AZ AMILÁZ SZEKRÉCIÓ VIZSGÁLATA PATKÁNY PAROTISBAN

Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Fogorvostudományi Kutatások Ph.D. program

AZ AMILÁZ SZEKRÉCIÓ VIZSGÁLATA PATKÁNY PAROTISBAN Doktori (Ph.D.) értekezés

Készítette: Dr. Barta Adrienn egyetemi tanársegéd

Témavezető: Prof. Dr. Zelles Tivadar Társtémavezető: Prof. Dr. László Ferenc Budapest, 2006. Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Gera István egyetemi tanár Prof. Dr. Boros Ildikó egyetemi tanár Dr. Kelentey Barna egyetemi adjunktus Hivatalos bírálók: Dr. Lohinai Zsolt egyetemi adjunktus Dr. Varga Csaba egyetemi docens

TARTALOMJEGYZÉK

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK* ___________________________________________________________ 4 BEVEZETÉS, A SZAKIRODALOM ÁTTEKINTÉSE _____________________________ 6 A NYÁLMIRIGYEK ANATÓMIÁJA__________________________________ 6 BEIDEGZÉS _______________________________________________________ 8 A NYÁL ÖSSZETÉTELE ____________________________________________ 9 AZ AMILÁZ ______________________________________________________ 10 A SZEKRÉCIÓ ___________________________________________________ 12 A SZEKRÉCIÓ MECHANIZMUSA __________________________________ 16 A NITROGÉN-MONOXID (NO) _____________________________________ 19 A NITROGÉN-MONOXID SZINTÉZISE _____________________________ 20 A NITROGÉN-MONOXID HATÁSAI ________________________________ 22 A NITROGÉN-MONOXID LOKALIZÁCIÓJA NYÁLMIRIGYEKBEN ___ 24 A NITROGÉN-MONOXID ÉS A SZEKRÉCIÓ KAPCSOLATA __________ 26 A NYÁL SZEREPE A GYULLADÁSBAN _____________________________ 28 CÉLKITŰZÉSEK _________________________________________________________ 32 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK _______________________________________________ 33 ANYAGOK _______________________________________________________ 33 KÍSÉRLETI ÁLLATOK ____________________________________________ 33 MÓDSZEREK ____________________________________________________ 33 IN VIVO VIZSGÁLATOK _________________________________________ 33 1. Kísérleti terv _____________________________________________________ 2. Elektroforézis ____________________________________________________ 3. Amiláz aktivitás meghatározása ______________________________________ 4. Gyulladás létrehozása a parotisban____________________________________ 5. NOS enzim aktivitás mérése ________________________________________ 6. Parotis acinus sejtek izolálása _______________________________________ 7. Immunhisztokémia ________________________________________________ 8. Western-blot analízis ______________________________________________ 9. Amiláz szekréció meghatározása az izolált parotis acinus sejtekben__________

33 34 34 35 36 37 38 39 39

STATISZTIKAI VIZSGÁLATOK____________________________________ 40 EREDMÉNYEK __________________________________________________________ 41 IN VIVO VIZSGÁLATOK ___________________________________________ 41 1. Az éheztetés hatása a parotis és szérum izoamiláz enzim aktivitásra __________ 41 2. A táplálákfelvétel hatása a parotis és szérum izoamiláz enzim aktivitásra ______ 41

TARTALOMJEGYZÉK

IN VITRO VIZSGÁLATOK __________________________________________ 43 1. A NOS2 expressziója, endotoxin alkalmazása után ________________________ 43 2. Az acinussejtek amiláz szekréciója, endotoxin alkalmazását követően _________ 47 MEGBESZÉLÉS __________________________________________________________ 48 KÖVETKEZTETÉSEK _____________________________________________________ 56 GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG ______________________________________ 57 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS_________________________________________________ 59 IRODALOMJEGYZÉK_____________________________________________________ 60 AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK_____________________ 76 ÖSSZEFOGLALÁS________________________________________________________ 77 SUMMARY ______________________________________________________________ 78

3

RÖVIDÍTÉSEK

RÖVIDÍTÉSEK* AC

adenilát cikláz

Ach

acetil-kolin

BSA

bovin szérum albumin

Ca2+

kalcium

cAMP

ciklikus adenozin-monofoszfát

cGMP

ciklikus guanozin-monofoszfát

Cl-

klór

cNOS

konstitutív nitrogén-monoxid szintáz enzim

COX2

ciklooxigenáz 2 enzim

Da

dalton

DAB

diamino-benzidin

DAF-2

4,5-diamino-fluoreszcein

DNS

dezoxi-ribonukleinsav

EDRF

endothelium-derived relaxing factor

EDTA

etiléndiamin-tetraecetsav

EGTA

etilénglikol-bisz(α-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraecetsav

eNOS (NOS3)

endothelialis nitrogén-monoxid szintáz enzim

-

F

fluorid

FAD

flavin-adenin-dinukleotid

FMN

flavin-mononukleotid

HCO3-

hidrogén-karbonát

HRP

horseradix peroxidase = tormaperoxidáz

H2O2

hidrogén-peroxid

H4BP

tetrahidrobiopterin

IgG

immunglobulin-G

iNOS (NOS2)

indukálható nitrogén-monoxid szintáz enzim

ip.

intraperitoneális

IP3

inozitol trifoszfát

iv.

intravénás

K+

kálium

BEVEZETÉS

kDa

kilodalton

LBP

LPS binding protein

L-NAME

NG-nitro-L-arginin metil-észter

L-NNA

NG-nitro-L-arginin

LPS

lipopoliszacharid

Na +

nátrium

NADPH

nikotinsavamid dinukleotid-foszfát

NADPHd

nikotinsavamid dinukleotid-foszfát diaforáz

NANC

non-adrenerg és non-cholinerg

NO

nitrogén-monoxid

NOS

nitrogén-monoxid szintáz enzim

nNOS (NOS1)

neuronális nitrogén-monoxid szintáz enzim

p

valószínűségi érték

PAR

proteináz-aktivált receptor

PB

perfusion buffer

PBC

perfusion buffer concentrate

PBS

phosphate buffered saline

PGE2

prosztaglandin E2

PIP2

foszfatidil-inozitol-4,5-bifoszfát

PO4

2-

foszfát

SB

suspension buffer

SBC

suspension buffer concentrate

sCD14

solubilis CD14

sc.

subcutan

SDS

sodium dodecile sulphate

sGC

solubilis guanilát-cikláz enzim

TLR4

Toll-like receptor 4

* Rövidítések és latin szavak: Brencsán orvosi szótár szerint. Medicina Könyvkiadó, 1998.

5

BEVEZETÉS

BEVEZETÉS, A SZAKIRODALOM ÁTTEKINTÉSE A NYÁLMIRIGYEK ANATÓMIÁJA A nyálmirigyek típusos exokrin mirigyek, az általuk termelt nyál szerepet játszik az emésztési folyamat előkészítésében, valamint a szájüreg és a nyelőcső mucosajának védelmében. Ezek a mirigyek nagyon hasonlítanak az egyik legtöbbet vizsgált exokrin mirigyhez, a pancreashoz, mégsem kaptak akkora figyelmet a kutatás területén. A hasnyálmirigy jelentős homogenitást mutat a nyálmirigyekkel mind morfológiailag, mind funkcióját tekintve. A nyálmirigyeket azonban emlősökben nagyfokú diverzitás jellemzi lokalizáció, fejlődés, mikroszkopikus szerkezet, valamint funkció tekintetében nemcsak az egyes fajok között, hanem fajon belül is. Ezek a tulajdonságok jelentősen megnehezítik a nyálmirigyek vizsgálatát, ugyanakkor kutatásuk a tudomány jóval szélesebb területeit öleli fel, mint a pancreas esetében. A nyálmirigyeket méretük alapján nagy és kis nyálmirigyekre csoportosíthatjuk. A legtöbb emlős faj 3 pár nagy nyálmiriggyel rendelkezik: fültőmirigy (glandula parotis), állkapocs alatti mirigy (glandula submandibularis) és nyelv alatti mirigy (glandula sublingualis). A néhány száz (>600) kis vagy járulékos nyálmirigyet lokalizációjuk szerint nevezték el és többnyire az ajak, bucca, nyelv, palatum és a sublingualis tájék submucosajában találhatók. Morfológiailag a nyálmirigyek ductusrendszerből és acinusokból állnak. A ductusrendszer és a kiválasztást végző acinusok mentén kötőszövet található, amely a mirigyparenchymát lebenyekre és lebenykékre tagolja. A kötőszövet egyrészt megtámasztja a mirigyállományt, másrészt a mirigyet ellátó ereket és idegeket tartalmazza. A ductusrendszer a fő kivezetőcsővel (ductus excretorius) kezdődik, mely az oralis mucosaba nyílik. A mirigy belseje felé haladva kisebb extralobularis (vagy interlobularis) ductusokra tagolódik, melyek a lebenyek közötti kötőszövetben haladnak. Hámbélésük a ductusok tagolódásával többrétegű laphámból többrétegű hengerhámmá alakul, mely fokozatosan egyrétegűvé válik. Ezek ágai már a lebenyeken belül találhatók (ductus intralobularis) és ductus striatusnak hívják őket, ugyanis a ductust bélelő hengerhámsejtek a bázisra merőleges csíkolatot mutatnak. Ennek oka a bazális membrán betüremkedése, mely jelentősen növeli a felületet. A ductusrendszer 6

BEVEZETÉS

legdistalisabb elemei az intercalaris ductusok, melyek falát lap- vagy köbhámsejtek bélelik. Ezek a sejtek kevésbé differenciáltak, mint a mirigy többi sejtje, és a ductusok, valamint az acinusok prekurzor sejtjeinek tekinthetők, bár a szekrécióban betöltött csekély szerepüket is igazolták. A parotistól és a glandula submandibularistól eltérően a sublingualis nyálmirigynek nincsen elágazó ductusrendszere. Ehelyett számos (8 és 20 között) különálló ductusa nyílik közvetlenül a szájüregbe vagy a ductus submandibularisba. Az acinussejtek piramis alakúak és gömbszerű acinust alkotnak, körülvéve a központi lument, ahová a szekrétum kiválasztása történik. A primer nyál termelését végző acinussejtek festődés, valamint a granulumok mérete alapján kétfélék lehetnek. A hematoxilin-eozin festéssel halványkékre festődő (basophil plazma miatt) serosus sejtek kisebb granulumokat tartalmaznak és sok riboszómát, ennek megfelelően híg, fehérjedús szekrétumokat termelnek. A rózsaszínre festődő (eosinophil) mucinosus sejtek sűrű, nyálkás váladékot termelnek és szekréciós vesiculáik hatalmas méretűek. A kevert acinusokban mindkét sejttípus előfordul, a mucinosus sejtek helyezkednek el a kivezetőcsőhöz közelebb, a serosus sejtek pedig félhold alakban körülveszik őket (Gianuzzi-féle félhold) (Lerner és mtsai 1991). Myoepthelialis sejtek is jelen vannak a nyálmirigyekben, főként az acinusok és az intercalaris ductusok környékén. Mind a szimpatikus, mind a paraszimpatikus idegrendszerből kapnak idegágakat. Ezek a sejtek kosárhoz hasonlóan veszik körül az acinussejteket, és összehúzódásukkal elősegítik a szekrétum kiürülését. Még fontosabb szerepük azonban az acinusok védelme a kitágulással szemben, ami a könnyen bekövetkezhetne a szekréció ideje alatt, a nagy intraluminalis nyomás miatt (Cook és mtsai 1994) (1. ábra). A nyálmirigysejtek mind szerkezetileg, mind funkcionálisan polarizáltak, és így a membrán is két részre osztható. Az apikális membrán a lument határolja, míg a bazolaterális membrán a sejtek közötti tér, illetve a capillarisok felé néz. A nyálmirigyeket a termelt szekrétum alapján 3 csoportra oszthatjuk. A parotis hasonlóan a pancreashoz - tisztán serosus mirigy. A glandula submandibularis és sublingualis kevert típusú mirigyek, az előbbi serosus, míg az utóbbi inkább mucinosus túlsúllyal. A submandibularis nyálmirigyek dimorfizmusa figyelhető meg számos állatfajban, például a disznóban vagy a rágcsálókban. Hím disznóban az acinusok 7

BEVEZETÉS

többnyire serosus jellegűek és többek között egy androsteron nevű feromont szintetizálnak, amely nagy mennyiségben termelődik a párzás ideje alatt. Ugyanakkor a nőstény disznók submandibularis acinusai jórészt mucinosusak (Cook és mtsai 1994).

1. ábra Az acinusok és a ductusrendszer egyszerűsített vázlata nyálmirigyben (Nagy 2000) BEIDEGZÉS A nyálmirigyek működését a vegetatív idegrendszer szabályozza, szimpatikus és paraszimpatikus efferensek útján. A

szimpatikus

praeganglionalis

rostok

a

gerincvelő

felső

mellkasi

szegmentumainak (Th1-3) oldalszarvából indulnak ki, majd a felső nyaki ganglionban (ganglion cervicale superior) átkapcsolódnak, és az erekkel együtt haladva érik el a nyálmirigyeket. A paraszimpatikus rostok a nucleus salivatorius superiorból és inferiorból lépnek ki, és a nyálmirigyekhez közeli magvakban kapcsolódnak át. A glandula parotishoz futó rostok

az

alsó

magból

(nucleus

salivatorius

inferior)

kiindulva

a

nervus

glossopharyngeusszal jutnak el a ganglion oticumba, ahol átkapcsolódás után már a nervus auriculotemporalisszal együtt haladva érik el a mirigyet. A glandula submandibularis és sublingualis felé futó rostok a nucleus salivatorius superiorból 8

BEVEZETÉS

indulnak és a nervus facialisszal jutnak el a submandibularis ganglionba, onnan pedig átkapcsolódás után, a mirigyekhez. A paraszimpatikus idegek kolinergek, ingerlésükre (vagy a nyálmirigy arteriájába acetil-kolint (Ach) fecskendezve) bőséges, híg nyál elválasztása és értágulás jelentkezik. A paraszimpatikus ingerlésnek trophicus hatása is van a mirigyszövetre. A szimpatikus (adrenerg) rostok ingerlése (például noradrenalinnal) a mirigyben vasoconstrictiot és kevés, nagyobb szárazanyagtartalmú viscosus nyál elválasztását idézi elő. Ezen idegek szerepét a reflexes nyálelválasztásban (például étkezések alatt) jól bizonyítják a kísérleti állatokon végzett denervációs vizsgálatok. Az

acinussejtek

beidegzése

mind

szimpatikus,

mind

paraszimpatikus

idegágakkal bőséges. Mind a két ideg ellátja gyakorlatilag az összes acinussejtet. A nyálmirigyeket ellátó idegek azonban nemcsak a szekrétoros, hanem a kontraktilis elemekkel – myoepithelialis sejtekkel – is kapcsolatban állnak, ugyanis nyálelválasztás során ez utóbbi sejtek kontrahálnak, így egyrészt védik az acinus sejteket, másrészt elősegítik a nyál ürülését (Garrett és Emmelin 1979). Emmelin feltételezése szerint egyetlen axon kapcsolatban áll az acinussejtekkel, myoepithelialis sejtekkel, és vérerekkel is (paraszimpatikus ideg esetében) (Emmelin 1987). Mindkét típusú neurotranszmitter, az Ach és a noradrenalin is gyorsan lebomlik, az acinussejtek membránjában található kolinészterázok, valamint a nyálmirigyekben kimutatott monoamin-oxidázok révén (Ferguson 1999). A NYÁL ÖSSZETÉTELE A nyál összetétele nem egyezik a plazma ultrafiltrátumáéval, mivel a hidrogén-, klorid-ionok, a glükóz és más komponensek koncentrációja eltérő (Baum 1993). A nyál túlnyomórészt (99 %-ban) vízből áll. A fennmaradó rész nagyobb (fehérjék, glikoproteinek, lipidek) és kisebb méretű szerves molekulákból (urea, glükóz), illetve elektrolitokból (nátrium (Na+), kalcium (Ca2+), klorid (Cl-), foszfát (PO42-), hidrogén-karbonát (HCO3-), fluorid (F-)) tevődik össze. A szerves anyagokat általában az acinussejtek termelik, kis részük a ductusból származik, vagy a vérből jut be a nyálba. A nyálmirigyek – szekréciós rátájuk függvényében – eltérő mértékben járulnak hozzá a szájüregbe kerülő nyál mennyiségéhez és összetételéhez. Így például a nyál 9

BEVEZETÉS

amiláz 80 %-át a parotis szekretálja (Nederfors és mtsai 1994), az acinussejtek révén. Jól bizonyítják ezt Kurahashi munkacsoportjának vizsgálatai, ahol a kísérleti állatok parotisának ductusát lekötötték. Táplálkozás hatására az operált állatoknál sem a szérum, sem a parotis amilázaktivitása nem változott, míg a kontroll állatok esetében a szérumban nőtt, a parotisban csökkent az amiláz aktivitás (Kurahashi és Inomata 1999b). Minimális mennyiségű amiláz megtalálható a glandula submandibularisban és sublingualisban is, de feltehetően ez is parotis eredetű. Ezt igazolták azok a kísérletek, melyekben bizonyítást nyert, hogy a kolinerg agonista pilokarpin adását követően a megnövekedett amilázaktivitás a glandula submandibularisban és sublingualisban a parotis szekréciójának eredménye (Ikeno és mtsai 1982). AZ AMILÁZ Az amiláznak 2 típusa létezik, az egyik az α-amiláz, vagy más néven endoamiláz, amely egyaránt megtalálható baktériumokban, gombákban, hüvelyes növényekben, állatokban és az emberben. A másik típus a β-amiláz, vagy exoamiláz csak növényekben fordul elő. A humán α-amiláznak 2 típusát ismerjük, a bioszintézis helye alapján. Az egyik a pancreas eredetű α-amiláz, a másik a parotis eredetű α-amiláz. Mára már nemcsak mindkét enzimnek, hanem a kódoló géneknek a szerkezetét is pontosan ismerjük (Nishide és mtsai 1986, Horii és mtsai 1987). Újabb vizsgálatok kimutatták, hogy létezik egy kevésbé ismert 3. típus is: a tumor-asszociált α-amiláz, melyet egy ritka tüdőkarcinómában mutattak ki (Tomita és mtsai 1989, Yokouchi és mtsai 1990). Mindhárom enzimet külön gén kódolja, Amy 1, Amy 2A és Amy 2B néven. Az előbbieken kívül az amiláz előfordul számos más szövetben is, így például jejunumban, májban, placentában, vázizomzatban, herében és lépben, bár 100-1000-szer kisebb koncentrációban (Whitten és mtsai 1988). Állatokban az α-amiláz megjelenéséért fajtól függően 2 vagy 3 gén felelős, és az enzim ugyancsak megtalálható többféle szervben. Így például patkányban elsősorban a parotisban és a pancreasban fordul elő, de ezen kívül májban, bélben, gyomorban, herében és a vázizomzatban is kimutatták az α-amiláz jelenlétét (Janowitz és Dreiling 1959, Hokari és mtsai 2003).

10

BEVEZETÉS

A humán parotis és pancreas eredetű izoamiláz egyetlen, 496 aminosavat számláló polipeptidláncból áll, és a 2 típus 97 %-os homológiát mutat (Nishide és mtsai 1986). Mindkét típus számos izoenzimet tartalmaz, melyeket gélelektroforézissel különítettek el (Keller és mtsai 1971). A parotis nyálban a fehérjék mintegy 30 %-át az α-amiláz adja. Az α-amiláz 5560 kDa súlyú molekula, és a keményítő és glikogén α-1,4-glikozidos kötéseit bontja, melynek eredményeképpen maltóz, maltotrióz és maltodextrin keletkezik (Karn és Malacinski 1978). Az enzim pH=6 felett működik, ezért a gyomorban, annak savas pHja miatt többnyire inaktiválódik. A hatóidő tehát igen rövid a szájüregben, bár az amiláz a fogakon maradt keményítőt étkezések után is képes emészteni. Ez a hatás azonban kariológiai szempontból kedvezőtlen, mivel az így keletkezett diszacharidok szubsztrátként szolgálnak a szájüreg baktériumainak. Régóta ismert, hogy az amiláz – néhány más emésztőenzimmel (például lipáz és tripszin) együtt – megtalálható a szérumban is (Fridhandler és mtsai 1974, Ryan és Appert 1975, Levitt és mtsai 1977, Isenman és mtsai 1999). Az α-amiláznak 2 típusát (pancreas és parotis eredetű) is kimutatták a humán szérumban. Az emésztőenzimek jelenlétét a vérben sokáig azzal magyarázták, hogy az exokrin szekréció patológiás változásának eredményeként (például gyulladás), vagy véletlen „melléktermékként” kerültek oda. Egybevág ezzel az a tény is, hogy az emésztőenzimek növekvő koncentrációja a szérumban általános jelenség és fontos diagnosztikus faktor a különböző gyulladásos betegségekben, mint például acut pancreatitis és mumpsz (Leclerc és Forest 1982, Levitt és Eckfeldt 1986, Scully és mtsai 1981). Azonban az emésztőenzimek a vér normál alkotórészei fiziológiás körülmények között is, és számos tanulmány bizonyítja, hogy koncentrációjukat a szérumban fiziológiás mechanizmusok szabályozzák (Isenman és mtsai 1999). Az α-amiláz két fő forrása emberben és patkányban egyaránt a parotis és a pancreas (Karn és Malacinski, 1978). Fiziológiás körülmények között mindkét mirigy juttat amilázt a szérumba: emberben egyenlő arányban (O'Donnell és mtsai 1977), míg patkányban a pancreas jóval kevesebb amilázt szekretál a keringésbe, mint a parotis (Proctor és mtsai 1991). Szintén kimutatták, hogy ha a parotis működését stimulálják pilokarpinnal (Ikeno és mtsai 1988, Ikeno és mtsai 1982) vagy ha a mirigyet beidegző paraszimpatikus ideget stimulálják (Proctor és mtsai 1989), megemelkedik a szérum 11

BEVEZETÉS

amiláz aktivitás. Éheztetett állatok táplálékfelvétele során szintén emelkedett a parotis eredetű szérum amiláz szintje (Proctor és mtsai 1990). Ugyanakkor sokáig nem ismerték, hogy a nem éheztetett állatokban a spontán táplálás hogyan befolyásolja a szérum izoamiláz szintet. A SZEKRÉCIÓ A különböző nyálmirigyek eltérő mértékben vesznek részt a szekrécióban. A kis nyálmirigyek folyamatosan, aktívan szekretálnak és a nagy nyálmirigyekre ható stimulusok csak kis mértékben hatnak szekréciójukra. A glandula submandibularis és sublingualis szintén folyamatosan szekretál, de alacsony szinten. Stimuláció hatására azonban a szekréció 10-20-szorosára nő. A parotis szekréciója nyugalomban elhanyagolható (nem mérhető), míg stimuláció alatt a nyál nagy részének szekréciójáért felelős. Így elmondható, hogy a nyugalmi nyál összetétele leginkább a glandula submandibularis, míg a stimulált nyál többnyire a parotis által termelt nyál összetételére hasonlít (Ferguson 1999). Az acinussejtek alapvetően kétféle szekréciós válaszra képesek, melyek jól elkülöníthetők a szekrétum mennyisége és minősége alapján. Étkezések között bazális szekréció zajlik, és ez tartja fenn a szájüreg homeosztázisát (például vízfelvétel, mineralizáció révén). Táplálkozás hatására azonban a bőségesen termelődő nyál elősegíti a szájképletek nedvesítését és elkezdi a bevitt táplálék emésztését (Huang és mtsai 2001). Az exokrin szekréció két lépésben történik. Az 1. lépcsőben az acinussejtek izotóniás primer nyálat termelnek, amely a 2. lépcsőben, a ductusrendszeren való áthaladás során módosul: Na+ és Cl- szívódik vissza, ugyanakkor K+ és HCO3szekretálódik. Ennek eredménye a szájüregbe kerülő hipotóniás nyál, amely többnyire a parotisból és a glandula submandibularisból származik. A glandula sublingualisban és a kis nyálmirigyek többségében ugyanis kimarad ez a 2. lépés, vagyis a nyál összetételének módosulása. Az alacsony Na+-koncentráció jelentősége abban rejlik, hogy megnöveli a fehérjeoldékonyságot, és csökkenti az ízérző receptorok NaCl iránti érzékenységének a küszöbét (sós íz érzékelése) (Ferguson 1999). A nyálszekréció funkcionálisan két történést foglal magába: a víz- és sótranszportot, valamint a fehérjeszekréciót. A fehérjék szintézisét többnyire a 12

BEVEZETÉS

nyálmirigyek acinussejtjei végzik. Az acinussejtek szerepe tehát a szekrécióban többrétű, nemcsak vizet juttatnak a nyálba, hanem a nyál eredetű fehérjék 85 %-át termelik - néhány fehérje (például lizozim, laktoferrin, szénsav-anhidráz) azonban a ductus-sejtek terméke. Ugyanakkor sok fehérje eredetét még mindig nem ismerjük (Cook és mtsai 1994, Castle és Castle 1998). A parotis acinussejtjei serosusak, és főként amilázt termelnek, így a parotisnyál híg, kevésbé viscosus. A sublingualis mirigy mucinosus sejtjei glikoproteinben gazdag, sűrű, viszkózus nyálat termelnek. A glandula submandibularis acinussejtjei kevertek, és az előbbi kettő közötti, átmeneti viszkozitású nyálat produkálnak. A víz- és elektrolittranszport a vér felől a mirigy lumene felé irányul. Ez a transepithelialis transzport lehet paracelluláris (sejtek közötti), amely mindig passzív, és lehet transzcelluláris (sejtmembránon keresztüli), amelyhez csatornákra és különböző transzporterekre van szükség. Ugyanakkor a fehérje transzport intracellulárisan történik, és a vesiculumok vagy granulumok exocytosisával végződik, többnyire a sejtek apikális oldalán (Nagy 2000). A parotis számos szekrétoros fehérjét állít elő, többek között amilázt, prolinban gazdag fehérjéket és parotis eredetű szekrétoros fehérjét (parotid secretory protein PRP). A szekrétoros fehérjék szekréciójának szabályozása biztosítja, hogy szükség esetén a megfelelő összetételű nyál termelődjön. Mivel ezek a fehérjék túl nagyok a sejtmembránon való átjutáshoz, ezért a sejten belül vesiculumok (granulumok) formájában tárolódnak és exocytosis útján jutnak ki a sejtből. A szekréciós granulumok egyben elosztó és osztályozó centrumokként működnek, és ha szükséges, tárolják is a szekrétoros fehérjéket. A granulumok a Golgi-komplex transz régiójából (trans-Golgi network) keletkeznek kétféle módon: vagy a Golgi-komplex egy részének érése során, vagy ez utóbbiról fűződnek le kerek vesiculákként (bimbózás). Az éretlen granulumok még lizoszómális és egyéb, nem oda tartozó fehérjéket tartalmaznak. A későbbi érés eredménye az érett szekrétoros granulum, mely bőségesen tartalmaz nyálfehérjéket. Mind az érett, mind az éretlen szekréciós granulum kiürülhet exocytosis révén, azonban a fehérjék relatív mennyisége a kétféle granulumban eltérő (Gorr és mtsai 2005). A fehérjék szekréciója igen összetett, bonyolult folyamat, melyről különböző kísérleti modellek (például szövet szelet, izolált acinus sejtek, sejtvonalak) alkalmazásával sikerült információkat szerezni. Jelenlegi ismereteink alapján a 13

BEVEZETÉS

szekréciónak 7 útvonala ismert a parotis acinus sejtekben (2. ábra). A parotis acinus sejtjei folyamatosan szekretálnak fehérjéket agonisták jelenlétében és hiányában egyaránt. A szekréciós útvonalakat megkülönböztethetjük a szekréció idejének, a szekretált fehérjék összetételének és a stimulációra adott válasz érzékenységének a vizsgálatával. Ezen útvonalak részletes felderítése és a szekretált fehérje komponensek pontos ismerete jelenleg is kiterjedt kutatások tárgyát képezik (Gorr és mtsai 2005). Mai tudásunk alapján a parotis acinus sejtekben 2 regulált (szabályozott) szekréciós útvonal működik, melyek segítségével a sejtek extracelluláris stimuláció hatására fehérjéket szekretálnak a lumenbe (Castle 1998). A nagyobb (major) szekréciós útvonal [1] nagy méretű szekréciós granulumokat foglal magába, melyek kolinerg vagy adrenerg stimuláció hatására ürülnek ki. Ez a klasszikus szekréció az exokrin sejtekben, mely a fehérje szekréció 80-90 %-át jelenti a parotis acinussejtjeiben. A kisebb (minor) szekréciós útvonal [2] kis transzport vesiculái pilokarpin vagy kis koncentrációjú izoproterenol hatására képződnek és ürülnek ki. Ez utóbbi ágensek azonban hatástalanok a nagy szekréciós granulumokra (Castle és Castle 1998). Ezek a szabályozott szekréciós utak a sejtek más egyéb funkcióiban is részt vesznek

(például

fehérjék

szekréciója

akut

stimuláció

hiányában,

víz-

és

elektrolitszekréció támogatása) (Castle és Castle 1998). Az acinus sejtek erős extracelluláris stimulációtól független szekrécióját bazális szekréciónak nevezzük. Ez az étkezések között alapszekréciót jelenti. Ugyanakkor magában foglalja az enyhe stimulációra, étkezések között működő kisebb szabályozott szekréciós útvonalat [2], valamint ide tartozik még a konstitutív [3] és konstitutív-szerű szekréciós útvonal [4] is (Gorr és mtsai 2005). Az acinus sejtekben stimuláció hiányában (illetve autonom blokád esetén) is folyamatosan mérhető egy enyhe fehérje "output" az apikális membrán irányába. Ez a fajta szekréció 2 fő fázisból áll. Korai fázisát konstitutív szekréciónak nevezzük, és újonnan szintetizált fehérjék szekrécióját jelenti, melyek többnyire az éretlen granulumokból származnak. Erre a szekréciós útvonalra specifikus szekrétoros fehérje markert még nem sikerült azonosítani. Feltételezik, hogy a bazolaterális membrán és az extracelluláris mátrix fehérjéi is ezen útvonal révén szekretálódnak. Ezek a szekréciós útvonalak a sejt bazolaterális felszíne felé irányulnak és a Golgi-komplex transz régiójával (trans-Golgi network) közvetlen kapcsolatban állnak [5]. A bazolaterális 14

BEVEZETÉS

irányú szekréció lehet polarizált szekréció is, amikor az eredetileg apikális irányba szánt szekréciós vesiculák "átirányítódnak" a sejt bazolaterális felszíne felé és ott ürülnek ki [6 és 7] (von Zastrow és mtsai 1987, Gorr és mtsai 2005). A bazális szekréció második, lassabb, de jelentősebb fázisa a konstitutív-szerű szekréciós útvonalat [4] jelenti. Az ide tartozó transzport vesiculák olyan fehérjéket tartalmaznak, melyek kikerülnek az érési folyamaton átesett nagy szekréciós granulumokból, és így a sejtek bazális szekréciójához járulnak hozzá (von Zastrow és Castle 1987, Gorr és mtsai 2005). A parotis acinus sejtek - csakúgy, mint a többi exokrin sejt - képesek igen nagy fehérjemennyiséget tárolni szekréciós granulumaikban. A granulumok tartalma hasonlít a nyál összetételéhez, ami azt jelenti, hogy a nyál fő komponenseit tartalmazzák a granulumok. Becslések szerint ez a szekretált fehérjék 80-90 %-át teszi ki. A granulumok keletkezéséért és szabályozott kiürüléséért specifikus reguláló fehérjék jelenléte is szükséges lehet (Day és mtsai 1995). Ezen kívül a pH is hatással van a fehérjék tárolására. Az exokrin sejtekben az éretlen granulumok belsejében savas pH uralkodik, míg az érett granulumokban a pH csak enyhén savas, a neutrálishoz közeli értéket mutat (Orci és mtsai 1987). Az éretlen granulumokban a savas pH biztosítja a fehérjék visszatartását, azonban enyhén bázikus ágensek hatására az újonnan szintetizált fehérjék stimulált szekréciója következhet be (von Zastrow és mtsai 1989). A fehérjék osztályozásában és raktározásában szerepe van a szulfatált proteoglikánoknak is (Venkatesh és Gorr 2002). Feltételezik, hogy ezek a savas pH-jú, nagy molekulák nem közvetlenül fejtik ki hatásukat, hanem a granulum pH-jának megváltoztatása révén. A szulfatált proteoglikánok elősegítik a granulumok fehérjetárolását és érését nemcsak a parotisban, hanem a szintén exokrin pancreasban is (Blair és mtsai 1991, De Lisle 2002). Azonban a pancreasszal ellentétben a Ca2+ jelenléte vagy hiánya a parotis acinus sejtekben nem befolyásolja a fehérjék aggregációját és a granulumok stabilitását, sőt kimutatták, hogy az amiláz a granulum érése során nem mutat aggregációs hajlandóságot (Gorr és Tseng 1995). A parotis szekréciós granulumaiban a fehérjék tárolásának mechanizmusa ugyanis eltérő a pancreashoz képest: míg a parotis sejtjeiben a szulfatált proteoglikánoké a fő szerep, a pancreasban ezen kívül fontos a kalciumionok és az alacsony pH által kiváltott aggregáció is (Venkatesh és mtsai 2004).

15

BEVEZETÉS

A szekretoros fehérjék visszatartása és szekréciója a parotis acinus sejtekben tehát igen bonyolult és összetett folyamat, amelynek pontos részleteit még ma sem ismerjük. A jelenségek pontos ismerete igen fontos lehet számos betegség (például Sjögren-szindróma) kezelése szempontjából, és jól hasznosítható a génterápia számára is (lásd Gyakorlati következtetések című fejezet).

2. ábra A fehérjék szekréciójában részt vevő útvonalak a parotis acinus sejtben (Gorr és mtsai 2005) 1: major szabályozott szekréciós útvonal 2: minor szabályozott szekréciós útvonal 3: apikális konstitutív szekréciós útvonal 4: konstitutív-szerű szekréciós útvonal 5: bazolaterális konstitutív szekréciós útvonal 6: granulumok bazolaterális irányú szekréciója 7: váltakozó bazolaterális konstitutív útvonal

A SZEKRÉCIÓ MECHANIZMUSA A szekréció folyamatát alapvetően a vegetatív idegrendszer szabályozza, bár egyéb tényezők, például a rágás, a táplálkozás és a hormonok is befolyásolják. Anderson és munkatársai nyulakon végzett kísérleteikben kimutatták, hogy a parotis

16

BEVEZETÉS

szekréciója csökkent, ha a tápot pépesítették, továbbá rágás során a munkaoldalon (ahol a rágás történik) mindig több nyál termelődött, mint a balanszoldalon (ahol rágás alatt nincs fogsorérintkezés) (Anderson és mtsai 1985). A szekréciót a táplálék összetétele is befolyásolja. Így például csökkent fehérje bevitel hatására a stimulált nyáltermelés szignifikánsan csökken (Menaker és Navia 1974). A hormonok is hatással vannak a nyálmirigyek szekréciójára. A hipofízis eltávolításának hatása mirigyatrófia és az amiláztartalom csökkenése (Bixler és mtsai 1957). Adrenalectomia hatására a parotis atrófizál, és ez a hatás mellékvesekéreg-szteroidokkal is kiváltható (Liu és Lin 1969, Zelles és mtsai 1981). A pajzsmirigy eltávolítása után a nyálelválasztás csökken, a fehérjetartalom azonban nő (Johnson és Cortez 1985). A nyálmirigyek minden külső inger nélkül is folyamatosan termelnek nyálat, ezt nyugalmi nyálnak nevezzük. A jelenség hátterében feltehetően a központi idegrendszerben elhelyezkedő nucleus salivatoriusok spontán aktivitása áll (Nagy 2000). Stimuláció hatására a vegetatív idegrendszer közreműködésével az impulzusok eljutnak a nyálmirigyekbe, és a nyáltermelés fokozódik. A szimpatikus és paraszimpatikus

idegeken

keresztül

továbbított

jel

az

acinussejtek

felé

neurotranszmitterek segítségével jut el, melyek a szekréciós válasz első messengerei. A neurotranszmitterek kötődnek a specifikus sejtfelszíni receptorfehérjékhez, mely elindít egy transzdukciós mechanizmust. Ennek során a külső szignál továbbítódik a sejt belseje felé. A nyálmirigyek sejtjeiben a transzdukciónak két fő útvonala létezik: cAMP (ciklikus AMP)-képződés és PIP2 (foszfatidil-inozitol-4,5-bifoszfát)-bontás útján történő transzdukció (Putney 1986, Baum 1987) (3. ábra).

17

BEVEZETÉS

3. ábra Az acinussejtek szekréciójában részt vevő szignál transzdukciós útvonalak (Looms és mtsai 2002) Számos

neurotranszmitter

létezik,

mely

szerepet

játszhat

a

nyálmirigyszekréció szabályozásában. A receptorok közül a legkorábbi ismereteink a muszkarinerg (kolinerg) és adrenerg (α és β) receptorokról vannak (van Zwieten 1991). Ezek a receptorok mind transzmembrán fehérjék, melyeknek ligandkötő doménje a membrán extracelluláris oldalán található. Az α- és β-receptorok dimerek. Két szubtípusuk van: α1/α2 és β1/β2; az egyes szubtípusok az agonsitákhoz és antagonistákhoz való affinitásukban különböznek. A kolinerg receptor monomer, és mint klónozással kiderült, 5 altípusa (M1-M5) létezik (Bonner és mtsai 1987). Ezek a receptorok specifikusak nemcsak szöveti eloszlás (Levey és mtsai 1991), hanem a szignál transzdukciós mechanizmus tekintetében is. Az M1, M3 és M5 receptorok hatására többnyire PIP2-bontás történik, míg az M2 és M4 receptorok aktivációjakor megemelkedik a cAMP-szint a sejtben (Peralta és mtsai 1988). Ugyanakkor léteznek átfedések is, mivel mindegyik receptor altípusnak számos effektora van. Az M1, M3 és M5 receptor képes aktiválni a foszfolipáz A2-t, a foszfolipáz Cγ-t csakúgy, mint a különböző Ca2+-csatornákat. Az M2 és M4 receptor egyaránt hatással van a foszfolipáz A2-re, a foszfolipáz Cβ-ra és az adenilát ciklázra (AC) is (Felder 1995). 18

BEVEZETÉS

A nyálmirigyekben a receptorok eloszlása eltérő. A parotisban többnyire csak M3 receptor található, míg a glandula sublingualisban az M3 receptoron kívül az M1 receptor (40-60 %-ban), a glandula submandibularisban pedig az M3, M5 és kis számban az M1 receptor is felelős a kolinerg szekrécióért (Tobin és mtsai 2002). A nyálmirigyek acinussejtjeiben muszkarinerg vagy α-adrenerg stimuláció hatására PIP2-bontás, míg β-adrenerg stimuláció hatására cAMP-képződés következik be. Az adrenerg és kolinerg szabályozáson kívül nem adrenerg és nem kolinerg (non-adrenerg és non-cholinerg - NANC) mechanizmusok is befolyásolhatják a szekrétoros sejtek működését (Ekström 1987). Adrenoceptor antagonisták és atropin jelenlétében szekréciós akitivitást figyeltek meg patkány parotisban, táplálkozás után (Ekström és mtsai 1998). Megállapították, hogy a NANC szabályozás a kolinerg és adrenerg mechanizmusokkal együtt, azokkal összhangban szabályozza a nyálmirigyek szekrécióját. A NANC szabályozás neurotranszmitterei különböző neuropeptidek, elsősorban a substance P, a vasoactive intestinal peptide (VIP), a neuropeptide Y (NPY) és a calcitonin gene-related peptide (CGRP); de a nitrogén-monoxid (NO) is szerepet játszik a szabályozásban (Fehér és mtsai 1999). A NITROGÉN-MONOXID (NO) Ismeretes, hogy testünkben a NANC idegek egyik fő mediátora a NO, mely a nyálszekréció szabályozásában is részt vesz. A NO-ról sokáig csak annyit tudtak, hogy egyike az egészségre ártalmas égéstermékeknek. Az első komoly eredmény 1987-ben született meg, amikor Moncada munkacsoportja bebizonyította, hogy a korábban EDRF-ként (endothelium-derived relaxing factor) ismert anyag azonos a NO gázzal (Palmer és mtsai 1987). Azóta a NO az egyik legkedveltebb kutatási témává vált, az orvostudomány szinte valamennyi ága foglalkozik ezzel a molekulával és a megjelenő publikációk száma exponenciálisan növekszik. A XX. század egyik legnagyobb felfedezésének tartják a NO-ot, és a Science nevű lap 1992-ben az év molekulájává választotta (Culotta és Koshland 1992).

19

BEVEZETÉS

A NITROGÉN-MONOXID SZINTÉZISE A NO igen egyszerű, és az egyik legkisebb súlyú (30 Da) molekula, előállításában azonban egy meglehetősen bonyolult és igen nagy (≈130-160 kDa), Hemalegységet is tartalmazó enzim, a nitrogén-monoxid szintáz (NOS) vesz részt (Nathan és Xie 1994). A folyamat során L-argininből NO és L-citrullin keletkezik (Moncada és mtsai 1991). A szintézis két külön lépcsőben történik és zavartalan lezajlásához különböző kofaktorokra (NADPH, FAD, FMN, kalmodulin, protoporphyrin IX (hem), tetrahidrobiopterin), valamint oxigénre van szükség (Knowles és Moncada 1994) (4. ábra).

4. ábra A NO szintézise L-argininből. Az első lépésben N-hidroxi-L-arginin keletkezik, mint köztes termék, majd ez alakul át NO-dá és L-citrullinná (Stuehr 1999). A NOS enzimnek három izoformája ismert, melyek különböző gének termékei. A neuronalis NOS-t (nNOS vagy NOS1) elsőként idegszövetben fedezték fel. Az indukálható (iNOS vagy NOS2) forma különböző hatásokra expresszálódik számos sejtben és szövetben. Az endothelialis (eNOS vagy NOS3) izoformát ér endothelből mutatták ki először. Az NOS1 és NOS3 nevét az elsőként leírt anatómiai lokalizáció alapján kapta, azóta azonban számos más szövetben – például a nyálmirigyekben - is igazolták jelenlétüket (Mitsui és mtsai 1997). Az NOS1 folyamatosan expresszálódik az agyban, a központi idegrendszerben és a perifériás idegekben, ugyanakkor megtalálható az izomsejtekben és az epithelialis sejtekben is. Az NOS3 expressziója szintén folyamatos,

20

BEVEZETÉS

és az enzim nemcsak endothelsejtekben, hanem szívizomsejtekben és más sejtekben is előfordul. A NOS1 és NOS3 konstitutív enzimek (cNOS): folyamatosan jelen vannak a sejtben (a citoszólban vagy a sejtpartikulumokban), szemben az indukálható formával. Működésükhöz Ca2+-ot igényelnek, mert a NO-szintézis csak akkor indul be, ha a kalmodulin Ca2+-ot köt meg, és a cNOS-hoz kapcsolódik. Azok a stimulusok tehát, amelyek a citoszól Ca2+-szintjét emelik, NO-szintézist indítanak be. A NO szintézise addig tart, amíg a kalmodulin le nem disszociál az enzimről. A

NOS2

(iNOS)

nyugalmi

körülmények

között

nincs

detektálható

mennyiségben jelen a sejtekben, de különböző ingerek (bakterialis toxinok, infekció, citokinek) hatására expresszálódik és a stimulust követő 2-4 órán belül a makrofágokon kívül számos más sejtben, így többek között az érfal és a szív izomsejtjeiben, immunsejtekben és a bélben is megjelenik. Működése független az intracelluláris Ca2+szinttől, mivel irreverzibilisen köti a kalmodulint. Tetrahidrobiopterin-mentes közegben azonban megszűnik működése, mivel a tetrahidrobopterint gyengén köti (Nathan és Xie 1994, Alderton és mtsai 2001, Stuehr 1999). Újabban kimutatták, hogy az nNOS-nak 4 altípusa létezik, melyek alternatív mRNS splicing-gal jönnek létre. Eszerint a teljes hosszúságú nNOS variánst nNOSαnak nevezzük. A splicing utáni 4 rövidebb nNOS-változat: nNOSβ, nNOSγ, nNOSη és nNOS-2 (Alderton és mtsai 2001). Bár a NO elsődleges forrása a NOS enzim, egyes szerzők kimutatták, hogy a NO nem-enzimatikus úton is létrejöhet nitritből savas közegben (pH=3). Így például fiziológiás körülmények között a gyomor lumenében, vagy ischemiás szövetekben (például szívizom) figyeltek meg NOS-független NO-képződést. Ez a fajta NOtermelődés dominál az ischemia progressziója alatt és NOS-inhibitorokkal nem gátolható, a magas koncentrációjú NO pedig végül sejtkárosodást hoz létre (necrosis) (Zweier és mtsai 1999). A keletkezett NO negatív feedback mechanizmussal képes gátolni a NOS működését azáltal, hogy reverzibilisen hozzákötődik az enzim hem részéhez. A NOS2NO komplex kialakulása függ az oldatban lévő NO szintjétől, a NOS1-NO komplex viszont független tőle (Stuehr 1999).

21

BEVEZETÉS

A megtermelt NO nem raktározódik, hanem azonnal felszabadul. Felezési ideje nagyon rövid, csupán néhány másodperc, azonban rendkívül gyorsan átdiffundál a membránon és kis idő alatt is nagy távolságok megtételére képes. Hatása nemcsak azon a sejten érvényesül, amelyben szintetizálódik, hanem a környező sejteken is, tehát intraés intercelluláris hatásról egyaránt beszélhetünk. A NO-nak konkrét receptora nincs. A sejtekben szabad gyökökkel, fémekkel, oxigénnel, s a keringésben többek között az oxihemoglobinnal lép reakcióba. A reakció során nitritté, illetve nitráttá alakul. A NOS3 esetében a fő támadáspont a solubilis guanilát cikláz (sGC). A NO az erek simaizomsejtjeiben található sGC hemcsoportjához kötődik, nitrozohem jön létre, amely

az

enzimaktivitás

fokozódásával

jár.

Ennek

hatására

a

cGMP-szint

megemelkedik és egy cGMP-függő protein-kináz foszforilálja a miozin könnyű láncát, ez pedig a simaizom elernyedéséhez vezet. Ez volt az a hatás, amelyről a NO az első nevét (endothelium-derived relaxing factor) kapta. Kimutatták, hogy a NO a felelős a terápiában több, mint 100 éve használt különböző

nitrovazodilátor

értágító

vegyületek

(nitroglicerin,

nitromint,

stb.)

hatékonyságáért, mivel a belőlük felszabaduló NO a fent leírt mechanizmussal simaizomrelaxációt okoz. Így ezekkel a NO-donorokkal számos kórkép vált kezelhetővé, mint például a stabil vagy instabil angina, coronaria vasospasmus, szívinfarktus, vagy a kongestiv szívelégtelenség (Moncada és Higgs 1995). Nem valószínű azonban, hogy a NO számtalan hatását (lásd A nitrogén-monoxid hatásai című fejezet) kizárólag a sGC-on keresztül fejti ki. Számos tanulmány bizonyítja, hogy a NO hatással van az AC-ra is. Az enzim terméke, a cAMP ugyanis mind a cNOS aktivitását, mind az iNOS transzkripcióját szabályozza, az AC-5 és AC-6 enzim izotípusokra pedig közvetlenül hat a NO. Ezen kívül még számtalan más szignál transzdukciós útvonalat feltételeznek, melyben a NO és az AC is szerepet játszik (Klein 2002, Adam és mtsai 1999, Hudson és mtsai 2001, Hill és mtsai 2000). A NITROGÉN-MONOXID HATÁSAI A NO hatása sokrétű. Bár az első publikációk még csak az értónus szabályozására irányuló szerepét hangsúlyozták, azóta kiderült, hogy a NO-nak számos és széleskörű fiziológiás és patológiás hatása van. Kimutatták, hogy többféle kórképben

22

BEVEZETÉS

a megváltozott NO termelődés játszik szerepet, a szeptikus sokktól a rosszindulatú daganatig (1. táblázat). 1. táblázat Kórképek és elváltozások, melyekben a megváltozott NO-produkció játszik szerepet (Brennan és mtsai 2003) Hypertensio és hypertonia Thromboemolia Septicus shock Bronchospasmus Acut respirációs distress szindróma (ARDS) Pulmonalis eredetű hypertensio Veseelégtelenség Immundeficiencia HIV-fertőzés okozta encephalopathia Impotencia Depressio Malignus tumorok

A NO főbb hatásai a következők: 1. A keringés működésének szabályozása A NO folyamatosan jelen van a kis artériák falában és szerepe van a bazális tónus beállításában. A vénák falában azonban nem mutatták ki a NO jelenlétét. A vérlemezkékben is jelen van a NO, megakadályozva a túlzott aggregációt. Az endocardium által termelt NO befolyásolja a szívizom relaxációját a diasztólés fázis alatt (negatív inotrop hatás) (Moncada és mtsai 1991). 2. Az immunrendszer működésének szabályozása A szervezetet ért különböző hatásokra (például infekció) a NOS2 által termelt NO szerepet játszik a szervezet védekezési mechanizmusaiban. Szabályozza a lymphocyták és más immunsejtek működését (baktericid, fungicid, citotoxikus hatás). Részt vesz a kórokozók elpusztításában, és egyes tumorsejtekre toxikus. A gyulladásos válasz létrejöttében is szerepe van, ugyanis a gyulladásos mediátorok fokozzák a NOS3 működését, valamint a NOS2 expresszióját. Az így képződött NO pedig segíti az értágulat létrejöttét, és a szövetpusztulást (Moncada és mtsai, 1991).

23

BEVEZETÉS

3. Az idegrendszer működésének szabályozása A NANC idegek többsége NO-ot használ mediátorként. A NO retrográd messengerként is működik az ingerületátviteli folyamatokban. Ezen kívül fokozza egyes neurotranszmitterek (például noradrenalin, dopamin) és neuropeptidek exocytosis úján történő felszabadulását. A NO tehát intra- és intercelluláris messengerként is működik a központi és környéki idegrendszerben (Moncada és mtsai 1991). Ezt bizonyítják azok a kísérletek, amelyek során egyes NO-ot felszabadító ágensek növelték a noradrenalinszintet a hipokampuszban (Lonart és Johnson 1995, Meffert és mtsai 1994), valamint gátolták a luteinizáló hormon felszabadulását a hipofízis elülső lebenyében (Ceccatelli és mtsai 1993), illetve a corticotropin-releasing hormon felszabadulását a hipotalamuszban (Costa és mtsai 1993). A NO-nak szerepe van a gastrointestinalis funkció szabályozásában is. Számos tanulmány vizsgálta a termelődött NO elhelyezkedését és eloszlását a gyomor-bél traktusban, különböző fajokban, beleértve az embert is. NO-termelő helyek (NOS enzim) megtalálhatók a nyálmirigyekben, a nyelőcsőben, a gyomorban, a vékony és vastagbélben, a végbélben, a pancreasban és májban, továbbá az epehólyagban és epevezetékben. A NOS eloszlása azonban nagyfokú faj- és szövetspecificitást mutat (Salter és mtsai 1991, Schleiffer és Raul 1997). A NO tehát hat az exokrin mirigyek működésére is. A pancreasban – amely az egyik leggyakrabban vizsgált külső elválasztású mirigy – a NO növeli a bazális protein szekréciót macskában és kutyában (Patel és mtsai 1995, Konturek és mtsai 1993). Patkányban azt találták, hogy a NO in vivo fokozza a pancreas fehérje szekrécióját, in vitro körülmények között azonban nem befolyásolja sem a bazális, sem a stimulált fehérje szekréciót, pancreas acinus sejtek esetén (Konturek és mtsai 1994). A NITROGÉN-MONOXID LOKALIZÁCIÓJA NYÁLMIRIGYEKBEN Miután bebizonyosodott, hogy a NO egy fontos messenger molekula, számos kutatócsoport kezdte vizsgálni, milyen szerepet játszik a NO a gastrointestinalis exokrin szekréció szabályozásában. Azóta számos direkt és indirekt módszert dolgoztak ki a sejtekben termelődött NO, valamint az expresszálódott NOS enzim kimutatására (2. táblázat). 24

BEVEZETÉS

2. táblázat NO termelődés és NOS expresszió acinus sejtekben való mérésére alkalmas módszerek (Looms és mtsai 2002) NO TERMELŐDÉS

NOS EXPRESSZIÓ

Direkt meghatározás fluoreszcens indikátor (például 4,5diamino-fluoreszcein (DAF-2)) Indirekt meghatározás -

-

-

Western-blot immunhisztokémia

a NO metabolitjainak (nitrit és nitrát) mérése a GC stimulációja jelölt L-citrulline mérése szövetben vagy sejt homogenizátumban

NADPH-diaforáz hisztokémia (Hope és mtsai 1991) segítségével kimutatták, hogy a NO széles eloszlást mutat a gastrointestinális traktusban, valamint a nyálmirigyekben (Grozdanovic és mtsai 1992). Sőt, az immunhisztokémiai vizsgálatok is igazolták, hogy az exokrin mirigyeket – így a nyálmirigyeket is - beidegző végágak NOS-t

(NOS1)

tartalmaznak.

NOS

immunoreaktivitást

találtak

humán

kis

nyálmirigyeket (Pederson és mtsai 1999), macska submandibularis nyálmirigyeket (Lohinai és mtsai 1995), valamint patkány és macska nagy nyálmirigyeket ellátó idegágakban (Ceccatelli és mtsai 1994, Alm és mtsai 1997, Takai és mtsai 1999). Ugyanakkor NO-ot szintetizálhat az exokrin mirigyek ereiben és capillarisaiban megtalálható NOS3 izoforma is (Forstermann és mtsai 1995, Xu és mtsai 1997). Ezen kívül kiderült, hogy maguk az acinus sejtek is képesek endogén NO-ot termelni (Xu és mtsai 1997, Looms és mtsai 2000, Tritsaris és mtsai 2000). Tritsaris és munkatársai (2000) izolált parotis acinus sejtekben különböző agonisták adását követően igazolták a NO jelenlétét egy fluoreszcens indikátor, a DAF-2 (4,5-diamino-fluoreszcein) segítségével. Ez a molekula a NO-dal való reakcióba lépése után erős fluoreszcens jelet ad. A NO jelenlétét a patkány parotis acinus sejtekben Western blot analízissel is igazolták (Ishikawa és mtsai 2002). Az eredmények azt mutatták, hogy NOS2 és NOS3 nem expresszálódik a sejtekben, az anti-NOS1 antitest kötődése után azonban egy jól 25

BEVEZETÉS

látható immunoreaktív csík jött létre, mely egy 155 kDa súlyú fehérjét jelzett a citoszólban. Nyúl parotis acinus sejtekben hasonló eredményt kaptak, ott egy 160 kDa citoszól eredetű fehérjét találtak, ami reakcióba lépett az NOS1 antitesttel (Sugiya és mtsai 2001). Ugyanakkor a submandibularis mirigy acinussejtjeiben csak nyomokban találtak NOS1 expressziót a citoszólban, a fehérje nagy része a sejt perifériáján, közvetlenül a membrán alatt lokalizálódott (Xu és mtsai 1997). Egy évvel később Lomniczi

és

munkatársai

más

módszereket

(NADPH-diaforáz

festődés

és

immunhisztokémia) alkalmazva a patkány glandula submandibularisban csak az idegvégződésekben, valamint a ductusrendszerben találtak NOS-t, az acinussejtekben nem (Lomniczi és mtsai 1998). A NITROGÉN-MONOXID ÉS A SZEKRÉCIÓ KAPCSOLATA Régóta tudjuk, hogy a muszkarinerg receptorok stimulációjakor megemelkedik az intracelluláris Ca2+-szint a parotisban (Takemura 1985, Merritt és Rink 1987). A NOS1 működéséhez Ca2+-ra és calmodulinra van szükség. A muszkarinerg Ach-receptorok stimulációjával tehát emelkedik az intracelluláris Ca2+-szint és így a NOS-aktivitás is. Ezt bizonyították Wang és munkatársai, akik a muszkarinerg agonista karbakol alkalmazásakor megnövekedett NO-releaset észleltek (Wang és mtsai 1994). Muszkarinerg stimuláció során megemelkedik az intracelluláris cGMP-szint is. A cGMP pedig szerepet játszik az amiláz és K+ szekréciójában, mint intracelluláris messenger (Watson és mtsai 1982). A NO szekrécióra kifejtett hatásával kapcsolatos vizsgálatok ellentmondásos eredményeket hoztak. Patkány submandibularis mirigyen végzett in vivo kísérletek szerint a NO aktiválja a nyálszekréciót, melyet különböző NOS-inhibitorok alkalmazásával bizonyítottak (Lomniczi és mtsai 1998). Lohinai és munkatársai azonban azt találták, hogy a NOS-inhibitorok fokozzák az amiláz szekréciót patkányban (Lohinai és mtsai 1999). Igaz ugyan, hogy ez utóbbi munkacsoport kevert nyálat vizsgált, s eredményeik inkább a parotis szekréciójára utalnak, mivel ez a mirigy az amiláz fő forrása (Ikeno és mtsai 1982). Az utóbbi években a kutatások fontos területévé vált annak vizsgálata, hogyan befolyásolja a cGMP-szint a Ca2+-homeosztázist. Két útvonal ismert, melynek során a cGMP-szint emelkedése a Ca2+ felszabadulását eredményezi az intracelluláris 26

BEVEZETÉS

raktárakból. A cGMP egyrészt fokozhatja a Ca2+-influxot a cGMP-dependens protein kinázon (G-kináz) keresztül. Másrészt a Ca2+ felszabadulhat a rianodin-szenzitív intracelluláris raktárakból egy olyan mechanizmuson keresztül, melyben a G-kináz és a cADP-ribóz érintett (Looms és mtsai 2001). Újabban kimutatták, hogy a NO/cGMP szignáltranszdukciós útvonal hatással van az amiláz szekrécióra patkányban. Ennek lényege, hogy a karbakol aktiválja a foszfolipáz C-t, melynek hatására megemelkedik az intracelluláris IP3 szintje. Az IP3 hatására felszabadul a Ca2+ az intracelluláris raktárakból, és a NOS enzim aktiválódik. A keletkezett NO pedig aktiválja a sGC-t, és cGMP termelődik a sejtben, amely a cGMP-dependens kinázokra, többek között a G-kinázra hat. A G-kináz foszforilációja amiláz szekréciót eredményez (Shimomura és mtsai 2004). Ugyanakkor igazolták, hogy a NO/cGMP kaszkád hatása a nyálszekrécióra a különböző fajokban eltérő. Mitsui közlése szerint nyúl parotisban 20-szor nagyobb a Ca2+-függő NOS-aktivitás, mint patkányban (Mitsui és mtsai 1997). A muszkarinerg receptorok aktivációja izolált patkány parotis acinus sejtekben 1,5-szeresére növelte a cGMP mennyiségét (Glenert és Nauntofte 1988), míg nyúl parotis acinus sejtekben 710-szeresére (Michikawa és mtsai 1998). Ennek ellenére bizonyították, hogy a cGMP nem vált ki amiláz szekréciót a nyúl parotis acinus sejtekben (Michikawa és mtsai 1998), míg patkány és egér (Watson és mtsai 1982) parotis acinus sejtjeiben igen. Az acinussejtekben termelődött endogén NO kis mérete és lipofil természete miatt könnyen kidiffundál a sejtből, a rövid féléletidő miatt azonban hamar lebomlik, így valószínűsíthető, hogy hatását a környező sejtekre fejti ki. Főbb funkciói a következők: 1. Megfelelő vérellátást biztosít a szekréció ideje alatt. Jól ismert tény, hogy a nyálmirigyek paraszimpatikus stimulációja vasodilatatiot okoz, a folyamatos szimpatikus stimuláció pedig egy intenzív vasoconstrictio után szintén vasodilatatiohoz vezet. A pontos mechanizmus, mellyel az exokrin mirigyek keringésének neuronális szabályozása történik, még mindig nem ismert. Az azonban tény, hogy a β-adrenerg stimuláció (például izoproterenollal) NOfelszabadulást idéz elő az acinusssejtekben, míg a paraszimpatikus ingerlésnek (például Ach-nal) nincs ilyen hatása (Looms és mtsai 2001).

27

BEVEZETÉS

2. A NO retrográd messengerként is működik (feedback hatás a periacinaris idegvégződések felé). A negatív vagy pozitív visszacsatolás valószínűleg mind a szimpatikus, mind a paraszimpatikus idegvégződések felé működik, hiszen a kétféle idegág között összeköttetés van a szekréció során (Looms és mtsai 2001). 3. A nyálmirigyek környezetében található szövetek sejtjeinek, főként az ideg és ér eredetű sejteknek a növekedését és differenciálódását is szabályozza a NO (Looms és mtsai 2001). 4. A NO részt vesz a host defence barrier fenntartásában a mikroorganizmusokkal, illetve tumorsejtekkel szemben (Looms és mtsai 2001). 5. Szerepe van számos kórkép patogenezisében, melyekben a NO-termelés túl alacsony vagy túl magas (például Sjögren-szindróma, periodontalis kórképek, egyes tumorok) (Looms és mtsai 2002, Brennan és mtsai 2003). A NYÁL SZEREPE A GYULLADÁSBAN A nyálmirigyek által termelt nyál szerepe igen sokrétű. A nyál egyik fő feladata a szájüreg védelme, egyrészt a szövetek nedvesen tartása, másrészt a mucin (illetve prolindús fehérjék), mint az epithelium felületén ható síkosító közeg szekréciója révén. Ugyanakkor a nyál egy olyan állandó milliőt biztosít, amelyben a zománc oldódásának kivédése miatt igen magas a Ca2+ és PO42- (valamint F-) koncentráció, a bekerülő savak pedig közömbösítődnek a HCO3- pufferhatása révén. A nyál hatására kezdődik el a fő emésztő enzim, az amiláz által az egyik legfontosabb tápanyag, a szénhidrát lebontása a cavum orisban (Ferguson 1999). A nyál antibakteriális hatása révén védelmet nyújt a szájüregen keresztül a szervezetbe elkerülhetetlenül behatoló baktériumokkal szemben is. Ennek a rendszernek az egyik tagja a laktoperoxidáz-tiocianát-rendszer. Szerepe a szájüregben a baktériumok által termelt és a nyálkahártya hámsejtjei számára káros hidrogén-peroxid átalakítása. A laktoperoxidáz a nyálban található tiocianát jelenlétében a hidrogén-peroxidból vizet és a hámsejtekre sokkal kevésbé toxikus hipotiocianátot képez. A lizozim szintén antibakteriális tulajdonságokkal rendelkezik. Muramidáznak is hívják, mivel feladata a baktériumok sejtfalában található muraminsav bontása. Az IgA (Immunglobulin A) viszonylag magas koncentrációban fordul elő a nyálban a többi immunglobulinhoz 28

BEVEZETÉS

képest. Megfigyelések szerint egyenes arányosság van az IgA koncentrációja és a caries előfordulási gyakorisága között, amit az IgA kariogén kórokozókkal szembeni hatásának tulajdonítanak. Ugyanakkor az IgA elősegíti a baktériumok aggregációját, és így a plakk képződését. A laktoferrin egy vaskötő fehérje, amely a vas elvonásával gátolja a baktériumok anyagcseréjét. A hisztidinben gazdag hisztatinok antiflogisztikus hatással rendelkeznak. Újabb vizsgálatok kimutatták a nyálban egy leukocyta proteináz inhibitor (salivary leucocyte proteinase inhibitor – SLPI) jelenlétét, amelyről azt tartják, hogy megakadályozza a humán immundeficiencia vírusnak (HIV) a nyálon keresztüli terjedését (Ferguson 1999). A nyálelválasztás részleges (sialosis) vagy teljes hiánya, és/vagy a nyálösszetétel megváltozása figyelhető meg egyes nyálmirigyeket érintő gyulladásos betegségekben, mint például a sialadenitis, a Sjögren-szindróma, de az irradiáció is hasonló tünetekkel jár. A csökkent nyáltermelés szájszárazságot okoz (xerostomia). A nyál összetételének változása általában a Na+- és Cl--inok koncentrációjának emelkedését, valamint a PO42-ionok koncentrációjának csökkenését jelenti, illetve egyes kisebb nyálproteinek koncentrációja is megváltozhat. Mindezek a változások diagnosztikus jelentőségűek lehetnek (Ferguson 1999). Mivel a NO is részt vesz a nyálelválasztás szabályozásában, terápiás haszna lehet, ha megértjük, hogy egy szisztémás gyulladás alatt a nyálmirigyekben (parotisban) milyen történések mennek végbe állatmodellekben, és ebben hogyan vesz részt a NO. Szisztémás gyulladás modellezésére jól alkalmazhatók a lipopoliszacharidok, amelyek képesek gyulladásos választ aktiválni a szövetekben. A LIPOPOLISZACHARIDOK Pfeiffer és Centanni több, mint 100 éve leírták, hogy Gram-negatív baktériumokból származó hőstabil toxin beadása lázat és más patológiás tüneteket vált ki

kísérleti állatokban. Kiderült, hogy ez a hőstabil molekula szénhidrát és lipid

komponensekből áll, innen származik a lipopoliszacharid (LPS) elnevezés (Rietschel és Brade 1992). Az LPS tehát a Gram-negatív baktériumok külső sejtfalában található molekula, és fontos tényező a bakteriális fertőzések patofiziológiájában. Az endotoxin számos

gyulladásos

mediátort

aktivál

a

makrofágokban

(monocitákban)

és

granulocitákban, például különféle citokineket (TNFα (tumor necrosis factor α), IL-1β (interleukin-1β), IL-6 (interleukin-6), IL-8 (interleukin-8)) és a PAF-ot (platelet 29

BEVEZETÉS

activating factor). Ezek a molekulák aktiválják a szervezet védekező rendszerét ("host defence system"), amely igyekszik eliminálni a bakteriális infekciót. Sajnos, ugyanezek a mediátorok járulnak hozzá igen komoly kórképek létrejöttéhez is, mint például a szeptikus sokk. Napjainkig jelentős ismereteink vannak nemcsak ezen gyulladásos mediátorok eredetéről és hatásairól, hanem az LPS-receptorról, illetve az LPS által kiváltott intracelluláris szignál útvonalakról is (Schumann és mtsai 1990, Ulevitch és Tobias 1995). Az LPS-kötő fehérjét (LPS Binding Protein - LBP) 1986-ban fedezték fel Tobias és munkatársai (Tobias és mtsai 1986). Fertőzés során a szérumban keringő LBP lipid transzferként működik, kötődik az LPS lipid A alegységéhez (ez az LPS-molekula biológiailag aktív része), majd az LPS-t a CD14-hez, az LPS-LBP komplex "receptorához" juttatja (Tobias és mtsai 1989). A CD14 a makrofágok felszínén található fehérje, amely továbbítja az LPS-t egy transzmembrán fehérjének, ennek eredményeként a létrejövő intracelluláris szignál hatására megkezdődik a citokinek mRNS-einek átírása (Raetz 1993) (5. ábra). A CD14-nek létezik egy plazmában keringő formája is, a sCD14 (solubilis CD14), amely komplexet alkot az LPS-sel, majd kötődik a sejtfelszíni receptorhoz (Pugin és mtsai 1993). Ugyanakkor - mivel a CD14 nem transzmembrán receptor - az LPS hatásának kialakulásához szükség van a TLR4receptorra (Toll-like receptor 4) is, amely makrofágokban található és továbbítja a jelet a sejt belseje felé (Pastor és mtsai 2004). Az LPS stimulálja az NOS2 aktivitást és a fokozott NO-termelődéshez vezet (Whittle 1994). A NO-nak védő hatása van az LPS által kiváltott gyulladás során. Ezt igazolják azok a vizsgálatok, ahol LPS-kezelt állatokban leblokkolták a NOtermelődést, és ennek hatására jelentősen nőtt a kísérleti állatok mortalitása (Jaworek és mtsai 2000).

30

BEVEZETÉS

5. ábra LPS (endotoxin) hatása a makrofágra (Raetz 1993). Az LPS hatását számos szervben, többek között a glandula submandibularisban, pancreasban, szívben, tüdőben, vesében, vastagbélben, stb. tanulmányozták (Rettori és mtsai 2000, Lomniczi és mtsai 2001, Jaworek és mtsai 2000, László és mtsai 1995, Kiss és mtsai 1997). Az LPS hatását a parotisra azonban elsőként munkacsoportunk vizsgálta meg.

31

BEVEZETÉS

CÉLKITŰZÉSEK Kísérleteink célja kettős volt. Először in vivo kísérleti rendszeren megpróbáltuk tisztázni, hogy a normál táplálás befolyásolja-e a parotis eredetű izoamiláz szintet a szérumban. Megnéztük 16 órás éheztetés, éheztetés utáni 1 órás etetés, valamint sötétben történő 2 órás etetés hatását a parotis és szérum amiláz szintjére patkányokban. Másrészt megvizsgáltuk, hogy a különböző farmakológiai és fiziológiai ingerek (5 mg/kg pilokarpin, illetve azonos térfogatú fiziológiás sóoldat) hatására hogyan változik az amiláz aktivitás a parotis szövetben és a szérumban. Másodszor in vitro kísérleti rendszert alkalmazva a NO direkt acinus sejt hatását vizsgáltuk, mivel a NOS enzimek jelenlétét a parotisban többféle eljárás segítségével igazolták, illetve a NO szerepét a nyálmirigyek, így a parotis élettani és kórélettani folyamataiban egyaránt feltételezik. A nagy számú in vivo kísérletek eredményei a NO közvetett, a keringésen keresztül kifejtett hatását mutatják. In vitro kísérletet jóval kisebb számban végeztek, és ezek azt mutatják, hogy a NO közvetlenül is hatással van a parotisra. Az értekezésben tárgyalt vizsgálatok egyik fő célja a NO közvetlen hatásának vizsgálata volt fiziológiás és patológiás körülmények között. Escherichia coli endotoxin (LPS) intravénás alkalmazása után azt vizsgáltuk, hogy a létrejött szisztémás gyulladás hogyan hat a parotis amiláz szekréciójára. A következő kérdésekre kerestük a választ: 1.

Az amiláz szekréció in vivo vizsgálata:

1.1.

A normál táplálás befolyásolja-e a parotis eredetű izoamiláz szintet a

szérumban? 1.2.

A különböző farmakológiai és fiziológiai ingerek hatására hogyan változik az amiláz szint a parotis szövetben és a szérumban?

2.

Az amiláz szekréció in vitro vizsgálata:

2.1.

Hogyan hat (hat-e egyáltalán) a NO a bazális és stimulált amiláz szekrécióra?

2.2.

Hogyan hat az LPS az amiláztermelő acinussejtekre, direkt vagy indirekt úton?

2.3.

Mi a NO szerepe az LPS által kiváltott parotis gyulladás során? 32

KÖVETKEZTETÉSEK

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ANYAGOK A NOS2 monoklonális antitestet, a Papanicolau-A Haematoxilin festéket, valamint az L-[U-14C]-arginin monohidrokloridot a BD Transduction Laboratories-tól (USA), a Reanaltól (Magyarország) és az Amershamtól (Egyesült Királyság) szereztük be. A NOS2 poliklonális és HRP-konjugált másodlagos antitestet a Biotechnology Inc.től (Santa Cruz, USA) vásároltuk; a többi vegyszer a Sigmától származott. Az ezektől eltérő beszerzési helyeket, illetve az eszközöket és műszereket forgalmazó cégek neveit a szövegben külön közöltem. KÍSÉRLETI ÁLLATOK Vizsgálatainkat hím és nőstény Wistar patkányokon végeztük, súlyuk 200 és 320 g között változott. A patkányokat standard laboratóriumi körülmények között tartottuk, 12 órás világos/sötét ciklusokban. A körülményekhez való alkalmazkodás miatt az állatokat 14 nappal a kísérletek megkezdése előtt helyeztük a fenti körülmények közé. Kísérleti állataink standard laboratóriumi tápot és csapvizet kaptak, korlátozás nélkül. Az in vivo kísérletekben az állatok egyenként voltak elhelyezve a ketrecekben. A patkányokon végzett kísérletek során az Állatvédelmi Törvény és a Semmelweis Egyetem állatkísérletekre vonatkozó rendelkezéseinek megfelelően jártunk el. MÓDSZEREK IN VIVO VIZSGÁLATOK

1. Kísérleti terv Az 1. kísérletben 16 órás éheztetés után a patkányok pilokarpint (5 mg/kg), vagy azonos térfogatú fiziológiás sóoldatot kaptak subcutan (sc.) (n=20). Egy óra elteltével vért vettünk és a parotisokat eltávolítottuk.

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

A 2. kísérletben 18 patkányt használtunk fel. A 16 órás éheztetés után az állatok fele standard laboratóriumi tápot kapott 1 órán keresztül, a másik fele éhezett. Egy óra múlva vért gyűjtöttünk és eltávolítottuk a nyálmirigyeket. A 3. kísérletben 16 állatot osztottunk 2 csoportra. A kísérlet kezdetéig minden állat ad libitum kapott laboratóriumi tápot. Este 7 órakor, a világítás lekapcsolásakor az állatok felétől megvontuk a táplálékot. A másik kísérleti csoport tovább kapta a tápot korlátozás nélkül. Az állatokat 2 órával később, este 9-kor dolgoztuk fel. Minden

kísérleti

csoportban

a

kísérlet

végén

az

állatokat

intraperitonealisan (ip.) adott Na-thiopental anesztéziában (50 mg/kg) elvéreztettük a vena abdominalis átvágásával, előtte pedig az arteria femoralison keresztül vért gyűjtöttünk.

2. Elektroforézis Az összegyűjtött vért alvadékképződés után 2500 g-vel centrifugáltuk 4 ºC-on, ezek után a szérumot a felhasználás idejéig -20 ºC-on tároltuk. A minták elektroforézisét 0.9 %-os agaróz gélen végeztük 8.6-os pH-jú Veronal pufferben, 80 V feszültséggel. A parotis és pancreas izoformák szétválasztásában segített, hogy 8.6-os pH-n ellentétes töltéssel rendelkeznek. Az amiláz aktivitást a gél megfelelő izoenzim csíkja alapján határoztuk meg.

3. Amiláz aktivitás meghatározása A szöveti amiláz aktivitás meghatározásához a mirigyeket óvatosan, zsírmentesen eltávolítottuk, majd lemértük, és Tris-pufferben (pH=7.4, 10 mM) homogenizáltuk. A homogenizátumot 2500 g-vel, 4 ºC-on, 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót használtuk fel az amiláz aktivitás mérésére. A szövet és a szérum amiláz aktivitását a korábban már leírt (Zelles és mtsai 1986) keményítő-jód színreakció alapján mértük. Ennek lényege, hogy az amilázt

tartalmazó

mintákat

keményítőt

(szubsztrát)

tartalmazó

oldattal

folyamatosan rázva inkubáltuk, majd az amiláz által le nem bontott keményítőt egy jódot tartalmazó reakcióeleggyel kötöttük meg. A szubsztrát oldat (pH=7.4) 4 g/l 34

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

keményítőt, Tris-HCl-t (60 mM), NaCl-ot (50 mM) és CaCl2-ot (0.001mM) tartalmazott. A mintákat 5-10 percre a szubsztrát oldathoz mértük 37 ºC-on. A reakciót a minták azonos mennyiségének jód-oldatba történő bemérésével állítottuk le, folyamatos keverés közben. A jódot tartalmazó reakcióelegyben 0.2 mM I2, 3 mM KI és 30 mM HCl volt. A HCl kicsapta (leállította) az amilázt, a jód pedig megkötötte az oldatban maradt, le nem bontott keményítőt. Az oldatok optikai denzitását 620 nm-en olvastuk le (BIORAD 3550 microplate reader). A keményítő oldat megfelelő hígítási sorát használtuk kalibrációs görbeként. Megfelelő határok között egyenes arányosság volt az oldat optikai denzitása és a megemésztett keményítő között. Így minél kevésbé volt intenzív az oldat színe, annál magasabb volt az enzimaktivitás. Az enzimaktivitás értékét egységekben adtuk meg. Egy egység (unit) 1 g lebontott keményítőt jelentett, 1 perc alatt. IN VITRO VIZSGÁLATOK

4. Gyulladás létrehozása a parotisban Kísérleteinkben 200-250 g súlyú hím Wistar patkányokat használtunk. A parotisban a gyulladást Escherichia coli LPS (0111:B4) farokvénába történő intravénás (i.v.) adásával (3 mg/kg, fiziológiás sóldatban oldva) váltottuk ki, és a mirigyeket 5 órával később távolítottuk el. Az LPS dózisát és alkalmazásának módját, valamint a mirigy eltávolításának idejét korábbi tanulmányok alapján határoztuk meg. Ezekben a kísérletekben kimutatták, hogy a patkány számos intestinalis és extra-intestinalis szervében az LPS időfüggő módon váltja ki a NOS2 enzim indukcióját, illetve az erek gyulladását (Boughton-Smith és mtsai 1993, László és mtsai 1995, Garvey és mtsai 1997). Az LPS hatását a parotisra és a létrejövő gyulladásos reakciót a mirigy nedves súly:száraz súly arányának mérésével igazoltuk. A kísérletet megelőzően 4 napig az állatok egy része L-NAME-et (NGnitro-L-arginin metil-észter, nem szelektív NOS-inhibitor) kapott az ivóvízben (0.1 mg/ml, azaz 10 mg/kg/nap), amit szubkrónikus előkezelésnek hívunk. Az L-NAME koncentrációját és az alkalmazás idejét korábbi közlemények alapján választottuk (Vág és mtsai 2001). 35

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

5. NOS enzim aktivitás mérése Meghatároztuk a teljes mirigyben a Ca2+-függő (ilyen a NOS1 és NOS3 izoforma), valamint a Ca2+-független (ilyen a NOS2) NOS aktivitást. A kísérlet alapja, hogy a NOS enzim hatására az L-[14C]-arginin L-[14C]-citrullinná alakul át, ahogy azt korábbi közleményekben leírták (Salter és mtsai 1991, László és mtsai 1995, Kiss és mtsai 1997). Eltávolítás után a szövetet 15 s-ig pufferben (pH 7.4; 0 °C) homogenizáltuk (250 mg szövet/1 ml), amely 10 mM Hepest, 32 mM szukrózt, 1 mM dithiothreitolt, 0.1 mM EDTA-t, 10 µg/ml szója tripszin inhibitort, 10 µg/ml leupeptint, valamint 2 µg/ml aprotinint tartalmazott. A homogenizátumot 20 percig 10000 g-n, 4 °C-on centrifugáltuk. A felülúszót Dowex gyantával (50W-8; 200-400, 8 % cross-linked, Na+ form) kevertük össze és további 10 percig centrifugáltuk (10000 g, 4 °C). A felülúszókat (40 µl) 10 percig 37 °C-on a reakciós pufferrel (110 µl) inkubáltuk. A reakciós pufferben a következő végkoncentrációjú anyagok szerepeltek: 50 mM KH2PO4, 1 mM MgCl2, 0.2 mM CaCl2, 50 mM valin, 1 mM dithiothreitol, 15.5 nM L-arginin, 1 mM L-citrullin, 0.3 mM NADPH, 3 µM FAD, 3 µM FMN, 3 µM THB4 és 0.17 µM [14C]L-arginin. Ezen kívül minden mintához 1010 µl fiziológiás sóoldatot, EGTA-t (1 mM), vagy NG-nitro-L-arginin-t (L-NNA, 1 mM) mértünk. A reakciót 0.5 ml 1:1 térfogat arányú Dowex:víz elegy hozzáadásával állítottuk le, mely eltávolította a megmaradt L-arginint, mint szubsztrátot. Desztillált víz (0,85 ml) hozzáadása és 30 perces ülepítés után a felülúszót leszívtuk, és szcintillációs koktél (2 mL Pico-Fluor) hozzámérése után meghatároztuk a minták radioaktivitását. A protein tartalmat spektrofotometriás esszével határoztuk meg (Bio-Rad Protein Assay). A NOS aktivitást pmol/perc/mg fehérje értékben állapítottuk meg. A teljes NOS aktivitást az in vitro fiziológiás sóval, valamint L-NNA val történt inkubáció során keletkezett citrullin mennyisége jelentette. Ezen belül a Ca2+-függő cNOS-aktivitást az EGTA-val és az LNNA-val történt inkubáció során kapott aktivitások különbsége adta meg. A Ca2+-független NOS-aktivitást a fiziológiás sóval és az EGTA-val inkubált eredmények különbsége jelentette.

36

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

6. Parotis acinus sejtek izolálása Acinusok izolálására Telbisz és Kovács (1999) korábban leírt módszerét használtuk, kisebb módosításokkal. A patkányokat Nembutallal (35 mg/kg, i.p.) altattuk, majd az altatott patkányokon felsőtest-perfúziót végeztünk. A mellkas feltárása után a hasüreg felé futó ereket peánnal leszorítottuk, majd a szívbe a bal kamrán keresztül retrográd irányban kanült helyeztünk. A jobb pitvar falába lyukat vágtunk a perfúziós folyadék elfolyásának biztosítására. Ezek után 2 lépésben perfundáltunk, 5 percig kb. 100 ml Ca-mentes pufferral (PB, perfusion buffer, összetétele: 10 ml PBC (perfusion buffer concentrate), 0,22 g glükóz és 2,5 ml EDTA törzsoldat 200 ml végtérfogatban; pH=7,3. A PBC összetétele: 41,5 g NaCl, 2,5 g KCl, 12 g HEPES és 30 ml 1 M NaOH 200 ml végtérfogatban. Az EDTA törzsoldat elkészítése: 0,18 selection B2 10 ml fiziológiás sóldatban oldva), majd újabb 5 percig kb. 100 ml Ca-tartalmú oldattal (SB, suspension buffer, össztétele: 20 ml SBC (suspension buffer concentrate), 10 ml CaMgC (calcium magnesium concentrate) és 0,18 g glükóz 200 ml végtérfogatban; pH=7,3. Az SBC összetétele: 8 g NaCl, 0,8 g KCl, 0,3 g KH2PO4, 0,2 g Na2SO4, 14,4 g HEPES, 13,8 g TES, 13 g Tricine és 3,75 g NaOH 200 ml végtérfogatban. A CaMgC összetétele: 0,52 g MgCl2*6 H2O és 0,72 g MgCl2*2 H2O 200 ml végtérfogatban). A jó perfúzió megkönnyíti a parotis kiemelését, illetve elősegíti, hogy a kollagenáz egyenletesen átitassa a szervet. A kiemelt parotist kollagenázt (200 U/ml) tartalmazó 0 °C–os pufferbe (HEPES-puffer, összetétele: 27 ml NaCl, 1,25 ml KCl, 0,32 ml KH2PO4, 2 ml MEM, 2 ml NE, 2 ml 200 mM glutamine, 1,187 g HEPES, 0,39 g glükóz, 0,3 g MgSO4, 0,92 CaCl2 és 1 g BSA (bovin serum albumin) 200 ml végtérfogatban; pH=7,3) helyeztük és az egyenletesebb enzimhatás elérése érdekében egy perfúziós pumpa segítségével az oldatot a kötőszövetes tok alá injektáltuk 0 °C-on. Ezek után a mirigyet 5-5 darabra vágtuk és egy Erlenmeyer-lombikba helyeztük, 10 ml kollagenázos pufferbe. Vibrothermben inkubáltuk 37 °C-on 2 menetben, összesen 50 percig (30 perc után a kollagenázos puffert frissre cseréltük, majd újabb 20 perces inkubálás következett). A szövetet egyre csökkenő pipettahegyeket (4, 2 és 1 mm) használva disszociáltuk, majd egy 200 µm átmérőjű neylon szűrő segítségével átszűrtük. Az acinus sejteket albumin grádiens (4 %-os BSA) segítségével tisztítottuk, 200 g-n, 4°C-on, 2 percig centrifugálva. Ezek után a sejteket HEPES37

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

pufferbe helyeztük, majd a kolinerg agonista Ach-nal (10-8-10-4 mol) inkubáltuk 37 °C-on, 30 percig. A kezelés után a mintákat centrifugáltuk és a felülúszót leszívtuk. Végezetül az acinus sejt szuszpenzióhoz Triton-X-et tartalmazó lízis puffert (összetétele: 0,138 g Na H2PO4, 0,1 g BSA és 100 ml Triton-X; 100 ml desztillált vízben) mértünk, melynek hatására a sejtek szétestek.

7. Immunhisztokémia A frissen izolált acinus sejtekből kimértünk 1 ml szuszpenziót, majd SuperFrost Plus üveglemezekre (Menzel-Glasel, Germany) csapattuk Shandon Cytospin

citocentrifuga

szobahőmérsékleten,

segítségével

(1500

rpm,

5

perc).

foszfátpufferben

(PBS,

pH

7.4)

oldott

A

sejteket 4

%-os

paraformaldehiddel fixáltuk 30 percig. Miután PBS-ben 3-szor átmostuk a preparátumot, 10 perces előinkubációt végeztünk 0.3 % H2O2-ot tartalmazó PBSben, az endogén peroxidáz aktivitás blokkolására. Ezek után kimostuk a maradék H2O2-ot, és a nem specifikus kötőhelyeket PBS-ben oldott 7 %-os normál kecske szérum 30 perces hozzáadásával blokkoltuk. Ezt követően 1 éjszakán át 4 °C-on, 1: 50 hígítású NOS2 monoklonális antitesttel inkubáltuk a sejteket, kivéve az első réteg, antitestet nem tartalmazó kontrollt, melyet a blokkolóban inkubáltunk (ez az aspecifikus jelölődés kiszűrésére szolgál). PBS-sel történő alapos mosás után a sejteket biotinilált anti-nyúl IgG-vel inkubáltuk 2 órán keresztül. Az avidin-biotin komplex reakciót 3'3'-diaminobenzidinnel (DAB) hívtuk elő a gyártó cég előírása alapján (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Parallel

preparátumokon

immunfluoreszcens

jelölést

készítettünk.

Fixálás és mosás után a sejteket primer ellenanyagként NOS2 antitesttel inkubáltuk 1 éjszakán át. A mosások után fluoreszcens-konjugált 1:100 hígítású anti-nyúl IgG-t használtunk szekunder ellenanyagként, ezzel inkubáltunk 2 órán át. Mind a fluoreszcensen jelölt, mind a DAB-bal előhívott preparátumokat PBS-sel, majd desztillált vízzel mostuk. A DAB-os preparátumokon Papanicolau-A Haematoxilinnal festést végeztünk 1 percen keresztül, majd csapvízzel mostuk és Aquatex-be ágyaztuk. Az immunfluoreszcens preparátumok beágyazóanyaga Biomedia Gel volt. (Electron Microscopy Sciences, Washington, USA). A fotókat

38

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

Olympus mikroszkóp és digitális kamera segítségével készítettük. A fluoreszcens preparátumokhoz 488 nm-es szűrőt használtunk. Az eredeti nagyítás 20X-os volt.

8. Western-blot analízis A teljes parotis szövetet, vagy a frissen izolált acinus sejteket lemértük. Ezek után jéghideg TRIS-mannitol pufferben (pH 7.4) homogenizáltuk (Ultra Turrax T8; 20000/perc, 2x30 másodperc), amely 2.0 mM TRIS 7-9-et, 50.0 mM mannitolt, 100.0 µM fenilmetilszulfonil fluoridot, 12.0 µM leupeptint, 0.5 mU/ml aprotinint és 0.5 %-os Triton-X 100-at tartalmazott. A sejt üledéket centrifugálással csapattuk ki, 12000 rpm-en, 20 percig, 4 °C-on. A teljes protein mennyiség 25 µl-es felülúszóit denaturáltuk. Ehhez öszekevertük, majd forraltuk a mintákat ekvivalens mennyiségű (25 µl), 20 mM Tris 7-9-et, 3.0 mM EDTA-t, 2 % SDS-t, 10 % merkaptoetanolt, 20 % glicerolt és elenyésző mennyiségű brómfenol-kéket tartalmazó oldatban. A fehérje minták azonos mennyiségein elektroforézist végeztünk (100 V-on) 7.5 %-os SDS-PAGE gélen. Az elektroforézis után a fehérjét a festetlen gélről elektroforetikus úton nitrocellulóz membránra juttattuk (átblottoltuk) (Amersham, Pharmacia Biotech., Bucinghamshire, UK). A mintákat megfelelően hígított (1:2000) NOS2 egér poliklonális antitesttel jelöltük, majd 1:2000 hígítású, HRP-konjugált másodlagos anitestet használtunk, és az immunoreaktív csíkokat ECL Advance Western Blotting Detection Kit-tel tettük láthatóvá (Amersham Biosciences).

9. Amiláz szekréció meghatározása az izolált parotis acinus sejtekben A parotis acinus sejtek izolálása után spektrofotometria segítségével (Telbisz és Kovács 1999, Tsunoda és mtsai 2003) mértük a sejtek bazális és Ach-nal stimulált

amiláz

szekrécióját.

A

minták

(felülúszó

és

sejtszuszpenzió)

amiláztartalmának meghatározásához Bernfeld módszerét (1965) alkalmaztuk, kisebb módosításokkal. Az amiláz szubsztrátjaként keményítőt használtunk. A módszer lényege, hogy a mintákhoz adott keményítőt az amiláz bontja, ennek eredményeképpen redukáló cukrok keletkeznek. Amikor az oldatot 3,5dinitroszalicilsavval

hevítjük,

nitroamino-szalicilsavak 39

keletkeznek,

melyek

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

absorptioját 546 nm-en, spektrofotométerrel mérhetjük. Standardnek maltóz görbét használtunk. Az eredményeket az amiláz release %-ában adtuk meg. Ezt úgy kalkuláltuk, mint az inkubációs közeg (felülúszó) amiláz aktivitása, valamint a total amiláz (felülúszó+sejtszuszpenzió) aktivitás közötti arány. STATISZTIKAI VIZSGÁLATOK A kísérleteink során nyert eredményeket az átlag ± standard hiba (mean ± S.E.M) formában fejeztük ki. A megfelelő mintákat próba segítségével hasonlítottuk össze. Az in vivo kísérletekben legalább 8 parallel mintát használtunk. A változásokat a kontoll értékek százalékában számítottuk ki. Statisztikai értékelésre variancia-analízist (ANOVA) használtunk. Az in vitro kísérletek statisztikai értékelésére a Mann-Whitney non-parallel

U-tesztet

és

a

Tukey-Kramer

többszörös

összehasonlító

tesztet

alkalmaztuk. A változást csak a 0,05-nál kisebb valószínűségi érték (p) esetén fogadtuk el szignifikánsnak. A statisztikai kiértékeléshez a Microsoft Excel nevű programot használtuk.

40

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

EREDMÉNYEK IN VIVO VIZSGÁLATOK

1. Az éheztetés hatása a parotis és szérum izoamiláz enzim aktivitásra

A szérum parotis izoamiláz szintje nem éheztetett patkányokban 5,78±0,79 U/l volt (n=10). A 16 órán keresztül éheztetett állatokban ez az érték kissé csökkent, 4,10±0,68 U/l-re (n=10; p<0,01). Kísérleti körülményeink között parotis szöveti amiláz aktivitás 5,00±0,94 U/100 mg volt, nem éheztetett patkányokban (n=10). 16 órás éhezés hatására ez 7,69±1,52 U/100 mg-ra nőtt (n=10; p<0,01). Az elektroforézis során a parotis amiláz, illetve a szérum parotis izoamiláz azonos irányba, míg a pancreas amiláz izoenzim az ellentétes irányba mozgott. A későbbiekben a pilokarpin hatását vizsgáltuk a szérum és a parotis szöveti izoamiláz szintjére. A pilokarpin gyengébb paraszimpatikus ágens, mint az Ach, viszont a

kolinészterázok

nem

tudják

lebontani.

Szisztémásan

alkalmazva

bőséges

nyálelválasztást indukál, a paraszimpatikus idegrendszer aktiválásával (Fergunson 1993). Eredményeink szerint 1 órával a pilokarpin beadása után 39±9 %-kal (n=20); p<0,01) csökkent a szöveti enzimaktivitás, míg 101±39 %-kal nőtt a szérum enzimaktivitás (n=20; p<0,01) (6. ábra).

2. A táplálékfelvétel hatása a parotis és szérum izoamiláz enzim aktivitásra

A következő kísérletben az etetés hatását vizsgáltuk az éheztetett állatokra. A 16 órán keresztül éheztetett patkányokban az 1 órás etetés hatására a parotisban 35±15 %kal (n=18; p<0,01) csökkent, míg a szérumban 41±17 %-kal (n=18; p<0,05) nőtt az amiláz aktivitás (7. ábra). Végül a táplálékfelvétel hatását vizsgáltuk a parotis és a szérum amiláz szintjére a sötét periódus első két órájában. Ebben az időszakban a patkányok nagyobb mennyiségű táplálékot vesznek magukhoz, míg a világos időszakban csak kevés tápot fogyasztanak. Ezen kísérleti körülmények között, a spontán táplálékfelvétel első két 41

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

órájában az amiláz szint 27±7 %-kal (n=16; p<0,01) csökkent. Ezzel párhuzamosan a szérum amiláz koncentráció 16±1 %-kal (n=16; p<0,05) nőtt azon állatok értékeihez

amiláz aktivitás (a kontroll érték %-ában)

képest, ahol a táplálékot megvonták a sötét periódus kezdetekor (8. ábra).

**

250 200 150

100

**

50 0 fiziológiás só

pilokarpin

fiziológiás só

parotisz szövet

pilokarpin

szérum

6. ábra A parotis szövet és a szérum amiláz aktivitása 1 órával pilokarpin (5 mg/kg, s.c.)

amiláz aktivitás (a kontroll érték %-ában)

beadását követően (n=20; **p<0,01) 200

*

150

100

**

50

0 éheztetett táplált parotisz szövet

éheztetett táplált szérum

7. ábra 1 órás táplálékfelvétel hatása a parotis szövet és a szérum amiláz aktivitására, 16 órás éheztetést követően (n=18; *p<0,05; **p<0,01)

42

amiláz aktivitás (a kontroll érték %-ában)

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

150

** 100

**

50

0 éheztetett táplált parotisz szövet

éheztetett táplált szérum

8. ábra Spontán táplálékfelvétel hatása a parotis szövet és a szérum amiláz aktivitására, 16 órás éheztetést követően (n=16; **p<0,01)

IN VITRO VIZSGÁLATOK

1. A NOS2 expressziója, endotoxin alkalmazása után

Az endotoxint (LPS) intravénásan alkalmaztuk, 3 mg/kg koncentrációban, 5 órával a kísérlet kezdete előtt. A létrejött gyulladás során a kísérleti állatok, valamint a nyálmirigyek nedves súlya, illetve amiláz tartalma nem változott (3. táblázat). A száraz súly azonban jelentős eltérést mutatott, és mi a nedves és száraz súly közötti ratiot adtuk meg, mint a gyulladás során létrejövő ödémára jellemző indexet, ami 86,8±0,4%-ról 90,2±0,5%-ra nőtt (n=10) (9. ábra). A citrullin-esszét alkalmazva azt találtuk, hogy az LPS szignifikánsan növelte a totál NOS aktivitást (1,38±0,08-ról 1,77±0,10-re, pmol/perc/mg fehérjében megadva, n=7, p<0,05) a teljes mirigyben. Ez a változás a Ca2+-független NOS2 aktivitásának emelkedését jelentette (0,022±0,008-ről 0,214±0,045-re, pmol/perc/mg fehérjében megadva, n=7, p<0,05), mivel a Ca2+-függő cNOS-aktivitás nem változott (1,36±0,11 és 1,53±0,05 pmol/perc/mg fehérje, LPS kezelés előtt és után, n=7) (10. ábra). 43

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

3. táblázat A kísérleti állatok súlyának, a parotis tömegének és az amiláztartalomnak a változása szisztémás LPS-kezelés (3 mg/kg, 5 óra, i.v.) után (n=10). Kontroll

LPS-kezelt

Állat súlya (g)

224,8 ± 5,065

231,5 ± 5,372

Parotis (nedves) súlya (g)

0,411 ± 0,013

0,450 ± 0,031

Amiláztartalom (µg)

81,5 ± 5,002

95,0 ± 5,465

A parotisz nedves és száraz súlya közötti arány (%)

92

***

91 90 89 88 87 86 85 84

Kontroll

LPS-kezelt

9. ábra A parotis nedves súly:száraz súly arány változása szisztémás LPS-kezelés (3 mg/kg, 5 óra, i.v.) után, a kontroll csoporthoz képest (n=10; ***p<0,001).

44

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

0.3

**

NOS2 enzim aktivitás (pmol/perc/mg fehérje)

0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 Kontroll

LPS-kezelt

10. ábra A NOS2 (NOS2) enzim aktivitásának változása szisztémás LPS-kezelés (3 mg/kg, 5 óra, i.v.) után, patkány parotisban, n=7, *: p<0,05 a kontroll csoporthoz képest.

Ezek után immunhisztokémiai módszerrel is megvizsgáltuk a NOS2 aktivitását az izolált parotis acinus sejtekben. Az immunfluoreszcens festék intenzitása szignifikánsan nagyobb volt az LPS-kezelt sejtekben, a kontrollhoz képest (11. ábra). A Western-blot analízis is erőteljes NOS2 fehérje expressziót jelzett a parotisban a kontrollhoz képest, LPS alkalmazása után mind a patkány parotis szövetben, mind az izolált acinus sejtekben. Csekély mennyiségű NOS2 a kontroll acinus sejtekben is látható (12. ábra).

45

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

11. ábra NOS2 fehérje expresszió változása, immunhisztokémiával meghatározva, szisztémás LPS-kezelés (3 mg/kg, 5 óra, i.v.) után, izolált patkány parotis acinus sejtekben. Nagyítás: 20X A=kontroll; B=LPS-kezelt

12. ábra NOS2 fehérje expresszió változása, Western-blottal meghatározva, szisztémás LPSkezelés (3 mg/kg, 5 óra, i.v.) után, patkány parotis szövetben és izolált acinus sejtekben.

46

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

2. Az acinussejtek amiláz szekréciója, endotoxin alkalmazását követően Ach-nal (10-8-10-4 mol) történő 30 perces in vitro inkubáció hatására az izolált patkány parotis acinus sejtekben dózisfüggő módon nőtt az amiláz-szekréció. Szisztémás LPS-kezelés hatására csökkent mind a bazális, mind az Ach-nal stimulált amiláz szekréció az izolált parotis acinus sejtekben (55±10 %-kal, illetve 49±6 %-kal (10-6 mólos Ach koncentráció, n=5-7, p<0,01). Az in vivo alkalmazott NOS-inhibitor LNAME nem befolyásolta szignifikánsan sem a bazális, sem az Ach-nal stimulált amiláz szekréciót, és az LPS gátló hatását sem befolyásolta (13. ábra).

13. ábra A bazális és az Ach-nal stimulált amiláz szekréció változása szisztémás LPS (3 mg/kg, 5 óra, i.v.) és L-NAME kezelés (0,1 mg/ml, 4 napig az ivóvízhez adva) hatására, 30 perces inkubációt követően, izolált patkány parotis acinus sejtekben. Az adatokat az átlag ±SEM-ként adtuk meg, n=5-7; *p<0,05 a kontroll és LPS-kezelt csoport között; #p<0,05 a bazális és Ach-nal indukált amiláz szekréció között.

47

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

MEGBESZÉLÉS A szekrétoros mirigyeknek alapvetően 2 fajtáját különbözetjük meg, úgymint exokrin és endokrin mirigyek. Az exokrin mirigyek termékeiket a mirigy ductus rendszerén keresztül a külső környezetbe (például a gastrointestinalis traktus lumenébe) szekretálják. Ugyanakkor az endokrin mirigyek produktumaikat az interstitiumba, majd a keringésbe választják ki. A szekrétumok célba juttatása mindkét mirigyben feltételezi a szekrétoros sejtek polaritását. Az exokrin sejtekben a transzport a szintézis helyéről a sejt apikális (ductus felé néző) membránja felé történik, míg az endokrin mirigyek sejtjeiben a bazolaterális (ér felé néző) felszín felé. A pancreas és a nyálmirigyek ugyanis

nemcsak

az

emésztőtraktusba,

hanem

a

véráramba

is

juttatnak

emésztőenzimeket. Ezen mirigyek tehát inkább „duakrin”, mint exokrin mirigyek, mivel termékeiket a külső környezetbe és a keringésbe szekretálják. In vivo vizsgálatainkban az exokrin parotis endokrin funkcióját vizsgáltuk, az egyik igen jelentős emésztőenzim, az amiláz szekréciójának vizsgálatán keresztül. Kísérleteink eredményei azt mutatták, hogy pilokarpin hatására a parotisban csökken az amiláz szintje, míg a szérum izoamilázé növekszik. Az éheztetést követő táplálékfelvétel hatására hasonló, de kisebb mértékű változást láttunk a parotis és szérum amiláz aktivitásában. Az ad libitum táplált patkányok esetében a sötét periódus korai szakaszában történő táplálékfelvétel hatására az amiláz aktivitás szintén csökkent a parotisban, míg a szérumban nőtt. Megfigyeltük, hogy a parotis és szérum eredetű izoamiláz elektroforetikus tulajdonságai megegyeznek. A pancreas eredetű izoamiláz azonban a parotisból származó izoamilázhoz képest ellentétes irányban mozdul el a gélben elektroforézis során. Ezek az eredmények megegyeznek korábbi tanulmányok eredményeivel (Hammerton és Messer 1971, Sanders és Rutter 1972, Takeuchi és mtsai 1974, Takeuchi és mtsai 1975). Vizsgálataink és számos más munkacsoportok tanulmányai kimutatták továbbá azt is, hogy a szérumban cirkuláló izoamiláz nagy része parotis eredetű. A pancreas és a máj csak kisebb mértékben járul hozzá a szérum amilázaktivitásához (Takeuchi és mtsai 1975, Proctor és mtsai 1990, Proctor és mtsai 1991, Ikeno és Ikeno 1991).

48

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

A pilokarpin szérum és parotis amilázszintjére kifejtett hatását vizsgáló kísérleteink eredményei szintén egybevágnak a korábbi eredményekkel. Ikeno munkacsoportja a kapott eredmények magyarázatára feltételezte, hogy az intraductalis nyomásfokozódás lehet a fő oka annak, hogy pilokarpin adása után a szérumban nőtt az amilázaktivitás (Ikeno és mtsai 1984, Ikeno és mtsai 1988). Proctor és munkatársai szerint

a

paraszimpatikus

koncentrációjú

parotis

idegi

stimuláció

szekrétumot,

nagy

mennyiségű,

ugyanakkor

szérum

de

alacsony izoamiláz

koncentrációnövekedést eredményez. A szimpatikus ideg stimulációjára magas lesz az amiláz szintje a nyálban, míg a szérumban nem, vagy alig változik. Továbbá feltételezték, hogy a szérumban keringő amiláz mennyisége arányos a termelt nyál volumenével (Proctor és mtsai 1989). Azon tanulmányok, melyek során jelzett amilázt juttattak a ductus rendszerbe retrográd úton, kimutatták, hogy az amiláz valószínűleg a sejtek közötti tereken keresztül jut ki a ductusból (paracelluláris transzport) (Garrett és Parons 1976, Ikeno és mtsai 1984, Isenman és mtsai 1999, Mazariegos és mtsai 1984). Ugyanakkor az exocytosis lehetősége sem kizárt, hiszen az emésztőenzimek esetén nagyméretű molekulákról van szó. Elképzelhető, hogy bizonyos hatások (például gyulladás), melyek növelik az exocytosis rátáját az apikális oldalon, arányosan fokozzák az exocytosist a bazolaterális oldalon (Isenman és mtsai 1999). Amikor az éheztetett állatok táplálékot vesznek magukhoz, a parotisban az amiláz akitivitás csökken, míg a szérumban nő. Ez a hatás valószínűleg egyidejű paraszimpatikus és szimpatikus hatásnak köszönhető, mivel az amiláz szint növekedése a szérumban mind paraszimpatektómiával, mind a parotist beidegző szimpatikus ideg átvágásával, mind propranollal végrehajtott β-adrenerg blokáddal kivédhető (Proctor és mtsai 1990). Vizsgálataink mutatták ki először, hogy az amiláz szintje a parotisban és a szérumban a napi spontán táplálékbevitel által szabályozott. Ad libitum táplált patkányokban, a sötét periódus első óráiban (amikor az állatok napi táplálékuk nagy részét megeszik) a nyálmirigyben csökken, míg a szérumban nő a parotis izoamiláz szint. Ez az egyidejű, ugyanakkor ellentétes irányú változás arra utal, hogy a táplálékfelvétel olyan idegi és hormonális szabályozó útvonalakat aktivál, amelyek az amiláznak a parotisból a szérumba jutásához vezetnek. A patkányok sokkal többet esznek éjjel, mint nappal, a 12-12 órás fényciklus során a táplálék 80-90%-át a sötét 49

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

periódusban fogyasztják el (Grenwood és mtsai 1980, Kraly és mtsai 1980, Kumar és mtsai 1988). Sreebny és munkatársai írták le elsőként, hogy a fehérjék szekréciója és tárolása a patkány parotisban diurnális jellegű (Sreebny és Johnson 1969). A diurnális táplálkozás megszokott jelenség a természetben (Kennaway 1998). A patkányoknál a diurnális táplálkozás azt jelenti, hogy éjjel pozitív az energia mérleg, és a táplálék nagy részét ekkor fogyasztják, míg nappal, amikor negatív az energia mérleg, alig esznek (Le Mangen 1983). Ennek megfelelően a sejtek és a szekréciós granulumok mérete este, az étkezés kezdetekor a legnagyobb, és reggel a legkisebb. A diurnális étkezési mintát sem a folyamatos fény, sem a folyamatos sötét nem befolyásolja (Fukushima és mtsai 1985). A diurnális étkezést a nucleus suprachiasmaticus sérülése megszünteti (Nagai és mtsai 1978). A parotis és a szérum amiláz szintjét nemcsak maga a táplálkozás, hanem a táplálék konzisztenciája is befolyásolja. Folyékony táplálék bevitel hatására az amilázaktivitás patkányban sem a parotisban, sem a szérumban nem változik, míg szilárd táplálék hatására a parotis amilázaktivitása szignifikánsan csökken, a plazmáé pedig szignifikánsan nő (Kurahashi és mtsai 1999b). Asztély és munkatársai szerint nem zárható ki, hogy szilárd táplálék rágásakor a periodontalis mechanoreceptorok aktiválódása a felelős a parotis amiláz szekréciójának növekedéséért, egy nem adrenerg és nem kolinerg szekrétoros mechanizmus révén (Asztély és mtsai, 1994). Kurahashi és munkacsoportja szerint azonban az amiláz szekréciójának emelkedését sokkal inkább a szilárd táplálék íze és az oralis mucosaval való kontaktusa okozhatja. (Kurahashi és mtsai 1999a). Mindezt igazolják későbbi kísérleteik is, melyben csökkent nyáltermelésű (glandula submandibularis és sublingualis ductusának lekötésével) patkányokat használtak (Kurahashi 2002). A patkányok táplálékbevitelét az előbbieken kívül még számos hormon és neurotranszmitter szabályozza, például a CCK (Reidelberger és mtsai 1994, Reidelberger és mtsai 1991), a neuropeptid Y (Beck 2000) és a leptin (Nagatani és mtsai 2000). Az 1987-ben felfedezett vazoaktív gáz és neurotranszmitter, a NO szintén hat a gastrointestinalis rendszerre, és így a nyálmirigyek szekréciójára is. A NO-ot szintetizáló NOS enzim eloszlása a különböző nyálmirigyekben és fajokban eltérő. A patkány submandibularis nyálmirigyben leginkább a mirigyhez 50

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

közeli idegágakban és a ductusokban találtak NOS enzimet, az acinussejtekben pedig csak nyomokban, illetve alig (Lomniczi és mtsai 1998, Xu és mtsai 1997). Patkány parotis acinus sejtek endogén NOS aktivitását különböző technikákkal számos munkacsoport bizonyította (Tritsaris és mtsai 2000, Looms és mtsai 2000, Ishikawa és mtsai 2002). A szerzők többsége a sejtekben mért NOS-t neuronális természetűnek tartja (NOS1) (Mitsui és Furuyama 2000, Ishikawa és mtsai 2002). Nem kizárt azonban, hogy az acinussejtek NOS2-t (iNOS) is expresszálnak. Ugyanis annak ellenére, hogy az acinussejtekben igen alacsony a bazális NOS-aktivitás, a bazális NO termelés növekszik az idő függvényében. Ez a bazális NOS aktivitás kapcsolatban állhat a sejtek „stressz” állapotával, és az inkubáció ideje alatt a NOS2 expresszió enyhén emelkedik (Looms és mtsai 2002). Ez lehet a magyarázata annak, hogy kísérleteinkben a kontroll sejtekben a Western-blot halvány csíkot jelzett a NOS2-re. A nyál első számú barriernek számít a szervezetbe bekerülő baktériumokkal és vírusokkal szembeni védelmi rendszerünkben. Számos tanulmány vizsgálta már a fertőzés hatását a nyálmirigyekre (elsősorban a glandula submandibularisban és sublingualisban), bakteriális endotoxin befecskendezése után (Lomniczi és mtsai 2001, Rettori és mtsai 2000, Kawabata és mtsai 2001). Munkánk célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogyan hat az endotoxin a szekrécióra patkány parotisban. Ismeretes, hogy az amiláz szekréció szabályozása a patkány parotisban és a submandibularis mirigyben eltérő. A submandibularis nyálmirigyben az amiláz szekréció konstitutív jelenség, mely független a különböző extra- és intracelluláris hatásoktól.

A

submandibularis

nyálmirigy

amiláz

szekréciója

egyedül

a

mikrofilamentumok integritásától függ. Kizárólag a mikrofilamentumok szétesése gátolja az amiláz kiválasztást, a legkülönbözőbb farmakológiai ágensek (például βadrenerg agonista, NO-donor, NOS-gátló, stb.) nem hatnak a szekrécióra (Busch és mtsai 2002). Eredményeink

megerősítik,

hogy

endotoxin

szisztémás

vagy

helyi

alkalmazása után az amiláz szekréció csökken a különböző nyálmirigyekben (parotis és submandibularis nyálmirigy) és különböző fajokban (patkány, egér) (Rettori és mtsai 2000, Lomniczi és mtsai 2001, Español és mtsai 2003). Mivel ezeket a vizsgálatokat a teljes mirigyen, illetve szövetszeleteken végezték, így arra nem adhattak választ, hogy az LPS sejt szinten direkt vagy indirekt módon csökkenti az amiláz 51

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

kiválasztást. Eredményeink azt mutatják, hogy a parotis acinus sejtekben az LPS indirekt mechanizmus révén csökkenti az amiláz szekréciót. Az LPS által kiváltott gyulladás egyik legfontosabb eredménye a NOS2 izoenzim aktivációja révén megemelkedett NO-szint. In vivo körülmények között patkányban az LPS intravénás injekciója az idő függvényében a NOS2 expressziójának fokozódásához és gyulladás kialakulásához vezet a gyomor-bél traktusban és számos extra-intestinalis szövetben (Boughton-Smith és mtsai 1993, László és mtsai 1994, László és mtsai 1995). A NOS2 expressziója és a hozzá kapcsolódó gyulladás az LPS beadása után 3 óra múlva fejlődik ki, és 5 óra múlva éri el a maximumát (BoughtonSmith és mtsai 1993, László és mtsai 1994). Nem szelektív NOS-inhibitor (például LNAME), vagy szelektív NOS2-inhibitor (például 1400W) alkalmazása az LPS-sel kiváltott NOS2 expresszióval egyidőben (például L-NAME), vagy az LPS beadásával egyidőben (például 1400W) csökkenti a gyulladást számos szervben, többek között a bélben (László és mtsai 1994, László és Whittle 1997, Garvey és mtsai 1997). A patkány teljes parotis szövetét, valamint izolált acinus sejteket használva eredményeink megegyeznek azon megfigyelésekkel, melyek szerint az LPS a NOS2 expresszióját okozza 5 óra elteltével. A mucin-szekretáló sejteken végzett korábbi kísérletek eredményei azt mutatják, hogy az endotoxin csökkenti a mucin-szekréciót, valamint a NOS2 expressziójához vezet (Slomiany és Slomiany 2002). Az LPS által kiváltott NO-indukció azonban az amiláz-termelő és mucin-termelő sejtekben különbözik. Nyúl sublingualis mirigyéből izolált mucin-szekretáló sejteken Slomiany és Slomiany (2002) kimutatták, hogy az in vitro inkubálás L-NAME-mel megakadályozta az LPS mucin-szintézist csökkentő hatását. Azaz ebben az esetben a NO direkt módon hatott a mucin-szintézisre. Ugyanakkor a patkány parotis acinus sejteken végzett kísérleteink azt mutatták, hogy az L-NAME in vivo nem hatott a bazális és acetil-kolinnal stimulált amiláz szekrécióra, és az LPS hatását sem befolyásolta. Azt feltételezzük, hogy a proteázaktivált receptor (PAR), ezen belül is a PAR-2 részben oka lehet annak, hogy LPS adásakor a NO különbözőképpen hat a nyálmirigyek mucin- és amiláz-secretiojára. A PAR-2 egyike annak a 4-tagú, G-proteinhez kapcsolt, 7 transzmembrán domainnel rendelkező receptorcsaládnak, amely a gastrointestinalis traktusban számos sejtben expresszálódik. Fiziológiás körülmények között a tripszin és tripszinszerű 52

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

molekulák aktiválják a PAR-2-t, amely hatással van a PIP2-bontásra, az arachidonsav kiválasztásra, az eikozanoidok szekréciójára és így a belek működésére is. Továbbá a PAR-2-nek patofiziológiás folyamatokban is szerepe van (Cenac és mtsai 2003). Korábban leírták a PAR előfordulását, valamint kiterjedt hatását a gastrointestinalis működésre, beleértve a nyálmirigyeket is (Kawabata 2003). A PAR-2 aktivációja növeli az amiláz és mucin szintézist a nyálmirigyekben, valamint szerepet játszik az LPS által kiváltott gyulladásban is, NO-dependens mechanizmusokon keresztül (Kawabata és mtsai 2000, Kawabata és mtsai 2002, Cenac és mtsai 2003, Kawabata 2003). Ugyanakkor a PAR-2 expressziója eltérő a különböző nyálmirigyekben. A parotisban alacsony a PAR-2 expressziója, míg a sublingualis nyálmirigy mutatja a legmagasabb expressziós értéket (Kawabata és mtsai 2000). LPS hatására a PAR-2-stimulációra adott szekréciós válasz gyengébb. Valószínűsítették, hogy endotoxaemiában a PAR-2 aktiválódik és deszenzitizálódik, valamint a nyálmirigyekben jelen lévő PAR-2 összefüggésben lehet a gyulladásos eseményekkel (Kawabata és mtsai 2001, Kawabata 2003). Összefoglalva elmondható, hogy a PAR-2 aktivációjára létrejövő NOfelszabadulás, a PAR-2 eltérő expressziója nyálmirigyekben, a PAR-2 által kiváltott amiláz- és mucin-szekréció, valamint az LPS-sel okozott PAR-2-deszenzitizáció lehet az oka - legalábbis részben - annak, hogy az LPS a mucin-szekréciót NO-függő módon gyengíti, míg az amilázszekréciót nyilvánvalóan a NO-tól független módon. Ezen eltérő mechanizmusok vizsgálatára további kísérletek szükségesek fiziológiás és patológiás (LPS által kiváltott gyulladás) körülmények között egyaránt - beleértve a PAR-2aktivációt is - annak tisztázására, hogy miért tér el a mucin- és amiláz-szekréció NOmediációja az acinussejt szintjén. Az eltérés másik oka lehet a kolinerg receptorok eltérő eloszlása a glandula submandibularisban és parotisban. A submandibularis nyálmirigyben kis számban M1 receptor is található. Kimutatták, hogy az M1 receptor aktiválja a NOS enzimet patkány submandibuaris nyálmirigyben (Leiros és mtsai 2000). A NOS-blokkolók hatására az Ach-nal kiváltott fehérjeszekréció szignifikánsan csökkent, ami arra utal, hogy az M1 receptor a NO-on keresztül indirekt úton okoz fehérjeszekréciót a patkány submandibularis nyálmirigyben. A parotisban viszont, ahol többnyire M3 receptor található, a kolinerg szekréció valószínűleg nem a NO-on keresztül valósul meg (Tobin és mtsai 2002). 53

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

Molero és munkatársai (1995) azt találták, hogy fiziológiás körülmények között a NO nem hat közvetlenül az amiláz-szekrécióra a nyálmirigyekhez nagymértékben hasonlító izolált pancreas acinus sejtekben. Tsunoda munkacsoportja hasonló eredményeket közölt izolált nyúl parotis acinus sejtek vizsgálatakor (Tsunoda és mtsai 2003). Ezek az adatok megegyeznek eredményeinkkel, melyekben a NO nem hat a bazális és acetil-kolinnal stimulált amiláz-szekrécióra sejt szinten. A teljes mirigyen és

szövetszeleteken

végzett

vizsgálatok

azonban

ellentmondásosak.

Egyes

kutatócsoportok igazolták, hogy a NO gátlása csökkenti, NO-donor alkalmazása pedig növeli az amiláz-szekréciót in vivo és parotis szövetszeleteken (Lohinai és mtsai 1999, Ishikawa és mtsai 2002, Yuan és mtsai 2003). Ugyanakkor újabb vizsgálatok azt mutatták,

hogy

a

paraszimpatikus

stimuláció

által

kiváltott

folyadék-

és

amilázszekrécióban a NO in vivo körülmények között nem játszik szerepet patkány parotisban (Sayardoust és mtsai 2006). Ezt megerősítették Finkelberg és munkatársai is patkány parotis szövetszeleteken végzett vizsgálataikkal, adataik szerint ugyanis a NOS nem hat közvetlenül az amiláz szekrécióra (Finkelberg és mtsai 2006). A fentieket összegezve valószínűsíthető, hogy a NO indirekt módon hat a nyálmirigyek amilázszekréciójára. A teljes mirigyben a NO elősegíti néhány neurotranszmitter, többek között noradrenalin vagy a VIP felszabadulását, és ezek fokozzák az amiláz szekréciót (Fujita-Yoshigaki és mtsai 1999, Mbaku és mtsai 2000, Roca és mtsai 2004). Patológiás

körülmények

között

nyálmirigy

gyulladás

során

in

vivo

rendszerekben és in vitro szövetszeletekben igazolták, hogy az endotoxin a nyálszekréciót NO-tól független (Rettori és mtsai 2000, Español és mtsai 2003), vagy részben függő (Lomniczi és mtsai 2001) mechanizmuson keresztül gátolja. Kimutatták, hogy az LPS a COX2-n (ciklooxigenáz 2) keresztül a PGE2 (prosztaglandin E2) - mely az emésztőcsatorna felső szakaszának egyik fő protektív faktora - felszabadulását okozza, amely kulcsszerepet játszik a nyálszekréció csökkentésében (Lomniczi és mtsai 2001, Español és mtsai 2003). Továbbá kimutatták, hogy az LPS hatására felszabaduló NO egyik indirekt hatása a PGE2 szintjének emelkedése, vagyis ezek az eredmények is megerősítik, hogy a NO indirekt módon gyengíti a nyálszekréciót (Rettori és mtsai 2000, Lomnici és mtsai 2001, Español és mtsai 2003). Újabb vizsgálatok szerint azonban a PGE2 is képes aktiválni a NO-termelődést. Patkány submandibularis mirigyben a PGE2 saját receptorán keresztül aktiválta a NO/cGMP útvonalat, tehát a 54

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

PGE2 és a NOS enzim között kétirányú kapcsolat áll fenn (Borda és mtsai 2002). Elképzelhető tehát, hogy a 2 molekula feedback mechanizmussal hatással van egymás szintézisére. In vitro kísérleteink eredményeit összegezve elmondhatjuk, hogy az endotoxin gyengíti a nyál barrier funkcióját a behatoló baktériumokkal szemben azáltal, hogy csökkenti a nyálszekréciót a parotisban az acinus sejtek szintjén. Ugyanakkor a bazális és az Ach-nal kiváltott vagy LPS-sel csökkentett amiláz-szekréciót a nem szelektív NOS-inhibitor L-NAME nem befolyásolja. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy fiziológiás és patológiás körülmények között a NO nem direkt módon szabályozza a bazális és Ach-nal stimulált amiláz szekréciót a patkány parotis acinus sejtben.

55

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

KÖVETKEZTETÉSEK In vivo kísérleteinkkel megállapítottuk, hogy a spontán táplálékfelvétel szabályozza a parotis szövet amiláz tartalmát és a szérum amiláz szintjét. A parotis amiláz tartalom, illetve a szérum amiláz aktivitás inverz változása táplálkozás hatására a parotis acinus sejt endokrin típusú szekréciós tevékenységére utalhat spontán táplálékfelvétel során. In vitro vizsgálataink eredményeiből arra a következtetésre juthatunk, hogy a NO sem fiziológiás, sem patológiás körülmények között nem rendelkezik direkt hatással a parotis acinus sejt amiláz szekréciójára. A bakteriális endotoxin indirekt módon csökkenti a parotis acinus sejt amiláz kiválasztását, s egyúttal aktiválja a NOS2 izoenzimet úgy szöveti, mint acináris szinten. A NOS-indukció által termelt többlet NO azonban nem hat a parotis acinus sejt amiláz kiválasztására.

56

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG Az exokrin mirigyek endokrin szekréciójának ismerete a mindennapi orvosi, klinikai gyakorlat számára sem elhanyagolható. Az α-amiláz aktivitás mérése a szérumban, vizeletben, nyálban és egyéb testnedvekben fontos diagnosztikus eszköz a parotis és pancreas megbetegedéseiben. A szomatikus sejtek géndefektusának kezelésében a génterápia lehetőséget ad számos fehérje (például hormonok, antibiotikumok, növekedési faktorok, anititestek, stb.) előállítására és keringésbe juttatására (Isenman és mtsai 1999). Az exokrin szervek, mint a pancreas vagy a nyálmirigyek endokrin szekréciója számos lehetőséget nyújt az ilyen jellegű terápiára. Goldfine és munkatársai humán növekedési hormon és inzulin rekombináns DNS-ét juttatták be exokrin mirigyek sejtjeibe retrográd úton, a ductus rendszeren keresztül (Goldfine és mtsai 1997). A sejtek előállították a kívánt fehérjét és bejuttatták a keringésbe. A módszer alkalmas volt arra, hogy az exogén fehérjék fiziológiás koncentrációja jöjjön létre a szérumban, és a szisztémás betegség gyógyítható legyen. Így lehetőség volt a magas vércukorszint kezelésére diabéteszes állatokban, ugyanis a humán inzulint kódoló plazmid egyszeri adására létrejött a normál glükóz homeosztázis. Az exokrin mirigyek fiziológiás endokrin szekréciójának pontos ismerete lehetőséget ad a génkutatás és szisztémás protein terápia segítségével számos betegség kezelésére. Egyes kórképekben, például multiplex myelomában, ahol paraproteinek (például immunglobulinok

könnyűlánc-komponensei,

vagy

amiláz)

szaporodnak

fel

a

szervezetben, a szérum amiláz meghatározása fontos eszköz lehet a prognózis szempontjából. A hyperamylasaemia kezdete ugyanis jelzi a betegség gyors lefolyását, így a szérum amiláz szint egy megbízható, a multiplex myeloma akitivitását jelző index lehet a mindennapi orvosi gyakorlat számára (Pinelli és mtsai 2006). A nyálmirigyek funkcióit, illetve a hozzá kapcsolódó molekulákat vizsgáló kutatások csak az utóbbi 3 évtizedben váltak igazán intenzívvé. Elsősorban a nyál emésztő és védő funkciói kerültek a tudományos érdeklődés középpontjába. Kiderült ugyanis, hogy például a csökkent nyáltermelés hatással van nemcsak a szájüregre, hanem az emésztőtraktus felső szakaszára, sőt az egész szervezetre is. Kísérleti állatokban gyógyszerrel létrehozott szájszárazság növelte szájpadra és szájüregre lokalizálódó rosszindulatú daganatok gyakoriságát (Wallenius 1966). A nyál tehát védő 57

GYAKORLATI HASZNOSÍTHATÓSÁG

és mikrobaellenes alkotói révén védi nemcsak a szájüreget, hanem az egész szervezetet is a behatoló káros ágensekkel szemben. A nyál egyik fontos alkotórésze a NO, mely összetett funkcióval rendelkezik mind az intra-, mind az extracelluláris szignál transzdukcióban. Ez a molekula egy "kétélű kardhoz" hasonlítható, hiszen alacsony koncentrációban kulcsszerepet játszik számos

fiziológiás

koncentrációban

folyamatban

(homeosztatikus

citosztatikus/citotoxikus

ágensként

hatás),

ugyanakkor

viselkedik

(Whittle

magas 1994).

Korábban azt feltételezték, hogy Sjögren-szindrómában a parenchyma pusztulását elsősorban lymphocyta infiltráció okozza. Ma már más tényezők, például nyálmirigyek sejtjeiben jelentkező abnormális NO-produkció szerepére helyezik a hangsúlyt (Konttinen és mtsai 1997). Sjögren-szindrómások kis labiális nyálmirigyeiben ugyanis azt találták, hogy az NOS2 gén expressziója igen magas, és ez folyamatos magas NOkoncentrációt tart fenn (Nathan és Xie 1994), amely végül szövetpusztuláshoz, a sejtek atrophiájához vezethet. Hasonlóan magas NO szintet mértek számos, az oralis mucosát érintő gyulladásos kórképben, mint például lichen planus vagy aphtha (Ohashi és mtsai 1999). A NO szerepe ismert a tumorbiológában is. Egyes endometrium és ovárium karcinómákban összefüggést találtak a tumor stádiuma és a NOS aktivitás között (Thomsen és mtsai 1994), továbbá a nyálmirigyekben mind benignus, mind malignus tumorokban megnövekedett NOS-expressziót mértek (Brennan és mtsai 2000, Bentz és mtsai 1998). A NO-nak tehát szerepe van a nyálszekréció szabályozásában, ugyanakkor fontos szignál molekula számos biológiai folyamatban. Mivel hatása sokrétű, a NO szintézis zavara számos szisztémás kórkép kialakulását eredményezheti, mint például hypertonia, diabetes mellitus, veseelégtelenség, immundeficienciák, vagy tumorok. A NO-hoz kapcsolódó kutatásokkal foglalkozó közlemények száma több tízezer. Ennek ellenére relatíve kevés publikáció jelent meg a fej-nyak régió NO által is érintett betegségeiről. Jelen munkánkban a NO-nak az egyik nagy nyálmirigyben, a parotisban kifejtett közvetlen effektusát vizsgáltuk. Számos kérdés vár még megválaszolásra, amíg e kis molekula összetett hatásait teljes egészében feltérképezzük.

58

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akikkel eddigi pályám során volt szerencsém megismerkedni és együtt dolgozni. Mindenek előtt köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Zelles Tivadarnak, az Orálbiológiai Tanszék volt igazgatójának, valamint Dr. Simon Györgynek, akik elindítottak a tudományos pályán. Szeretnék köszönetet mondani társtémavezetőmnek, Dr. László Ferencnek, aki felbecsülhetetlen szakmai és baráti segítséget nyújtott. Kiváló tudóst és embert ismerhettem meg személyében. Külön köszönetet szeretnék mondani Dr. Varga Gábornak, aki az MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetében és az Orálbiológiai Tanszéken biztosította számomra a lehetőséget a tudományos munkára, segített a kutatási téma kiválasztásában és ráirányította figyelmemet a kutatómunka szépségeire. Ugyanakkor köszönettel tartozom jelenlegi munkahelyem, a Gyermekfogászati és Fogszabályozási Klinika igazgatójának, Dr. Tarján Ildikónak a támogatásért és a bátorító szavakért. Rendkívüli munkabírása és humánuma nagy hatással volt rám munkám során. Külön

szeretném

köszönetemet

kifejezni

az

Orálbiológiai

Tanszék

dolgozóinak, akik mindig készségesen segítettek a felmerülő problémák megoldásában. Végül köszönöm családom segítségét, támogatását, türelmét és főként szeretetét, melyből nap, mint nap erőt meríthetek.

AZ

ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

IRODALOMJEGYZÉK 1.

Adam L, Bouvier M, Jones TL. (1999) Nitric oxide modulates beta (2)-adrenergic receptor palmitoylation and signaling. J Biol Chem, 274 (37): 26337-26343.

2.

Alderton WK, Cooper CE, Knowles RG. (2001) Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J, 357: 593-615.

3.

Alm P, Ekström J, Larsson B, Tobin G, Andersson K-E. (1997) Nitric oxide synthase immunoreactive nerves in rat and ferret salivary glands, and effects of denervation. Histochem J, 29: 669-676.

4.

Anderson DJ, Hector MP, Linden RWA. (1985) The possible relation between mastication and parotid secretion in the rabbit. J Physiol (London), 364: 19-29.

5.

Asztély A, Tobin G, Ekström J. (1994) Masticatory-salivaryreflexes mobilize non-adrenergic, non-cholinergic secretory mechanisms in parotid glands of conscious rats. Acta Phyiol Scand, 151: 373-376.

6.

Baum BJ. (1987) Neurotransmitter control of secretion. J Dent Res, 66: 628-632.

7.

Baum BJ. (1993) Principles of saliva secretion. Ann NY Acad Sci, 694: 17-23.

8.

Beck B. (2000) Neuropeptides and obesity. Nutrition, 16: 916-923.

9.

Bentz BG, Haines GK III, Hanson DG, Radosevich JA. (1998) Endothelial constitutive nitric oxid e synthase (ecNOS) localization in normal and neoplastic salivary tissue. Head Neck, 20: 304-309.

10.

Bernfeld P, Berkeley BJ, Bieber RE. (1965) Reversible dissociation of enzymes at high dilutions and their inhibition by polyanions. Arch Biochem Biophys, 111: 31-38.

11.

Bixler D, Webster RC, Muhler JC. (1957) The effect of testosterone, thyroxine, and cortisone on the salivary glands of the hypophysectomized rat. J Dent Res, 36: 566-570.

12.

Blair EA, Castle Am, Castle JD. (1991) Proteoglykan sulfation and storage parallels storage of basic secretory proteins in exocrine cells. Am J Physiol, 261: C897-S905.

13.

Bonner TI, Buckley NJ, YoungAC, Brann MR. (1987) Identification of a family of muscarinic acetylcholine receptor genes. Science (Wash. DC), 237: 527-532.

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

14.

Boughton-Smith NK, Evans SM, László F, Whittle BJR, Moncada S. (1993) The induction of nitric oxide synthase and intestinal vascular permeability by endotoxin in the rat. Br J Pharmacol, 110: 1189-1195.

15.

Borda E, Heizig G, Busch L, Sterin-Borda L. (2002) Nitric oxide synthase/PGE2 cross-talk in rat submandibular gland. Prostagl Leukotr Ess Fat Acids, 67 (1): 3944.

16.

Brennan PA, Thomas GJ, Langdon JD. (2003) The role of nitric oxide in oral diseases. Arch Oral Biol, 48: 93-100.

17.

Brennan PA, Umar T, Buckley J. (2000) Expression of nitric oxide synthase in pleomorphic adenomas of the parotid. Br J Oral Maxillofac Surg, 38: 338-342.

18.

Busch L, Sterin-Borda L, Borda E. (2002) Differences in the regulatory mechanism of amylase release by rat parotid and submandibular glands. Arch Oral Biol, 47: 717-722.

19.

Castle JD. (1998) Protein secretion by rat parotid acinar cells: pathways and regulation. Ann NY Acad Sci, 842: 115-124.

20.

Castle JD, Castle AM. (1998): Intracellular transport and secretion of salivary proteins. Crit Rev Oral Biol Med, 9: 4-22.

21.

Ceccatelli S, Hulting A-L, Zhang X, Gustafsson L, Villar M, Hökfelt T. (1993) Nitric oxide synthase in the rat anterior pituitary gland and the role of nitric oxide in regulation of luteinizing hormine secretion. Proc Natl Acad Sci, USA 90: 11292-11296.

22.

Ceccatelli S, Lundberg JM, Zhang X, Åman K, Hökfelt T. (1994) Immunohistochemical demonstration of nitric oxide synthase in the peripheral autonomic nervous system. Brain Res, 656: 381-395.

23.

Cenac N, Garcia-Villar R, Ferrier L, Larauche M, Vergnolle N, Bunnett NG, Coelho AM, Fioramonti J, Bueno L. (2003) Protease-activated receptor-2-induced colonic inflammation in mice: possible involvement of afferent neurons, nitric oxide, and paracellular permeability. J Immunol, 170: 4296-4300.

24.

Cook DI, Van Lennep EW, Roberts ML, Young JA. Secretion by the major salivary glands. In: Physiology of the gastrointestinal tract (3rd ed.), edited by Johnson LR, Raven Press, New York.1994: 1061-1117.

61

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

25.

Costa A, Trainer P, Besser M, Grossman A. (1993) Nitric oxide modulates the release of corticotropin-releasing hormone from the rat hypothalamus in vitro. Brain Res, 605: 187-192.

26.

Culotta E, Koshland Jr DE. (1992) News is good-news. Science, 258: 1862-1865.

27.

Day R, Benjannet S, Matsuuchi L, Kelly RB, Marcinkiewicz M, Chretien M, Seidah NG. (1995) Maintained PC1 and PC2 expression in the AtT-20 variant cell line 6T3 lacking regulated secretion and POMC: restored POMC expression and regulated secretion after cAMP treatment. DNA Cell Biol, 14 (2): 175-188.

28.

De Lisle RC. (2002) Role of sulfated O-linked glycoproteins in zymogen granule formation. J Cell Sci, 115: 2941-2952.

29.

Ekström J, Asztely A, Tobin G. (1998) Parasympathetic non-adrenergic, noncholinergic mechanisms in salivary glands and their role in reflex secretion. Eur J Morphol, 36 (Suppl): 208-212.

30.

Ekström J. (1987) Neuropeptides and secretion. J Dent Res, 66: 524-530.

31.

Emmelin N. (1987) Nerve interactions in salivary glands. J Dent Res, 66 (2): 509517.

32.

Español AJ, de la Torre E, Sales ME. (2003) Parasympathetic modulation of local acute inflammation in murine submandibular glands. Inflammation, 27: 97-105.

33.

Feher E, Zelles T, Nagy G. (1999) Immunocytochemical localisation of neuropeptide-containing nerve fibres in human labial glands. Arch Oral Biol, 44: S33-37.

34.

Felder CC. (1995) Muscarinic acetylcholin receptors: signal transduction through multiple effectors. FASEB J 9: 619-625.

35.

Fergunson MM. (1993) Pilocarpine and other cholinergic drugs in the management of salivary gland dysfunction. Oral Surg, Oral Med, Oral Pathol, 75: 186-191.

36.

Ferguson DB. The salivary glands and their secretions. In: Oral Bioscience, edited by Harcourt Publishers, 19999: 117-150.

37.

Finkelberg A, Busch L, Reina S, Sterin-Borda L, Borda E. (2006) Endogenous signalling system involved in parotid gland adenosine A1 receptor-amylase release. Acta Physiol, 186: 29-30.

62

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

38.

Forstermann U, Goth I, Schwarz P, Closs EI, Kleinert H. (1995) Isoforms of nitric oxide synthase. Biochem Pharmacol, 50: 1321-1322.

39.

Fridhandler L, Berk JE, Montgomery KA, Wong D. (1974) Columnchromatographic studies of isoamylases in human serum, urine and milk. Clin Chem, 20: 547-552.

40.

Fujita-Yoshigaki J, Dohke Y, Hara-Yokoyama M, Furuyama S, Sugiya H. (1999) Presence of a complex containing vesicle-associated membrane protein 2 in rat parotid acinar cells and its disassembly upon activation of cAMP-dependent protein kinase. J Biol Chem, 274: 23642-23646.

41.

Fukushima M, Lupien J, Bray GA.(1985) Interaction of light and corticosterone on food intake and brown adipose tissue of the rat. Am J Physiol, 242: R753R757.

42.

Garrett JR, Emmelin N. (1979) Activities of salivary myoepithelial cells: a review. Med Biol, 57: 1-28.

43.

Garrett JR, Parons PA. (1976) Movement of horseradish peroxidase in rabbit submandibular glands after ductal injection. Histochem J, 8: 177-189.

44.

Garvey E, Oplinger JA, Furfine ES, Kiff RJ, László F, Whittle BJR, Knowles RG. (1997) 1400W is a slow-, tight-binding and highly selective inhibitor of inducible nitric oxide synthase in vitro and in vivo. J Biol Chem, 272: 4959-4963.

45.

Glenert U, Nauntofte B. (1988) Stimulation-induced changes in cyclic nucleotide content by isolated rat parotid acini: effects of calcium. Pharmacol Toxicol, 62: 282-289.

46.

Goldfine ID, German MS, Tseng HC, Wang J, Bolaffi JL, Chen JW, Olson DC, Rothman SS. (1997) The endocrine secretion of human insulin and growth hormone by exocrin glands of the gastrointestinal tract. Nat Biotechnol, 15: 13781382.

47.

Gorr S-U, Tseng SY. (1995) Aggregation and concentration-dependent sorting of exocrine-regulated secretory proteins. Biochem Biophys Res Commun, 215 (1): 82-88.

48.

Gorr S-U, Venkatesh SG, Darling DS. (2005) Parotid secretory granules: crossroads of secretory pathways and protein storage. J Dent Res, 84 (6): 500-509.

63

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

49.

Grenwood K, Armstrong S, Coleman G. (1980) Persistance of rat nocturnal feeding and drinking during diurnal presentation of palatable diet. Physiol Behav, 24: 1119-1123.

50.

Grozdanovic Z, Baumgarten HG, Brüning G. (1992) Histochemistry of NADPHdiaphorase, a marker for neuronal nitric oxide synthase, in the peripheral autonomic nervous system of the mouse. Neurosci, 48: 225-235.

51.

Hammerton K, Messer M. (1971): The origin of serum amylase. Electrophoretic studies of isoamylases of the serum, liver and other tissues of adult and infant rats. Biochim Biophys Acta, 244: 441-451.

52.

Hill J, Howlett A, Klein C. (2000): Nitric oxide selectively inhibits adenylyl cyclase isoforms 5 and 6. Cell Signalling, 12: 233-237.

53.

Hokari S, Miura K, Koyama I, Kobayashi M, Matsunaga T, Iino N, Komoda T. (2003) Expression of α-amylase isozymes in rat tissues. Comp Biochem Phys, B135: 63-69.

54.

Hope BT, Michael GJ, Knigge KM, Vincent SR. (1991) Neuronal NADPHdiaphorase is a nitric oxide synthase. Proc Natl Acad Sci USA, 88: 2811-2814.

55.

Horii A, Emi M, Tomita N, Nishide T, Ogawa M, Mori T, Matsubara K. (1987) Primary structure of human pancreatic alpha-amylase gene: its comparison with human salivary alpha-amylase gene. Gene, 60 (1): 57-64.

56.

Huang AY, Castle AM, Hinton BT, Castle DJ. (2001) Resting (basal) secretion of proteins is provided by the minor regulated and constitutive-like pathways and not granule exocytosis in parotid acinar cells. J Biol Chem, 276 (25): 22296-22306.

57.

Hudson TY, Corbett JA, Howlett AC, Klein C. (2001) Nitric oxide regulates adenylyl cyclase activity in rat striatal membranes. J Neurochem, 77 (5): 12791284.

58.

Ikeno K, Ikeno T. (1991). Effects of prolonged parotid duct ligation, parotidectomy and acute hepatits of rats on amylase activity. Arch Oral Biol, 36: 183-188.

59.

Ikeno T, Ikeno K, Uno T. (1988) Relationship between serum-amylase activity and intraductal pressures in the rat parotid and submandibular salivary glands after administration of pilocarpine or isoprenaline. Arch Oral Biol, 33: 403-406.

64

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

60.

Ikeno T, Nasu J, Kuzuya H. (1982) Mechanism of increase in amylase activity in the submandibular and sublingual glands after administration of pilocarpine. Arch Oral Biol, 27: 597-601.

61.

Ikeno T, Ikeno K, Kuzuya H. (1984) Transport to the bloodstream of amylase following retrograde infusion of amylase into the parotid glands in the rat. Arch Oral Biol, 29: 587-589.

62.

Isenman L, Liebow C, Rothman S. (1999) The endocrine secretion of mammalian digestive enzymes by exocrine glands. Am J Physiol, 276: E223-232.

63.

Ishikawa Y, Iida H, Skowronski MT, Ishida H. (2002) Activation of endogenous nitric oxide synthase coupled with methacholine-induced exocytosis in rat parotid acinar cells. J Pharmacol Exp Ther, 301: 355-363.

64.

Janowitz HD, Dreiling DA. (1959) The plasma amylase. Am J Med, 27 (6): 924935.

65.

Jaworek J, Jachimczak B, Bonior J, Kot M, Tomaszewska R, Karczewska E, Stachura J, Pawlik W, Konturek SJ. (2000) Protective role of endogenous nitric oxide (NO) in lipopolysaccharide-induced pancreatic damage. (A new experimental model of acut pancreatitis). J Physiol Pharmacol, 51 (1): 85-102.

66.

Johnson DA, Cortez J. (1985) Changes in rat parotid salivary proteins following surgical thyroidectomy. J Dent Res, 64: 326.

67.

Karn RC, Malacinski GM. (1978) The comparative biochemistry, physiology, and genetics of animal α-amylases. Adv Comp Physiol Biochem, 7: 1-103.

68.

Kawabata A. (2003) Gastrointestinal functions of proteinase-activated receptors. Life Sci, 74: 247-254.

69.

Kawabata A, Kuroda R, Morimoto N, Kawao N, Masuko T, Kakehi K, Taneda M, Nishikawa H, Araki H. (2001) Lipopolysaccharide-induced subsensitivity of proteinase-activated receptor-2 in mouse salivary glands in vivo. Neunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 364: 281-284.

70.

Kawabata A, Kuroda R, Nishida M, Nagata N, Sakaguchi Y, Kawao N, Nishikawa H, Arizono N, Kawai K. (2002) Protease-activated receptor-2 (PAR-2) in the pancreas and parotid gland: immunolocalisation and involvement of nitric oxide in the evoked amylase secretion. Life Sci, 71: 2435-2446.

65

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

71.

Kawabata A, Morimoto N, Nishikawa H, Kuroda R, Oda Y, Kakehi K. (2000) Activation of protease-activated receptor-2 (PAR-2) triggers mucin secretion in the rat sublingual gland. Biochem Biophys Res Commun, 270: 298-302.

72.

Keller PJ, Kauffman DL, Allan BL, Willams BL. (1971) Further studies on the structural differences between the isoenzymes of human parotid-amylase. Biochem, 10: 4867-4874.

73.

Kennaway DJ. (1980) Generation and entertainment of circadian rythms. Clin Exp Pharmacol Physiol, 25: 862-865.

74.

Kiss J, Lamarque D, Delchier JC, Whittle BJR. (1997) Time-dependent actions of nitric oxide synthase inhibition on colonic inflammation induced by trinitrobenzene sulphonic acid in rats. Eur J Pharmacol, 336: 219-224.

75.

Klein C. (2002) Nitric oxide and the other cyclic nucleotide. Cell Signalling, 14: 493-498.

76.

Knowles RG, Moncada A. (1994) Nitric oxide synthases in mammals. Biochem J, 298: 249-258.

77.

Konttinen YT, Platts LA, Tuominen S, Eklund KK, Santavirta N, Tornwall J, Sorsa T, Hukkanen M, Polak JM. (1997) Role of nitric oxide in Sjogren's syndrome. Arthritis Rheum, 40: 875-883.

78.

Konturek SJ, Bilski J, Konturek PK, Cieszkowski M, Pawlik W. (1993) Role of endogenous nitric oxide in the control of canine pancreatic secretion and blood flow. Gastroenterology, 104: 896-902.

79.

Konturek SJ, Szlachcic A, Dembinski A, Warzecha Z, Jaworek J, Stachura J. (1994) Nitric oxide in pancreatic secretion and hormone-induced pancreatitis in rats. Int J Pancreatol, 15 (1): 19-28.

80.

Kraly FS, Cushin BJ, Smith GP. (1980) Nocturnal hyperphagia in the rat is characterized by decreased postprandial satiety. J Comp Physiol 94: 375-387.

81.

Kumar BA, Papamichael M, Leibowitz SF. (1988) Feeding and macronutrient selection patterns in rats: adrenalectomy and chronic corticosterone replacement. Physiol Behav, 42: 581-589.

82.

Kurahashi M. (2002) The effect of dietary consistency and water content on the parotid glands of submandibular and sublingual duct-ligated rats. Arch Oral Biol, 47: 369-374. 66

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

83.

Kurahashi M, Inomata K. (1999a) Effects of dietary consistency and water content on parotid amylase secretion and gastric starch digestion in rats. Arch Oral Biol, 44: 1013-1019.

84.

Kurahashi M, Inomata K. (1999b) Relationship between parotid amylase secretion and osmolality in the gastric contents of rats fed a pelleted or liquid diet. Jap J Physiol, 49: 507-512.

85.

László F, Evans SM, Whittle BJR. (1995) Association of microvascular leakage with induction of nitric oxide synthase: effects of nitric oxide synthase inhibitor sin various organs. Eur J Pharmacol, 283: 47-53.

86.

László F, Whittle BJR, Moncada S. (1994) Time-dependent enhancement or inhibition of endotoxin-induced vascular injury in rat intestine by nitric oxide synthase inhibitors. Br J Pharmacol, 111: 1309-13015.

87.

László F, Whittle BJR. (1997) Actions of isoform-selective and non-selective nitric nitric oxide synthase inhibitors on endotoxin-induced vascular leakage in rat colon. Eur J Pharmacol, 334: 99-102.

88.

Le Mangen J. (1983) Body energy balance and food intake: neuroendocrine regulatory mechanism. Physiol Rev, 63: 314-386.

89.

Leclerc P, Forest J. (1982) Electrophoretic determination of isoamylases in serum with commercially available reagents. Clin Chem, 28: 37-40.

90.

Leiros CP, Rosignoli F, Genaro AM, Sales ME, Sterin-Borda L, Santiago Borda E. (2000) Differential activation of nitric oxide synthase through muscarinic acethylcholine receptors in rat salivary glands. J Auton Nerv Syst, 79: 99-107.

91.

Lerner A, Rosenthal MA, Liebow C, Lebenthal E. Salivary secretion. In: Textbook of Gastroenterology, edited by Tadata Yamada, JB Lippincott Company, Philadelphia, 1991: 218-233.

92.

Levey A, Kitt CA, Simonds WF, Price DL, Brann MR. (1991) Identification and localization of muscarinic acetylcholine receptor protein in brain with sybtypespecific antibodies. J Neurosci, 11 (10): 3218-3226.

93.

Levitt Md, Eckfeldt JH. Diagnosis of acute pancreatits. In: Go VLW, Gardner JD, Brooks FP, Lebenthal E, Di Mango EP, Scheele GA (Eds): Exocrine pancreas: biology, pathology and diseases. Raven Press, New York, 1986: 481-502.

67

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

94.

Levitt MD, Ellis C, Engel RR. (1977) Isoelectric focusing studies of human serum and tissue amylases. J Lab Clin Med, 90: 141-152.

95.

Liu FTY, Lin HS. (1969) Role of adrenocortical hormones in growth and development of salivary glands in immature female rats. J Dent Res, 48: 602.

96.

Lohinai Zs, Székely AD, Soós L, Fehér E. (1995) Distribution of nitric oxide synthase containing elements in the feline submandibular gland. Neurosci Lett, 192: 9-12.

97.

Lohinai Zs, Burghardt B, Zelles T, Varga G. (1999): Nitric oxide modulates salivary amylase and fluid, but not epidermal growth factor secretion in conscious rats. Life Sci 64: 953-963.

98.

Lomniczi A, Suburo AM, Elverdin JC, Mastronardi CA, Diaz S, Rettori V, McCann SM. (1998) Role of nitric oxide in salivary secretion. Neuroimmunmod, 5: 226-233.

99.

Lomniczi A, Mohn C, Faletti A, Franchi A, McCann SM, Rettori V, Elverdin JC. (2001) Inhibition of salivary secretion by lipopolysaccharide: possible role of prostaglandins. Am J Physiol Endocrinol Metab, 281: E405-E411.

100. Lonart G, Johnson KM. (1995) Characterization of nitric oxide generator-induced hippocampal [3H]norepinephrine release. I. The role of glutamate. J Pharmacol Exp Ther, 257: 7-13. 101. Looms DK, Dissing S, Tritsaris K, pedersen AM, Nauntofte B. (2000) Adrenoceptor-activated nitric oxide synthesis in salivary acinar cells. Adv Dent Res, 14: 62-68. 102. Looms DK, Tritsaris K, Nauntofte B, Dissind S. (2001) Nitric oxide and cGMP activate Ca2+-release processes in rat parotid acinar cells. Biochem J, 355: 87-95. 103. Looms DK, Tritsaris K, Pedersen AM, Nauntofte B, Dissing S. (2002) Nitric ixide signalling in salivary glands. J Oral Pathol Med, 31: 569-584. 104. Mazariegos MR, Tice LW, Hand AR. (1984) Alteration of tight junctional permeability in the rat parotid gland after isproterenol stimulation. J Cell Biol, 98: 1865-1877. 105. Mbaku EN, Zhang L, Duckles SP, Buchholz J. (2000) Nitric oxide synthasecontaining nerves facilitate adrenergic transmitter release in sheep middle cerebral arteries. J Pharmacol Exp Ther, 293: 397-402. 68

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

106. Meffert MK, Premack B, Schulman H. (1994) Nitric oxide stimulates Ca2+independent synaptic vesicle release. Neuron, 12: 1235-1244. 107. Menaker L, Navia JM. (1974) Effect of undernutrition during the perinatal period on caries development in the rat. V. Changes in whole saliva volume and protein content. J Dent Res, 53: 592. 108. Merritt JE, Rink TJ. (1987) Rapid increases in cytosolic free calcium in response to muscarinic stimulation of rat parotid acinar cells. J Biol Chem, 262: 4958-4960. 109. Michikawa H, Mitsui Y, Fujita-Yoshigaki J, Hara-Yokoyama M, Furuyama S, Sugiya H. (1998) cGMP production is coupled to Ca2+-dependent nitric oxide generation in rabbit parotid acinar cells. Cell Calcium, 23: 405-412. 110. Mitsui Y, Yasuda N, Furuyama A, Sugiya H. (1997) Nitric oxide synthase activities in mammalian parotid and submandibular salivary glands. Arch Oral Biol, 42 (9): 621-624. 111. Mitsui Y, Furuyama S. (2000) Characterization of nitric oxide synthase in the rat parotid gland. Arch Oral Biol, 45: 531-536. 112. Molero X, Guarner F, Salas A, Mourelle M, Puig V, Malagelada JR. (1995) Nitric oxide modulates pancreatic basal secretion and response to cerulein in the rat: effects in acute pancreatitis. Gastroent, 108: 1855-1862. 113. Moncada S, Higgs EA. (1995) Molecular mechanisms and therapeutic strategies related to nitric oxide. FASEB J, 9: 1319-1330. 114. Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA: Nitric oxide: Physiology, Pathophysiology, and Pharmacology. Pharmacol Rev 43: 109-142, 1991. 115. Nagai K, Nishio T, Nakagawa H, Nakamura S, Fukuda Y. (1978) Effect of bilateral lesions of the suprachiasmatic nuclei on the circadian rythm of the food intake. Brain Res, 142: 384-389. 116. Nagatani S, Guthikondra P, Foster DL. (2000) Appearance of a nocturnal peek of leptin secretion in the pubertal rat. Horm Behav, 37: 345-352. 117. Nagy G. Nyálmirigybetegségek. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, 2000: 8-31. 118. Nathan C, Xie Q. (1994) Nitric oxide synthases: roles, tolls and controls. Cell, 78: 915-918.

69

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

119. Nederfors T, Ericsson T, Twetman S, Dahlöf C. (1994) Effects of the βadrenoceptor antagonists atenolol and propanolol on human parotid and submandibular-sublingual salivary secretion. J Dent Res, 73: 5-10. 120. Nishide T, Nakamura Y, Emi M, Yamamoto T, Ogawa M, Mori T, Matsubara K. (1986) Primary structure of human salivary alpha-amylase gene. Gene, 41 (2-3): 299-304. 121. Nishide T, Emi M, Nakamura Y, Matsubara K. (1986) Corrected sequences of cDNAs for human salivary and pancreatic α-amylases. Gene, 50: 371-372. 122. O’Donnell MD, Fitzgerald O, McGeeney KF. (1977) Differential serum amylase determination by use o fan inhibitor, and design of a routine procedure. Clin Chem, 23: 560-566. 123. Ohashi M, Iwase M, Nagumo M. (1999) Elevated production of nitric oxide in oral mucosal diseases. J Oral Pathol Med, 28: 355-359. 124. Orci L, Ravazzola M, Anderson RGW. (1987) The condensing vacuole of exocrine cells is more acidic than the mature secretory vesicle. Nature, 326: 7779. 125. Palmer RMJ, Ferrige AG, Moncada S. (1987) Nitric oxide release accounts for the biological activity of endothelium-derived relaxing factor. Nature (Lond), 327: 524-526. 126. Pastor CM, Pugin J, Kwak B, Chanson M, Mach F, Hadengue A, Frossard JL. (2004) Role of Toll-like receptor 4 on pancreatic and pulmonary injury in a mice model of acute pancreatitis associated with endotoxemia. Crit Care Med, 32 (8): 1759-1763. 127. Patel AG, Toyama MT, Nguyen TN, Cohen GA, Ignarro LJ, Reber HA, Ashley SW. (1995) Role of nitric oxide in the relationship of pancreatic blood flow and exocrine secretion in cats. Gastroenterology, 108: 1215-1220. 128. Pederson AM, Dissing S, Fahrenkrug J, Hannibal J, Reibel J, Nauntofte B. (1999) Innervation pattern and Ca2+ signalling in labial salivary glands of healthy individuals and patients with primary Sjögren’s syndrome (pSS). J Oral Pathol Med, 29: 97-109.

70

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

129. Peralta EG, Ashkenazi A, Winslow JW, Ramachandran J, Capon DJ. (1988) Differential regulation of PI hydrolysis and adenylyl cyclase by muscarinic receptor subtypes. Nature (Lond), 334: 434-437. 130. Pinelli M, Bindi M, Rosada J, Scatena P, Castiglioni M. (2006) Amylase: a disease activity index in multiple myeloma? Leuk Lymph, 47 (1): 151-154. 131. Proctor GB, Asking B, Garrett JR. (1990) Factors influencing the movement of rat parotid amylase into the serum of rats on feeding. Exp Physiol, 75: 709-712. 132. Proctor GB, Asking B, Garrett JR. (1991) Serum amylase of non-parotid and nonpancreatic origin increases on feeding in rats and may originate from the liver. Comp Biochem Physiol, 98B: 631-635. 133. Proctor GB, Asking B, Garrett JR. (1989) Effects of secretory nerve stimulation on the movement of rat parotid amylase into the circulation. Arch Oral Biol, 34: 609-613. 134. Pugin J, Schürer-Maly C-C, Leturcq D, Moriarty A, Ulevitch RJ, Tobias PS. (1993) Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14. Proc Natl Acad Sci, 90: 2744-2748. 135. Putney Jr, JW: Identification of cellular activation mechanisms associated with salivary secretion. Ann Rev Physiol 48: 75-88; 1986. 136. Raetz CRH. (1993) Bacterial endotoxins: extraordinary lipids that activate eucaryotic signal transduction J Bacteriol, 175 (18): 5745-5753. 137. Reidelberger RD, Varga G, Liehr RM, Castellanos DA, Rosenquist GL, Wong HC, Walsh JH. (1994) Cholecystokinin suppresses food intake by a nonendocrine mechanism of rats. Am J Physiol, 267: R901-R908. 138. Reidelberger RD, Varga G, Solomon TE. (1991) Effects of selective cholecystokinin antagonists L364,718 and L365,260 on food intake in rats. Peptides, 12: 215-221. 139. Rettori V, Lomniczi A, Elverdin JC, Suburo A, Faletti A, Franchi A, McCann SM. (2000) Control of salivary secretion by nitric oxide and its role in neuroimmunomodulation. Ann NY Acad Sci, 917: 258-267. 140. Rietschel ET, Brade H. (1992) Bacterial endotoxins. Sci Am, 267: 54-61.

71

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

141. Roca V, Rosignoli F, Calafat M, Lairos CP. (2004) Lack of nitric oxide-mediated regulation of amylase secretion stimulated by VIP in parotid glands of NOD mice. Int Immunopharmacol, 4: 1837-1844. 142. Ryan J, Appert H. (1975) Circulatory turnover of pancreatic amylase. Proc Soc Exp Biol Med, 149: 921-925. 143. Salter M, Knowles RG, Moncada S. (1991) Widespread tissue distribution, species distribution and changes in activity of Ca2+-dependent and Ca2+independent nitric oxide synthases. FEBS Lett, 291: 145-149. 144. Sanders TG, Rutter WJ. (1972) Molecular properties of rat pancreatic and parotid alpha-amylase. Biochem, 11: 130-136. 145. Sayardoust S, J Ekström. (2006) Parasympathetic nerve-evoked protein synthesis, mitotic activity and salivary secretion in the rat parotid gland and the dependence on NO-generation. Arch Oral Biol, 51: 189-197. 146. Schleiffer R, Francis R. (1997) Nitric oxide and the digestive system in mammals and non-mammalian vertebrates. Comp Biochem Physiol, 118A (4): 965-974. 147. Schumann RR, Leong SR, Flaggs GW, Gray PW, Wright SD, Mathison JC, Tobias PS, Ulevitch RJ. (1990) Structure and function of lipopolysaccharide binding protein. Science, 249: 1429-1431. 148. Scully S, Eckersall PD, Edmond RT, Boyle P, Beely JA. (1981) Serum alphaamylase isoemzymes in mumps: estimation of salivary and pancreatic isoenzymes by isoelectric focusing. Clin Chim Acta, 113: 281-291. 149. Shimomura H, Tanaka S, Komione N, Shimooka S, Imai A, Nashida T. (2004) Soluble guanylyl cyclase is localised in the acinar cells and participates in amylase secretion in rat parotid. Arch Oral Biol, 49: 691-696. 150. Slomiany BL, Slomiany A. (2002) Porphyromonas gingivalis interferes with salivary mucin synthesis through inducible nitric oxide synthase activation of ERK and p38 kinase. Biochem Biophys Res Commun, 297: 1149-1153. 151. Sreebny LM, Johnson DA. (1969) Diurnal variations in secretory components of the rat parotid. Arch Oral Biol, 14: 397-405. 152. Stuehr DJ. (1999) Mammalian nitric oxide synthases. Biochim Biophys A, 1411: 217-230.

72

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

153. Sugiya H, Mitsui Y, Michikawa H, Fujita-Yoshigaki J, Hara-Yokoyama M, Hashimoto S, Furuyama S. (2001) Ca2+-regulated nitric oxide generation in rabbit parotid acinar cells. Cell Calcium, 30: 107-116. 154. Takai N, Uchihashi K, Higuchi K, Yoshida Y, Yamaguchi M. (1999) Localization of neuronal-constitutive nitric oxide synthase and secretory regulation by nitric oxide in the rat submandibular and sublingual glands. Arch Oral Biol, 44: 745750. 155. Takemura H. (1985) Changes in cytosolic free calcium concentration in isolated rat parotid cells by cholinergic and β-adrenergic agonists. Biochem Biophys Res Commun, 131: 1048-1055. 156. Takeuchi T, Matsushima T, Sugimura T, Kozu T, Takeuchi T, Takemoto T. (1974) A rapid, new method for quantitative analysis of human amylase isoenzymes. Clin Chim Acta, 54: 137-144. 157. Takeuchi T, Mura M, Sasaki R, Matsushima T, Sugimura T. (1975) Comparative studies on electrophoretic mobility and immunogenicity of pancreatic and parotid amylases of rat. Biochim Biophys Acta, 403: 456-460. 158. Telbisz Á, Kovács AL. (1999) Complete dissociation of rat pancreas into acini by a perfusion –incubation method: measurement of protein synthesis and the degradation of endogenous proteins. Pancreas, 18: 342-348. 159. Thomsen LL, Lawton FG, Knowles RG, Beesley JE, Riveros-Moreno V, Moncada S. (1994) Nitric oxide synthase activity in human gynecological cancer. Cancer Res, 54: 1352-1354. 160. Tobias PS, Soldau K, Ulevitch RJ. (1989) Identification of a lipid A biding site in the acut phase reactant lipolysaccharide binding protein. J Biol Chem, 25: 1086710871. 161. Tobias PS, Soldau K, Ulevitch RJ. (1986) Isolation of a lipopolysaccharidebinding acut phase reactant from rabbit serum. J Exp Med, 164: 777-793. 162. Tobin G, Giglio D, Götrick B. (2002) Studies of muscarinic receptor subtypes in salivary gland function in anaesthetized rats. Auton Neurosci: Basic Clin, 100: 19.

73

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

163. Tomita N, Horii A, Doi S, Yokouchi H, Shiosaki K, Higashiyama M, Matsuura N, Ogawa M, Mori T, Matsubara K. (1989) A novel type of human α-amylase produced in lung carcinoid tumor. Gene, 76: 11-18. 164. Tritsaris K, Looms DK, Nauntofte B, Dissing S. (2000) Nitric oxide synthesis causes inositol phosphate production and Ca2+ release in rat parotid acinar cells. Pflügers Arch – Eur J Physiol, 440: 223-228. 165. Tsunoda S, Michikawa H, Furuyama S, Sugiya H. (2003) Evidence that nitric oxide does not directly contribute to methacholine-induced amylase secretion in rabbit parotid acinar cells. Pflugers Arch, 446: 470-474. 166. Ulevitch RJ, Tobias PS. (1995) Receptor-dependent mechanisms of cell stimulation by bacterial endotoxin. Annu Rev Immunol, 13: 437-457. 167. Vág J, Hably Cs, Kerémi B, Kovács E, Bartha J, Fazekas Á. (2001) Role of nitric oxide in the regulation of blood flow in the rat submandibular gland during carotid artery occlusion. Arch Oral Biol, 46: 261-267. 168. van Zwieten PA. (1991) Adrenergic and muscarinergic receptors: classification, pathophysiological relevance and drug target. J Hypertens, 9 (suppl 6): S18-S27. 169. Venkatesh SG, Cowley DJ, Gorr S-U. (2004) Differential aggregation properties of secretory proteins that are stored in exocrine secretory granules of the pancreas and parotid glands. Am J Physiol Cell Physiol, 286: C365-371. 170. Venkatesh SG, Gorr S-U. (2002) A sulfated proteoglykan is necessary for storage of exocrine secretory proteins in the rat parotid gland. Am J Physiol Cell Physiol, 283 (2): C438-445. 171. von Zastrow M, Castle AM, Castle JD. (1989) Ammonium chloride alters secretory protein sorting within the maturing exocrine storage compartment. J Biol Chem, 264 (11): 6566-6571. 172. von Zastrow M, Castle JD. (1987) Protein sorting among two distinct export pathways occurs from the content of maturing exocrine storage granules. J Cell Biol, 105: 2675-2684. 173. Wallenius R. (1966) Experimental oral cancer in the rat with special reference to the influence of saliva. Acta Pathol Microbiol Scand, 180 (Suppl): 1-91.

74

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

174. Wang SZ, Zhu SZ, El-Fakahany E. (1994) Efficient coupling of m5 muscarinic acetylcholine receptors to activation of nitric oxide synthase. J Pharmacol Exp Ther, 268: 552-557. 175. Watson EL, Jacobson KL, Dowd F. (1982) Does cyclic GMP mediate amylase release from mouse parotid acini? Life Sci, 31: 2053-2060. 176. Whitten RO, Chandler WL, Thomas MGE, Clayson KJ, Fine JS. (1988) Survey of α-amylase activity and isoamylases in autopsy tissue. Clin Chem, 34: 1552-1555. 177. Whittle BJR. Nitric oxide in gastrointestinal physiology and pathology. In: Physiology of the gastrointestinal tract (3rd ed.), edited by Johnson LR, Raven Press, New York. 1994: 267-293. 178. Xu X, Zeng W, Diaz J, Lau KS, Gukovskaya AC, Brown RJ, Pandol SJ, Muallem S. (1997) nNOS and Ca2+ influx in rat pancreatic acinar and submandibular salivary gland cells. Cell Calcium, 22: 217-228. 179. Yokouchi H, Horii A, Emi M, Tomita N, Doi S, Ogawa M, Mori T, Matsubara K. (1990) Cloning and characterization of a third type of human alpha-amylase gene, AMY2B. Gene, 90 (2): 281-286. 180. Yuan Z, Iida H, Inoue N, Ishikawa Y, Ishida H. (2003) Effect of SNI-2011 on amylase secretion from parotid tissue in rats and in neuronal nitric oxide synthase knockout mice. Eur J Pharmacol, 464: 197-206. 181. Zelles T, Blazsek J, Tófalvi A. (1986) Effects of suramin a trypanocidal drog on the rat parotid gland. Zahn-, Mund- und Kieferheilkunde mit Zentralblatt, 74: 684690. 182. Zelles T, Keszler P, Boros I, Blazsek J. Amylase synthesis in the parotid gland of cortisone-treated rats. In Zelles T: Saliva and salivation. Pergamon Press - Akad K, Budapest, 1981: 249-257. 183. Zweier JL, Samouilov A, Kuppusamy P. (1999) Non-enzymatic nitric oxide synthesis in biological systems. Biochim Biophys Acta, 1411: 250-262.

75

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK I.

Barta A, Tarján I, Kittel Á, Horváth K, Pósa A, László F, Kovács A, Varga G, Zelles T, Whittle BJR: Endotoxin can decrease isolated rat parotid acinar cell amylase secretion in a nitric oxide-independent manner. Eur J Pharmacol 524: 169-173, 2005. IF: 2,432

II.

Nagy Á, Barta A, Varga G, Zelles T: Changes of salivary amylase in serum and parotid gland during pharmacological and physiological stimulation. J Physiol Paris 95: 141-145, 2001. IF: 0,862

ÖSSZ IF: 3,294

76

ÖSSZEFOGLALÁS

ÖSSZEFOGLALÁS Jelen tanulmány a nyálban található amiláz szekrécióját vizsgálta fiziológiás, farmakológiás és patológiás körülmények között, in vivo és in vitro. A többnyire a parotis által termelt szérum amiláz koncentrációja fontos diagnosztikus faktor az exokrin nyálmirigyeket érintő betegségben. In vivo kísérletsorozatunkban azt vizsgáltuk, hogy milyen a kapcsolat a szérumban és a parotis szövetben lévő izolamiláz koncentrációja között, a különböző ingerekre adott válaszok során. A Wistar patkányok standard laboratóriumi tápot és vizet kaptak ad libitum. Az 1. kísérletben 16 órás éheztetés után az állatok 5 mg/kg pilokarpint vagy fiziológiás sóoldatot (kontroll csoport) kaptak (sc.). A 2. kísérletben - szintén éheztetés után - az állatok fele 1 órán keresztül evett tápot, míg a másik fele nem kapott semmit. A 3. kísérletben az állatok korlátozás nélkül kapták a tápot, a sötét periódus kezdetéig. Este 7 és 9 óra között az állatok fele tovább kapta a tápot, a másik fele éhezett (kontroll csoport). A pancreas és parotis eredetű izoamiláz eltérő fiziko-kémiai tulajdonságai alapján került szétválasztásra, elekroforézis segítségével. Az amiláz koncentráció meghatározásához a keményítő-jód rekaciót alkalmaztuk és keményítőt használtunk szubsztrátként. Eredményeink szerint a farmakológiai inger, mint például a pilokarpin, vagy az éheztetés utáni táplálás, csakúgy, mint a spontán táplálék bevitel, csökkentette a parotisban az amiláz szintet, míg a szérum parotis izoamiláz koncentráció nőtt. Tehát a parotis eredetű izoamiláz szintjét a szérumban a spontán táplálékfelvétel is szabályozza. Az amiláznak (számos nyálfehérjével együtt, például mucin) antibakteriális hatása is ismert. In vitro kísérletsorozatunkban amiláz szekretáló sejteken vizsgáltuk a bakteriális endotoxin hatását. Eredményeink szerint az endotoxin (Escherichia coli lipopoliszacharid; 3 mg/kg, iv., 5 h) nitrogén-monoxid szintáz (NOS2)-indukciót váltott ki a teljes parotis szövetben (Western-blottal és citrullin esszével meghatározva), valamint

az

izolált

patkány

parotis

acinus

sejtekben

(Western-blottal

és

immunhisztokémiával meghatározva). Ugyanakkor az endotoxin ezekben az izolált sejtekben csökkentette a bazális és acetil-kolinnal stimulált amiláz szekréciót. A NGnitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) (0.1 mg ml-1, az ivóvízhez adva, 4 napig) nem befolyásolta az amiláz felszabadulást sem önmagában, sem endotoxinnal adva. Így összegezve elmondható, hogy a bazális, az acetil-kolinnal stimulált és az endotoxinnal csökkentett

amiláz

szekréció

nem

függ

az

endogén

nitrogén-monoxidtól.

SUMMARY

SUMMARY The present study investigated the secretion of salivary amylase under physiological, pharmacological and pathological conditions, in vivo and in vitro. The concentration of amylase secreted mainly by the parotid is an important diagnostic factor in certain salivary diseases. The aim of our in vivo study was to investigate the relationship between parotid isoamylase concentration in serum and parotid tissue in response to various stimuli. Wistar rats were fed with standard laboratory chow and water was supplied ad libitum. In the first experiment, after a 16-h fasting rats received (s.c.) 5 mg/kg pilocarpine or saline (control group). In the second study, half of the rats were fed for 1 h and the other received no food, after fasting. In the third experiment half of the rats were fed during the experiment (2 h after the beginning of the dark period) and the other fasted in the last 2 h. Pancreatic and parotid isoamylase levels in serum were separated by gelelectrophoresis utilizing their different physical-chemical properties. Amylase concentration was determined by using starch as a substrate. Our data show that such stimulation as pilocarpine or feeding in the fasted state, as well as the spontaneous food intake during the nonfasted state result in a decrease in parotid tissue amylase activity and a proportional increase in serum levels of parotid isoamylase. In conclusion, parotid isoamylase in the serum is also regulated by spontaneous food intake. Amylase is an important digestive enzyme and diagnostic factor. It has antibacterial effects among salivary proteins (e.g. mucin). In our in vitro study, the actions of endotoxin on amylase secreting cell activity have been evaluated. Endotoxin (Escherichia coli lipopolysaccharide; 3 mg/kg, i.v., 5 h) evoked nitric oxide synthase 2 (NOS2) induction in the rat whole parotid tissue (assessed by Western blot and the citrulline assay) and in rat isolated parotid acinar cells (assessed by Western blot and immunhistochemistry). On the other hand it reduced basal and acetylcholine-stimulated amylase secretion from these isolated cells. NG-nitro-L-arginine methyl ester (LNAME) (0.1 mg/ml, 4 days in drinking water) did not affect amylase release under basal or acethylcholine-stimulated conditions, either in control or endotoxin treated acinar cells. In conclusion, basal, acethylcholin-evoked or endotoxin-treated amylase secretion from rat parotid acinar cells does not appear to be modulated by endogenous nitrc oxide.