1.
ÚVOD Ječmen je druhou nejpěstovanější obilovinou v České republice a čtvrtou
ve světě. Využití ječmene je velmi široké. Začíná od potravinářství, přes průmysl (slad k výrobě piva) až po krmnou plodinu pro hospodářská zvířata. Spolu s vývojem rostlin se objevovaly i jejich choroby. Ječmen bývá napadán jak houbovými, virovými tak i bakteriálními chorobami. V zájmu člověka, co by pěstitele, bylo vždy sledování kvantity a kvality produkce. Po druhé světové válce došlo k rozšíření používaných pesticidů. U používání chemikálií, dle mého názoru, však negativa převažují nad pozitivy. Negativa spatřuji ve znečištění životního prostředí, ve vzniku nových, odolnějších ras patogena, ale také ve vyšších ekonomických nákladech na pesticidy. Pozitiva jsou v jednoduchosti aplikace. Předpoklad vypěstování kvalitní produkce je eliminace jak biotických tak abiotických činitelů poškozující zdraví rostlinné produkce. Z biotických činitelů jsou nejzávažnější skupinou patogenů houby vyvolávající onemocnění jako je např. padlí travní, na které je diplomová práce zaměřena, rzi, skvrnitosti, ale také patogeni způsobující virová onemocněn a bakteriální onemocnění. Ochrana proti chorobám a škůdcům je realizována především chemizací. Nejefektivnější a nejekologičtější způsob ochrany je však využívání genů rezistence. V rámci šlechtitelského procesu nových odrůd se stále více uplatňují nové postupy. Mezi nové a dynamicky se rozvíjející se metody můžeme zařadit techniky molekulární genetiky, tzv. mapování polymorfismu DNA. Tyto metody nachází stále větší uplatnění např. v ranné fázi šlechtitelského procesu na rezistenci jako tzv. MAS (Marker Assisted Selection) markery nebo při studiu genetického charakteru hostitelské rostliny a patogenního organismu včetně jejich interakce. Cílem diplomové práce je co nejvýstižněji objasnit problematiku molekulárních markerů rezistence ječmene a jejich případného praktického využití. Diplomová práce se opírá o základy mé bakalářské práce psané na téma: Molekulární markery rezistence ječmene na padlí travní. V diplomové práce jsou fakta aktualizována s doplněním o praktické výsledky aplikace molekulárních (DNA) markerů u vybraných registrovaných odrůd jarního ječmene na území České republiky. Tyto praktické výsledky byly získány na půdě Mendelovy zemědělské a lesnické univerzitě v Brně, fakulty Agronomické, pod hlavičkou Ústavu biologie rostlin.
9
2.
CÍLE PRÁCE
1.
Seznámení se s genetickou determinací rezistence ječmene vůči padlí travnímu.
2.
Praktická aplikace metod molekulární biologie u vybraných genotypů ječmene (izolace genomové DNA, detekce mikrosatelitních markerů).
3.
Vyhodnocení polymorfismu SSR markerů na 1H chromozomu ječmene (lokalizace Mla lokusu) u vybraných genotypů ječmene.
10
3.
LITERÁRNÍ PŘEHLED
3.1.
Ječmen setý (Hordeum vulgare)
3.1.1. Botanická charakteristika
Ječmen setý (Hordeum vulgare) se botanicky zařazuje do rodu ječmen (Hordeum L.), řádu lipnicokvěté (Poale) a čeledi lipnicovité (Poaceae) (CERKAL et al., 2005). Čeleď Poaceae je největší rodinou jednoděložných rostlin. Rod Hordeum zahrnuje 32 druhů a celkem 45 taxonů (BOTHMER et al., 1991). Celý rod ječmen se podle počtu chromozomů rozděluje do 3 skupin na diploidní (2n=14), tetraploidní (2n=28) a hexaploidní (2n=42). Všechny kulturní ječmene představují jeden kulturní druh a tím je diploidní ječmen setý (Hordeum vulgare). Tento druh se dále člení podle uspořádání klasu na convariety. Přehled convariet ječmene (ZIMOLKA et al., 2000): -
Hordeum vulgare convar. vulgare – ječmen setý víceřadý o
šestiřadý – všechny tři klásky plodné, šest podélných řad obilek stejnoměrně rozmístěno okolo klasového vřetene v podobě šesticípého přeslenu,
o
čtyřřadý – tři plodné klásky, řidší klas se šesti řadami obilek, prostřední velmi těsně přilehlá a tím opticky vytváří čtyři řady obilek.
-
-
Hordeum vulgare convar. intermedium – ječmen setý přechodný o
prostřední klásky plodné, postranní částečně nebo zcela neplodné,
o
u nás se nepěstuje.
Hordeum vulgare convar. distichon – ječmen setý dvouřadý o
jediný (střední) klásek je plodný a tím tvoří dvě řady obilek, postranní dva klásky jsou jalové (někdy tvoří prašníky), bezosinné, zakrnělá plucha a pluška,
o
variety:
nutans (nící) – klas při zrání háčkuje, osinatý, pluchatá obilka, nejdůležitější sladovnické odrůdy,
11
erectum (vzpřímený) – krátký, hustý klas, vzpřímený do plné zralosti,
zeocrithon (paví) – velmi hustý klas, na bázi široký, k vrcholu se zužující,
nudum (bezpluchý, nahý) – tvoří pluchy s nesrůstající obilkou.
3.1.2. Cytogenetika ječmene
Všechny druhy ječmenů mají 7 chromozómových párů (2n = 14). Chromozomy jsou relativně velké a snadno rozlišitelné (HRAŠKA et al., 1989). Velikost genomu ječmene je 4,9 x 109 bp/1C (ARUMUGANATHAN & EARLE, 1991), tedy menší než tradičně uváděná hodnota 5,3 x 109 bp/1C (BENNET & SMITH, 1976) (KLUMPLER, 2006).
3.1.3. Morfologie ječmene
Ječmen (obr. 1) má 5-8 zárodečných kořínků. Mezi vzcházejícími rostlinami se pozná podle barvy, která je zelená se šedavým nádechem, překříženými oušky a úzkým, krátkým jazýčkem (obr. 2). Květenstvím je lichoklas (obr. 3) jako u dalších příbuzných obilnin, např. pšenice, žito, výjimkou je oves, ten má latu. Plevy jsou úzké, bez kýlu. Pluchy se vyznačují červeným středovým nervem a plušky jsou srostlé k zrnu. Osina vyrůstá z pluchy. Plodem obilnin je obilka, která může být buď nahá nebo pluchatá. Jako nahou nazýváme tu, kde povrch obilky tvoří oplodí. Jako pluchatá je nazývána obilka s uzavřenou pluchou a pluškou. Ječmen nelze zařadit pouze do jedné z této skupiny, své postavení má u obou typů. Čárkovitý list je pro obilniny charakteristickým. List je tvořen z čepele a listové pochvy, objímající stéblo. Stonkem je stéblo, které je tvořeno internodii a nody, ze kterých vyrůstají listy (ZIMOLKA et al., 2000).
12
3.1.4. Agrotechnika
Ječmen je rozšířen od nížin až po horské oblasti. V oblastech s krátkým vegetačním obdobím je pěstován převážně jako jařina. Nejlépe snáší mírné klima na hlubších půdách s dobrým zásobením vodou. Dobrou zásobu vody vyžaduje z hlediska jeho kořeného systému (ZIMOLKA et al., 2000). Z obilnin má horší osvojovací schopnost živin a také nejhůře snáší kyselejší půdy. Značnou výhodou je jeho vyšší tolerance k předplodině. Rozhodujícími faktory, které vytvářejí předpoklady dobrých a kvalitních sklizní, jsou kromě vhodné odrůdy, časného setí a dobré agrotechniky, také vysoká půdní úrodnost a dobrá výživa rostlin (VANĚK et al., 2002).
3.1.5. Využití ječmene
Ječmen setý (Hordeum vulgare L.) patří mezi nejstarší obilniny vůbec. Starověké národy jej pěstovaly jako poživatinu, ale také k výrobě piva. Je doloženo, že ve Starém Egyptě faraónův dvůr spořádal denně 130 džbánů piva. Nejen ve Starém Egyptě, ale také u starých Řeků a Římanů hrál ječmen významnou roli. Ječná kaše byla využívána jako oběť bohům, ale také jako vydatná potrava. Ječné odvary měly blahodárné účinky na posilování při sportovních kláních v aréně a byly využívány též jako náhradní výživa u kojenců, rekonvalescentů a těžce nemocných (www.probio.cz). V současné době hraje velkou roli u základních potravin na Blízkém východě. V Evropě
a
USA
je
ječmen
využíván
zejména
na
výrobu
pivovarského
a lihovarnického sladu. Nejznámějším produktem z ječmene jsou ječné kroupy a krupky. Jsou jednou ze základních surovin pro tradiční českou zabijačku. Kvalita krup, které se používají převážně do polévek, je však rafinací snížena. Dochází ke značné ztrátě vitamínů a vlákniny. Z tohoto důvodu se na „scénu“ dostávají nahé ječmene, které ztrácejí vnější obalové vrstvy (pluchy) při sklizni a vrstvy oplodí s osemením jsou jemnější. Tyto nově získané kvality umožňují přímé kuchyňské využití i bez předešlého opracování. Z ječmene jsou dále známy ječné celozrnné vločky, lupínky, mouka (těstoviny, knedlíky, omáčky…). Ječmen není chlebovinou, obsahuje málo lepku, ale používá se na pečení plochých chlebů a placek (www.probio.cz).
13
Nejkvalitnější část produkce, cca 30% jarních ječmenů, je používáno k výrobě sladu. Víceřadé ozimé ječmeny se pěstují převážně ke krmným účelům. Na nutriční hodnotě ječmene se podílejí zejména sacharidy (cca 80%) a cukry (cca 10%). V ječmeni jsou přítomny i vitamíny a těmi jsou B a E. Z ječmene se dále připravuje náhražka kávy, která se nazývá melta (cs.wikipedia.org).
3.1.6. Nejzávažnější choroby ječmene setého
Choroby rostlin se vyvíjely a vyskytovaly společně s rostlinami. Od počátků pěstování rostlin byla snaha pěstitele vyprodukovat dostatečné množství produktu v dobré kvalitě. Dříve však bohužel nebyly vhodné podmínky pro zkoumání proč se ta daná choroba vyskytuje a jak se proti ní bránit. V následujícím
výčtu
chorob
jsou
vybrány
pouze
některé
choroby
se stručnými charakteristikami. Nejvíce obsáhlá charakteristika je u choroby padlí travní, na které je diplomová práce zaměřena. Choroby ječmene jsou rozděleny do kategorií – houbové, virové a bakteriální. Záměrně nebyli vybráni škůdci, jelikož se diplomová práce orientuje na choroby a ne na škůdce.
1.
houbové choroby a.
plíseň sněžná – Fusarium graminearum (obr. 4 a) Nebezpečná v oblastech s dlouhodobou sněhovou pokrývkou.
Po výsevu vyvolá odumření klíčních rostlin, hnědou suchou hnilobu kořenového systému a paty stébla,
na níž jsou protáhlé hnědé skvrny
(POKORNÝ, ústní sdělení). Choroba může způsobit zbělení jednotlivých klásků a tím jejich hluchost. Nebezpečná v oblastech s dlouhodobou sněhovou pokrývkou (PRIGGE et al., 2006).
b.
stéblolam – Pseudocercosporella herpotrichoides U ječmene je tato choroba méně nebezpečná než u pšenice – vyšší
schopnost bazálních pletiv ječmene lépe odolávat houbě tím, že delší dobu rostou a tloustnou (PRIGGE et al., 2006). Dochází k poškození stébla a jejímu předčasnému zasychání, může docházet až k běloklasosti (www.syngenta.cza).
14
c.
padlí travní – Blumeria graminis První příznaky se mohou objevit již na podzim, především
v teplejším počasí. Příznakem jsou bělavé kupky mycelia na listových čepelích, popř. bázích čepele. U odrůd odolných vůči napadení padlím, popř. po fungicidním ošetření jsou na listech zřetelné okrouhlé až oválné černobílé skvrny (KAZDA et al., 2001). Bližší specifikace je uvedena v kapitole 2.1.7 Padlí travní.
d.
rhynchosporiová skvrnitost – Rhynchosporium secalis (obr. 4 b) V průběhu
sloupkování
se
na
rostlinách
objevují
vejčité
nepravidelné skvrny (www.agromanual.cz). Při silném výskytu mohou ztráty při sklizni dosahovat až 20% (www.syngenta.czb).
e.
hnědá skvrnitost ječmene – Helminthosporium teres Silnější výskyt zjišťován u odrůd, které jsou rezistentní k padlí.
Diagnostika hnědé skvrnitosti ječmene je podle podélných, příčných proužků se žlutavým okolím. Důsledkem je snížení hmotnosti obilek a tím je podstatně ovlivněn následný výnos (PRIGGE et al., 2006).
f.
rez ječná – Puccinia hordei (obr. 4 c) Vyznačuje se drobnými, prášivými kupkami uredospor na líci
ječných listů s žlutým až oranžovým zabarvením. Na rubu listů se vyskytují teleutospory, které jsou černé, trvale pokryté epidermis (POKORNÝ, ústní sdělení).
g.
helmintosporiová hniloba a skvrnitost obilnin – Helminthosporium sativum Tato choroba způsobuje tmavě hnědé skvrny na listech od báze listů
k vrcholu.
Dochází
k zakrslosti
a
silnému
odnožování,
napadení
kořenovému krčku a kořenu. Napadení způsobuje deformaci obilky a někdy nemusí klas ani vymetat.
15
h.
prašná sněť – Ustilago nuda (obr. 4 d) První příznaky se vyskytují v době metání, kdy místo základů obilek
se objevuje černá masa spor. Konečné stadium se vyznačuje prázdným klasovým vřetenem.
2.
virové choroby
a.
Virus žluté zakrslosti ječmene – Barley yellow dvarf virus BYDV (obr. 4 e) Napadení se projevuje žloutnutím a zakrsnutím, posléze odumřením
celé rostlinky (PRIGGE et al., 2006). Snadno se zamění s fyziologickým poškozením. Přesná identifikace choroby je možná pouze pomocí tesů např. ELISA.
3.
bakteriální choroby
a.
Bakteriální hnědnutí báze plev – Pseudomonas syringae pv. atrofaciens Hnědé zbarvení na bázi plev a stébel. Nejvíce se toto onemocnění
vyskytuje při vlhkém počasí v období od metání do mléčné zralosti.
b.
Bakteriální černání obilek ječmene – Pseudomonas syringae pv. syringae Partie
sladovnického
ječmene,
které
mají
více
jak
4% diskolorovaných zrn, mají nižší sladovnickou hodnotu a nebo se považují za nevhodné pro výrobu sladu. Pro vznik infekce je nezbytná vysoká vlhkost v období mezi mléčnou zralostí a ranou fází voskové zralosti (KŮDELA et al., 2002).
16
3.1.7. Padlí travní
Čeleď Erysiphales, do níž patří Blumeria graminis (obr. 5), jsou patogenní houbové organismy, které napadají řadu krytosemenných rostlin, zahrnující nejméně 1.617 rodů a 9.838 druhů (PANSTRUGA & SCHULZE-LEFERET, 2002). MORI et al. (2002) vypočítali, že první rozšíření Erysiphales (před 138-91 miliony let) se shoduje s datem hlavní diverzifikace krytosemenných rostlin (před 130-90 miliony let). Tyto výsledky podporují hypotézu, že vývoj Erysiphales probíhal současně s evolucí krytosemenných rostlin (PSOTKOVÁ, 2007). Padlí travní (Blumeria graminis f.sp. hordei) je nejvíce rozšířenou chorobou ječmene v Evropě. V České republice frekvence a stupně choroby na jarním ječmeni jsou nepřetržitě analyzovány v polních zkouškách vedené Státním zkušebním ústavem zemědělským (DREISEITL, 2001). Tento patogen je obligátním parazitem, biologicky velmi variabilním. Napadá obiloviny, plevelné trávy, pícniny s výjimkou kukuřice. Každá rostlina má svoji formu, která ji napadne, tudíž se nemůže stát, že jedna forma napadne dva druhy rostlin. Při časném napadení během odnožování je škodlivost největší, protože napadení vede k prořídnutí porostu (PRIGGE et al., 2006). Padlí je ektoparazit, který napadá všechny nadzemní části rostliny. Vytváří kupky (obr. 6), které jsou bělavé, šedavé či nahnědlé barvy vyskytující se na pletivu. V kupkách, vegetativní mycelium, se nachází konidiofory černého zabarvení, které odškrcují konidie, nepohlavní fruktifikace. U odolných odrůd se tvoří žluté až nahnědlé nekrotické skvrny bez zřetelného mycelia. Vlivem intenzifikace produkce obilí význam padlí vzrostl (HÄNI et al., 1993). Patogen způsobuje u napadených rostlin zvýšenou respiraci, tím pádem dochází k ubývání sacharidů a zvyšování dusíkatých látek. Vývoj květů je zpomalen a dochází ke špatnému vývoji zrna, které je ve většině případů menší. Houba nejčastěji přezimuje jako mycelium na živých substrátech, např. ozimý ječmen, pšenice, trávy. Po přezimování se šíří konidiemi na jařiny, jarní ječmene, trávy (POKORNÝ, ústní sdělení). Infekce probíhají pomocí větru konidiemi, které se tvoří ve vatovitých polštářcích (kupkách). Houba proniká jen do nejsvrchnějších vrstev listových pletiv. Horké roční období přežívá houba pomocí černých plodnic – kleistothecii (obr. 7). Na podzim, zejména při chladném a vlhkém počasí, vytvářejí plodnice askospory (obr. 8), které infikují vzcházející ozimy (HÄNI et al., 1993). 17
Rozsah poškození sklizně ječmene v důsledku napadení padlím travním kolísá dle ročníku, polohy, odrůdy a použité agrotechniky. Padlí je podporováno vlahým počasím, s občasnými přeháňkami a zvýšenou oblačností. Trvalejší horké, suché počasí s intenzivním slunečním svitem tlumí rozvoj epidemie. Za příznivého počasí se mohou každý týden vytvořit až dvě generace houby, což může způsobit explosivní epidemii. Výnosové ztráty při silném výskytu padlí přesahují 10, v ojedinělých případech 30 i více procent. Průměrné ztráty odrůd bez účinné odolnosti k padlí činí cca 5% (DREISEITL & JUREČKA, 1996). Intenzitu napadení zvyšuje přerostlý porost, jednostranná výživa dusíkem, deficit manganu, hořčíku, boru, časný výsev ozimého a pozdní výsev jarního ječmene (POKORNÝ, ústní sdělení). Na intenzitu napadení má dále vliv teplé, relativně suché jarní počasí (bohatá produkce a silný nálet spor). Ječmen je na napadení nejvíce náchylný od vzcházení do konce sloupkování, pak nastupuje rezistence pletiv (HÄNI et al., 1993). Nepříznivým
důsledkem
vysoké
proměnlivosti
padlí
je
skutečnost,
že se mohou objevit nové patotypy odolné proti některým účinným látkám fungicidů (KAZDA et al., 2001). Ochrana se provádí jak pomocí agrotechniky tak pomocí chemie. Nejdůležitější je však prevence, která zahrnuje izolační vzdálenosti jarního a ozimého ječmene. Dále, jak bylo zmíněno v předchozím odstavci, neset pozdě jarní a časně ozimý ječmen. Velmi důležité je používání odolných odrůd, nepřehnojování dusíkem, vyrovnaná výživa, dodržování správného osevního postupu. Chemická ochrana není zpravidla rentabilní pro podzimní ošetření odnožujících rostlin ozimého ječmene. Napadené spodní listy stejně během zimy odumřou. U jarního ječmene je však napadení v odnožování velmi škodlivé a je třeba mu předejít chemickou ochranou. Tyto rané výskyty padlí však nebývají časté. Naproti tomu porosty ječmene, které nemají zabudovanou účinnou genetickou odolnost, jsou pravidelně ohroženy chorobou koncem sloupkování a ochrana je rentabilní (PRIGGE et al., 2006). Prahovými hodnotami napadení ve stadiu objevení posledního listu až po jeho plný vývin činí 20-40% napadených 2., 3. a 4. listů shora (HÄNI et al., 1993).
18
3.2.
Rezistence (sensu lato) Pojem rezistence znamená obecně odolnost, schopnost něčemu odolávat,
projevit odpor vůči nějakému podmětu. Choroby rostlin způsobené různými patogeny (biotickými faktory) spolu s abiotickými stresovými faktory významně ovlivňují výnos a kvalitu produktů kulturních plodin. Genetická ochrana rostlin, tvořící základ rezistentního šlechtění, je v současné době jednou z důležitých částí integrované ochrany rostlin. Její význam je, že se hodnotí jako vysoce ekonomická a je ideální z hlediska ochrany životního prostředí (BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004). Rezistence je velmi často řízena major geny. Tyto major geny mají velmi často dominantní dědičnost, méně často recesivní. Polygenní dědičnost rezistence byla také udávána, ale má mnohem nižší frekvenci (SINGH & SINGH, 1995). Jednotnou
soustavu
pojmů
z hlediska
genetiky
rezistence
vytvořil
Van der Planck (1968) a rozdělil rezistenci na vertikální a horizontální. Vertikální rezistence je rasově specifická a je uvažována s určitou rasou nebo rasami patogena. Horizontální rezistence je rasově nespecifická a je účinná proti všem rasám patogena (VĚCHET, 2008).
3.2.1. Vertikální rezistence
Též zvaná specifická či diferencující rezistence se vyznačuje rasovou specifikou, tzn. odolnost k jedné rase patogena. Tato rezistence je kontrolována major geny, což jsou geny velkého účinku. Major geny mají velký účinek na fenotyp. Kódují kvalitativní znaky, což jsou znaky kódované malým počtem genů. Vliv prostředí na jejich expresi je velmi zanedbatelný. Často bývá řízena monogenně (jedním genem) nebo oligogenně (několika málo geny) a přestává být účinná při výskytu nových ras patogena. Vyskytuje se pyramidování genů, to znamená přítomnost několika genů rezistence k různým rasám v jedné odrůdě (POKORNÝ, ústní sdělení). Vertikální rezistence může také existovat jako orgánově-specifická rezistence, která je vyjádřená tehdy, když patogen napadá pouze část nebo části rostliny (VĚCHET, 2008).
19
Tato rezistence se však ztrácí, přestává být účinná se vznikem a šířením ras virulentních ke genům řídícím vertikální rezistenci. K tomu zpravidla dochází dříve nebo později, mají-li tuto rezistenci odrůdy rozšířené na větších plochách (BARTOŠ, 1991). Projev vertikální rezistence se řídí zpravidla alelami s dominantním účinkem, méně často se jedná o odchylky od dominance a jen velmi zřídka je odolnost řízena recesivními alelami (BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004). Vznik
nových
ras
patogena lze omezit
udržováním
stávajících
ras
na náchylných odrůdách. Existují dvě možnosti řešení: 1.
pěstování rezistentních odrůd a nehostitelských plodin,
2.
pěstování směsi odolných a náchylných genotypů (zde je podíl náchylných genotypů
tak
malý,
že
nedojde
k ekonomickým
ztrátám)
(CHLOUPEK, 2000). Oligogenní sytém dědičnosti rezistence proti chorobám je u řady zemědělských plodin dostatečně znám a s výhodou se jej využívá ve šlechtění. Avšak současné velkoplošné pěstování odrůd s oligogenně založenou odolností proti chorobám vyvolává značný selekční tlak na patogena, čímž se zkracuje životnost odrůd s tímto způsobem po jejich rozšíření do praxe. To vyvolává nutnost neustále hledat nové zdroje rezistence
a
vytvářet
nové
kombinace
různých
genů
rezistence
(BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004).
3.2.2. Horizontální rezistence
Rovněž nazývána rasově nespecifická rezistence, všeobecná či stálá rezistence. Horizontální rezistence, jak už název napovídá, se vyznačuje rezistencí ke všem rasám patogena a je stálou vlastností. Je řízena polygenně, tzn. že jí řídí více minor genů (geny s malým účinkem). Naproti vertikální rezistenci je u horizontální rezistence fenotyp více ovlivněn prostředím. Geny mají kvantitativní účinek, ne kvalitativní jak tomu je u vertikální rezistence. Jejím výrazem je pomalé napadení hostitelské rostliny patogenem. Avšak rezistence, která se často projevuje v dospělosti, nemusí být trvalá (VĚCHET, 2008). Její efekt je méně výrazný než efekt genů specifické rezistence; snižuje se stupeň napadení, prodlužuje inkubační doba, redukuje sporulace a tak se brzdí
20
postup napadení. Doporučuje se využívat při vysoké variabilitě patogena a u trvalých plodin a plodin pěstovaných na velkých plochách (BARTOŠ, 1991). Tento typ rezistence je velmi rozšířen u kulturních rostlin a byl prokázán u pšenice ve vztahu ke rzi travní (Puccinia graminis Pers.), rzi pšeničné (Puccinia recondita Rob. Ex Desm.), u brambor ve vztahu k plísni bramborové (Phytopthora infestans Mont.) a kukuřice ve vztahu ke sněti kukuřičné (Ustilago maydis DC.) atd. (BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004).
U kulturních rostlin se předpokládá spolupůsobení obou typů rezistence. Jsou známy případy, kdy oligogenně založená odolnost zesilovala efekt polygenně založené odolnosti a naopak, nebo případy, kdy polygenní odolnost aktivizovala oligogenně založenou odolnost. Vedle interakce jaderných genů existuje interakce jaderných major a minor genů s cytoplazmou (BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004).
3.2.3. Rezistence ječmene
Existují základní principy ochrany rostlin před vznikem choroby, v případě této práce ochranou proti napadení patogenem Blumeria graminis. Jednou, velmi častou metodou, je použití chemických látek - pesticidů. To však neřeší minimalizaci ztrát a kvalitu dosaženého produktu. Dalším způsobem je dodržování osevních postupů, dodržování správné agrotechniky a vysetí ječmene ve vhodných oblastech. Třetím, domnívám se velmi významným, je šlechtění na odolnost. Odolné odrůdy snadněji odolávají všem patogenům, nejen Blumeria graminis, mají stabilnější výnos, ale i kvalitu. Díky vyšlechtěným odolným odrůdám se dále předchází případným epidemiím. Snižují se tak ekonomické náklady na pěstování, protože se nevyplatí pro velmi slabé napadení používat fungicidy. Na ječmenu je nejvíce genů rezistence na padlí travní lokalizováno na rameni pátého
chromozomu
a
jednom
rameni
ze
čtvrtého
chromozomu
(SINGH & SINGH, 1995).
3.2.3.1.
Typy rezistence ječmene k padlí travní
J∅RGENSEN (1993) rozlišuje šest základních druhů rezistence ječmene k padlí travní: rezistenci determinovanou lokusem mlo, rasově specifickou rezistenci (lokus 21
Mla), částečnou rezistenci, indukovanou rezistenci, pasivní rezistenci a nehostitelskou rezistenci (KLUMPLER, 2006).
1.
rezistence determinovaná lokusem mlo Lokus mlo rezistence ječmene na padlí travní je relativně novým druhem
rezistence a je využívána ve šlechtění a pěstování evropských druhů ječmene (JØRGENSEN, 1992a). 2.
rasově specifická rezistence – lokus Mla Lokus Mla se vyskytuje na 1H chromozomu, Mla byl lokusem, který byl
v této diplomové práci studován. Podrobnější informace viz. kapitola 3.2.5 Lokus Mla.
3.
částečná rezistence Částečnou rezistencí se rozumí neúplná rezistence, která má redukovanou
rychlost vývoje epidemie i přes vysoký infekční typ. Prakticky to znamená zpomalení epidemie.
4.
indukovaná rezistence Tento typ rezistence není podmíněn geneticky, říká se jí též získaná
rezistence. Získaná je v důsledku působení předchozí současné infekce dvou patogenů nebo napadení rostliny dvěma patogeny, kteří následovali po sobě v určitém časovém sledu.
5.
pasivní rezistence Pasivní rezistence je převážně fyziologickou obranou rostliny. Brání
se změnami strukturních, chemických a fyzikálních vlastností.
6.
nehostitelská rezistence Rostlina neumožňuje vytvořit vztah s patogenem. Má nevhodné podmínky
pro rozmnožování a přežití většiny patogenů. Rostliny jsou úplně imunní k infekci (SEDLÁŘOVÁ, 2008).
22
3.2.4. Šlechtění ječmene jarního k padlí travnímu
Šlechtění
ječmene
na
padlí
travní
v Československu/České
republice
odstartovalo před mnoha lety (FADRHONS, 1962). Významné úspěchy v potvrzení byly zaznamenány na polích, z nichž některé jsou ovlivňovány šlechtěním rostlin v mnoha evropských zemích (BRÜCKNER, 1964). Po 2. světové válce byly pouze dvě zahraniční odrůdy (Elgina a Trumf) registrovány v České republice hlavně pro jejich lepší rezistenci na padlí travní (DREISEITL, 2006). Infekce padlím travním na ječmeni může mít výrazné ztráty na výnosu a kvalitě zrna. Jestliže je zde nebezpečí infekce, citlivé kultivary jsou léčeny fungicidy. Ty jsou však drahé a škodí na zdraví lidí a zvířat. Navíc jejich aplikace vyžaduje další finanční náklady, mohou mechanicky a nebo chemicky ublížit rostlinám a půdě a dokonce narušit agrosystém. Rezistentní odrůdy jsou levné a jsou šetrnou alternativou životního prostředí k ochraně
před
nemocemi.
Efektivní
rezistentní
ochrana
kultivarů
stojí
v nichž
jsou
nad ekonomickými ztrátami během vstupů do vegetačního období. K padlí
travní
bylo
popsáno
nejméně
třináct
lokusů,
Ml (mildew) geny. Písmenem se zkratkou Ml se označuje alela rezistence a je počátečním písmenem odrůdy, u níž byla prvně zjištěna. K nejvýznamnějším lokusům patří Mla, v němž bylo identifikováno dvacet různých alel. Podle JAHOORA & FISHBECKA (1993) je v kulturním ječmeni 14 lokusů rezistence a 17 v Hordeum spontaneum. Ve šlechtění se využívaly zejména různé alely major-genů rezistence Mla, ale i Mlg, Mlv, Mlat, Mlp a jiné, založené na hypersenzitivní reakci. Z nich pocházející rezistence však byla překonána v kratším či delším časovém období. V současné době se proto využívá recesivní gen rezistence mlo s nespecifickou (horizontální) rezistencí (odrůdy Foram, Olbram a Atribut) (CHLOUPEK, 2000). Dlouhodobou rezistenci se doposud nepodařilo získat. Kromě vhodných kombinací major genů rezistence se šlechtění zaměřuje i na kvantitativní rezistenci (slow mildewing) a střední rezistenci, při které se předpokládá delší trvání. Diverzifikace genů v porostu a tím interakční rezistence se v praxi může dosáhnout vhodnou směsí kultivarů (HRAŠKA et al., 1989). U ječmene je již známo několik desítek genů odolnosti k padlí travnímu, u nichž se významná část nachází v oblasti lokusu Mla na chromozomu 23
1H (JAHOOR & FISHBECK, 1993). JORGENSEN (1994) shrnul i další známé lokusy rasově specifických genů determinujícíh odolnost k padlí travnímu s jejich lokalizacemi na chromozomech 1H (Mla, Mlk, Mlnn, Mlra, Mlga), 2H (MlLa), 4H (Mlg, mlo) a 6H (Mlh). Později byly zmapovány geny Mlj na chromozomu 5H, mlt a Mlf na chromozomu 7H. Účinnost některých genů odolnosti byla však již patogenem díky jeho vysoké přizpůsobivosti překonána. Jedním z nositelů odolnosti je planě rostoucí ječmen Hordeum vulgare ssp. spontaneum, v jehož kolekci bylo zjištěno několik nových plně účinných zdrojů odolnosti k evropskému patotypu padlí travního (DREISEITL & BOCKELMAN, 2003). Perspektivní snahou ve šlechtění je cílený výběr potomstev kombinujících plně účinné geny rezistence, což není možné používáním klasických metod. Proto jsou jednotlivé geny mapovány pomocí DNA markerů a vyvíjeny markery v těsné vazbě s těmito geny, aby mohly být dále využívány v tzv. „marker assisted selection“ (MAS), popřípadě kombinovány v jedné odolné odrůdě (TETUROVÁ et al., 2005).
3.2.5. Lokus Mla
Na boj rostlin proti patogennímu napadení mají rostliny vyvinut rozsáhlý komplex poznání a obrany. Spoléhají se na vyznačení speciálních proteinů rezistence každé buňky (KELLER & JORDÁN, 2005). Přezkoumání dat genů na rezistenci k Blumeria graminis v Mla lokusu u ječmene odhalilo, že je přítomno nejméně 12 genů, z toho každý zahrnuje jeden Mla lokus a jeden nebo více těsně spojených, pomocných genů rezistence. V prozatímním zařazení je zaznamenáno 16 pomocných genů rezistence. Mnoho zdrojů rezistence na padlí travní u ječmene se ukazuje ve skrytu multigenní rodiny v Mla regionu, ne sám v nadřazených genech (JØRGENSEN, 1992b). Rostlinné geny rezistence jsou často lokalizovány do velkých genových shluků. Lokus Mla ječmene je jedním z nejlépe geneticky popsaných rasově specifických lokusů (PSOTKOVÁ, 2007). Mapováním se zjistil velký počet lokusů, umístěných na 1H chromozomu, které determinují rezistenci. Shluk genů Mla rezistence je umístěn blízko telomerického konce tohoto chromozomu (WISE, 1999). Mnohé rasově specifické geny rezistence k padlí u ječmene vyžadují pro svou funkci dva přídavné geny Rar1 a Sgt1. Gen Rar1 kóduje malý, vysoce konzervovaný, cytoplazmatický zinek vázající protein (SHIRASU et al., 1999). Gen Sgt1 kóduje 24
podjednotku ubikvitin ligázového komplexu (TORNERO et al., 2002). Komplex RAR1-SGT1 může pomocí ubikvitinace proteinů aktivovat pozitivní či degradovat negativní regulátory rezistence zprostředkované proteiny R, což svědčí o vazbě mezi rezistencí a ubikvitinací (AZAVEDO et al., 2002; AYLIFFE & LAGUDAH, 2004) (PSOTKOVÁ, 2007).
3.3.
Molekulární markery Jak již bylo v této práci podotknuto, lidé se od počátku pěstování rostlin, jako
zdroj potravy, snažili vybírat a pěstovat hlavně rostliny, které jim dávaly jistotu přísunu kvalitní potravy. V druhé polovině devatenáctého století však přišel průlom v podobě osobnosti Johanna Gregora Mendela. Augustiánský kněz, později opat, který pomocí hrachu sledoval jeho jednotlivé znaky. V této době však nebyla možnost zjistit přítomnost chromozomů, buněčného dělení (meioza) nebo i o samotného oplození. Od této doby však uplynul delší čas a s ním přišly další objevy, možnosti zkoumání. Z hlediska zkvalitňování rostlinné produkce začalo docházet ke šlechtění rostlin. Šlechtěním se rozumí proces, při kterém vzniká nová odrůda ze zkřížení dvou odrůd s žádoucími znaky. Nejde však pouze o zlepšování výnosů na základě šlechtění, ale také jde o zjištění příčin a „léčení“ těchto příčin. K tomu jsou užívány molekulární markery, které zaručují rychlé testování rozsáhlého materiálu. V posledních letech byla získána řada nových poznatků o struktuře rostlinného genomu, na jejichž základě byly odvozeny molekulární markery. Značné úsilí bylo věnováno ve snaze využít tyto markery ve šlechtění rostlin a pro identifikace genotypů (OVESNÁ et al., 2002a). Aplikace metod molekulární biologie umožňuje využití bílkovinných a enzymových systémů a různých DNA markerů jako biochemických a molekulárních genetických markerů ve šlechtění rostlin, pro popis a identifikaci genotypů/odrůd (RAFALSKI et al., 1991). Genetickým markerem je jakýkoliv gen nebo detekovaní fyzické změny v chromozomu nebo cytoplasmatické organele používaný jako speciální označení chromozomu nebo chromozomální oblasti. Molekulární marker je makromolekula (aminokyselina nebo protein) o známé velikosti a elektroforetickými metodami použit
25
jako referenční bod při odhadování velikosti neznámých fragmentů a molekul (REDEI, 2003). Genetický marker (signální gen) se používá pro označení jasně se fenotypově projevujícího znaku s jednoduchou dědičností. Označení marker pak předpokládá spojení tohoto znaku genovou vazbou s jinými kvantitativními či kvalitativními znaky (SOZINOV, 1985). Molekulární marker představuje snadné, nedestruktivní testování rostlinného materiálu. Pro analýzu nám stačí pouze malý kousek rostlinky, např. kousek listu. Nepotřebujeme ani dospělou rostlinu, stačí nám vyklíčená rostlinka. Tu si potom po analýze, pokud má pro nás vhodný genotyp, můžeme živou, nepoškozenou ponechat. Markery jsou
molekuly,
které mohou
být
použity pro
„stopování“
požadovaných genů ve zkoumaném genotypu. Ve skutečnosti jako molekulární marker může být použita část DNA nebo protein. Dřívější postupy, které se zabývaly výběrem určitých rysů, byly založeny na hodnocení morfologických znaků (STAUB et al., 1996), izoenzymů, zásobních proteinů – gluteiny, gliadiny, hordeiny (VAPA & RADOVIC, 1998; METAKOVSKY, 1991; SHARIFLOU et al., 2001; KRAIC et al., 1995; ČERNÝ & ŠAŠEK 1996) (OVESNÁ et al., 2002b).
V poslední době se používají především DNA markery, které: 1.
lze definovat specifickou strukturou určitých úseků DNA a hodnotit molekulárně-genetickými metodami (DNA markery),
2.
jsou produkty určitého lokusu a jsou zřetelné v gelové matrici po specifickém zbarvení (proteinové markery) (CHLOUPEK, 2000).
Oběma typům markerů je společné to, že nejsou ovlivňovány jako klasické markery epistatickým působením nebo vlivy prostředí. Vycházejí z úzké genetické vazby mezi cílem šlechtění vhodným markerem, identifikovatelným již u mladých rostlin (CHLOUPEK, 2000).
Souhrnná charakteristika molekulárních (DNA) markerů: 1.
jsou aplikovatelné u všech organismů, kde je zvládnuta technika izolace DNA,
2.
nejsou závislé na podmínkách vnějšího prostředí,
3.
jejich počet je téměř neomezen, 26
4.
DNA markery lze aplikovat i při minimálním množství biologického materiálu, jsou nedestruktivní,
5.
pomocí DNA markerů lze charakterizovat i velmi raná ontogenetická stadia rostlin (ŘEPKOVÁ & RELICHOVÁ, 2001).
3.3.1. Rozdělení molekulárních markerů
Markerů je mnoho druhů, podle metodiky, která je detekuje. Prvními markery, které se využívaly, jsou viditelné (diskrétní) polymorfismy. Tyto markery dovolovaly odhalovat jen malou část genetické variability. Jsou diskrétní, protože ve fenotypu mají jen několik málo variant (obvykle 2 až 3) a jsou podmíněny jedním nebo někdy dvěma lokusy. Nejsou zpravidla ovlivněny prostředím. Takovéto markery využíval už Johann Gregor Mendel u svých hrachů (žlutá a zelená semena, bílé a purpurové květy, …). Viditelné polymorfismy byly využívány ještě v šedesátých letech minulého století. Viditelný polymorfismus není reprezentativní pro celý genom a neodhaluje dostatek genetické variability (URBAN, 2006).
Metody rozlišení markerů: 1.
markery založené na hybridizaci DNA – např. RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism)
2.
markery založené na polymerázové řetězové reakci PCR (Polymerace Chain Reaction).
3.3.1.1.
SSR (Simple Sequence Repeats) markery
Vzhledem ke způsobu detekce variability DNA mikrosatelitními markery se v další části budu věnovat těmto DNA markerům. SSR markery jsou založené na polymerázové řetězové reakci (PCR). Jsou to markery založené na in vitro amplifikaci určitých sekvencí DNA nebo lokusů prostřednictvím specifických i nespecifických primerů (nukleotidových sekvencí) za účasti termostabilního enzymu DNA polymerázy. Amplifikované fragmenty se
separují
elektroforeticky
a
spektra
jsou
detekována
po
obarvení
(např. ethidiumbromidem) nebo autoradiograficky (BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004).
27
Mikrosatelity jsou krátké opakující se úseky o délce do 10 bp. Obvykle jsou vysoce variabilní, díky odlišným počtům opakujících se jednotek. Již od 70. let 20. století je znám výskyt mikrosatelitních lokusů; tj. krátkých opakujících se sekvencí v eukaryontních genomech (OVESNÁ, 2002b). Mikrosatelity jsou krátké 2-6 nukleotidů dlouhé motivy, které se tandemově opakují v počtu až 60 repetic. Mikrosatelity mutují 10.000x rychleji než jiné oblasti genomu (MITAS et al., 1995). TAUTZ et al. (1986) poukázali na existenci samostatných sekvencí, které se vyskytovali u eukaryot a byly 5 až 10x více zastoupeny než ekvivalentní-náhodně dané velikosti motivů a než vysoké číslo „tajných“ opakování nebo zakódovaných uspořádání výskytu opakujících se sekvencí. Jedná se o kodominantní markery, které mají vysokou informační hodnotu. K analýze mikrosatelitů postačuje malé množství DNA tak, jak je tomu u běžné PCR (JEFFREYS et al., 1985). Mikrosatelity se vyznačují vysokým stupněm polymorfismu, relativně rovnoměrným zastoupením po celém genomu, kodominancí, založením na
PCR
a
požadavkem
na
minimální
množství
analyzované
DNA
(BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004). Kodominantní charakter SSR markerů umožňuje rozlišit homozygoty (jeden proužek odpovídající dvěma alelám stejné velikosti) od heterozygotů (dva proužky s rozdílnou mobilitou, představující dvě alely s rozdílnou délkou amplifikovaných úseků) (KLUMPLER, 2006). Pozice jednotlivých markerů jsou mapovány, jsou využívány pro přípravu markerů, studium diverzity a vzhledem ke své reproducibilitě, jednoduchosti a možnosti automatizace se jeví jako velmi vhodné pro genotypizaci.
3.3.2. Praktické využití molekulárních markerů
Praktická aplikaci molekulárních markerů již významně ovlivnila šlechtitelské postupy a stala se základním inovačním prvkem rovněž v oblasti semenářství. Specifické místo nalezly molekulární markery při kontrolách přítomnosti patogenních mikroorganismů v rostlinách i při sledování výskytu GMO (Geneticky modifikované organismy) (KUČERA et al., 2002). Molekulární a biochemické markery jsou využívány v taxonomických, fylogenetických a populačně genetických studiích, které jsou používány v genetickém mapování a studiu organizace genomu a v neposlední řadě mají aplikace v oblasti charakterizování, popisu a identifikace odrůd zemědělských plodin. 28
Zejména tyto šlechtitelské aplikace nabývají v současné době stále více na významu. Mnohé šlechtitelské a semenářské firmy využívají biochemické a genetické markery ve svých šlechtitelských programech, ke kontrole čistoty osiva, k identifikaci odrůd a v posledních letech i jako genetické markery v systémech „molecular-aided breeding“ a „marker assisted selection“, které výrazným způsobem ovlivňují
charakter šlechtění
a tvorbu
nových
genotypů
kulturních
rostlin
(ČURN et al., 2002). Různé metody založené na amplifikaci DNA prostřednictvím specifických a nespecifickýh primerů se ve stále větší míře uplatňují v aplikovaném výzkumu ve šlechtění rostlin. Jsou konstruovány genetické mapy a identifikovány markery některých hospodářsky důležitých znaků a vlastností (BEDNÁŘ & VYHNÁNEK, 2004).
3.3.2.1.
Využití molekulárních markerů v populační genetice fytopatogenních organismů
Technika gelové elektroforézy proteinů enzymů našla aplikace i v oblasti fytopatologie, jako technika pro taxonomické studie u patogenních hub, později i pro studium interakcí patogen-hostitel a studium populační genetiky patogenních organismů (MARSHALL, 1983). Genom hub bývá studován z několika hledisek a podle toho se též liší metodika studia. V taxonomických studiích a ve sledování intra- a interspecifické variability se vedle morfologických znaků čím dál více uplatňují molekulárně-biologické analýzy pomocí molekulárních markerů. Ke studiu populací se velmi často používá metod, které nejsou lokusově specifické, ale naopak postihují celý genom organismu, jsou vysoce polymorfní a méně technicky náročné. Z fytopatologického hlediska se molekulární markery u genomu hostitele využívají k mapování rezistence. Nejvhodnějšími technikami pro mapování jsou techniky RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorohism), STS (Sequence Tagged Sites) a SSR (Simple Sequence Repeats) (CAHNTRET et al., 2000). U rezistencí založených monogenně je situace poměrně jednoduchá, na základě znalostí sekvence daného genu je možné získat STS marker pro konkrétní lokus, který se pak využívá při šlechtění k selekci rezistentních a náchylných linií.
29
Möhler a Jahoor v roce 1996 detekovali STS marker rezistence k padlí travní (Blumeria graminis) u obilovin (LEIŠOVÁ et al., 2002).
30
4.
MATERIÁL A METODIKA
4.1.
Materiál Pro analýzy detekce variability u ječmene na padlí travní bylo použito celkem
7 odrůd ječmene setého (Hordeum vulgare L.): Xanadu, Bolina, Sebastian, Heris, Braemar, Malz a Tolar. Vzorky pro analýzu dodal Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský v Brně (ÚKZÚZ). Charakteristika použitých odrůd byla získána z Přehledů odrůd. Tento přehled je každoročně aktualizován samotným ÚKZÚZem.
4.1.1. Charakteristika použitých odrůd
1.
Braemar -
Sladovnická, středně raná odrůda,
-
rostliny středně vysoké, odrůda středně odolná proti poléhání, středně odolná proti lámání stébla,
-
zrno středně velké až velké, podíl předního zrna vysoký,
-
odolná proti napadení padlím travním, středně odolná proti napadení rzí ječmene, středně až méně odolná proti napadení komplexem hnědých skvrnitostí, středně až méně odolná proti napadení rhynchosporiovou skvrnitostí,
-
výnos zrna v zemědělských výrobních oblastech kukuřičné, řepařské a obilnářské středně vysoký, v zemědělské výrobní oblasti bramborářské a pícninářské vysoký.
2.
Xanadu -
Sladovnická, středně ranná odrůda,
-
rostliny středně vysoké, odrůda středně odolná proti poléhání, středně odolná proti lámání stébla,
-
zrno středně velké až velké, podíl předního zrna vysoký,
-
odolná proti napadení padlím travním, středně odolná proti napadení rzí ječmene, středně odolná proti napadení komplexem hnědých
31
skvrnitostí,
středně
odolná
proti
napadení
rhynchosporiovou
skvrnitostí, -
3.
výnos zrna ve všech zemědělských výrobních oblastech vysoký.
Bolina -
Nesladovnická, poloraná odrůda,
-
rostliny středně dlouhé, středně odolné proti poléhání,
-
středně odolná proti lámání stébla,
-
zrno středně velké, výtěžnost předního zrna střední,
-
středně odolná proti napadení padlím travním, komplexem hnědých skvrnitostí a rhynchosporiovou skvrnitostí, méně odolná proti napadení rzí ječnou, středně odolná proti lámání stébla,
-
výnos zrna velmi vysoký ve všech zemědělských výrobních oblastech.
4.
Sebastian -
Sladovnická polopozdní odrůda,
-
rostliny nízké, odrůda středně odolná proti poléhání, středně odolná až odolná proti lámání stébla,
-
zrno středně velké, výtěžnost předního zrna středně vysoká až vysoká,
-
středně odolná proti napadení padlím travním, středně odolná až odolná proti napadení rzí ječmene, středně odolná proti napadení komplexem hnědých skvrnitostí, středně odolná proti napadení rhynchosporiovou skvrnitostí,
-
5.
výnos zrna ve všech zemědělských výrobních oblastech vysoký.
Tolar -
Provozně spolehlivá odrůda,
-
sladovnická kvalita vhodná pro výrobu českého piva,
-
polní odolnost na padlí travní,
-
sladovnami a pivovary: 1.
sladovny Soufflet,
2.
další tuzemské sladovny (www.odrudynickerson.cz).
32
6.
Heris -
Polopozdní středně vysoká odrůda,
-
středně odolná proti poléhání,
-
sladařská jakost nevyhovující, odrůda určená pro krmné účely,
-
zrno středně velké až velké s velmi dobrou výtěžností předního zrna,
-
odrůda odolná proti napadení padlím travním, středně odolná až odolná proti napadení rzí ječnou, středně odolná proti napadení hnědou a rhynchosporiovou skvrnitostí,
7.
-
odrůda nadprůměrně výnosná ve všech zkušebních oblastech,
-
pěstitelsky osvědčená odrůda,
-
unikátní kombinace genů rezistence vůči chorobám, o
rez ječná – gen Pa7,
o
padlí travní – gen mlo.
Malz -
Sladovnická polopozdní odrůda,
-
rostliny nízké, odrůda středně odolná proti poléhání, středně odolná proti lámání stébla,
-
zrno středně velké, výtěžnost předního zrna vysoká,
-
méně odolná proti napadení padlím travním, středně odolná proti napadení rzí ječnou, středně až méně odolná proti napadení hnědou skvrnitostí,
středně
odolná
proti
napadení
rhynchosporiovou
skvrnitostí, -
výnos zrna je v zemědělské výrobní oblasti kukuřičné vysoký, v zemědělských výrobních oblastech řepařské a obilnářské středně vysoký,
v
zemědělských
výrobních
oblastech
bramborářské
a pícninářské středně vysoký, -
jedna z nejpěstovanějších sladovnických odrůd v ČR,
-
výběrová sladovnická kvalita vhodná pro výrobu Českého piva
-
Preferovaná sladovnami a pivovary: o
nosná odrůda pro Plzeňský Prazdroj,
o
preferovaná pivovarem Radegast,
o
preferovaná sladovnami Soufflet, 33
o
preferovaná dalšími tuzemskými sladovnami a pivovary,
o
nosná a nejpěstovanější sladovnická odrůda na Slovensku.
Rodokmeny analyzovaných odrůd jsou uvedeny v tabulce 1.
4.2.
Metodika Metodika detekce polymorfizmu DNA ječmene SSR markery sestává z těchto
základních kroků: 1.
izolace DNA z rostlinného materiálu,
2.
příprava reakční směsi pro PCR,
3.
provedení kontrolní elektroforézy,
4.
příprava nedenaturovaných polyakrylamidových (PAA) gelů,
5.
separace amplikonů na PAA,
6.
vizualizace PCR produktů,
7.
statistické a grafické vyhodnocení získaných výsledků.
4.2.1. Izolace rostlinné DNA
Rostlinná DNA, která byla dále využita při analýzách, byla izolována z rostlin starých 6-7 dní, pomocí DNeasy Plant Mini Kit (f. Qiagen). Izolováno bylo dle návodu výrobce pro izolaci z rostlinných pletiv. První navážka činila u každého vzorku 0,1 g. V mikrozkumavce byl rostlinný materiál pomocí kapalného dusíku rozdrcen. Lyzi buňky způsobila aplikace jednotlivých chemikálií. Poté byl uvolněn buněčný obsah, odstranění nežádoucí RNA a proteinů, vysrážení a převedení DNA do roztoku. Při izolaci DNA bylo využito těchto přístrojů: analytické váhy, stolní chlazená odstředivka Mikro 22R (Hettich, GE), minishaker MSI (Ika, GE), vodní lázeň GFL 1002 (GFL, GE) a automatické pipety Nichipet Ex (Nichiryo, JAP).
Izolace DNA pomocí DNeasy Plant Mini Kit: 1.
Rozdrcení 100 mg rostlinného materiálu v mikrozkumavce pomocí drtičky a tekutého dusíku,
2.
přidání 400 µl pufru AP1 a 4 µl RNázy → důkladné zvortexování,
34
3.
10-ti minutová inkubace ve vodní lázni při 65°C teploty, během inkubace bylo zkumavkou 2-3x protřepáno,
4.
přidání 130 µl pufru AP2 k lyzátu → zvortexování → 5-ti minutová inkubace na ledu,
5.
centrifugace
lyzátu
po
dobu
2
minut
při
maximální
rychlosti
-1
18.000 otáček.min , 6.
přenesení tekuté frakce do čisté mikrozkumavky → pomocí pipet přidáno 1,5 objemu pufru AP3/E → velmi jemné promíchání,
7.
centrifugace 650 µl tohoto mixu po dobu 60-ti sekund při otáčkách 6.000 otáček.min-1, tekutá frakce byla vyhozena,
8.
krok číslo 7. byl opakován ještě jednou,
9.
po opakovaném kroku číslo 7. bylo připipetováno 500 µl pufru AW
→
opětovná
60-ti
sekundová
centrifugace
při
otáčkách
6.000 otáček.min-1, tekutá frakce byla vyhozena, 10.
opětovné přidání 500 µl pufru AW a po dvou minutové centrifugaci při maximálních otáčkách, tj. 18.000 otáček.min-1, bylo připipetováno 100 µl předehřátého pufru AE → inkubace při laboratorní teplotě po dobu 5-ti minut → použití centrifugy při otáčkách 6.000 otáček.min-1 po dobu jedné minuty,
11.
krok číslo 10. byl zopakován s použitím 50 µl AE → centrifugace po dobu jedné minuty při 6.000 otáček.min-1,
12.
vyhození kolonky s pevným podílem → v tekuté části zůstala požadovaná DNA,
13.
skladování genomové DNA v ledničce,
14.
zda izolace po tomto 13-ti krokovém postupu byla úspěšná bylo zjišťováno kontrolní fází. Zahrnuje jak kvalitativní tak kvantitativní stanovení. Kvalita DNA byla zjištěna kontrolní elektroforézou (1,5% agarózový gel). Kvantitativní stanovení se provádí měřením absorbance DNA při 260 nm za použití stolního elektrofotometru UV/VIS Hélios Gamma (Spectronic Unicam, UK). Genomová DNA byla skladována při teplotě 4°C.
35
4.2.2. Příprava reakční směsi pro PCR a vlastní PCR
Komponenty a reakční směsi pro analýzu mikrosatelitních markerů
Použitá metoda při analýze mikrosatelitů – vycházela z práce RAMSAY et al., (2000). Složena z přípravy master mixu (objem 25 µl): 0,5 U Taq polymerázy (Promega), 1x příslušný pufr, 0,1 mM každého DTP (Promega), 0,3 M každého primeru, 30 ng templátové DNA.
Primery
Pro
analýzy bylo
použito
celkem
10
SSR
primerů
lokalizovaných
na 1H chromozomu: Bmag0105, Bmag0382, Bmag0579, EBmac0405, EBmac0656 a HvHVA.
Průběh reakce PCR
Průběh reakce zajišťoval termocykler T3 Thermocycler combi (Biometra, GE). Přístroj je vybaven třemi na sobě nezávislými komorami, kromě 0,2 ml zkumavek mohou být použity i zkumavky o objemu 0,5 ml. Teplotní a časový profil reakce probíhající v termocykleru T3: 1 cyklus, 93°C – 120 s; 30x (93°C – 60 s, 54°C – 120 s, 72°C – 120 s), byl shodný pro všechny analyzované SSR markery.
4.2.3. Kontrolní elektroforéza
Vždy byla prováděna před vlastní elektroforetickou separací. Byl používán 1,5% agarózový gel (barvení ethidiumbromidem) z části objemu reakce pro kontrolu ne/úspěšnosti reakce. V horizontální elektroforéze v systému Agagel Standard (Biometra, GE) byla provedena kontrolní elektroforéza, zdroj Minicell Power Pack P20 (Biometra, GE), umožňuje regulaci dodávaného napětí v rozmezí 20-200 V, zajišťoval stejnoměrné napětí 70 V. Pomocí transluminátoru Ultraviolet (Ultra lum Inc., CA) s UV lampou probíhala vizualizace výsledků. Černobílá kamera CCTV (Panasonic,
36
USA) zajišťovala dokumentaci ve spolupráci s počítačovým programem Scion Image (USA). Výsledek kontrolní elektroforézy je ukázán na obr. 9.
4.2.4. Příprava nedenaturovaných polyakrylamidových (PAA) gelů
Složení 8% PAA gelu: 1.
destilovaná voda
2.
TBE pufr (Tris báze – tris(hydroxymethyl)diaminomethan, kyselina boritá, EDTA – ethylendiamintetraoctová kyselina) (příprava TBE pufru v tabulce 2)
3.
akrylamid/bisakrylamid (19:1)
4.
persíran amonný
5.
TEMED - tetramethyldiamin (N,N,N)
Příprava 8% PAA gelu: 1.
promíchání složek 1. – 4. pomocí elektromagnetické míchačky,
2.
přidání složky č. 5 (objemy pro přípravu 1 skla (gelu) jsou uvedeny v tabulce 3),
3.
zhotovený roztok naléván mezi sestavené elektroforetické desky a nanášecí jamky byly vytvořeny vložením plastového hřebenu mezi desky,
4.
polymerizace gelu – řetězení monomeru akrylamidu – pro vytvoření prostorového zesíťování se přidává bisakrylamid
Velikost gelu pro analýzy byla stanovena na š x v x t (cm): 17 x 18 x 0,01 (cm). Po vyjmutí plastového hřebenu vzniklo 12 jamek, do kterých se nanášely vzorky. První a dvanáctá jamka sloužila k nanesení velikostního markeru, který sloužil jako kontrola (standard o velikosti 20 bp DNA (Ladder Cambrex, UK)). Do druhé jamky se nanesla negativní kontrola. Vzorky se do jamek nanášely pomocí stříkačky. Nejdříve byl do jamek nanesen pufr 1xTBE. Tato metoda se označuje jako podvrstvování elektrodovým pufrem. Posledním krokem v nanášení vzorků, bylo pomocí speciálních špiček (Maxi Round Tip (AB gene, USA)) nanesení samotného vzorku o objemu 12 µl. Vlastní elektroforéza byla zahájena pod napětím 100 V po dobu 10-15 min. Toto napětí bylo zvoleno pro pozvolné rozvrstvení vzorku v gelu. Po uplynutí této doby 37
se napětí zvýšilo na 300-310 V. Doba vlastní elektroforézy byla závislá na velikosti produktu (v bp) a pohybovala se kolem 2-3 hodin.
4.2.5. Vizualizace PCR produktů
Hlavní složkou pro vizualizaci byl použit dusičnan stříbrný (0,2% AgNO3 ). Použitá sada roztoků (uchovávány při laboratorní teplotě):
1.
fixační směs (tab. 4)
2.
0,2% roztok dusičnanu stříbrného
3.
vývojka (tab. 5)
Postup barvení:
1.
Uvolnění gelu z elektroforetických desek, po ukončení elektroforézy → ponoření gelu do fixačního roztoku po dobu 3 minut,
2.
opatrné přenesení gelu do roztoku dusičnanu stříbrného → promývání gelu po dobu 5-ti minut,
3.
vyjmutí gelu z roztoku a promytí 3x destilovanou vodou,
4.
přemístění
gelu
do
nádoby
s vyvíjecí
směsí;
z důvodu
toxicity
z formaldehydu je nutné tento krok provádět v odvětrávatelné digestoři; nádoba byla umístěna na třepačce, kde se gel promývala po dobu 10-15 min. (v závislosti na síle roztoku), 5.
přenesení gelu na fólii a jeho následné zatavení (obr. 10); tento způsob umožňuje dlouhodobé skladování při teplotě 4°C; pro lepší uchovatelnost byl dále zvolen scan na scanneru Umax 1220S (UMAX, GE) – možnost uchování v elektronické podobě a následné jednoduché publikování.
4.2.6. Statistické a grafické vyhodnocení výsledků
Vyhodnocení elektroforeogramů bylo pomocí binární matice, přítomnosti specifického produktu (1) nebo absence (0) (tab. 6). Pro snadnější a přesnější vyhodnocení byl použit statistický software FreeTree verze 9.1 metodou UPGMA
38
a výpočtu Jaccardova podobnostního koeficientu; grafické zpracování formou dendrogramu (software TreeView verze 1.6). Ke zhodnocení jednotlivých SSR markerů se použil index diversity (DI), pravděpodobnostní identita (PI) a polymorfní informační obsah (PIC) dle RUSSELA et al. (1997).
39
5.
VÝSLEDKY A DISKUZE Padlí travní je považováno za jednu z nejvíce škodlivých chorob vyskytující
se na ječmeni. Dříve byl výskyt patogena Blumeria graminis, způsobujícího toto onemocnění, eliminován převážně chemickými zásahy. Tato metoda je však velmi finančně a ekologicky náročná. Dnes je snaha o eliminaci tohoto onemocnění na úrovni šlechtění, ale hlavně na molekulární úrovni. Tento způsob ochrany je šetrný nejen k životnímu prostředí, ale v neposlední řadě je i ekonomicky prospěšný. Pěstování odrůd odolných vůči škodlivým činitelům je levný, účinný a zdravotně bezpečný způsob ochrany. Lokalizace nových genů odolnosti v genomu ječmene a vývoj a využití DNA markerů tak patří k dalším podmínkám úspěšného šlechtění odrůd ječmene odolných k padlí travnímu (DREISEITL et al., 2003). Délka trvání jakékoliv rezistence je limitována rychlou adaptací patogena na gen rezistence dané odrůdy, která je umožněna především vysokou rekombinační schopností a krátkým generačním intervalem padlí travního. Jelikož se rasově specifická rezistence řídí systémem gen proti genu, je efektivita konkrétního genu R výskytem (kvalitativní aspekt) a frekvencí (kvantitativní aspekt) odpovídající virulence v populaci padlí. V nepřítomnosti patogena se pak všechny rostliny jeví jako rezistentní. Odrůdy ječmene můžeme rozdělit na dvě skupiny: ty, které nemohou indukovat změny v populaci patogena (odrůdy bez genů R a odrůdy obsahující gen mlo) a ty, které obsahují geny R na něž se může Blumeria graminis adaptovat. Objevení se prvních jedinců virulentních k určitému genu rezistence je výsledkem mutace v populaci padlí ve studovaném teritoriu nebo imigrace virulence z jiné oblasti (DREISEITL, 2003). Vyvíjení genetických map s DNA markery je předpokladem pro genetické mapování genů rezistence. Znalost lokusů genů rezistence a identifikace DNA markerů v těsné vazbě s těmito geny může značně usnadnit proces šlechtění například zavedením technologií založených na selekci pomocí DNA markerů (MOHAN et al., 1997). V okolí lokusu Mla na chromozomu 1H se nachází značné množství genů rezistence ječmene, z tohoto důvodu byl zvolen pro detekci variability v této diplomové práci. Mikrosatelitní markery byly zvoleny s ohledem na jejich lokalizaci v blízkosti lokusu Mla (obr. 11).
40
V rámci
praktické
části
diplomové
práce
bylo
analyzováno
celkem
10 SSR markerů ječmene lokalizovaných na 1H chromozomu u sedmi odrůd jarního ječmene. Celkově bylo detekováno 15 alelických variant, což jsou průměrně 2 varianty na 1 lokus (tab. 7). Nulová alela nebyla zjištěna žádná. Uniformní spektrum vykazovaly 2 SSR markery (Bmag0105 a Bmac0405). Tyto markery není možné použít pro rozlišení analyzovaného souboru odrůd ječmene. Ostatní markery vykazovaly 2-3 alely. Nejvyšší počet alel (3) vykazovaly tyto SSR markery – Bmag0345 a Bmac0213. NEVIMOVÁ et al. (2009) při studiu genetické variability ječmene jarního detekovali SSR markery až s 9 alelickými variantami, přičemž zjistili výskyt i nulových alel. V našem případě je počet alel nižší, což je dáno menším rozsahem analyzovaného souboru genotypů a mikrosatelitních markerů. Průměrná hodnota indexu diverzity (DI), rozmanitost alel v lokusu, byla v diplomové práci zjištěna 0,36 a její rozsah byl zjištěn v rozmezí těchto hodnot: 0,00 až 0,57. Průměrná hodnota pravděpodobnosti identity (PI), míra identity mezi dvěmi genotypy, 0,51 v rozsahu hodnot 0,23 až 1,00. Průměrná hodnota polymorfního informačního obsahu (PIC), frekvence alel je 0,29 a jeho hodnoty jsou v rozsahu 0,00 až 0,51. Nejvyšší zjištěná hodnota PIC byla u primeru Bmag0345 a Bmac0213 a to o hodnotě 0,51. Nejnižší vypočtenou hodnotou, nezapočítávám-li uniformní spektrum, vykazovaly shodně čtyři SSR markery a to: Bmag0382, HvHVA, Bmac0339 a Bmag0211. Zjištěná hodnota byla 0,32. Statistické vyhodnocení analyzovaných markerů je uvedeno v tabulce 8. MLČOCHOVÁ et al. (2005) zjistili, bráno z údajů PIC při rozsahu 122 primerů 35 uniformních, mezi nimi se vyskytoval i primer Bmag0105 lokalizovaný na chromozomu 1H. Průměrná hodnota polymorfního informačního obsahu byla v jejich případě vypočítána na 0,287. Nejvyšší vypočtenou hodnotu, na 1H chromozomu, se vyskytovala u dvou SSR markerů Bmac0399 a Bmac0144 s hodnotou 0,602. Nejnižší hodnota 0,218 byla zjištěna u Bmag0382. Při porovnání se získanými výsledky práce MLČOCHOVÉ et al. (2005) se dají zjistit mírné odlišnosti. Shodujeme se v případě výskytu uniformního markeru a to Bmag0105. Rozcházíme se však u výsledků mnou zjištěné nejvyšší hodnoty PIC u SSR markeru Bmag0345, kde jsem zjistila hodnotu 0,51 a u práce MLČOCHOVÉ et al. (2005) bylo zjištěno uniformní spektrum. V dalších zkoumaných markerech nebyla zjištěna shoda. Tyto rozdíly byly s největší pravděpodobností způsobeny příbuzností mnou zkoumaných odrůd ječmene. Dalším významným faktorem je počet analyzovaných genotypů a SSR marketů, který je v mém případě výrazně nižší. 41
Rozsah velikostí získaných produktů se pohyboval od 105 do 190 bp. Nejnižší počet párů bazí byl zjištěn u SSR markeru Bmag0105 (105 bp) a nejvyšší Bmac0339 (180-190 bp). Zjištěné hodnoty se velmi neliší od průměrných hodnot, které jsou uvedeny v tabulce 9, tak jak jsou uvedeny v internetových databázích. Na základě statistického vyhodnocení byl vytvořen dendrogram podobnosti (obr. 7) (Jaccardův koeficient) analyzovaných genotypů. Dendrogram (obr. 12) pochází z řeckého „dendron“ což znamená strom. V pojetí genetiky se používá pro názorné uspořádání podle podobnosti (odlišnosti). Dendrogram rozdělil analyzované genotypy na dva klastery (přiřazení objektů do skupin). Počítačový program pomocí matematických vzorců vyhodnotil stupeň podpory daného tvrzení (bootstrapping). Čím je tvrzení vyšší (blíží se hodnotě 100), tím větší je opora pro dané větvení v dendogramu
(FLEGR,
2005).
V klasteru/subklasteru
mají
vzorky
z hlediska
genetického společný základ. Pokud jsou jednotlivé vzorky homogenní a tvoří linie, pak se nacházejí ve společném subklasteru (SLEZÁKOVÁ, 2008). První klaster (A) se dále rozdělil na dva subklastery (AA, AB). Subklaster AA, který obsahoval odrůdy Heris, Bolina a Xanadu byl dále rozdělen na dva subklastery, kde se ukázala velmi blízká podobnost odrůd německého původu Bolina a Xanadu. Vysoký stupeň podobnosti, který je zapříčiněn shodou jednoho z rodičů, kterým je odrůda Scarlett (tab. 1). Podobnost odrůdy Malz, která má sejného rodiče jako předešlé dvě odrůdy nebyla prokázána. Druhý klaster (B) obsahuje 2 odrůdy (Sebastian a Tolar), které se statisticky významně liší od ostatních analyzovaných odrůd. S výjimkou německých odrůd nebyl zjištěn vliv provenience (země původu) odrůd na jejich umístění v dendrogramu.
42
6.
ZÁVĚR Jak již bylo poznamenáno v úvodu, ječmen je jednou z nejpěstovanějších plodin
nejen v České republice, ale také ve světě. Jeho vysoká produkce spočívá v jeho širokém uplatnění nejen v potravinářském a krmivářském průmyslu. Stále velká obliba pivního moku je závislá na kvantitě a kvalitě pěstovaného sladovnického ječmene. Kvalita ječmene v celém průmyslovém užití je závislá převážně na zdravotním stavu
pěstované
plodiny.
Zdravotní
stav
má
mnoho
způsobů
udržování.
Nejekologičtějším způsobem je využívání genů rezistence k biotickým a abiotickým činitelům. Tento způsob ochrany je nyní velmi používaným vzhledem k tomu, že v konečných produktech se nenachází rezidua po chemických přípravcích na ochranu rostlin, tj. fungicidy, insekticidy atd. V diplomové práci byly zpracovány základní teoretické a praktické poznatky. Ze sledovaných 10 SSR markerů je možné pro další analýzy použít 8 SSR markerů, které nevykazují uniformní spektrum. Markery jež vykazovaly uniformní spektrum není možné použít pro rozlišení analyzovaného souboru odrůd ječmene. Pro zjištění markerovací schopnosti bylo využito těchto ukazatelů: index diverzity
(DI),
polymorfní
informační
obsah
(PIC)
a
průměrná
hodnota
pravděpodobnosti (PI). Ze všech použitých mikrosatelitů Bmag0105, Bmag0579, Bmac0405, Bmag0345, GMS021, Bmag0211, Bmac0213, Bmag0382, HvHVA a EBmac0656 byla zjištěna hranice polymorfního informačního obsahu 0,00 až 0,51. Nejvyšší hodnotu polymorfního informačního obsahu vykazovaly markery Bmag0345 a Bmac0213. V rámci pokusů byla zjišťována i velikost bazí, která se nijak výrazně neodlišovala od hodnot uváděných v internetových zdrojích. Na základě výsledků z PCR reakcí byl sestaven dendrogram, který ukazuje využitelnost mikrosatelitních markerů v rámci studia genetické variability detekce sledovaných genotypů ječmene. Dosažené výsledky jsou zkresleny malým počtem zkoumaných odrůd, ale také zjištěnou příbuzností druhů. S výjimkou německých odrůd nebyl zjištěn vliv provenience (země původu) odrůd na jejich umístění v dendrogramu. Vzhledem ke zvyšující se zátěži životního prostředí pesticidy roste význam genetické determinance rezistence. S tím je spojeno stále větší využívání molekulárních markerů (např. i mikrosatelitních markerů) v procesu šlechtění.
43
7.
SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY
ARUMUNATHAN, K., EARLE, E.D..: Molecular Biology Reporternt plant species. Vol. 9, 1991. Nuclear DNA content of some important plant species, s. 208-218. AYLIFE, M. A., LAGUDAH, E. S.: Annuals of Botany. Vol. 94, 2004. Molecular genetics of disease resistance in cereals, s. 765-773. AZAVEDO, C., SADANANDOM, A., KITAGAWA, K., FREIALDENHOVEN, A., SHIRASU, K., SCHULZE-LEFERT, P.: Science. Vol. 295, 2002. The RAR1 interactor SGT1, an essential component of R gene-triggered disease resistance, s. 2073-2076. Barley Yellow Dvarf Virus [online]. 1999 [cit. 2009-04-18]. Dostupný z WWW:
. BARTOŠ, P.: Odolnost zemědělských rostlin k chorobám. Praha : ČZU Praha, 1991. 120 s. BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T.: Genetika rostlin. Brno : MZLU Brno, 2004. 146 s. BENNETH, M. D., SMITH, J. B.: Royal Society of. London, 1976. Nuclear DNA amounts in angiosperms, s. 227-274. BOTHMER,
von
R,
JACOBSEN,
N.,
BADEN,
C.,
J∅RGENSEN,
RB & LINDE – LAURSEN: International Board for Plant Genetic Resources., 1991. An ecogeographical study of the genus Hordeum, s. 127. BRÜCKNER, F.: Rostlinná Výroba. Vol. 10, 1964. Powdery mildew on barley V. The resistance of barley varietes to physiological races of Erysiphe graminis DC. detected in Czechoslovakia and the posibility to use it in breeding for resistance, s. 395-408. CAHNTRET, N., SOURDILLE, P., RODER, M., TAVAUD, M., BERNERD, M., DOUSINAULT, G.: Theoretical and Applied Genetics. Vol. 100, 2000. Location and mapping of the powdery mildew resistance gene MIRE and detection of a resistance QTL by bulked segregant analysis (BSA) with microsatelits in wheat, s. 1217-1224. CERKAL, R., HRSTKOVÁ, P., STŘEDA, T.: Prezentace obilnin [online]. 2006 [cit. 200902-08]. Dostupný z WWW: . ČERNÝ, J., ŠAŠEK, A. Scientia Agric. Bohemoslov. Vol. 27, 1996. Analysis of genetic structure of regional common wheat varieties using signal gliadin and glutenin genes, s. 161-182.
44
ČURN, V., DOLANSKÁ, L., ENDRYCHOVÁ, V.:
Využití bílkovinných markerů
v genetice a šlechtění rostlin. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk : 2002. s. 5-14. DREISEITL, A. Plant, Soil and Environment. Vol. 49, 2003. Adaption of Blumeria graminis f.sp. hordei to barley genetic resistance in the Czech republic in 1971-2000, s. 241-248. DREISEITL, A. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. Vol. 37, 2001. Powdery Mildew Resistance in Czech and Slovak Barley Breeding Lines, s. 105-113. DREISEITL, A. Czech Journal of Genetics and Plant Breeding. Vol. 42, 2006. Powdery mildew Resistance of Foreign Spring Barley Varietes in Czech Official Trials, s. 1-8. DREISEITL, A., BOCKELMAN, H. E.: Ressource Crops and Evolution. Vol. 50, 2003. Sorces of powdery mildew resistence in a wild barley collection, s. 345-350. DREISEITL, A., JUREČKA, D.:
Ochrana rostlin. Vol. 32, 1996. Disease occurence
on spring barley in the Czech Republic in 1989-1995, s. 221-229. DREISEITL, A., ŘEPKOVÁ, J, KYJOVSKÁ, Z., LÍZAL, P., JAHOOR, A.: První kroky na cestě k vývoji DNA markerů pro detekci nových genů odolnosti ječmene k padlí travnímu. In Zborník z 10. odborného seminára \"Nové ponatky z genetiky a šľachtěnia poľnohospodárských rastlín\", Výskumný ústav rastlinnej výroby Piešťany, 26.-27. november. Piešťany, Slovenská republika Výzkumný ústav rastlinnej výroby Piešťany, 2003. s. 1-1. FADRHONS, J.: Breeding of barley for resistance to powdery mildew Vol. 8, 1962. Rostlinná Výroba, s. 1137-1150. FLEGR, J. Evoluční biologie. Praha : Academia Praha, 2005. 559 s. Fusarium graminearum [online]. 1999 [cit. 2009-04-18]. Dostupný z WWW: . HÄNI, F., POPOW, G., REINHARD, H., SCHWARZ, A., TANNER, K., VORLET, M.: Choroby polních rostlin. Praha : Scientia, s.r.o., pedagogické nakladatelství Praha, 1993. 336 s. Hordeum
vulgare
[online].
2006
[cit.
2009-04-18].
Dostupný
z
WWW:
. HRAŠKA, S. et al.: Špeciálna genetika poľnohospodárskych rastlín. Bratislava : Príroda, 1989. 120 s.
45
CHLOUPEK, O. Genetická diverzita, šlechtění a semenářství. Praha : Academia, 2000. 312 s. JAHOOR, A., FISHBECK, G.: Plant breeding. Vol. 110, 1993. Identification of new genes for mildew resistence of barley at the Mla locus in lines derived from Hordeum spontaneum, s. 116-122. Ječmen
[online].
2001
[cit.
2009-02-09].
Dostupný
z
WWW:
. Ječmen obecný Hordeum vulgare [online]. 2007 [cit. 2009-04-18]. Dostupný z WWW: . JEFFREYS, A. J., WILSON, V., THEIN, S. L.: Nature. Vol. 314, 1985. Hypervariable „minisatellite“ regions in human DNA, s. 67-73. JØRGENSEN, J. H. Journal Euphytica. Vol. 63, 1992a. Plant Biology Section, Enviromental Science and Technology Department, s. 141-152. JØRGENSEN, J. H. Plant breeding. Vol. 108, 1992b. Multigene families of powdery mildew resistance genes in locus Mla on barley chromosome 5, s. 53-59. JØRGENSEN, J. H. Coordinator's report: Disease and pest resistant genes. Barley Genetics Newsletter [online]. 1993, no. 22 [cit. 2009-04-08]. Dostupný z WWW: . JØRGENSEN, J. H. Review Plant Science. Vol. 13, 1994. Genetics of powdery mildew resistence in barley, s. 97-119. KAZDA, J., JINDRA, Z., KABÍČEK, J., PROKINOVÁ, E., RYŠÁNEK, P., STEJSKAL, V.: Choroby a škůdci polních plodin, ovoce a zeleniny. Praha : ČZU Praha, 2001. 148 s. KELLER, B., JORDÁN, T.: Evolution and organisation of the resistance gene loci Mla and Pm3 in wheat and barley. In EU BioExploit FP6.: Universitat Zürich, 2005. KLUMPLER, T. Studium polymorfismu DNA markerů využitelných k identifikaci nových genů rezistence ječmene k padlí travnímu, Brno. 2006. 45 s. Masarykova Univerzita Brno. Diplomová práce. KRAIC, J., HORVATH, L., GREGORA, E., ZAK, I.: Rostlinná výroba. Vol. 41, 1995. Standard methods for electrophoretic separation of wheat glutenins and gliadins by SDS-PAGE and A-PAGE, s. 219-223. KUČERA, L., POLÁKOVÁ, K., LEIŠOVÁ, L., OVESNÁ, J.: Přístup k analýze molekulárních dat. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk, 2002. s. 215-218. 46
KŮDELA, V., NOVACKY, A, FUCIKOVSKY, L.: Rostlinolékařská bakteriologie. Praha : ACADEMIE, nakladatelství Akademie věd České republiky, 2002. 347 s. LEIŠOVÁ, L., MINAŘÍKOVÁ, V., KUČERA, V., OVESNÁ, J.: DNA markery v diagnostice houbových patogenů. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk: 2002. s. 71-78. MARSHALL, 1983, In ČURN, V., DOLANSKÁ, L., ENDRYCHOVÁ, V.: Využití bílkovinných markerů v genetice a šlechtění rostlin. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk, 2002. s. 5-14. METAKOVSKÝ, E. V. Journal of Genetic Breeding. Vol. 45, 1991. Gliadin allele identification in common wheat II. Catalogue of gliadin alleles in common wheat, s. 325-344. MITAS, M., YU, A., DILL, J., KAMP, T. L., CHAMBERO, E. J., HAWORTH, I. S.: Nucleic Acids Research. Vol. 23. 1995. Hairpin properties of single-strandet DNA containing a GC-rich triplet repeat: (CTG) 15, s. 1050-1059. MLČOCHOVÁ, L., CHLOUPEK, O., UPTMOOR, R., ORDON, F., TRIEDR, W.: Plant Breeding. Vol. 123, 2004. Molecular analysis of the barley cv. \"Valticky\" and its X-ray-derived semidwarf-mutant \"Diamant\", s. 421-427. MOHAN, M., NAIR, S., BHAGWAT, A., KRISHNA, T. G., YANO, M, BHATIA, C. R., SASAKI, T.: Molecular breeding 3., 1997. Genome mapping, molecular markers and marker-assisted selection in crop plants, s. 87-103. MORI, Y., SATO, Y., TAKAMATSU, S.: Mycoscience. Vol. 41, 2002. Molecular phylogeny and radiation time of Erysiphales interred from nuclear ribosomal DNA sequences, s. 437-447. NEVIMOVÁ, H., BEDNÁŘ, J., VYHNÁNEK, T.: Acta Universitatis Agriculturae et Silviculturae Mendelinae Brunensis. Polymorphism of microsatellite markers on chromosome 3H and 7H in barley genotypes resistant and susceptible to Rhynchosporium secalis.. Brno : MZLU Brno, 2009. s. 69-78. OVESNÁ, J., POLÁKOVÁ, K., LEIŠOVÁ, L.:
Czech Journal of Genetic and Plant
Breeding. Sv. 38, 2002a. Analýza DNA a jejich aplikace v genetice rostlin, s. 29-40. OVESNÁ, J., RULCOVÁ, J., POLÁKOVÁ, K., KUČERA, L., LEIŠOVÁ, L.: DNA markery – současnost a perspektivy. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. 2002b. s. 86-94. 47
PANSTRUGA, R., SCHULZE-LEFERT, P.: Molecular Plant Patology. Vol. 3, 2002. Live and let live: insights into powdery mildew disease and resistance, s. 495-502. PRIGGER, G., BERNARD, M., HABERMAYER, J.: Houbové choroby obilnin, znaky pro včasné rozlišení. Praha : BASF spol. s r.o., 2006. 155 s. PSOTKOVÁ, R. Lokalizace nových genů rezistence k Blumeria graminis f.sp. hordei u Hordeum vulgare pomocí DNA markerů Brno, 2007. 66 s. Masarykova Univerzita Brno. Diplomová práce. Puccinia
hordei
[online].
1999
[cit.
2009-04-18].
Dostupný
z
WWW:
RAFALSKI et al., 1991 In ČURN, V., DOLANSKÁ, L., ENDRYCHOVÁ, V.:
Využití
.
bílkovinných markerů v genetice a šlechtění rostlin. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk : 2002. s. 5-14. RAMSAY, L., MACAULAY, M., IVANISSCHEVICH, S. D., NACLEAN, K., CARDLE, L., FULLER, J., EDWARDS, K. J., TUVESSON, S., MORGANTE, M., MASSARI, M., MAESTRI, E., MARMIOLI, N., SJAKSTE, T., GANAL, M., POWELL, W., WAUGH, R. A.:
Genetics. Vol. 156, 2000. Simple sequence repeat-based linkage map
of barley, s. 1997-2005. REDEI, G. P. Encyclopedic dictionary of genetics, genomics and proteomics. 2003. 1392 s. Rhynchosporiová skvrnitost [online]. 2006 [cit. 2009-02-09]. Dostupný z WWW: b. Rhynchosporiová listová skvrnitost [online]. 2008 [cit. 2009-02-09]. Dostupný z WWW: . Rhynchosporium secalis [online]. 1999 [cit. 2009-04-18]. Dostupný z WWW: . RUSELL, J., FULLER, J., YOUNG, G., THOMAS, B., TARAMINO, G., MACALUAY, M., WAUGH, R., POWEL, W.: Genome. Vol. 40, 1997. Discriminating between barley genotypes using microsatellites markers, s. 442-450. ŘEPKOVÁ, J., RELICHOVÁ, J.: Genetika rostlin. 1. vyd. Brno : MU Brno, 2001. 269 s. SEDLÁŘOVÁ, M. Výuka a studijní materiály – Obecná a speciální fytopatologie. Genetika interakce hostitele a patogena. Olomouc : Přírodovědecká fakulta Univerzita Palackého Olomouc, 2008. 50 s. 48
SHARIFLOU, M. R., HASSANI, M. E., SHARP, P. J.: Plant Breeding. Vol. 120, 2001. A PCR-based DNA marker for detection of mutant and normal alleles of the Wx-Dl gene of wheat, s. 121-124. SHIRASU, K., LAHAYE, T., TAN, M. W., ZHOU, F., AZAVEDO, C., SCHULZE-LEFERT, P.: Cell. Vol. 99, 1999. A novell class of eukaryotic zinc-binding proteins is required for disease resistance signaling in barley and development in C. elegans, s. 355-366. SINGH, R. P., SINGH, U. S.: Molecular Methods in Plant Pathology. Lewis Publisher, 1995. 523 s. SLEZÁKOVÁ, K. Detekce polymorfizmu DNA u genotypů tritikale se zlepšenou pekařskou kvalitou Brno : MZLU Brno, 2008. 65 s. Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně. Diplomová práce. SOZINOV, 1985. In ČURN, V., DOLANSKÁ, L., ENDRYCHOVÁ, V.: Využití bílkovinných markerů v genetice a šlechtění rostlin. In Využití molekulárních markerů v biologii, šlechtění a uchovávání genových zdrojů rostlin. Šumperk : 2002. s. 5-14. STAUB, J. E., SERQUEN, F. C., GUPTA, M.:
Horticulture Science. Vol. 31, 1996.
Genetic markers, map construction, and their application in plant breeding, s. 729-741. Stéblolam
[online].
2006
[cit.
2009-02-09].
Dostupný
z
WWW:
a. TAUTZ, D., TRICK, M., DOVER, G.: Nature. Vol. 322, 1986. Cryptic simplicity in DNA is a major source of genetic variation, s. 652-656. TETUROVÁ, K., ŘEPKOVÁ, J., LÍZAL, P., DREISEITL, A.: Lokalizace nového genu odolnosti k padlí travnímu u Hordeum vulgare ssp. spontaneum pomocí DNA markerů. . In Nové poznatky z genetiky a šľachtěnia pľ´nohospodárských rastlín. Piešťany, Slovenská republika. 2005. s. 42-45. TORNERO, P., MERRITT, P., SADANANDOM, A., SHIRASU, K., INNES, R. W., DANGL, J. L.: The Plant Cell. Vol. 14, 2002. RAR1 and NDR1 Contribute Quantitatively to Disease Resistance in Arabidopsis, and Their Relative Contributions are Dependent on the R Gene Assayed, s. 1005-1015. URBAN, T.: Virtuální svět genetiky 3 – principy genetiky kvantitativních znaků [online]. 2006 [cit. 2009-02-23]. Dostupný z WWW: . 49
Ustilago
nuda
[online].
1999
[cit.
2009-04-18].
Dostupný
z
WWW:
. VANĚK, V., et al. Výživa a hnojení polních a zahradních plodin. 3. dopl. vyd. Praha : Proffi Press Praha, 2002. 132 s. VAPA, L., RADOVIC, D.: Cereal Research. Communications. Vol. 26, 1998. Genetics and molecular biology of barley hordeins, s. 31-38. VĚCHET, L. Rezistence obilnin k chorobám. In Rezistence obilnin k chorobám, odborný seminář 13.11.2008. 2008. s. 10. Výrobky - ječmen setý [online]. 2006 [cit. 2009-02-08]. Dostupný z WWW: <www.probio.cz/vyrobky/jecmen-sety.htm>. WISE, R. P. Genetics . Vol. 153, 2000. The Mla (Powdery mildew) Resistance Cluster Is Associated With Three NBS-LRR Gene Families and Supressed Recombination Within a 240-kb DNA Interval on Chromosome 5S (1HS) of Barley, s. 1929-1948. ZIMOLKA, J., et al. Speciální produkce rostlinná – rostlinná výroba. Brno: MZLU Brno, 2000. 217 s.
50
8. PŘÍLOHY
8.1
Seznam tabulek
Tab. 1
Analyzované odrůdy jarního ječmene
Tab. 2
Složení TBE pufru
Tab. 3
Směs na přípravu PAA gelu (8%)
Tab. 4
Směs na přípravu fixační směsi
Tab. 5
Směs na přípravu vývojové směsi
Tab. 6
Matice pro tvorbu dendrogramu
Tab. 7
Velikost a počet detekovaných produktů
Tab. 8
Statistické vyhodnocení analyzovaných SSR markerů ječmene
Tab. 9
Sekvence použitých primerů
8.2
Seznam obrázků
Obr. 1
Ječmen obecný – Hordeum vulgare
Obr. 2
Ouška s jazýčky ječmene
Obr. 3
Květ ječmene
Obr. 4
výběr z nejzávažnějších chorob ječmene a) Fusarium graminearum, b) Rhynchosporium secalis, c) Puccinia hordei, d) Ustilago nuda, e) BYDV – Barley Yellow Dvarf Virus
Obr. 5
Padlí travní – Blumeria graminis
Obr. 6
Bělavé kupky padlí travního
Obr. 7
Kleisthothecia padlí travního
Obr. 8
Kleisthothecium s askosporami
Obr. 9
Kontrolní elektroforéza
Obr. 10
Elektroforeogram SSR markeru Bmag0405
Obr. 11
Vazebná mapa SSR markerů v sedmi vazebných skupinách
Obr. 12
Dendrogram
51
