelenése

51. old.

5.3. Reaktív gliózis

53. old.

5.3.1. Disztroglikán eltűnése és újbóli megjelenése a sérülést követően

58o.

5.3.2. Laminin immunreaktivitás megjelenése a sérülés körüli erekben.

58. old.

5.3.3. A laminin immunpozitivitás eltűnése

59. old.

5.3.4. Disztrofin a reaktív gliában

64. old.

5.3.5. Integrinek a reaktív gliában.

64. old.

6. Megbeszélés

66. old.

6.1. A laminin immunopozitivitás ill. –negativitás magyarázata

66. old.

6.2. A β-disztroglikán immunpozitivitás eltűnése a gliovaszkuláris kapcsolat „szétkapcsolódásának ” jele lenne?

70. old.

6.3. Kölcsönös erősítés a gliareakció és a gliovaszkuláris kapcsolat szétkapcsolódása között?

71. old.

3

6.4. A disztroglikán immunpozitivitásának nyomonkövetése segít meghatározni a sérülés utáni reakció szakaszait

72. old.

6.5. Dp71 eloszlása a kifelett patkány agyában

72. old.

6.6. A fejlődő állatok vizsgálata

74. old.

6.7. Integrinek

75. old.

7. Új kísérletes eredmények összegzése és következtetések

76. old.

7.1. Új kísérletes eredmények összegzése

76. old.

7.2 Következtetések

76. old.

8. Összefoglalás

77. old.

9. Summary

78. old.

10. Irodalomjegyzék

79. old.

11. Saját publikációk jegyzéke

100. old.

12. Köszönetnyilvánítás

102. old.

4

1. Bevezetés A többsejtű szervezetek sejtjei a szervezetet szövetekbe, szervekbe tömörülve építik fel (ez alól kevés kivételt találunk, ezek, az ún. sejthalmazos ill. álszövetes állatok). Huzella Tivadar meghatározása szerint a szövet közös eredetű, hasonló alakú és azonos működésű sejtek, és sejtközötti állomány történetileg kialakult egysége. A szövetek szerveződéséhez a sejteknek nem csak fel kell ismerniük a szomszédos sejteket, ill. az azokat körülvevő extracelluláris mártixot, hanem kapcsolatokat is kell velük létesíteniük. Ezek a sejtkapcsolatok dinamikus jellegűek, a kapcsolatok felbomlása és újraalakulása alapfeltétele az egyedfejlődés morfo- és hisztogenetikai folyamatainak. A sejtkapcsolatok tanulmányozása alapvető az olyan klinikai fontosságú folyamatokban, mint pl. a beágyazódás és placentaképződés, a tumorok, ill. a gyulladás terjedése, a sebgyógyulás, és a vaszkularizáció. A

sejtek

kapcsolódása

a

sejtfelszíni

receptorokkal

történik,

amelyek

gyakran

elektronmikoszkóppal is jól vizsgálható sejtfelszíni struktúrákat alakítanak ki. A központi idegrendszert a szervezet általános kötőszövetes terétől a glia választja el, amely a felszínen, és ezzel egybefüggően a behatoló erek mentén glia limitans-t képez. Ennek megfelelően a glia-kötőszövet kapcsolatok jelentős szerepet játszanak az agy fejlődésében, a fejlődő agy vaszkularizációjában. A központi és a perifériás idegrendszer egyik alapvető szövettani különbsége éppen az, hogy az előbbit egységes, közös glia limitans határolja, míg az utóbbi neuronjait környező gliasejtjeikkel külön-külön kapcsolódnak a kötőszövethez, aminek szerepe lehet az eltérő regenerációs képességben is. A kötőszövet sejtközötti állományához hasonló anyagok befolyásolják a sejtvándorlást és az axonnövekedést. Sérülés, gyulladás hatására a glia-kötőszövet kapcsolatok felbomlanak, majd a gyógyulás folyamán új kapcsolatok alakulnak ki, a revaszkularizáció, az új glia limitans, ill. a visszamaradó gliaheg kialakulásakor. A vaszkularizációnak fontos szerepe van az agyi tumorok növekedésében is.

5

2. Irodalmi háttér

2.1. Gliasejtek oszályozása és jellemzése A gliaféleségek jellemzésénél Hajós Ferenc (2008) összefoglalását vettük alapul. A neuroglia (glia görög szó, jelentése: ragasztó) kifejezést Rudolf Virchow német patológus használta először 1846-ban, ezzel illette az idegsejtek között húzódó területeket, amelyek hasonlónak tűntek számára az egyéb szervekben található kötőszövetekhez. Camillo Golgi olasz kutató vezette be a XIX. század hetvenes éveiben azokat a fémimpegráción alapuló festési módszereket, amelyek révén sikerült kimutatnia, hogy a neuroglia nagy számban tartalmaz jellegzetes, az idegsejtektől különböző sejtet. Santiago Ramón y Cajal spanyol neuroanatómus és tanítványa, Pio del Río Hortega továbbfejlesztették a fémimpregnációs eljárásokat, és a gliasejtek osztályozására egy olyan rendszert dolgoztak ki, amely lényegében máig érvényes.

2.1.1. Asztroglia Az asztrogliára jellemző, hogy GFAP –t (glial fibrillary acidic protein) tartalmaz, vagy bizonyos funkcionális állapotban képes expresszálni. Az asztroglia funkciói: -

az idegsejtek és nyúlványaik szabad felszínének borítása, szigetelése;

-

a központi idegszövet stuktúrájának stabilizálása, a neuronok közötti tér kitöltése;

-

az

idegsejtek

anyagcseréjében

való

részvétel,

pl.

glukóztranszport,

glutaminképzés; -

kálium és más ionok felvétele és leadása az extracelluláris térből, ill. egyenletes elosztásuk, ezáltal a központi idegrendszer homeosztázisának biztosítása;

-

transzmitter-felvétel az extracelluláris térből;

-

anyagfelvétel és -transzport a subarachnoidális térből;

-

az elpusztult szinapszisok fagocitálása;

-

reakciók a környező neuronokat ért ártalmakra;

-

sérülések után s központi idegrendszeri heg képzése;

6

-

a vér-agy gát indukálása, fenntartása;

-

a pre- és posztnatális idegsejt-vándorlás, idegrostnövekedés irányítása.

Az asztrocitáknak két típusát ismerjük. Az egyik a rostos asztrocita, amely elsősorban a fehérállományra jellemző, és hosszú vékony nyúlványokkal rendelkezik, míg a másik a plazmás asztrocita, cytoplazmában gazdag sejttestéből viszonylag kevés nyúlvány ered, de ezek sokszorosan elágazódnak, és dús, bokros ágrendszert alkotnak. A plazmás asztrocita elsősorban szürkeállományban fordul elő. Az asztrociták nyúlványainak végtalpai a központi idegrendszert majdnem hézagmentesen körülveszik, és elválasztják mind az agyburkoktól (membrana limitans gliae superficialis), mind az erektől (membrana limitans gliae perivascularis), a két rendszer tkp. összefügg az ereknek az agyba való belépésénél

2.1.2. Az asztroglia módosulatai: I. Helyzetük, speciális funkcióik szerint beszélhetünk pl. perivaszkuláris, periszinaptikus, perinodális (a mielinhüvely Ranvier-befűződéseinél) asztrocitákról. Speciális gliasejtek a neurohipofízis pituicitái és a tobozmirigy ún. intersticiális sejtjei. II. A radiális glia az asztroglia korai formája, mind a törzsfejlődésben, mind az egyedfejlődésben. Ennek hosszú sejtjei (’rostjai’) a velőcső kamrai oldalán lévő sejttestekből indulnak, arra merőlegesen azaz sugárirányban), átérik az agyfalat, és merőlegesek az agyburki felszínre is. Szerepük van a sejtmigráció irányításában, a fejlődő neuronok helyükre juttatásában, sőt, újabb adatok szerint magában a sejtképzésben is. A radiális glia speciális fajtái: a) A Bergmann glia a kisagykéreg azon asztroglia jellegű sejtjeinek neve, melyek sejtteste a ganglionáris rétegben van, míg nyúlványaik a molekuláris rétegen keresztül merőlegesen futnak a felszín felé. b) A tanycyták a központi idegrendszer üregeinek jellegzetes sejtjei, melyek a kamrai felszínt kötik össze a mélyebben fekvő erekkel vagy a külső felszínnel. c) A Müller glia a retinát radiális glia módjára átfogó kétnyúlványú sejt, melynek sejtmagja a retina belső szemcsés rétegében található. A vékony perifériás nyúlvány a fotoreceptorok tövénél zonula okkludenszekkel kapcsolt záróréteget (membrana limitans

7

externa) alkot. A vastag, külső nyúlvány a retina belső felszínét oszlopos végtalpakkal zárja le (membrana limitans interna). III. Az ependima a canalis centralis és az agykamrák falát bélelő hengerhámszerű sejtekből áll, amely embrióban kinociliumokkal, másutt mikrovillusokkal borított felszínnel határolja el a kamraüreget. Egyesek szintén az asztrogliához sorolják, míg mások önálló gliatípusként tartják számon. A sejtek bázisáról nyúlványok indulhatnak, amelyek radier módon távolodnak az agyfelszíntől, és vastagabb agyállomány esetében hosszabb-rövidebb lefutás után elvesznek. Egyes helyeken az ependima többrétegűvé válik, és a kamra ürege felé bedomborodó ependimaszerveket képez (pl. a szubkommissszurális szerv).

2.1.3. Oligodendroglia Az oligodendroglia legismertebb funkciója a mielinhüvely képzése és fenntartása. Az oligodendrocitáknak kevés nyúlványa van (innen a nevük). A nyúlványok mindegyike, kis kiszélesedéssel egy közelben levő axonon rögzül, és mielinhüvelyt formál körülötte. Léteznek azonban olyan oligodendrociták is, amelyek nem vesznek részt mielinburok képzésében, hanem ún. perineuronális oliodendrociták (szatellita sejtek). Általában az oligodendrogliához sorolják az utóbbi években sokat vizsgált ún. NG-2 sejteket, amelyek nevüket sejtmembránjuk jellegzetes proteoglikánjáról kapták. Szerepük még kevéssé ismert, a glia-utánpótlásban, ill. a gliareakciókban lehet jelentőségük.

2.1.4. Mikroglia A Hortega-féle mikroglia hosszúkás magvú, két, három főnyúlvánnyal rendelkező sejt. A nyúlványok finom, tüskés jellegű további ágakra bomlanak. A sejtek gyakran közeli kapcsolatban állnak a vérerekkel. Kóros viszonyok között ezek a sejtek a leginkább változékonyak, sőt kifejezetten változtatják a helyüket, és élénk fagocitatevékenységre képesek. Mezenchimális eredetűek, a monocita sejtvonalból származnak. Embrionális korban végrehajtott inváziójuk során egyenletesen eloszlanak az agy parenchimájában, minden sejtnek kialakul a saját, meghatározott területe. Sérülések esetén további

8

monociták vándorolhatnak be, és alakulhatnak mikrogliává. A mikroglia-sejtek immunkompetens sejtek, olyan, az immunválasz szempontjából fontos fehérjéket képesek felszínükön expresszálni, mint pl. a MHC II. . 2.1.5. A perifériás idegrendszeri glia Schwann-sejtek. Lehetnek mielinhüvelyképzők, vagy nem-mielinhüvelyképzők. Utóbbiakba az axonok csak beágyazódnak. Szatellita sejtek mind az érző, mind a vegetatív dúcokban a neuronok perikarionját, és ahol van a dendritek tövét is, egy rétegben körülvevő ellapult sejtek. A szatellita sejteknek szerepük van a neuronok anyagcseréjének segítésében, ill. izolálják az egymás melletti perikarionokat. Különleges, újabban sokat vizsgált típusok: Enterális glia a tápcsatorna idegfonataiban fordul elő. Olfactory nerve ensheathing cells (ONEC) a szaglófonalakat borítja, mintegy átmenet a központi és a perifériás glia között. Felhasználásához sok reményt fűztek az idegpályák regenerációjával kapcsolatos kísérletek során.

2.1.6. Az asztroglia markerei 2.1.6.1. A GFAP (glial fibrillary acidic protein) A GFAP expressziója az érett asztrogliára jellemző, ma az asztroglia alapvető marker fehérjéjének tekintjük (Bignami és mtsai 1972, Dahl és mtsai 1986, Eng 1985). Mindazokat a központi idegrendszeri elemeket, amelyek megfelelő inger hatására képesek GFAP-t expresszálni, vagy az ilyen sejtek elkötelezett előalakjai, az asztrogliához sorolhatjuk. Sem a mikrogliában, sem az oligodendrogliában nem fordul elő GFAP, kimutatható viszont azonban az oligodendroglia egyik progenitor sejtjében, amelyből adott körülmények között még asztrocita is fejlődhet (O-2A prekurzor, Cameron és Rakic 1991, Raff és Miller 1984; Raff és mtsai 1983). A bulbus olfactorius ONEC sejtjei is képesek GFAP-t expresszálni (Doucette 1984, 1991, Ramon-Cueto és Nieto-Sampedro 1992), épp úgy, mint a corpus pineale gliasejtjei (Müller és mtsai 1978) ill. a pituiciták (Redecker és Morgenroth 1989). Az emlősök ependimáját néhányan GFAP- mentesnek találták (DeVitry és mtsai 1981, Ludwin és mtsai 1976).

9

A GFAP alegységekből épül fel, az alegységeknek ’feje’, ’nyele’, és ’farka’ van. Az alegységek molekulatömege kb 50 kDa, ebből kb. 40 kDa a proteolízis rezisztens mag. Az Nterminális feji domén jelenléte szolgál a filamentumok tetramerekből történő felépüléshez, míg a C-terminális farki rész szolgál az egyéb fehérjékhez való kapcsolódáshoz. A GFAPalegységek egy kritikus koncentráció felett spontán összeállnak filametumokká. A GFAP-nak a teljes génszekvenciája ismert, amely különböző mRNS-ek létrejöttét kódolja. A központi idegrendszerben túlnyomó többségben az ún. α-GFAP van, míg a perifériásban a β (Zelenika és mtsai 1995). Immun-elektromikroszkópos

vizsgálatok

szerint

az

asztrocitákban

a

GFAP

filamentumok ott vannak jelen a legnagyobb mennyiségben, ahol a glianyúlványok egymással, valamint neuronokkal és vaszkuláris ill. meningeális lamina basalissal kapcsolatot létesítenek (Nakazawa és Ishikawa 1998, Rutka és mtsai 1997). Ugyancsak immunelektronmikroszkópiai vizsgálatok igazolták (Hajós és Halasy 1998), hogy a GFAP-nek a fibrillumba épült alegységei is adnak immunhisztokémiai reakciót, nem csak a szabadok, mint eleinte egyesek hitték. A GFAP knock-out (amelyekben a GFAP-t kódoló gén hiányzik) állatokon végzett kísérletek szerint károsodott a vér-agy gát (Pekny és mtsai 1998). Lepekhin és mtsai (2001) eredményei szerint, a dupla mutáns (GFAP/vimentin) állatok esetében a nyúlványképzés, a motilitás, a gliaheg képzés károsodik. A GFAP és a vimentin hiánya külön külön nem, de együttesen megakadályozza a reaktív gliózis kialakulását in situ (Pekny és mtsai1998). A GFAP eloszlása az agyban egyenetlen (Hajós és Kálmán 1989, Kálmán és Hajós 1989, Ludwin és mtsai 1976, Zilles és mtsai 1991), számos területen szinte hiányzik (pl. colliculusok, kéreg középső rétegei). Az egyenlőtlen eloszlást mennyiségi mérések is igazolták (Patel és mtsai 1985). Sérülések hatására azonban az eredetileg GFAP negatív területeken is megjelenik a GFAP-immunpozitivitás az asztrocitákban (Bignami és Dahl 1976). Hozumi és mtsai (1990ab) mennyiségi mérésekkel is igazolták, hogy a GFAP immunpozitivitás megjelenésével egyidejűleg a GFAP mRNS-szint és a GFAP-szint is fokozódik sérülés hatására. 2.1.6.2.Glutamin szintetáz és S100 protein. Mivel a GFAP nem feltétlenül expresszálódik, más markerra is szükség lehet. Például a glutamát-szintetáz, amely a glutamát ill. az ammónium ionok megkötésével kapcsolatos. Egy másik marker az S-100β fehérje, egy kálcium kötő fehérje, az asztroglia kalciumszintjének egyik szabályozója, amelynek a GFAP filamentumok fel- és leépülésének

10

szabályozásában van szerepe. A glutamin-szintetáz előfordulását Martinez-Hernandez és mtsai (1977), az S-100β-ét Ludwin és mtsai (1976) bizonyították. A GFAP immunfestése a központi idegrendszerben biztosan asztrogliát mutat ki, de nem minden esetben mutatja ki az asztrogliát. A glutamin-szintetáz és az S-100β a GFAPmentes sejtekben is kimutatható, de nem biztos, hogy minden kimutatott sejt asztroglia (Goto és mtsai 1988, Monzon-Mayor és mtsai 1998). Újabb jellegzetes, markerként használható fehérjék a glutamát traszportere (GLAST Rothstein és mtsai 1994) vagy a gap junction-ök konnexin 43-ja (Rohlmann és mtsai 1993). 2.1.6.3. Vimentin és nesztin Az asztroglia-sejtek intermedier filamentumként tartalmazhatnak vimentint és nesztint is. A vimentin mind molekulasúlyában, mind felépülésének és lebomlásának szabályozásában hasonlít a GFAP-ra. Először fibroblasztokban ítrák le (Brown és mtsai 1976). Az emlősök központi idegrendszerében elsősorban a fejlődés során van jelen, a radiális gliában. Az érett agyszövetben csak egyes helyeken található meg (Bergmann glia, corpus callosum, Dahl és mtsai 1981, Pixley és deVellis 1984, Schnitzer és mtsai 1981), de újra megjelenik a sérülést követő gliareakcióban (Dahl és mtsai 1982, Janeczko 1993). A nesztin a neuroepitheliális eredetű sejtek éretlen formáinak intermedier filamentuma (Lendahl és mtsai 1990, Levison és Goldman 1993, Rao 1999). Számos éretlen asztrocita alakban előfordul, így a radiális gliában is (Hockfield és McKay 1985), és a glia prekurzor sejtekben (Rao és Mayer-Proschel 1997). Re-expresszióját mutatták ki a reaktív gliában is (Clarke és mtsai 1994, Frisén és mtsai 1995). Meg kell említeni, hogy a vimentin, nesztin és GFAP általában ’hibrid’ fonalakként létezik, és amikor pl. ’vimentin filamentumról’ beszélünk, ez tkp. a domináns elemre utal (Eliasson és mtsai 1999, Marvin és mtsai 1998, Quinlain és Franke 1983, Quinlain és Stewart 1991). 2.1.7.Gliafejlődés A legfejlettebb idegrendszerekre (emlősök, madarak) jellenmző, hogy az asztrogliasejtek döntő többsége független a kamrafaltól, nem ependimális. Speciális gliatípusok vannak a különböző feladatokra (ld. 2.1.2) de a domináns sejttípus csillag alakú, nyúlványaik egyenrangúak a tér minden irányában. A kamrát külön sejttípus, ependima béleli. Az egyedfejlődés során azonban radiális gliát találunk (leírását ld. 2.1.2.), akárcsak a legtöbb gerincesben egész életén át. A sejttest ilyenkor még ependimafunkciót, míg a nyúlvány asztrocitafunkciót lát el. A radiális glia szerepe alapvető a sejtvándorlás ill. a korai

11

axonnövekedés irányításában, újabb nézetek szerint az idegsejt-előalakok termelésében is (azaz tkp a radiális glia lenne az idegrendszeri ’őssejt’, Alvarez-Buylla, 2001, Alvarez-Buylla és mtsai 1988, Doetsch és mtsai 1999, Doetsch 2003, Malatesta és mtsai 2000, Miyata és mtsai 2001, Noctor és mtsai 2001). Az éretlen asztroglia-szerkezet felváltása az érettel két alapvető lépést foglal magában: a) radiális glia felváltása valódi asztrocitákkal: az egyirányban orientált, ependimális eredetű nyúlványrendszer felváltása extraependimális sejtekből induló, a tér minden irányába nyúló nyúlványrendszerrel. Szétválik az ependima- és asztrocitafunkció, az agyfalon átnyúló oszlopszerű gliasejt-territóriumok helyett kisebb, sokszögletű, közel gömbölyű territóriumok alakulnak ki. b) a nesztin és a vimentin felváltása GFAP-vel. Mindkettő a 2-3. posztnatális héten megy végbe (Akers 1977, Kálmán és Ajtai 2001, Pixley és deVellis 1984, Stichel és mtsai 1991). Ezek az átalakulások a fő neuronvándorlások és pályanövekedések lezajlása után következik be. Ezek irányításában alapvető szerepe van a gliának, növekedési faktorok és pálya-szignalizációs molekulák képzése mellet az extracelluláris mátrixbann szerepet játszó anyagok (ld. alább) termelésében, amelyek a felületeket növekedésre, vándorlásra alkalmassá, vagy alkalmatlanná teszik. A radiális glia eltűnése után is folyik glia-utánpótlás az ependima alatt elhelyezkedő szubventrikuláris zónából, asztrocitáké és oligodendrogliáé egyaránt (Gressens és mtsai 1992, Holmin és mtsai 1997, Levison és Goldman 1993, Zerlin és mtsai 1995) sőt, újabb adatok szerint neuronutánpótlás is (Doetsch és mtsai 1999, Doetsch 2003, Seri és mtsai 2001). A szubventrikuláris zóna legkiterjedtebb része az, amelyik az oldalkamra elülső szarvában, a corpus callosum, és a nucleus causatus közötti szöglet mentén található (1. ábra). Itt a sejtközötti állomány összetétele is sajátságos, az embrionális agyra emlékeztető (Gates és mtsai 1995, Quiñones-Hinojosa és mtsai 2006).

1. ábra. A szubventrikuláris zóna vázlatos rajza.

12

2.2. Az extracelluláris mátrix (ECM) Az idegrendszeri extracelluláris mártix alapvető jelentőségű a sejtvándorlásban (ld. pl. Steindler és mtsai 1989), az axonnövekedésben (Fitch és Silver 1997, Tessier-Lavigne és Goodman 1996, Bovolenta és Fernaud-Espinosa 2000), a vaszkularizációban (Bischoff 1997, Risau 1997, Risau és Lemmon 1988), a sérülés utáni reakciókban (Berry és mtsai 1983, Malhotra és mtsai 1993, Fitch és Silver 1997, McKeon és mtsai 1991, 1999). Az extracelluláris mátrixot és a lamina basalist, amely a központi idegrendszert az agyburkok és az erek felé határolja, az asztroglia termeli (Bernstein és mtsai 1985, Celio és Blümcke 1994, Chiu és mtsai 1991). Azonos vagy hasonló molekulákból épülnek fel, mint a szervezet más részein (ld. 2. ábra). Az extracelluláris mátrix a központi idegrendszerben nem szabadon helyezkedik el, hanem vékony rétegben szorosan a gliához kapcsolva. Általános leírását ld. pl. Aumailley és Gayraud (1998), Carbonetto (1984), Celio és Blümcke (1994), Dow és Wang (1998).

2. ábra Az extracelluláris mátrix komponensei: Jobbra az extracelluláris mátrixnak a lamina basalishoz (ld. még 2.3.3, ill. 7. ábra) való kapcsolódása látszik. Balra a lamina basalis összetétele: hosszú hialuronsav molekulákhoz kémcsőkefeszerű proteoglikán molekulák kapcsolódnak, amelyek egy ’core protein’-ből és glikozaminoglikán (GAG) oldalláncokból állnak. Ehhez a rendszerhez kapcsolódnak a vastag kollagén rostok.

13

2.2.1.Az extracelluláris mátrix komponensei: 2.2.1.1. Hialuronsav Glukuronsav és acetilglikozamin alegységekből álló, rendkívül hosszú, hatalmas vízkötő képességű glikozaminoglikán. Kötőfehérjéi: a hialuronektin (fibronektinszerű) ill. verzikánszerű proteoglikánok: gliális hialuronsav-asszociált protein GHAP, BHN (brainspecific hyaluronectin), hialektánok (Bighami és Dahl 1986, 1988, Bignami és mtsai 1989, 1992). 2.2.1.2. Proteoglikánok Két fő komponensük van: egy ún. „core-protein” és annak kémcsőkefeszerűen elhelyezkedő glikozaminoglikán oldalláncai (2. ábra). A glikozaminoglikán a hialuronsavhoz hasonlóan

savas

diszacharidszármazék

alegységekből

álló

láncszerű

molekula

(kondroitinszulfát, dermatánszulfát, heparánszulfát, keratánszulfát).

2.2.1.3. Adhéziós glikoproteidek: laminin éa fibronektin A laminin a sejteket körülvevő lamina basalisok alkotója. A lamininnel kapcsolódnak a sejtmembrán komponensei közül az integrinek, és a nem integrin típusú laminin-receptorok, mint pl. a disztroglikán (ld. később). A laminin (3. ábra) három alegységből épül fel (α, β, γ) amelyeknek több izoformája van, ezeket számokkal jelöljük.

3. ábra. Bal oldalán a lamininek három alegységből álló, kereszt alakú molekulája látható. (www.fullfile.us). A sejhez, a proteoglikánhoz, ill. a kollagén rostokhoz való kapcsolódásért más-más kötőhely felelős. Az ábra jobb oldalán látható integrin két alegységből (alfa és béta) álló transzmembrán fehérje, amely felismeri és köti az extracelluláris mátrix adhéziós fehérjéinek RGD-részletét. Az integrin citoplazmatikus vége a citoszkeletonhoz kapcsolódik az aktinkötő fehérjéken keresztül. (www.dan1. medikem.gu.se ). 14

A különböző alegységek kombinációjából 15 féle laminin molekula jöhet létre (1. táblázat) (Colognato és Yurchenko 2000, Libby és mtsai 2000). A három alegység összefonódva egy kereszt alakú molekulát alkot (3. ábra). A laminin tartalmaz egy jellegzetes arginin-glicin-aszparaginsav (ún. RGD) szekvenciát, amelyet a sejtmembrán receptorai felismernek, és kapcsolódnak hozzá. A laminin az általános, mindenhol jelenlévő részvevője a lamina basalisnak (összefoglaló: Colognato és Yurchenko 2000, Hallman és mtsai 2005), épp úgy, mint a laminin receptorok, amelyek elengedethetetlenek az extracelluláris mátrix létrejöttéhez. Az asztrociták főleg laminin-1 és –2-t termelnek (Chiu és mtsai 1991), de csak bizonyos helyeken, ill. sérülés (gliareakció, ld. 2.5. fejezet) esetén. Említésre méltó, hogy laminin immunpozitivitás megjelenhet a neuronokban (!) is (Hagg és mtsai 1989, 1997, Jucker és mtsai 1992, 1996a, Powell és Kleinman 1997, Yamamoto és mtsai 1988, Zhou 1990), ennek molekuláris háttere és biológiai szerepe még nem ismert. A lamininnel rokon szignál-molekulák a netrinek. 1.táblázat: laminintípusok és felépítésük. TÍPUS LAMININ-1 LAMININ-2 LAMININ-3 LAMININ-4 LAMININ-5 LAMININ-6 LAMININ-7 LAMININ-8 LAMININ-9 LAMININ-10 LAMININ-11 LAMININ-12 LAMININ-13 LAMININ-14 LAMININ-15

ALFA 1 2 1 2 3 3 3 4 4 5 5 2 3 4 5

BÉTA 1 1 2 2 3 1 2 1 2 1 2 1 2 2 2

GAMMA

1 1 1 1 2 1 1 1 1 1 1 3 3 3 3

A számok az egyes láncok különböző típusait jelzik, ezek kombinációjából épülnek fel a bal olszopban lévő sorszámmal ellátott lamininek (Colognato és Yurchenko 2000 nyomán, Libby és mtsai szerint (2000) kiegészítve). A fibronektin elsősorban a kötőszöveti rostokat kapcsolja össze az extracelluláris mátrix többi komponensével, így háromdimenziós térhálózatot hoz létre. Tartalmaz RGD 15

szekvenciát, így sejtekkel is kapcsolódik, segitve letapadásukat, ill. a sejteket összekapcsolja a kötőszöveti rostrendszerrel. Egyes szövetekben speciális típusai (kondronektin, vitronektin) fordulnak elő. 2.3. Sejt és kötöszövet kapcsolata 2.3.1. Integrinek Az integrinek transzmembrán fehérjék, amelyek felismerik és kötik az extracelluláris mátrix adhéziós fehérjéit. Kétféle alegységből (alfa és béta) álló, nem kovalensen kapcsolt heterodimer glikoproteinek. Mindegyik alegységnek három doménje van: egy nagy extracelluláris, egy membránt áthidaló és egy általában rövid citoplazmatikus domén. Az emlős sejtekben legalább 15 féle α- és legalább 8 féle β-alegység kombinálódhat egymással, megszabva a ligandkötés specificitását (Milner és Campbell 2002a). Egyesek csak egy ligandot kötnek, mások az extracelluláris fehérjék széles skálájával (fibronektin, laminin, kollagének) léphetnek kapcsolatba. Az integrinek extracelluláris doménje a ligand egy rövid szekvenciáját, a már említett RGD-t ismereik fel, és kötik meg. Ez a szekvencia nagyon sok fehérjében előfordulhat, de a polipeptidlánc egyéb szakaszai illetve térszerkezete erősen befolyásolják a kötődési képességet. Az integrin citoplazmatikus vége a citoszkeletonhoz kapcsolódik az aktin kötő fehérjéken keresztül (vinculin, talin, stb.), ezáltal az integrin mintegy hidat képez az extracelluláris és az intracelluláris rostozat között, azokat egyetlen szerkezeti és funkcionális egységgé „integrálja” (3. ábra). Egyidejűleg továbbítja a sejt felé az adhéziós molekulával való kötődés tényét, a sejt erre jellemző válaszát provokálva. Számos humorális faktorról mutatták ki, hogy receptora kapcsolatban áll valamely integrinnel. Az integrineknek az agyban játszott szerepére nézve ld. pl. Del Zoppo és Hallenbeck (2000), Del Zoppo és Mabuchi (2003), Del Zoppo és Milner (2006), Del Zoppo és mtsai (2006), Milner és Campbell (2002ab), Wagner és mtsai (1997). Az

integrinek

előfordulhatnak

diffúz

eloszlásban

a

sejtfelszínen,

vagy

csoportosulhatnak egy membránrégióban. Ennek két típusa van (4. ábra). Az egyik az adhéziós plakk (vagy fokális kontaktus, amely az amöboid módon mozgó sejtek (egysejtűek, kötőszöveti sejtek, sejtkultúrák sejtjei) ideiglenes letapadási helyein alakul ki. Az adhéziós plakkhoz a citoplazma aktin filamentumai kapcsolódnak belülről az aktin kötő fehéjék (vinculin, talin, paxilin, tenzin) segítségével. (Itt jegyezzük meg, hogy az aktint

16

horgonyzó sejt-sejt kapcsolatok közül gliában általában a leggyengébb formát, az ún. punctum adherenst találjuk, Mugnaini 1986, Wolfburg és Risau 1995). A másik fajta kapcsolat a hemidezmoszóma amelyhez intermedier filamentumok horgonyzódnak ki a citoplazmatikus oldalon. Ez a típus azonban az asztrocitákban igen ritka.

4.

ábra.

Integrin

szerepe

a

sejtkapcsolatokban.

Balra

fokális

kontaktus:.

Intracellulárisan aktin kapcsolódik hozzá, vinkulin, talin és α-aktinin segítségével. Extracellulárisan fibronektin kapcsolódik az integrinhez. Jobbra hemidezmoszóma, amelyhez intermedier filamentumok horgonyzódnak ki a citoplazmatikus oldalon, míg extracellulárisan a lamina basalisban komponenseit látjuk (ld. később). (www.anatomy.iupui.edu). Nakazawa és Ishikawa (1998) találtak hasonlót, amelyben a glia limitanst alkotó asztrocita nyúlványok belső felszínén elektrodenz anyag található, amelyben sok plektint mutattak ki. Ebben végződnek a GFAP filamentumok, egymás vagy a meningeális kötőszövet felé dezmoszóma, ill. hemidezmoszóma jellegű kapcsolatokat kialakítva. Mások feltételezik, hogy a dezmoszóma fehérjéi csak keratinnal képesek kapcsolatot kialakítani GFAP-val, vagy vimentinnek nem (Rungger-Brandle és mtsai 1989). Vannak ezenkívül ún. ’point contact’-ok, olyan integrin tartalmú adhéziós helyek, amelyek különböznek méretben és eloszlásban a fokális kontaktustól (Tawil és mtsai 1993). A fokális kontaktusban a sejtek erősen az extracelluláris mátrixhoz kötődhetnek, és csökkentik a sejtek mozgékonyságát (Luna és Hitt 1992), míg a ’point contact’ olyan sejtekre jellemző, amelyek igen mozgékonyak. Több tanulmány is leírja, hogy a ’point contact’-ban a β1 integrin foszforilált formában található, míg a fokális kontaktusban ez nincs jelen. (Johansson és mtsai 1994). Az agyi erekben igen sokféle integrin játszhat szerepet. Ezek végigvizsgálását, esetleges változásait a fejlődő ill. műtéti sérülésnek alávetett állatokban nem tűzhettük ki 17

célul. Az αV, és a β1 a komponenseket választottuk, amely Milner és Campbell (2002a) szerint a legtöbb β- ill. α- komponenssel párt képez. 2.3.2. A disztrofin-disztroglikán komplex:

2.3.2.1. A disztroglikán A nem integrin típusú laminin-receptorok közül a legfontosabb a disztroglikán. A disztroglikánt, akárcsak a disztrofint, eredetileg az izomban írták le, később más szövetekben is (beleértve a központi idegrendszert Henry és Campbell 1999). Durbeej és mtsai (1998) azt találták, hogy a disztroglikán egy mindenhol jelen lévő sejfelszíni receptor, és szerepe van a sejteknek a basalis membránhoz való kötésében a felnőtt szövetekben (5. ábra).

5. ábra. A disztroglikán-disztrofin komplex sematikus rajza. A β-disztroglikán transzmembrán fehérje, sejten belüli részéhez a disztrofinon keresztül aktin kapcsolódik. A disztrofinnak több formája van (ld. később), az agyban a leggyakoribb a Dp71. A sejten belül a komplex részei még a disztrobrevin, ill. a szintrofin (syn). Utóbbi felelős a víz- (akvaporin, az agyban az AQP4) és egyes ioncsatornák (Kir4.1) elhelyezkedéséért. Az α-disztroglikán kapcsolja a βdisztroglikánt a lamina basalis komponenseihez (laminin, agrin). Amiry-Moghaddam és mtsai (2004) nyomán. A disztroglikánt egy gén kódolja amely egy poszttranszlációs lépésben α és βdisztroglikánra hasad (Ibraghimov-Bereskovnaya és mtsai 1992, Smalheiser és Kim 1995). Αz α-disztroglikán egy erősen glikozilált extracelluláris fehérje, amely lamininhez és más extracelluláris fehérjékhez kötődik, pl. agrinhez, perlekánhoz. A β-disztroglikán egy 18

transzmembrán fehérje, amely a α-disztroglikánt a sejtmembránhoz horgonyozza. A βdisztroglikán másik vége a disztrofin-disztroglikán komplex magját képezi. A disztroglikándisztofin komplexum három részből áll: a disztroglikán, a szarkoglikán komplexum a szarkoszpánnal, és a citoplazmatikus komplexum. Az utóbbi részei a szintrofinok (α1-2,β12,γ1-3 és a disztrobrevinek (α1-2,β) (Chamberlain 1999, Culligan és Ohlendick 2002, Ehmsen és mtsai 2002, Henry és Campbell 1999, Montanaro és Carbonetto 2003, Moukhles és Carbonetto 2001, Saito és mtsai 1999). A disztroglikán-disztrofin komplex a perivaszkuláris glia-végtalpakon is megtalálható (Culligan és mtsai 2001, Hallmann és mtsai 2005, Milner és mtsai 2008, Tian és mtsai 1996), amely

elengedhetetlenül

szükséges

a

gliavaszkuláris

kapcsolat

kialakulásához.

A

disztroglikán immunfestése az agyi ereket jól kirajzolja (Milner és mtsai 2008, Tian és mtsai 1996, Uchino és mtsai 1996, Zaccaria és mtsai 2001). 2.3.2.2. A disztrofin és izoformái A disztrofinokat a DMD (Duchenne Muscular Dystrophy) gén kódolja, amelynek mutációs elváltozása a régóta ismert Duchenne és Becker típusú izomsorvadáshoz vezet (Emery 1989). A betegek egyharmadában súlyos kognitív deficit is jelentkezik. Azoknál a kísérleti rágcsálóknál, amelyeknél a betegséget modellezték (mdx model), mind viselkedésbeli, mind biokémiai zavarokat is megfigyeltek (összefoglaló: Anderson és mtsai 2002, Montanaro és Carbonetto 2003). Ez arra utalt, hogy a disztrofinoknak fontos szerepe van a központi idegrendszerben is. A disztrofin aktin-kötő fehérje, a spektrin-szupercsalád tagja. Míg az N-terminális domén aktinfilamentumokat köt, a C-terminális domén a disztroglikánhoz kapcsolódik. A DMD gén több promoterrel rendelkezik (6. ábra). Egyes promoterek rövidebb proteineket eredményeznek, amelyeknek a N-terminális végéről többkevesebb aminosav hiányzik (Bar és mtsai 1990, Gorecki és mtsai 1992, Lederfein és mtsai 1992, Winder 1997). Ezeket a fehérjéket molekulatömegük alapján különböztetjük meg: Dp 260, Dp 140, Dp 116, Dp 71, a teljes láncú disztrofin a Dp 427 (ti. kDa). A központi idegrendszerben megtalálhatók a Dp 140 és a Dp 71 variánsok, akárcsak a Dp 427 (Lidov 1996). A Dp 116-ot a perifériás idegrendszerben mutatták ki Saito és mtsai (1999), Yamada és mtsai (1996). A Dp 260 csak a retinában fordul elő (D’Souza és mtsai 1995). A Dp71 bizonyult a leggyakrabban előforduló fehérjének a disztrofin család tagjai közül, jelenlétét a legtöbb nem-izom jellegű szövetben bizonyították (Austin és mtsai 1995,

19

Bar és mtsai 1990, Ceccarini és mtsai 1997, Greenberg és mtsai 1996, Lederfein és mtsai 1992, Rapaport és mtsai 1992).

6. ábra. A DMD gén sematikus rajza. A DMD gén több promoterrel rendelkezik, ezek különböző

hosszúságú

disztrofin

molekulákat

(Dp)

eredményeznek,

amelyek

molekulatömegük alapján különböztethetőek meg. A rövidülés az N-terminális felől megy végbe. Az utrophin a disztrofin autoszómális homológja. A Dp71 képes kapcsolatba lépni a disztrofin-disztroglikán komplexszel, csakúgy, mint a teljes hosszúságú disztrofin (Blake és mtsai 1999, Garcia-Tovar és mtsai 2001, Gorecki és Barnard 1995, Goreczki és mtsai 1992, Huard és mtsai 1992). A Dp427 hiányzik a gliasejtekből, de jelen van a neuronokban. In vitro kísérleteikben Torelli és mtsai (1992) azt találták, hogy az emberi sejtkultúrákban csak a neuronok mutatnak immunpozititivitást a gliasejtek nem. Jung és mtsai (1993) ill. Lidov és mtsai (1990) kimutatták, hogy mind a teljes hosszúságú disztofin, mind a Dp 71 kötődik a sejthártyához. Jancsik és Hajós (1999) a Dys2 antitest használatával immunpozitivitást talált a perivaszkuláris glia-végtalpakban. A Dys2 monoklonális antitest nem csak a Dp427-et, hanem annak valamennyi izoformáját felismeri, mivel azoknak C-terminális végük azonos. Moukhles és Carbonetto (2001) más ellenanyagot használtak, de szintén kimutatták a disztrofint a perivaszkuláris glia végtalpakban, és a Bergmann-gliában. Schofield és mtsai (1994) azt találták, hogy a Dp71 (a leggyakoribb idegrendszeri disztrofin) mRNS-e megtalálható a

20

gliasejtekben. Sejtkultúrákon folytatott vizsgálatok (Alemann és mtsai 2001, Imamura és Ozawa 1998) kimutatták a Dp71 jelenlétét az asztrocitákban. Garcia-Tovar és mtsai (2001) szerint ez összefügg a GFAP jelenlétével. A helyzet bonyolultabb, amióta a Dp71 mRNS-nek alternatív splicingjai is ismertek (Austin és mtsai 1995, Goreczki és mtsai 1997, Kramarcy és mtsai 1994). A 78. exon splicing variánsa ahhoz vezet, hogy a transzkripció, a C-terminális végen 13 aminosav kicserélődik 31 hidrofób aminosavra (Hugnot és mtsai 1992, Lederfein és mtsai 1992). Ezt az izoformát Dp71f –fel jelölik, szemben az ’eredeti’ formával, amely ekkor a Dp71d jelölést kapta. A splicing variánsok nem különböztethetőek meg az in situ hibridizáció során. A Dp71f nem mutatható ki olyan antitestekkel, amelyek belső fehérje szekvenciákra specifikusak (Lidov 1996), vagy olyanok által, amelyek a hidrofil közös C-terminálisra érzékenyek, pl. azok az antitestek, amelyeket Jancsik és Hajós (1999) ill. Moukhles és Carbonetto (2001) használtak. Sejtkultúrákban való kimutatásuk (Aleman és mtsai 2001, Garcia-Tovar és mtsai 2001, 2002) olyan monoklonális antitestekkel történtek (ún. 5f3, Fabbrizio és mtsai 1994), amelyek éppen a C-terminálisnak éppen a megváltoztatott, hidrofób formájához kapcsolódnak. Annak ellenére, hogy valószínűnek tűnik, hogy a gliasejtek tartalmazzák a Dp71 splicing variánsait, ezek in situ feltérképezése a gliasejtekben eddig hiányzott. 2.3.2.3. Egyéb komponensek A szarkoglikánok ill. a szarkoszpán közül az eddigi adatok szerint az agyban csak az ε-szarkoglikánt mutatták ki (Xiao és mtsai 2003). A β-disztrobrevint kimutatták neuronokban, az α-disztrobrevint pedig agyi erek mentén, glia-végtalpakban (Blake és mtsai 1999, Ueda és mtsai 2000). Jelátviteli folyamatokban van szerepe. A szintrofinok szintén előfordulnak neuronokban (Gorecki és mtsai 1997, Piluso és mtsai 2000), de a perivaszkuláris gliavégtalpakban is (Ambrosini és mtsai 2008, Haenggi és mtsai 2004). Itt fontos szerepük a vízcsatorna-molekulák (akvaporin, a glia-végtalpakban: akvaporin 4), ill. ioncsatornák (pl. Kir 4.1 inward-rectifikáló káliumcsatorna) eloszlásának szabályozásában (Amiry-Moghaddam és mtsai 2003ab, 2004). Érdemes megjegyezni, hogy az akvaporin-molekulák azonosak azokkal az ’ortogonal arrays of particles’-szel, (OAP), amelyet sokáig a fagyasztva-töréses preparátumokon az asztrociták jellemzőjének tekintettek (Rash és mtsai 1998, Verbavatz és mtsai 1997, Venero és mtsai 2001, Wolburg 1995). Az itt felsorolt komponensek azonban kívül estek vizsgálataink hatósugarán, csak a disztroglikánt és a Dp71f-et vizsgáltuk.

21

2.3.3 A lamina basalisról általában A lamina basalis molekuláris összetételét elsősorban hámszövetben tanulmányozták (7. ábra), de hasonló az idegrendszerben is. A lamináris, ’kétdimenziós’ szerveződést segíti a sajátságos térszerkezetű kollagén-IV. A nidogén és entaktin glikoprotein segítik a kollagén-IV kapcsolódását a lamininhez. A kollagén-IV-el kapcsolódó laminin-molekulák a sejteken lévő receptoraikkal (ti. integrin, disztroglikán) kapcsolódva egy ’kétdimenziós’ réteget alkotnak a nyugvó sejtek (pl. hámsejtek, gliasejtek) felületén. Hozzájárulnak a lamina basalis kialakításához bizonyos heparánszulfátok (perlekán, szindekán). Ezek a nidogénnel és az entaktinnal a lamina basalis tömöttebb részében (lamina densa) vannak. A kevésbé elektrondenz lamina lucida kollagén-V-öt tartalmaz. A laminin-molekulák mindkét réteget átérik. Szintén a nidogénhez és az entaktinhoz kapcsolódik a kollagén-VII, amely a kötőszöveti rostok kapcsolódását biztosítja a sejtekkel ellentétes oldalon. (Leírás Junqueira és mtsai 1989, ill. Röhlich 2006, alapján.)

7. ábra. A lamina basalis két formája. Balra a gyakoribb eset, amikor a sejtréteg kötőszövettel érintkezik: A lamina basalis alatt rácsrostokból álló réteg található (Junqueira és mtsai 1989, nyomán). Jobb oldalon azt a variációt látjuk, amikor mindkét oldalon sejtréteg van, mint pl. a glia és az endotél esetében (Módis 2004 nyomán, módosítva). Figyeljük meg a laminin és a kollagén-IV elhelyzkedését. GAG – glikozaminoglikán, HS – heparanszulfát, LD – lamina densa, LRE és I – lamina rara (azaz lamina lucida) externa és interna, TJ – tight junction.

22

A lamina basalis szerkezete módosul olyankor, amikor nem sejtréteget és kötőszövetet köt össze, hanem mindkét oldalán sejtréteg van. Ekkor hiányzik a lamina reticularis, a két sejtréteg saját lamina basalisai a sejtektől elfelé eső felszínükkel ’összetapadnak’ közös lamina basalis jön létre. Ez történik a veseglomerulusokban a podociták és az endotélsejtek között, a tüdőben a pneumociták és az endotélsejtek között, az agyban pedig a perivaszkuláris glia és az endotél között (ld. lejjebb) (Módis 2004). 2.3.4 Lamina basalisok az agyban 2.3.4.1. Asztrociták és az agyburok A központi idegrenszer sejtjei közül úgy tűnik, hogy csak az asztrociták, valamint elődük, a radiális glia, ill. az ependima egy speciális módosult formája a plexus choroideus hámja képes arra, hogy a kötőszövettel kapcsolatot létesítsen. Az asztrociták képezik a központi idegrendszer közös határolórétegét, a membrana glia limitans externát. Ennek kialakulásában kétféle kapcsolat is szerepet játszik, a végtalpak egymáshoz való kapcsolódása, ill. a központ idegrendszer közös lamina basalisával való kapcsolatuk. Ez egy alapvető különbség a perifériás idegrendszerhez képest, ahol a szatellita sejtek, és a Schwann-sejtek mindegyike képes kapcsolatot létesíteni a kötőszövettel. Ennek valószínűleg szerepe van a két rendszer sebgyógyulási ill. gyulladásos folyamataira, valamint

alapvetően

eltérő

regenerációs

lehetőségeire.

A

meningeális

felszín

ultrastruktúrájáról ld. pl. Carbonell és Boya (1988) ill. Nakazawa és Ishikawa (1988). A meningeális sejt-asztrocita kapcsolat hasonlít a mezenchima-hámsejt kapcsolatra, amely alapvető a hám morfogenezisében. A hámsejteket a lamina basalis választja el a szomszédos mezenchimától. A lamina basalis a növekvő hám (vagy pl. glia) szekréciós terméke, és fejlődés alatt a szomszédos mezenchima olyan enzimeket termel, amelyek megemésztik a laminát. A lamina basalis elvesztése a hámszövet szétdarabolódásához vezet, bár úgy tűnik, hogy ez a reakció függ a szövettől, és a fejlődési stádiumtól. Úgy tűnik, hogy a gliomeningeális sejtkölcsönhatás épp olyan fontos az agyban, mint a mezenchima-hám kölcsönhatás más szervekben. Struckhoff (1995) azt az eredményt kapta sejttenyészetben, hogy a meningeális sejt támogatja a gliasejteket a növekedésben, míg fordítva, az asztrociták gátolják a meningális sejtekét. A lamina basalis csak akkor jön létre, ha a glio-meningeális kölcsönhatás egyensúlyban van. A meningeális sejtek valószínűleg az asztrocitákat különböző

23

extracelluláris mátrix komponensek termelésére ösztönzik. A lamina basalis létrejötte központi lépés a gliomeningeális sejtkapcsolatban és a membrana limitans gliae létrejöttében. A meninxnek, ill. a glia limitansnak irányító szerepe van a radiális glia (Milner és Campbell 2002) ill. a kisagyi Bergmann glia elrendeződésében (Sievers és mtsai 1994), a kérgi rétegeződés kialakításában (sérülésekor ektópiás sejtcsoportok alakulnak ki, Hu és mtsai 2007, Milner és Campbell 2002a, Suzuki és Choi 1991)

2.3.4.2. A perivaszkularis glia és a vér-agy gát. Az agyi erek körül egyre szűkülő kötőszövetes tér, a perivaszkuláris glia limitans és a lamina basalis tulajdonképpen a pia maternek illetve az agyfelszíni glia limitansnak és a basalis laminának a folytatása. Ahol az agyba behatoló erek már endotélcsővé redukálódnak, az eredetileg különálló endoteliális és asztroglia eredetű lamina basalis összeolvad, és egy közös lamina basalis jön létre (8. ábra). Az említett fúzió nincs meg az éretlen agyszövet erein, illetve a sérülés körül újra megjelenik a gyulladás során (Bär és Wolff 1972, Caley és Maxwell 1970, Marin-Padilla 1985, Sixt és mtsai 2001). Azoknak a cirkumventrikuláris szerveknek a területén, amelyeknél a vér-agy gát átjárható, a gliaeredetű (parenchimális) és a vaszkuláris lamina basalisok között keskeny rés marad (szubfornikális szerv, area postrema, organon vasculosum laminae terminalis, de nem a szubkommisszurális szerv (Cifuentes és mtsai 1992, Krisch és mtsai 1978, Palkovits 1986). A perivaszkuláris mikrogliának csak az erekkel érintkező részét borítja lamina basalis, míg a cerebrális pericitákat teljesen körülveszi (Abbott 1991, Bär és Wolff 1972, Goldstein és Betz 1986 Vígh 2006). Az agyi lamina basalisokat az asztroglia termeli (Bernstein és mtsai 1985, Celio és Blümcke 1994, Chiu és mtsai 1991). A központi idegrendszert a vér-agy gát választja el a szisztémás keringéstől. Ez a vérplazmát és az intersticiális folyadékot elválasztó határfelület, melynek felépítésében alapvető szerepe van az endotélsejtek típusának, a köztük kialakuló tight junction-ők szerkezetének, és az asztrocitáknak (9. ábra). A vér-agy gát tulajdonságaiért elsősorban a tight junction-ök szerkezete felelős. Az asztroglia maga nem része a vér-agy gátnak (kivéve a rájákat és cápákat, közös nevükön lemezkopoltyúsok, Elasmobranchii, Bundgaard és Abbott 2008, Bundgaard és Cserr 1981). Jelenléte, indukáló hatása azonban szükséges, mint ahogyan a GFAP-é is (Abbott 2002, Janzer és Raff 1987, Pekny és mtsai 1998).

24

8. ábra. A vér-agy gát felépítése sematikus rajzokon. Az agyi ereket teljes hosszukban körbeveszik az asztrocita végtalpak. Az endotélsejteket a szoros zárókapcsolatok kötik össze. A pericitákat az endotélsejtekkel közös lamina basalis beburkolja, a mikrogliasejteket csak az ér felől takarja. (Sixt és mtsai 2001, ill. Vigh 2006, nyomán).

25

. 9. ábra. A vér-liquor-agy közti határolóterületek sematikus rajzai. A vér és az agy ill. a vér és liquor közötti határterületen tight junction-ök vannak (A), míg a liquor-agy határfelületen (szaggatott vonal) gap junction-ök. A vér-liquor gát tight junction-kapcsolatok miatt nem járható át (B), akárcsak a vér-agy gát (C). Az agy-liquor határ: ependmasejtek határolják a kamrát, amelyek között gap junkionok vannak, így könnyű a diffúzió. (Johanson és mtsai 2008) 2.4. Vaszkularizáció. Az embrionális fejlődésben folyamán az agyi kiserek kialakulásában, az agy vaszkularizásióban fontos szerepet játszik a glia-endotél kölcsönhatás (Dorell és mtsai 2002, Risau 1997). Az agy esetében embrionális idegrendszert körülvevő érfonatból angiogenezissel (azaz érbimbók benövésével) fejlődnek ki a parenchimális erek, nem pedig helyben alakulnak ki a mezenchimális sejtekből (vaszkulogenezis). Az angiogenezist szabályozó faktorok (pl. a VEGF –vaszkuláris növekedési faktor, Risau 1997, Krum és mtsai 2002) termelésében döntő szerepe van a gliának. Az érbenövés az agy-kötőszövet felület megnagyobbodását, új gliakötőszövet határfelületek kialakulását jelenti. Éppen ezért az érképződésben jelentős szerepe van a lamininnek, fibronektinnek, a lamina basalis kialakulásának, az integrineknek (többek között αV-és β1-tartalmúaknak). Ld. Beck és D’Amore (1997), Francis és mtsai (2002), Grant és mtsai (1990), Milner és Campbell (2002ab). Az asztroglia ezek képzésében a fejlődés alatt is szerepet játszik (ld. pl. Jiang és mtsai 1994). Mint említettük, az újonnan növő erek körül eleinte tág kötőszövetes rés van, a meningeális szövet folytatásaként. Ez a rés később, a gliovaszkuláris kapcsolatok, végtalpak

26

kialakulásával eltűnik, és az endotél lamina basalisa összeolvad a perivaszkuláris gliáéval (Bär és Wollf 1972, Caley és Maxwell 1970, Marin-Padilla 1985). Érett agyszövetben csak a felszín közelében, illetve a cirkumventrikuláris szervekbn (kivéve a szubkommisszurálist) marad meg ez a rés (Cifuentes és mtsai 1992, Krisch és Leonhardt 1978, Palkovits 1986). 2.5. A reaktív gliózis Alapvetően az asztrociták reakciója, és fő jelei az asztrocita hipertrofiája, illetve az intermedier filamentumok mennyiségének növekedése (Reier 1986). A reaktív asztrociták intenzív anyagcsere jeleit, illetve az éretlen glia számos tulajdonságát mutatják. Gliareakció követ a központi idegrendszerben minden vaszkuláris, traumás, degeneratív károsodást. A vér-agy gát miatt az idegszövet csak korlátozottan hozzáférhető a sejtek és egyéb anyagok számára, ezért a „gyógyulás” folyamán az asztrociták termelik a szükséges anyagokat (Brodkey és mtsai 1993, Eddleston és Mucke 1993, Lawson és Perry 1995, Merrill és Beneviste 1996, Ridet és mtsai 1997). A jelenség első leírását Virchow adta (Reier 1986) de a döntő áttörést a GFAP felfedezése hozta (Eng és mtsai 1971), amely az érett asztroglia fő intermedier filamentuma, és egyik fő immunhisztokémiai markere, amelynek követésével a gliareakció jól követhető (Bighami és Dahl 1976, Berry és mtsai 1983, Hozumi és mtsai 1990ab, Mathewson és Berry 1984). Del Rio Hortega és Penfield (1927) szerint a gliareakció lefolyásában fázisok különíthetőek el. Ezeket ma a következőképpen látjuk (Reier 1986): 1) Gyulladásos fázis mikroglia reakcióval: Ez a fázis kb két-három napig tart. A makrofágok már az első nap megjelennek, majd fokozatosan eltűnnek. Részben a rezidens mikrogliából, részben a vér monocitáiból származnak. A GFAP expresszió ennek a fázisnak a végén kezd el fokozódni. Erre a fázisra jellemző a vér-agy gát átjárhatóságának fokozódása (penetráló sérülés éppenséggel megnyitja), és a gliovaszkuláris kapcsolatok feloldódása (Jaeger és Blight 1997). 2) Az asztroglia reakció ill a 3) a demarkáló paliszádszerű nyúlványrendszer kialakulása: A 3-14. nap között zajlik le, ilyenkor a GFAP pozitív asztrociták dominálnak a sérülés területén. Kb egy napig a reakció izomorf, azaz az asztrociták nyúlványainak nincsen kitüntett irányuk, de a negyedik napon az asztrociták nyúlványai már a sérülés felé irányulnak és egy paliszádszerű mintázatba rendeződnek (anizomorf fázis). Az asztroglia reakció a maximális kiterjedését a 7-8. napon éri el. A reakció még a túloldalra is átterjedhet, főleg a corpus callosum mentén (Amaducci és mtsai 1981, Ludwin 1985, 27

Mathewson és Berry 1984, Moumdijan és mtsai 1991). A második hét után a kiterjedt reakció fokozatosan eltűnik. 4) Meningeális kötőszövet benövése és 5) maradandó gliaheg kialakulása, közepén általában kötőszövetes ’maggal’. Az első hét végére a meningeális mag jelenik meg, amelyre mintegy válaszul az asztrociták laminint és IV. típusú kollagént termelnek (Berry és mtsai 1983, Bernstein és mtsai 1985, Liesi és mtsai 1984, Liesi és Kauppila 2007, Liesi és Risteli 1989). A meningeális kollagén rostok bekapcsolódásával a 8-12. nap között a glia végtalpak mentén kialakul a membrana limitans gliae secundaria. Ennek teljes felépülése után (16-20. nap) a reaktív asztrociták nagy része eltűnik, ill. a reaktivitásra jellemző anyagok termelése megszűnik (azaz a GFAP expresszió visszaszorul). Az új membrana limitans vastagabb, durvább, laposabb glianyúlványokból áll (Carbonell és Boya 1988). Különösen a proliferáló ill. a korai fejlődési szakaszban lévő asztrociták gátolják a meningocitákat, ez talán magyarázhatja azt is, hogy miért nem alakul ki heg az éretlen állatokban (Berry és mtsai 1983, Struckhoff 1995). Később, mikor a gliasejtek profilerációs képessége csökkent, a meningeális sejtek képesek az invázióra, és ekkor létre is jön a gliaheg. Sérülés hatására a reaktív glia angiogenezist, revaszkularizációt indukál (Salhia és mtsai 2000). Mind ez, mind az említett kötőszövetes heg-’mag’, ill. a membrana limitans secundaria kialakulása glia-kötőszöveti kapcsolatok kiépülésével jár. 3. Célkitűzések Az irodalmi összefoglalásból látszik, hogy a glia-kötőszövet kapcsolat alapvető az agyburkok, az agyi erek kialakulásában, a sérülés utáni reakciókban. Vizsgálataink célja ennek megfelelően a glia-kötőszövet kapcsolatra, ill. annak állapotára, változásaira jellemző immunhisztokémiai reakciókat keresni. Kísérletsorozatainkban vizsgáltuk: Kifejlett állatban a laminin, β- disztroglikán, és a Dp71f eloszlását. Fejlődés alatt a gliovaszkuláris kapcsolat kialakulásának immunhisztokémiai jeleit a laminin, β-disztroglikán, fibronektin, nesztin, GFAP immunfestésével. Sérülés nyomán bekövetkező érválaszokat, gliovaszkuláris változásokat -

a laminin, β-disztroglikán, disztrofin, GFAP immunfestésével.

Vizsgáltuk ezenkívül, hogy az integrinekben leggyakrabban előforduló α- és β-komponensek, az αV és a β1 alkalmas-e az agyi érfejlődés illl. a sérülésre adott érválasz követésére. 28

4. Módszerek

4.1. Kísérleti állatok Kísérleteinket albinó fejlődő (embrionális napok, E12-E20, ill. posztnatális napok, P0P20) és kifejlett Wistar patkányokon végeztük. A patkányok pároztatása után a terhesség bekövetkeztét rendszeres kenetvétellel határoztuk meg. A pároztatás utáni napot tekintettük E0-nak, a születés napját P0-nak. Szúrásos sérülés esetén 6-8 kifejlett állatot (200-400 grammos, hím és nőstény vegyesen), a fejlődéses vizsgálatokhoz 3-4 állatot használtunk fel időpontonként. 4.1.1. Műtét A narkózist ketaminnal (20 mg/kg), és xylazinnal (80mg/kg) hoztuk létre. A fejbőrön és a galea aponeuroticán ejtett metszés után a koponyán lyukat fúrtunk, ezeken keresztül steril tűvel az agyban lézió hoztunk létre (általában a parietális kortexben), majd a fejbőrt varratokkal egyesítettük. A szúrásos sérülést azért választottuk, mert egyszerű, és jellegzetes gliareakció követi. Az egyes kísérletsorozatokban alkalmazott túlélési idők a kísérletek leírásánál kerül részletezésre. 4.1.2. Feldolgozás Fixálás: Az állatok éteres altatás után intrakardiális infúzióval, 4% paraformaldehiddel (0,1 M foszfát puffer, pH:7,4) fixáltuk, amit 24 órás, egyes esetekben (ld. ott) csak 4 órás, utófixálás követett. Újszülött állatok ill. embriók esetén a fixálás a fent említett anyaggal immerzió útján történt. Post-mortem vizsgálatként egyes agyakat csak immerzióval fixáltunk, 1 őrás késleltetéssel. Metszés: Coronalis sorozatmetszeteket készítettünk Vibratommal, 50 μm-es vastagságban, szükség esetén agarba ágyazás után. Egy agyból készítettünk kriosztátos metszeteket is. 4.2. Immunhisztokémiai reakció Előkezelés: 90 percig 20%-os normál kecskesavóval, a nem-specifikus immunglobulinkötőhelyek blokkolására. 29

Primer antitestek: ld a 2. táblázatot Inkubáció: két napig, 4°C hőmérsékleten 2. táblázat. A felhasznált primer ellenanyagok Antitest

Típusa

Anti-laminin 1 Anti–laminin α2 Anti-laminin β1

Poliklonális Monoklonális Poliklonális

Milyen állatból? Nyúl Egér Kecske

Anti-laminin β2

Poliklonális

Kecske

Anti-laminin γ1

Polklonális

Nyúl

Anti-fibronektin Anti-GFAP

Poliklonális Monoklonális

Nyúl Egér

Anti GFAP

Poliklonális

Nyúl

Anti-nesztin 5f3 (Dp71f splicing variáns ellen) Dys2 (Dp71d, és Dp427 ellen) Anti-β-disztroglikán Anti-integrin αV

Monoklonális Monoklonális

Egér Egér

Monoklonális

Egér

Monoklonális Poliklonális

Egér Nyúl

Anti-integrin β1

Monoklonális

Nyúl

Gyártó cég

Hígítás

Sigma Novocastra Santa-Cruz Biotechnology Santa-Cruz Biotechnology Santa-Cruz Biotechnology Sigma Boehringer ill. Novocastra DAKO ill. Santa Cruz Biotech BD Bioscience D. Mornet által kifejlesztve Novocastra

1:100 1:100 1:10

Novocastra Santa-Cruz Biotechnology Santa-Cruz Biotechnology

1:100 1:20

1:10 1:100 1:100 1:100 1:100 1:1500 1:100 1:100

1:20

Előhívás: 1. Fluoreszcens jelölés: Az egér-antitestek esetén Cy3-konjugált egér-antitest elleni immunglobulint, míg a nyúlban termelt antitestek ellen fluoreszcein-izotiocianát-konjugált, nyúl-immunglobulin elleni antitestet használtunk (Mindkettő a Jackson ImmunoResearch Laboratory-tól. kecske) 1:300 hígitásban, 180 percig, szobahőmérsékleten. Laminin- β1 és β2 esetében, mivel nem állt rendelkezésünk kecske immunglobulin ellen való, fluoreszcensen jelzett antitest, ezért azt a megoldást választottuk, hogy a DAB reakciónál használt kecske immunglobulin elleni biotinilált antitestet használtunk (90 perc,

30

szobahőmérséklet), majd ezt követően fluoreszcensen (FITC) jelölt szterptavidinnel inkubáltuk, mint fent. Kettős jelzések (GFAP-laminin, GFAP- disztroglikán, GFAP-disztrofin, laminindisztroglikán, laminin-nesztin, fibronektin-nesztin) Az estleges nem kívánt keresztreakció elkerülése miatt a GFAP ellenes antitest mindig más állatból származott, mint a GFAP-val együtt vizsgált anyag elleni antitest. 4.3. Képalkotás A színes felvételek Olympus BX 51 mikroszkópon, DP50 digitális kamerával készültek. Az alkalmazott festékek közül a C3TM-konjugált antitest zöld fénnyel megvilágítva vörös színt ad, míg a fluoreszcein-izotiocianát kék fénnyel gerjesztve zöld színnel világít. Az azonos agyterületeken a megfelelő szűrő alkalmazásával a kétféle jelzéssel készült felvételeket külön-külön fényképeztük le, majd az Adobe7 Photoshop programmal szuperponáltuk őket. Ahol együtt fordulnak elő, ott sárga színt látunk. Néhány képet konfokális mikroszkóppal dr. Adorján István készített, amit ezúton is köszönünk.

31

5.Eredmények: 5.1 Intakt, kifejlett állatok 5.1.1. Laminin Laminin immunpozitivitást intakt kifejlett állatok agyi ereiben nem találtunk, kivéve azokat a helyeket, ahol az erek éppen beléptek az agyállományba (10-11. ábrák). Maga az agyburok, ill. annak erei viszont erős immunreaktivitást mutattak (12. ábra). Érdemes megjegyezni, hogy sok esetben neuronok bizonyultak laminin-immunpozitivnak. Kriosztáttal készített metszeten az agyállomány belsejében lévő erek is erősen jelölődtek (13. ábra). Amennyiben nem perfúziós fixálást alkalmaztunk, hanem a leölt patkányok fejéből az agyat csak 1-2 óra elteltével vettük ki, és immerzióval fixáltunk, a környezethez képest nem kaptunk az erekben intenzív jelölődést (14. ábra). Nem jelölődtek a perfundált, intakt állatok agyi erei akkor sem, ha az általában használt, a laminin-1 ellen termelt ellenanyag helyett annak egyes komponenseit, a β1- ill. γ1- láncok elleni antitesteket használtunk, vagy a laminin-2-re (amely egyesek szerint szintén előfordul az agyi erekben, ld. az irodalmi összefoglalást) jellemző α2 elleni antitesteket, esetleg a β2 alegységek ellenieket (15. és 16. ábrák). Hogy milyen lamininekben fordulnak elő ezek az alegységek, azt mutatja az 1. táblázat (15. old.). Az area posztréma (17. ábra), az organon vasculosum laminae terminalis (18. ábra), a szubfornikális szerv (19. ábra) és az eminentia mediana erei felnőtt sértetlen állatban is erősen laminin immunpozitívak. Ezekben a cirkumventrikuláris szervekben a vér-agy gát átjárható. A szubkommisszurális szervben, ahol az átjárhatóság nem áll fenn, nem tapasztaltunk erős laminin immunpozitivitást. 5.1.2. Disztroglikán Az ép agyban az érhálózat jól kirajzolódik a β-disztroglikán immunfestése nyomán (20-21. ábrák). A β-disztroglikán a meningeális felszín mentén is megfigyelhető, de azon kívül, ti. a meningeális erekben, nem. Sem az asztrociták, sem azok nyúlványai nem jelölődtek (ld. ezeket a párhuzamos metszeten GFAP festéssel, 22. ábra). A fentebb említett cirkumventrikuláris szervek erei is jól jelölődtek.

32

10-11. ábra: Intakt agyban az ereknek csak a belépő része (nyíl) laminin-immunpozitív. Skála: 100 μm. 12. ábra: Agyburok kiterítve: az erek erősen laminin-immunpozitívak. Skála: 100 μm. 13. ábra: Kriosztát metszet (az erek laminin immupozitívak). Skála: 100 μm. 14. ábra: A poszt mortem immerziós fixálás gyenge immunpozitivitást eredményez. Skála: 60 μm. 15-16. ábra. Ép kortexben az erekben (nyilak) immunreaktivitás nem mutatható ki sem β1 (15. ábra), sem γ1 (16. ábra) láncok elleni monoklonális antitesttel. Skála: 40 μm.

33

17-19. ábra: Cirkumventrikuláris szervek, amelyekben az erek laminin-pozitívak. 17. ábra: Area postrema AP). (4V-4. kamra). Skála: 80 μm. 18. ábra: Organon vasculosum laminae terminalis (ChO- chiasma opticum, 3V-3. kamra). Skála: 200 μm. 19. ábra: Szubfornikális szerv (CF-commissura fornicis). Skála: 250 μm.

34

20-21. ábra: Agyi erek a β-disztroglikán immunfestése nyomán. A meningeális erek nem jelölődtek, ellentétben a laminin immunfestésével. Az agyi érhálózat jól kirajzolódik. Skála: 40 ill. 100 μm. 22. Asztrociták az agyfelszínen és egy ér mentén. GFAP immunfestése. Skála: 40 μm. 5.1.3. Disztrofin Az egyik általunk használt antitest az 5f3 volt, amely felismeri a Dp71f fehérje Cterminálisán lévő 31 aminosavat. A másik pedig a Dys2, amely a Dp71d splicing variánst ismeri fel, illetve az összes többi variánst, beleértve a teljes hosszúságú Dp 427-et. 5f3 antitest felhasználásával a neuronok fényes körökként jelennek meg, egy majdnem jelöletlen, sötét maggal (23. ábra). A neuronok mindenütt jelölődtek az agyban, de leginkább a hippocampusban, a gyrus dentatusban, a bulbus olfactoriusban, a cortexben, és különösen a Purkinje-sejtekben a kisagyban. A neuronokkal ellentétben az asztrociták jellegzetes nyúlványrendszere egyértelműen jelölődött (24-25. ábrák). A Dys2 antitest kizárólag neuronokat jelölt, hasonló eloszlásban, mint az 5f3, de gliát nem, kivéve néhány perivaszkularis jelölődést. A 23. és 26. ábrák jól mutatják ezeket a különbségeket az 5f3 és a

35

Dys2 immunpozitivitás között. Kettős-jelzéses vizsgálatok (27-29. ábrák) jelezték az 5f3 és a GFAP együttes előfordulását az asztrocitaszerű strukturákban, de a neuronszerű perikarionon nem. Megjegyzendő azonban, hogy az anti-GFAP több asztrocitát jelölt, mint az 5f3 antitest. A Dys2 antitesttel jelölődött sejtek nem mutattak GFAP-pozitivitást. A továbbiakban részletesen tanulmányoztuk az 5f3 antitesttel jelölhető struktúrákat a patkányagy különböző területein. A meningeális felszín mentén a glia limitans 5f3immunpozitivitást mutatott (30. ábra). A glianyúlványok és -végtalpak egyértelműen azonosíthatóak voltak. Néhány esetben a sejt egész nyúlványrendszere jelölődött, nem csupán az a nyúlvány, amely a felszínre tartott. A perivaszkuláris glia, a glia limitans folytatásában, szintén immunpozitivitást mutatott a belépő erek mentén. A jelölődés az agyfelszíntől távolodva jelentősen csökkent (31. ábra). Következésképpen mélyen az agyban a perivaszkuláris glia nem jelölődött, kivéve néhány esetet (32. ábra). A fissura hippocampi mentén jelölődött számos ér nem mondott ellen ennek a tendenciának, hiszen a fissura tkp. betűrődött agyfelszín. Az agypályák szegények voltak 5f3-at tartalmazó struktúrákban, néhány kivétellel, mint például a corpus callosum (33. ábra). Az agytörzsben a felszínnel kontaktusban lévő glianyúlványok 5f3-immunpozitivitása sokkal erősebb. A szubmeningeális és a perivaszkuláris jelölődés sokkal intenzívebb volt (3435. ábrák). Ebben a térségben a felszínre érő elemek inkább hosszú radialis rostok, mint sem szubmeningeális asztrociták rövid nyúlványai. Ezek a rostok hálózatot alkotnak, és áthaladnak a felszínes agyi pályákon (piramidális, spinocerebelláris), bár a mintázatuk különböző volt az eltérő lokalizációban (összehasonlításra ld. a 34-35. ábrákat). A kilépő agyidegek nem voltak fluoreszcensek. Az erek csak az agyba való belépésük kezdetén voltak immunpozitívak (34. ábra). A középvonali gliasövények jelölődtek. Az ependima (36-38. ábrák) szintén immunpozitivitást mutatott az egész kamrarendszerben. A sejtek hámszerű elrendeződése és nyúlványaik láthatóak a gerincvelő központi csatornája körül (36. ábra). Egyébként az ependima jelölődése hasonlított az idegsejtekére: a jelölés a sejtek perifériájára szorítkozott, míg a sejtek belseje jelöletlen maradt (37-38. ábrák). A szubependimális asztrociták a kamra mentén szinén jelölődtek. Láthatók voltak emellett még sejtszerű poligonális strukturák, amelyeknekszintén csak a perifériájuk jelölődött, de csak laza kapcsolatban álltak az ependimával (37-38. ábrák).

36

23. ábra A hippocompus granuláris rétegének (G) neuronjai jól láthatók az 5f3 jelölésével. (F: fissura hippocampi). Az immunpozitivitás kirajzolja a glia limitanst (dupla nyílhegy), néhány eret (nyílhegy), de nem mindegyiket (nyíl). Néhány asztrocita is jelölődött (csillag, dupla csillag) Skála: 60 μm. 24-25. ábra: Az előző ábra nagyított részletei (a csillaggal és dupla csillaggal jelölt területek nagyításai, a jelzések megegyeznek), Az 5f3-immunpozitív asztrocitákat könnyű felismerni jellegzetes nyúlványrendszerükről. A neuronok (G - granuláris réteg) megjelennek mint üres körök. Dupla nyílhegy mutatja a glia limitanst. Skála: 15 μm. 26. ábra: A Dys2 csak a neuronok fő rétegét jelöli (ld G), de a glia limitanst ill. az ereket nem Skála: 60μm.

37

27-29. ábra: Kettősjelzéses vizsgálat 5f3 és anti-GFAP antitesttel. 27. ábra: 5f3-(Dp71f ellen) immunpozitivitás 28. ábra: GFAP-immunpozitivitás 29. ábra: A kettő számítógépes összegzése. A sárgás szín az 5f3 és a GFAP kolokalizációját jelöli. A nyilak azonos, kettősen jelölt struktúrákra mutatnak az egyes képeken. Megfigyelhetjük, hogy vannak olyan asztociták, amelyek csak GFAP-val jelölődnek, 5f3-mal nem (nyílhegy 28. ábra), ill. neuron amely élénken jelölődnek 5f3-mal (nyílhegy 27. ábra), de GFAP-val nem. Skála: 40 μm.

38

30. ábra: A meningeális felszín mentén az 5f3-immunpozitivitás kirajzolja a glia limitanst (dupla nyílhegy), a glianyúlványokat és a végtalpakat (megtört nyílak) csakúgy, mint az asztrocitákat a felszín alatt (nyíl). Skála: 30 μm. 31. ábra: A perivaszkuláris tér szintén mutat immunpozitivitást (nyílhegy) a glia limitans (kettős nyílhegy) folyatatásában a felszín közelében. Skála: 30 μm. 32. ábra: Mélyebb erek (nyílhegy) csak ritkán tartalmaznak 5f3–t (a nyilak az asztrocitákra mutatnak, a megtört nyilak az asztociták nyúlványira.). Skála: 30 μm. 33. ábra: A corpus callosum tartalmaz 5f3 pozitív asztrocitákat ellentétben a többi agypályával. Figyeljük meg az erek egyenlőtlen jelölődését (nyíl kontra nyílhegy). Skála: 20μm.

39

34-35. ábra: Az agytörzsi strukturákban a glia limitans erősebb 5f3-jelölődést mutat (kettős nyílhegy), a felszíni glia nyúlványai hosszabbak (nyílhegy). A mintázat eltérő a ventralis és a lateralis felszín mentén. A megtört nyilak az alig jelölődött idegsejtekre mutatnak. Csak a belépő erek kezdeti szakasza jelölődött (nyíl). Az agyi idegek és pályák (csillag) immunonegatívak. Skála: 30 μm.

Az oldalkamrák elülső szarva mellett, a nucleus caudatus-putamen komplex és a corpus callosum között látható egy immunopozitív terület, megfelelően a szubventikuláris zóna helyzetének (39-41. ábrák). Itt típusos asztrociták nem jelölődtek, de egy lépesmézszerű rajzolat megfigyelhető volt nagy felbontású objektivvel (42. ábra). A nucleus caudatusputamen magcsoport oldalán a terület érintkezik a felszínnel kapcsolatban álló polygonális struktúrákkal (41. ábra). Hasonló struktúra a szeptális oldalon nem figyelhető meg. A

circumventrikuláris

szervek

könnyen

megkülönböztethetőek

voltak

a

környezetüktől intenzív 5f3-jelölődésük által: a szubfornikális szerv (43. ábra) az organon vasculae laminae terminalis, az area postrema (44. ábra), melyekben főleg az erek jelölődtek. Az eminantia mediana (45. ábra) egyike volt a legintenzívebben jelölödő strukturáknak az agyban, sűrű jelölt rostokkal átfonva, csak úgy mint a környező erek. A jelölődés látható volt a perzisztáló radiális glia sejtekben, az eminentia mediana hátsó, vaskosabb részén. Más 40

endokrin hypothalamus magok (nucleus supraopticus, nucleus paraventriculáris), vagy a cirkadián ciklust szabályozó nucleus suprachiasmaticus, nem voltak immunpozitívak, de a felszínre merőleges gliarostok erősen és intenzíven jelölődtek a chiasma opticumban (46 ábra).

36-38. ábra: Az ependima 5f3-immunpozitivitást mutat az egész kamrarendszerben. 36. ábra: A sejtek (kettős nyílhegy) hámszerű elrendeződése és nyúlványaik láthatóak a gerincvelő központi csatornája körül (CC - canalis centralis). Skála: 30 μm. 37-38. ábra: A szubependimális asztrociták (nyíl) a kamra mentén (V) szintén jelölődtek (nyílhegyek), épp úgy, mint a bizonyos poligonális strukturák (tört nyíl), amelyek csak laza kapcsolatban állnak az epedimával. Skála: 30 μm, ill. 10 μm.

41

39-42. ábra: Szubependimális strukturák jelölődése 5f3-al az oldalkamra elülső része körül. (Oldalkamra: V a 39. ábrán, csillag a 40-en, CC - corpus callosum, CP - caudatus-putamen komplex S - Septum). A nyílhegy az ependimára mutat. A kettős nyílhegy az oldalkamra elülső szarva melletti immunpozitív területekre mutat (39. és 40. ábra), amelyek laterálisan helyezkednek el a corpus callosum és a caudatus-putamen komplexum között. A megtört nyilak (39. és 40. ábra) poligonális szubependimális elemekre mutatnak, hasonlóan a 37 és 38. ábrákhoz. Ezek csak a caudatus-putamen komplexum oldalán jelennek meg, sohasem a septum oldalán (41. ábra). Skála: 50 μm. 42. ábra: A nagy felbontású felvételen megfigyelhető a fent említett lépesmézszerű rajzolat. Skála: 12μm. 42

43-46. ábrák: A cirkulventrikuláris szervek jelölődése 5f3-al 43. ábra: A szubfornikális szerv (SFO). CF: commissura fornicis. .Skála: 200 μm. 44. ábra: Az area postrema (AP) CC: canalis centralis, kettős nyílhegy mutatja erősebben jelzett alsó szegélyét. Skála: 150 μm. 45. ábra: Erős jelölődés az eminentia mediana körüli tanicitákon (nyíl), és a környező ereken (nyílhegy), V - harmadik kamra. Skála: 200 μm. 46. ábra: A chiasma opticum (ChO) negatív volt, kivéve a meninx felé irányuló rostokat (nyílhegy) Skála: 200 μm. A Bergmann-glia rostjai a meninx felé haladva egyre erősebben jelölődtek (47. ábra.) Csak kevés területen találtunk olyan immunpozitív asztrocitákat, amelyek függetlenek voltak a meninxtől, az erektől vagy a kamráktól: a hippocampusban (ld. 23-25. ábrák), a pallidumban,

a

habenulában

(48.

ábra),

interpeduncularisban (49-50. ábrák).

43

a

substantia

nigrában,

és

a

nucleus

47. ábra: A Bergmann gliát leginkább a meningeális felszín közelében jelölték az 5f3 antitestek (nyílhegy), a Purkinje-sejteket a megtört nyílak jelölik. Skála: 60 μm. 48. ábra: Számos 5f3-immunpozitív asztrocita látható a habenulában (Hb). Skála: 100 μm. 49-50. ábra: Nucleus interpeduncularis és annak kinagyított részlete. Jellegzetes asztrocitákat figyelhetünk meg (nyíl). Skála: 100 ill. 30 μm. 5.2. Fejlődő állatok 5.2.1. A 12-15. embrionális napok Vizsgálataink kezdetén, a 12. embrionális napon az agyi érhálózat jól feltüntethető volt a laminin ill. a fibronektin immunfestésével (51-52. ábrák). Az erek ilyenkor még nagyrészt radiális lefutásúak. A továbbiakban elsősorban a cortex ereit vizsgáltuk. A 14. napon disztroglikán-immunpozitivitás még nem volt kimutatható (53-54. ábrák). Első ízben a 15. napon észleltünk disztroglikán-immunreaktivitást a gangliondomb ereiben, ill. a meningeális felszínen.

44

5.2.2. A 16. embrionális naptól újszülöttkorig A disztroglikán-immunpozitivitás a 16. embrionális napon jelent meg agyszerte. A kirajzolódó érrendszer hű mása volt annak, amit a fibronektin vagy a laminin immunfestése nyomán láttunk (55-56. ábrák). Ez a helyzet megmaradt a születésig (57-59. ábrák), sőt utána is 1-2 napig, miközben az érhálózat egyre gazdagabb lett. A gliaszerkezet ekkor még tipikus radiális glia (60. ábra), mint az a nesztin immunfestése jól mutatja. 5.2.3. Az ötödik posztnatális napig Az első posztnatális napokban a fibronektin- majd a laminin-immunpozitivitás tűnik el az erekből. Ez a folyamat a kortexben annak középső rétegében kezdődik, és onnan halad fokozatosan mind a felszín felé, mind azzal ellentétes irányba. A neuronok és a piális felszín immunpozitivitása megmarad. A születés utáni 5. napon a fibronektin pozitív erek már csak a felszíni kéregben találhatóak meg. (61. ábra). Ekkor a lamininimmunpozitivitás hiánya még csak a kortex középső részén figyelhető meg (62. ábra). Továbbra is radiális az uralkodó gliaszerkezet, amely azonban helyenként már erek kontúrjait is kirajzolja (63. ábra, ld. inset). 5.2.4. A hetedik posztnatális napig Ebben a korban a disztroglikán immunfestése továbbra is kirajzolta az érhálózatot (64. ábra). A 7. napra a laminin-immunpozitivitás eltűnése kiterjedt a cortex egész középső részére (65. ábra). A fibronektin csak a felszín közelében volt megtalálható, a mélyebb rétegekben nem (66. ábra). A gliában ebben a korban még mindig a radiális ’rostok’ domináltak, nesztin-immunpozitivitás megfigyelhető volt még a kéreg teljes területén (68. ábra), de a GFAP is kezdett megjelenni a szubpiális asztrocita rétegben és az erek mentén (67. ábra). Egyik gliamarker eloszlása sem mutatott azonban lokális egybeesést a laminin illetve a fibronektin eltűnésével. A laminin-immunreaktivitás eltűnése volt észlelhető ott is, ahol még megmaradt a radiális glia, ugyanakkor laminin kimutatható volt GFAP-tartalmú asztrociták jelenlétében is.

45

51-54: ábra: Laminin-, fibronektin- és disztroglikán-immunpozitivitás a 12. és 14. napokon. 51- 52: ábra: Az embrionális 12. napon (51. ábra) ill. 14. napon (52. ábra) a laminin- (L), és a fibronektin- (F) immunpozitivitás már kirajzolja az agyi ereket és a piális felszínt (kinagyítva ld. az insetben). Ch: plexus choroideus, GE: ganglion domb, Hp: hippocampus, Hy: hypothalamus, Th: thalamus, V - oldalkamra. Skála: 1 mm. 53-54. ábra: Kettős jelzéses vizsgálat (fibronektin (F), disztroglikán (D)). Az erek fibronektinimmunpozitivitást mutatnak, disztroglikán-immunpozitivitás nem látható. A nyilak azonos pontokat jelölnek. A disztroglikán esetén csak az erekben lévő vörösvértestek fluoreszkálnak (P: pia mater). Skála: 250 μm.

46

55-56. ábra: Kettős jelzéses felvétel a 16. embrionális napon: disztroglikán (D) és fibronektin (F). Ebben az időszakban a disztroglikán már jelöli az ereket, még a felszínen is. (V: kamra, P: pia mater), a nyílak azonos pontokra mutatnak. A kamra közlében (csillag) egy radiális mintázat figyelhető meg, míg a kamrától távol eső területen (két csillag) ez a mintázat nem látható. A mintázatot valószínűleg a sejtek kontúrjai hozzák létre. Skála: 400 μm. 57-59.ábra: Újszülött korban (P0) az erek a cortex teljes területén jelölődnek, mind a laminin (L), mind a disztroglikán (D), valamint a fibronektin (F) immunfestésével (Cx: cortex, CC: corpus callosum, Cp: cauda-putamen komplex). Skála: 100 μm, az 59. ábrán 80 μm. 60. ábra: A glia ilyenkor még sűrű, radiális glia amely jól kimutatható a nesztin (N) immunfestésével. Skála: 100 μm.

47

61- 63. ábra: Fibronektin -, laminin-, és nesztin-immunpozitivtitás újszülöttben az 5. napon. A születés utáni első napokban először a fibronektin-, majd a laminin-immunpozitivitás tűnik el fokozatosan az erekből. Ez a folyamat a cortexben a középső rétegben kezdődik, és onnan halad mind a felszín felé mind a mélybe (a szimpla nyílak az immunpozitív, a dupla nyílak az immunnegatív erekre mutatnak). A neuronok és a pia laminin-immunpozitivitása megmarad. Skála: 100 μm. 61. ábra: A születés utáni 5. napon fibronektin-pozitív (F) erek már csak a felszín közelében találhatóak. 62. ábra: A laminin- (L) immunpozitivitás hiánya még csak a cortex középső részén figyelhető meg. 63. ábra: A glia még ilyenkor is nesztin- (N) immunpozitív radiális glia. 5.2.5. A 12. posztnatális napig A 7-12. napok között a vaszkuláris laminin immunpozitivitás is eltűnt a kortexből, kivéve azokat a helyeket, ahol a felnőtt állatban is megfigyelhető (69. ábra). A disztroglikán, akárcsak eddig, ill. felnőttkorban is, jól kimutatható (70. ábra). A GFAP már kiterjedten jelen van a piális felszín alatt, ill. a kéreg mélyében, valamint sokfelé az erek mentén (71. ábra). Nesztin-immunopozitív radiális glia-rostok egyre ritkábban voltak láthatók, viszont egyes erek kirajzolódtak a nesztin immunfestése nyomán (72-73. ábrák). A fenti időadatok az agykéregre vonatkoznak. Mélyebb agyterületeken a fibronektin, és főleg a laminin tovább is kimutatható volt az erekben. Ezeket a területeket nem vizsgáltuk végig, csak példaképpen mutatunk be néhány adatot. A septumban ill. a hippocampusban még a 12. napon is laminin-immunpozitívek voltak az erek (74-75. ábrák), ugyanakkor ezeken a területeken már a GFAP-immunpozitív asztrociták domináltak, amelyek számos kapcsolatot is létesítettek a laminin-immunpozitív erekkel. Legtovább kitartott a laminin-pozitivitás a rhombencephalon ereiben, ahol még a 20. napon is megtalálható volt.

48

64-65. ábra A 7. napon a disztroglikán- (D) immunpozitivitás a cortex erein mindenütt megfigyelhető. A laminin- (L) immunpozitivitás eltűnése kiterjedtebb, különösen a kortex középső részén (szimpla nyílak: mindkét felvételen immunpozitív ér, kettős nyílak: az ér laminin-immunnegatív). P: pia mater. Skála: 100 μm. 66. ábra: A fibronektin (F) csak a piális felszín (P) közelében látható, a mélyebb struktúrákban nem. Kettős nyíl: jelöletlen ér. Skála: 100 μm. 67. ábra: A 7. napon GFAP kezd megjelenni a szubpiális asztrocita rétegben (nyílhegy), és az erek mentén (nyíl). P: piális felszín. Skála: 100 μm. 68. ábra: A nesztin immunfestése még sok radiális rostot mutat. P: piális felszín. Skála: 100 μm.

49

69. ábra: A születés utáni 12. naptól kezdve a laminin- (L) immunpozitivitás a kifejlett állatra jellemző mintázatot mutatja: megfigyelhető a pia mater (P) mentén és az agyba belépő erek (nyílak) kezdeti szakaszán (ld inset). A kettős nyílak mélyebben futő, jelöletlen erek helyét jelzik. Skála: 100 μm. 70. ábra: A disztroglikán- (D) immunpozitivitás mind a felszíni ereken, mind a felszíntől távoli ereken is kimutatható (a nyílak ugyanazokra az erekre mutatnak, mint az előző felvételen) Skála: 100 μm. 71. ábra: A 12. napon már kiterjedt GFAP immunpozitivitás figyelhető meg az erek (nyíl) és a piális felszín (dupla nyíl) mentén. Skála: 50 μm. 72-73. ábra: Nesztin-immunpozitív radiális glia a 12. napon már csak nyomokban található. Skála: 100 μm, ill. 50 μm.

50

74-75. ábra: Bizonyos területeken, mint például a septum (74. ábra: CA - commissura anterior) vagy a hippocampus (75. ábra) a laminin-mmunpozitivitás (dupla nyíl) tovább marad meg az erekben annál, mint amit a cortexben láttunk. Laminin-pozitív erek láthatók a GFAP-pozitív asztrocitákat (nyílhegy) tartalmazó területeken is. Számos asztrocita kapcsolódik az erekhez (figyeljük meg a sárga területeket, nyílak). Skála: 100 μm. 76. ábra: Gliovaszkuláris kapcsolatok a nesztin és a laminin, valamint a nesztin és fibronektin (képünkön) kettős festése esetén már a 18. embrionális naptól megfigyelhetőek. Skála: 100 μm. 5.2.6. Gliovaszkuláris kapcsolatok megjelenése Amikor a gliát nesztin elleni immunhisztokémiai reakcióval jelöltük, az ereket pedig a laminin vagy a fibronektin immunfestésével, kettősjelzést alkalmazva, a 18. embrionális kortól kezdve észleltünk az ereken sárga foltokat, amelyekről feltételeztük, hogy gliovaszkuláris kapcsolatoknak, végtalpaknak felelnek meg (76. ábra). A pontosabb lokalizáció érdekében konfokális mikroszkóppal is készíttettünk felvételeket (77-80. 51

ábrák). Ezek a vizsgálatok mutatták, hogy a 16. embrionális napon az ereken még nem láthatók glia végtalpak (77-78. ábrák), viszont a 18. napon már azonosíthatók (79. ábra), és a 20. napra már szinte beborítják az ereket (80. ábra). A fejlődő agyakon kapott eredményeinket a 3. táblázat foglalja össze (ld. a következő oldalt).

77- 80. ábra: Gliavégtalpak kialakulása ereken. Laminin-nesztin kettős jelzés, konfokális mikroszkópos felvételeken. A laminin-immunpozitivitást a zöld, a nesztint a piros szín jelzi, sárga színt kolokalizáció esetén látunk. 77-78. ábra: Tizenhatodik intrauterin nap: kevés ér látható, ezeken sincs gliavégtalp. A nesztin immunfestése a sejtek kontúrjait is jól kirajzolja. (77. ábra meningeális, 78. ábra kamrai felszín). Skála: 100 μm. 79. ábra: Tizennyolcadik intrauterin nap: glia-végtalpak egy éren. Skála: 20 μm. 80. ábra: Huszadik intrauterin nap: az éren számos végtalp látható. Skála: 20 μm.

52

3. táblázat Fejlődés alatti változások összegzése Napok

E12 E14 E16 E18 E20 P0

P3

P5

P7

P10 P12 P16 P20

Fibronektin +

+

+

+

+

+

+-

-

-

-

-

-

-

Laminin

+

+

+

+

+

+

+

+

+-

+-

-

-

-

D.-glikán

-

-

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Nestin

+

+

+

+**

+

+

+

+

+

+-

-

-

-

GFAP

-

-

-

-

-

-

-

-

-+

-+*

+

+

+

**végtalpak megjelenése; * fokozatos növekedés. ++- erős jelölődés, + van jelölődés, -+-szórványos jelölődés, - nincs jelölődés 5.3. Reaktív gliózis 5.3.1. Disztroglikán eltűnése és újbóli megjelenése a sérülést követően A léziókat a kéreg középső zónájában végeztük, ahol irodalmi adatok (ld. irodalmi háttér), de saját megfigyeléseink szerint is intakt agyban az asztrociták ritkán mutatnak GFAP-pozitivitást (81-82. ábrák), a sérülést követő GFAP-expresszió tehát igen feltűnő.

81. - 82. ábra: A kortex középső zónájában intakt agyban csak kevés asztrocita mutat GFAP immunpozitivitást (81. ábra), ld. a nyílat ill. a nagyított területet). Az erek itt is erősen jelölődnek disztroglikánnal (82. ábra). Skála: 50 μm.

53

Magának a gliareakciónak a követésére a GFAP elleni immunhisztokémiai reakciót használtunk. Vizsgáltuk ezenkívül a laminin immunreaktivitásának alakulását is. A második posztoperatív napon a lézió közelében a β-disztroglikán-immunpozitivitás eltűnt, bár az erek kontúrja felismerhető maradt (83. ábra). Távolabb a β-disztroglikán-immunpozitivitás megmaradt. Az asztrocita reakció ekkor még nem lépett fel, némi gyenge GFAPimmunopozitivitás érzékelhető, csakúgy, mint az intakt agyban (84 ábra). A műtét utáni negyedik napon asztrociták vették körül a sérült szövetet, a GFAP pozitiv asztrociták megtalálhatóak voltak mind a lézió közelében, ahol az erekben disztroglikán már nem mutatható ki, mind attól távol, ahol a disztroglikán-immunpozitivitás nem károsodott (85-86. ábrák). Az asztrociták rövidesen (az első hét végére) demarkálták a sérülést (87-88. ábrák). A reakció következő fázisára (a második posztoperatív héten) jellemző volt a GFAPpozitív asztrociták által elfoglalt terület, ill. a vaszkuláris β-disztroglikán-immunnegativitás területének egybeesése (89-90. ábrák). A sérüléstől távolabbi területeken az asztociták GFAPimmunreaktivitása ekkorra már visszatért az intakt agyban jellemző eloszlásra. Így azon a területen,

ahol

a

β-disztroglikán-immunpozitivitás

megmaradt,

GFAP-immunpozitív

asztrociták már alig voltak találhatók. A nyugvó és a reaktív glia határán több kettősen jelölődött ér található: a β-disztroglikán-immunpozitivitás éppúgy megfigyelhető, mint a GFAP pozitív glia-nyúlványok. Az a terület, amelyre kiterjed a reaktív asztrociták jelenléte illetve ezzel egyidejűleg β-disztroglikán-immunpozitivitás hiánya, megmaradt a következő napokban (91-92. ábrák). Az új glia limitans β-disztroglikán-immunpozitivitást is mutatott a GFAP mellett (93-94. ábrák). Ugyanakkor az új glia limitanst kialakító asztrociták maguk nem rajzolódtak ki a β-disztroglikán immunfestésével. A gliareakció területén eközben βdisztroglikán-immunpozitív erek jelentek meg a sérülés mentén. Ezen erek jelölődése eleinte sokkal kevésbé intenzív, mint az intakt agyban. Amint a β-disztroglikán-immunpozitív erek megjelentek a GFAP-immunpozitív asztrociták között, a kettősen (β-disztroglikán és GFAP) jelölt erek egyre gyakoribbá válnak. A harmadik műtét utáni hét végére így megszűnt a területi egybeesés az erek β-disztroglikán-negativitása és a gliareakció között (95-96. ábrák). A negyedik-ötödik héten az erek β-disztroglikán immunopozitivitása a sérülés körül megegyezett az intakt agyterületekben tapasztaltakéval (97-100. ábrák). A β-disztroglikánpozitív erek erek egészen a sérülés felszínén létrejött új glia limitansig követhetőek.

54

83-88. ábra: A gliareakció kiterjedése a 2. (83-84. ábrák) a 4. (85-86. ábrák) és a 7. (87-88. ábrák) posztoperativ napon a sérülés (helyét L jelzi) után. Kettős jelzés azonos metszeteken, 83., 85., és 87. ábrák: β-disztroglikán-, 84., 86., és 88. ábrák: GFAP-immunfestés. 83., 85., és 87. ábrák: A sérülés közelében az erek nem mutatnak β-disztroglikánimmunreaktivitást, bár a festetlen erek kontúrjai felismerhetőek (nyílhegy). Skála: 120 μm. 84. ábra: 2. posztoperativ nap: GFAP pozitív asztrociták csak szórványosan láthatóak (nyíl). Skála: 120 μm. 86. ábra: 4. posztoperativ nap: a gliareakció korai fázisa. GFAP-pozitív asztrociták jelentek meg a lézió környékén, bár elhatároló nyúlványrendszer még nem alakult ki. Nyílhegyek asztrociták disztroglikán-negatív érek körül. Skála: 120 μm. 88. ábra: 7. posztoperativ nap: az asztociták demarkálják a sérülést, megfigyelhetőek a sérülés felé hajló nyúlványok. Skála: 120 μm. 55

89-90. ábra: A 9. posztoperativ napon a gliareakciót (90. ábra, GFAP) azon a területen találjuk, ahol a β-disztroglikán (a 89. ábrán) nem jelöli az ereket. Ezzel ellentétben azokon a területeken, ahol az erek jelölődnek, nem láthatunk GFAP-immunpozitív asztrocitákat. A nyílhegyek a kettősen jelölt erekre mutatnak. Több kettősen jelölt ér is található a gliareakció határán. Skála: 120 μm. 91-92. ábra: A 12. posztoperativ napon hasonló a helyzet (91. ábra: disztroglikán, 92. ábra: GFAP). Skála: 120 μm.

56

93-94. ábra: A 14. posztoperativ nap: az újonnan képződött glia limitans (nyilak), amely a sérülés felszínén jött létre, immunpozitivitást mutat mind a β-disztroglikánnal (93. ábra), mind a GFAP-val (94. ábra). Igen halvány β-disztroglikán-immmunpozitív erek jelennek meg a gliareakció területén. Nyílhegy: kettősen jelölt ér. Skála: 120 μm. 95-96. ábra: A 18. posztoperativ napon amint a β-disztroglikán-immunpozitív erek megjelentek a GFAP-immunpozitív asztrociták között, a kettősen jelölt erek egyre gyakoribbá válnak (nyílhegyek). Skála: 120 μm.

57

97-100. ábra: 4: A végleges gliaheg létrejötte. 21. ill. 35. posztoperativ napok, 97., 99. ábrák: β-disztroglikán, 98., 100. ábrák: GFAP immunfestése (L: sérült terület, nyíl: az új glia limitans). A β-disztroglikán-pozitív erek behálózzák a maradék gliózis területét. Skála: 120 μm. 5.3.2. Laminin -immunreaktivitás megjelenése a sérülés körüli erekben. Míg az intakt agyállományba ágyazott erek nem mutattak immunoreaktivitást antilaminin 1 savó használatakor, szúrt sérülés környékén három nap múlva (korábbi időpontot nem vizsgáltunk) az erekben észlelhető volt a laminin immunpozitivitás. Amikor a laminin és a β-disztroglikán immunpozitivitását együtt vizsgáltuk (101-106. ábrák), akkor a lamininimmunpozitivitás az erekben rendszerint ott voltak található, ahol a β-disztroglikánimmunpozitivitást nem lehetett kimutatni, bár kettősen jelzett erek is előfordultak. A sérüléstől távol az erek csak β-disztroglikán-immunpozitivitást mutattak. Neuronokban is találtunk, az intakt agyhoz hasonlóan, laminin-immunpozitivitást (ld. pl. a 104. ábrát). Az 5.3.1. ill. 5.3.2. alfejezetek kettős immunjelzéssel kapott eredményeit színes felvételeken is bemutatjuk (107-110 ábrák).

58

Monoklonális ellenanyagokat használva a laminin β1 (111. ábra) vagy γ1 (112 ábra) lánca ellen, az erek mutattak immunpozitivitást a sérülés környékén. Nem volt immunpozitivitás kimutatható monoklonális antitestekkel a laminin α2 és β2 láncok ellen, sem a sérülés közelében, sem attól távol. 5.3.3. A laminin-immunpozitivitás eltűnése Ebben a kísérletsorozatban a sérülést követő laminin-immunopozitivitást és a gliareakciót együttesen vizsgáltuk, kettős immunfluoreszcens technikával, anti-laminin 1 és anti GFAP használatával, a sérülés utáni 2. héten. A GFAP-immunpozitivitás kiterjedtsége (113-114. ábrák) jelzi a gliareakcióét a lézió környékén. Neuronok most is festődtek az agy minden területén, beleértve az intakt területeket, de különösen szembetűnően a hippocampus piramissejtes rétegében (113. ábra). A reaktív gliózis mélyén az erek laminin immunpozitivitást nem mutattak, csak körvonaluk jelölődött a glianyúlványok által. A laminin és a GFAP együttes immunreaktivitását sárga szín jelezte, amely elsősorban a gliareakció határán volt megfigyelhető (113. ábra). A sérülés területére behatoló meningeális szövet erősen lamininpozitív volt. A 114. ábrán jól látszik a reaktív gliózis során képződött új (másodlagos) glia limitans és vele együtt, a meningeális szövet felé eső oldalon, az új lamina basalis (114. ábra). A sérülés területén az erek laminin-immunpozitívak, amíg el nem érik a glia limitanst. Innen kezdve a lamininimmunpozitivitást GFAP-pozitivitás váltja fel, az erekhez futó körülvevő glianyúlványok miatt. A laminin immunpozitivitás fokozatos eltűnése jól megfigyelhető egy ér kinagyított hosszanti metszetén (115. ábra). Először egy kettős, laminin pozitív (zöld) vonal határolja a lument, mintha két különálló lamina basalisról lenne szó. Ez a két vonal összeolvad amikor az erek belépnek a reaktív glia területére. Az ér színe átmegy sárgába, narancssárgába, jelezve a laminin-immunpozitivítás csökkenését, ill. a GFAP kolokalizációját, a gliális kapcsolatok kialakulását. Végül a piros szín válik dominánsá, mivel a lamininimmunpozitivitás eltűnik. Hasonló folyamatot láthatunk az 116. ábra érkeresztmetszetein. Az erek körül az immunfestés két pozitív réteget mutat ki a sérült területen (ld nagyított felvétel).

59

101-106. ábra: A β-disztroglikán (101., 103., 105. ábrák) és a laminin-immunreaktivitás (102., 104., 106. ábrák) összehasonlítása az agyi erekben sérülés hatására. A laminin-immunpozitív erek (nyilak, 102., 104., 106. ábrák) a sérülés területe körül (L), míg a β-disztroglikán immunpozitivak (nyílhegy, 101., 103., 105. ábrák) távolabb találhatóak Skála: 120 μm. A nyílak a 101., 103., 105. ábrákon azon erek körvonalára mutatnak, amelyek β-disztroglikán immunpozitivitást nem mutatnak, de lamininnel festődnek a 102., 104., 106. ábrákon. A nyílhegyek azokra a helyekre mutatnak, ahol β-disztroglikán-immunpozitivitást találunk, de laminin immunpozitivitás nem észlelhető a párhuzamos felvételeken. A kettősen jelzett erekre mind nyíl, mind nyílhegy mutat. Laminin-immunpozitivitás láthatók a neuronokban is (csillag).

60

107-110. ábra: Kettős jelzésű kombinált felvételek a sérülés területén az ábrák számítógépes összeolvasztásával, a sárga szín az immunpozitivitás kolokalizációját jelzi. 107-109 ábra (a 89. és 90.; 91. és 92.; 95. és 96. ábrák anyagából, a jelöléseket ld. ott): βdisztroglikán (piros) és GFAP (zöld)-pozitivitás: A GFAP-pozitív asztrociták a sérülés körül koncentrálódnak. Az érhálózat a gliareakció területén nem vagy kevéssé β-disztroglikán pozitív. Kettősen jelzett erek (nyílhegy, sárgás szín) figyelhetők meg a gliareakció határán. Skála: 120 μm. 110. ábra (a 101. és 102. ábra anyagából): A β-disztroglikán- (piros) és a laminin- (zöld) immunpozitivitás eloszlása a sérülés körül. A laminin-immunpozitív erek (nyíl) megtalálhatók a sérülés területén, míg a β-disztroglikán-immunpozitivitás (nyílhegy) csak attól távol. A kettősen jelzett területekre mind nyíl, mind nyílhegy mutat. Skála: 120 μm. Eredményeink szerint tehát erek elsősorban a sérült agyszövetnek abban a zónájában mutatnak laminin-immunpozitivitást, ahol reaktív glia még nem jelent meg, gliovaszkuláris kapcsolat még nem alakult ki. A reaktív gliózis területén csak a sérüléshez legközelebb lévő erek mutatnak laminin-immunpozitivitást. Ezek körül a GFAP jelölésével már kimutatható a perivaszkuláris glia. A sérüléstől távolabb az erek laminin-immunpozitivitása elvész, és körülöttük már csak perivaszkuláris glia található. Léziós kísérleteink eredményeit a 4. 61

táblázat foglalja össze. Látható, hogy a GFAP és a β-disztroglikán immunhisztokémiai vizsgálatával a sérülés utáni folyamat szakaszokra tagolható. Az integrin és a disztrofin vizsgálatát ld. lejjebb (5.3.4, 5.3.5). 4. táblázat A sérülés utáni gliareakció Napok 2 4 7 9 12 14 18 21 25 +* +* ++ ++ ++ ++ ++ 0 GFAP -+ + 0 Diglikán 0 0 ++ 0 0 0 0 0 0 Dp71 + + + + + ++0 Laminin 0 ++ ++ ++ + 0 0 Integrin ++- erős jelölődés, + van jelölődés, -+-szórványos jelölődés, - nincs jelölődés

28 ++ + 0 +0

35 + + 0 0 0

*A reakció kiterjed a Dg+ erek területére is

111-112. ábra: Monoklonális β1 (111. ábra) és a γ1 (111. ábra) antitest immunpozitivitásának eloszlása a kortex ugyanazon részletén a műtét utáni hetedik napon. Az agyfelszín a kép felső részén található, a L a sérülést jelzi. A sérülés közelében az erek immunpozitívak (nyilak). Skála: 20 μm. 113-116 ábra (ld. a túloldalt): Fluoreszcens kettős jelzés GFAP és laminin kimutatására. A laminin-immunpozitív stuktúrák zöldek, míg a GFAP-immunpozitivitás piros színnel jelenik meg. A sárga szín az együttes előfordulására utal. 113. ábra: Áttekintő felvétel a sérülésről és környezetéről. Azok az erek mutatnak kettős immunpozitivitást, amelyek a sérülés közvetlen közelében vannak (nyílhegy). Mélyen az agyban az erek nem mutatnak laminin-immunpozitivitást (nyíl). Az x-szel jelölt nyílhegy a gliális lamina basalisra mutat, amely demarkálja a szövethiányt. A kis nyílhegyek a lamininpozitív neuronokra mutatnak (piramidalis sejtek) a hippocampusban. Skála: 200 μm. 62

114. ábra: Erek hatolnak be a sérülést körülvevő agyállományból a sérülésbe. A kis hármas nyilak a reaktív gliózis határán lértejövő új glia limitansra és új lamina basalisra mutatnak. Megfigyelhető egy kettős, külső (sárga) és belső (zöld) határvonal. A laminin immunpozitivitás eltűnik azokban az erekben, amelyek áthaladnak ezen a rétegen (nyílhegy). A vastag nyíl egy olyan sárga területre mutat, amely műterméknek tűnik. Néhány asztrocitanyúlvány kinyúlik az erek mentén, túl a szövethiányon (nyílhegy, x). Skála: 60 μm. 115. ábra: Egy ér hosszanti metszete a gliareakció területén. Felül kettős vonal határolja a lument (kettős nyílhegy), amely egybeolvad egy vonallá (első nyílhegy balról). További nyílhegyek jelölik a fokozatos átmenetet zöldből pirosba, párhuzamosan az ér behatolásával az agyba. A nyílak az erek mélyebben fekvő részeire mutatnak. Skála: 20 μm. 116. ábra: Erek a sérülés (L) közelében (a nagyított kép a bal alsó sarokban). Az erek laminin-immunpozítivak (kettős nyílhegy), de nem GFAP-immunpozitívak a szövethiány közelében. A két nagy nyílhegy elkülöníti a két réteget. Más erek közül (x, y, kettős nyílhegy,

nyíl,

nyílhegy)

azokat

jelöltük,

amelyek

laminin

és/vagy

GFAP-

immunopozitivitást mutatnak. Az insetben látható, hogy az ér mindkét rétege lamininpozitiv, de a GFAP-pozitivitás csak a külsővel esik egybe (egyes és dupla nyílhegyek). Skála: 20 μm.

63

5.3.4. Disztrofin a reaktív gliában A vizsgálatot a műtéti sérülést követő 7. napon végeztük. Ekkor a sérülés körül Dp71f pozitív reaktív gliasejteket találtunk (117. ábra). Egyaránt jelölődtek a sérülést demarkáló ’anizomorf’, és kollaterális helyzetű ’izomorf’ asztrociták. Jelölt sejtek csak a sérülés közvetlen közelében fordultak elő, és soha nem terjedtek ki az egész azonosoldali cortexre, vagy éppenséggel az ellenkező oldali cortexre a corpus callosumon keresztül, amint az a GFAP esetében gyakran észlelhető. A Dys2 antitestek a léziót követően sem jelöltek asztrocitákat (118. ábra).

117-118. ábra: 5f3- és Dys2-immunopozitivitás a 7. posztoperativ napon. 117. ábra: Dp71f-pozitív reaktív gliasejtek találhatók a sérülés után (L- a sérülés helye) Mind a sérülést demarkáló anizomorf (nyíl), mind a kollaterális izomorf asztrociták (nyílhegy) jelölődnek. Skála: 30 μm. 118. ábra: A Dys2 antitestek nem jelölték a lézió környezetében lévő asztrocitákat. A kettős nyilak szövettörmelékre mutatnak. Skála: 30 μm. 5.3.5. Integrinek a reaktív gliában. Következetesen, összefüggő érhálózatban αV- ill. β1-integrin-immunpozitivitást nem találtunk sem a fejlődő, sem a kifejlett, intakt állatokban, a meningeális erekben sem.

64

Sérülést követően a második posztoperatív napon az integrin-αV-immunpozitítás neuronokban kimutatható, asztrocitákon nem (119. ábra).

119-122. ábra. Integrin αV-immunpozitivitás sérülés hatására: 119. ábra: A 2. posztoperatív napon (POD2) az αV-immunpozitítás csak neuronokban mutatható ki (nyilak). Skála: 100 μm. 120. ábra: A 4. napon a sérülés környékén sok immunpozitiv asztrocita található (nyilak). Ld. insetben egy eret, amelyet immunpozitív glia-végtalpak borítanak. Skála: 100 μm. 121. ábra: A 12. posztoperativ napra az immunpozitivitás sokat gyengül, de a sérülés közvetlen közelében még megfigyelhetőek jelölődött asztrociták. Nyíl: ér, a perivaszkuláris végtalpak jelölődtek. Skála: 100 μm. 122. ábra: A14. posztoperativ napon αV-immunpozitivitás már nem látható. Skála: 100 μm.

A negyedik posztoperatív napon a sérülés környékén integrin αV-immunpozitiv asztrociták jelentek meg (120. ábra), a reakció ezen a napon a legerősebb. A 7. napon továbbra is megfigyelhetők intergrin-αV immunpozitív asztrociták, de a 12. napig a sérülés közvetlen

65

közelébe szorulnak vissza, immunreaktivitásuk pedig egyre gyengül (121. ábra). A 14. napon immunpozitív asztrociták már nem láthatóak (122. ábra). 6. Megbeszélés 6.1. A laminin immunopozitivitás ill. –negativitás magyarázata Mivel a laminin állandó komponense a lamina basalisnak, feltehetőleg nem jelenléte, hanem kimutatása a probléma. Az irodalmi adatokat áttekintve a következő álláspontokat találjuk: 1.

Az agyi erek mindenütt mutatnak laminin-immunpozitivitást (Ekblom és mtsai 1982,

Mauro és mtsai 1984). Ezekben a kísérletekben a metszetek (általában parafinos metszetek) az immunreakció előtt átestek egy pepszines vagy kollagenázos kezelésen, tehát antigénfeltáráson. Alternativaként Eriksdotter-Nilson és mtsai (1986) azt találták, hogy a lamininimmmunpozitivitás kimutatható az agyban enzimatikus előkezelés nélkül is fagyasztva metszéses technikával, nem fixált anyagon. A fagyasztás azonban tkp. maga is egyfajta feltárásnak tekinthető. 2.

A fixálás erősségétől függ, hogy látható-e az erek körül laminin-immunpozitivitás

(Jucker és mtsai 1992). A perfúziót követő rövid fixálás estén, ill. hosszabb fixálás után. A túl erős fixálás károsítja a laminin antigéndeterminánsait. Jucker és mtsai (1992) szerint a laminin- immunpozitivitás kimutatható a felnőtt, intakt agyi erekben, ha a fixálás után eltelt idő kevesebb, mint 4 óra. 3.

Más munkacsoportok véleménye szerint a laminin-immunpozitivitás az erek

tulajdonságaitól függ. Az újszülött patkány erei erős laminin-immunpozitivitást mutatnak (Zhou 1990). Ez a születés utáni tizenegyedik napra eltűnik (Krum és mtsai 1991), kivéve a cirkumventrikuláris szerveket. Sérülés nyomán a laminin-immunpozitivitás újra megjelenik az agyi erekben (Hagg és mtsai 1989, Shigematsu és mtsai 1989ab, Sixt és mtsai 2001, Sosale és mtsai 1988), de a gyógyulási fázis folyamán újra eltűnik, kb. egy hónap leteltével. Krum és Rosenstein (1989) éppenséggel a sérülés ill. transzplantáció utáni érképződés jelének tekintik a laminin-immunpozitivitást. A mi eredményeink a harmadik esetet látszanak inkább alátámasztani. A fixálás hatása ellen szól, hogy azok az erek, amelyek belépnek az agyba vagy a sérülés ürege felől, vagy az intakt meningeális felszín felől jönnek, jobban jelölődnek, nem úgy mint azok az erek, amelyek az intakt agyban helyezkednek el. A cirkumventrikuláris szervek ereinek

66

immunpozitivitása, szintén cáfolja a fixálás döntő szerepét. Ugyanakkor a késleltetett fixálás (post-mortem kísérlet) csak részben volt eredményes. A laminin-immunpozitivitásnak az erek tulajdonságaitól való függésére két magyarázat adódik: a) Felvetődik, hogy az agyi erekben olyan laminin-típusok vannak, ill. jelennek meg a lamina basalis átépülésével kapcsolatosan, a fejlődés során, illetve a sérülés utáni gyógyulás alatt, amelyeket nem tudunk kimutatni. Ilyen átépülésre vannak adatok, agyban és másutt (Ekblom és mtsai 1998, Falk és mtsai 1999, Malinda és mtsai 1999, Miner és mtsai 1997, Sephel és mtsai 1996, Tiger és mtsai 1997). A laminin 1 ellen képzett poliklonális immunsavó várhatóan (gyártó cég refenciái alapján, ill. irodalmi adatok szerint) minden olyan lamininnel reagál, amiben akár α1, akár β1, akár γ1 alegység előfordul, mivel ezek a laminin 1 alegységei. Nem zárható ki azonban, hogy a különböző laminin alegységek nem egyforma erősen reagálnak antitestjeikkel, ezért vizsgáltuk meg, a β1 és a β2 alegységek lokalizációját monoklonális ellenagyaggal. Egyik sem adott immunreakciót az intakt agyszövet ereivel, az agyburok is csak a β1 esetében mutatott festődést. Ez arra utal, hogy valóban eltérő lehet az egyes alegységek szerepe a vizuálisan értékelhető immunreakció kialakításában, és közülük talán az alfa alegység lehet a domináns. Egyes munkacsoportok szerint az α1 lánc csak a fejlődésben lévő erekre jellemző (Falk és mtsai 1999, Malinda és mtsai 1999). Két α láncról tartják azt, hogy esetleg részben a helyére lép az agyi erek fejlődése során. Ezek közül az egyik az α2 (Falk és mtsai 1999, Hunter és mtsai 1992, Jucker és mtsai 1996b, Malinda és mtsai 1999, Tian és mtsai 1996, Toti és mtsai 1998) amely a laminin 2, 4 és 12 kialakításában vesz részt. A másik gyanúsított az α5, amely 1998 előtt monoklonális 4C7 antitestként volt ismert (Church és Aplin 1998, Ekblom és mtsai 1998, Ferletta és Ekblom 1999, Miner és mtsai 1995, Tiger és mtsai 1997, Wagner és mtsai 1997). Sixt és mtsai (2001), ill. Hallmann és mtsai (2005) szerint a perivaszkuláris asztrociták laminin 1 és 2-t (α2β1γ1) képeznek, az endotél pedig laminin 8-at (α4β2γ1) és 10-et (α5β2γ1) Mi az α2-t és a β-t nem tudtuk kimutatni, még sérülés körül sem. Laminin 7, 8 és 9 nem tartalmaznak sem α1-et sem α2-t, de tartalmaznak γ1-et és β1et, vagy β2-t. Éppen a legutóbb felfedezett lamininok (a laminin 13, 14, 15 Colognato és Yurchenko 2000, Libby és mtsai 2000) tartalmaznak legalább egy láncot (β2-t), amely reagál az általunk használt antitesttel. A lamininek összetételére vonatkozó 1. táblázat (15. oldal) 67

szerint a laminin 1 alkotásában résztvevő alegységek közül a γ-1 minden eddig ismert lamininben előfordul, kivéve a laminin 5-öt. Ez a laminin lenne a legjobb jelölt, amely magyarázná a negatív eredményeket. Leginkább azonban a hámban fordul elő (Champliaud és mtsai 1996), csak Wagner és mtsai (1997) tudták kimutatni agyi erekben. Ez a laminin viszont nem kötődik a nidogénhez és a kollagén IV-hez, ezért csak laminin 6 jelenlétében épülhet be a lamina basalisba (Aumailley és Gayraud 1998, Champliaud és mtsai 1996, Ekblom és mtsai 1998). A laminin 6 viszont tartalmaz β1 és γ1 láncokat. b) A másik lehetőség, hogy az agyi erek érett lamina basálisán a laminin antigéndeterminánsai nem hozzáférhetőek az antitestek számára. A lamina basalis az agyi erek és a perivaszkuláris glia között valójában a két lamina basalis összeolvadásából jön létre: az egyik a gliáé (parenchimális) míg a másik az éré (Bär és Wolff 1972, Del Zoppo és Hallenbeck 2000, Hallman és mtsai 2005, Marin-Padilla 1985, Sixt és mtsai 2001). Ez az összeolvadás nem csak fény- vagy elektronmikroszkópos szinten, hanem molekuláris szinten is létrejön, azaz pl. immunglobulin-molekulák nem hatolhatnak be közéjük. Így a laminin az immunreakció számára hozzáférhetetlenné válik. Azok az eredmények, melyek szerint a laminin kimutatható, olyan esetekből származnak, ahol az összeolvadás nem teljes (VirchowRobin tér, cirkumventrikuláris szervek, sérülések, fejlődő agy, ld. fentebb). Bár az agy piális felszínét határoló membrana limitans glia externát és a perivaszkuláris gliát külön struktúraként szokás leírni, valójában azonban az előbbi az agyi ereknek az agyba való belépésénél a Virchow-Robin rések fokozatos összeszűkülésével, és eltűnésével átmegy az utóbbiba. Ezen a helyen az agyfelszínt borító ill. az ér körüli lamina basalis összeolvad. Újszülött patkányban az elektonmikroszkópos tanulmányok egy nagy perivaszkularis rést mutattak ki a különálló külső (gliális) és a belső (vaszkuláris) lamina basalis között (Bär és Wolff 1972, Caley és Maxwell 1970, Marin-Padilla 1985, Risau és Lemmon 1988, Jiang és mtsai 1994). Később egy „közös” lamina basalis alakul ki, és ez a két réteg összeolvad, és eltűnik a perivaszkuláris rés. Az erek hisztológiai ’érettsége’ ezek szerint, a gliovaszkuláris kapcsolat megjelenésével, az agyszövetet határoló glia limitans externa lamina basalisa, az ér lamina basalisának összefekvésével jön létre, ezt jelzi a laminin immunpozitivitás eltűnése. A 12. posztnatális napra teszik azt az időpont amikor a gliovaszkularis kapcsolatok létrejönnek (Bär és Wolff 1972, Caley és Maxwell 1970) és megszűnik az erek növekedése (Krum és Rosenstein 1989, Krum és mtsai 1991). Ezzel összhangban áll az a megfigyelés, hogy a cirkumventrikuláris szervek esetén, ahol a perivaszkuláris rés nem tűnik el (Krisch és Leonhard 1978, Palkovits 1986), a két különálló lamina basalis megmarad, az immunpozitívitás kifejlett állatban is kimutatható 68

(Krum és mtsai 1991). Ez a jelenség az átjárható vér-agy gáttal rendelkező cirkumventrikuláris szervekben észlelhető (tehát a szubkommisszurális szervben nem), bár érdekes módon ezek körül különösen erős GFAP festődésű glia található (Hajós és Kálmán 1989). Sérülés hatása a gliovaszkuláris glia limitans felbomlik, és ennek hatására a gliavaszkularis kapcsolatok „szétesnek ” (Jaeger és Blight 1997, Del Zoppo és Milner 2006). A sérülés utáni gyógyulási folyamat érinti a glia és a basalis lamina kapcsolatának helyreállását is. A laminin immunpozitivitás megjelenése az erekben sérülés után (Hagg és mtsai 1989, Krum és mtsai 1991, Shigematsu és mtsai 1989ab, Sixt és mtsai 2001, Sosale és mtsai 1988) utalhat az érújraképződésre és a lamina basalis újraképződésére a sérülés következtében (Banda és mtsai 1982, Sephel és mtsai 1996, Shigematsu és mtsai 1989ab). A sérülés után a reaktív glia körbekeríti a roncsolt szövetet egy új, másodlagos glia limitansszal (Carbonell és Boya 1988), laminint termel, és létrehozza a lamina basalist (Bernstein és mtsai 1985, Liesi és Kauppila 2007, Liesi és Risteli 1989, Liesi és mtsai 1984, Ogawa és mtsai 1989). Egy hónap időtartam megegyezik azzal az idővel, amely alatt a sérülést követő reaktív gliózis is visszahúzódik (Krum és mtsai 1991, Mathewson és Berry 1984). A laminin-immunpozitivitás eltűnése tehát jele lehet az erek érésének, a gliovaszkuláris kapcsolatok helyreállásának az agyi érújraképződés során. Saját vizsgálataink megerősítik a Virchow-Robin-réssel, a fejlődő aggyal, a cirkumventrikuláris szervekkel, ill. a sérülésekkel kapcsolatos megfigyeléseket. Tapasztaltuk, hogy a laminin-immunpozitivitás megszűnik a sérülés utáni gliovaszkuláris kapcsolatok helyreállásával. Mindezt összevetve azzal, hogy enzimes feltárás vagy fagyasztás hatására intakt agyon is észlelhető az erek laminin-immunpozitivitása (Ekblom és mtsai 1982, Eriksdotter-Nilson és mtsai 1986, Mauro és mtsai 1984), azokkal értünk egyet (ld. pl. Krum és Rosenstein 1989, Krum és mtsai 1991), akik szerint a laminin-immunreaktivitás azért hiányzik, mert a laminin hozzáférhetetlen az ellenanyagok számára, a vaszkuláris és gliális (parenchimális) lamina basalisok összefekvése miatt. (ld. a 6. ábrát, 2.3.3) A fagyasztvametszés immunpozitivitást elősegítő szerepét magunk is tapasztaltuk, de a fagyasztás tkp. egyfajta feltárásnak is tekinthető. A kollagenáz hatása (Mauro és mtsai 1984) arra utal, hogy a IV típusú kollagén, a lamina basalis állandó alkotója, maszkírozza a laminin epitópjait. Valószínű, hogy ehhez az aldehides fixálás is hozzásegít a kialakuló keresztkötések által. Mint lejjebb részletesen diszkutáljuk (ld. 6.2.) a mátrix-metalloproteázok aktivitása az agyi sérülések körül megnő. Ezek egyben kollagenáz hatásúak is. ami a fentiek szerint elősegíti a cerebrovaszkuláris laminin immunhisztokémiai kimutathatóságát. 69

Végezetül megemlítjük, hogy a neuronok laminin-immunpozitivitása, ami számos ábránkon látható, jól ismert jelenség, bár funkcionális magyarázata tudtunkkal nincsen (Hagg és mtsai 1989, 1997, Jucker és mtsai 1992, 1996a, Powell és Kleinmann 1997, Yamamoto és mtsai 1988, Zhou 1990). 6.2.

A

β-disztroglikán

immunpozitivitás

eltűnése

a

gliovaszkuláris

kapcsolat

„szétkapcsolódásának ” jele lenne? Az, hogy az erek körvonala felismerhető volt a β-disztroglikán-immunpozitivitás elvesztése ellenére is ill. az, hogy az erek laminin-immunpozitívitása kimutatható, azt sugallja, hogy a β-disztroglikán-immunpozitivitás hiánya nem az erek pusztulására, teljes eltűnésére vezethető vissza. Hasonlóan csökkent β-disztroglikán-immunpozitivitást észleltek Agrawal és mtsai (2006) kísérletes autoimmun encephalitis során, és Milner és mtsai (2008) agyi ischémia során. A jelenséget a β-disztroglikán metalloproteinázok általi hasításának tulajdonították, amely okozhatja a β-disztroglikán-immunpozitivitás csökkenését, ahogy azt Milner és mtsai (2008) bebizonyították. A metalloproteináz-2 és -9 eltávolítja azt a részt a βdisztroglikánból, amely az α-disztroglikánnal -és ezáltal a lamininnel- (Yamada és mtsai 1996) köti össze. A sejtmembrán és az extracelluláris mátrix közötti kapcsolat ’felszakadása’ pl a βdisztroglikán hasítása révén, feltétele lehet a szöveti átrendeződésnek, számos fiziológiai és patológia folyamatban (Yamada és mtsai 1996). Ez a fent leírt mechanizmus vezethet pl a szinapszisok felszakadásához (Michalak és Opas 1997, Paggi és mtsai 2006) és a daganatszóródáshoz (Brennan és mtsai 2004) is. Több adat áll rendelkezésre arról is, hogy a mátrix-metalloproteináz aktivitás megnő különféle agyi sérülések hatására pl. ischémia, trauma, vagy gyulladás (Asahi és mtsai 2000, Chang és mtsai 2003, Del Zoppo és mtsai 2007, Fukuda és mtsai 2004, Milner és mtsai 2008, Yong 2005), ami a gliovaszkuláris kapcsolatok fellazulásához vezet. Megjegyzendő azonban, hogy a szétkapcsolódásnak más mechanizmusai is lehetnek, pl. a β1-tartalmú integrinek mennyiségének csökkenése (Del Zoppo és Milner 2006, Del Zoppo és mtsai 2006 áttekintése nyomán). A gliovaszkuláris kapcsolat elengedhetetlenül szükséges az endotélsejtek számára a vér-agy gát létrehozásához (Abbott 2002, Janzer és Raff 1987, Risau és Wolburg 1990, Taocheng és mtsai 1987, Walburg és Risau 1995, Wolburg és mtsai 1994). Sérülés hatására a gliovaszkuláris kapcsolatok leválnak az erekről, a vér-agy gát elveszti az integritását „áteresztő” lesz (Del Zoppo és Hallenbeck 2000, Del Zoppo és Mabuchi 2003, Del Zoppo és 70

mtsai 2006, Jaeger és Blight 1997, Nag és mtsai 1997, Schnell és mtsai 1999, Wagner és mtsai 1997), átjárhatóvá válik a vétplazma és a fehérvérsejtek számára. A disztroglikándisztofin komplex és a disztroglikán-laminin kapcsolat integritása szükséges a gliovaszkuláris kötödéshez, az agyi érrendszer stabilitásához, és a vér-agy gát fennmaradásához (Del Zoppo és Mabuchi 2003, Del Zoppo és mtsai 2006, Jancsik és Hajós 1999, Nico és mtsai 2003, 2004, Zaccaria és mtsai 2001) valamint az akvaporin- és kálium-csatornák (Kir 4.1) megfelelő elrendeződéséhez (Amiry-Moghaddam és mtsai 2003ab, 2004, Frigeri és mtsai 2001, Nelly és mtsai 2001, Warth és mtsai 2004, 2005). A disztroglikánt nem tartalmazó null-mutáns egerek lamina basalisa nem folytonos (Moore és mtsai 2002). A mi kísérleteink, amelyeket során más típusú sérüléssel kaptunk, mint Agrawal és mtsai (2006) és Milner és mtsai (2008), alátámasztják azt a megfigyelést, hogy a βdisztroglikán immunpozitivitás elvesztése az általános jelenség agyi sérülést követően. Az a jelenség, hogy laminin-immunpozitív erek mutathatóak ki ott, ahol a β-disztroglikán immunpozitivitás

hiányzik,

valószínűleg

szintén

visszavezethető

a

gliovaszkuláris

kapcsolatok fellazulására, ill. a mátrix-metalloproteinázok aktivitására, mivel ezek kollagenáz hatásúak is, a kollagenáz pedig, mint az előző pontban említettük, mesterségesen alkalmazva elősegíti a cerebrovaszkuláris laminin kimutatását (Mauro és mtsai 1984). 6.3. Kölcsönös erősítés a gliareakció és a gliovaszkuláris kapcsolat szétkapcsolódása között? A sérülés közelében a gliareakció erős és elhúzódó, és területe egybeesik azokkal a területekkel, ahol az erek elvesztették a β-disztroglikán-immunpozitivitásukat. Itt lehet szerepe kölcsönös erősítésnek. Az erekből kilépő, és a sérülés felé diffundáló anyagok hatására a mikroglia (Del Zoppo és mtsai 2007, Lee és mtsai 2007) és később a reaktív asztrocita is expresszál mátrix-metalloproteinázokat (Gotschall és Deb 1996, Swanson és mtsai 2004), amelyek képesek hasítani –többek között- a β-disztroglikánt is. Vegyük figyelembe azt is, hogy a β-disztroglikán hasítása fokozhatja mind az agyi erek áteresztőképességét, mind a gliareakciót. Moore és mtsai szerint (2002) a disztroglikán hiánya (null-mutáns egerekben) a GFAP expresszió növekedéséhez vezet, valószínűleg a penetráló anyagok miatt. A reaktív asztrociták tehát fenntarthatják és elősegítik a β-disztroglikán hiányát, és fordítva. Ez a jelenség lehet az alapja annak, hogy egy bizonyos szakaszban a reaktív gliózis területe megegyezik azzal, ahol hiányzik az erek β-disztroglikán-immunpozitivitása. Ez a szakasz összevethető Mathewson és Berry (1984) ill. Hozumi és mtsai (1990)

71

immunhisztokémiai és biokémiai eredményeivel, amely szerint a gliareakció intenzív a sérülés utáni második héten, Hsu és mtsai (2006) pedig emelkedett metalloproteináz 2 aktivitást találtak a 7-14. posztoperatív napon azokon az asztrocitákon, amelyek a sérülést határolják. A GFAP-expresszió szükségesnek látszik a vér-agy gát helyreállításához (Pekny és mtsai 1998), valószínűleg azért, mert szükséges a perivaszkuláris glianyúlványok citoszkeletonjának kialakításához. 6.4. A disztroglikán immunpozitivitásának nyomonkövetése segít meghatározni a sérülés utáni reakció szakaszait A β-disztroglikán immunhisztokémiai feltérképezése (a GFAP mellett) segít a sérülés utáni gliareakció lépéseit nyomon követni, és a különböző stádiumait meghatározni (ld. 3. táblázat). 1. A β-disztroglikán-immunpozitivitásának eltűnése megelőzi a GFAP pozitívitás feltűnését. 2. A korai fázisban a GFAP-immunpozitivitás azokon a sérüléstől távoli területeken is megnő, amely ereinek β-disztroglikán immunpozitivitása megmarad. 3. Később a gliareakció kiterjedése csak azzal a területtel esik egybe, ahol az erek elvesztik a β-disztroglikán-immunpozitivitásukat. 4. A β-disztroglikán-immunopzitivitás a lézió körüli ereken is megjelenik, amelyek körül reaktív glia van. A mi megfigyeléseink szerint a β-disztroglikán-immunopozitivitás visszatér a 18. napon. Ez a periódus kb. egybeesik a vér-agy gát sérülés utáni átjárhatóságával (Jaeger és Blight 1997), tehát a gliovaszkuláris kapcsolatok rendeződésével. A β-disztroglikán és a laminin és talán az extracelluláris mátrix más összetevőinek, valamint a disztroglikán-disztrofin komplexnek vizsgálata lehetővé teszi, hogy több információt nyerjünk az agyi erek fejlődéséről, éréséről, funkcionális állapotáról és pathológiájáról, beleértve az agytumorokat is. 6.5. Dp71 eloszlása a kifelett patkány agyában Sejtkultúrákon végzett kísérletekben megfigyelték, hogy az 5f3 jelöli a GFAP pozitív asztocitákat (Garcia-Tovar és mtsai 2001). A mi kettős-jelzéses kísérleteink in situ igazolták a DP71f jelenlétét az asztrocitákban, de a Dp71d-jét nem. Az 5f3 antitestet, amely specifikusan jelöli a Dp71f hidrofil részét, Mornet és munkatársai állították elő, és ellenőrizték (Montpellier, Franciaország, ld. Fabbrizio és mtsai 1994).

72

A Dys2-antitest a molekula C- terminális részét ismeri fel, amely azonos mind a teljes molekulahosszúságú Dp427, mind a Dp71d, és más rövid izoformák esetében. A negatív eredmény, amelyet a Dys2-antitest használatakor kaptunk, megerősíti a mások által már korábban publikált eredményeket, akik ezeket a disztrofinokat asztrocitákban nem tudták kimutatni, csak neuronokban, pl. Lidov (1996). A GFAP csak bizonyos asztrocita-populációkban van jelen fénymikroszkóppal megjeleníthető szinten (Connor és Berkowitz 1985, Hajós és Kálmán 1989, Kálmán és Hajós 1989, Linser 1985, Ludwin és mtsai 1976, Patel és mtsai 1985, Zilles és mtsai 1991). Kísérleteinkben az 5f3-mal jelölt Dp71f-pozitív stukturák ott jelentek meg, ahol mindig találhatók GFAP-pozitív asztrociták (glia limitans, perivaszkuláris glia, cirkumventrikuláris szervek, szubependimális asztrociták, és a hippocampus, a substantia nigra, habenula, nucleus interpeduncularis, pallidum). A glia limitans és a perivaszkularis glia esetében egyben lamina basalis-kialakító asztrocitákról van szó. Ideérthető a circumventrikuláris szervek gliája és a Bergmann-glia, sőt, a reaktív glia is, amely szintén képez lamina basalist (Bernstein és mtsai 1985, Liesi és Kauppila 2007, Liesi és Risteli 1989, Liesi és mtsai 1984, Ogawa és mtsai 1989). Az 5f3-jelölődés az oldalkamra elülső szarvánál megfelel annak a reziduális szubventrikuláris zónának, amelyben az embrionális extracelluláris mátrix megmarad, és egyebeken kívül laminin is kimutatható (Gates és mtsai 1995, Gressens és mtsai 1992, Quiñones-Hinojosa és mtsai 2006). Az általunk megfigyelt lépesméz-szerű rajzolat az 5f3 használata nyomán létrejöhet a sejtek körvonalának jelölődésével. Ezen a területen Mercier és Hatton (2000) ill. Mercier és mtsai (2002) észleltek egy laminint tartalmazó, az erek lamina basalisáról leváló hálózatról, amelyet fraktonnak neveztek el, a fraktál-szerű elhelyezkedése miatt, és amely az agyi erektől az ependimáig terjed. Ezzel lehetnek kapcsolatosak az 5f3 antitesttek által jelölt szubependimalis asztrocitaszerű sejtek is. Lehetséges, hogy az 5f3 pozitív sejtek lennének azok az őssejtek vagy prekurzor sejtek a felnőtt agyban, amelyekről az utóbbi évtizedben számos közlemény megjelent? (Ld. Doetsch és mtsai 1999, Doetsch 2003, Seri és mtsai 2001). Ezzel jól összeegyeztethető, hogy a Dp71 mRNS egyike az első RNS-eknek, amelyek megjelennek a fejlődés során, és jelen van a gyorsan megjelenő pluripotens őssejtekben. Kísérleteink szerint a Dp71f expressziója előfordul a reaktív gliában, bár soha nem olyan kiterjedt, mint a GFAP esetében (Mathewson és Berry 1984, Moumdijan és mtsai 1991) pl nem terjed ki a távolabbi kortex területekre illetve a corpus callosum útján az ellenoldali kortexbe. 73

6.6. A fejlődő állatok vizsgálata Patkányban az erek belépése a cortexbe a 10-11. napon kezdődik (Bär és Wolff 1972, Kálmán és Tuba 1993). Fibronektin és laminin az irodalmi adatok szerint már a vaszkularizáció kezdetén jelen van, a fibronektin elősegíti az endotélsejtek migrációját és proliferációját, a laminin pedig elrendeződésüket (Grant és mtsai 1990, Jiang és mtsai 1994, Risau és Lemmon 1988). A specializált ér-glia kontaktusok megjelenését a 18-20. napra teszik (ez függhet az alkalmazott metodikától is, Fedoroff 1986, Rosenstein és More 1994), egyezően a mi megfigyeléseinkkel. A disztroglikán megjelenése viszont a laminin megjelenése utánra, de a gliovaszkuláris kapcsolatok kialakulása elé esik, azt mintegy előkészíti. Itt két kérdés vetődik fel: - Hogyan lehetséges, hogy a laminin előbb jelenik meg, mint receptora? -

Hogyan lehetséges, hogy a disztroglikán immunfestése kirajzolja a teljes érhálózatot, még a glia végtalpak megjelenése előtt?

Az első kérdésre az a válasz adódik, hogy a disztroglikán megjelenése előtt integrinek szolgálhatnak a laminin receptorául (az integrineknek az agyi vaszkularizációban játszott szerepének áttekintésre ld. pl. Del Zoppo és Milner 2006, Del Zoppo és mtsai 2006, Francis és mtsai 2002, Milner és Campbell 2002ab). A másik kérdéshez meg kell említeni, hogy többen úgy vélekednek, hogy disztroglikán csak glián fordul elő, míg az endotélnek a közös lamina basalishoz való rögzülését integrinek biztosítják (Culligan és mtsai 2001, Hallmann és mtsai 2005, Sixt és mtsai 2001, Tian és mtsai 1996). Mások szerint az endotélen is van disztroglikán (Hosokawa és mtsai 2001, Shimizu és mtsai 1999). Eredményeink ezzel jobban összeegyeztethetőek. A posztnatális fejlődés során az, hogy előbb a fibronektin tűnik el az erek körül, utána a laminin, a perivaszkuláris rés kisebb fokú beszűkülését jelezheti, végleges eltűnése előtt. Másik magyarázat az ’integrin switch’ az első posztnatalis napokon (Milner és Campbell 2002b), ti. a fibronektin-kötő α4β1, α5β1 integrinek felváltása laminin-kötőkkel (α1β1, α6β1). A laminin-pozitivitás vége (12. nap) jó egyezést mutat azzal az idővel, amikorra az érfejlődés fő szakasza végetér, az embrionális erek körüli tág szövetrések eltűnnek, és megjelennek az asztrocita-végtalpak (Caley és Maxwell 1970, Jancsik és Hajós 1999, Krum és mtsai 1991, Robertson és mtsai 1985, Rowan és Maxwell 1981), azaz a 10-12 posztnatális nappal. Ugyanakkor kb. párhuzamos azzal a periódussal, amikor a nesztin- és vimentintartalmú radiális gliát felváltják a GFAP-tartalmú asztrociták (a második posztnatális héten).

74

Az időbeni egyezés ellenére azonban helyi kapcsolat nincsen a két folyamat között, pedig ez a meghatározott térbeni elrendeződésben (középről a felszín és a mély rétegek felé) eltűnő

laminin-immunpozitivitás

esetén

könnyen

észrevehető

lenne.

A

laminin

immunreaktivitás eltűnése észlelhető ott is, ahol még radiális glia van, ugyanakkor megtartott lehet GFAP-tartalmú asztrociták jelenlétében is. Nem felel meg a laminin ’eltűnésének’ ’menetrendje’ az agykérgi vaszkularizáció fő hullámainak sem: Rowan és Maxwell (1981) szerint a vaszkularizáció először a felszínhez közel intenzív (a születés utáni első négy napon), utána a középtájon (de a felszíni és mély zónákban is) a 6-12. napon. Meg kell azonban jegyezni, hogy a kéreg középső része azon területek közé tartozik, ahol a GFAPexpresszió gyenge, kevés a GFAP-pozitív asztrocita (Ludwin és mtsai 1976, Kálmán és Hajós 1989, Zilles és mtsai 1991). Lehetséges tehát, hogy a laminin-mentes erek ilyen asztrocitákkal állnak kapcsolatban, bár a perivaszkuláris glia általában GFAP-pozitív. Eredményeink alapján a következő szakaszokat különböztethetjük meg: E16 előtt: fibronektin, laminin E16-P0: fibronektin, laminin, disztroglikán E18 után: nesztin végtalpak elszaporodása P0– P5 laminin, disztroglikán, fogyó fibronektin, P5 – P7 laminin, disztroglikán P7-P12 disztroglikán, laminin fokozatos eltűnése, nesztin/GFAP, radiális glia/asztrocita váltás P12 – kifejlettre jellemző. Ezek az adatok a neokortexre vonatkoznak. Más területeken a vaszkuláris folyamatok máskor mehetnek végbe, mint arról a szövegben szó esik. 6.7. Integrinek Irodalmi adatok is bizonyítják, hogy az általunk vizsgált alegységek: αV, β1 (főleg a fibronektin-kötő α4β1, α5β1, laminin-kötő α1β1, α6β1, αVβ3) szerepet játszanak az erek fejlődése során (Del Zoppo és Milner 2006, Del Zoppo és mtsai 2006, Francis és mtsai 2002, Milner és Campbell 2002ab). Ennek ellenére fejlődő, ill. kifejlett, de intakt állatokon egyik alegységet sem sikerült következetesen, összefüggő érhálózatban kimutatnunk. Mivel integrineket általában fénymikroszkópos immunhisztokémiával ki lehet mutatni, nyilván technikai problémával kerültünk szembe. Az integrineknek fontos szerep jut az agyi erek patológiás folyamataiban. Áttekintő cikkek alapján (Del Zoppo és Milner 2006 Del Zoppo és mtsai 2006, Milner és Campbell

75

2002a) a β1 alegység expressziója nőhet vagy csökkenhet a károsodás jellegétől függően, akut ischemiában pl. csökken. Ez is magyarázathatja, hogy sérülés után sem tudtuk kimutatni. Az αVβ3 fokozott immunoreaktivitását kimutaták fokális ischemiában (Okada és mtsai 1996), de endotélsejteken. Asztrocitákon az αVβ5 ill. αVβ 8 jelenlétét mutaták ki éretlen alakokon ill. sejtkultúrában (Milner és mtsai 2001). Reaktív asztrocitákon αV megjelenését tudtunkkal mi észleltük először. Ennek ’csúcsa’ éppen arra a periódusra esett, amelyben másik kísérletsorozatunkban a disztroglikán-immunpozitivitás már eltűnt, de a disztroglikán-negativitás és a GFAP-immunpozitivitás területi ’koincidenciája’ még nem alakult ki (ld. 3. táblázat). A fokozott immunreaktivitás oka lehet a disztroglikán kiesésének kompenzálása (ld. 6.2), vagy esetleg az integrinek ’szabaddá válása’ a gliovaszkuláris kapcsolatok oldódásakor, hasonlóan ahhoz, amit a lamininin esetében leírtunk (lld. 6.1). 7. Új kísérletes eredmények összegzése. Következtetések 7.1 Új kísérletes eredmények összegzése 1)

Feltérképeztük a Dp71f splice variáns in situ eloszlását, összefüggést találtunk a GFAP ill. a lamina basalissal kapcsolódó asztrociták elhelyezkedésével. Jelölődést találtunk az ependimában és a szubventrikuláris zónában is, továbbá a reaktív gliában.

2)

3)

Összefüggéseket találtunk agyi sérülések után az erekben: a)

a laminin-immunpozitivitás megjelenése és a disztroglikán-pozitivitás eltűnése;

b)

a disztroglikán-immunpozitivitás eltűnése és a GFAP megjelenése;

c)

a laminin-pozitivitás eltűnése és az új gliovaszkuláris kapcsolatok között.

Fejlődő állatokon a disztroglikán immunpozitivitás megjelenése a laminin megjelenése és a korai gliovaszkuláris kapcsolatok megjelenésének kezdete közé esik.

4)

A fejlődés során a laminin-pozitivitás eltűnése és a nesztin-tartalmú radiális glia felváltása GFAP-tartalmú asztrocitákkal párhuzamos, de helyi összefüggés nincs.

5)

Kimutattuk az αV integrin-alegység fokozott immunreaktivitását a reaktív gliában.

7.2 Következtetések Az egyes új kísérletes eredményeken kívül a kísérletsorozatnak egészében azt a közös eredményét szeretnénk kiemelni, hogy a különböző hisztokémiai markerek segítségével, felhasználva az irodalmi adatokat is, időben is nyomon követhetjük és szakaszokra oszthatjuk a sérülés utáni (tágabban: a patológiás folyamatokhoz kapcsolódó) érreakciókat, ill. az érfejlődést. Ennek a patológiában lehet jelentősége, annál is inkább, mert a vaszkularizáció gátlása a tumorok, egyebek közt agyi tumorok egyik terápiás lehetősége is (ld. pl. Puduvalli és Sawaya 2000, Wei és mtsai 2001). 76

8. Összefoglalás A központi idegrendszer esetében igen fontosak a kötőszövettel való kapcsolatok, az agyburok ill. az agyba hatoló erek mentén, a fejlődés során, ill. az agyi sérülések esetén. Vizsgálataink célja ennek megfelelően a glia-kötőszövet kapcsolatra, ill. annak állapotára, változásaira jellemző immunhisztokémiai reakciókat keresni, különös tekintettel a gliovaszkuláris kapcsolatokra. Kísérleteinket albinó kifejlett és fejlődő (embrió: E12-E20, ill. posztnatális: P0-P20) patkányokon végeztük. Az agyi károsodás utáni reakciók vizsgálatára Léziót hoztunk létre ketamin-xilazin narkózisban, a koponyát felfúrva, steril tűvel. Vibratome-mal

készített

metszeteken

fluoreszcensen

jelölt

antitestek

segítségével

immunhisztokémiai reakciót végeztünk. Vizsgáltuk: 1) a lamina basalis egyik fő alkotóját, a laminint; 2) fibronektint; 3) a laminin-receptor disztroglikán β-alegységét; 4) a vele komplexet alkotó disztrofineket, köztük a Dp71 splicing variánst, amelynek agyi feltérképezése még nem történt meg; 5) a szintén laminin-receptor integrin két központi fontosságú alegységét, az αV és a β1-t; 6) az érett asztroglia markerét, a GFAP-t (glial fibrillary acidic protein); 7) az éretlen gliában előforduló nesztint. Új kísérletes eredményeink: 1) Első alkalommal térképeztük fel a Dp71f splice variáns in situ eloszlását. Összefüggést találtunk a lamina basalissal kapcsolódó asztrociták elhelyezkedésével. Jelölődést találtunk az ependimában, a szubventrikuláris zónában, és a reaktiv gliában. 2) Összefüggést találtunk: a) a laminin immunpozitivitás megjelenése és a disztroglikán pozitivitás eltűnése között; b) a β-disztroglikán immunpozitivitás eltűnése és a GFAP megjelenése között; c) a laminin immunpozitivitás eltűnése és az új gliovaszkuláris kapcsolatok között. 3)Fejlődő állatokon a disztroglikán immunpozitivitás megjelenése a lamininé és a korai gliovaszkuláris kapcsolatoké közé esik. 4) A laminin-immunopozitivitás eltűnése és a nesztintartalmú radiális glia felváltása GFAP-tartalmú asztrocitákkal időben párhuzamos, de helyi összefüggés nincsen a két folyamat között. 5) Kimutattuk az αV integrin-alegység fokozott immunreaktivitását a reaktív gliában. A korábbi irodalmi adatokkal összhangban megállapíthatjuk, hogy az agyi erek laminin-immunpozitivitása (amennyiben antigén-feltárás nem történ), valamint a β-disztroglikán immunpozitivitás eltűnése a gliovaszkuláris kapcsolatok lazulására ill. megszűnésére utal. A kísérletsorozatnak azt a közös eredményét emeljük ki, hogy a különböző hisztokémiai markerek segítségével nyomon követhetjük és szakaszokra oszthatjuk a sérülés utáni (tágabban: a patológiás folyamatokhoz kapcsolódó) érreakciókat, ill. az érfejlődést. Ennek a patológiában lehet jelentősége, annál is inkább, mert a vaszkularizáció gátlása a tumorok, egyebek közt agyi tumorok egyik terápiás lehetősége is.

77

9. Summary In the central nervous system the connections to the connective tissues have a great importance, along the meninges and the vessels penetrating the brain. The aim of the study is therefore to find immunohistochemical reactions which are characteristic of the state and functional alterations of the glia-connective tissue connections, especially the gliovascular connections. The animals were albino adult and developing (E12-E20, and. P0-P20) rats. To study the effect of the brain lesions, stab wounds were performed in ketamine-xylasine narcosis by sterile disposable needles. Coronal sections were cut by Vibratome, and floating sections were processed for fluorescent immunohistochemistry against: 1) laminin, one of the main component of basal lamina; 2) fibronectin; 3) β-subunit of the laminin-receptor dystroglycan; 4) dystrophins, which form complex with dystroglycan, especially the a vele Dp71 splicing variánst, which has not been mapped in the brain yet; 5) the αV and β1 subunits, the most frequent subunits of the integrin, another laminin-receptor; 6) the marker of the mature astroglia, GFAP (glial fibrillary acidic protein); 7) the nestin which is found in the immature astroglia. The new experimental results are: 1) First mapping on the distribution of the Dp71f in situ. Its localization showed correlations to the GFAP-expression, and to the basal lamina production by astrocytes, including reactive astrocytes. Ependyma and subventricular zone were also labeled. 2) Following lesions, correlations were found between d)

the appearance of the laminin positivity and the disappearance of dystroglycan;

e)

the disappearance of dystroglycan and the GFAP expression in the reactive glia;

f) the disappearance of laminin and the formation of new gliovascular connections. 3)

During development the dystroglycan immunopositivity appears between the

appearance of the laminin immunopositivity and the formation of the early gliovascular connections. 4) In developing brain the disappearance of the laminin-immunopositivity and the replacement of the nestin-containing radial glia by GFAP-containing asztrocytes, occur in the same time interval. There is no local coincidence, however, between them. 5) The immunoreactivity of the αV integrin-subunit increases in post-lesional glial reaction. In accordance with the former data published, the laminin-immunoreactivity of the brain vessels (without antigen-exploration), and the disappearance of the β-dystroglycan refer to the decoupling of the gliovascular connections. Beyond the experimental data, let me emphasize a general consequence: applying histochemical markers, the vascularization and the vascular reactions following lesions or other pathological alterations can be monitored and its stages can be distinguished. It may have a great importance in the pathology, especially because the inhibition of vascularization is a possibility in the therapy of tumors, including brain tumors.

78

10. Irodalomjegyzék Abbott NJ. Permeability and transport of glial blood-brain barriers. In: Abbott NJ (szerk.). Glial-Neuronal Interactions. Ann New York Acad Sci, Vol. 633, New York, 1991: 378394. Abbott NJ. (2002) Astrocyte-endothelial interactions and blood-brain barrier permeability. J Anat, 200: 629-638. Agrawal S, Anderson P, Durbeej M, van Rooijen N, Ivars F, Opdenakker G, Sorokin LM. (2006) Dystroglycan is selectively cleaved at the parenchymal basement membrane at sites of leukocyte extravasation in experimental autoimmune encephalomyelitis. JEM, 203: 1007-1019. Akers RM. (1977) Radial fibers and astrocyte development in the cerebral cortex. Anat Rec, 187: 520. Aleman V, Osorio B, Chavez O, Rendon A, Mornet D, Martinez D. (2001) Subcellular localization of Dp71 dystrophin isoforms in cultured hippocampal neurons and forebrain astrocytes. Histochem Cell Biol, 115: 243–254. Alvarez-Buylla A. (2001) Neural stem cells disguised as „glia”. Soc Neurosci Abstr, 2: 4. Alvarez-Buylla A, Theelen M, Nottebohm F. (1988) Mapping of radial glia and of a new cell type in adult canary brain. J Neurosci, 8: 2707-2012. Amaducci L, Forno KI, Eng LF. (1981) Glial fibrillary acidic protein in cryogenic lesions of the rat brain. Neurosci Lett, 21: 27-32. Ambrosini E, Serafini B, Lanciotti A, Tosini F, Scialpi F, Psaila R, Raggi C, Di Girolamo F, Petrucci TC, Aloisi F. (2008) Biochemical characterization of MLC1 protein in astrocytes and its association with the dystrophin-glycoprotein complex. Mol Cell Neurosci, 37: 480-493. Amiry-Moghaddam M, Otsuka T, Hurn PD, Traystman RJ, Haug F-M, Froehner SC, Adams ME, Neely JD, Agre P, Ottersen OP, Bhardwaj A. (2003a) An α-syntrophin-dependent pool of AQP4 in astroglial end-feet confers bidirectional water flow between blood and brain. Proc Natl Acad Sci USA, 100: 2106-2111. Amiry-Moghaddam M, Williamson A, Palomba M, Eid T, de Lanerolle NC, Nagelhus EA, Adams ME, Froehner SC, Agre P, Ottersen OP. (2003b) Delayed K+ clearance associated with aquaporin-4 mislocalization: phenotypic defects in brains of alphasyntrophin-null mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 100: 13615-13620.

79

Amiry-Moghaddam M, Frydenlund DS, Ottersen OP. (2004) Anchoring of aquaporin-4 in brain: molecular mechanisms and implications for the physiology and pathophysiology of water transport. Neuroscience, 129: 999-1010. Anderson JL, Head SI, Rae C, Morley JW. (2002) Brain function in Duchenne muscular dystrophy. Brain, 125: 4–13. Asahi M, Asahi K, Jung JC, Del Zoppo GJ, Fini ME, Lo EH. (2000) Role for matrix metalloproteinase 9 after focal cerebral ischemia: effects of gene knockout and enzyme inhibition with BB-94. J Cereb Blood Flow Metab, 20: 1681-1689. Aumailley M, Gayraud B. (1998) Structure and biological activity of the extracellular matrix. J Mol Med, 76: 253–265. Austin RC, Howard PL, D’Souza VN, Klamut HJ, Ray PN. (1995) Cloning and characterization of alternatively spliced isoforms of Dp71. Hum Mol Genet, 4: 1475– 1483. Banda MJ, Knighton DR, Hunt TK, Werb Z. (1982) Isolation of a nonmitogenic angiogenesis factor from wound fluid. Proc Natl Acad Sci USA, 79: 7773–7777. Bar S, Barnea E, Levy Z, Neuman S, Yaffe D, Nudel U. (1990) A novel product of the Duchenne muscular dystrophy gene which greatly differs from the known isoforms in its structure and tissue distribution. Biochem J, 272: 557–560. Bär TH, Wolff JR. (1972) The formation of capillary basement membranes duringinternal vascularization of the rat’s cerebral cortex. Z Zellforsch, 133: 231-248. Beck L Jr, D’Amore P. (1997) Vascular development: cellular and molecular regulation. FASEB, 11: 365-372. Bernstein JJ, Getz R, Jefferson M, Kelemen M. (1985) Astrocytes secrete basal lamina after hemisection of rat spinal cord. Brain Res, 327: 135-141. Berry M, Maxwell WI, Logan A, Mathewson A, McConnell P, Ashhurst DE, Thomas GH. (1983) Deposition of scar tissue in the central nervous system. Acta Neurochir Suppl, 32: 31-53. Bignami A, Dahl D. (1976) The astroglial response to stabbing. Immunofluorescence studies with antibodies to astrocyte-specific protein (GFAP) in mammalian and submammalian vertebrates. Neuropathol Appl Neuro, 2: 99-110. Bignami A, Dahl D. (1986) Brain-specific hyaluronate-binding protein. A product of white matter astrocytes? J Neurocytol, 15: 671-679.

80

Bignami A, Dahl D. (1988) Expression of brain-specific hyaluronectin (BHN), a hyaluronatebinding protein, in dog postnatal development. Exp Neurol, 1:107-117. Bignami A, Eng LF, Dahl D, Uyeda CT. (1972) Localization of the glial fibrillary acidic protein in astrocytes by immunofluorescence. Brain Res, 43: 429-435. Bignami A, Lane WS, Andrews D, Dahl D. (1989) Structural similarity of hyaluronate binding proteins in brain and cartilage. Brain Res Bull, 1:67-70. Bignami A, Perides G, Asher R, Dahl D. (1992) The astrocyte--extracellular matrix complex in CNS myelinated tracts: a comparative study on the distribution of hyaluronate in rat, goldfish and lamprey. J Neurocytol, 8: 604-613. Bischoff J (1997) Cell adhesion and angiogenesis J Clin Invest, 99: 373-376. Blake DJ, Hawkes R, Benson MA, Beesley PW. (1999) Different dystrophin-like complexes are expressed in neurons and glia. J Cell. Biology, 147: 645-657. Bovolenta P, Fernaud-Espinosa I. (2000) Nervous system proteoglycans as modulators of neurite outgrowth. Prog Neurobiol, 61: 113-132. Brennan PA, Jing J, Ethunandan M, Górecki D. (2004) Dystroglycan complex in cancer. Eur J Surg Oncol, 30: 589-592. Brodkey JA, Gates M, Laywell ED, Steindler DA. (1993) The complex nature of interactive neuroregeneration-related molecules. Exp. Neurol, 123: 251-270. Brown SS, Lewinson W, Spudich J. (1976) Cytoskeletal elements of chick embryo fibroblasts revealed by detergent extraction. Supramol Struct J, 5: 119-130. Bundgaard M, Abbott NJ. (2008) All vertebrates started out with a glial blood-brain barrier 4500 million years ago. Glia, 56: 699-708. Bundgaard M, Cserr HF. (1981) A glial blood-brain barrier in Elasmobranchs. Brain Res, 226: 61-73. Caley DW, Maxwell DS. (1970) Developement of the blood vessels and extracellular spaces during postnatal maturation of rat cerebral cortex. J Comp Neurol, 138: 31-48. Cameron RS, Rakic P. (1991) Glial cell lineage in the cerebral cortex: a review and synthesis. Glia, 4: 124-137. Carbonell AL, Boya J. (1988) Ultrastructural study on meningeal regeneration and meningoglial relationships after cerebral stab wound in the adult rat. Brain Res, 439: 337-344. Carbonetto S. (1984) The extracellular matrix of the nervous system. Trends Neurosci, 7:382387.

81

Ceccarini M, Rizzo G, Rosa G, Chelucci C, Macioce P, Petrucci TC. (1997) A splice variant of Dp71 lacking the syntrophin binding site is expressed in early stages of human neural development. Dev Brain Res, 103: 77–82. Celio MR, Blümcke I. (1994) Perineuronal nets--a specialized form of extracellular matrix in the adult nervous system. Brain Res Rev, 19: 128-145. Chamberlain J. (1999) The dynamics of dystroglycan. Nat Genet, 23: 256-258. Champliaud MF, Lunstrum GP, Rousselle P, Nishiyama T, Keene DR, Burgeson RE. (1996) Human amnion contains a novel laminin variant, laminin 7, which like laminin 6, covalently associates with laminin 5 to promote stable epithelial-stromal attachment. J Cell Biol, 132: 1189–1198. Chang DI, Hosomi N, Lucero J, Heo JH, Abumiya T, Mazar AP, Del Zoppo GJ. (2003) Activation systems for latent matrix metalloproteinase-2 are upregulated immediately after focal cerebral ischemia. J Cerebral Blood Flow & Metab, 23: 1408-1419. Chiu AY, Espinosa de los Monteros A, Cole RA, Loera S de Vellis J. (1991) Laminin and slaminin are produced and released by astrocytes, Schwann-cells and schwannomas. Glia, 4: 11-24. Church HJ, Aplin JD. (1998) BeWo choriocarcinoma cells produce laminin 10. Biochem J, 332: 491–498. Cifuentes M, Fernández-LLebrez P, Pérez J, Pérez-Fígares JM, Rodríguez EM. (1992) Distribution of intraventricularly injected horseradish peroxidase in cerebrospinal fluid compartments of the rat spinal cord. Cell Tissue Res, 270: 485-494. Clarke SR, Shetty AK, Bradley JL, Turner DA. (1994) Reactive astrocytes express the embryonic intermediate neurofilament nestin. Neuroreport, 5: 1885-1888. Colognato H, Yurchenko PD. (2000) Form and function: The laminin family of heterotrimers. Devel Dyn, 218: 213-231. Connor JR, Berkowitz RM. (1985) A demonstration of glial filament distribution in astrocytes isolated from rat cerebral cortex. Neuroscience, 16: 33–44. Cooper NG, Steindler DA. (1986) Monoclonal antibody to glial fibrillary acidic protein reveals a parcellation of individual barrels in the early postnatal mouse somatosensory cortex. Brain. Res, 380: 341-348. Culligan K, Glover L, Dowling P, Ohlendieck K. (2001) Brain dystrophin-glycoprotein complex: Persistent expression of β-dystroglycan, impaired oligomerization of Dp71 and up-regulation of utrophins in animal models muscular dystrophy. Cell Biol, 2:2. 82

Culligan K, Ohlendieck K. (2002) Diversity of the brain dystrophin-glycoprotein complex. J Biomed Biotech, 2: 31-36. Dahl D, Björklund H, Bignami A. Immunological markers in astrocytes. In: Fedoroff S, Vernadakis A (szerk). Astrocytes: cell biology and pathology of astrocytes. Academic Press, New York, 1986:1-27. Dahl D, Rueger DC, Bignami A, Weber K, Osborn M. (1981) Vimentin, the 57 000 molecular weight protein of fibroblast filaments, is the major cytoskeletal component in immature glia. Eur J Cell Biol, 24: 191-196. Dahl D, Strocchi P, Bignami A. (1982) Vimentin in the central nervous system. A study of the mesenchymal-type intermediate filament-protein in Wallerian degeneration and in postnatal rat development by two-dimensional gel electrophoresis. Differentiation, 22: 185-190. DeVitry F, Picoret R, Jacque C, Tixier-Vidal A. (1981) The glial fibrillary acidic protein: A cellular marker in tanycytes in the mouse hypothalamus. Dev Neurosci 4: 457-460. Del Zoppo GJ, Hallenbeck JM. (2000) Advances in the vascular pathophysiology of ischemic stroke. Thromb Res, 98: 73-81. Del Zoppo GJ, Mabuchi T. (2003) Cerebral microvessel responses to focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab, 23: 879-894. Del Zoppo GJ, Milner R. (2006) Integrin–Matrix Interactions in the Cerebral Microvasculature. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 26: 1966-1973. Del Zoppo GJ, Milner R, Mabuchi T, Hung S, Wang X, Berg GI, Koziol JA. (2007) Microglial activation and matrix protease generation during focal cerebral ischemia. Stroke, 38: 646-651. Del Zoppo GJ, Milner R, Mabuchi T, Hung S, Wang X, Koziol JA. (2006) Vascular matrix adhesion and the blood-brain barrier. Biochem Soc Trans, 34: 1261-1266. Doetsch F. (2003) A niche for adult neural stem cells. Current Opinion in Genetics & Development, 13: 543-550. Doetsch F, Caillé I, Lim DA, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. (1999) Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell, 97: 703–716. Dorrell MI, Aguilar E, Friedlander M. (2002) Retinal vascular development is mediated by endothelial filopodia, a preexisting astrocytic template and specific R-cadherin adhesion. Invest Ophthalmol Vis Sci, 43: 3500-3510.

83

Doucette JR. (1984) The glial cells in the nerve fiber layer of the rat olfactory bulb. Anat Rec, 210: 385-391. Doucette JR. (1991) PNS-CNS transitional zone of the first cranial nerve. J Comp Neurol, 31: 451-466. Dow KE, Wang W. (1998) Cell biology of astrocyte proteoglycans. Cell Mol Life Sci, 54: 567-581. D’Souza VN, Nguyen TM, Morris GE, Karges W, Pillers DA, Ray PN. (1995) A novel dystrophin isoform is required for normal retinal electrophysiology. Hum Mol Genet, 4: 37–42. Durbeej M, Henry MD, Ferletta M, Campbell KP, Ekblom P. (1998) Distribution of dystroglycan in normal adult mouse tissues. J Histochem Cytochem, 46: 449-457. Eddleston M, Mucke L. (1993) Molecular profile of reactive astrocytes-implications for their role in neurologic disease. Neuroscience, 54: 15-36. Ehmsen J, Poon E, Daviesk. (2002) The dystrophin-associated protein complex. J Cell Sci, 115: 2801-2803. Eng LF. (1985) Glial fibrillary protein (GFAP): The major protein of glial intermediate filaments in differentiated astrocystes. J Neuroimmunology, 8: 203-214. Eng LF, Vanderhaeghen JJ, Bignami A, Gerstl B. (1971) An acidic protein isolated from fibrous astrocytes. Brain Res, 28: 351-354. Ekblom M, Falk M, Salmivirta K, Durbeej M, Ekblom P (1998) Laminin isoforms and epithelial development. Ann NY Acad Sci, 857: 194–211. Ekblom P, Miettinen M, Rapola J, Foidart JM. (1982) Demonstration of laminin, a basement membrane glycoprotein, in routinely processed formalin-fixed human tissues. Histochem, 75: 301-307. Eliasson C, SahlgrenC, Berthold CH, Stakeberg J, Celis JE, Betsholtz C, Eriksson JE, Pekny M. (1999) Intermediate filament protein partnership in astrocytes. Biol Chem J, 274: 23996-24006. Emery AE. (1989) Clinical and molecular studies in Duchenne muscular dystrophy. Prog Clin Biol Res, 306: 15–28. Eriksdotter-Nilsson M, Björklund H, Olson L. (1986) Laminin immunohistochemistry is a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. J Neurosci Meth, 17: 275-286.

84

Fabbrizio E, Nudel U, Hugon G, Robert A, Pons F, Mornet D. (1994) Characterization and localization of a 77 kDa protein related to the dystrophin gene family. Biochem J, 299: 359–365. Falk M, Ferletta M, Forsberg E, Ekblom P. (1999) Restricted distribution of laminin a1 chain in normal and adult mouse tissues. Matrix Biol, 18: 557–568. Fedoroff S. Prenatal ontogenesis od astrocytes.In: Fedoroff S, Vernadakis A. (szerk.) Acad Press, New York, 1986:35-74. Ferletta M, Ekblom P. (1999) Identification of laminin-10/11 as a strong cell adhesive complex for a normal and a malignant human epithelial cell line. J Cell Sci, 112: 1–10. Fernaud-Espinosa I, Nieto-Sampedro M, Bovolenta P. (1992) Differential activation of microglia and astrocytes in aniso- and isomorphic gliotic tissue. Glia, 8: 277–291. Fitch MT, Silver J. (1997) Glial cell extracellular matrix: boundaries for axon growth in development and regeneration. Cell Tissue Res, 290: 379-384. Francis SE, Goh KL, Hodivala-Dilke K, Bade BL, Stark M, Davidson D, Hynes RO. (2002) Central Roles of α5β1 integrin and fibronectin in vascular development in mouse embryos and embryoid bodies. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 22: 927-933. Frigeri A, Nicchia GP, Nico B, Quondamatteo F, Herken R, Roncali L, Svelto M. (2001) Aquaporin-4 deficiency in skeletal muscle and brain of dystrophic mdx mice. FASEB J, 15: 90-98. Frisén J, Johansson CB, Török C, Risling M, Lendahl U. (1995) Rapid, widespread, and longlasting induction of nestin contributes to the generation of glial scar tissue after CNS injury. J Cell Biol, 131: 453-464. Fukuda S, Fini CA, Mabuchi T, Koziol JA, Eggleston LL Jr, Del Zoppo GJ. (2004) Focal cerebral ischaemia induces active proteases that degrade microvacular matrix Stroke 35: 998-1004. Garcia-Tovar CG, Luna J, Mena R, Soto-Zarate CI, Cortes R, Perez A, Leon-Avila G, Mornet D, Rendon A, Hernandez JM. (2002) Dystrophin isoform Dp71 is present in lamellipodia and focal complexes in human astrocytoma cells U-373 MG. Acta Histochem, 104: 245–254. Garcia-Tovar CG, Perez A, Luna J, Mena R, Osorio B, Aleman V, Mondragon R, Mornet D, Renden A, Hernandez JM. (2001) Biochemical and histochemical analysis of 71 kDa dystrophin isoform (Dp71f) in rat brain. Acta Histochem, 103: 209–224.

85

Gates MA, Thomas LB, Howard, EM, Laywell ED, Sajin B, Faissner A, Götz B, Silver J, Steindler DA. (1995) Cell and molecular analysis of the developing and adult mouse subventricular zone of the cerebral hemispheres. J Comp Neurol, 361: 249–266. Goldstein GW, Betz AL. (1986) A vér-agy gát. Tudomány, 11: 40-53. Gorecki DC, Barnard EA. (1995) Specific expression of G-dystrophin (Dp71) in the brain. Neuroreport, 6: 893–896. Gorecki DC, Abdulrazzak H, Lukasiuk K, Barnard EA. (1997) Differential expression of syntrophins and analysis of alternatively spliced dystrophin transcripts in the mouse brain. Eur J Neurosci, 9: 965–976. Gorecki DC, Monaco AP, Derry JMJ, Walker AP, Barnard EA, Barnard PJ. (1992) Expression of four alternative dystrophin transcripts in brain regions regulated by different promoters. Hum Mol Genet, 1: 505–510. Goto S, Matsukado Y, Uemura S, Mihara Y, Inoue N, Ikeda J, Miyamoto E. (1988) A comparative immunohistochemical study of calcineurin and S-100 protein in mammalian and avian brain. Exp Brain Res, 69: 645-650. Gottschall PE, Deb S. (1996) Regulation of matrix metalloproteinase expressions in astrocytes, microglia and neurons. Neuroimmunomodulation, 3: 69-75. Grant DS, Kleinmann HK, Martin GR. (1990) The role of basement membranes in vascular development. Ann NY Acad Sci, 588: 61–72. Greenberg DS, Schatz Y, Levi Z, Pisso P, Yaffe D, Nudel U. (1996) Reduced levels of dystrophin associated proteins in the brains of mice deficient for Dp71. Hum Mol Genet, 5: 1299–1303. Gressens P, Richelme C, Kadhim HJ, Gadisseux JF, Evrard P. (1992) The germinative zone produces the most cortical astrocytes after neuronal migration in the developing mammalian brain. Biol. Neonate, 61: 4-24. Haenggi T, Soontornmalai A, Schaub MC, Fritsch J-M. (2004) The role of utrophin and Dp71 for assemgly of different dystrophin-associated protein complexes (DPCs) int he choroid plexus and microvasculature of the brain. Neuroscience, 129: 403-413. Hagg T, Muir D, Engvall E, Varon S, Manthorpe M. (1989) Laminin-like antigen in rat CNS neurons: distribution and changes upon brain injury and nerve growth factor tratment. Neuron, 3: 721-732. Hagg T, Portera-Cailliau C, Jucker M, Engvall E. (1997) Laminins of the adult mammalian CNS; laminin-α2 (merosin, M-) chain immunoreactivity is associated with neuronal processes. Brain Res, 764: 17–27. 86

Hajós F. A neuroglia szerkezete In: Huszti Zs, Kálmán M. (szerk.) Glia. Akadémiai Kiadó, Budapest, 2008: 9-38. Hajós F, Halasy K. (1998) Pre- or postembedding immunochemistry: which to choose for the localization of glial fibrillary acidic protein (GFAP)? Neurosci Meth J, 85: 99-105. Hajós F, Kálmán M. (1989) Distribution of glial fibrillary acidic protein (GFAP)immunoreactive astrocytes in the rat brain. II. Mesencephalon, rhombencephalon and spinal cord. Exp Brain Res, 78: 164–173. Hallmann R, Horn N, Selg M, Wendler O, Pausch F, Sorokin LM. (2005) Expression and function of laminins in the embryonic and mature vasculature. Physiol Rev, 85: 9791000. Henry MD, Campbell KP. (1999) Dystroglycan inside and out. Curr Opin Cell Biol, 11: 602– 607. Hockfield S, McKay RD. (1985) Identification of major cell classes in the developing mammalian nervous system. J Neurosci, 5: 3310-3328. Holmin S, Almquist P, Lendahl U, Mathiesen T. (1997) Adult nestin-expressing subependymal cells differentiate to astrocytes in response to brain injury. Eur J Neurosci, 9: 65–75. Hosokawa H, Ninomiya H, Kitamura Y, Fujiwara K, Masaki T. (2001) Vascular endothelial cells that express dystroglycan are involved in angiogenesis. J Cell Sci, 115:1487-1496. Hozumi I, Aquino DA, Norton WT. (1990a) GFAP mRNA levels following stab wounds in rat brain. Brain Res, 534: 291-294. Hozumi I, Chiu FC, Norton WT. (1990b) Biochemical and immunocytochemical changes in glial fibrillary acidic protein after stab wounds. Brain Res, 524: 64-71. Hsu JY, McKeon R, Goussev S, Werb Z, Lee JU, Trivedi A, Noble-Haeusslein LJ. (2006) Matrix metalloproteinase-2 facilitates wound healing events that promote functional recovery after spinal cord injury. J Neuroscience, 26: 9841-9850. Hu H, Yang Y, Eade A, Xiong Y, Qi Y. (2007) Breaches of the pial basement membrane and disappearance of the glia limitans during development underlie the cortical lamination defect in the mouse model of muscle-eye-brain disease. J Comp Neurology, 501: 168-183. Huard J, Cote PY, Parent A, Bouchard JP, Tremblay JP. (1992) Dystrophin-like immunoreactivity in monkey and human brain areas involved in learning and motor functions. Neurosci Lett, 141: 181–186.

87

Hugnot JP, Gilgenkrantz H, Vincent N, Chafey P, Morris GE, Monaco AP, Berwald-Netter Y, Koulakoff A, Kaplan JC, Kahn A. (1992) Distal transcript of the dystrophin gene initiated from an alternative first exon and encoding a 75 kDa protein widely distributed in nonmuscle tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 7506–7510. Hunter DD, Llinas R, Ard M, Merlie JP, Sanes JR. (1992) Expression of s-laminin in the developing rat central nervous system. J Comp Neurol, 323: 238–251. Ibraghimov-Beskrovnaya O, Ervasti JM, Leveille CJ, Slaughter CA, Sernett SW, Campbell KP. (1992) Primary structure of dystrophin-associated glycoproteins linking dystrophin to the extracellular matrix. Nature, 355: 696-702. Imamura M, Ozawa E. (1998) Differential expression of dystrophin isoforms and utrophin during dibutyryl-cAMP-induced morphological differentiation of rat brain astrocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 6139–6144. Jaeger C B, Blight AR. (1997) Spinal cord compression injury in guinea pigs:structural changes of endothelium and its perivascular cell associations after blood-brain barrier breakdown and repair. Exper Neur, 144: 381-399. Jancsik V, Hajós F. (1999) The demonstration of immunoreactive dystrophin and its developmental expression in perivascular astrocytes. Brain Res, 831: 200-205. Janzer RC, Raff MC. (1987) Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature, 325: 253-257. Janeczko K. (1993) Coexpression of GFAP and vimentin in astrocytes proliferating in response to injury in the mouse cerebral hemisphere. A combined autoradiographic and double immunocytochemical study. Int J Dev Neurosci, 11: 139-147. Jiang B, Liou GI, Bezhadian MA, Caldwell RB. (1994) Astrocytes modulate retinal vasculogenesis: effects on fibronectin expression. J Cell Sci, 107: 2499–2508. Johanson CE, Duncan III JA, Klinge PM, Brinker T, Stopa EG, Silverberg GD. (2008) Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease. Cerebrospinal Fluid Research, 5: 10 Jucker M, Bialobok P, Hagg T, Ingram DK. (1992) Laminin immunohistochemistry in brain is dependent on method of tissue fixation. Brain Res, 586: 166-170. Jucker M, Tian M, Ingram DK. (1996a) Laminins in the adult and aged brain. Mol Chem Neuropath, 28: 209-218.

88

Jucker M, Tian M, Norton DD, Sherman C, Kusiak JW. (1996b) Laminin alpha 2 is a component of brain capillary basement memrbrane: reduced expression in dystrophic dy mice. Neuroscience, 71: 1153-1161. Jung D, Filliol D, Metz-Boutigue M-H, Rendon A. (1993) Characterization and subcellular localization of the dystrophin-protein 71 (Dp71) from brain. Neuromuscul Disord, 3: 515–518. Junqueira LC, Carneiro J, Kelley O. (1989) Basic Histology. Prentice-Hall International, London,:66-70. Kálmán M, Ajtai BM. (2001) A comparison of intermediate filament markers for presumtive astroglia in the developing rat neocortex:immunostaining against nestin reveals more detail, than GFAP or vimentin. Int J Dev Neurosci, 19: 101-108. Kálmán M, Hajós F. (1989) Distribution of glial fibrillary acidic protein (GFAP)immunoreactive astrocytes in the rat brain I Forebrain. Exp Brain Res, 78: 147-163. Kálmán M, Tuba A. (1993) Embryonic neural tissue survival may depend upon ts stage of vascularisation. Eur J Neurosci Suppl, 6:1176. Kramarcy NR, Vidal A, Froehner SC, Sealock R. (1994) Association of utrophin and multiple dystrophin short forms with the mammalian M 58,000 dystrophin associated protein (syntrophin). J Biol Chem, 269: 2870–2876. Krisch B, Leonhardt H, Buchheim W. (1978) The functional and structural border between the CSF- and blood-milieu in the circumventricular organs (organum vasculosum laminae terminalis, subfornical organ, area postrema) of the rat. Cell Tiss Res, 195: 485579. Krum JM, Mani N, Rosenstein JM. (2002) Angiogenic and astroglial responses to vascular endothelial growth factor administration in adult rat brain. Neuroscience, 110: 589-604. Krum JM, More NS, Rosenstein JM. (1991) Brain angiogenesis: variations in vascular basement membrane glycoprotein immunoreactivity. Exp Neurol, 111: 151-165. Krum JM, Rosenstein JM. (1989) The fine structure of vascularastroglial reactions in transplanted fetal neocortex. Exp Neurol, 103: 203–212. Lawson LJ, Perry VH. (1995) The unique characteristics of inflammatory responses in mouse brain are acquired during postnatal development. Eur J Neurosci, 7: 1584-1595. Lederfein D, Levy Z, Augier N, Mornet D, Morris G, Fuch O, Yaffe D, Nudel U. (1992) A 71-kilodalton protein is a major product of Duchenne muscular dystrophin gene in brain and other nonmuscle tissues. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 5346–5350.

89

Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD. (1990) CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell, 60: 585-595. Lepekhin EA, Eliasson C, Berthold CH, Berezin V, Bock E, Pekny M (2001). Intermediate filaments regulate astrocyte motility. Neurochem J. 79: 617-625. Levison SW, Goldman JE. (1993) Both oligodendrocytes and astrocytes develop from progenitors in the subventricular zone of postnatal rat forebrain. Neuron, 10: 201-212. Li S, Edgar D, Fassler R, Wadsworth W, Yurchenco PD. (2003) The role of laminin in embryonic cell polarization and tissue organization. Dev Cell, 4: 613–624. Libby RT, Champliaud MF, Claudepierre T, Xu Y, Gibbons PE, Koch M, Burgeson RE, Hunter DD, Brunken WJ. (2000) Laminin expression in adult and developing retinae: evidence of two novel laminins. J Neurosci, 20: 6517–6528. Lidov HGW. (1996) Dystrophin in the nervous system. Brain Pathol, 6: 63–77. Lidov HGW, Byers TJ, Watkins SC, Kunkel LM. (1990) Localization of dystrophin to postsynaptic regions of central nervous system cortical neurons. Nature, 348: 725–728. Liesi P, Kauppila T. (2007) Induction of type IV collagen and other basement-membraneassociated proteins after spinal cord injury of the adult rat may participate in formation of the glial scar. Exp Neurol, 173: 31-45. Liesi P, Kaakkola S, Dahl D, Vaheri A. (1984) Laminin is induced in astrocytes of adult brain injury. EMBO J, 3: 683-686. Liesi P, Risteli L. (1989) Glial cells of mammalian brain produce a variant form of laminin. Exp Neurol, 105: 86-92. Linser PJ. (1985) Multiple marker analysis in the avian optic tectum reveals three classes of neuroglia and carbonic anhydrasecontaining neurons. J Neurosci, 5: 2388–2396. Ludwin SK. (1985) Reaction of oligodendrocytes and astrocytes to trauma and implantation. A

combined autoradiographic and immunohistochemical study. Lab Invest, 52: 20-30. Ludwin SK, Kosek JC, Eng LF. (1976) The topographical distribution of S-100 and GFAP proteins in the adult rat brain. An immunocytochemical sorting reveals a neuronal lineage. Development, 127: 5253-5263. Malhotra SK, Svensson M, Aldskogius H, Bhatnagar R, Das GD, Shnitka TK. (1993) Diversity among reactive astrocytes, proximal reactive astrocytes in lacerated spinal cord preferentially react with monoclonal antibody J1-31. Brain Res Bull, 30: 395-404. Malinda KM, Nomizu M, Chung M, Delgado M, Koratomi Y, Yamada Y, Kleinman HK, Ponce ML. (1999) Identification of laminin α1 and β1 chain peptides active for endothelial cell adhesion, tube formation, and aortic sprouting. FASEB J, 13: 53-62. 90

Marin-Padilla M. (1985) Early vascularization of the embryonic cerebral cortex: Golgi and electron microscopic studies. J Comp Neurol, 241: 237-249. Martinez-Hernandez A, Bell KP, Norenberg MD. (1977) Glutamine synthetase: glial localization in brain.Science, 195: 1356-1368. Marvin MJ, Dahlstrand J, Lendahl U, McKay RD. (1998) A rod end deletion in the intermediate filament protein nestin alters its subcellular localization in neuroepithelial cells of transgenic mice. Cell Sci J, 111: 1951-1961. Mathewson AJ, Berry M. (1984) Observations on the astrocytic response to a cerebral stab wound in adult rats. Brain Res, 327: 61-69. Mauro A, Bertolotto A, Germano I, Giaccone G, Giordana MT, Migheli A, Schiffer D. (1984) Collagenase in the immunohistochemical demonstration of laminin, fibronectin and factor VIII/Rag. Histochem, 80: 157-163. McKeon RJ, Jurynec MJ, Buck CR. (1999) The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar. J Neurosci, 19: 10778-10788. McKeon RJ, Schreiber RC, Rudge S, Silver J. (1991) Reduction of neurite outgrowth in a model of glial scarring is correlated with the expression of inhibitory molecules on reactive astrocytes. J Neurosci, 11: 3398-3411. Mercier F, Hatton GI. (2000) Immunocytochemical basis for a meningeo-glial network. J Comp Neurol, 420: 445–460. Mercier F, Kitasako JT, Hatton GI. (2002) Anatomy of the brain neurogenic zones revisited: fractones and the fibroblast/macrophage network. J Comp Neurol, 451: 170–188. Merrill JE, Benveniste EN. (1996) Cytokines in inflammatory brain lesions: Helpful and harmful. Trend Neurosci, 19: 331-338. Michalak M, Opas M. (1997) Functions of dystrophin and dystrophin associated proteins. Curr Opin Neurol, 10: 436–442. Milner R, Hung S, Wang X, Spatz M, Del Zoppo GJ. (2008) The rapid decrease in astrocyteassociated dystroglycan expression by focal cerebral ischemia is protease-dependent. J Cereb Blood Flow Metab, 28: 812-823. Milner R, Campbell RM (2002a) The integrin family of cell adhesion molecules has multiple functions vithin the CNS. J Neurosci Res, 69: 286-291. Milner R, Campbell RM (2002b) Developmental regulation of β1 integrins during angiogenesis in the central nervous system. Mol Cell Neurosci, 20: 616-626.

91

Milner R, Relvas JB, Fawcett J, ffrench-Constant C. (2001) Developmental regulation of αv integrins produces functional changes in astrocyte behavior. Mol Cell Neurosci, 18: 108-118. Miner JH, Lewis RM, Sanes JR. (1995) Molecular cloning of a novel laminin chain, a5, and widespread expression in adult mouse tissues. J Biol Chem, 270: 28523–28526. Miner JH, Patton BL, Lenz SI, Gilbert DJ, Snider WD, Jenkins NA, Copeland NG, Sanes JR. (1997) The laminin alpha chains: expression, developmental transitions, and chromosomal locations of alpha1-5, identification of heterotrimeric laminins 8-11, and cloning of a novel alpha3 isoform. J Cell Biol, 137: 685-701. Miyata T, Kawaguchi A, Okano H, Ogawa M. (2001) Asymmetric inheritance of radial glial fibers by cortical neurons. Neuron, 31: 727-741. Módis L. Az extracelluláris mátrix. In: Szabó G (szerk.) Sejtbiológia. Medicina, Budapest, 2004: 473-480. Montanaro F, Carbonetto S. (2003) Targeting dystroglycan in the brain. Neuron, 37: 193–196. Monzon-Mayor M, Yanes C, de Barry J, Capdevilla-Carbonell C, Renau-Piqueras J, Tholey G, Gombos G. (1998) Heterogeneous immunoreactivity of glial cells in the mesencephalon of a lizard: a double labeling immunohistochemical study. Morphol J, 235: 109-119. Moore SA, Saito F, Chen J, Michele DE, Henry MD, Messing A, Cohn RD, Ross-Barta SE, Westra S, Williamson RA, Hoshi T, Campbell KP. (2002) Deletion of brain dystroglycan recapitulates aspects of congenital muscular dystrophy. Nature, 418: 422425. Moukhles H, Carbonetto S. (2001) Dystroglycan contributes to the formation of multiple dystrophin-like complexes in brain. J Neurochem, 78: 824-834. Moumdijan RA, Antel JP, Yong VW. (1991) Origin of contralateral reactive gliosis in surgically injured rat cerebral cortex. Brain Res, 547: 223–228. Mugnaini E. (1986) Cell junctions of astrocytes, ependyma, and related cells in the mammalian central nervous system, with emphasis on the hypothesis of a generalized functional syncytium of spporting cells. Ld: Astrocytes. Fedoroff S, Vernadakis A. (szerk.) New York Acad Press, 329-371. Müller M, Ingrid A, Bock E. (1978) Immunohistochemical demonstarion of S-100 protein anf GFA-protein in interstitial cells of rat pineal body. Brain Res, 140: 1-13.

92

Nag S, Takahashi JL, Kilty DW. (1997) Role of vascular endothelial growth factor in bloodbrain barrier breakdown and angiogenesis in brain trauma. J Neuropath & Exp Neur, 56: 912-921. Nakazawa E, Ishikawa H. (1998) Ultrastructural observations of astrocyte end-feet in the rat central nervous system. J Neurocytol, 27: 431-440. Neely JD, Amiry-Moghaddam M, Ottersen OP, Froehner SC, Agre P, Adams ME. (2001) Syntrophin-dependent expression and localization of Aquaporin-4 water channel protein. Proc Natl Acad Sci USA, 98: 14108-14113. Nico B, Frigeri A, Nicchia GP, Corsi P, Ribatti D, Quondamatteo F, Herken R, Girolamo F, Marzullo A, Svelto M, Roncali L. (2003) Severe alterations of endothelial and glial cells in the blood-brain barrier of dystrophic mdx mice. Glia, 42: 235-251. Nico B, Nicchia GP, Frigeri A, Corsi P, Mangieri D, Ribatti D, Svelto M, Roncali L. (2004) Altered blood-brain barrier development in dystrophic MDX mice. Neuroscience, 125: 921-935. Noctor SC, Flint AC, Weissman TA, Dammerman RS, Kriegstein AR. (2001) Neurons derived from radial glial cells establish radial units in neocortex. Nature, 409: 714-772. Oláh I. Kötőszövet In: Röhlich P (szerk.) Szövettan. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2006: 119-129. Ogawa M, Araki M, Nagatsu I, Yoshida M. (1989) Astroglial cell alteration caused by neurotoxins: immunohistochemical observations with antibodies to glial fibrillary acidic protein, laminin, and tyrosine hydroxylase. Exp Neurol, 106: 187–196. Okada Y, Copeland BR, Hamann GF, Koziol JA, Cheresh DR, Del Zoppo GJ. (1996) Integrin αvβ3 is expressed is selected microvessels following focal cerebral ischemia. Am J Pathol, 149: 37-44. Paggi P, De Stefano ME, Petrucci TC. (2006) Synaptic remodeling induced by axotomy of superior cervical ganglion neurons: Involvement of metalloproteinase-2. J Physiol Paris, 99: 119-124. Palkovits M. Summary of structural and functional aspects of the circumventricular organs. In: Gross PM. (szerk.) Circumventricular Organs and Body Fluids. CRC Press Inc, Boca Raton, Florida, 1986: 209-218. Patel AJ, Weir MD, Hunt A, Tahourdin CS, Thomas DGT. (1985) Distribution of glutamine synthetase and glial fibrillary acidic protein and correlation with glutamate

93

decarboxylase in different regions of the rat central nervous system. Brain Res, 331: 1– 10. Pekny M, Stanness KA, Eliasson C, Betsholtz C., Janigro D. (1998) Impaired induction of blood-brain barrier properties in aortic endothelial cells by astrocytes from GFAPdeficient mice. Glia, 22: 390-400. Piluso G, Mirabella M, Ricci E, Beisito A, Abbondanza C, Servidel S, Puca AA, Tonali P, Puca GA, Nigro V. (2000) Gamma1 and gamma2 syntrophins, two novel dystrophinbinding proteins localized in neuronal cells. J Biol Chem, 275: 15851-15860. Pixley SR, de Vellis J. (1984) Transition between immature radial glia and the mature astrocytes studied with monoclonal antibody to vimentin. Dev Brain Res, 15: 201-209. Powell S, Kleinman HK. (1997) Neuronal laminins and their cellular receptors. Int Biochem Cell Biol, 29: 401-414. Puduvalli VK, Sawaya R. (2000) Antiangiogenesis – therapeutic strategies and clinical implications for brain tumors. J Neurol Oncol, 50: 189-200. Quinlain RA, Franke WW. (1983) Molecular interactions in intermediate-sized filaments revealed by chemical cross-linking. Heteropolymers of vimentin and glial filament protein in cultured human glioma cells. Eur J Biochem, 132: 477-484. Quinlain RA, Stewart M. (1991) Molecular interactions in intermediate filaments. Bioessays, 13: 597-600. Quiñones-Hinojosa A, Sanai A, Soriano-Navarro M, Gonzalez-Perez O, Mirzadeh Z, GilPerotin S, Romero-Rodriguez R, Berger MS, Garcia-Verdugo JM, Alvarez-Buylla A. (2006) Cellular composition and cytoarchitecture of the adult human subventricular zone: a niche of neural stem cells. J Comp Neur, 494: 415-434. Raff MC, Miller RH. (1984) Glial cell development in the rat optic nerve. Trends Neurosci, 13: 469-472. Raff MC, Miller RH, Noble M. (1983) A glial progenitor cell that develops in vitro into astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium. Nature, 303: 390-396. Ramon-Cueto A, Nieto-Sampedro M. (1992) Glial cells from adult rad olfactory bulb. Immunocytochemical properties of pure cultures of ensheathing cells. Neuroscience, 47: 213-220. Rao MS. (1999) Multipotent and restricted precursors in the central nervous system. Anat Rec 257: 137-148.

94

Rao MS, Mayer-Proschel M. (1997) Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells. Dev Biol, 188: 48-63. Rash JE, Yasumura T, Hudson CS, Agre P, Nielsen S. (1998) Direct immunogold labeling of aquaporin-4 in square arrays of astrocyte and ependymocyte plasma membranes in rat brain and spinal cord. Proc Natl Acad Sci USA, 95: 11981–11986. Rapaport D, Fuchs O, Nudel U, Yaffe D. (1992) Expression of the Duchenne muscular dystrophy gene products in embryonic stem cells and their differentiated derivatives. J Biol Chem, 267: 21289–21292. Redecker P, Morgenroth C. (1989) Comparative immunohistochemical study of the persence of glial fibrillary acidic protein in the pituitary of several vertebrates. Anat Anz, 168:37-47. Reier PJ. Gliosis following CNS injury, the anatomy of astrocytic scar and their influence on axonal elongation. In: Fedoroff S, Vernadakis A (szerk.): Astrocytes. Academic Press, New York, 1986:263-324. Ridet JL, Malhotra SK, Privat A, Gage FH. (1997) Reactive astrocytes: cellular and molecular cues to biological function. Trends Neurosci, 20: 570–577. Risau W. (1997) Mechanisms of angiogenesis. Nature, 386: 671-674. Risau W, Lemmon V. (1988) Changes in the vascular extracellular matrix during embryonic vasculogenesis and angiogenesis. Devel Biol, 125: 441–450. RisauW, Wolburg H. (1990) Development of the blood-brain barrier. Trends Neurosci, 13: 174-178. Rio Hortega P, Penfield W. (1927) Cerebral cicatrix. The reaction of neuroglia and microglia to brain wounds. Bull. Johns Hopkins Hosp. 41: 278-303. Robertson PL, Du Bois M, Bowman PD, Goldstein GW. (1985) Angiogenesis in developing rat brain:an in vivo and in vitro study. Brain Res, 355: 219-223. Rohlmann A, Laskawi R, Hofer A, Dobo E, Dermietzel R, Wolff JR. (1993) Facial nerve lesions lead to increased immunostaining of the astrocytic gap junction protein (connexin 43) in the corresponding facial nucleus of rats. Neurosci Lett, 154: 206-208. Rosenstein JM, More NS. (1994) Immuncytochemical expression of the blood-brain barrier glucose transporter (GLUT-1) in neural transplants and brain wounds. J Comp Neur, 350: 229-240. Rothstein JD, Martin L, Levey AI, Dykes-Hoberg M, Jin L, Wu D, Nash N, Kuncl RW. (1994) Localization of neuronal and glial glutamate transporters. Neuron, 13: 713-725.

95

Rowan RA, Maxwell DS. (1981) Patterns of vascular sprouting int he postnatal development of the cerebral cortex of the rat. Am J Anat, 160: 247-255. Rungger-Brandle E, Achtstatter T, Franke WW. (1989) An epithelium- type cytoskeleton in glial cell: astrocytes of amphibian optic nerves contain cytokeratin filaments and are connected by desmosomes. J Cell Biol, 109: 705–716. Rutka JT, Murakami M, Dirks PB, Hubbard SI, Becker LE, Fukuyama K, Jung S, Tsugu A, Matsuzawa K. (1997) Role of glial filaments in cells and tumors of glial origin: a review. J Neurosurg, 87: 420–430. Saito F, Masaki T, Kamakura K, Anderson LV, Fujita S, Fukuta- Ohi H, Sunada Y, Shimizu T, Matsumura K. (1999) Characterization of the transmembrane molecular architecture of the dystroglycan complex in schwann cells. J Biol Chem, 274: 8240–8246. Salhia B, Angelov L, Roncari L, Wu X, Shannon P, Guha A. (2000) Expression of vascular endothelial growth factor by reactive astrocytes and associated neoangiogenesis. Brain Res, 883: 87-97. Schnell L, Fearn S, Klassen H, Schwab ME, Perry VH. (1999) Acute inflammatory responses to mechanical lesions in the CNS: differences between brain and spinal cord. Eu J Neurosci, 11: 3648-3658. Schnitzer J, Franke WW, Schachner M. (1981) Immunocytochemical demonstration of vimentin in astrocytes and ependymal cells of developing and adult mouse nervous system. J Cell Biol, 90: 435–447. Schofield JN, Blake DJ, Simmons C, Morris GE, Tinsley JM, Davies KE, Edwards YH. (1994) Apo-dystrophin-1 and apodystrophin- 2, products of the Duchenne muscular dystrophy locus: expression during mouse embryogenesis and cultured cell lines. Hum Mol Genet, 3: 1309–1316. Sephel GC, Kennedy R, Kudravi S. (1996) Expression capillary basement membrane components during sequential phases of wound angiogenesis. Matrix Biol, 15: 263–279. Seri B, Garcia-Verdugo JM, McEwen BS, Alvarez-Buylla A. (2001) Astrocytes give rise to new neurons in the adult mammalian hippocampus. J Neurosci, 21: 7153-7160. Shigematsu K, Kamo H, Akiguchi J, Kameyama M, Kimura H. (1989a). Neovascularization of transplanted central nervous tissue suspensions: an immunohistochemical study with laminin. Neurosci Lett, 99: 18-23. Shigematsu K, Kamo H, Akiguchi J, Kimura J, Kameyama M, Kimura H. (1989b) Neovascularization in kainic acid-induced lesions of rat striatum. An immunocytochemical study with laminin. Brain Res, 501: 215-222. 96

Shimizu H, Hosokowa H, Ninomiya H, Miner JH. (1999) Adhesion of cultured bovine aortic endothelial cells to Laminin-1 mediated by dystroglycan. J Biol Chem, 274: 1199512000. Sixt M, Engelhardt B, Pausch F, Hallman R, Wendler O, Sorokin LM. (2001) Endothelial cell laminin isoforms, laminin 8 and 10, play decisive roles in T cell recruiment across the blood-brain barrier in experimental autoimmun encephalomyelitis. J Cell Biol, 153: 933945. Smalheiser NR, Kim E. (1995) Purification of cranin, a laminin binding membrane protein. Identity with dystroglycan and reassessment of its carbohydrate moieties. J Biol Chem, 270: 15425-15433. Sosale A, Robson JA, Stelzner DJ. (1988) Laminin distribution during corticospinal tract development and after spinal cord injury. Exp Neurol, 102: 14-22. Steindler DA, Cooper NG, Faissner A, Schachner M. (1989) Boundaries defined by adhesion molecules during development of the cerebral cortex: the J1/tenascin glycoprotein in the mouse somatosensory cortical barrel field. Dev Biol, 131: 243-260. Stichel CC, Müller CM, Zilles K. (1990) Distribution of glial fibrillary acidic protein and vimentin immunoreactivity during rat visual cortex development. J Neurocytol, 20: 97108. Struckhoff G. (1995) Cocultures of meningeal and astrocytic cells--a model for the formation of the glial-limiting membrane. Int J Dev Neurosci, 995: 595-606. Suzuki M, Choi BH. (1991) Repair and reconstruction of the cortical plate following closed cryogenic injury to the neonatal rat cerebrum. Acta Neuropathol, 82: 93-101. Swanson RA, Ying W, Kauppinen TM. (2004) Astrocyte influences on ischaemic neuronal death. Curr Mol Med, 4: 193-205. Tao-Cheng JH, Nagy Z, Brightman MW. (1987) Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. J Neurosci, 7: 3293-3299. Tawil N, Wilson P, Carbonetto S. (1993) Integrins in point contacts mediate cell spreading: factors that regulate integrin accumulation in point contacts vs. focal contacts. J Cell Biol, 120: 261-271. Tessier-Lavigne M, Goodman CS. (1996) The molecular biology of axon guidance. Science, 274: 1123-1133. Tian M, Jacobson C, Gee SH, Campbell KP, Carbonetto S, Jucker M. (1996) Dystroglycan in the cerebellum is a laminin α2-chain binding protein at the glial-vascular interface and is expressed in Purkinje cells. Eur J Neurosci, 8: 2739-2747. 97

Tiger CF, Champliaud MF, Pedrosa-Domellof F, Thornell LE, Ekblom P, Gullberg PD. (1997) Presence of laminin α5 chain and lack of laminin α1 chain during human muscle development and in muscular dystrophies. J Biol Chem, 272: 28590–28595. Torelli S, Sogos V, Ennas MG, Muntoni F, Clerk A, Strong PN, Gremo F. (1992) Dystrophin immunoreactivity in normal and Duchenne human fetal neurons in culture. J Neurosci Res, 32: 116–125. Toti P, Villanova M, DeFelice C, Megha T, Bartolommei S, Tosi P. (1998) Expression of laminin 1 and 2 in brain tumor vessels. An immunohistochemical study. J Submicrosc Cytol Pathol, 30: 227–230. Uchino M, Hara A, Mizuno Y, Fujiki M, Nakamura T, Tokunaga M, Hirano T, Yamashita T, Uyama E, Ando Y, Mita S, Ando M. (1996) Distribution of dystrophin and dystrophinassociated protein 43DAG (beta-dystroglycan) in the central nervous system of normal controls and patients with Duchenne muscular dystrophy. Intern Med, 35: 189-194. Ueda H, Baba T, Terada N, Kato Y, Fujii Y, Takayama I, Mei X, Ohno S. (2000) Immunolocalization of dystrobrevin in the astrocytic endfeet and endothelial cells in the rat cerebellum. Neurosci Lett, 283: 121-124. Verbawatz JM, Ma T, Gobin R, Verkman AS. (1997) Absence of orthogonal arrays in kidney, brain and muscle from transgenic knockout mice lacking water channel aquaporin-4. J Cell Sci, 110: 2855–2860. Venero JL, Vizuete ML, Machado A, Cano J. (2001) Aquaporins in the central nervous system. Prog Neurobiol 63: 321–336. Vígh B. Idegrendszer. In: Röhlich P. (szerk.) Szövettan. Semmelweis Kiadó, Budapest 2006: 460-461. Wagner S, Tagaya M, Koziol JA, Quaranta V, Del Zoppo GI. (1997) Rapid disruption of an astrocyte interaction with the extracellular matrix mediated by integrin α6β4 during focal ischemia/reperfusion. Stroke, 28: 858–865. Warth A, Kröger S, Wolburg H. (2004) Redistribution of aquaporin-4 in human glioblastoma correlates with loss of agrin immunoreactivity from brain capillary basal laminae. Acta Neuropathol, 107: 311-318. Warth A, Mittelbronn M, Wolburg H. (2005) Redistribution of the water channel protein aquaporin-4 and the K+ channel protein Kir4.1 differs in low- and high-grade human brain tumors. Acta Neuropath, 109: 418-426. Wei L, Erinjeri JP, Rovainen CM, Wolsey TA. (2001) Collateral growth and angiogenesis around cortical stroke. Dep Neurol, 32: 2179-2184. 98

Winder SJ. (1997) The membrane-cytoskeleton interface: the role of dystrophin and utrophin. J Muscle Res Cell Motil, 18: 617–619. Wolburg H. (1995) Orthogonal arrays of intramembranous particles: a review with special reference to astrocytes. J Hirnforsch, 36: 239-258. Wolburg H, Neuhaus J, Kniesel U, Krauß B, Schmid E-M, Öcalan M, Farrell C, Risau W. (1994) Modulation of tight junction structure in blood-brain barrier endothelial cells. Effects of tissue culture, second messengers and cocultured astrocytes. J Cell Sci, 107: 1347-1357. Wolburg H, Risau W. (1995) Formation of the blood-brain barrier. Ld: Kettenmann H, Ransom BR (szerk.) Neuroglia. UniversityPress, New York, 763-776. Xiao J, LeDoux MS. (2003) Cloning, developmental regulation and neural localizatio of rat εsarcoglycan. Mol Brain Res, 119: 132-143. Yamada H, Chiba A, Endo T, Kobata A, Anderson LV, Hori H, Fukuta-Ohi H, Kanazawa I, Campbell KP, Shimizu T, Matsumura K. (1996) Characterization of dystroglycanlaminin interaction in peripheral nerve. J Neurochem, 66: 1518–1524. Yamamoto T, Iwasaki Y, Yamamoto H, Konno H, Isemura M. (1988) Intraneuronal lamininlike molecule in the central nervous system: demonstration of its unique differential distribution. J Neurol Sci, 84: 1-13. Yong VW. (2005) Metalloproteinases: mediators of pathology and regeneration in the CNS. Neuroscience, 6: 931-944. Zaccaria ML, Perrone-Capano C, Melucci-Vigo G, Gaeta L, Petrucci TC, Paggi P. (2001) Differential regulation of transcripts for dystrophin Isoforms, dystroglycan, and alpha3AChR subunit in mouse sympathetic ganglia following postganglionic nerve crush. Neurobiol Dis, 8: 513-524. Zelenika D, Grima B, Brenner M, PessacB. (1995) A novel glial fibrillary acidic protein mRNA lacking exon 1. Mol Brain Res, 30: 251-258. Zerlin M, Levison SW, Goldman JE. (1995) Early patterns of migration, morphogenesis, and intermediate filament expression of subventricular zone cells in the postnatal rat forebrain. J Neurosci, 15: 7238–7249. Zhou FC. (1990) Four patterns of laminin-immunoreactive structure in developing rat brain. Dev Brain Res, 55: 191-201. Zilles K, Hajós F, Kálmán M, Schleicher A. (1991) Mapping of glial fibrillary acidic proteinimmunoreactivity in the rat forebrain and mesencephalon by computerized image analysis. J Comp Neurol, 308: 340–355 99

11. Saját publikációk jegyzéke Az értekezésben feldolgozott közlemények: Szabó A, Kálmán M. (2004) Disappearance of the post-lesional laminin immunopositivity of brain vessels is parallel with the formation of gliovascular junctions and common basal lamina. A double-labeling immunohistochemical study. Neuropath Appl Neurobiol 30:169-170 IF: 3,402 Szabó A, Jancsik V, Mornet D, Kálmán M. (2004) Immunofluorescence mapping of dystrophin in rat brain: astrocytes contain the splice variant Dp71f but confined to subpopulations. Anat Embryol, 208: 463-477. IF: 1,254 Szabó A, Kálmán M. (2008) Post traumatic lesion absence of β-dystroglycanimmunopositivity in brain vessels coincides with the glial reaction and the immunoreactivity of vascular laminin. Curr Neurovasc Res, 5: 206-213. IF: 2,826 Az értekezéssel kapcsolatos előadások (zárójelben a megjelent kivonatuk): Kálmán M, Kiss B, Szabó A. (2000) Agyszövet vaszkularizációjának vizsgálata a laminin immunhisztokémiai festésével. IBRO-MITT Millenniumi Konferencia, Budapest (Investigation of brain vascularisation by immunohistochemical staining against laminin. Neurobiology, 2000, 8:342-343). Kálmán M, Szabó A, Kiss B. (2000) Differences of laminin immunopositivity can indicate functional differnces between rat brain vessels. Tripartite Meeting of Anatomy, Cambridge, J Anat, 2001, 198: 366). Kálmán M, Szabó A, Mornet D, Jancsik V. (2002) A splice variant of dystrophin characterises basal lamina-forming astrocytes? 32th Annual Meeting of Society for Neuroscience, Orlando (Soc Neurosci Abstr, 424.5). Kálmán M, Szabó A, Mornet D, Jancsik V. (2003) A disztrofin egy splicing variánsának Dp71f eloszlása a fejlődő agyban: - egyes migráló sejtek és növekedő axonok jelölése? Magyar Idegtudományi Társaság IX. Konferenciája, Balatonfüred (Distribution of a splice variant of dystrophin (Dp71f) in the mature brain characterizes subpopulations of astrocytes? Clin Neurosci, 56 Suppl 2: 83). Kálmán M, Szabó A, Goren O, Adorján I. (2004) Different immunohistochemical localisation of laminin and its receptor dystroglycan in developing brain. 99.

100

Versammlungen der Anatomischen Gesellschaft, Wien (Verh Anat Ges, Ann Anat Suppl, 186: 112-113). Szabó A, Goren O, Adorján I, Kálmán M. (2004) Maturation of cerebral vessels in relation of the maturation of the astroglia 3. Forum of the European Neuroscience Associations, Lisbon (FENS Abstr, Vol 2, A179.24) Szabó A, Kálmán M. (2005) Comparative immunohistochemical studies on different laminin receptors:integrins and dystroglycan-dystrophin complex in glial recation to lesion. Magyar Idegtudományi Társaság X. Konferenciája, Pécs, 2005 (Clin Neurosci, 58 Suppl 1: 87). Szabó A, Kálmán M. (2005) Immunohistochemical reactivity of laminin receptors in glial reaction to lesion. Euroglia, Amsterdam Adorján I, Kálmán M, Szabó A. (2006) Immunohistochemical milestones of cerebrovascular maturation 36th Annual Meeting of Society for Neuroscience, Atlanta (Soc Neurosci Abstr, 488.20) Kálmán M, Adorján I, Pócsai K, Bagyura Zs, Szabó A. (2007) Divergent immunoreactivities of dystroglycan and utrophin in developing and post-lesion cerebral vessels. 5th World Congress of Neuroscience, International Brain Research Organization, Melbourne. Egyéb közlemények: Kálmán M, Szabó A. (2000) Plectin immunopositivity appears in the astrocytes in the white matter but not in the gray matter after stab wounds. Brain Res, 857: 291-294. IF: 2,526 Kálmán M, Szabó A. (2001) Immunohistochemical investigation of actin-ancho ring proteins vinculin, talin and paxillin in rat brain following lesion: a moderate reaction, confined to brain tracts. Exp Brain Res, 139: 426-434. IF: 2,306 Kálmán M, Szabó A. (2003) Appearance of annexin II immunopositivity in reactive astrocytes but not in microglia. Neurobiology 9: 138-146. IF: nincs Egyéb poszterek (zárójelben a megjelent kivonatuk): Kálmán M, Szabó A. (1999) Cytoskeleton associated proteins in rat brain after stab wounds 5th World Congress of Neuroscience, International Brain Research Organization, Jerusalem. Kálmán M, Szabó A. (2000) Annexin-II in glial reaction following lesion. IV. European Meeting on Glial Cell Function, Barcelona.

101

Szabó A, Kálmán M. (2001) Comparative study on the distribution of GFAP, annexin-II and tenascin around brain lesions. 17. Arbeitstagung der Anatomischen Gesellschaft, Würzburg, (Verh Anat Ges, Ann Anat Suppl, 183: 294-295). Szabó A, Kálmán M. (2002) Appearance of annexin II immunopositiviy in reactive astrocytes anti-coincides with microglial activity during post-lesional glial reactions. 2. Forum of the European Neuroscience Associations, Párizs, (FENS Abstr, 171.13). Szabó A, Kálmán M, Mornet D, Jancsik V (2003) A disztrofin egy splicing variánsának Dp71f eloszlása az érett agyban: egyes asztrocita- populációk jelölődése? Magyar Idegtudományi Társaság IX. Konferenciája, Balatonfüred (Clin Neurosci, 56 Suppl 2: 43). Adorján I, Goren O, Szabó A, Kálmán M. (2005) Comparative immunohistochemical studies of ependymal features and cytoskeletal proteins in mammalian radial glia and avian ependymoglia Magyar Idegtudományi Társaság X. Konferenciája, Pécs 2005 (Clin Neurosci, 58 Suppl 1: 5). Adorján I, Szabó A, Goren O, Kálmán M. (2005) Immunohistochemical investigations on developing ependyma suggest local differences. 100. Versammlung der Anatomischen Gesellschaft, Leipzig. Adorjan I, Szabo A, Kálmán M Heterogenous appearance of immunohistochemical markers in ependyma 36th Annual Meeting of Society for Neuroscience Atlanta, 2006 (Soc Neurosci Abstr, 515.17, 2006)

12. Köszönetnyilvánítás Témavezetőmnek: dr. Kálmán Mihálynak, dr. Csillag András és dr. Réthelyi Miklós professzoroknak, dr. Jancsik Veronikának, dr. Adorján Istvánnak, és a labor asszisztenseinek: Szász Istvánnénak és Őz Andreának.

102