Az árpa (Hordeum vulgare L.) biotechnológiája

Gyulai G, Kiss E, Heszky L (2004) Az árpa biotechnológiája. in Magyarország kultúrflórája. VIII/14. pp. 274-289. (Eds.) L. Tomcsányi, G Turcsányi. Az árpa - Hordeum vulgare L., Akadémiai Kiadó, Budapest.

Az árpa (Hordeum vulgare L.) biotechnológiája Bevezetés A Hordeum nemzetségnek közel 50 faja ismert (44 faj, illetve 46 taxon) (1. táblázat), melyek a meiotikus párosodási mintázatuk alapján négy szupraspecifikus faj-csoportba oszthatók, ezek a Hcsoport (pl. 2n = 14: H. pusillum, 2n = 28: H. jubatum, H. depressum), az I (í) csoport (pl. 2n = 14: H. vulgare, H. spontaneum, 2n = 28: H. bulbosum), az X-csoport (pl. 2n = 14: H.marinum), és az Ycsoport (pl. 2n = 18: H. murinum) fajai (Jacobsen és Bothmer 1992). Gazdasági jelentőségénél fogva az öntermékenyülő, 2n = 2x = 14, kromoszómaszámú ősi árpafaj a Hordeum spontaneum és annak domesztikált származékai a termesztett két-, ’négy’-, és hatsoros árpa (Hordeum vulgare L.), illetve a Hordeum bulbosum fajok a legjelentősebbek. Az árpában a korábbi citológiai alapú kromoszóma-számozás nem egyezik a mai, a génkapcsoltsági csoportokon alapuló árpa fizikai térképén (linkage map) alapuló számozással. A megfeleltetés a következő: 1H = a citológiai 5. kr., 2H = 2 kr., 3H = 3 kr, 4H = 4 kr., 5H = 7 kr., 6H = 6 kr., és 7H = 1 kr. Ma már célszerű a fizikai térkép alapján megadott (1H - 7H) kromoszómaszámozást alkalmazni (1. ábra). Evolúciós szempontból a kétsoros H. spontaneum (Koch 1848), illetve a H. distichon (sörárpa) vadárpafajok tekinthetők a legősibb formának, amelyek a többi árpa ősének tekinthetők (Bakhteyev 1963), beleértve a hatsoros árpafajokat is (Hordeum agriocrithon, Aberg 1940). Ez utóbbiak valószínűen egy recesszív mutáció eredményeként hoznak mindhárom kalászkában fertilis virágot (Evans 1966). Az árpa kalászában egy nóduszon három kalászka ül, mindegyik kalászka csak egyvirágú (eltérően a búzától, vagy a zabtól, ahol 3-6 virágúak a kalászkák). A hatsoros árpa esetében mindhárom egyvirágú kalászka-, míg a kétsoros árpa esetében csak a középső kalászka fertilis. Az ún. 'négysoros' árpa, a vulgare típus fajtái, valójában hatsorosak, csak látszólag mutatnak 'négysoros' szerkezetet. Ennek a fenotípusos plaszticitásnak a genetikai okai feltárásra várnak. A hatsoros árpában, ha a virágok azonos méretűek, de a kalászkák laterális virágai átfedik egymást ez a ’négysoros’, vulgare típust-, amennyiben a laterális virágok nem fednek át, úgy a hatsoros hexastichum típust-, míg ha a kalász laterális virágai kisebbek, mint a középső virág, úgy a hatsoros intermedium típust eredményezik. A kétsoros árpák oldalsó virágainak egyszerűsödése különböző mértékű lehet: a distichum típus fajtáiban a háromvirágú kalászka két oldalsó steril virágában a porzók és lekerekített toklászok kifejlődhetnek, míg a deficiens típusba tartozó fajtákban csak a toklászok és pelyvák maradványai találhatók meg. A két-, és hatsoros kalászszerkezet a búzáéhoz hasonló evolúciós fejődést mutat, ahol Triticum monococcum egymagvú-, a T. dicoccum kétmagvú-, míg a termesztett búza a T. aestivum kalászkája három/virágú/magvú. A poliploid evolúció és a kalász fertilitása között, azonban nem minden fajban mutatható ki ilyen egyenes összefüggés. A vad Hordeum fajok közül többségben vannak a diploidok


(2n = 2x = 14; pl. H. bulbosum, H. distichon); a néhány tetraploid- (2n =4x = 28; pl. H. brachyantherum, H. depressum, H. marinum, H. tetraploidum) és változó ploidszintű- (2n =14, 28; pl. H. hexastichon, H. hystrix), valamint a hexaploid fajok mellett (2n = 6x = 42; pl. H. arizonicum, H. hexaploidum, H. jubatum, H. lechleri H. Parodii) (Aberg 1940, Takahashi 1955, Staudt 1961). Az árpa genetikai és mai értelemben vett biotechnológiai kutatásai megelőzték a tudományág születését az izolált embriócsírázási kísérletekkel (Brown és Morris 1890, Brown 1906). A növénybiotechnológia (Haberlandt 1902), az általános biotechnológia (Ereky 1919) tudományán belül a Tradescantia sejtkultúrához, illetve a plazmolizált sejtek (protoplasztok) osztódásának első megfigyeléséhez kötődik (Haberlandt 1902, 1919), amelyet az in vitro táptalajok kidolgozása követett a kukorica (Robbins 1922), borsó (Kotte 1922) és paradicsom (White 1934) gyökércsúcs tenyészeteiben. Ezt követte a tiamin-hatáson (B1-vitamin) alapuló (Bonner 1937) élesztőkivonat első alkalmazása (Robbins 1922), az auxinok-(Darwin 1986, Paál 1918, Went 1928), és a növénybiotechnológia eredményeként felfedeztt (Skoog és Miller 1956), illetve a mikroelemek első alkalmazása (Gautheret 1985) (Gyulai és mtsi. 1995b). Biotechnológiai szempontból különös jelentőségű a Hordeum fajok örökletes sótűrése. Ismert, hogy ennek a sótűrésnek köszönhető a nagy Mezopotámia-i öntözéses kultúrák kialakulása (Takahashi 1955, Harlan 1976). Az árpa szárszilárdsága gyenge, így hajlamos a megdőlésre, ezért elméletileg az alsó nóduszok célzott rövidítése megoldást jelenthet. Ezzel párhuzamosan szükségessé válik az asszimilációs felület arányainak megváltoztatása: a széles és lehajló levelek helyett, a keskeny és felálló, a napfényt sűrűbb állományban is jobban hasznosító levéltípus kialakítása. A takarmányárpában a termésátlag és -stabilitás javítása (Zhu et al. 1999) mellett a fehérjetartalom, és fehérjeminőség (nagy lizintartalom) növelése a cél (Bright és mtsi. 1983, Koblitz 1986, Ahokas 1998). A söripar ezzel szemben nagy szénhidrát- (keményítő) és alacsony fehérjetartalmú gyorsan csírázó fajtákat igényeli. Ezeknek a nemesítési céloknak a megoldására számos biotechnológiai módszer áll rendelkezésre.

I. Embriótenyészet Az első árpa embriótenyészetekben (Brown 1906) a minimál táptalaj csak öt makroelemet tartalmazott: CaSO4(5.8 mM), MgSO4 (1 mM), KCl (3.4 mM), KH2PO4 (1.8 mM), FeCl3, szacharóz (146 mM) kiegészítéssel. A nitrogénforrásként tesztelt aminosavak közül csak az aszpanaginsav volt hatékony, míg a tirozin és a fenilalanin nagymértékű gátlást mutatott. A kazein-hidrolizátum (5g/l) további serkentő hatása is igazolódott (Kent és Brink 1947 in Dunwell 1986). Érdekes, hogy a kazein nem többlet nitrogénforrásként, hanem a táptalaj ozmotikus nyomásának növelésén keresztül mutatott aktivitást (kazein-hatás) (Ziebur és al. 1950 in Dunwell 1986), amely elvezetetve a nagy ozmotikumú táptalajok kifejlesztéséhez (Ziebur és Brink 1951 in Dunwell 1986), amelyekben a megemelt szacharóz mennyiség (365 mM) lehetővé tette a 7-9 napos, és csak 0.3-1.1 mm nagyságú árpa embriók in vitro felnevelését is (Norstog 1956, 1965, és Jensen 1983 in Dunwell 1986).

2


Különböző egyszikű fajok endospermium (lisztes táplálószövet) kivonatának alkalmazása különleges eredményt adott, mert a búza-endospermiumon (búzaliszten) nevelt steril árpaembriók gyorsabb növekedést mutattak az árpa saját tápszövetén nevelt embriókéhoz képest (Brown és Stingl 1907 és Harlan és Pope 1926 in Dunwell 1986). A ma is használatos agarral szilárdított táptalajt Merry alkalmazta először (Merry 1942 in Dunwell 1986).

II. Portok-, pollen- és ovárium-, ovulumtenyészet, gametoklón-szelekció, ikerembrióelemzés A maszlag (Datura innoxia) in vitro kultúrájában elsőként leírt haploid indukciót (Guha és Maheswari 1964) követően, napjainkra már több száz növényfajból állítottak elő androgenetikus haploidokat (Dunwell 1986, Barnabás és mtsi. 1991, Pauk és mtsi. 1999, Gyulai és mtsi. 1999, 2000). Árpában az első haploid eredményeket Clapham (1971, 1973 in Clapham 1988) érte el, majd a genotípus-elemzés (Foroughi-Wehr és Friedt 1984), a donor növény előnevelési feltételei (ForoughiWehr és Friedt 1984), az optimális pollen fejlődési stádium meghatározása (Sunderland és mtsi. 1981 in Dunwell 1986), a kalászok hideg előkezelése (Huang és Sunderland 1982 in Dunwell 1986), a leoltott portok - táptalaj helyes arányának meghatározása (Xu és Sunderland 1982 in Dunwell 1986), illetve a táptalaj-kondicionálás (Xu és Sunderland 1981 in Dunwell 1986) eredményei születtek meg. Az androgenetikus haploid regeneránsok között, a kloroplasztisz gének deléciója miatt létrejövő nagyszámú albinó növény (Day és Ellis 1984) az árpában is problémát jelent, ezért az árpa haploidok előállításában a bulbosum-módszerrel felnevelt gynogenetikus haploid indukció (ld. később), illetve az ikerembrió elemzés és az alloplazmás technika terjedt el (Devaux 1992). Az alloplazmás Tritordeum vonalak androgenezis indukciójában a T. durum citoplazma bizonyult a legkevésbé hatékonynak a H. chilense és a T. aestivum citoplazmájával szemben (Hernández és mtsi. 2001). Kawakami (1967 in Clapham 1988) az árpában 0.032 %-ban talált ikerembriót, melyek közül diploid-diploid (2n – 2n), diploid-triploid (2n – 3n) és csak nagyon kis gyakoriságban fordultak elő haploid-diploid (n – 2n) ikerembriók, melyek közül a haploidokat ki lehetett szelektálni (Trione és Stockwell 1989). Számos, a haploid indukcióban szerepet játszó ’gént’, illetve markert sikerült térképezni. Manninen (2000) több androgenetikusan aktív RFL lókuszt azonosított a 2H-, és a 4H kromoszómán, a hajtásdifferenciálódásért felelős Shd1-gént a 2H kromoszómán lokalizálták (Komatsuda és mtsi. 1995). QTL-markerek közül kettő a kallusznövekedéssel, négy pedig a hajtásfejlődéssel mutatott kapcsoltságot (Mano et al 1996, Yin et al. 1999). Napjainkra közel 20 haploid, illetve DH-eredetű árpa fajtát minősítettek (Devaux 1992), közöttük árpa mozaik vírusra rezisztens fajtát is (Foroughi-Wehr és Friedt 1984).

3


III. Bulbosum-módszer (H.vulgare x H.bulbosum), embriómentés (embrio resque) A H. bulbosum idegenbeporzó, évelő vadárpa faj, a mediterrán területeken őshonos. Különös jelentősége van az árpa-nemesítésben, mert fontos gomba-, vírus-, és rovar- (pl. búza-levéltetü, russian wheat aphid) rezisztencia géneket hordoz. Két citotípusa ismert: a diploid (2n = 2x = 14) és az autotetraploid (2n = 4x = 28) forma. A gynogenetikus haploid indukciós bulbosum eljárás Kasha és Kao (1970) nevéhez fűződik, melyet San Noeum (1976, 1979 in Castillo és Cistué 1993) és Castillo és Cistué (1993) fejlesztett tovább (2. ábra). A módszer lényege, hogy a H. vulgare-nak a H. bulbosummal történt megporzásából fejlődő zigóta még létrejön, azonban a fejlődésnek induló hibrid embriókból a H. bulbosum kromoszómák gyorsan eliminálódnak (10-14 nap), majd az embrió is elhal (3. ábra). Érdekes, hogy a triploid endospermium szövet is fejlődésnek indul, de 2-5 nap alatt ez is elhal. Amennyiben a fejlődő hibrid embriókat embrió-kulturába viszzük (embrio resque), az embriók megmenthetők és felnevelhetők, ezzel gynogenetikus haploid növényeket eredményezve. Ez az embriómentés eljárásának egyik célja. A módszer másik célja a rezisztencia átvitele a vadfajból a termesztett fajba, ugyanis a hibrid embrió totipotens sejtjeiben a vadfaj és a termesztett faj kromoszómái között szomatikus rekombináció mehet végbe (H. bulbosum kromoszómáinak eliminációja közben) ezzel adva lehetőséget a rezisztencia gének átvitelére. A bulbosum módszerel más keresztezési kombinációk is eredményezhetnek haploidokat. A H.geniculatum x H.vulgare (akár 2n, akár 4n) keresztezésből haploid H.geniculatum vonalak születtek (Clauss és Kunert 1980 in Koblitz 1986). A H.brachyantherum x H.depressum keresztezésből DHdihaploid (a haploid genom megkettőzödésével létrejött homozigóta diploidok, DH), míg a H.arizonicum x H.lechleri keresztezésből trihaploid (a haploid genom megháromszorozódásával létrejött, homozigóta triploid) regeneránsok fejlődtek (Subrahmanyam 1979, 1980 in Koblitz 1986). A nemzetséghibridek előállítását célzó kísérletekben is számos haploid utód jöhet létre melléktermékként. A H.vulgare x Secale cereale keresztezésből haploid (Fedák 1977, 1979 in Koblitz 1986), míg az autotetraploid árpa x diploid rozs keresztezéséből diploid árpa regeneránsok születtek (Lukjanjuk és mtsi. 1981 in Koblitz 1986). A bulbosum módszer főbb lépései a következők. Előinkubálás: a megporzás előtt a kasztrált (a porzók kivágása), haploid indukcióra kijelölt anya (termős-) növényeket (H. vulgare) 16h/18h °C és 8h/12h °C hőmérsékleten neveljük, míg a donor (porzós) H .bulbosum növényeket nyolc héten keresztül, 10 °C-on, 10h/14h sötét/fény periódussal vernalizáljuk (Jensen 1988). Az előinkubálás feltételei jelentősen befolyásolhatják a sikeres haploid, illetve hibrid embriók kialakulását. Három nappal a megporzást követően célszerű egy gibberellinsavas (GA3) permetezést (217 µM koncentrációban, 0.25 %-os nedvesítővel pl. Tween-20) alkalmazni. Tizennégy nappal a megporzás után, a fejlődő embriók táptalajra helyezésével in vitro körülmények között folytatódik a haploid/parciális hibrid embriók felnevelése (Kasha és Kao 1970, Chen és Hayes 1989, Hayes és Chen 1989, Pickering és Devaux 1992). E célra a legalkalmasabbnak az I25-8 táptalaj bizonyult (Jensen, 1988). A haploid egyedek diploidizációjára a 2.5 mM kolchicin (2% DMSO-ban oldva) kezelés (5

4


órán keresztül, fényen, 20 °C-on) az optimális (Dunwell 1986, Jensen 1988). Az esetleges diploid regeneránsok könnyen elkülöníthetők a morfológiai bélyegek pl. a fejlődő levélkék szőrözöttsége, vagy a nagyobb sztóma-méret, illetve a sztóma zárósejtek (a haploidokénál kétszerte több) kloroplasztisz száma alapján.

IV. Faj- és nemzetséghibridek Egy termesztett növény genetikai változatosságának kiaknázására a legkézenfekvőbb lehetőség az újabb kultúrváltozatok illetve ökotípusok termesztésbe vonása. Amint ezek a genetikai források kimerültek, úgy a következő génforrást a termesztett fajtával rokon vadfajok biztosítják (Sharma et al. 1999). Amint ezek a génforrások is kimerültek, akkor a további lehetőséget a nemzetséghibridek jelenthetik (Heszky 1972; Kjaer és mtsi. 1991, Gyulai és mtsi. 1992), melyekben a távoli szülők előnyös genetikai tulajdonságainak kombinálása és egyesítése (ld. Triticale) (Starks és Tai 1974; Martin 1983) a cél. Schooler (1961) H.compressum x H.pusillum fajkeresztezése , majd Dewey (1971), és a Rajháthy-iskola faj– és nemzetséghibridjei adtak jelentős fajhibrideket a Hordeum x Agropyron, Hordeum x Triticum és Hordeum x Secale keresztezésekben (Rajháthy és Morison 1959, Rajháthy és Symko 1974, Fedák 1985 és 1986, Fedák és Armstrong 1981, Fedák és Nakamura 1982, Kruse 1973 és 1974) (2. és 3. táblázat). A bulbozum-módszer ’melléktermékeként’ a H.vulgare x H.bulbosum keresztezésből is számos hibrid-kombináció született (Padilla és Martin 1983). A árpa x rozs (Hordecale), illetve a rozs x árpa (Secalordeum) hibridek előállítását a két faj előnyös tulajdonságainak kombinálása inspirálta (Gupta és Fedák 1985). Az árpa kedvező agronómiai tulajdonságai: a széles geográfiai és ökológiai adaptációs képesség, a sótolerancia, számos természetes betegségrezisztencia, a nagyobb lizin- és amilóz tartalom. A rozs esetében pedig a savanyútalajtolerancia, a szabad levirágzási hajlam, a télállóság, a törpeség és a hímsterilitási gének jelenléte előnyös. Az említett tulajdonságok kombinálása mind az árpa x rozs, mind a rozs x árpa hibridekben rendkívüli jelentőségűek lehetnek a jövőben (Fedák 1986, Cattivelli és Bartels 1990, Qiquan és mtsi. 1991). Az első árpa x rozs keresztezéseket Quinke (1940) végezte, azonban mind a H.vulgare x S.cereale, mind a H.jubatum x S.cereale hibridek termése embrió- és endospermium nélküliek voltak, amit Thomson és Johnston (1945) egy beporzást követő abortálódási folyamatnak tulajdonított, azt tapasztalva, hogy a hibrid-embrió fejlődése megindul és a 4. napig folytatódik, azonban a 7. napra a fejlődés teljesen megáll. Meglepetésre az endospermium sejtjeinek kromoszómaszáma 100 volt a várt 21 helyett. Az első fertilis Hordecale (H.jubatum x S.cereale) hibridek előállítása Brink és mtsi. (1944), illetve Wagenaar (1959) nevéhez fűződik. A rozzsal történő visszakeresztezések is, csak részleges fertilitású BC-utódokat eredményeztek (Fedák 1986). A H.vulgare x H.jubatum steril diploid hibridből Orton és Steidl (1980) kolchicin kezeléssel állított elő fertilis tetraploid vonalakat.

5


Az árpa és búza hibridje (Tritordeum), a tritikáléhoz hasonlóan nagy lehetőségeket rejt magában. A hexaploid Tritordeum (2n = 6x = 42, HchHchAABB), a Hordeum chilense x Triticum durum amfiploidja, amely számos előnyös agronómiai tulajdonságot mutat: jó termékenyülés, nagy fehérjetartalom, jó kromoszómastabilitás (Martin és mtsi. 1999, Hernandéz és mtsi. 2001). A háromvonalas (trigenerikus) hibridek létrehozása is sikeres volt a H.jubatum (4x) x H.compressum (2x) x H.vulgare (4x) (Orton és Tai 1977 in Koblitz 1986), a H.vulgare x Triticum aestivum x S.cereale és S.montanum (Fedák és Armstrong 1983 in Koblitz 1986), a H.vulgare x Triticale (8x) x Triticale (6x) (Clauss 1980), valamint a H.brachyantherum x H.bogdanii x H.vulgare (Schooler és Anderson 1979 in Koblitz 1986) keresztezésekben, sajnos nagymértékű kromoszómainstabilitás mellett (3. táblázat).

V. Szomaklón nemesítés A faj- és nemzetség hibridekben a filogenetikai távolság miatt fellépő inkompatibilitás (Thomas és Pickering 1985, Kiss és Rédei 1953, Kiss 1955, Finch és Bennet 1980, Belea 1986) feloldására az embriókultúrában felnevelt embriók, a kolchicin kezeléssel előállított amfiploidok, poliploidok, mellett a szomatikus szövetek in vitro manipulációjával előállított szomaklónok jelenthetnek alternatív megoldást (Martin 1983, Padilla és Martin 1983, Gyulai és mtsi. 1992, 1995a). A hibrid szomaklónok, a visszakeresztezési technikával szemben egy rendkívül gyors lehetőséget nyújtanak a fertilitás helyreállításában is. Orton és Steidl (1980) a H.vulgare x H.jubatum, Chu és mtsi. (1984) és Galiba és mtsi. (1986) a H.vulgare (2n=2x=14) x Tritucum aestivum (2n=6x=42), Chen és Hayes (1991) a H.vulgare x H.bulbosum hibridekből állítottak elő hibrid-szomaklón regeneránsokat. A szomaklónok regenerációjuk során átmennek egy hormon-indukálta kallusz fázison (Gyulai és mtsi.1995b), amely során, nagymértékű kromoszóma átrendeződés és genom kiegyenlítődés megy végbe, ez ad lehetőséget addiciós illetve szubsztitúciós hibridszomaklónok szelekciójára, amely során a fertilitás is helyreállítható (Lapitan és mtsi. 1984, Dudits & Heszky 1990, Gyulai és mtsi. 1995b). Ez a technika, azonban, a mitotikus óra, a mitotikus sokk, illetve a tkromoszóma telomerek rövidülése (Kilian et al. 1999, Qi et al. 1996) miatt fellépő szub/letalitás elkerülésére csak rövid idejű tenyészetben-tartást enged meg. Az első kalluszfázison keresztül regenerált árpa növényt (szomaklónális változékonyság, SCV – soma clonal variation) merisztéma eredetű kallusz kultúrában állították elő (Cheng és Smith 1975). 45 árpafajta összehasonlításában lineáris összefüggést lehetett kimutatni a genotípus-hatás, a 2,4-Dérzékenység, az embrió eredetű kalluszosodás és növényregeneráció hatékonysága között, (Bayliss és Dunn 1979 in Dunwell 1986, Gray és Purohit 1991). A szomaklónális variabilitás (SCV) nagy mértékű lehet, haploid árpanövények növények merisztéma eredetű kallusztenyészetében tíz regeneránsból négy diploid és hat haploid típusú aneuploid volt (Saalbach és Koblitz 1977 in Dunwell 1986). Az explantum fontosságát mutatja, hogy a kalluszosodás és a növényregeneráció mértéke nagy különbséget mutatott a levélalapról, illetve a

6


levél lemez végéről vett minták között (Saalbach és Koblitz 1978). Más vizsgálatokban a különböző méretű (0.3-1.4 mm) zigotikus pro-embriók, méretüktől függő kalluszosodási és a növényregenerációs aktivitást mutattak (Orton 1979 in Dunwell 1986). Az organogenezissel regenerált növények között, összehasonlítva az embriogenezisen keresztül regenerált szomaklónokkal, nagyobb fokú variabilitás volt tapasztalható, amely változások kiterjedtek a klorofill-hiányosságra, a levél és szár morfológiai elváltozásokra, kalászforma változatokra, sőt tetraploid regeneránsokra is (Ahloowalia 1987). A gynogenetikus haploid árpa (H genom), a diploid árpa (HH genom) és a H.bulbosum x H.vulgare keresztezésből származó diploid hibrid árpa (HB genom) embriókból indított kalluszkultúrák regeneránsainak összehasonlításából következtetni lehetett a H.bulbosum által kódolt tulajdonságok jó átviteli lehetőségeire (Pickering 1989, 1991) A HHBB genomú hibridek (H.vulgare x H.bulbosum, 2n = 4 x = 28) sikertelen regenerációja megakadályozta a B-genom további megismerését (Jorgensen és mtsi. 1986). Az endospermium eredetű triploid növények regenerációjának lehetőségét, sőt még az első kísérleti eredményeket is, a tudományos közvélemény csak nagy fenntartásokkal fogadta kukoricában (La Rue 1949). A kételyt árpában sem sikerült eloszlatni, amikor a 7-28 kromoszómaszámú, éretlen árpa-endospermium eredetű kallusz-regeneránsok között, egyetlen triploid egyedet sem sikerült kimutatni (Sun és Chu 1981. in Dunwell 1986). A triploid árpa (2n = 3x = 21) előállításására klasszikus módszert kellett alkalmazni egy diploid (2n=2x=14) H. spontaneum C.Koch var. transcaspicum Vav. és egy tetraploid (2n = 4x = 28) H.vulgare cv. Shin Ebisu No.16' vonal keresztezésével (Tsuchiya 1967. in Pickering 1991). Az előállított triploid árpák egy további diploid-keresztezést követően alkalmasak voltak triszóm (2n = 2x+1 = 15) sorok előállítására is, melyek segítségével sikkerült lokalizálni a Chlorina recesszív gént (Pickering 1989, 1991), illetve a 3. kormoszómán lokalizálni a Polymyxa graminis gomba által közvetített árpa mozaik vírus (BaYMV) elleni rezisztenciát adó géneket (Kaiser és Friedt 1989). A

szomaklónális

változékonyság

legújabb

területe

a

transzgénikus

növények

utódpopulációiban fellépő SCV-elemzés, amelynek mértéke a vártnál jóval nagyobbnak adódott árpában, melynek oka nem a transzformációban, hanem a kallusz-fázisban végbement mitotikus sokknak tulajdonítható (Bregitzer és mtsi. 1998). Az árpa szomaklónok, hasonlóan a legtöbb termesztett növényhez, eddig csak kis mértékben járultak hozzá a közvetlen fajtaelőállításhoz, azonban sok új mutánst illetve variánst eredményeztek a genetikai elemzések számára (Dudits és Heszky 2000).

VI. Mutánsizolálás A gabonafélékben alkalmazott mutánsizolálási technikák (Barabás 1959 és 1962, Reilly 1985) közül, az árpában, a különböző felhasználási célok (ld. sörárpa, takarmányárpa stb.) szerint történt a mutánsszelekció pl. a fehérjetartalom és -összetétel megváltoztatására, az aminosav-, illetve aminósavanalóg rezisztencia kialakítására. Az első munkákban (Bright és mtsi. 1979 in Dunwell 1986)

7


aminósavbioszintézis-mutánsok izolálása során közel 10.000 embrióból mindössze egyetlen S-2aminoethyl-L-cystein rezisztens egyedet sikerült szelektálni. A nagy lizintartalmú mutánsok előállítására jelentős nemzetközi konzorciumok (pl. International Atomic Energy Commission, Nemzetközi Atomenergia Bizottság, Bécs) alakultak. A szelekciós munka során különös figyelmet kell fordítani a genotípusos jellemzők felismerésére (markerezésére). Ismert, hogy a nagy keményítőtartalmú kukorica mutánsok áteső fényben opálos szint mutatnak a keményítő szemcsék térszerkezetéből adódó levegő maradványok (reziduumok) következtében (Nelson 1969 és 1979 in Munck 1992, Ahokas 1998). Ehhez hasonlóan, néhány nagy lizin-tartalmú fehérje-mutáns is hasonló opálos magszint ad. A több tízezer egyedet is magába foglaló populációk gyors tesztelése a mai napig sem lenne megoldott, ha nem alkalmaznak egy klasszikus textilfestési eljárást az acilán-naransc-diazo (acilane-orange-diazo) festést, amely szelektíven kötődik a lizinhez, illetve a hisztidin és arginin bázikus aminosavakhoz (Munck 1992). Az első opaque-2 (o-2) és fluory-2 (fl-2) típusú nagy lizintartalmú kukorica mutánsokban (Mertz 1964, in Munck 1992) a zein szintézis egyidejű gátlását is tapasztalták, azáltal, hogy az opaque-2 gén olyan regulátor fehérjét kódol, amely a zein strukturgén promoter régiójához kapcsolódik. Érdekes, hogy a nagy lizin-tartlamú árpa mutánsokban (lys-1, lys-3) a prolamin (az árpa endospermium fehérjéje, amelyet a kukoricában zein-nek, a búzában gliadin-nak hívunk) összetétele előnyös változást mutatott azáltal, hogy az eszenciális aminosavak közöttük a lizin, triptofán és a metionin aminosavak mennyisége megkétszereződött (Schmidt és mtsi. 1990, in Munck 1992). Ez a változás azért jelentős, mert az 1965-ben FAO/WHO programban megindult kutatások kiderítették, hogy az emberiség táplálékának 50 %-át adó búza, kukorica és rizs táplálkozás-élettanilag nem megfelelő, mert alacsony az esszenciális aminosav (lizin, treonin, metionin, cisztein, triptofán, valin) tartalmuk (a kizárólag kukoricán nevelt állatokban a két legfontosabb limitáló aminosav a lizin és a triptofán). Az újabb nagy lizin-tartalmú árpa-mutánsok, illetve fajhibridek (lys-3 a 7. kromoszómán, RISO. Dánia) aminosavösszetételbeli változására jellemző, hogy a lizin tartalom növekedésével együtt jár az aszparaginsav, a treonin, az aginin, a glicin és az alanin tartalom növekedése is, valamint a prolin, a glutaminsav/glutamin tartalom csökkenése. A lys-1 árpa mutánsban nagyarányú volt a cisztein csökkenése, míg a metionin, az izoleucin és leucin tartalom egyidejűleg növekedett (Munck 1992). Árpában az Osborne (1928 in Munck 1992) által kidolgozott módszerrel a fehérjéket négy frakcióra lehet elkülöníteni; (1) víz-, (2) különböző só-oldatok, (3) meleg etanol- és (4) NaOH oldószeres kivonatokra. A kukorica víz/só oldatos zein kivonata már az 1940-es években készen állt a táplálkozás-élettani vizsgálatokhoz, az új árpamutánsok elemzése Wiebe (1968) alapvető munkája óta folyik. A herbicid rezisztencia (Maliga és mtsi. 1975, Malone és Dix 1986, Dudits és Heszky 2000) kialakítására az árpában, agronómiai okok miatt kevesebb erőfeszítés történt. Jelentős eredmény, hogy

8


Giffard és mtsi. (1982 in Dunwell 1986) embriókultúrában izolált Asulam herbiciddel szemben ellenálló vonalakat. Sótűrő mutánsok izolálására Orton (1980 in Dunwell 1986) csak kallusz kulturában végzett előkísérleteket a H.vulgare és a H.jubatum összehasonlításával. A betegség ellenállóságra történő mutáns-szelekció nagy jelentősége miatt számos kísérleti megközelítést alkalmaztak. Branchard (1982 in Dunwell 1986) mezokotil eredetű kallusztenyészetben végzett kísérleteket Rhynchosporium gomba elleni rezisztenciára. Az 1,2-propandiol cellobiozidot (a gomba neve után "rhinkosporozid") alkalmazva azonban a toxin hatástalannak bizonyult sejtszinten, a szer a kallusznövekedést sem befolyásolta. Fusarium ellenállóság kialakítására Wenzel és mtsi. (1984 in Dunwell 1986) Fusarium-savat (Fusarium-toxin) alkalmazott 0.2 mM koncentrációban, azonban csak kallusz szinten sikerült túlélő sejtvonalakat szelektálni. Az eddig szelektált mutációk térképezése, valamint a mutánsok molekuláris markerezése egyre több adatot szolgáltat az árpa genom-térképének további finomításához.

VII. Protoplaszt-tenyészet, protoklón-szelekció, génátvitel, genetikai transzformáció Az idegen gén bevitelének (géntraszformáció) számos módszere ismert. A protoplaszt fúzió (in Dudits és Heszky 1990, Sváb és mtsi. 1990, Medgyesi és mtsi. 1985), (2) az Agrobacterium által történő transzformáció (Chilton és mtsi. 1977), illetve kokultiváció (Márton és mtsi. 1979), (3) a polietilén-glikol által stimulált direkt DNS-transfer, a (4) fiatal kalászkába- (Lörz és mtsi. 1985, Crossway és mtsi. 1985), illetve (5) mikrospórába történő közvetlen DNS-mikro injekció (Neuhaus és mtsi. 1988, De la Pena és mtsi. 1987), a (6) a Neumann és Rosenbeck (1972) által leírt, és Sugar és Neumann (1984) által modellezett elektroporációs módszer, valamint a (7) gyors géntranszfert biztosító a génpuska (Klein és mtsi. 1987, Mendel és mtsi. 1989) eljárások mindegyike alkalmasnak bizonyult nemcsak a sejtmag-, hanem a sejtorganellumok transzformációra is, akár a mitokondrium (Johnston és mtsi. 1988) akár a kloroplasztisz (Boynton és mtsi. 1988) esetében (Lee és mtsi. 1989, Svab és mtsi. 1990). A kétszikűekre kidolgozott protoplaszt izolálási és fúziós technikákat (Kao és Michayluk 1974; Dudits és mtsi. 1976; Lörz és mtsi. 1985; Yon és mtsi. 1991) eleinte nehezen lehetett adaptálni az egyszikűekre, így az árpára is. Az első sikeres árpaprotoplasztokat Koblitz (1986) gyökérszövetből, Rahman és Kochbar (1982 in Dunwell 1986) levélből izolálta, növényregeneráció nélkül. Protoplaszt eredetű növényregenerációt Lührs és Lörz (1988) ért el először, azonban az árpa regeneránsok 100%-ban albínók voltak. Lazzeri és Lörz (1988, in Jähne és mtsi. 1991) zöld növényregeneránsokat kapott, de a regeneránsok életképtelennek bizonyultak az üvegházi kiültetés után. Az első nagy hatékonyságú árpa protoplaszt regenerációs rendszer kidolgozása. Jan et al (1990 in Jähne és mtsi. 1991) nevéhez fűződik, melyet tovább sikerült növelni speciális elektromos kezeléssel (Mordhorst és Lörz 1992). Mindezek az eredmények új lehetőséget nyújtottak az árpa

9


biotechnológiai és genetikai kutatásai számára (Manninen 2000), valamint a környezetbarát (nem virális promótert tartalmazó) transzgénikus árpafajták létrehozásásában (Carlson és mtsi. 2001). Az első stabil transzgénikus árpát csak 1994-ben sikerült előállítani (Wan és Lamaux 1994) biolisztikus (génpuska) génbevitellel. Az azóta elért eredmények nagy genotípus-függést bizonyítottak, mert nagyszámú és stabil transzgén árpa előállítása eddig csak a Golden Promise (tavaszi árpa) és az Igri (őszi árpa) fajtákban volt sikeres. Az Agrobacterium-közvetített transzformációk nehézkesnek (közel 10 hónapos munka) bizonyultak (Collins és mtsi. 1999). Mindezek ellenére az (1,3-1,4)-β-güukanáz enzim génjét sikerült bevinni árpába Agrobacterium közvetítette transzformációval, amely transzformánsok a baromfi takarmányozási kísérletekben, mind az endopsermium-specifikus, mind az aleuron-specifikus promóterrel ellátott konstrukciókban, jobb takarmányhasznosítást mutattak, azáltal, hogy az árpa β-glükán sejtfalkomponensének jobb enzimatikus feltáródását biztosították (Horvath és mtsi. 2001). A takarmányozási célú transzgénikus árpanemesítés másik területe a csírázás gyorsításában és hatékonyságának növelésében szerepet játszó (ld. söripar) α-amiláz, és α-glükanáz gének bevitelét célozza, amely gének a megemelt kópiaszámban hatékonyan expresszálódhatnak. A fermentációs söripar számára sikeresen transzformáltak és expresszáltattak árpa-szuszpenzióban gomba eredetű (Trichoderma reesi), hőstabil β-glükanázt (EGI), amely hatékonyan emésztette a β-glükánt (Aspergen és mts. 1995). A betegségellenállóságra történő transzgénikus nemesítésben a lisztharmat-rezisztencia mellett sikeresen alakították ki rozsdarezisztenciát egy kukorica-eredetű rezisztencia-gén bevitelével (Collins és mtsi. 1999). A bar-génnel transzformált herbicidrezisztens árpanövények (pAL51, pAL74, és pAHC25 plazmidok) T0, T1, és T2 - generációinak (T = transzformáns) elemzésében a kilenc T-vonal rövidebb növénymagasságot adott a kontrollhoz képest. Viszont, az ezermag-tömegben nem mutatkozott csökkenés (Harwood és mtsi. közlése). A BYDV (árpa törpeségi és sárgulási virus, barley yellow dwarf virus) elleni rezisztenciát a vírus RNS-függő RNS-polimeráz génjének a blokkolásával érték el (Bregitzer és mtsi. 1988, Horvath és mtsi. 2001). Az árpa sárgulási mozaikvírus (BYDV) burok fehérje génnel transzfromált árpanövények (CaMV-35S promóter) gyengének mutatkoztak, csökkent növény-magassággal, ezermagtömeggel, és vigorral, sőt a vírus-rezisztencia sem nyilvánult meg (Bregitzer és mtsi. 1988). A thioredoxin-h gén az endospermiumban termelő 12 kD molekulatömegű fehérjét kódol, és a csírázás során a nitrogén- és a szénforrás mobilizálásáért felel. Amikor ezt a gént búzából sikerült az árpába átvinni egy árpa eredetű B1-hordein gén promóterével, a transzgénikus árpában harmincszoros túltermelődést (over-expressziót), és ezzel gyorsított csírázást sikerült elérni, amely máris kifizetődőnek bizonyult a söripar számára (Wong J és mtsi. Berkley Egyetem, USA közlése). Napjainkra (2002) kezdenek megbízható kísérleti eredmények rendelkezésre állni a transzgénikus árpafajták stabilitásáról. A beültetett (átvitt) transzgén stabilitásának nem várt mértékű szomaklónális változékonysága (SCV, Soma Clonal Variation) már bizonyítást nyert. Egy T2 (T –

10


transzgénikus)

hasadó

populáció

genetikai

stabilitásának

vizsgálatakor,

kiderült,

hogy

a

szomaklónokhoz hasonlóan, a mag-kontroll növényeknél is nagyobb SCV jelentkezik (Bregitzer és mtsi. 1988). A transzgénikus növények instabilitása mögött a megemelkedett transzpozon aktiválódás is szerepet játszhat, ugyanis a transzpozonok a növényekben is elsősorban vírus-szerű/eredetű/ek, és gyakran okozzák a transzgén blokkolását (transgene silencing) (Demeke és mtsi. 2001, Courtail és mtsi. 2001), illetve rekombinálódását (Ho és mtsi. 1999). A legnagyobb probléma, azonban az, hogy a génátvitelben alkalmazott növényi transzgének promótere (a génátírás indító szakasza), a karfiol mozaikvírus (CaMV, a keresztes virágú növények pararetrovírusának) promótere, és ezzel gyakorlatilag a fertőző vírusba épített hasznos génnel végezzük a transzformációt. A természetes CaMV fertőzéskor a vírus genomja nem épül be a megfertőzött növény genomjába, hanem ’csak’ egy cirkuláris minikromoszómát képez a sejtmagban. A virion DNS szintézise a citoplazmában megy végbe reverz transzkripcióval. Amikor transzformációt végzünk, a transzformációs vektor (CaMV promóter + szelekciós markergén + riportergén + maga a hasznos növényi gén) kivágódik az Agrobacterium T-DNS-éből, és beépül a növényi genomba (a promoterrel együtt). Ez a folyamat illegitim rekombinációval (törés-újrakötés, DSBR, double stranded DNA break repair) megy végbe. Ezáltal, nemcsak a hasznos gén épül be a növénybe, hanem a nemkivánatos CaMV gén-promóter is, amely egy rekombnációs ’forró pontot’ visz be ezáltal a növénybe, illetve az azt elfogyasztó állatba/emberbe is (Ho és mtsi.1999). A humán fogyasztás azért bizonyult kérdésesnek, mert kiderült, hogy a CaMV közeli rokonságban (retrovirus) van a hepatitisz-B vírussal. A Roundup Ready gyomírtószer-rezisztens transzgénikus szójában, a közel 10-éves termesztés után megmagyarázhatatlan eredetű, új, rekombináns DNS szekvenciákat mutattak ki, amelyek a virális eredetű, transzgén-promóter által aktivált, transzpozon-hatásnak volt tulajdonítható (Palevitz 2000), igazolva ezzel az első kísérleti eredményeket (Ewen és Pusztai 1999). A szántóföldön termesztett transzgénikus árpák genetikai stabilitásáról megállapításáról rövidebb időszak áll még rendelkezésre. Horvath és mtsi. (2001) vizsgálatában 18 homozigóta transzgénikus árpavonalat (Golden Promise fajta) vizsgáltak, melyeket génpuskával transzformáltak, külön-külön, három plazmid alkalmazásával, melyek a bar-gént, az uidA-t, és az (1,3-1,4)-β-glukanáz gént hordozták. Terméshozamban a transzgénikus vonalak (6 t/ha) alulmaradtak a kontrollal (7.7 t/ha) szemben. A T3 generációban transzgén-instabilitás mutatkozott, mert három különböző rekombináns (1,3-1,4)-β-glukanáz genotípust lehetett kimutatni, igaz, hogy ezek a rekombináns transzgének már stabilnak mutatkoztak a további hároméves vizsgálatokban. A transzgénikus (1,3-1,4)-β-glükanáz gént keresztezéssel is át sikerült vinni egy jobb árpavonalba, amelyben a terméshozam már elérte a kontroll értéket (Horvath és mtsi. 2001). VIII. Molekuláris markerszelekció A markerek gyakorlatilag három csoportba sorolhatók: (1) morfológiai (fenotípusos tulajdonságok, Linné-féle rendszertani bélyegek) (Linné 1753a,b; 1758), mellyel a taxonomia (rendszertan) dolgozik, (2) fehérje markerek pl. izoenzim-mintázat, illetve bármely élettani

11


tulajdonság pl. auxotrofia (hiánymutáns), rezisztencia (ellenállóság) stb, és (3) a nukleinsav (RFLP, PCR-alapú eljárások, stb) alapú markerek. Abban az esetben, amikor a különböző módszerek alapján megállapított két tulajdonság (marker) együttes megjelenése igazolható, a két tulajdonság kapcsolt, és ezzel az egyik tulajdonság (pl. egy mikroszatellita-marker) meglétének indirekt igazolására.) alkalmassá válik a másik tulajdonság (pl. kórokozó rezisztencia, fenológiai jelleg stb.) Egy genetikai marker akkor megfelelő, ha monogénes tulajdonságú, kodominánsan öröklődik (a homozigóta és heterozigóta forma elkülöníthető a recesszív ill. domináns allél kimutatásával), nincs genetikai kölcsönhatásban (kapcsoltságban) más tulajdonsággal (markerrel), környezeti hatásoktól független (nem érzékeny az epigenetikus hatásokra), valamint szoros kapcsoltságban van (nincs interkromoszomális rekombináció) azzal a génnel (tulajdonsággal), amelyhez való kapcsoltságát bizonyítottuk. Az izoenzim technika (Markert és Moller 1959), a restrikciós endonukleázok (Messelson és Yuan 1968) alkalmazásán alapuló RFLP (restriction fragment length polymorphizmus)-analízis (Botstein et al. 1980), és a PCR (polymerase chain reaction)-alapú eljárásokkal (Mullis és Faloona 1987) számos Hordeum-specifikus markert azonosítottak. A PCR-eljárások alapja a Nobel díjjal jutalmazott Mullis-i PCR-módszer (Saiki et al. 1985, Mullis és Falooma 1987), melyben kulcsenzimként még az Escherichia coli baktérimból konvencionális módon izolált DNS polimeráz-I. enzimet (Klenow fragment) alkalmazták, 37 °C-os hőmérsékleten, minden PCR ciklushoz történő külön adagolással. A módszer automatizálását a Thermus aquaticus, a gejzírek forró vizéből izolált hőstabil baktériumfaj DNS polimeráza (Taq polimeráz) (Lawyer et al. 1989) tette lehetővé (Saiki et al. 1988). Ezt követően számos új, hőstabil baktériumfaj DNS-polimeráz enzimét klónozták sikeresen (pl. Thermus flavis, Thermus termophilus, Thermococcus litoralis, Thermotaga maritima, Pyrococcus furiosus), és számos új technikai újítással könnyítették a módszert (pl. a PCR készülék fedelének fűtésével nem szükséges az olajfedés). A PCR-alapú technikák közül a legfontosabb módszerek a random bázisszekvenciájú primereket alkalmazó RAPD-, (random amplified polymorphic DNA) (Williams et al. 1990); az APPCR (arbitrary primed PCR) (Welsh and McClelland 1990); és a DAF (DNA amplification fingerprinting) (Caetano-A. et al. 1991) vizsgálatok. A szekvenciaspecifikus módszerek közül az STS (sequence target sites) (Olson et al. 1989); az ISJ-PCR (intron splice junction) (Weining and Langridge 1991), és az AFLP (amplified fragment length polymorphism) (Vos et al. 1995), továbbá a mikroszatellita régiók polimorfizmusát kimutató SSR-PCR-, (simple sequence repeat) (Gupta et al. 1994), az ISSR-PCR (inter simple sequence repeat) (Zietkiewicz et al. 1994), az MS-PCR (microsatellite) (Akkaya és mtsi. 1992), és az R-PCR (restricted) (Puskás et al. 1994) eljárások (Fu et al. 1997, Gyulai et. al. 2000) a legjelentősebbek (4. ábra, 6. táblázat). Liu és mtsi. (1996) 45 árpa-SSR markert azonosított, amelyek közül 6 térképeződött a 7H kromoszómán. Bezant és mtsi. (1996) nyolc virágzási időhöz-, és három növénymagassághoz kapcsolt

12


QTL-markert azonosított. Steffenson és mtsi. (1996) hét betegségrezisztencia markert, míg Schonfeld és mtsi. (1996) három lisztharmat rassz-specifikus markert azonosított. A rizs – árpa molekuláris genom összehasonlításában Saghai és mtsi. (1996) ért el kimagasló eredményeket, különösen az árpa 7. és a rizs 6. számú kromoszómáin térképezett szinténiás markerclusterek azonosításával. Yu és mtsi. (2000) elkészítette az árpa BAC-könyvtárát (bacterial artificial chromosome), melyből 504 random klónnal egy átlagos 106 kb nagyságú klóntárat hoztak létre, amelyekből rezisztencia gén/analóg/okat sikerült azonosítani. A bulbosum-módszerrel előállított homozigóta dihaploid vonalak (DH-vonalak) alkalmasak voltak az árpa markergénjeinek és kvantitatív tulajdonságainak részletes vizsgálatára (Kajser és Friedt 1989). Az analízis során 23 kvantitatív tulajdonság és 10 genetikai marker kapcsoltságát lehetett kimutatni. Az árpa 3. kromoszómájának C-sávozással jelzett régiói szoros kapcsoltságot mutattak több kvantitatív jelleggel (a szár legfelső internódiumának hossza, illetve a szár keresztmetszetének mérete). A 6. kromoszóma C-sávja kapcsoltságot mutatott az ezermagtömeggel és a mag magnézium tartalmával. Egy nagy nemzetközi együttmuködésben kilencvennégy H. bulbosum technikával eloállított DH árpavonal elemzést 12 morfológiai, 87 RFLP, 5 RAPD, 1 STS, 5 IFLP (intron fragmenthossz polimorfizmus, Müller és mtsi. 1995), 33 SSR, és 586 AFL markerrel végezték el. Az elkészült genetikai térkép 1.9 cM átlagos léptéket ért el. A markerek szegregációja nagy változatosságot mutatott: RAPD (54%), SSR (27%), AFLP (26%) és RFLP (18%), melyek alapján feltételezheto, hogy a DH-vonalak kifejlodésük megindulásakor speciális gamétaszelekción mehetnek keresztül, amely gaméták speciális meiotikus rekombinációs mintázatukat örökítik (Costa és mtsi. 2001). Transzgénikus búzaföldek közelében növő vadárpát (tengerparti árpa, Hordeum marinum L.) RAPD-markerekkel elemezve igazoltnak látszik, hogy természetes körülmények között a búza átporozhatja a gyomnövényeit, azaz végbemegy a transzgén-introgressziója. Ugyan, mindössze egy vadárpa növényt azonosítottak, amelyben búza-specifikus RAPD-fragmentumok jelentek meg, feltételezhetően egy korábbi, de végbement átporzást igazolva (Guadagnuolo és mtsi. 2001). IX. Genomelemzés és evolúciókutatás Az árpa genomelemzésének evolúciós jelentősége az, hogy minden kromoszómája homeológ a búza megfelelő kromoszómájával és egyben modellnövénye is a gazdaságilag jelentősebb búza genomelemzéseknek (Moore és mtsi. 1995, Devos és Gale 1997) (5 ábra, 6 ábra). Az árpa(Hordeum) a Triticeae tribuszba tartozik (4. 5. táblázat), melynek fajai feltételezhetően a Pleistocén korban váltak szét és különültek el egy közös diploid őstől, amely az ősrizsből válhatott ki. Mindezek ellenére a genomok ismétlődő szekvenciaelemzése azt mutatja, hogy pl. a rozs (2n = 14) genetikailag közelebb áll a búzához (2n = 42), mint az árpához (2n = 14) (Bendich és McCarthy 1970, Moore és mtsi. 1993).

13


Történetileg a Poaceae család fajainak evolúciós és genetikai hasonlóságát az első szubsztitúciós eredmények igazolták, amelyekben feltételezték, hogy a helyettesítő (szubsztituáló) kromoszómának nagyon hasonló genetikai állományt kell hordoznia ahhoz, hogy a helyettesítendő (szubsztituált) kromoszómát pótolni tudja. Az első igazolást Shephard (1968) végezte el, amikor a glutenin raktározó fehérje gént mind a három búza homeológ (1A, 1B, 1D) kromoszómáján (tripla kópiában) ki tudta mutatni. A markertechnikák fejődésével további bizonyítékok születtek a Paceae-család fajaiban, nemcsak az egyes gének, hanem géncsoportok (gén-clustererek) génjeinek evolúciósan rögzített (konzervált) sorrendjére (synteny, szinténiás gének) is (Moore és mtsi. 1995, Devos és Gale 1997). Tudománytörténeti érdekesség, hogy ha a PCR-módszer felfedezése (Mullis és Faloona 1987) és kiteljesedése (Vos és mtsi. 1995) akár csak pár évvel korábban történik, akkor nem születhettek volna meg ezek a nagy kromoszóma-szakaszokat átívelő, RFLP-próbákon alapuló, evolúciós eredmények (Devos és Gale 1997). A gazdaságilag fontos Poaceae fajokban azonosított több száz reciprok homeolog RFLP próbából kialakított sikerült összeállítani a 25 rizs markercsoportból alló genomját (rice linkage/genome blocks, ’lego boksz’), amelyekbő ’kirakhatóvá’ vált (lego) a többi Poaceae faj genomja. Meglepő, hogy egy-egy rizs marker-blokkban az azonosított gének/markerek sorrendje minden fajban azonos (intergenomikus kolinearitás), evolúciósan konzervált, csak a blokkok sorrendje (ld. a fajok eltérő kromoszómaszámát), a blokkok száma (ld. duplikáció), és helyzete (ld. inverzió, transzlokáció, poliploidizáció) változik, aminek eredménye maga az új faj. A genomelemzésekben (Bennett és Smith 1976, Sherman és mtsi. 1995) a szinténiás génilletve markercsoportok alapján számos evolúciósan konzervált géncsoportot (gén clustert) lehetett azonosítani a legősibb, mert: legkisebb genom-méretű rizstől (n = 12, 1C = 0.4 x 109 bp), a közepes genom-méretű, szegmentális alloteraploid kukoricán (n = 10, 1C = 2.7 x 109) és a diploid árpán (n = 7, 1C = 4.8 x 109 bp) keresztül, a legnagyobb genom-méretű búzáig (n = 21, 1C = 16 x 109 bp) (5. ábra, 6. ábra). A genom mérete és a kromoszómák száma közötti különleges evolúciós kapcsolat jól elemezhető az árpa és rokon fajai között (6. ábra). A prokarioták egyetlen genoforján (kromoszómáján) egyetlen génátírási kezdőpont (replikációs origo) van, ezért az osztódást megelőző DNS-szintézis (replikáció) is csak egy pontból kiindulva haladhat végig a DNS-en. Ezzel szemben az eukarioták minden kromoszómája egyidőben, párhuzamosan replikálódhat (egy kromoszómán akár több kezdőponttal), annál gyorsabban, mennél több kromoszómára van tagolva a hatalmas növényi genom (Smith és Szathmáry 1997). Ezért érdekes, hogy a legősibb és egyik legkisebb genomú rizs genomja 24 kromoszómára van tagolva, míg az evolúcióban fiatalabb árpa több mint tízszer akkora genomja ’csak’ 20 kromoszómára tagolt (6. ábra). Az egyes géneknek különböző fajokban azonosított lókuszai jó példáját mutatják az evolúciónak és domesztikációnak is. Az adh gének, például, 3.4 Kb hosszú DNS szakaszok, az enzim maga 370 aminosavból felépülő, NAD+-függő, Zn-tartalmú, két alegységes dimer szerkezetű alkohol dehidrogenáz enzim (E.C.1.1.1.1.). A legősibb fajokban, így a rizsben az adh gén, egy 65 millió évvel ezelőtt végbement génduplikáció eredményeként, már két

14


kópiában van jelen (adh1 és az adh2), de még azonos kromoszómán (a 11. kromoszómán), alig 35 kb távolságra egymástól. A kukoricában és a cirokban az adh1 és adh2 gén már külön kromoszómára transzlokálódott (adh1: 1L – 128 cM, adh2: 4S – 46 cM) (Schwartz, 1966, Schwartz and Endo 1966). Ez a transzlokáció még az „őskukoricában” mehetett végbe, és járulhatott hozzá a cirok és a kukorica evolúciós szétválásához. Az evolúciósan jóval fiatalabb árpában már egy harmadik adh gén is megtalálható (adh1, adh2, adh3), amely az adh2 gén további megkettőződésének az eredménye (Cummings és Clegg 1998, Tarchini és mtsi. 2000). Szatellita DNS. Az árpa, hasonlóan a többi eukarióta virágos növény genomjához, hatalmas mennyiségű, nem-kódoló DNS szakaszokat tartalmaz, amelyek mint az ismétlődések tengereként (repeat seas) veszik körül a gén-szigeteket (gene islands). A nem kódoló szakaszok jelentős része ismétlődő szekvenciájú un. repetitív-DNS, amelynek mértéke az árpa genom 70%-át is meghaladja. Öt nagy csoportjuk ismert: (1) szatellitek (ismétlődő alapszakaszaik alapján mini-, midi és mikroszatellitek), (2) szétszórt ismétlődések (interspersed ripítek, rövidek és hosszúak), (3) pszeudogének, (4) transzpozonok, és (5) retrotranszpozonok (Gyulai és mtsi. 1995). Az ismétlődő DNS szekvenciák szatellita neve a kromoszóma-genetikából származik, ahol a másodlagos befuzodésekkel határolt, heterokromatikus kromoszóma régiókat jelölték (Navashin 1912). Késobb, a DNS CsCl-grádiens ultracentrifugálásával nyert, a magi DNS-tol elkülönült, vékonyabb sávot alkotó DNS is a szatellita nevet kapta (Sueoka, 19619).A szatellita DNS-ek szekvenálása oligonukleotidok egymást követo (tandem) ismétlodéseit mutatták (Jeffreys et al. 1985). Jellemzojük, hogy a kromoszómán a heterokromatikus régióban lokalizáltak, fehérjét nem kódolnak. Néhány fajban rejtett szatellitek (cryptic satellites) is elofordulhatnak, amelyek a CsCl grádiensen a fo DNS sávval együtt futnak, vele azonos suruségét mutatva. A midiszatellitekben 20-30 bp hosszú DNS-szakaszok ismétlodnek, a miniszatellitekben az alapszekvencia 10-15 bp hosszú, 3-4 szeres tandem ismétlodéssel (szinonim elnevezés a HVRszekvenciák, hiper variable region), míg a mikroszatellitekben az alapszekvencia 2-5 nukleotid hosszúságú, 10-80-szoros egymás utáni (tandem) ismétlodésben (szinonim elnevezésük: SSR simple sequence repeats, STR short tandem repeats, VNTR variable number of tandem repeats, és VNDR variable number of dinucleotide repeats). A mikroszatellitek (SSR) további három alcsoportra különíthetok

összetételük

alapján:

tökéletes

SSR,

pl.

(ATG)10,

megszakított

SSR,

pl.

(AT)10CACA(AT)10, és az összetett SSR, pl. (AT)10(CA)10, amelyek jelenléte számtalan kombinációban igazolt az árpában (Moore és mtsi. 1995). CpG ismétlődések. A mikroszatellitek speciális fajtái a dinukleotid mikroszatellitek, melyek kiemelt szerepet játszanak az árpa, és minden növényi gén izolálásában és klónozásában. Legjellemzőbbek a CG-dinukleotid-ismétlődések (5’CG3’’ / 3’GC5’)n (más jelzés szerint CpG - Citozinphosphodiester-Guanin, CpG-repeat, CpG-blokk, CpG-motifs, CpG-islands -szigetek,stb). Ismert, hogy a DNS báziseloszlása nem egyenletes. Az A+G = C+T egyenlő aránya ellenére (A –Adenin, T – Timin, C – Citozin, G – Guanin) a G+C-tartalom az elméleti 50%-tól nagymértékű eltérést mutat, pl. az árpában és a búzában 45%, az emberben 40%. Az eltérés abból adódik, hogy a növények

15


(különösen az egyszikűek, és az állatok) az aminosavak szinonim tripletjeiből ’többet használnak fel’ (a legfontosabb 18 aminosavnak még további 13 szinoním kodonját), míg a kétszikűek kevesebbet (18 aminosavnak csak 7 szinonim tripletét). A glutaminsavat kódóló gén GAA tripletje, például, alacsonyabb GC-tartalmú, mint a glutaminsav másik, szinoním GAG tripletje. Ezért is bizonyult olyan nehéznek az egyszikű és a kétszikű növények azonos főgénjeinek (houskeeping genes) reciprok (egymással történő) DNS-hibridizációs (Southern-bott) azonosítása. A CpG ismétlődések további, univerzális sajátsága hogy a kódoló gének kezdőpontjához (5’-vég, promóter) közel (kapcsoltan), vagy éppen abban találhatók, ezzel adva lehetőséget a kevés számú növényi promóter hiányában is végrehajtható hatékony árpa gének izolálásra (Moore és mtsi. 1993 és 1995). A genomban egyenlőtlenül oszlanak el, az n-ismétlődésszám nagy változatosságát mutatva (az emberi genomban, például, a törékeny X-kromoszóma-betegség FMR1 génjének 1. sz. exonja egy, a CpG dinukleotid ismétlődéséhez hasonló CpCpG trinukleotid ismétődést tartalmaz, amelynek hossza a nem-betegben (CCG)6-60, a hordozóban (CCG) 50-200 míg a betegben (metilált-CCG)200< számú). Az CpG ismétlődések eloszlási gyakorisága könnyen megbecsülhető a négy DNS-bázis 24 = 16-féle kombinációjából (AA, AT, AC, AG, TT, TA, TC, TG, CC, CA, CT, CG, GG, GA, GT, GC), amelynek értéke bármelyik kiválasztott génben (szekvenciában) vizsgálva elméletileg 1/16, közel 6,25%, egyenletes eloszlást feltételezve. Ez az érték, azonban, búzában és minden növényben nagyobb, mint az állatokban (4%), vagy az emberben (1%) (ld. CpG supression, CpG-csökkenés). A CpG szupresszió oka abban keresendő, hogy a CpG ismétlődések C-citozinja könnyen metilálódik metil-citozint eredményezve. A metil-citozin, azonban, hajlamos egy spontán végbemenő enzimatikus dezaminációra, amelynek az eredménye timin (ez a folyamat egy természetes C→T tranzició a két pirimidin bázis között). Azáltal, azonban, hogy a DNS egyik szálán végbement egy C→T tranzició, a DNS komplementer szálán is végbe kell mennie egy ’javításnak’ (a DNS replikáció helyesírás-ellenőrzése segítségével, proof reading), amelynek eredménye a G→A purin-tranzició:

5’…(C-G)n…3’ → …(metCG)n…→ …(T-G)n… III III III III II III 3’…(G-C)n…5’ → (G-C)n → (A-C)n…

Az egész folyamat egy típusos pontmutáció, amely egyben genetikailag konzerválja a metilációs mitázatot is. A folyamat vizsgálatára az SNP (nukleotid-polimorfizmus - single nucleotide polymoprghism) módszer vált a legalkalmasabbá. Valószínű, hogy ezeken a rögzült metilációs mintázatokon keresztül fogyhattak el a ’hosszú evolúción keresztül ment’ állati és emberi genom CpG ismétlődési (CpG szupresszió), míg az evolúciósan lassabb (és ezért ’fiatalabb’) árpában és a többi növényben számuk magasabb maradt. Az evolúciósan öregebb kétszikűek, és a belőlük leegyszerüsődő egyszikűek pontos CpG tartalmának meghatározására csak napjainkban indulnak meg a vizsgálatok (az egyszikűek nagyobb G+C tartalmából még nem következtethető a több CpG ismétlődés). A CpG ismétlődések citozinjának metilációjából származik egy, a tárgyunkat nem képező másik következmény is, a génblokkolás, (gén elhallgattatás, gene silencing), azáltal, hogy a metil-citozinon blokkolódik génátíródás (transzkripció). A metilációs mintázat (amely nem szorítkozik a (CG)n dinukleotid ismétlődésekre) a mitotikus ciklusban sem oldódik fel, egyfajta epigenetikai hatást

16


(molekuláris inprinting) örökítve az utódnemzedékre (ld. a környezeti hatás öröklődővé válásának évszázados vitáját). Az árpa és a búza genomjának teljes citozin-tartalmából átlag 30% van metilálva, míg ha csak a CpG ismétlődések citozinjait vizsgáljuk ez az érték elérheti a 82%-ot. A rizsben ez az érték sokkal alacsonyabb (1-7%), akárcsak az állatokban. A nem-metilált citozin tartalmú CpG ismétlődések további különös jelentősége az, hogy a DNS metiláltságára érzékeny speciális restrikciós endonukleáz enzimek (NotI, MluI, NruI), melyek a CpG- ismétlődések palindrom szekvenciáit hasítják jól összevethető RFLP mintázatot szolgáltatva. Amennyiben a CpG ismétlődésben a citozim metilálva van (

met

Citozin) az enzim nem tudja a DNS-t hasítani, és ezzel egy RFLP fragmentum eltűnik az

elemzésekben. A NotI enzim palindrom bázissorrendu hasítószekvenciája 5’-GCGGCCGC-3’ 3’-CGCCGGCG-3’ Éppen a NotI-emésztési mintázatok (PFGE – pulse field gele electrophoresis módszerrel, változó térerejű gélelektroforézissel elválasztva,) nyújtották az első rizs – árpa –búza összehasonlító genomösszehasonlító eredményeket az evolúciós kapcsolatok megállapításához (Moore és mtsi. 1993). Retroelemek. A mikroszatelliták nagy szerepet játszanak az árpa genom 3 %-át kitevő retrotranszpozonok (RTP) felépítésében is. A retoelemek egyrészről reverz tarnszkripció útján (retrotranszpozonok) önmagukat szaporítani képesek (ezek azok a típusos önző gének, amelyeknek csak egy céljuk van, önmaguk szaporítása, Richard Dawkins 1976), másrészről transzpoziciós tulajdonsággal is rendelkeznek (retrotranszpozonok). Felépítésükben fontos szerepet játszik az a két határoló szakasz, amely megfordított ismétlődésű mikroszatellita régióból (inverted ripítek) áll. A közrefogott kódóló DNS szakaszok, mintegy a határolószakszok ’fészkében ülnek’. Az egyik legkutatottabb retrotranszpozon az árpa BARE-1 (barley retro element) eleme, amely több ezerszeres ismétlődésben (!) fordul elő az árpa genomban. Az BARE-1 két határoló megfordított ismétlődő szekvenciája teszi lehetővé, hogy a genomban szétterjedjenek és szaporodjanak (beépülés, kivágódás, újra beépülés), avagy ’ugráljanak’ (ugráló gének). Ennek során törhetnek (rekombinálódhatnak) is, új szekvenciájú elemeket hozva létre. Az árpában ezeknek a törött illetve teljes BARE-1 elemeknek a teljes száma elérheti 14.000-t haploid, genomra számítva (Vicient és mtsi. 2001). A H. spontaneum vadárpában végzett vizsgálatok azt is igazolták, hogy a BARE-1 elem stresszz-aktíválódó, mert a száraz ökológiai körülmények között nőtt egyedekben a BARE-1 megbecsülhető száma ötszörösére emelkedett (14.000-ről 70.000re), kimutathatóan megnövelve ezzel a genom méretét is, sőt a RAPDpolimorfizmus mértéke, a ’fajhatárokat is felülmúló mértékben’ nőtt meg az optimális (nedves) körülmények között nőtt egyedek mintázataihoz képest (Vicient és mtsi. 1999). Számos új technika, pl. IRAP – inter-retrotansposon amplified polymorphism, RMAR – retrotrasnposon-microsatellite amplified polymorphism, és SSAP – sequence-specific amplification polymorphism (Waugh és mtsi. 1997, Kalendar és mtsi. 2000) megszületését eredményezték ezek a H. spontaneum alapú molekuláris vizsgálatok (Wessler 1996, Vicient és mtsi. 1999, Kalendar és mtsi. 2000).

17


1. Táblázat A Hordeum nemzetség jellemző fajai és kromoszómaszámuk (Darlington & Wylie 1961, Jensen 1988, Gyulai és mtsi. 1997)

fajnév 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44.

kromoszómaszám (2n, 4n, 6n) ) elterjedés 14 28 42 H. agriocrithon H. arizonicum H.brachyantherum H.brevisubulatum H.bulbosum H.californicum H.canadense H.comosum H.cornutum H. deficiens H.depressum H.distichon (1) H.distichum H.erectum H.euclaston H.halophilum H.hexaploidum H. v. hexastichon (2) H.hystrix (3) H.intermedium H. irregulare H.jubatum H.lechleri H.leporinum H.marinum (4) H.murinum (5) H.muticum H.nigrum H.nudriramulosum H.nudum H.nutans H.parodii H.pavisi H.pubiflorum H.pusillum H.secalinum H.spontaneum (6) H.stebbinsii H.tetraploidum H.tetrastich um H.thyrosoideum H.trifurcatum H.vulgare (7) H.zeocriton

+ + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +

+ +

+ + + + + + + + +

+ +

+ + + + + + + + + + + + +

Tibet Amerika Mérsékelt öv Mérsékelt öv Mediterrán Amerika Kultúrfaj Chile Mérskelt öv Mérsékelt öv Amerika Kultúrfaj Kultúrfaj Mérsékelt öv Amerika Argentina Kultúrfaj Mérsékelt öv Mérsékelt öv Mérsékelt öv Amerika Amerika Amerika Eurázsia Eurázsia, Afrika Mérsékelt öv Mérsékelt öv Kultúrfaj É.mérsékelt öv Mérsékelt öv D-Amerika Franciaország Amerika Amerika Mérsékelt öv Ázsia Mérsékelt öv Mérsékelt öv Mérsékelt öv Kultúrfaj Mérsékelt öv Kultúrfaj Mérsékelt öv

Megjegyzés: az ismertebb fajok magyar nevei: (1) = kétsoros-, sör-, tavaszi árpa, (2) = hatsoros árpa, (3) = szíki árpa, (4) = tengerparti árpa, (5) = egérárpa, (6) = vadárpa, (7) = négysoros árpa (négysosornak látszó hatsoros ld. a szövegben). 2. Táblázat. Hordeum nemzetség fontosabb fajhibridjei (Dunwell 1986, Clapham 1988, Jensen 1988,Gyulai és mtsi. 1997)

18


fajhibridek H.chilense x H.vulgare H.chilense x H.bulbosum H.compressum x H.pusillum H.jubatum x H.bulbosum H.jubatum x H.compressum H.lechleri x H.vulgare H.vulgare x H.bulbosum H.vulgare x H.jubatum

előállítók Thomas & Pickering Thomas & Pickering Schooler Wagenaar Rajháthy & Symko Starks & Tai Rajháthy &Symko Kasha & Kao Chen & Hayes Peckering Orton & Steidl

előállítás éve 1985 1985 1961 1959 1974 1974 1974 1970 1991 1989 1980

3. Táblázat. A Hordeum nemzetség fontosabb nemzetséghibridjei (Fedak 1986; Koblitz 1986, Gyulai és mtsi. 1997) Nemzetséghibridek Agropyron sericeum x H.Jubatum H.bogdani x Elymus canadensis H.bogdani x Sitation hystrix H.californicum x S.vavilovii H.chilense (2x) x S.africanum H.chilense x S.montanum H.chilense x S.vavilovii H.chilense x S.cereal H.cilense x T.aestivum H.depressum x S.cereale H.depressum (4x) x H.compressum (2x) H.distichum x S.cereale H.geniculatum x S.cereale H.geniculatum x S.ancestrale H.jubatum x S.cereale H.jubatum x S.kuprijanovii Hlechleri x S.cereale H.maritimum x S.cereale H.murinum x S.cereale H.nodosum x S.cereale Hparodii x S.anatolicum H.parodii x S.cereale H.pubiflorum x S.africanum H.vulgare x S.cereale H.vulgare x S.kuprijanovii H.vulgare x S.monatnum H.vulgare x S.vavilovii H.vulgare x T.aestivum

H.vulgare x Triticale H.vulgare x T.durum H.vulgare x T.timopheevi Hordeotriticum x S.cereale Triticum crassum x H.vulgare

Előállítók Steidl Dewey Dewey Gupta & Fedák Finch & Benett Finch & Benett Finch & Benett Thomas & Pickering Finch & Benett Anonymus Morrison & et al Scholler Copper és mtsi Clauss & Kunert Shummy és mtsi Shummy és mtsi Brink és mtsi Wagenaar Rajhathy és mtsi Shummy és mtsi Fedák & Armstrong Shummy és mtsi Shummy és mtsi Clauss & Kunert Gupta & Fedák Fedák & Armstrong Fedák & Armstrong Fedák Clauss & Kunert Clauss & Kunert Clauss & Kunert Fedák & Nakamura Clauss & Kunert Kruse Zhou és mtsi Pershina & Shummy Chu és mtsi Galiba Molnár-Láng és mtsi Clauss Mujeeb-Kazi Cauderon és mtsi Fedák & Armstrong Fedák & és mtsi Fedák & és mtsi Fedák & és mtsi

Előállítás éve 1977 1971 1971 1987 1980 1980 1980 1985 1980 1979 1959 1967 1978 1981 1981 1981 1944 1959 1964 1979 1981 1981 1981 1981 1987 1981 1981 1985 1981 1981 1981 1982 1981 1973 1979 1981 1984 1986 1991 1980 1978 1978 1980 1981 1981 1981

Megjegyzés: H = Hordeum, S = Secale, T = Triticum

19


(Saccharum )

cukornád

(Sorghum)

cirok

(Zea)

kukorica

(Tripsacum)

‘prérifű’

(Setaria)

Maydeae

Paniceae muhar

(Pennisetu m)

négerköles

Andropogoneae

Panicodae

Andropogonodae

IV: Panicoideae

III. Chloridoideae Chlorideae

(Eleusine)

aszályfű

Oryzeae

(Oryza)

Poaeae

(Lolium)

perje

(Festuca)

csenkesz

rizs

Poodae

7

14

14

24

18

18

18

18

20

20

40

7

7

7

6

9

9

9, 10

9

10

10

10

9

3.6 x 10 bp

9

0.8 x 10 bp

9

2.7 x 10 bp

-

-

-

-

9

0.4 x 10 bp

-

-

9

9

11 x 10 bp

9

16 x 10 bp

7

8 x 10 bp

7

9

42

42

x=

5 x 10 bp

(Avena)

zab

búza

Aveneae

Triticeae

(Secale)

árpa

rozs

14

14

Oryzodae

I. Pooideae Triticodae

Tribusz-csoport Tribusz Nemzetség 2n =

Genom-méret 9 (x 10 bp)

II. Pharoideae

Pázsitfűfélék (Poaceae)*

Alcsalád

Család

4. táblázat. Az árpa (Hordeum vulgare L.) rendszertani kapcsolatai a pázsitfüvek (Poaceae) növénycsaládban, alap (x) és diploid (2n) kromoszómaszáma, valamint genommérete (hossza DNS bázispárban, bp, mérve).

* az Bambusoideae (V.) alcsaládot, jelentősebb termesztett fajok hiányában, nem tüntettük fel (ld. 7. ábra).

21

5. táblázat. Az árpa (Hordeum) nemzetség és a rokon génuszok genomösszetétele, a domesztikáció (vad, domesztikált – dom.) különböző fokain (Waines és mtsi 1982, Gupta 1991, Gyulai és mtsi 1997) fajok

Hordeum bulbosum

diploid (2n = 2x = 14) vad dom.

tetraploid (2n = 4x = 28) vad dom.

hexaploid (2n = 6x = 42) vad dom.

BB

(gumós árpa)

Hordeum vulgare

HH

(árpa)

Secale cereale (rozs) Triticum. monococcum L L. var. boeticum Boiss. T. urartu Tum. T. monococcum L. var. monococcum T. turgidum var. dicoccon Schrank var. durum Desf. var. turgidum var. polonicum L. var. carthlicum Nevski T. timopheevii Zhuk. var. araraticum T. timopheevii Zhuk. var. timopheevi T. aestivum L. em. Thell. var. spelta L. var. macha Dek.& Men. var. vavilovi Jakubzn. var. aestivum var. compactum Host. var. sphaerococcum T. zhukovskyi Men.& Er. Avena sativa (zab)

RR AbAb AuAu AmAm AABB

AABB AAGG AAGG

AABBDD

AAAAGG AACCDD

21

22

6. táblázat. PCR-eljáráson alapuló molekuláris diagnosztikai módszerek (markerszelekció) az árpa (Hordeum vulgare L.) genomelemzésében PCR-alapú markerazonosítás - Egy-primeres módszerek random szekvenciájú primerek* o RAPD o DAF o AP-PCR ismétlődő szekvenciájú primerek o SSR o ISSR - Két-primere módszerek o ISJ o MS o R-PCR - Négyprimeres módszerek o Nested-PCR

Primer hossza

Ref.

10 nt 5 – 15 nt 18-32 nt

Williams et al. (1990) Caetano-A. et al. (1991) Welsh és McClelland (1990)

16 nt < 18 nt <

Gupta et al. (1995) Zietkiewicz et al. (1995)

10-20 18-21< 20 nt <

Weining és Langridge (1991) Akkaya et al. (1992) Puskás et al. (1994)

10-15 nt < 20-25 nt <

sokszerzős

* Rövidítések: AP-PCR – arbitrary primed polymerase chain reaction, tetszőleges bázissorrendű primerrel felszaporított DNS-polimeráz láncreakció. DAF – DNA amplification fingerprinting, DNSfelszaporításon alapúló genetikai-újjlenyomat. ISSR – inter simple sequence repeat, mikroszatelliták közötti szakaszok. ISJ – intron splice junction, intron-exon hatarszekvencia specifikus PCR. MS – microsatellite, mikroszatelltta. Nested – fészkelt, beágyazott PCR. RAPD – random amplified polymorphic DNA, tetszőleges bázissorrendű primerrel felszaporított DNS-mintázatbeli különbség. SSR – simple sequence repeat, egyszerű (mert rövid) belső szekvenciájú ismétlődések.

22

23

1. ábra Az ’ősrizsből’ leszármaztatható egyszikűek evolúciós kapcsolatai: RIZS belső piros genom-gyűrű, OLASZ-MUHAR – kék, CUKORNÁD - piros, CIROK – zöld, KUKORICA – lila, kettős genom-gyűrű, BÚZAFÉLÉK – világoskék, ZAB zöld (DEVOS, K. M.–GALE, M. D. 1997)

23

24 IRODALOM ABERG, E. 1940: The taxonomy and phylogeny of Hordeum L. sect. Cerealia ANDS. with special reference to Tibetan barleys. Symb. Bot. Upsalienses 4:1-150. AHLOOWALIA, B. S. 1987: Plant regeneration from embryo-callus culture in barley. Euphytica 36 p. 659–665. AHOKAS, H. 1998: Barley; in: BANGA, S. S.–BANGA, S. K. (eds): Hybrid cultivar development – Narosa New Delhi, India. p. 316–331. AKKAYA, M. S.–BHAGWAT, A. A.–CREGOAN, P. B. 1992: Length polymorphisms of simple sequence repeat in soybean. Genetics 132 p. 1131–1139. ASPEGREN, K.–MANNONEN, L.–RITALA, R. PUUPPONEN-P. R.–KURTÉN, U.–SALMENKALLIO-M, M.– KAUPPINEN, V.–TEERI, T.H. 1995: Secretion of a heat-stable fungal β-glucanase from transgenic, suspension-cultured barley cells. Mol. Breeding 1 p. 91–99. BACHTEYEV, F. KH. 1963: Origin and phylogeny of barley. In. Barley Genetics I. Proc. First Int Barley Genetics Symp. Wageningen. Broekhuizen S, Dantuma G, Lamberts H, Lange W (eds). p.1–18. BARABÁS, Z. 1959: An induced mutant in Triticum carthlicum with the diagnostic feature of T. vavilovii. Nature 183 p. 1349. BARABÁS, Z. 1962: Observation of sex differentiation in Sorghum by use of induced male-sterile mutants. Nature 195 p. 257–259. BARNABÁS, B.–PFAHLER, P. L.–KOVÁCS, G. 1991: Direct effect of colchicine on the microspore embryogenesis to produce dihaploid plants in wheat (Triticum aestivum L.). Theor. Appl. Genet. 81 p. 675–678. BELEA A 1986: Faj- és nemzetségkeresztezések a növényvilágban. Mezőg. Kiadó, Bp. BENDICH, A. J.–MCCARTHY, B. J. 1970: DNA comparisons among barley, oats, rye and wheat. Genetics 65 p. 545–565. BENNETT, M. D.–SMITH, J. B. 1976: Nuclear DNA amounts in angiosperms. Philos. Trans. R. Soc. London Biol. 274 p. 227–274. BEZANT, J.–LAURIE, D.–PRATCHETT, N.–CHOJECKI, J.–KEARSEY, M. 1996: Marker regression mapping of QTL controlling flowering time and plant height in a spring barley (Hordeum vulgare L.) cross. Heredity 77 p. 64–73. BONNER, J. 1937: Vitamin B1, a growth factor for higher plants. Science 85 p. 183–184. BOTSTEIN, D.–WHITE, R. L.–SKONIC, M.–DAVID, R. W. 1980: Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32 p. 314–331. BOWDEN, B. N. 1965: Modern grass taxonomy. In. Outlook on agriculture, Vol. IV, No 5. p. 243–253. BOYNTON, J. E.–GILLRAM, N. W.–HARRIS, E. H.–HOSLER, J. P.–JOHNSON, A. M.–JONES, A. R.– RANDOLPH-ANDERSON, B. L.–ROBERTSON, D.–KLEIN, T. M.–SHARK, K. B.–Sanford, J. C. 1988: Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science 240 p. 1534–1538. BREGITZER, P.–HALBERT, S. E.–LEMAUX, P. G. 1998: Somaclonal variation in he progeny of transgenic barley. Theor. Appl. Genet. 96 p. 421–425. BRIGGS, D. E. 1978: Barley. Chapman and Hall, London BRIGHT, S. W. J.–KUEH, J. S. H.–ROQUES, S. E. 1983: Lysine transport in two barley mutants with altered uptake of basic amino acids in the root. Plant Physiol. 72 p. 821–824. BRINK, R. A.–COOPER, D. C. 1944: The antipodals in relation to abnormal endosperm behavior in Hordeum jubatum × Secale cereale hybrid seeds. Genetics 29 p. 391–406. BROWN, H. T.–MORRIS, G. H. 1890: Research on the germination of some of the Gramineae. J. Chem. Soc. 57 p. 458–528. BROWN, H. T. 1906: On the culture of the excised embryos of barley on nutrient solutions containing nitrogen in different forms. Transactions Guiness Research Laboratory 1 p. 288–299. CAETANO-ANOLLES, G.–BASSAM, G. J.–GRESSHOFF, P. M. 1991: High resolution DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primer. Biotechnology 9 p. 553–556.

24

25 CARLSON, A. R.–LETARTE, J.–CHEN, J.–KASHA, K. J. 2001: Visual screening of microspore-derived transgenic barley (Hordeum vulgare L.) with green-fluorescent protein. Plant Cell Rep. 20 p. 331–337. CASTILLO, A. M.–CISTUÉ, L. 1993: Production of gynogenic haploids of Hordeum vulgare L. Plant Cell Rep. 12 p. 139–143. CATTIVELLI, L.–BARTELS, D. 1990: Molecular cloning and characterization of cold-regulated genes in barley. Plant Physiol. 93 p. 1504–1510. CHEN, F.–HAYES, P. 1991: Effect of exogenous plant growth regulators on in vitro seed growth, embryo development and haploid production in a cross between H. vulgare (L.) and H. bulbosum (L.). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 26 p. 174–184. (ebben nincs hiba) CHENG, T. Y.–SMITH, H. H. 1975: Organogenesis from callus culture of Hordeum vulgare. Planta 123 p. 307–310. CHU, C. C.–SUN, C. S.–CHEN, X.–ZHANG, W. X.–DU, Z. H. 1984: Somatic embryogenesis and plant regeneration in callus from inflorescences of Hordeum vulgare × Triticum aestivum hybrids. Theor. Appl. Genet. 68 p. 375–379. CHILTON, M. D.–DRUMMOND, M. H.–MERLO, D. J.–SCIAKY, D.–MONTAYA, A. L.–GORDON, M. P.– NESTER, E. W. 1977: Stable incorporation of plazmid DNA into higher plant cells. The molecular basis of crown gall tumors. Cell 11 p. 263–271. CLAUSS, E 1980: Trigeneric hybrids between barley, wheat and rice. Cereal Res. Commun. 8: 142– 155. CLAPHAM, D. H. 1988: Haploid induction in cereals; in: REINERT, J.–BAJAJ, Y. P. S. (eds): Plant cell, tissue and organ culture. Narosa Publ. House, New Delhi–Madras–Bombay. p. 279–298. COLLINS, N.–DRAKE, J.–AYLIFFE, M.–SUN, Q.–ELLIS, J.–HULBERT, S.–PRYOR, T. 1999: Molecular characterization of the maize Rp1-D rust resistance haplotype and its mutants. Plant Cell 11 p. 1365–1376. (ebben nincs hiba) COSTA, J. M.–COREY, A.–HAYES, P. M.–JOBET, C.–KLEINHOFS, A.–KOPISCH-OBUSCH, A.–KRAMER, S. F.–KUDRNA, D.–LI, M.–RIERA-LIZARAZU, O.–SATO, K.–SZUCS, P.–TOOJINDA, T.–VALES, M. I.–WOLFE, R. I. 2001: Molecular mapping of the Oregon Wolfe Barleys: phenotypically polymorphic doubled-haploid population. Theor. Appl. Genet. 103 p. 415–424. COURTAIL, B.–FENEBACH, F.–EBERHARDT, S.–RHOMER, L.–CHIAPELLO, H.–CARILLERI, C.–LUCAS, H. 2001: Tnt-1 transposition events are induced by in vitro transformation of Arabidopsis thaliana and transposed copies integrated into genes. Mol. Gen. Genomics 265 p. 32–42. (ebben nincs hiba) CROSSWAY, A.–OAKES, J. V.–IRVINE, J. M.–WARD, B.–KNAUF, V. C.–SHEWMAKER, C. K. 1985: Integration of forrign DNA following microinjection of tobacco mesophyll protoplasts. Mol. Gen. Genet. 202 p. 179–185. CUMMINGS, M. P.–CLEGG, M. T. 1998: Nucleotide sequence diversity at the alcohol dehydrogenase 1 locus in wild barley (Hordeum spontaneum ssp. spontaneum): an evaluation of the background selection hypothesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 p. 5637–5642. DARLINGTON, C. D.–WYLIE, A. P. 1961: Chromosome atlas of flowering plants. George Allen & Unwin Ltd, London DARWIN, Ch. 1896: The power of movement in plants. D. Appleton, New York DAWKINS, R 1986: Az önző gén. Gondolat K. Budapest DAY, A.– ELLIS, T. H. N. 1984: Chloroplast DNA deletions associated with wheat plants regenerated from pollen: possible basis for maternal inheritance of chloroplasts. Cell 39 p. 359–368. DE LA PENA, A.–LÖRZ, H.–SCHELL, J. 1987: Transgenic rye plants obtained by injecting DNA into young floral tillers. Nature 325 p. 274–276. DEMEKE, T.–HUCL, P.–BAGA, M.–CASWELL, K.–LEUNG, N.–CHIBAR, R. 1999: Transgene inheritance and silencing in hexaploid spring wheat. Theor. Appl. Genet. 99 p. 947–953. DEVAUX, D. P. 1992: Haploidy in barley and wheat improvement; in: DATTEE, Y.–DUMAS, C.– GALLAIS, A. (eds.): Reproductive biology and plant breeding. Springer, Berlin. p. 139–151. DEVOS, K. M.–GALE, M. D. 1997: Comparative genetics in the grasses. Plant Mol. Biol. 35 p. 3–15. DEWEY, D. R. 1971: Synthetic hybrids of Hordeum bogdanii with Elymus canadensis and Sitation hystrix. Amer. J. Bot. 58 p. 902–908.

25

26 DUDITS, D.–KAO, K. N.–CONSTABEL, F.–GAMBORG, O. L. 1976: Fusion of carrot and barley protoplasts and division of heterocaryocytes. Can. J. Genet. Cytol. 18 p. 263–269. DUDITS D.– HESZKY L. 2000: Növényi biotechnológia és géntechnológia. Agroinform Kiadó, Bp. DUNWELL, J. M. 1986: Barley; in: EVANS, D. A.–SHARP, W. R.–AMMIRATO, P. V. (eds.): Handbook of plant cell culture. Vol. 4. Macmillan Publ. Corp., New York–London. p. 339–369. EREKY, L. 1919: Biotechnologie der Fleisch-, Fett-, und Milcherzeugung im landwirtschaftlichen Grossbetriebe. Verlag Paul Parey, Berlin EVANS, L. T. 1996: Crop evolution, adaptation and yield. Cambridge Univ. Press, Cambridge EWEN, S. W. B.–PUSZTAI, A. 1999: Effects of diets containing genetically modified potatoes containing Galanthus nivalis lectin on rat small intestines. The Lancet 354 No. 9187. FEDAK, G. 1985: Cytogenetics of a hybrid and amphiploid between Hordeum pubiflorum and Secale africanum. Can. J. Genet. Cytol. 27 p. 1–5. FEDAK, G. 1986: Hordecale (Hordeum vulgare L. × Secale cereale L.); in: BAJAJ, Y. P. S. (ed.): Biotechnology in agriculture and forestry 2. Crops I. Springer-Verlag, Berlin–Heidelberg– NewYork–Tokio. p. 544–555. FEDAK, G.–ARMSTRONG, K. C. 1981: Hybrids of Hordeum parodii and lechleri with Secale cereale. Barley Genetics IV. Proc. 4th Int. Barley Genet. Symp., Edinburgh. p. 740–745. FEDAK, G.–NAKAMURA, C. 1982: Chromosome instability in a hybrid between Hordeum vulgare and Secale vavilovii. Can. J. Genet. Cytol. 24 p. 207–212. FINCH, R. A.–BENNETT, M. D. 1980: Mitotic and meiotic chromosome behavior in new hybrids of Hordeum with Triticum and Secale. Heredity 41 p. 201–209. FOROUGHI-WEHR, B.–FRIEDT, W. 1984: Rapid production of recombinant barley yellow mosaic virus resistant Hordeum vulgare lines by anther culture. Theor. Appl. Genet. 67 p. 377–382. (ebben nincs hiba) GALIBA, G.–MOLNÁR-LÁNG, M.–SUTKA, J. 1986: In vitro multiplication of barley (Hordeum vulgare L.) × wheat (Triticum aestivum) hybrid. Növénytermelés 35 p. 481–485. GAUTHERET, R. J. 1985: History of plant tissue and cell culture: a personal account; in: VASIL, I. K. (ed.): Cell culture and somatic cell genetics of plant. Vol. 1. Academic Press, Orlando. p. 1– 59. GRAY, D.–PUROHIT, A. 1991: Somatic embryogenesis and development of synthetic seed technology. Ctritical Rev. Plant Sci. 10 p. 33–61. GUADAGNUOLO, R.–SAVOVA-BIANCHI, D.–KELLER-SENFTEN, J.–FELBER, F. 2001: Search for evidence of introgression of wheat (Triticum aestivum L.) traits into sea barley (Hordeum marinum s. str. HUDS.) and bearded wheatgrass (Elymus caninus L.) in central and northern Europe, using isozymes, RAPD and microsatellite markers. Theor. Appl. Genet. 103 p. 191– 196. GUHA, S.–MAHESHWARI, S. C. 1964: In vitro production of embryos from anthers of Datura. Nature 204 p. 497. GUPTA, P. K.–FEDAK, G. 1985: Meiosis in seven intergeneric hybrids between Hordeum and Secale. Z. Pflanzenzüchtg. 95 p. 262–273. GUPTA, M.–CHYI, Y. S.–Romero-S, J.–OWEN, J. L. 1994: Amplification of DNA markers from evolutionarily diverse genomes using single primers of simple sequence repeats. Theor. Appl. Genet. 89 p. 998–1006. GYULAI, G.–JANOVSZKY, J.–KISS, E.–LELIK, L.–CSILLAG, A.–HESZKY, L. E. 1992: Callus initiation and plant regeneration from inflorescence primordia of the intergeneric hybrid Agropyron repens (L.) BEAUV. × Bromus inermis LEYSS. cv. nanus on a modified nutritive medium. Plant Cell Rep. 11 p. 266–269. GYULAI, G.–MURENYETZ, L.–JANOVSZKY, J.–TÁRCZI, M.–RÁCZ, I. 1995a: Initiation of monocot plant development in vitro for studying plant-microbe interaction; In: FENDRIK, I. – del Gallo, M. – Vanderleyden, J. de Zamotozy, M (eds) (eds.): Azospirillum VI. and related microorganisms. NATO ASI Series, VolG: Ecol. Sci., Vol. 37. Springer-Verlag, Berlin– Heidelberg. p. 155–159. GYULAI, G.–JEKKEL, Zs.–KISS, E.–KISS, J.–HESZKY, L.E. 1995b: A selective auxin and cytokinin bioassay based on root and shoot formation in vitro. J. Plant Physiol. 145 p. 379–382.

26

27 GYULAI, G.–DWEIKAT, I.–JANOVSZKY, J.–OHM, H.–KISS, E.–SHARMA, H.–HESZKY, L. E. 1997: Application of ISSR/SSR-PCR for genome analysis of Agropyron, Bromus, and Agropyron × Bromus; in: STASZEWSKI, Z.–MLYNIEC, W.–OSINSKI, R. (eds.): Ecological aspects of breeding fodder crops and amenity grasses. PBAI, Radzikow, Poland. p. 306–312. GYULAI, G.–GÉMESné, J. A.–SÁGI, ZS.–ZATYKÓ, L.–HESZKY, L. E.–VENCZEL, G. 1999: PCR analysis of F1 hybrid derived DH pepper lines. Capsicum and Eggplant Newsletters 18 p. 40– 43. GYULAI, G.–GÉMESné, J. A.–SÁGI, ZS.–VENCZEL, G.–PINTÉR, P.–KRISTÓF, Z.–TÖRJÉK, O.–HESZKY, L.E.–BOTTKA, S.–KISS, J.–Zatykó, L. 2000: Doubled haploid development and PCR-analysis of F1 hybrid derived DH-R2 paprika (Capsicum annuum L.) lines. J. Plant Physiol. 156 p. 168– 174. HABERLANDT, G 1902: Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. K. Preuss. Akad. Wiss. (Berlin) 16 p. 318–345. HABERLANDT, G. 1902: Zur Physiologie der Zellteilung. 3. Mitteilung: Über Zellteilung nach Plasmolyse. Sitzungsber. K. Preuss. Akad. Wiss. (Berlin) 20 p. 322–348. HARLAN, J. R. 1976: Barley; in: SIMMONDS, N. W. (ed.): Evolution of crop plants. Longman, London. p. 93–98. HERNÁNDEZ, P.–BARCELÓ, P.–MARTIN, A.–CABRERA, A. 2001: The effect of Hordeum chilense and Triticum cytoplasms on anther culture response of tritordeum. Plant Cell Rep. 20 p. 542–546. HAYES, P. M.–CHEN, F. 1989: Genotypic variation for Hordeum bulbosum-mediated haploid production in winter and facultative barley. Crop Sci. 29 p. 1184–1188. HESZKY, L. E. 1972: A new artificial hybrid of species from the genera Festuca and Lolium (Festuca pratensis HUDS. × Lolium temulentum L.). Acta Agron. Hung. 21 p. 363–368. HO, M. W.–RYAN, A.–CUMMINS, J. 1999: Cauliflower mosaic viral promoter – recipe for disaster? Microbial Ecol. Health Dis. 11 p. 194–197. HORVATH, H. – JENSEN, L. –WONG, O. – KOHL, E. –ULLRICH, S.– COCHRAN, J.–KANNANGARA, C.– WETTSTEIN, D. 2001: Stability of transgene expression, field performance and recombination breeding of transformed barley. Theor. Appl. Genet. 102 p. 1–11. JACOBSEN, N.–VON BOTHMER, R. 1992: Supraspecific groups in the genus Hordeum. Hereditas 116 p. 21–24. JÄHNE, A.–LAZZERI, P. A.–LÖRZ, H. 1991: Regeneration of fertile plants from protoplasts derived from embryogenic cell suspensions of barley (Hordeum vulgare L.) Plant Cell Rep. 10 p. 1–6. JENSEN, C. J. 1988: Monoploid production by chromosome elimination; in: REINERT, J.–BAJAJ, Y. P. S. (eds.): Plant cell tissue and organ culture. Narosa Publ. House, New Delhi–Madras– Bombay. p. 299–330. JOHNSTON, S. A.–ANZIANO, P. Q.–SHARK, K.–SANFORD, J. C.–BUTOW, R. A. 1988: Mitochondrial transformation in yeast by bombardment with microprojectiles. Science 240 p. 1538–1541. JORGENSEN, R. B.–JENSEN, C. J.–ANDERSEN, B.–BOTHMER, R. V. 1986: High capacity of plant regeneration from callus of interspecific hybrids with cultivated barley (Hordeum vulgare L.). Plant Cell Tiss. Org. Cult. 6 p. 199–207. KAISER, R.–FRIEDT, W. 1989: Chromosomal location of resistance to barley yellow mosaic virus in German winter-barley identified by trisomic analysis. Theor. Appl. Genet. 77 p. 241–245. (ebben nincs hiba) KALENDAR, R.–TANSKNEN, J.–IMMONEN, S.–NEVO, E.–SCHULMAN, A. H. 2000: Genome evolution of wild barley (Hordeum spontaneum) by BARE-1 retrotransposon dynamic in response to sharp microclimatic divergenece. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 p. 6603–6607. KAO, K. N.–MICHAYLUK, M. R. 1974: A method for high-frequency intergeneric fusion of plant protoplasts. Planta 115 p. 355–367. KASHA, K. J.–KAO, K. N. 1970: High frequency haploid production in barley (Hordeum vulgare L.). Nature 225 p. 874–876. KILIAN, A.–KUDRNA, D.–KLEINHOFS, A. 1999: Genetic and molecular characterization of barley chromosome telomeres. Genome 42 p. 412–419. KIMBER, G.–FELDMAN, M. 1987: Wild wheat. An introduction. Spec. Rep. Coll. Agric. Univ., Missoury, Columbia, USA

27

28 KISS A 1955: Búza-rozs hibridek és az 1. sz. Triticale genetikai vizsgálata. MTA Agrártud. Oszt. Közl. 6 p. 85–119. KISS, A.–RÉDEI, GY. 1953: Experiments to produce rye-wheat Triticale. Acta Agronomica Hung. 3 p. 257–276. KJAER, B.–HAAHR, V.–JENSEN, J. 1991: Association between 23 quantitative traits and 10 genetic markers in a barley cross. Plant Breed. 106 p. 261–274. KLEIN, T. M.–WOLF, E. D.–WU, R.–STANFORD, J. C. 1987: High velocity microprojectiles for delivering nucleic acids into living cells. Nature 327 p. 70–73. KOBLITZ, H. 1986: Barley (Hordeum vulgare L.): establishment of cultures and the regeneration of plants; in: BAJAJ, Y. P. S. (ed.): Biotechnology in agriculture and forestry 2. Crops I. Springer-Verlag, Berlin–Heidelberg–New York–Tokyo. p. 181–203. KOCH, C. 1848: Beiträge zu einer Flora des Orientes. Linnaea 21 p. 710. KOMATSUDA, T.–TAGUCHI-SHIOBARA, F.–OKA, S.–TAKAIWA, F.–ANNAKA, T.–JACOBSEN, H. J. 1995: Transfer and mapping of the shoot differentiation locus Shd1 in barley chromosome 2. Genome 38 p. 1009–1014. KOTTE, W. 1922: Kulturversuche mit isolierten Wurzelspitzen. Beitr. Allg. Bot. 2 p. 413–434. KRUSE, A. 1973: Hordeum × Triticum hybrids. Hereditas 73 p. 157–161. KRUSE, A. 1974: Hordeum × Agropyron hybrids. Hereditas 78 p. 291–294. LAPITAN, N. L. V.–SEARS, R. G.–GILL, B. S. 1984: Translocations and other karyotypic structural changes in wheat × rye hybrids regenerated from tissue culture. Theor. Appl. Genet. 68 p. 547–554. LA RUE, C. D. 1949: Cultures on the endosperm of maize. Amer. J. Bot. 34 p. 585–586. LEE, B.–MURDOCH, K.–TOPPING, J.–KREIS, M.–JONES, M. G. K. 1989: Transient gene expression in aleurone protoplast isolated from developing caryopses of barley and wheat. Plant Mol. Biol. 13 p. 21–29. LINNÉ, C. 1735, 1758: Systema Naturae, Leiden (1. és 10. kiadás) LINNÉ, C. 1753: Species Plantarum. Laurentii Salvii Holmiae, Stockholm LIU, Z. W.–BIYASHEV, R. M.–SAGHAI MAROOF, M. A. 1996: Development of simple sequence repeat DNA markers and their integration into a barley linkage map. Theor. Appl. Genet. 93 p. 869– 876. LÖRZ, H.–BAKER, B.–SCHELL, J. 1985: Gene transfer to cereal cells mediated by protoplast transformation. Mol. Gen. Genet. 199 p. 178–182. LÜHRS, R.–LÖRZ, H. 1988: (: a második kettős pontot vedd ki) Initiation of morphogenic cellsuspension and protoplast cultures of barley. Planta 175 p. 71–81. MALIGA, P.–SZ. BREZNOVITS, A.–MÁRTON, L.–JOÓ, F. 1975: Non mendelian streptomycin-resistant tobacco mutant with altered chloroplast and mitochondria. Nature 225 p. 401–402. MALONE, R. P.–DIX, P. J. 1986: Selection for herbicide resistance in tissue cultures of Fragaria and Nicotiana; in: WITHERS, L. A.–ANDERSON, P. G. (eds.): Plant tissue culture and its agricultural applications. Butterworths, London. p. 479–486. MANNINEN, O. M. 2000: Association between anther-culture response and molecular markers on chromosome 2H, 3H and 4H of barley (Hordeum vulgare L.). Theor. Appl. Genet. 100 p. 57– 62. MARKERT, C. L.–MOLLER, F. 1959: Multimeric forms of enzymes: tissue, ontogenic, and species specific patterns. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 45 p. 753–763. MARTIN, A. 1983: Cytology and morphology of the hybrid Hordeum chilense × Aegilops squarrosa. J. Hered. 74 p. 487. MÁRTON, L.–WULLEMS, G. J.–MOLENDIJK, L.–SCHILPEROORT, R. A. 1979: In vitro transformation of cultured cells from Nicotiana tabacum by Agrobacterium tumefaciens. Nature 227 p. 129– 131. MEDGYESI, P.–FEJES, E.–MALIGA, P. 1985: Interspecific chloroplast recombination in a Nicotiana somatic hybrid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 p. 6960–6964. MENDEL, R. R.–MÜLLER, B.–SCHULZE, J.–KOLESNIKOV, V.–ZELENIN, A. 1989: Delivery of foreign genes to intact barley cells by high-velocity microprojectiles. Theor. Appl. Genet. 78 p. 31–34. MESSELSON, M.–YUAN, R. 1968: DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217 p. 1110–1114.

28

29 MOORE, G.–DEVOS, K. M.–WANG, Z.–GALE, M. D. 1995: Cereal genome evolution: grasses line up and form a circle. Curr. Biol. 5 p. 737–739. MORDHORST, A. P.–LÖRZ, H. 1992: Electrostimulated regeneration of plantlets from protoplasts derived from cell suspensions of barley (Hordeum vulgare). Physiol. Plant. 85 p. 289–294. MULLIS, K. B.–FALOONA, F. A. 1987: Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155 p. 335–350. MUNCK, L. 1992: The case of high-lysine barley breeding; in: SHEWRY, P. R. (ed.): Barley genetics, biochemistry, molecular biology and biotechnology. Biotechnology in agriculture series No. 5. CAB Intl. Publishing, Oxford. p. 573–601. MÜLLER, K. J.–ROMANO, N.–GERSTNER, O.–GARCIA-MAROTO, F.–POZZI, C.–SALAMINI, F.–ROHDE, W. 1995: The barley Hooded mutation caused by a duplication in a homeobox gene intron. Nature 374 p. 727–730. (ebben nincs hiba) NEUHAUS, G.–SPANGENBERG, G.–MITTELSTEN, S. O.–SCHWEIGER, H. G. 1988: Transgenic rapeseed plants obtained by the microinjection of DNA into microspore-derived embryoids. Theor. Appl. Genet. 75 p. 30–36. NEWMANN, E.–ROSENBECK, K. 1972: Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membr. Biol. 10 p. 279–290. NORSTOG, K. 1956: The growth of barley embryos on coconut milk media. Bull. Torrey Bot. Club. 88 p. 27–29. NORSTOG, K. 1965: Development of cultured barley embryos L. Growth of 0.1–0.4 embryos. Amer. J. Bot. 53 p. 613–614. (ebben nincs hiba) OLSON, M.–HOOD, L.–CANTOR, C.–DOTSTEIN, D. 1989: A common language for physical mapping of the human genome. Science 254 p. 1434–1435. ORTON, T. J.–STEIDL, R. P. 1980: Cytogenetic analysis of plants regenerated from colchicine treated callus cultures of an interspecific Hordeum hybrid. Theor. Appl. Genet. 57 p. 89–95. PAÁL, A 1918: Über phototropische Reizleitung. Jahbr. Wiss. Botanik, Leipzig 58 p. 406–458. PADILLA, J. A.–MARTIN, A. 1983: Morphology and cytology of Hordeum chilense × H. bulbosum hybrids. Theor. Appl. Genet. 65 p. 353–355. PALEVITZ, B. 2000: DNA surprise: Monsanto discovers extra sequence in its Roundup Ready soybeans. The Scientist 14 (July 24) p. 20. (ebben nincs hiba, furcsa, de így idézik ezt a lapot) PAUK J.–KERTÉSZ Z.–BARABÁS Z. 1999: Búzatörzsek előállítása portoktenyészetből és szerepük teljesítménykísérletekben. Növénytermelés 37 p. 197–203. PICKERING, R. A. 1989: Plant regeneration and variants from calli derived from immature embryos of diploid barley (Hordeum vulgare L.) and H. vulgare × H. bulbosum L. crosses. Theor. Appl. Genet. 78 p. 105–112. PICKERING, R. A. 1991: Production of a trisomic series in Hordeum vulgare cv. ‘Golden Promise’ and its use in locating a recessive Chlorina gene. Plant Breed. 106 p. 342–344. PICKERING, R.–DEVAUX, P. 1992: Haploid production: approaches and uses in plant breeding; in: SHEWRY, P. R. (ed.): Barley: genetics, biochemistry, molecular biology, and biotechnology. CAB Intl., Wallingford, UK. p. 519–548. PUSKÁS, L. G.–FARTMAN, B.–BOTTKA, S. 1994: Restricted PCR: amplification of an individual sequence flanked by a highly repetitive element from total human DNA. Nucleic Acids Res. 22 p. 3251–3252. QIQUAN, S.–HARVEY, B.–ROSSNAGLE, B.–JANA, S.–ANSHENG, L. 1991: New monoecious form of barley. Genetic Manipulation Plants 7 p. 95–100. QI, X.–STAM, P.–LINDHOUT, P. 1996: Comparison and integration of four barley genetic maps. Genome 39 p. 379–394. QUINCKE, F. L. 1940: Interspecific and intergeneric crosses with Hordeum. Can. J. Res. 18 p. 372– 373. RAJHATHY, T.–MORRISON, J. W. 1959: Cytogenetic studies in the genus Hordeum. IV. Hybrids of H. jubatum, H. brachyanterum, H. vulgare and a hexaploid Hordeum sp. Can. J. Genet. Cytol. 1 p. 124–132.

29

30 RAJHATHY, T.–SYMKO, S. 1974: High frequency of haploids from crosses of Hordeum lechleri (6x) × Hordeum vulgare (2x) and H. jubatum (4x) × H. bulbosum (2x). Can. J. Genet. Cytol. 16 p. 468–472. REILLY, M. L. 1985: Functional aspects of cereal structure; in: GALLAGHER, E. J. (ed.): Cereal production. Butterworths, London. p. 137–158. ROBBINS, W. J. 1922: Effect of autolysed yeast and peptone on growth of excised corn root tips in the dark. Bot. Gaz. (Chicago) 74 p. 59–79. SAALBACH, G.–KOBLITZ, H. 1978: Attempts to initiate callus formation from barley leaves. Plant Sci. Lett. 13 p. 165–169. SAGHAI MAROOF, M. A.–YANG, G. P.–BIYASHEV, R. M.–MAUGHAN, P. J.–ZHANG, Q. 1996: Analysis of the barley and rice genomes by comparative RFLP linkage mapping. Theor. Appl. Genet. 92 p. 541–551. SCHOOLER, A. B. 1961: Wild barley hybrids I. Hordeum compressum × Hordeum pusillum. J. Hered. 51 p. 179–181. SCHÖNFELD, M.–RAGNI, A.–FISCHBECK, G.–JAHOOR, A. 1996: RFLP mapping of three new loci for resistance to powdery mildew (Erysiphe graminis f. sp. hordei) in barley. Theor. Appl. Genet. 93 p. 48–56. SHARMA, H.–FRANCKI, M.–CRASTA, O.–GYULAI, G.–BUCHOLTZ, D.–OHM, H.–ANDERSON, J.– PERRY, K.–PATTERSON, F. 1999: Cytological and molecular characterization of wheat lines with Thinopyrum intemedium chromosome additions, substitutions and translocations resistant to Barley Yellow Dwarf Virus. Cytologia 64 p. 93–100. (ebben nincs hiba) SHERMAN, J. D.–FENWICK, A. L.–NAMUTH, D. M.–LAPITAN, N. L. V. 1995: Barley RFLP map: alignment of three barley maps and comparisons to Gramineae species. Theor. Appl. Genet. 91 p. 681–690. SKOOG, F.–MILLER, C. O. 1956: Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp. Soc. Exptl. Biol. 11 p. 118–131. SMITH, J. M.-SZATHMÁRY, E. 1997: Az evolúció nagy lépései. Scientia Kiadó, Budapest. pp.1-396. STARKS, G. D.–TAI, W. 1974: Genome analysis of Hordeum jubatum and H. compressum. Can. J. Genet. Cytol. 16 p. 663–668. STAUDT, G 1961: The origin of cultivated barleys: a discussion. Economic Botany 15 p. 205-212. STEFFENSON, B. J.–HAYES, P. M.–KLEINHOFS, A. 1996: Genetics of seedling and adult plant resistance to net blotch (Pyrenophora teres f. teres) and spot blotch (Cochliobolus sativus) in barley. Theor. Appl. Genet. 92 p. 552–558. SUGAR, I. P.–NEUMANN, E. 1984: Stochastic model for electric field-induced membrane pores. Biophys. Chem. 19 p. 211–225. SVAB, Z.–HAJDUKIEWICZ, P.–MALIGA, P. 1990: Stable transformation of plastids in higher plants. Proc. Natl. Acad. Sci.USA 87 p. 8526–8530. TARCHINI, R.–BIDDLE, P.–WINELAND, R.–TINGEY, S. RAFALSKI, A. 2000: The complete sequence of 340 kb of DNA around the rice Adh1-Adh2 region reveals interrupted colinearity with maize chromosome 4. Plant Cell 12 p. 381–391. TAKAHASHI, R. 1955: The origin and evolution of cultivated barley. Adv. Genet. 7 p. 227–266. THOMAS, H. M.–PICKERING, R. A. 1985: Comparisons of the hybrids Hordeum chilense × H. vulgare, H. chilense × Secale cereale and the amphidiploid of H. chilense × H. vulgare. Theor. Appl. Genet. 69 p. 519–522. THOMAS, C. A. 1971: The genetic organization of chromosomes. Annu. Rev. Genet. 5 p. 237–256. (az Annual-t így roviditik) THOMSON, W. P.–JOHNSTON, D. 1945: The cause of incompatibility between barley and rye. Can. J. Res. 23 p. 1–15. TRIONE, E. J.–STOCKWELL, V. O. 1989: Development of detached wheat spikelets in culture. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 17 p. 161–170. VOS, P.–HOGERS, R.–BLEEKER, M.–REIJANS, M.–LEE, T.–HORNES, M.–FRIJTERS, A.–POT, J.– PELEMAN, J.–KUIPER, M.–ZABEAU, M. 1995: AFLP: a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 21 p. 4407–4414.

30

31 ZIETKIEWICZ, E.–RAFALSKI, A.–LABUDA, D. 1984: Genome fingerprinting by simple sequence repeat (SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification. Genomics 20 p. 176–183. ZHU, H.–BRICENO, G.–DOVEL, R.–HAYES, P. M.–LIU, B. H.–LIU, C. T.–ULLRICH, S. E. 1999: Molecular breeding for grain yield in barley: an evaluation of QTL effects in a spring barley cross. Theor. Appl. Genet. 98 p. 772–779. VICIENT, C. M.–SUONIEMI, A.–Anamthawat-J, K - –TANSKANEN, J.–BEHARAV, A.–NEVO, E.– SCHULMAN, A.H. 1999: Retrotransposon BARE-1 and its role in genome evolution in the genus Hordeum. Plant Cell 11 p. 1769–1784. VICIENT, C. M.–JAASKELAINEN, M. J.–KALENDAR, R.–SCHULMAN, A. J. 2001: Active retrotransposons are a common feature of grass genomes. Plant Physiol. 125 p. 1283–1292. WAGENAAR, E. B. 1959: Intergeneric hybrids between Hordeum jubatum L. and Secale cereale L. J. Hered. 50 p. 195–202. WANG, M.–GRAHAM, M.–BRETTELL, R.–JACOBSEN, J.–RAMM, K.–UPADHYAYA, N.–WATERHOUSE, P. 1998: Transformation of an elite barley cultivar with barley yellow dwarf virus (BYDV) resistance genes; in: LARKIN, P. J. (ed.): Proc. 4th Asia Pacific Conference on Agricultural Biotechnology. Australia. p. 18–20. WEINING, S.–LANGRIDGE, P. 1991: Identification and mapping of polymorphisms in cereals based on the polymerase chain reaction. Theor. Appl. Genet. 82 p. 209–216. WELSH, J.–MCCLELLAND, M. 1990: Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers. Nucleic Acids Res. 18 p. 7213–7218. WENT, F. W. 1928: Wuchsstoff und Waschstum. Rec. Traw. Bot. Neerl. 25 p. 1–16. WESSLER, S. R. 1996: Turned on by stress. Plant retrotransposons. Curr. Biol. 6 p. 959–961. WHITE, P. R. 1937: Vitamin B1 in the nutrition of excised tomato roots. Plant Physiol. 12 p. 803–811. WIEBE, G. A. 1968: Introduction of barley into the new world; in: Barley: origin, botany, culture, winter hardiness, genetics, utilization, pests. Agriculture Handbook No. 338. USDA, Washington D.C. p. 2–8. (ebben nincs hiba) WILLIAMS, J. G. K.–KUBELIK, A. R.–RAFALSKI, K. J.–TINGEY, S. V. 1990: DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18 p. 6531– 6535. YIN, X.–STAM, P.–DOURLEIJN, C. J.–KROPFF, M. J. 1999: AFLP mapping of quantitative trait loci for yield-determning physiological characters in spring barley. Theor. Appl. Genet. 99 p. 244– 253. YON, Q. S.–ZHANG, X. Q.–SHI, B. J.–LI, J. M. 1991: Green plant regeneration from protoplast of barley (Hordeum vulgare L.). Chinese Sci. Bull. 36 p. 923–935. YU, Y.–TOMKINS, J. P.–WAUGH, R.–FRISCH, D. A.–KUDRNA, D.–KLEINHOFS, A.–BRUEGGEMAN, R. S.–MUEHLBAUER, G. J.–WISE, R. P.–WING, R. A. 2000: A bacterial artificial chromosome library for barley (Hordeum vulgare L.) and the identification of clones containing putative resistance genes. Theor. Appl. Genet. 101 p. 1093–1099.

31

Az árpa (Hordeum vulgare L.) biotechnológiája

Recommend Documents