AZ AMILÁZ SZEKRÉCIÓ VIZSGÁLATA PATKÁNY PAROTISBAN

Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei

AZ AMILÁZ SZEKRÉCIÓ VIZSGÁLATA PATKÁNY PAROTISBAN DR. BARTA ADRIENN Témavezető: Prof. Dr. Zelles Tivadar Társtémavezető: Prof. Dr. László Ferenc

SemmelweisEgyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Fogorvostudományi Kutatások Ph.D. program Budapest, 2006.

BEVEZETÉS

BEVEZETÉS A nyálmirigyek típusos exokrin mirigyek, az általuk szekretált nyál szerepet játszik az emésztés előkészítésében, valamint a szájüreg és a nyelőcső mucosajának védelmében. A nyálmirigyek – szekréciós rátájuk függvényében – eltérő mértékben járulnak hozzá a szájüregbe kerülő nyál mennyiségéhez és összetételéhez. Így például a nyál amiláz 80 %-át a parotis szekretálja. A parotis nyál fehérjéinek mintegy 30 %-át az α-amiláz adja. Régóta ismert, hogy az amiláz – néhány más emésztőenzimmel (például lipáz és tripszin) együtt – megtalálható a szérumban is. Az emésztőenzimek jelenlétét a vérben sokáig azzal magyarázták, hogy az exokrin szekréció patológiás változásának eredményeként (például gyulladás), vagy véletlen „melléktermékként” kerültek oda. Azonban az emésztőenzimek a vér normál alkotórészei fiziológiás körülmények között is, és számos tanulmány bizonyítja, hogy koncentrációjukat a szérumban fiziológiás mechanizmusok szabályozzák. Az α-amiláz két fő forrása emberben és patkányban egyaránt a parotis és a pancreas. Fiziológiás körülmények között mindkét mirigy juttat amilázt a szérumba: emberben egyenlő arányban, míg patkányban a pancreas jóval kevesebb amilázt szekretál a keringésbe, mint a parotis. Kimutatták, hogy ha a parotis működését stimulálják pilokarpinnal, vagy ha a mirigyet beidegző paraszimpatikus ideget stimulálják, megemelkedik a szérum amiláz aktivitás. Éheztetett állatok táplálékfelvétele során szintén emelkedett a parotis eredetű szérum amiláz szintje. Ugyanakkor sokáig nem ismerték, hogy a nem éheztetett állatokban a spontán táplálás hogyan befolyásolja a szérum izoamiláz szintet. A nyálmirigyek szekrécióját a vegetatív idegrendszer szabályozza, szimpatikus és paraszimpatikus efferensek útján. A szekréció folyamatát azonban egyéb tényezők, például a rágás, a táplálkozás és a hormonok is befolyásolják. Stimuláció hatására a vegetatív idegrendszer közreműködésével az impulzusok eljutnak a nyálmirigyekbe, és a nyáltermelés fokozódik. A szimpatikus (adrenerg) és paraszimpatikus (kolinerg) idegeken keresztül továbbított jel az acinussejtek felé neurotranszmitterek segítségével jut el, melyek a szekréciós válasz első messengerei. A neurotranszmitterek kötődnek a specifikus sejtfelszíni receptorfehérjékhez, mely elindít egy transzdukciós mechanizmust. Ennek során a külső szignál továbbítódik a sejt belseje felé. A nyálmirigyek sejtjeiben a transzdukciónak két fő útvonala létezik: cAMP (ciklikus AMP)-képződés és PIP2 (foszfatidil-inozitol-4,5-bifoszfát)-bontás útján történő transzdukció

2

BEVEZETÉS

Az adrenerg és kolinerg szabályozáson kívül nem adrenerg és nem kolinerg (non-adrenerg és non-cholinerg - NANC) mechanizmusok is befolyásolhatják a szekrétoros sejtek működését. Ismeretes, hogy testünkben a NANC idegek egyik fő mediátora a nitrogén-monoxid (NO), mely a nyálszekréció szabályozásában is részt vesz. A NO igen egyszerű, és az egyik legkisebb súlyú (30 Da) molekula, előállításában azonban egy meglehetősen bonyolult és igen nagy (≈130-160 kDa), enzim, a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) vesz részt. A folyamat során L-argininből NO és L-citrullin keletkezik. A szintézis két külön lépcsőben történik és zavartalan lezajlásához különböző kofaktorokra (NADPH, FAD, FMN, kalmodulin, protoporphyrin IX (hem), tetrahidrobiopterin), valamint oxigénre van szükség. A NOS enzimnek három izoformája ismert, melyek különböző gének termékei. A neuronalis NOS-t (nNOS vagy NOS1) elsőként idegszövetben fedezték fel. Az indukálható (iNOS vagy NOS2) forma különböző hatásokra expresszálódik számos sejtben és szövetben. Az endothelialis (eNOS vagy NOS3) izoformát ér endothelből mutatták ki először. Az nNOS és eNOS nevét az elsőként leírt anatómiai lokalizáció alapján kapta, azóta azonban számos más szövetben – például a nyálmirigyekben - is igazolták jelenlétüket. A NOS1 és NOS3 konstitutív enzimek (cNOS): folyamatosan jelen vannak a sejtben (a citoszólban vagy a sejtpartikulumokban), szemben az indukálható formával. Működésükhöz Ca2+-ot igényelnek, mert a NO-szintézis csak akkor indul be, ha a kalmodulin Ca2+-ot köt meg, és a cNOS-hoz kapcsolódik. Azok a stimulusok tehát, amelyek a citoszól Ca2+-szintjét emelik, NO-szintézist indítanak be. A NO szintézise addig tart, amíg a kalmodulin le nem disszociál az enzimről. A NOS2 (iNOS) nyugalmi körülmények között nincs detektálható mennyiségben jelen a sejtekben, de különböző ingerek (bakterialis toxinok, infekció, citokinek) hatására expresszálódik és a stimulust követő 2-4 órán belül a makrofágokon kívül számos más sejtben, így többek között az érfal és a szív izomsejtjeiben, immunsejtekben és a bélben is megjelenik. Működése független az intracelluláris Ca2+-szinttől, mivel irreverzibilisen köti a kalmodulint. A NO-nak számos hatása ismert, és szerepe van a gastrointestinalis funkció szabályozásában is. Nagyszámú tanulmány vizsgálta a termelődött NO elhelyezkedését és eloszlását a gyomor-bél traktusban, különböző fajokban, beleértve az embert is. NO-termelő helyek (NOS enzim) megtalálhatók a nyálmirigyekben, a nyelőcsőben, a gyomorban, a vékony és vastagbélben, a végbélben, a pancreasban és májban, továbbá epehólyagban és epevezetékben. A NOS eloszlása azonban nagyfokú faj- és szövetspecificitást mutat. Számos

3

BEVEZETÉS

direkt és indirekt módszert dolgoztak ki a sejtekben termelődött NO, valamint az expresszálódott NOS enzim kimutatására, így például NADPH-diaforáz hisztokémia segítségével kimutatták, hogy a NO széles eloszlást mutat a gastrointestinális traktusban, valamint a nyálmirigyekben. A nyálmirigyek acinussejtjeiben termelődött endogén NO kis mérete és lipofil természete miatt könnyen kidiffundál a sejtből, a rövid féléletidő miatt azonban hamar lebomlik, így valószínűsíthető, hogy hatását a környező sejtekre fejti ki. Főbb funkciói a következők: megfelelő vérellátást biztosít a szekréció ideje alatt retrográd messenger (negatív vagy pozitív feedback hatás a szimpatikus és paraszimpatikus idegágak felé) környező szövetek ér és ideg eredetű sejtjeinek differenciálódását szabályozza részt vesz a host defence barrier fenntartásában (mikroorganizmusokkal, tumorsejtekkel szemben) számos kórkép pathogenesisében szerepe van (pl. Sjögrenszindróma, periodontalis kórképek, tumorok) A nyálmirigyek által termelt nyál szerepe igen sokrétű. A nyál egyik fő feladata a szájüreg védelme, egyrészt a szövetek nedvesen tartása, másrészt a mucin (illetve prolindús fehérjék), mint az epithelium felületén ható síkosító közeg szekréciója révén. A nyál antibakteriális hatása révén védelmet nyújt a szájüregen keresztül a szervezetbe elkerülhetetlenül behatoló baktériumokkal szemben is. A nyálelválasztás részleges (sialosis) vagy teljes hiánya, és/vagy a nyálösszetétel megváltozása figyelhető meg egyes nyálmirigyeket érintő gyulladásos betegségekben, mint például a sialadenitis, a Sjögren-szindróma, de az irradiáció is hasonló tünetekkel jár. A csökkent nyáltermelés szájszárazságot okoz (xerostomia). A nyál összetételének változása általában a Na+- és Cl--inok koncentrációjának emelkedését, valamint a PO42--ionok koncentrációjának csökkenését jelenti, illetve egyes kisebb nyálproteinek koncentrációja is megváltozhat. Mindezek a változások diagnosztikus jelentőségűek lehetnek. Mivel a NO is részt vesz a nyálelválasztás szabályozásában, terápiás haszna lehet, ha megértjük, hogy egy szisztémás gyulladás alatt a nyálmirigyekben (pl. parotisban) milyen történések mennek végbe állatmodellekben, és ebben hogyan vesz részt a NO. Szisztémás gyulladás modellezésére jól alkalmazhatók a lipopoliszacharidok (LPS), amelyek képesek gyulladásos választ aktiválni a szövetekben. Az LPS molekula szénhidrát és lipid komponensekből áll, innen származik az elnevezés. Az LPS a Gram-negatív baktériumok külső sejtfalában található molekula, és fontos tényező a bakteriális fertőzések

4

BEVEZETÉS

patofiziológiájában. Az endotoxin számos gyulladásos mediátort aktivál a makrofágokban (monocitákban) és granulocitákban, például különféle citokineket (TNFα (tumor necrosis factor α), IL-1β (interleukin-1β), IL-6 (intelukin-6), IL-8 (interleukin-8)) és a PAF-ot (platelet activating factor). Ezek a molekulák aktiválják a szervezet védekező rendszerét ("host defence system"), amely igyekszik eliminálni a bakteriális infekciót. Kísérleti körülmények között az LPS-t intravénás úton beadva, néhány óra elteltével szisztémás gyulladás jön létre a kísérleti állatokban, ahogy azt már számos szervben leírták. Az LPS hatását a parotisra azonban elsőként munkacsoportunk vizsgálta meg.

5

CÉLKITŰZÉSEK

CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteink célja kettős volt. Először in vivo kísérleti rendszeren megpróbáltuk tisztázni, hogy a normál táplálás befolyásolja-e a parotis eredetű izoamiláz szintet a szérumban. Megnéztük 16 órás éheztetés, éheztetés utáni 1 órás etetés, valamint sötétben történő 2 órás etetés hatását a parotis és szérum amiláz szintjére patkányokban. Másrészt megvizsgáltuk, hogy a különböző farmakológiai és fiziológiai ingerek (5 mg/kg pilokarpin, illetve azonos térfogatú fiziológiás sóoldat) hatására hogyan változik az amiláz aktivitás a parotis szövetben és a szérumban. Másodszor in vitro kísérleti rendszert alkalmazva a NO direkt acinus sejt hatását vizsgáltuk, mivel a NOS enzimek jelenlétét a parotisban többféle eljárás segítségével igazolták, illetve a NO szerepét a nyálmirigyek, így a parotis élettani és kórélettani folyamataiban egyaránt feltételezik. A nagy számú in vivo kísérletek eredményei a NO közvetett, a keringésen keresztül kifejtett hatását mutatják. In vitro kísérletet jóval kisebb számban végeztek, és ezek azt mutatják, hogy a NO közvetlenül is hatással van a parotisra. Az értekezésben tárgyalt vizsgálatok egyik fő célja a NO közvetlen hatásának vizsgálata volt fiziológiás és patológiás körülmények között. Escherichia coli endotoxin (LPS) intravénás alkalmazása után azt vizsgáltuk, hogy a létrejött szisztémás gyulladás hogyan hat a parotis amiláz szekréciójára. A következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Az amiláz szekréció in vivo vizsgálata: 1.1. A normál táplálás befolyásolja-e a parotis eredetű izoamiláz szintet a szérumban? 1.2. A különböző farmakológiai és fiziológiai ingerek hatására hogyan változik az amiláz szint a parotis szövetben és a szérumban? 2. Az amiláz szekréció in vitro vizsgálata: 2.1. Hogyan hat a NO a bazális és stimulált amiláz szekrécióra? 2.2. Hogyan hat az LPS az amiláztermelő acinussejtekre, direkt vagy indirekt úton? 2.3. Mi a NO szerepe az LPS által kiváltott parotis gyulladás során?

MÓDSZEREK

MÓDSZEREK IN VIVO VIZSGÁLATOK Vizsgálatainkat 250-320 g súlyú nőstény Wistar patkányokon végeztük, melyeket egyenként helyeztünk el a ketrecekben, és standard laboratóriumi körülmények között tartottunk, 12 órás világos/sötét ciklusokban. 1.

Kísérleti terv Az 1. kísérletben 16 órás éheztetés után a patkányok (n=20) pilokarpint(5 mg/kg), vagy azonos térfogatú fiziológiás sóoldatot kaptak (sc.). Egy óra elteltével vért vettünk és a parotisokat eltávolítottuk. A 2. kísérletben 18 patkányt használtunk fel. A 16 órás éheztetés után az állatok fele standard laboratóriumi tápot kapott 1 órán keresztül, a másik fele éhezett. Egy óra múlva vért gyűjtöttünk és eltávolítottuk a nyálmirigyeket. A 3. kísérletben 16 állatot osztottunk 2 csoportra. A kísérlet kezdetéig minden állat ad libitum kapott laboratóriumi tápot. Este 7 órakor, a világítás lekapcsolásakor az állatok felétől megvontuk a táplálékot. A másik kísérleti csoport tovább kapta a tápot korlátozás nélkül. Az állatokat 2 órával később, este 9-kor dolgoztuk fel. Minden kísérleti csoportban a kísérlet végén az állatokat Nathiopental anesztéziában (ip., 50 mg/kg) elvéreztettük a vena abdominalis átvágásával, előtte pedig az arteria femoralison keresztül vért gyűjtöttünk.

2.

Elektroforézis Az összegyűjtött vért alvadékképződés után 2500 g-vel centrifugáltuk 4 ºC-on, ezek után a szérumot a felhasználás idejéig -20 ºC-on tároltuk. A minták elektroforézisét 0.9 %-os agaróz gélen végeztük 8.6-os pHjú Veronal pufferben, 80 V feszültséggel. A parotis és pancreas izoformák szétválasztásában segített, hogy 8.6-os pH-n ellentétes töltéssel rendelkeznek. Az amiláz aktivitást a gél megfelelő izoenzim csíkja alapján határoztuk meg.

3.

Amiláz aktivitás meghatározása A szöveti amiláz aktivitás meghatározásához a mirigyeket zsírmentesen eltávolítottuk, majd lemértük, és Tris-pufferben (pH=7.4, 10 mM) homogenizáltuk. A homogenizátumot lecentrifugáltuk és a felülúszót használtuk fel az amiláz aktivitás mérésére. A szövet és a szérum amiláz aktivitását a korábban már leírt (Zelles és mtsai 1986) keményítő-jód színreakció alapján mértük.

7

MÓDSZEREK

Szubsztrátként keményítőt használtunk és az oldatok optikai denzitását 620 nm-en olvastuk le. A keményítő oldat megfelelő hígítási sorát használtuk kalibrációs görbeként. Az enzimaktivitás értékét egységekben adtuk meg. Egy egység (unit) 1 g lebontott keményítőt jelentett, 1 perc alatt. IN VITRO VIZSGÁLATOK 4.

Gyulladás létrehozása a parotisban Kísérleteinkben 200-250 g súlyú hím Wistar patkányokat használtunk. A parotisban a gyulladást Escherichia coli LPS (0111:B4) farokvénába történő iv. adásával (3 mg/kg, fiziológiás sóldatban oldva) váltottuk ki, és a mirigyeket 5 órával később távolítottuk el. Az LPS hatását a parotisra és a létrejövő gyulladásos reakciót a mirigy nedves súly:száraz súly arányának mérésével igazoltuk. A kísérletet megelőzően 4 napig az állatok egy része L-NAME-et (NG-nitro-L-arginin metil-észter, nem szelektív NOS-inhibitor) kapott az ivóvízben (0.1 mg/ml, azaz 10 mg/kg/nap).

5.

NOS enzim aktivitás mérése Meghatároztuk a teljes mirigyben a Ca2+-függő (ilyen a NOS1 és NOS3 izoforma), valamint a Ca2+-független (ilyen a NOS2) NOS aktivitást. A kísérlet alapja, hogy a NOS enzim hatására az L-[14C]-arginin L-[14C]citrullinná alakul át, ahogy azt korábbi közleményekben leírták (Salter és mtsai 1991). Eltávolítás után a szövetet egy EDTA-t tartalmazó pufferben (pH 7.4) homogenizáltuk (250 mg szövet/1 ml). A homogenizátumot 20 percig 10000 g-n, 4 °C-on centrifugáltuk. A felülúszót Dowex gyantával kevertük össze és tovább centrifugáltuk (10000 g, 4 °C). A felülúszókat [14C]L-arginin-t is tartalmazó reakciós pufferrel inkubáltuk. Ezen kívül minden mintához fiziológiás sóoldatot, EGTA-t, vagy NG-nitro-L-arginin-t (L-NNA) mértünk. A reakciót 0.5 ml 1:1 térfogat arányú Dowex:víz elegy hozzáadásával állítottuk le, mely eltávolította a megmaradt L-arginint, mint szubsztrátot. Desztillált víz hozzáadása és 30 perces ülepítés után a felülúszót leszívtuk, és szcintillációs koktél hozzámérése után meghatároztuk a minták radioaktivitását. A protein tartalmat spektrofotometriás esszével határoztuk meg (Bio-Rad Protein Assay). A NOS aktivitást pmol/perc/mg fehérje értékben állapítottuk meg. A teljes NOS aktivitást az in vitro fiziológiás sóval, valamint L-NNA val történt inkubáció során keletkezett citrullin mennyisége jelentette. Ezen belül a Ca2+-

8

MÓDSZEREK

függő cNOS-aktivitást az EGTA-val és az LNNA-val történt inkubáció során kapott aktivitások különbsége adta meg. A Ca2+-független NOS-aktivitást a fiziológiás sóval és az EGTA-val inkubált eredmények különbsége jelentette. 6.

Parotis acinus sejtek izolálása Acinusok izolálására Telbisz és Kovács (1999) korábban leírt és az irodalomban elfogadott módszerét használtuk, kisebb módosításokkal. Az izolált acinus sejteket HEPES-pufferbe helyeztük, majd a kolinerg agonista Ach-nal (10-8-10-4 mol) inkubáltuk 37 °C-on, 30 percig. A kezelés után a mintákat centrifugáltuk és a felülúszót leszívtuk. Végezetül az acinus sejt szuszpenzióhoz Triton-X-et tartalmazó lízis puffert mértünk, melynek hatására a sejtek szétestek.

7.

Immunhisztokémia A frissen izolált acinus sejtekből kimértünk 1 ml szuszpenziót, majd SuperFrost Plus üveglemezekre csapattuk citocentrifuga segítségével (1500 rpm, 5 perc). A sejteket 30 percig PBS-ben oldott 4 %-os paraformaldehiddel fixáltuk, majd 10 perces előinkubációt végeztünk 0.3 % H2O2-ot tartalmazó PBS-ben, az endogén peroxidáz aktivitás blokkolására. Ezek után kimostuk a maradék H2O2-ot, és a nem specifikus kötőhelyeket PBS-ben oldott 7 %-os normál kecske szérum 30 perces hozzáadásával blokkoltuk. Indirekt immunperoxidáz vagy indirekt immunfluoreszcens technikát alkalmaztunk. A sejteket 1 éjszakán át 1:50 hígítású NOS2 monoklonális antitesttel inkubáltuk. PBS-sel történő mosás után a sejteket anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk 2 órán keresztül. Az avidin-biotin komplex reakciót 3'3'-diaminobenzidinnel (DAB) hívtuk elő a gyártó cég előírása alapján. Parallel preparátumokon immunfluoreszcens jelölést készítettünk. Fixálás és mosás után a sejteket primer ellenanyagként NOS2 antitesttel inkubáltuk 1 éjszakán át. A mosások után fluoreszcens-konjugált 1:100 hígítású anti-nyúl IgG-t használtunk szekunder ellenanyagként, ezzel inkubáltunk 2 órán át. A DAB-os preparátumokon Papanicolau-A Haematoxilinnal festést végeztünk, majd csapvízzel mostuk és Aquatex-be ágyaztuk. Az immunfluoreszcens preparátumok beágyazóanyaga Biomedia Gel volt. (Electron Microscopy Sciences, Washington, USA). A fotókat Olympus mikroszkóp és digitális kamera segítségével készítettük. A fluoreszcens preparátumokhoz 488 nm-es szűrőt használtunk. Az eredeti nagyítás 20X-os volt.

9

MÓDSZEREK

8.

Western-blot analízis A teljes parotis szövetet, vagy a frissen izolált acinus sejteket lemértük. Ezek után jéghideg TRIS-mannitol pufferben (pH 7.4) homogenizáltuk. A sejt üledéket centrifugálással csapattuk ki. A teljes protein mennyiség 25 µl-es felülúszóit denaturáltuk. A fehérje minták azonos mennyiségein elektroforézist végeztünk (100 V-on) 7.5 %-os SDS-PAGE gélen. Az elektroforézis után a fehérjét a festetlen gélről elektroforetikus úton nitrocellulóz membránra juttattuk (átblottoltuk). A mintákat 1:2000 hígítású NOS2 egér poliklonális antitesttel jelöltük, majd szintén 1:2000 hígítású, HRP-konjugált másodlagos antitestet használtunk, és az immunoreaktív csíkokat ECL Advance Western Blotting Detection Kit-tel tettük láthatóvá. 9.

Amiláz szekréció meghatározása az izolált parotis acinus sejtekben A minták amiláztartalmának meghatározásához Bernfeld módszerét (1965) alkalmaztuk, kisebb módosításokkal. Az amiláz szubsztrátjaként keményítőt használtunk. Az oldatok absorptioját dinitroszalicilsav színreagens segítségével, 546 nm-en spektrofotométerrel mértük. Standardnek maltóz görbét használtunk. Az eredményeket az amiláz release %-ában adtuk meg. Ezt úgy kalkuláltuk, mint az inkubációs közeg (felülúszó) amiláz aktivitása, valamint a total amiláz (felülúszó+sejtszuszpenzió) aktivitás közötti arány.

STATISZTIKAI VIZSGÁLATOK A kísérleteink során nyert eredményeket az átlag ± standard hiba (mean ± S.E.M) formában fejeztük ki. Statisztikai értékelésre a variancia-analízist (ANOVA), a Mann-Whitney non-parallel U-tesztet valamint a Tukey-Kramer többszörös összehasonlító tesztet alkalmaztuk.

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS IN VIVO VIZSGÁLATOK Az elektroforézis során a parotis amiláz, illetve a szérum parotis izoamiláz azonos irányba, míg a pancreas amiláz izoenzim az ellentétes irányba mozgott. Megfigyeléseink megegyeznek korábbi vizsgálatok eredményeivel, melyekben azt is kimutatták, hogy patkányban a szérum amiláz döntő hányada parotis eredetű. A szérum parotis izoamiláz szintje nem éheztetett patkányokban 5,78±0,79 U/l volt (n=10). A 16 órán keresztül éheztetett állatokban ez az érték kissé csökkent, 4,10±0,68 U/l-re (n=10; p<0,01). Kísérleti körülményeink között parotis szöveti amiláz aktivitás 5,00±0,94 U/100 mg volt, nem éheztetett patkányokban (n=10). 16 órás éhezés hatására ez 7,69±1,52 U/100 mg-ra nőtt (n=10; p<0,01). Első kísérletünkben a pilokarpin, egy paraszimpatikus ágens hatását vizsgáltuk. 1 órával a pilokarpin beadása után a a parotis amiláz aktivitás csökkent (39±9 %-kal, n=20; p<0,01), míg a szérum enzimaktivitás nőtt (101±39 %-kal, n=20; p<0,01). Eredményeink megegyeznek korábbi vizsgálatok eredményeivel. A következő kísérletben az etetés hatását vizsgáltuk az éheztetett állatokra. A 16 órán keresztül éheztetett patkányokban az 1 órás etetés hatására a parotisban 35±15 %-kal (n=18; p<0,01) csökkent, míg a szérumban 41±17 %-kal (n=18; p<0,05) nőtt az amiláz aktivitás. Végül a táplálékfelvétel hatását vizsgáltuk a parotis és a szérum amiláz szintjére a sötét periódus első két órájában. Ebben az időszakban a patkányok nagyobb mennyiségű táplálékot vesznek magukhoz, míg a világos időszakban csak kevés tápot fogyasztanak. Ezen kísérleti körülmények között, a spontán táplálékfelvétel első két órájában az amiláz szint 27±7 %-kal (n=16; p<0,01) csökkent, a szérum amiláz koncentráció pedig 16±1 %-kal (n=16; p<0,05) nőtt. Vizsgálataink mutatták ki először, hogy az amiláz szintje a parotisban és a szérumban a napi spontán táplálékbevitel által szabályozott. Ad libitum táplált patkányokban, a sötét periódus első óráiban (amikor az állatok napi táplálékuk nagy részét megeszik) a nyálmirigyben csökken, míg a szérumban nő a parotis izoamiláz szint. Ez az egyidejű, ugyanakkor ellentétes irányú változás arra utal, hogy a táplálékfelvétel olyan idegi és hormonális szabályozó útvonalakat aktivál, amelyek az amiláznak a parotisból a szérumba jutásához vezetnek.

11

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

IN VITRO VIZSGÁLATOK 1. A NOS2 expressziója, endotoxin alkalmazása után Az endotoxint (LPS) intravénásan alkalmaztuk, 3 mg/kg koncentrációban, 5 órával a kísérlet kezdete előtt. A létrejött gyulladás során a kísérleti állatok, valamint a nyálmirigyek nedves súlya, illetve amiláz tartalma nem változott. A száraz súly azonban jelentős eltérést mutatott, és mi a nedves és száraz súly közötti ratiot adtuk meg, mint a gyulladás során létrejövő ödémára jellemző indexet, ami 86,8±0,4%-ról 90,2±0,5%-ra nőtt (n=10). A citrullin-esszét alkalmazva azt találtuk, hogy az LPS szignifikánsan növelte a totál NOS aktivitást (1,38±0,08-ról 1,77±0,10-re, pmol/perc/mg fehérjében megadva, n=7, p<0,05) a teljes mirigyben. Ez a változás a Ca2+független NOS2 aktivitásának emelkedését jelentette (0,022±0,008-ről 0,214±0,045-re, pmol/perc/mg fehérjében megadva, n=7, p<0,05), mivel a Ca2+függő cNOS-aktivitás nem változott (1,36±0,11 és 1,53±0,05 pmol/perc/mg fehérje, LPS kezelés előtt és után, n=7). Ezek után immunhisztokémiai módszerrel is megvizsgáltuk a NOS2 aktivitását az izolált parotis acinus sejtekben. Az immunfluoreszcens festék intenzitása szignifikánsan nagyobb volt az LPS-kezelt sejtekben, a kontrollhoz képest. A Western-blot analízis is erőteljes NOS2 fehérje expressziót jelzett a parotisban a kontrollhoz képest, LPS alkalmazása után mind a patkány parotis szövetben, mind az izolált acinus sejtekben. A patkány teljes parotis szövetét, valamint izolált acinus sejteket használva eredményeink megegyeznek azon megfigyelésekkel, melyek szerint az LPS a NOS2 expresszióját okozza 5 óra elteltével. 2. Az acinussejtek amiláz szekréciója, endotoxin alkalmazását követően Ach-nal (10-8-10-4 mol) történő 30 perces in vitro inkubáció hatására az izolált patkány parotis acinus sejtekben dózisfüggő módon nőtt az amilázszekréció. Szisztémás LPS-kezelés hatására csökkent mind a bazális, mind az Achnal stimulált amiláz szekréció az izolált parotis acinus sejtekben (55±10 %-kal, illetve 49±6 %-kal (10-6 mólos Ach koncentráció, n=5-7, p<0,01). Az in vivo alkalmazott NOS-inhibitor L-NAME nem befolyásolta szignifikánsan sem a

12

EREDMÉNYEK ÉS MEGBESZÉLÉS

bazális, sem az Ach-nal stimulált amiláz szekréciót, és az LPS gátló hatását sem befolyásolta. Eredményeink megerősítik a korábbi vizsgálatok eredményeit, miszerint endotoxin szisztémás vagy helyi alkalmazása után az amiláz szekréció csökken a különböző nyálmirigyekben (parotis és submandibularis nyálmirigy) és különböző fajokban (patkány, egér). Mivel ezeket a vizsgálatokat a teljes mirigyen, illetve szövetszeleteken végezték, így arra nem adhattak választ, hogy az LPS sejt szinten direkt vagy indirekt módon csökkenti az amiláz kiválasztást. Eredményeink azt mutatják, hogy a parotis acinus sejtekben az LPS indirekt mechanizmus révén csökkenti az amiláz szekréciót. Ugyanis a patkány parotis acinus sejteken végzett kísérleteink azt mutatták, hogy az L-NAME in vivo nem hatott a bazális és acetil-kolinnal stimulált amiláz szekrécióra, és az LPS hatását sem befolyásolta. In vitro kísérleteink eredményeit összegezve elmondhatjuk, hogy az endotoxin gyengíti a nyál barrier funkcióját a behatoló baktériumokkal szemben azáltal, hogy csökkenti a nyálszekréciót a parotisban az acinus sejtek szintjén. Ugyanakkor a bazális és az Ach-nal kiváltott vagy LPS-sel csökkentett amiláz-szekréciót a nem szelektív NOS-inhibitor L-NAME nem befolyásolja. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy fiziológiás és patológiás körülmények között a NO nem direkt módon szabályozza a bazális és Ach-nal stimulált amiláz szekréciót a patkány parotis acinus sejtben

13

KÖVETKEZTETÉSEK

KÖVETKEZTETÉSEK In vivo kísérleteinkkel megállapítottuk, hogy a spontán táplálékfelvétel szabályozza a parotis szövet amiláz tartalmát és a szérum amiláz szintjét. A parotis amiláz tartalom, illetve a szérum amiláz aktivitás inverz változása táplálkozás hatására a parotis acinus sejt endokrin típusú szekréciós tevékenységére utalhat spontán táplálékfelvétel során. In vitro vizsgálataink eredményeiből arra a következtetésre juthatunk, hogy a NO sem fiziológiás, sem patológiás körülmények között nem rendelkezik direkt hatással a parotis acinus sejt amiláz szekréciójára. A bakteriális endotoxin indirekt módon csökkenti a parotis acinus sejt amiláz kiválasztását, s egyúttal aktiválja a NOS2 izoenzimet úgy szöveti, mint acináris szinten. A NOS-indukció által termelt többlet NO azonban nem hat a parotis acinus sejt amiláz kiválasztására.

14

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akikkel eddigi pályám során volt szerencsém megismerkedni és együtt dolgozni. Mindenek előtt köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Zelles Tivadarnak, az Orálbiológiai Tanszék volt igazgatójának, valamint Dr. Simon Györgynek, akik elindítottak a tudományos pályán. Szeretnék köszönetet mondani társtémavezetőmnek, Dr. László Ferencnek, aki felbecsülhetetlen szakmai és baráti segítséget nyújtott. Kiváló tudóst és embert ismerhettem meg személyében. Külön köszönetet szeretnék mondani Dr. Varga Gábornak, aki az MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetében és az Orálbiológiai Tanszéken biztosította számomra a lehetőséget a tudományos munkára, segített a kutatási téma kiválasztásában és ráirányította figyelmemet a kutatómunka szépségeire. Ugyanakkor köszönettel tartozom jelenlegi munkahelyem, a Gyermekfogászati és Fogszabályozási Klinika igazgatójának, Dr. Tarján Ildikónak a támogatásért és a bátorító szavakért. Rendkívüli munkabírása és humánuma nagy hatással volt rám munkám során. Külön szeretném köszönetemet kifejezni az Orálbiológiai Tanszék dolgozóinak, akik mindig készségesen segítettek a felmerülő problémák megoldásában. Végül köszönöm családom segítségét, támogatását, türelmét és főként szeretetét, melyből nap, mint nap erőt meríthetek.

15

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK I.

Barta A, Tarján I, Kittel Á, Horváth K, Pósa A, László F, Kovács A, Varga G, Zelles T, Whittle BJR: Endotoxin can decrease isolated rat parotid acinar cell amylase secretion in a nitric oxide-independent manner. Eur J Pharmacol 524: 169-173, 2005. IF: 2,432

II.

Nagy Á, Barta A, Varga G, Zelles T: Changes of salivary amylase in serum and parotid gland during pharmacological and physiological stimulation. J Physiol Paris 95: 141-145, 2001. IF: 0,862 ÖSSZ IF: 3,294

16