A G R O K É M I A É S T A L A J T A N 54 (2005) 1–2
177–188
Asszociatív nitrogénkötő oltóanyagtörzsek túlélőképességét befolyásoló tényezők két potenciális vivőanyagban 1,2
KÖDÖBÖCZ LÁSZLÓ, 3KÁRPÁTI ÉVA, 4DUSHA ILONA és 5 BIRÓ BORBÁLA
1
Szent István Egyetem, Mezőgazdasági-, Környezeti Mikrobiológia és Biotechnológia PhD Program, Gödöllő, 2BIOdeTECHt Kft., Érd, 3Mezőgazdasági Biotechnológiai Kutató Központ, Gödöllő, 4Szegedi Biológiai Központ, Szeged és 5MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézet, Rhizobiológiai Kutatórészleg, Budapest
A fenntartható mezőgazdasági gyakorlathoz tartozó eljárás lehet a költséges és környezetszennyező műtrágyák, környezetbarát biotrágyákkal való kiváltása (SZEGI, 1967). A növény–talaj–mikroba rendszereknek, a növényi rizoszférának ily módon történő irányított biotizációjához napjainkban az ún. másodgenerációs mikrobiális oltóanyagok kifejlesztésével járulhatunk hozzá (BIRÓ, 2002). Az oltóanyagok talajéletre gyakorolt pozitív hatását tovább fokozhatjuk, ha azokat valamely olcsó, könnyen hozzáférhető, az oltóanyag életképességét hosszú ideig biztosító, trágyaszerként is szolgáló vivőanyaggal alkalmazzuk együtt. Az ilyen irányú mezőgazdasági biotechnológia fejlődésével ezért a diazotrófok termőföldre történő kijuttatása során is a szervetlen vivőanyagokat (pl. a folyékony táptalajok, semleges és inert porok) felváltották a különböző talaj- és tőzeg-alapú készítmények. Ezt követően számos esetben bizonyítást nyert, hogy az ilyen, szerves anyagokat is tartalmazó hordozók képesek leginkább az oltóanyagok túlélőképességét a talajba kerülés bizonytalan időpontjáig biztosítani (BIRÓ, 1992a,b; KÖDÖBÖCZ et al., 2003). Ennek megfelelően SOÓS és munkatársai (1976), JAUHRI és PHILIP (1984) a tőzeg különböző változatait, GAIND és GAUR (1990) a búzakorpát, VIVEGANANDAN és JAUHRI (2000, 2002) a kalcium alginátot, GAIND és GAUR (2002) pedig egy ipari mellékterméket, a szálló pernyét részesítette előnyben. A mezőgazdasági és kommunális hulladékok feldolgozása során keletkező komposztok számos új lehetőséget rejthetnek magukban a mikrobiális oltóanyagok „új generációjának” a kifejlesztéséhez. Ezek termőterületeken való elhelyezése hazánkban is egyre inkább terjedő gyakorlat (BIRÓ et al., 1993), amit egyrészt a kényszerűség, másrészt a talajok tápanyag-gazdálkodásának az igazolt javulása is indokol. Az eljárás a biodegradálható anyagok természetes körforgását is segíti, és alternatívát kínál az egyre inkább csökkenő szerves tráPostai cím: BIRÓ BORBÁLA, MTA Talajtani és Agrokémiai Kutatóintézet, 1022 Budapest, Herman Ottó út 15. E-mail:
[email protected]
KÖDÖBÖCZ et al.
178
gyák helyettesítésére is (SZILI-KOVÁCS, 1985). További perspektívát jelenthet a termőterületeken történő elhelyezéshez az olyan kiegészítő technológiák kifejlesztése, amelyekkel a felhasználás, illetve a hasznosíthatóság is javítható, vagy a kihelyezés kockázata csökkenthető. Ilyen alternatív technológiák lehetnek a komposztálás (DUMONTET et al., 1999; MARKÓ, 1998) mellett a biogázelőállítás, vagy a mikrobiális oltóanyagokkal megvalósított dúsítás is, amivel a mezőgazdasági művelés sikere fokozható (SZEGI, 1967; BIRÓ & PACSUTA, 2002). A mikrobiális oltóanyagok vivőanyagát a fentiek figyelembevételével célszerű úgy megválasztani, hogy azok az oltóanyagtörzsek túlélését képesek legyenek biztosítani a felhasználásig (SOÓS et al., 1976). A korábbi gyakorlat szerint erre a tőzeges vivőanyagok feleltek meg a leginkább. Napjainkban az alternatív, kevésbé költséges és környezetbarát, hulladékanyagokat is hasznosító megoldásokat keressük. Az oltóanyagtörzsek genetikai eszközökkel történő alakítása mellett a technológia fejlődése érdekében az új vivőanyagokkal való összeegyeztetés is kiemelt fontosságú (KÁRPÁTI et al., 1999). Az előállított szerves vivőanyagok, komposztok, humusztrágyák kiindulási alapanyagaitól és az alkalmazott technológiától függően ugyanakkor azok minősége, stabilitása, mikroba-összetétele igen változatos lehet, ami befolyásolja nemcsak a kezelt talajok mikrobiális aktivitását (SASTRE et al. 1996), de az alkalmazott oltóanyagtörzsek túlélőképességét is. A Synorhizobium baktériumokra vonatkozó túlélőképesség-vizsgálatainknál (KÖDÖBÖCZ et al. 2003) feltételeztük a vivőanyagokban potenciálisan jelenlevő antagonista mikroorganizmusoknak a hasznos törzsek megmaradását befolyásoló képességét. Jelen munkánkban ugyanannak a két szerves hordozóanyagnak az asszociatív Azospirillum oltótörzsek túlélőképességére kifejtett hatását vizsgáltuk és ellenőriztük a hordozóanyagokból kitenyésztett potenciálisan antibiózisra képes mikroorganizmusok (mikroszkopikus gombák és sugárgombák) antagonista tulajdonságait is. Anyag és módszer Laboratóriumi körülmények között rifampicin, klóramfenikol és kanamicin antibiotikum rezisztenciával rendelkező Azospirillum brasilense és A. lipoferum fajok túlélését vizsgáltuk két olyan közegben, amelyek potenciálisan hordozóanyagként szolgálhatnak az oltóanyagok előállítása során. A törzsek származási körülményeit és jellemzését KÁRPÁTI és munkatársai (1999) közlik. Az Azospirillum fajokat Okon-táptalajon (OKON et al., 1977) szaporítottuk. A 24 órás tenyésztés után a törzseket 10–10 ml steril csapvízzel mostuk le, majd szuszpendáltuk. A szuszpenziók 1–1 ml-ével 250 ml Okon táplevest oltottunk, majd 48 órai inkubáció következett rázótermosztátban (150 fordulat/perc), 30 oC-on. A kiindulási szuszpenziók élő csíraszámát az ANGERER és munkatársai (1998) által módosított határhigításos táplemezes eljárással ellenőriztük, és
Asszociatív nitrogénkötő baktériumok túlélése vivőanyagokban
179
108 ml-1 nagyságrendre állítottuk be. Az oltóanyagot egyenletesen a vivőanyaghoz kevertük 100 ml oltóanyag/200 g komposzt arányban. Az oltótörzsek kiindulási sejtszáma ennek megfelelően 106 g-1 száraz vivőanyag volt, amelyet 100%-nak tekintettünk. A keveréket tenyészedényekbe helyeztük. Az ily módon kialakított közegek nedvességtartalmát súlyra öntözéssel a teljes vízkapacitás 60%-án tartottuk a kísérlet teljes ideje alatt. Az utólagos fertőzések elkerülése érdekében az edényeket steril, megnedvesített papírvattával takartuk le. Az Azospirillum törzsek pusztulási arányának meghatározásához a bevitt törzseket Okon-féle szelektív táplemezek segítségével tenyésztettük az oltást követő 1., 2., illetve 3. hét végén DÖBEREINER és BALDANI (1979) szerint. Ebből a célból a komposzt, illetve humusztrágya 1–1 g-jából 3 párhuzamosban, hígítási sort készítettünk. A szuszpenziók élő csíraszámát a már fentebb hivatkozott módszerrel (ANGERER et al., 1998) határoztuk meg, 1 g szárazanyagra vetítve. Az A. brasilense visszatenyésztéséhez 20 μg⋅ml-1 rifampicint és 20 μg⋅ml-1 kloramfenikolt, az A. lipoferum esetén pedig 20 μg⋅ml-1 rifampicint és 50 μg⋅ml-1 kanamicint alkalmaztunk a szelektív táptalajokhoz. Az oltóanyagtörzsekkel szemben megnyilvánuló antibiózis ellenőrzése céljából potenciálisan antagonista mikroorganizmusokat, sugárgombákat és fonalas mikroszkopikus gombákat (penészeket) izoláltunk a közegekből és Nutrient táptalajra oltottuk, majd 48 órán át 28 oC-on inkubáltuk. A lemezekről random módon sugárgomba és penészgomba izolátumokat gyűjtöttünk, amelyeket tisztítás után törzsgyűjteményben helyeztünk el. Az Azospirillum oltótörzsekkel szembeni antagonizmus tanulmányozásához a komposztból és humusztrágyából 10–10 sugárgomba és mikroszkopikus gomba izolátumot vontunk be. Az antagonista hatást agarkorong módszerrel, a PATEL és BROWN (1969) által leírtak szerint ellenőriztük. Ehhez a sugárgomba- és a mikroszkopikus gomba törzsekkel egyenletesen benőtt, 72 órás Nutrient, illetve Martin agar lemezekből (SZEGI, 1980) dugófúróval 7–7 mm-es korongokat vágtunk ki. A korongokat 3–3 ismétlésben az Azospirillum brasilense vagy A. lipoferum (107⋅ml-1 csíraszámú) 100 μl mennyiségű szuszpenziójával egyenletesen szélesztett Nutrient lemezekre helyeztük. A lemezeket az antibiotikus anyagok kidiffundálása érdekében 1 éjszakán át hűtőszekrényben tároltuk, majd 28 oC-on inkubáltuk 72 óráig. Az antagonizmus mértékét a sugárgomba vagy a penésztelepek körül kialakult kioltási zóna mérésével állapítottuk meg. Az antagonizmus értékelése az antibiotikumoknál általánosan elfogadott skála szerint történt a következőképpen: erős, mérsékelt, ill. gyenge antagonizmus, ha a kioltási zóna >18 mm, 12–18 mm, ill. <12 mm. Nincs antagonista képesség, ha a korongok körül kioltási zóna nem fedezhető fel. A kapott eredményeket az izolátumokra vonatkozó középértékek %-os arányában mutatjuk be. A vizsgálatokhoz használt nagy szervesanyag-tartalmú közegek, mint hordozók fizikai és kémiai tulajdonságait az MSz-08-0206/1-78 sz. szabvány előírásai szerint határoztuk meg (KÖDÖBÖCZ et al., 2003). A hordozóanyagok sterilezése
KÖDÖBÖCZ et al.
180
121 oC-on, 1 atm. túlnyomáson, három egymást követő napon, 15–15 percig történt (parciálisan). A szerves vivőanyagok kiválasztásánál a mezőgazdasági és/vagy kommunális hulladékanyagok hasznosíthatóságát tartottuk szem előtt. A vizsgálatokba a következő termékeket vontuk be: kommunális szennyvíziszapot tartalmazó komposzt; és egy szőlőtörköly-tartalmú, anaerob módon előállított humusztrágya. A tesztelt anyagokra és előállításukra vonatkozó egyéb adatok és információk az előállító és forgalmazó BIOGÉN Kft. (Tapolca) tulajdonát képezik. A vizsgálatok során alkalmazott tenyészedényeket előzetesen 3%-os klorogénoldattal fertőtlenítettük, majd steril desztillált vízzel 4-szer öblítettük. Az eredmények értékelését kéttényezős varianciaanalízissel végeztük. A túlélési vizsgálatoknál az 1. tényezőt az idő, a 2. tényezőt a törzsek jelentették. A legkisebb szignifikáns eltéréseket (SzD) P = 0,05%-os szinten határoztuk meg. A bemutatott ábrákon az átlagértékek közötti szignifikáns különbségeket a megfelelő nagyságú hibasávok jelzik. Eredmények és értékelésük Azospirillum-törzsek túlélőképessége komposztban A komposztok megfelelő technológiával előállított, stabilizált mikrobiológiai állapotú szerves anyagok. Előállításuk során a magas hőmérséklet a patogén mikroorganizmusok vegetatív sejtjeinek pusztulását idézi elő, ami a szennyvíziszap alapanyagok alkalmazásánál az élelmiszerbiztonsági követelmények miatt különösen indokolt. Az általunk vizsgált kiindulási, nem sterilizált komposztban az Azospirillum oltást követő 1. héten a kezdeti sejtszámhoz viszonyítva 15–20%-kal megnőtt mindkét oltótörzs csíraszáma (1A. ábra). A 2. hét végére ugyanakkor erőteljes élősejtszám-csökkenést tapasztaltunk, mely így a kezdeti gyarapodást követően ismét a kiindulási szintre esett vissza. A 3. hét végére ez a tendencia folytatódott, bár a 2. és 3. hetek sejtszámai között nem volt kimutatható szignifikáns különbség (1A. ábra). Steril komposztban az 1. hét végére a kiindulási állapothoz viszonyítva szintén 10–15%-os Azospirillum sejtszám-gyarapodást tapasztaltunk, mely különbség szignifikánsnak adódott (1B. ábra). Ez a növekvő arány a 2. hét végére is megmaradt, csupán a 3. héten tapasztaltunk kismértékű csökkenést, amely elmaradt a nem steril komposztban mértekhez viszonyítva. Ezek a különbségek azonban csak tendenciaként jelentkeztek, szignifikáns különbségeket az 1., 2., ill. 3. héten detektált élősejtszámok között nem, csak a kontrollal való összehasonlításban mutattunk ki. Az eredményekből megállapíthatjuk, hogy a tesztelt vivőanyagok sterilezése nagymértékben javíthatja az alkalmazott Azospirillum oltótörzsek túlélőképességét. Az ilyen közegekben a bekeverést követő kezdeti sejtszám-gyarapodás
Asszociatív nitrogénkötő baktériumok túlélése vivőanyagokban
181
figyelhető meg mindaddig, amíg az élő sejttömeg túléléséhez, szaporodásához szükséges tápanyagok rendelkezésre állnak. További magyarázatot jelenthet, hogy a sterilezéssel a túlélési esélyeket csökkentő konkurens mikrobapopuláció eltűnik. A közegbe juttatott oltótörzsek így a sterilezés hatására nem kerülnek kompetitív kölcsönhatásba a vivőanyag eredeti (abundáns) mikrobiótájával. A
Túlélési arány (%)
125
A. lipoferum A. brasilense Átlag
120 115 110 105 100 95 90
B
Túlélési arány (%)
130 125 120 115 110 105
A. lipoferum A. brasilense Átlag
100 95 90 0
1.
2.
3.
Idő (hetek)
1. ábra Az Azospirillum lipoferum és A. brasilense oltóanyagtörzsek túlélőképessége nem sterilizált (A) és steril (B) komposzt vivőanyagban a háromheti tárolási idő alatt
Azospirillum-törzsek túlélőképessége humusztrágyában A 2. ábra alapján megállapíthatjuk, hogy az 1. hét végére némi sejtszámgyarapodás történt, de ez nem szignifikáns a kiindulási állapothoz viszonyítva. A 2. héten erőteljes sejtpusztulás következett be, mely folyamat a 3. hét végére szignifikáns csökkenést idézett elő az 1. heti állapothoz viszonyítva (2A. ábra). A vizsgált közegek közül az A. lipoferum és A. brasilense törzsek pusztulási üteme a nem steril humusztrágyában volt a legerőteljesebb. Steril humusztrágyában az első héten 20–30%-os sejtszám-gyarapodást figyeltünk meg. A 2. és 3. héten néhány százalékos csökkenés következett, de
KÖDÖBÖCZ et al.
182
még a 3. hét végén detektált értékek is szignifikánsan nagyobbak voltak, mint a kiinduló sejtszám (2B. ábra). A két Azospirillum törzs pusztulási ütemét összehasonlítva megállapítható, hogy sem a humusztrágyában, sem a komposztban nem volt köztük kimutatható A Túlélési arány (%)
110 105 100 A. lipoferum A. brasilense Átlag
95 90
B
Túlélési arány (%)
140 130 120 A. lipoferum A. brasilense Átlag
110 100 90 0
1.
2.
3.
Idő (hetek)
2. ábra Az Azospirillum lipoferum és A. brasilense oltóanyagtörzsek túlélőképessége nem steril (A) és steril (B) humusztrágyában a háromheti tárolási idő alatt
szignifikáns különbség, annak ellenére, hogy két külön fajba (Azosprillum brasilense, Azospirillum lipoferum) tartoznak. A vizsgált Azospirillum törzsek pusztulási dinamikájára nagyobb hatást gyakorolt a komposzt, illetve humusztrágya steril, illetve nem steril volta, mint az előállítási körülmények (aerob, mikroaerofil). A nem steril közegekben a kezdeti sejtszám-gyarapodás ellenére a vizsgálati periódus végére a csíraszám a kiindulási szint alá csökkent, bár e különbség egyik esetben sem volt szignifikáns (1A. és 2A. ábrák). A kezdeti gyarapodást követő sejtpusztulás üteme a steril közegekben lassúbb volt és egyik vivőanyagban sem csökkent a kiindulási szintre, vagy az alá (1B. és 2B. ábrák).
Asszociatív nitrogénkötő baktériumok túlélése vivőanyagokban
183
Hasonló eredményre jutottunk a lucernamag vagy talaj kezelésére alkalmazott Sinorhizobium meliloti oltótörzsekkel végzett korábbi kísérleteinkkel is (KÖDÖBÖCZ et al., 2003) a steril és a nem steril vivőanyagokban való túlélés tesztelésekor. A nagy szervesanyag-tartalmú vivőanyagok alkalmazása mellett szól számos más eredmény is. Így többek között FALLIK és OKON (1996) több lehetséges vivőanyagban (tőzeg, vermikulit, bazalt granulátum, ill. bentonit granulátum) vizsgálva az Azospirillum brasilense törzs túlélőképességét azt tapasztalták, hogy az A. brasilense legjobb túlélő sejtszámát a tőzeg-alapú vivőanyagok biztosították. A 108 g-1 baktériumot tartalmazó tőzeg oltóanyag hatására tenyészedényekben szignifikánsan nőtt a kukorica (Zea mays) cső- és szemmérete is. Az oltótörzsekkel szembeni antagonizmus alakulása Megvizsgáltuk az aerob úton előállított szennyvíziszap komposzt és a szőlőtörköly-tartalmú szerves humusztrágya mikrobiológiai és biotikus tulajdonságait. A nem steril vivőanyagokban ugyanis az oltóanyagtörzsek túlélőképességét a konkurens mikroorganizmusok is befolyásolhatják. Az antagonizmus mértékét kitenyészthető, izolált mikroorganizmusokkal laboratóriumi in vitro körülmények között ellenőriztük. A 3. ábrán a kétféle vivőanyagból izolált 10–10 sugárgomba- és penészgomba törzs antagonista tulajdonságát tüntettük fel a tesztelt Azospirillum oltótörzsekkel szemben. A kioltási zóna nagysága szerint az antagonizmus mértéke szerint csoportosíthattuk a konkurens, izolált mikroorganizmusokat. Megállapítható volt, hogy a humusztrágyában az erősen antagonista képességű mikroorganizmusok (sugárgombák és penészek) aránya kisebb volt (kb. 50%) mint a komposztban (kb. 85%). Az antagonizmust nem mutató mikroorganizmusok részaránya is különbözött a kétféle közegben. A komposztban az Azospirillum baktériumokkal szemben antagonizmust nem mutató gombák és sugárgombák részaránya 33%-nak, a szerves humusztrágyában pedig 45%-nak adódott. Ezek az eredmények alátámasztják, illetve magyarázzák a tesztelt oltóanyagtörzsek jobb túlélőképességét a humusztrágyában. A korábbi eredményekkel összhangban (JANSEN & MCGILL, 1995; SZEGI, 1980) igazolódott, hogy a mikrobiális oltóanyagok túlélőképességére a közegek (talajok, vivőanyagok) mikrobiológiai, biotikus tulajdonságai is jelentős hatást gyakorolhatnak. A vivőanyagok kiválasztásánál ezért az oltóanyagtörzsekkel szembeni antagonizmus mértékére vonatkozó eredmények is figyelembe veendők (FAYEZ & DAW, 1990). A vizsgált két Azospirillum faj közötti taxonómiai különbség kimutathatóan nem befolyásolta azok komposztban, illetve humusztrágyában való túlélőképességét, a korábbi eredményeket alátámasztva (BIRÓ et al., 1992). Hasonló eredményre jutott JANSEN és MCGILL (1995) egy Azospirillum brasilense faj N-kötő kapacitását vizsgáló mikrokozmosz kísérletben. Eredményeik szerint a közös-
KÖDÖBÖCZ et al.
184 A
Sugárgombák Penészek
Kioltási zóna (mm)
0
12-0
18-12
22-18
0
5
10
15 20 25 30 35 Antagonisták aránya (%)
40
45
50
55
B Sugárgombák Penészek
Kioltási zóna (mm)
0
12-0
18-12
22-18
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Antagonisták aránya (%)
3. ábra A komposztból (A) és humusztrágyából (B) izolált 10–10 sugárgomba és mikroszkopikus gomba izolátum antagonizmusának mértéke Azospirillum lipoferum és A. brasilense oltóanyagtörzsekkel szemben
ségi szintű kölcsönhatások erőteljesebben hatnak egy adott mikroba N-kötő képességére, mint ahogy azt a genetikai adottságuk meghatározná. Ennek ellentmondanak JAUHRI és PHILIP (1984) adatai, amelyek szerint a szabadon élő N-kötő baktériumok túlélőképessége jobbnak bizonyult a mutánséhoz viszonyítva. A törzsek gyökérkolonizációs képességében azonban már nem volt szignifikáns különbség. KÖDÖBÖCZ és munkatársai (2003) Synorhizobium meliloti törzsek vad és mutáns változatainak túlélőképességének eltérő dinamikáját mutatták be. Annak ellenére, hogy az Azospirillum baktériumok két különböző fajcsoportot képviseltek, kisebb különbség adódott túlélőképességük mértékében, mint az egyazon fajhoz tartozó lucerna oltótörzsek között.
Asszociatív nitrogénkötő baktériumok túlélése vivőanyagokban
185
Összefoglalás Egy-egy, antibiotikum rezisztenciával jelölt Azospirillum brasilense és Azospirillum lipoferum faj túlélőképességét vizsgáltuk laboratóriumi körülmények között steril és nem steril komposztban és humusztrágyában, mint lehetséges vivőanyagokban a mikrobiális oltások során. A jelölt fajreprezentánsok csíraszámának meghatározásához az általunk módosított határhígításos módszert és antibiotikum-tartalmú szelektív Okon agarlemezeket (OKON et al., 1977) alkalmaztunk. A pusztulás vagy szaporodás mértékét a kiindulási csíraszám %-ában fejeztük ki. Az oltóanyagok vivőanyagaként alkalmazott kétféle közegből sugárgomba és mikroszkopikus gomba törzseket izoláltunk. Az Azospirillum baktériumokkal szemben megnyilvánuló antagonizmust agarkorong módszerrel ellenőriztük és a kioltási zóna nagysága szerint kategorizáltuk. Megállapítottuk, hogy a két oltóanyag fajreprezentáns túlélőképessége között egyik vizsgált közegben sem volt szignifikáns eltérés. A vivőanyagokban való megmaradó-képesség ezért feltehetően nem faji, hanem egyedi, törzsi tulajdonság lehet, ami a környezeti körülményekhez való alkalmazkodóképesség mértéke szerint nyilvánul meg. Az alkalmazott vivőanyag ezért jelentős mértékben befolyásolta a bevitt mikroorganizmusok sejtszámának alakulását. Ilyen szempontból az anaerob úton előállított, szőlőtörköly-alapú humusztrágya mindkét Azospirillum faj túléléséhez kedvezőbb körülményeket biztosított. A steril közegekben az Azospirillum baktériumok kezdeti sejtszám-gyarapodása is tartósabbnak bizonyult, a 3-heti vizsgálati periódus végére sem csökkent a kiindulási érték alá az eredeti, nem steril változatokkal való összehasonlításban. A nem steril vivőanyagok között a humusztrágyából izolált sugárgomba és mikroszkopikus gomba törzsek antagonista hatása kisebb volt, mint az aerob előállítású, szennyvíziszap-tartalmú komposztból származó izolátumoké. Eredményeink bizonyították, hogy a korábbi gyakorlat szerint alkalmazott tőzeges vivőanyagok jól helyettesíthetők alternatív hordozóanyagokkal. Vizsgálataink szerint a mezőgazdasági és kommunális hulladékok, mint nagy szervesanyag-tartalmú közegek, tulajdonságaik által meghatározott módon az asszociatív nitrogénkötő baktériumokkal megfelelően társíthatók. A kutatásokat az OTKA (T 046610), az NKFP és a GVOP Programok (4/015/2001; 311/0127/2004), valamint az EU-Kp-6 Horizontal-HYG projektjei támogatják. Kulcsszavak: Azospirillum, komposzt, humusztrágya, túlélőképesség, antagonizmus
KÖDÖBÖCZ et al.
186
Irodalom ANGERER, I. P. et al., 1998. Indicator microbes of chlorsulfuron addition detected by a simplified soil dilution method. Agrokémia és Talajtan. 47. 297–305. BIRÓ B., 1992a. N2-kötő, növényi növekedést serkentő Azospirillumok. Agrokémia és Talajtan. 41. 139–145. BIRÓ B., 1992b. Az Azospirillum növényoltás lehetőségei. Agrokémia és Talajtan. 41. 390–399. BIRÓ B., 2002. A mikrobiális oltóanyagok alkalmazásának lehetőségei a mezőgazdaságban és a környezetvédelemben. Mag, Kutatás, Termesztés, Kereskedelem. 1. 29–30. BIRÓ B. & PACSUTA J., 2002. Újgenerációs szemlélet és lehetőségek a talajbiológiai aktivitás és a talajtermékenység irányított fokozására. Gyakorlati Agrofórum. 13. 72–74. BIRÓ, B., SZILI-KOVÁCS, T. & SZEGI, J., 1992. Some characteristics of N2-fixing Azospirillum strains isolated from maize and wheat roots. Acta Microbiol. Hung. 39. 359–360. BIRÓ, B. et al., 1993. Effect of fertilizer on spontaneous Rhizobium infection in Hungarian soils. Agrokémia és Talajtan. 42. 207–212. DÖBEREINER, J. & BALDANI, V. L. D., 1979. Selective infection of maize roots by streptomycin-resistant Azospirillum lipoferum and other bacteria. Can. J. Microbiol. 25. 1264–1269. DUMONTET, S., DINEL, H. & BALODA, S. B., 1999. Pathogen reduction in sewage sludge by composting and other biological treatments – a review. Biol. Agric. Hortic. 16. 409–430. FALLIK, E. & OKON, Y., 1996. Inoculants of Azospirillum brasilense: biomass production, survival and growth promotion of Setaria italica and Zea mays. Soil Biol. Biochem. 28. 123–126. FAYEZ, M. & DAW, Z. Y., 1990. Growth and acetylene reducing activity of Azospirillum as affected by interaction with soil streptomyceta, penicillia and fusaria. Soil Biol. Biochem. 22. 1143–1149. GAIND, S. & GAUR, A. C., 1990. Shelf life of phosphate solubilizing inoculants as influenced by type of carrier, high temperature and low moisture. Can. J. Microbiol. 36. 846–849. GAIND, S. & GAUR, A. C., 2002. Impact of fly ash and phosphate solubilizing bacteria on soybean productivity. Bioresouce Technol. 85. 313–315. JANSEN, R. A. & MCGILL, W. B., 1995. Community-level interactions control proliferation of Azospirillum brasilense Cd in microcosms. Soil Biol. Biochem. 27. 189–196. JAUHRI, K. S. & PHILIP, K., 1984. Pressmud, a potential carrier for Rhizobium and Azotobacter. Zbl. Microbiol. 139. 97–107. KÁRPÁTI, É. et al., 1999. Interaction of Azospirillum lipoferum with wheat germ agglutinin stimulates nitrogen fixation. J. Bacteriol. 181. 3949–3955. KÖDÖBÖCZ L. et al., 2003. Rhizobium törzsek túlélőképessége különböző vivőanyagokban. Agrokémia és Talajtan. 52. 395–408. MARKÓ B., 1998. Kommunális és ipari hulladékok (aerob és anaerob) kezelése. Környezetvédelmi Füzetek, 1998/17. OMIKK. Budapest
Asszociatív nitrogénkötő baktériumok túlélése vivőanyagokban
187
OKON, Y., ALBRECHT, S. L. & BURRIS, R. H., 1977. Methods for growing Spirillum lipoferum and for counting it in pure culture and in association with plants. Appl. Environ. Microbiol. 45. 85–88. PATEL, J. J. & BROWN, M. E., 1969. Interactions of Azotobacter with rhizosphere and root surface microflora. Plant and Soil. 31. 273–281. SASTRE, I., VICENTE, M. A. & LOBO, M. C., 1996. Influence of the application of sewage sludges on soil microbial activity. Biores. Technol. 57. 19–23. SOBERON, M. et al., 1989. Isolation of a Rhizobium phaseoli cytochrome mutant with enhanced respiration and symbiotic nitrogen fixation. J. Bacteriol. 171. 465–472. SOÓS T., MANNINGER E. & BAKONDI Z. É., 1976. A rhizobiumos oltóanyag előállításához használatos tőzeg vivőanyag, valamint a tőzeghez adott ammonium molibdenát és bórsav hatása a lucernára tenyészedény- és szabadföldi kísérletben. Növénytermelés. 25. 17–22. SZEGI J., 1967. Nitrogénkötő mikroorganizmusok jelentősége a talaj termékenysége szempontjából. Agrokémia és Talajtan. 16. 477–486. SZEGI J., 1980. Antibiotikus anyagok hatasa az Azotobacter nitrogénkötésben résztvevő enzimrendszerre. Agrokemia és Talajtan. 29. 227–236. SZILI-KOVÁCS T., 1985. A szennyvíziszap-elhelyezés talaj-mikrobiológiai problémái. Agrokémia és Talajtan. 34. 486–493. VIVEGANANDAN, G. & JAUHRI, K. S., 2000. Growth and survival of phosphate solubilizing bacteria in calcium alginate. Microbiol. Res. 155. 205–207. VIVEGANANDAN, G. & JAUHRI, K. S., 2002. Efficacy of rock phosphate based soil implant formulation of phosphobacteria in soybean (Glycine max Merrill). Indian J. Biotechnol. 1. 180–187. Érkezett: 2005. március 7.
KÖDÖBÖCZ et al.
188
Factors Influencing the Survival of Associative Nitrogen-fixing Inoculant Strains in Two Potential Carriers 1,2
L. KÖDÖBÖCZ, 3É. KÁRPÁTI, 4I. DUSHA and 5B. BIRÓ
1
Ph.D School of Agricultural and Environmental Microbiology and Biotechnology, Szent István University, Gödöllő, 2BIOdeTECHt Ltd., Érd, 3Agricultural Biotechnological Research Center, Gödöllő, 4Biological Centre of the Hungarian Academy of Sciences, Szeged, 5Research Institute for Soil Science and Agricultural Chemistry of the Hungarian Academy of Sciences, Budapest
S um ma ry The survival of two bacterium species, Azospirillum brasilense and Azospirillum lipoferum, both labelled with antibiotic resistance, was tested under laboratory conditions in sterile and non-sterile substrates (composted communal sewage sludge and an anaerobically digested waste from the wine-preparation process), as potential carriers for microbial inoculation. A modified form of the limit dilution method was used to determine the number of colony-forming units (CFU ml-1) of the two species on selective Okon plates (OKON et al., 1977) containing antibiotics. The extent of mortality or multiplication was expressed as a percentage of the initial germ number. Actinomycetes and moulds were isolated from both carriers. Antagonism towards the Azospirillum bacteria was investigated using the agar disc method and classified based on the magnitude of the clear zone. There were no significant differences between the survival rates of the two species on either substrates, suggesting that survival could be a characteristic of individual lines, rather than of species, being manifested as a function of adaptability to the given environmental conditions. Nevertheless, the carriers had a substantial influence on the number of colony-forming units. In this respect the grape-based humus manure provided better conditions for both the Azospirillum species. The initial increase in the number of colony-forming units of Azospirillum bacteria proved more durable on sterile substrates, not dropping below the initial value even at the end of the 3-week experimental period compared with the original, non-sterile variants. Among the non-sterile carriers, the antagonistic effect of actinomycetes and moulds isolated from humus manure was smaller than that of isolates originating from sewage sludge compost produced under aerobic conditions. The results proved that the peat carriers previously used in practice could be replaced by alternative carriers. The properties of agricultural and communal waste materials with high organic matter contents allow them to be used in conjunction with associative N-fixing bacteria. Fig. 1. Survival of inoculant strains of Azospirillum lipoferum and A. brasilense in non-sterile (A) and sterile (B) compost carrier during the 3-week storage period. Fig. 2. Survival of inoculant strains of Azospirillum lipoferum and A. brasilense in non-sterile (A) and sterile (B) humus manure during the 3-week storage period. Fig. 3. Antagonism of 10 isolates each of actinomycetes and mould from compost (A) and humus manure (B) to inoculant strains of Azospirillum lipoferum and A. brasilense.
