Ř asy a sinice Řasy
ve vod árenské a hygienick é praxi vodárenské hygienické praxi PřF UK, 28. – 29. března 2009
RNDr. Lenka Šejnohová, Ph.D. – Botanický ústav AV ČR, v.v.i., Brno Mgr. Petr Pumann – Státní zdravotní ústav, Praha RNDR. Jindřich Duras, Ph.D. – Povodí Vltavy
Související přednášky Katedra Botaniky & Ekologie • Botanika bezcévných rostlin (LS, Prášil): ekologie, taxonomie sinic a řas + determinace praktika • Algologie I, II (ZS,LS, Škaloud et all.): podrobná taxonomie sinic a řas + determinace praktika. • Ekologie sinic a řas (ZS, Nedbalová, Neustupa): Fytobentos a bioindikace prostředí. Eutrofizace. Vodní květy. http://botany.natur.cuni.cz/neustupa/ekologie-ras.html • Vodní ekosystémy (LS, Černý): Přehled organismů sladkovodních lotických a lentických systémů.
Související přednášky - ÚŽP • Hygiena (ZS, Prof. Bencko): Požadavky na kvalitu pitné vody; Způsoby zajištění pitné vody pro obyvatelstvo; Biologické metody monitorování znečištění životního prostředí. • Limnologie (ZS, Doc. Stuchlík): koloběh vody, trofizace, acidifikace • Znečišťování a ochrana vod (LS, Ing. Benešová): Pitná voda,požadavky na kvalitu, úpravárenství, zdravotní zabezpečení pitné vody. • Environmentální mikrobiologie (LS, RNDr. Novotný): Mikroorganismy ve vodním prostředí: plankton, benthos, stratifikovaná mikrobní společenství.
Kdy půjdeme na oběd a kdy domů ….. struktura přednášky So 28.3. • 9-13h. Lenka Šejnohová – kvantifikace, ekologie VKS, cyanotoxiny, bioindikace • 13-14h: oběd • 14-17h. Petr Pumann – ČSN, vodárenství Ne 29.3. • 9-12h. Jindřich Duras – omezení VKS • 12-13h. zápočtový testík
Zápočet, zkouška • Zápočet Prezenční listina + Zápočtový testík – ne 12-13h. • Zkouška Test 40 otázek + doplňující mikroskopický rozbor Termín: domluva
Basic research X Aplikace vědy • Význam naší přednášky – propojení Praha x Brno
Sinice a řasy ve vodárenské a hygienické praxi • Vodárny (VAK) - Detekce a odstranění – šetrnost (toxicita) • Rekreace (ZU,Povodí,BU,HBU) - Monitoring – predikce, kvantifikace a determinace biomasy, detekce toxicity, zásahy na omezení rozvoje • Bioindikace (VUV,Povodi,BU) - Determinace a výpočty indexů kvality vod • Ekotoxikologické biotesty (RECETOX MU Brno, šir.spektrum soukromých firem) - „Obětování“ sinic a řas v laboratoři k testovaní toxicity
Chci jít do praxe - jaké mám mít znalosti a zkušenosti • Determinace Univerzita – systém sinic a řas, praktické určování DP a Ph.D. • Ekologie sinic a řas: kultura vs. ekosystém (nároky na světlo, teplo, vztah k živinám a znečištění, způsob přezimování a faktory způsobující rozvoj, predátoři) • Kvantifikace … • Znalosti o produkci toxinů, slizů, odorů aj. jednotlivými zástupci a jejich účincích • Výhodou řidičský průkaz ☺
Determinace
Determinace praxe • Dostupná determinační literatura = použív.v praxi - hygienici: sinice – dostupné materiály v ČJ - Povodí: Susswasserflora von Mitteleurope - synonymika ! • Determinační kurzy www.sinice.cz www.szu.cz/voda www.czechphycology.cz • Akreditace laboratoří
Ekologie - Vodní květ sinic = sinice s aerotopy (vznášení na hladině)
•
Optimální podmínky rozvoje: - trofizace (P) - životní strategie a ŽC (aerotopy, přezimování, reinvaze, predace) - dlouhé zdržení vody v nádrži - mechanismy proti predaci (sliz, velké kolonie, cyanotoxiny?)
•
Komplikace - Ekosystém: nic to nežere, zastínění, snížení diverzity nádrže, bioakumulace cyanotoxinů v potravní pyramidě atd. - Rekreace: dermatotoxicita, neurotoxicita - Vodárenství: detekce a odstranění cyanotoxinů
• •
Determinace a kvantifikace: komplikovaná Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny
Proč jsou cyanobakterie tak úspešné? 1) Trofizace
65nm
2) Gas vezicles
Nejčastější rody sinic tvořící vodní květy Kokální: Microcystis Woronichinia
Vláknité: Aphanizomenon Anabaena Planktothrix
Microcystis Rozšíření: sladké eutrofní vody celý svět (kromě pólů) výhradně plankton (pouze klidová stádia bentos) Počet druhů: svět cca 20 – z toho 9 známo pouze z tropů (např. M. protocystis) některé kosmpolitní (např. M. aeruginosa, M.wesenbergii) ČR – 4 …. (prý 10) poměrně uniformních Tvar a uspořádání buněk: kulovité buňky ve slizových koloniích Sliz: homogenní, bezbarvý, rozplývavý (M.aer.) či ohraničený (M.wes.) Velikost kolonií: mikro- i makroskopické práškovitý vodní květ Tvar kolonií: kulovité, laločnaté, děrované Rozmnožování: rozpadem kolonií Vnitřní struktury viditelné svět. mikr.: aerotopy
Určování Microcystis - molekulárně jsou všechny „druhy“ rodu Microcystis jeden cluster - V PRAXI je lze ale dobře definovat morfologicky ⇒ MORFOTOPY – souvisí s nimi toxicita !
Komplikace při určování:
!
-
prokaryotní velmi staré organismy chybí pohlavní rozmnožování mimořádně adaptabilní – některé znaky velice variabilní různé fáze ŽC !!! 1. Velikost b. NUTNÉ URČOVAT 2. Tvar (forma) kolonií KOMBINACÍ 3. Struktura slizu VÍCE ZNAKŮ 4. Nahuštění b. v kolonii
Microcystis M. aeruginosa
M. viridis
M. wesenbergii
M. ichtyoblabe
Kombinace znaků při určování morfotypů Microcystis Vel. b.(um) Tvar kolonií A
B
C
D
2 – 3,2
Nahuštění b. Morfotyp/toxicita pravidelně nepravidelně rozplývavý, rovnoměrně, SILNĚ TOXICKÝ nezřetelný zprvu velice sférické hustě ⇒ M. ichtyoblabe
4–7
krychlovité
4–6
laločnaté, otvory
Sliz
kopíruje okraje skupin b.
nepravidelně TOXICKÝ Balíčkovité shluky ⇒ M. viridis
rozplývavý
pravidelně rovnoměrně
TOXICKÝ
⇒ M. aeruginosa 5–9
laločnaté, otvory
zřetelně náhodně hraničený, rozmístěné b. NETOXICKÝ oddálen od b. ⇒ M. wesenbergii
Microcystis ichtyoblabe
Microcystis aeruginosa
Microcystis viridis
Microcystis wesenbergii
MORFOTYP
VEL B
VÝSKYT
> 2.5
jezera sev. Evropa
> 2.5
vzácně chladné oblasti
3.
M. firma M. natans M. ichtyoblabe
> 3.2
velice častý meso- až eutrofní nádrže
4.
M. smithii
3.25.6
čistá až mesotrofní jezera
1. 2.
5. 6. 7. 8. 9. 10 .
M. viridis M. flos-aquae
3.5-7
M. novacekii M. botrys
3-5.5
M. aeruginosa M. wesenbergii
3.54.8
běžný eutrofní nádrže netvoří dominanty, sporný morfotyp tropické oblasti
5-6
roztroušeně v nádržích jezerního typu
4-6
běžný eutrofní nádrže
4-9
běžný eutrofní nádrže
V Ý Z N A M N É V P R A X I
Různé fáze životního cyklu = různá morfologie u stejného morfotypu (druhu)
Microcystis
Microcystis – studium faktorů pro přezimování a reinvazi v mikrokosmech
Microcystis dlouhodobá kultura – ztráta GV
Woronichinia naegeliana slizové stopky
Planktothrix
Anabaena A. flos-aquae
A. planctonica
A. sigmoidea
A. smithii
Aphanizomenon
Cylindrospermopsis
Cylindrospermopsis raciborskii (WOLOZ.) SEEN.& SUBBA RAJU
r. Planktothrix širší vlákna (5 µm) bez heterocytů (viz. záměny)
Vlákno je zakončeno špičatým heterocytem
Záměny-Planktothrix
Nové určování
Zvyšování počtu lokalit a frekvence výskytu Cylindrospermopsis raciborskii v ČR 1979 - 2007 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 1979
1992
1995
1996
2001
2002
2004
2005
2006
počet lokalit s výskytem Cylindrospermopsis
2007
(Roz)Šíření Cylindrospermopsis Původně pantropický druh Další nálezy i subtropy - Thajsko (Li et al. 2001) - Vietnam (Nguyen et al. 2007) - Japonsko (Chonudomkul et al. 2004) - Nový Zéland (Wood & Stirling 2003) - Kuba (Komárek & Komárková 2003) - Brazílie (Branco & Senna 1994, Souza et al. 1998, Bouvy et al. 2000, Molica et al. 2001) - Chile (Lagos 1998) - Arizona (La Bounty& Burns 2005)
Evropa - 1. výskyt Řecko jezero Kastoria (Skuja 1937)
Invaze Cylindrospermopsis v Evropě
Země
Rok nálezu
Záznam
Řecko
1937
Skuja
Maďarsko
1942
Szalai
Rakousko
1961
Claus
Ukrajina
1968 1974
Kondratjeva Aksenova
Panonská oblast - ČR (střední Evropa)
1977 1979
Hamar, Schmidt Horecká a Komárek
Španělsko
1980
Romo and Miracle
Slovensko
1988
Hindák
Německo (Brand.)
1994
Krienitz and Hedewald
Francie
1997
Couté
Itálie
2003
Ventura
Bulharsko
2003
Stoyneva
Portugalsko
2003
Saker
Holandsko
2005
Mooji
Možné příčiny „objevení“ Cylindrospermopsis v Evropě 1) Lidský faktor - Zvýšený zájem determinátorů
toxicita
cylindrospermopsin
2) Environmentální faktory zvyšování průměrných teplot, zatížení prostředí živinami Invaze/expanze
Terminologie
Invaze - šíření druhů do oblastí, kde nejsou původní - druhy nekontrolovatelně se šířící a agresivně vytlačující původní druhy Expanze - šíření původních druhů mimo svůj dosavadní areál rozšíření Toxicita cylindrospermopsin Alkaloid Účinky: inhibice enzymů - hepatotoxicita Saxitoxiny - imunotoxicita - neurotoxicita
Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny – BU AV ČR & MU 1. Sekce cyanotoxinů Vedoucí sekce: Doc. Mgr. Luděk Bláha, PhD. analýzy cyanotoxinů, vlivy cyanotoxinů na ostatní organismy
2. Technologická sekce Vedoucí sekce: Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, PhD. možnosti omezení rozvoje vodních květů sinic, metody pro detekci sinic
3. Sekce autekologie a biologie sinic Vedoucí sekce: RNDr. Lenka Šejnohová, Ph.D. autekologie sinic vodních květů, determinace fytoplanktonu a fytobentosu
4. Sekce popularizace a ekologické výchovy Vedoucí sekce: Ing. Eliška Maršálková, PhD. popularizace problematiky sinic, školení a semináře pro odbornou veřejnost
Monitoring vodních květů sinic v ČR
Organizace MVKS - historie Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny
1. Odběr r. 1994 – Doc. Ing. B.Maršálek, CSc. – Determinace: J.+J. Komárkovi – Finanční zázemí: Sdružení flos-aquae 2. Odběr r. 1999 – Rozšíření počtu lokalit (125) a vzorků (189) – Navíc analýzy Mcyst!! 3. Od 2004 každoroční monitoring
Organizace MVKS • Hlavní organizátor: Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny • Spolupracující instituce: 24 lidí (celkem 8 institucí, především Podniky Povodí, ZU Liberec) • Cíle: 1a) Jaké % fytoplanktonu tvoří v ČR sinice 1b) Jaké druhy sinic VK se v ČR pravidelně vyskytují 1c) V jakých sezónách dominují VK ve fytoplanktonu 2a) Monitoring výskytu Mcyst intra/extracel. 2b) Lze odvodit asociaci výskytu Mcyst a rodu/druhu 3) Porovnání výsledků s okolními evropskými státy
Česká republika 2006 - frekvence výskytu jednotlivých skupin fytoplanktonu
hnědé řasy
64,4%
zelené řasy
77,5%
sinice
96,8%
Anabaena
42,8%
Aphanisomenon Cylindrospermopsis
46,8% 2,3% 67,1%
Microcystis Planktothrix Woronichinia
27,9% 43,7% frekvence výskytu = v kolika % vzorků byly jednotlivé skupiny nalezeny
Toxiny sinic = cyanotoxiny (1/4)
CH3 N
O
O N
CH3 HN
+
-
O NH
H
C H3 O3SO
NH
P O
-
O
CH3
H3C N H
N H
O
NH NH
CH3
O
OCH3
H3C
NH
NH
CH3
CH3
O
N
NH
NH
O H2C
O NH
N O
H
COOH
OH
H3C
NH O
COOH O
NH HN
NH2
– produkty metabolismu sinic (cyanobakterií) způsobující jejich toxicitu – velmi rozmanitá skupina látek a) chemicky (heterocyklické sloučeniny – alkaloidy, peptidické látky, lipidické látky, lipopolysacharidy) b) toxikologicky (různé mechanismy účinku, různé cílové orgány…) Cyanotoxiny lze obecně rozdělit na dvě velké skupiny: 1. CYTOTOXINY – jedná se o sloučeniny, které vykazují nějaký typ biologické aktivity (inhibice enzymů, buněčných procesů, antibakteriální, antivirální, protinádorová aktivita), ovšem jejich akutní toxicita pro obratlovce je nízká (detailněji se o nich dále nebudeme zmiňovat) 2. BIOTOXINY – „klasické“ cyanotoxiny, vysoce toxické pro obratlovce již v malých dávkách: microcystiny a nodulariny, cylindrospermopsiny, anatoxiny a saxitoxiny, lipopolysacharidy, aplysiatoxiny a lyngbyatoxin
CH3
NH
O
O
O NH
CH3
Určovat
CH3
Metody stanovení cyanotoxinů
1. HPLC – kapalinová chromatografie (obr.) 2. ELISA – imunochemická metoda 3. MALDI-TOF – hmotnostní spektrometrie
Toxiny sinic = cyanotoxiny (2/4) Typy toxických účinků: • hepatotoxicita (poškození jater) • neurotoxicita (narušení funkce nervového systému) !!! • dermatotoxicita (poškození kůže) • imunotoxicita (poruchy imunitního systému) • embryotoxicita (narušení vývoje plodu) • genotoxicita (poškození genetické infromace) • dráždivé účinky (na kůži, sliznice, trávicí soustavu) Sloučeniny zodpovědné za výše zmíněné účinky nebyly v některých případech dosud identifikovány, neustále jsou objevovány: - nové metabolity sinic s biologickou aktivitou - nové toxikologické vlastnosti již známých cyanotoxinů Týmy zabývající se studiem cyanotoxinů a jejich efektů na člověka i na celý ekosystém: ČR: Centrum pro cyanobakterie a jejich toxiny (společné pracoviště BÚ AV CR a MU v Brně.
Určovat
Výzkum toxických účinků cyanobakterií a jejich frakcí na Vodní fotoautotrofní organismy Vodní bezobratlé - korýše – hrotnatka velká Daphnia magna - akutní a chronické účinky Larvy obojživelníků – FETAX – test embryotoxicity a teratogeneze s embryi obojživelníků – drápatka vodní (Xenopus laevis) Ryby – embryolarvální test u kapra obecného – spolupráce s Veterinární a farmaceutickou universitou v Brně In vitro testy – dvě permanentní buněčné linie
Účinky na fotoautotrofní organismy •
studium interakcí s cizorodými látkami, citlivosti druhů
Zelené řasy (Chlorophyta) Rozsivky (Chromophyta)
Skrytěnky (Cryptophyta)
Vyšší rostliny
Sinice (Cyanophyta)
Organismy používané pro ekotoxikologické biotesty - konzumenti Daphnia magna – Hrotnatka velká Potamopyrgus antipodarum – Písečník novozélandský
Pakomáři rodu Chironomus • • •
Tubifex tubifex – Nitěnka obecná Artemia salina Thamnocephalus platyurus
Test s vajíčky obojživelníků
(drápatky)
Spolupráce s VFU a MZLU - experimenty s rybami Spolupráce s VFU - experimenty s ptáky
Účinky na obratlovce • Úhyny ryb spojené především se snížením obsahu kyslíku
• Hromadné úhyny ptáků v různých částech světa spojovány s masovými rozvoji sinic – nejednoznačné důkazy • Většinou souhrn více faktorů – paraziti, UV, sinice, patogeny – oslabení populací
Bioakumulace microcystinu-LR v rybí tkáni
Bioakumulace
MICROCYSTINU
Biotoxiny (3/4) – „klasické“ cyanotoxiny, vysoce toxické pro obratlovce již v malých dávkách Biotoxiny lze rozdělit do pěti skupin: 1) Microcystiny a nodulariny 2) Cylindrospermopsiny 3) Anatoxiny-a, anatoxin-a(S) a saxitoxiny 4) Lyngbyatoxin a aplysiatoxiny 5) Lipopolysacharidy 1) Microcystiny a nodulariny – cyklické peptidy – u obratlovců působí primárně na játra (hepatotoxicita), ale mohou poškozovat i jiné orgány (plíce, střeva, ledviny), mají genotoxické a podle nejnovějších informací rovněž neurotoxické účinky – při chronické expozici – podpora nádorového bujení (karcinogeneze) Byly prokázány u rodů: Anabaena, Anabaenopsis, Hapalosiphon, Microcystis, Nodularia, Nostoc, Oscillatoria, Planktothrix, dále některé pikoplanktonní sinice 2) Cylindrospermopsiny – heterocyklické látky – poškození jater (hepatotoxicita), dále ledvin, plic, sleziny, střev, genotoxicita, pravděpodobný lidský karcinogen Byly prokázány u rodů: Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis
Určovat
Biotoxiny (4/4) Anatoxiny-a, anatoxin-aS a saxitoxiny – celkem 3 různé typy heterocyklických sloučenin, které různými způsoby narušují přenos nervových vzruchů (neurotoxicita) Byly prokázány u rodů: Anabaena, Aphanizomenon, Cylindrospermopsis, Raphidiopsis Lyngbya, Oscillatoria, Phormidium, Planktothrix Lyngbyatoxin a aplysiatoxiny – heterocyklické sloučeniny, látky vyvolávající podráždění a záněty (např. kůže, dermatotoxicita) Byly prokázány u rodů: Lyngbya, Oscillatoria, Schizothrix Lipopolysacharidy – látky vyvolávající záněty a podráždění (kůže, zažívacího traktu apod.) – součást buněčné stěny všech sinic, o rozdílech v toxicitě mezi jednotlivými rody / druhy / kmeny není dosud příliš mnoho informací
Určovat
COOH
MICROCYSTINY
CH3
OCH3
H3C
CH3
NH
O H2C
O NH
CH3
O
N
NH
H3C
CH3 NH
O NH
CH3
NH
O O
COOH O
CH3
• •
cyklické peptidy, 70 forem producenti Microcystis, Planktothrix, Anabaena, Anabaenopsis,
•
mechanismus účinku: inhibice proteinfosfatáz PP1 a 2A
NH
HN
NH2
Nostoc
- u obratlovců primárně hepatotoxicita - ovlivněny mohou být i další orgány (plíce, ledviny, imunitní systém) -chronicky promoce karcinogeneze ! relativně stabilní a odolné vůči rozkladu ! komplikace při výrobě pitné vody – nutné nákladné technologie
COOH
MICROCYSTINY = riziko?
OCH3
H3C
N
CH3
O
dermální kontakt náhodná ingesce a vdechnutí
rekreace
pitná voda ryb y zelenina
?
RIZIKA SPOJENÁ S PŘÍJMEM MICROCYSTINŮ KONTAMINOVANÝMI POTRAVINAMI NEJSOU VŮBEC REGULOVÁNA
HN
O NH
CH3
NH
NH O
§ Vyhl. 135/2004 Sb. §
H3C
CH3
COOH O
NH
§ Vyhl. 252/2004 Sb. §
NH
O H2C
O NH
CH3
O
CH3
NH
NH2
CH3
Metody hodnocení kvantity fytoplanktonu 1) Koncentrace chl-a (µg/l) ČSN ISO 10260 2) Počet buněk/ml
ČSN 75 7712 TNV 75 7717 3) Objemová biomasa
1) Koncentrace chl-a Terén - sonda Fluoro-Probe – celk. chl-a + rozdělení na 4sk. (Cyanophyta, Chlorophyta, Chromophyta, Cryptophyta) http://www.sinice.cz/cz/popularizacni/fluoroprobe.htm Laboratoř - extrakce ethanolem – chl-a (ČSN ISO 10260) - mikrodestičky Genios výhody: malá časová náročnost, v případě sondy měření in situ+profil vodního sloupce : zachycení reálných poměrů biomas jednotlivých skupin a druhů (x b/ml) nevýhody: nevíme nic o druhovém složení (znát aspoň dominantu jednotlivých skupin? – příp. toxicita) : sonda – finanční náročnost : živé vzorky
2) Počet buněk/ml Průtoková cytometrie – počet buněk jednotlivých tax. skupin výhoda: časová nenáročnost, přesnost, možnost zpracovat velké množství vzorků nevýhoda: finanční nedostupnost, živé vzorky, písek, kolonie Počítací komůrky – Bürker – Cyrus I., Cyrus II.
2a) Počet b./ml – výhody/nevýhody výhoda: dostupné, finančně nenáročné, možnost fixáží nevýhoda: časová náročnost, hlavní problém taxonomicky různorodé skupiny - různé typy a velikosti stélek bičíkatci – útíkají, praskají kolonie – sinice bez desintegrace velká variabilita odhadu dle osoby, po desintegraci komplikace určit druh vlákna – sinice svazečky, různé velikosti vláken chyba ve velikostech – 5µm sinice vs. „zelená koule“ 50 µm brána stejným počtem 1 vnitřní struktury v buňkách – PROBLÉM při počítání-jiná rovina na sklíčku, koncentrování Přesný plán metodiky promyslet: • (fixace), zkoncentrování, desintegrace, počítání, výpočet podle vzorce
2b) Počet b./ml – fixace 1 Lugolův roztok 10 g jodidu draselného se rozpustí ve 20 ml vody, přidá se 5 g krystalického jodu a smíchá se s 50 ml 10% kyseliny octové. Po promíchání se nechá 1 den ustát. výhoda: - fixace rozsivek – fytobentos, šupinaté chrysomonády pro TEM - fixace VK – při koncentraci lze využít centrifugaci (TNV 75 7717) nevýhoda: - sinice (fotografování změna barvy, zakrytí fotosyntetických barviv – nemožnost použít fluorescenci!!-problém pikocyanobakterie)
2b) Počet b./ml – fixace 2 Formaldehyd výsledná koncentrace ve vzorku 1,5-2% výhoda: - zachování fluorescence, fotografování (ale je krátkodobé!) nevýhoda: - VK – při koncentraci se musí využít vakuová filtrace - vyblednutí vzorku během krátkého časového intervalu-fluroscence nefunkční - rozsivky a šupinaté chrysomonády – porušení struktur SiO2 - citlivé buňky praskají (skrytěnky, vacuolarie atd.)
2b) Počet b./ml – fixace shrnutí 1) Je-li možnost – zpracovat vzorek živý (lednice uchování cca max. týden-VK ale jen den!, uvést do protokolu) 2) Fixace – zvážit účel analýzy a hustotu vzorku – jaké tax. skupiny jsou ve vzorku mám možnost použít fluorescenci? (formaldehyd – sinice VK; Lugol – rozs., chrysomonády, citlivý bičíkatci) 3) Je-li možnost: vzorek fixovat dvojmo – obě metody fixace (ale problém místa, peněz za fixáže/vzorkovnice, čas zpracování …)
2c) Počet b./ml - zkoncentrování vzorku KDY ? - počet b. < 50tis.b/ml PROČ ? - bez zkoncentrování nezaznamenáme některé zástupce, které se pak mohou rozvinout v dominantu.. CO VĚDĚT PŘEDEM ? - Přibližné SLOŽENÍ, abychom neeliminovali některé skupiny zvolenou metodikou JAK ? - centrifugace - vakuová filtrace
Centrifugace
Vakuová filtrace
2e) Počet b./ml – Vlastní počítání Bičíkatci – např. skrytěnky v živém vzorku: projetí celého Burkra před zahajením počítání ostatních skupin Vlákna a svazečky vláken: - dle ČSN délka vláken/5 = počet buněk Kolonie - desintegrace Doporučení fluroscence - výskyt pikocyanobakterií – norma ČSN: „Stanovení pikoplanktonu je orientační…“ - po desintegraci Microcystis
2f) Počet b./ml – Vzorec Burker b./ml Počítáme buňky uvnitř čtverce a ty, které leží nebo se dotýkají 2 zvolených stran (obvykle se volí horní a pravá str.) VZOREC počet buněk v 50ti čtvercích * 5 000 = b/ml
(pravidlo - spočítat min. 400b. jinak počítat dál a pak např. 100čtverců * 2 500 = b/ml - nezapomenout na vydělení při metodách zkoncentrování)
• doporučení: vytvoření vzorce v Excelu – pak jen vkládání počtu buněk jednotlivých druhů • nutné mít tlusté krycí sklo (užší sklíčko podhodnocení cca na 80%)
3) Objemová biomasa (biovolume) • Manuální výpočet (počet b. x objem) • Program - Fyto-N (JU, České Budějovice) výhody: zachycení reálných poměrů biomas jednotlivých skupin a druhů (x b/ml) nevýhody: časová náročnost – program Fyto-N
OK
ÚČEL – METODIKA - ČAS Jednorázová univerzální metoda použitelná v každý čas na každém místě prakticky neexistuje CO TEDY? Pravidla 1) Použít během 1 projektu příp. u projektů, budeme co budememe srovnávat výsledky, 1 metodiku 2) V současnosti norma – OK chlorofyl-a počet b./ml (biovolume ale přesnější – sinice/řasy vel.b…) Vždy zvážit základní otázku: Účel projektu - je nutná detailní kvantitativní analýza? fytoplankton s VK – nutné 2x počítání - před a po desintegraci..
Praxe na BU AVČR Brno Hodnocení kvantity fytoplanktonu: Monitoring: Sonda Fluoro-Probe kombinace s počtem b/ml Věděcky zaměřené projekty: Fluoro-Probe s biovolume (objemová biomasa) Počítání buněk/ml - Burker, většinou využití vakuové filtrace (VK) s celulozním filtrem 0.2um, desintegrace ultrazvukem, biovolume využití programu FYTOn
Problémy spojené s kvantifikací rodu Microcystis (b/ml) • 1) AEROTOPY • – vznášení při zahušťování a při počítání v komůrce • 2) VELKÉ KOLONIE – buňky se navzájem překrývají PODHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ
Aerotopy? = paralelní sdružení proteinových měchýřků (gas vezicles=GV), které jsou naplněné směsí vzduchu
AEROTOPY Syntéza: - závislá na okolních podmínkách - u Microcystis v sedimentech rapidní snížení jejich množství Funkce: vznášení ve vodním sloupci a na hladině – konkurenční boj o světlo s ostatními fotosyntet. organismy
PLYNOVÉ MĚCHÝŘKY
65nm
Centrifugace
Vakuová filtrace
Injekční stříkačka s KOH
- rychlá, levná
„úplná“ desintegrace kolonií Microcystis
se současnou destrukcí aerotopů
Modelový příklad Jarní vzorek fytoplaktonu - eutrofní nádrž pod 50tis.b/ml - předpokládáme výskyt sinic VK A) 1) vakuová filtrace (např. 50ml-100ml na 5ml-10ml do zkumavky) 2) 0,5ml prohlédnout druhové složení – výskyt Microcystis - %odhad morfotypů 3) 0,5ml Burker spočítat ostatní druhy než Microcystis (vlákna – změření délek) 4) 2ml desintegrace vzorku (ultrazvuk, stříkačka) 4) spočítání desintegrovaných buněk Microcystis (urychlí se fluorescencí, neplavou mají popraskané GV) 5) dosazení do vzorce (nezapomenout na vydělení při zkoncentrování!) B) 1) fixace lugologým roztokem (pozor znemožníme si počítání buněk Microcystis pomocí fluorescence po desintegraci; při přefixování nelze použít ultrazvuk na desintegraci kolonií) 2) centrifugace 10ml 2x na 1ml 3) dále se pokračuje bodem 3) jako v předchozím případě Vždy nutné!!! – použitou metodiku zanést do protokolu!!!!
Bioindikace a monitoring ekologického stavu povrchových vod Princip bioindikace - sledování kvality (druhové složení, diverzita), kvantity, deformací, fyziologických, biochemických změn bioty – jedinec, populace: • Fytoplankton • Fytobentos • Makrofyta
Zooplankton Zoobentos Ryby Výhody bioindikace (x chemicko-fyzikální parametry) - odraz dlouhodobějšího stavu lokality (365dní, 24h denně) - záznam impaktů interakcí faktorů ( např. polutantů)
Bioindikace PovVod v ČR a EU dnes • Rámcová směrnice WFD EU 2000 (Water Framework Directive) – cíl: dosažení dobrého ekologického stavu všech vodních útvarů (3 markery sledování: biologické, hydromorfologické, chemicko-fyzikální parametry) • ČR projekt ARROW - „Akční plán MŽP“ - implementace WFD – Výzkumný a vodohospodářský ústav (VUV) vytvoření metodik: odběrů a zpracování dat výběr referenčních lokalit sledování a hodnocení stavu
Tradice makroozoobentos Fytoplankton, fytobentos - pracná implementace v ČR (determinace - zkušenosti)
Fytoplankton, fytobentos - implemetace WFD v ČR
Metodiky Marvan, Kozáková (2006): Metodika odběru a zpracování fytobentosu
stojatých vod. VUV, TGM. Marvan, Heteša (2006): Metodika odběru a zpracování fytobentosu stojatých vod. VUV, TGM. Komárková (2006): Metodika odběru a zpracování fytoplanktonu stojatých vod. VUV, TGM. Marvan, Heteša (2006): Metodika odběru a zpracování fytoplanktonu tekoucích vod. VUV, TGM. Výběr a charakterizace referenčních lokalit Revize indikačních seznamů (synonymika úú) Podklad saprobitní index - Sládečkovi 1996, 1997
indexy
Situační monitoring – Povodí, VUV Hodnocení: software Omnidia (Francie) ? – různé trofie, saprobity, salinity, kyslíku, pH, diverzity (ČR: SLA, ± ROTTův index Tr. Sap. – Rakousko) !!! Typologie toků … (podloží, n.m.v.)
Bioindikace - fytoplankton • Tekoucí vody - omezení: pouze dolní toky řek s omezeným uplatněním fytobentosu a ve výjimečných případech (ovlivnění toku stojatými vodami) • Stojaté vody - kvalitativní a kvantitativní rozbor
Bioindikace - fytobentos • Tekoucí voda - větší výpovědní hodnota než fytoplankton • Stojaté vody – kombinace s fytoplanktonem - využití při algicidních zásazích k hodnocení změn ekologického stavu nádrže
Jaderná elektrárna Dukovany - biofilmy
Zelené vláknité řasy (Cladophora, Microspora) přirůstající na podklad, tvoří velké biomasy, na povrchu stélek epifytické rozsivky rodů Cocconeis, Fragilaria, Rhoicosphaenia, Gophonema
Bioindikace fytobentos - rozbory – hodnocení
Pleurosira laevis – indikace zvýšené salinity
Program Omnidia – hodnocení kvality vody rozsivky
Lokalita se zvýšenou trofií a saprobitou - hodnocení Omnidia
povlaky sinic ř. Chroococcales, Oscillatoriales
Navicula goepertiana – indikátor zvýšené trofie i saprobity
Van Dam 1994 pH 1 2 3 4 5 6
Catégories acidobiontic acidophilic neutrophile alkaliphilous alkalibiontic indifférent
Salinity 1 2 3 4
fresh fresh brackish brackish fresh brckish
Saprobity 1 2 3 4 5
oligosaprobous ß-mésosaprobous alpha-mésosaprobous alpha-méso - polysaprobous polysaprobous
Trophic state
pH requirements pH optimum <5,5 pH optimum 5,5
7 exclusively occurring at pH >7 No apparent optimum Cl- (mgl-1)
Salinity(‰)
<100 <500 500 - 1000 1000 - 5000
<0,2 <0,9 0,9 - 1,8 1,8 - 9,0
Oxyg. sat.(%) >85 70 - 85 25 - 70 10 - 25 <10
BOD5 (mgl-1) <2 2- 4 4 - 13 13 - 22 >22
1 2 3 4 5 6 7
oligotroaphentic oligo-mésotraphentic mésotraphentic méso - eutroaphentic eutraphentic hypereutraphentic indifférent
Oxygen requirements 1 2 3 4 5
N-Hétérotrophy ([N] orga.) 1 2 3 4
Sensitive N-autotrophic Tolerant N-heterotrophic Facultative N-heterotrophic Obligately N-heterotrophic
continuously high (100% sat.) fairly high (>75% sat.) moderate (>50% sat.) Low (above 30% sat.) very low (about 10% sat.)
MOISTURE 1 2 3 4
Strictly aquatic mainly occurring in water bodies regularly on wet and moist places moist or temporarely dry places y
Van DAM, H., A. MERTENS & J. SINKELDAM (1994 A coded checklist and ecological indicator values of freshwa diatoms from the Netherlands. Netherl. J.Aquat. Ecol. 28(1):117-133
Index trofie ROTTův (st.0,3-3,9) – oblast v grafu 2,8 – 3,3 eutrofie Trofie ROTTtr. 3,4 3,3
Index trofie
3,2 3,1 3 2,9 2,8 2,7 1
2
směr hypertrofie
3
4
5
6
7
8
9
vzorky
10
11
12
13
14
15
16
Saprobní index - Sládečkův (0-4) a ROTTův (1-3,8) Saprobita
saprobní index
červená linie – hranice α-meso-poly-saprobie (Van Dam) 3 2,8 2,6 2,4 2,2 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
1 SLA - index ROTTsp - index
2
3
4
5
6
7
8
vzorky
9
10
11
12
13
14
15
16
Index kyslíku a salinity – Van Dam (1994) Indexy kyslíku
low 30% sat.
5
index kyslíku
4
moderate 50% sat.
☺
3
fairly hight 75%sat.
☺
2
1 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
vzorky
Index salinity Salinity 1 2 3 4
fresh fresh brackish brackish fresh brckish
Cl- (mgl-1)
Salinity(‰)
<100 <500 500 - 1000 1000 - 5000
<0,2 <0,9 0,9 - 1,8 1,8 - 9,0
0.8
Podobnost druhového složení rozsivek Prunerov I
Tusimice CPED MVAR RABB DVUL
EDU 0CHV
Pocerady
Chvaletice
NGOE
Porici
Melnik NCAP
EDU 7CHV CTUM FVIR
GAFF
Hodonin
FFAS NSIG AGRA GPAR DTEN NDIS
HAMP ACOA FARC NPSE NDIS NMUT
CPLA NVEN NCON ALIB NGRA NTRI APED NFON FULN TABE NAMP
Prunerov II
CMIN
Detmarovice NCOM
-0.6
NSTR
PGIB AAMB ALAN
Ledvice c. 4 NCOM
Tisova
NPAL SBRE
Temelin AVEN
-0.8
NTRY
Vítkovice
Ledvice ELE
1.0
Ekotoxikologické biotesty • Ekotoxikologie – interdisciplinární vědní obor kombinující poznatky: ekosystémy a interakce chemických látek
Ekologie
Toxikologie
Cíl: poznání interakcí mezi živými organismy a chemickými/toxickými látkami v prostředí na všech úrovních (molekula – populace)
Koncept ekotoxikologie Interakce TOXICKÁ L./ŽIVÝ SYSTÉM - Vstupuje do prostředí - Specifická distribuce (voda x vzduch x půda x organismy) - Specifický osud (reaktivita x transformace x (bio)degrace – vznik nových látek) INTERAKCE ŽIVÝ SYSTÉM - ne všechny l. jsou organismům dostupné – vazby na složky v prostředí, nerozpustnost - některé l. se mohou v org. kumulovat Expozice = míra kontaktu LÁTKA/ŽIVÝ ORG. (dávka, délka, doba – jednorázová, opakovaná, dlouhodobá)
Koncept ekotoxikologie
Interakce TOXICKÁ L./ŽIVÝ SYSTÉM Chem.l. – studium toxicity 1) In vitro – biochemické studie, univerzální pro všechny organismy (př. mutagen) 2) Testy toxicity s jednotlivými organismy - poznání efektů na různých trofických úrovních - akutní toxicita - chronická toxicita: reprodukční toxicita, imunotoxicita 3) EkotoxikologieProducenti populací, společenstev – sinice, řasy, VR Konzumenti Destruenti
Producenti Toxicita na producenty má zásadní vliv na celý ekosystém Akutní efekty - inhibice fotosyntézy - letalita Výsledek - ztráta citlivých druhů - snížení diverzity - likvidace producentů – kolaps ekosystému
Toxická látka • Paracelsus (± 1500n.l.) „All substanses are poisons, only the dose makes a distinction between one which is a poison and one which is a remedy“ Toxikant - není přírodního původu Toxin - látky přírodního původu Producenti používané v testech:
Scenedesmus Raphidocelis Chlorella Microcystis
Křivka dávka - odpověď (lowest observed effect concentration)
100 90 (no observed NOEC 80 effect concentration) 70 60 50 40 30 20 10 Ne 0 toxické 0,1
Letální účinky
LOEC LC EC50 - koncentrace, která způsobí úč (snížená reprodukce, růst atd.) u 50% testovacích organismů,
Odhad EC50 1
10
100
Logaritmické měřítko Křivka – sigmoidní tvar
1000
10000
Vypočítané parametry • EC 50 : účinná koncentrace způsobující 50% odpověď v testovací populaci. • Účinná koncentrace, mg/L, ml/L • LD50: dávka způsobující 50% letalitu v testovací populaci.
Determinační pomůcky a kurzy CCT www.sinice.cz
1) Pomůcky - Interaktivní klíč k určování vodních květů sinic (CD (Šejnohová et. al., 2005 - Atlas fytobentosu (CD 2008)
2) Kurzy & konference - Konference Cyanobakterie 2004, 2006, 2008 - Determinační semináře CCT – pátky 1x měsíčně www.fytobentos.sinice.cz/schuzky_prihlaska.htm - Determinační kurzy fytobentos, fytoplankton ve spolupráci SZU Praha - Determinační kurz Fytobentos : 20.-22.4.2009 - www.fytobentos.sinice.cz
Kontakty [email protected] www.sinice.cz www.fytobentos.sinice.cz www.recetox.cz www.sejnohova.cz
Děkuji Vám za pozornost
