Associatie tussen milieublootstelling en fertiliteit: een case-control studie bij subfertiele mannen en een interim analyse bij subfertiele vrouwen

Verspreiding: Algemeen

Eindrapport

Associatie tussen milieublootstelling en fertiliteit: een case-control studie bij subfertiele mannen en een interim analyse bij subfertiele vrouwen. denhonde

Elly Den Hond1, Willy Baeyens2, Bianca Cox3, Petra De Sutter4, Thomas D’Hooghe5, Jean-Marc Kaufman6, Tim Nawrot3,7, Willem Ombelet8, Herman Tournaye9, Axel Vandendael8, Nik Van Larebeke10 1

Milieurisico- en gezondheid; VITO; Mol Vakgroep Analytische en Milieuchemie (ANCH); VUB; Brussel 3 Centrum voor Milieukunde; UHasselt; Diepenbeek 4 Afdeling Reproductieve Geneeskunde, Vrouwenkliniek; UZGent; Gent 5 Leuvens Universitair Fertiliteitscentrum; KULeuven; Leuven 6 e Laboratorium andrologie; UGent; Gent 7 Maatschappelijke Gezondheidszorg; KULeuven; Leuven 8 Gynaecologie, verloskunde, fertiliteit; ZOL; Genk 9 Centrum voor Reproductieve Geneeskunde; VUB; Brussel 10 Vakgroep Radiotherapie en kerngeneeskunde; UGent; Gent 2

e

Studie uitgevoerd in opdracht van het Steunpunt Milieu en Gezondheid, 2 generatie (2007-2011) 31 oktober 2012

Alle rechten, waaronder het auteursrecht, op de informatie vermeld in dit document berusten bij de Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek NV (“VITO”), Boeretang 200, BE-2400 Mol, RPR Turnhout BTW BE 0244.195.916. De informatie zoals verstrekt in dit document is vertrouwelijke informatie van VITO. Zonder de voorafgaande schriftelijke toestemming van VITO mag dit document niet worden gereproduceerd of verspreid worden noch geheel of gedeeltelijk gebruikt worden voor het instellen van claims, voor het voeren van gerechtelijke procedures , voor reclame of antireclame en ten behoeve van werving in meer algemene zin aangewend worden

Verspreidingslijst

VERSPREIDINGSLIJST Rapport publiek beschikbaar

I

Samenvatting

SAMENVATTING

Kadering van het onderzoeksproject Dit rapport beschrijft de resultaten van 2 parallelle case-control studies die werden uitgevoerd als onderzoeksproject binnen het Steunpunt Milieu en Gezondheid 2007-2011 door vier Vlaamse fertiliteitscentra – het Leuvens Universitair Fertiliteitscentrum (LUFC); de afdeling gynaecologie, verloskunde & fertiliteit van het Ziekenhuis Oost-Limburg (ZOL); het centrum voor reproductieve geneeskunde van het UZ Brussel en de vrouwenkliniek van het UZ Gent – in samenwerking met de Vlaamse Instelling voor Technologisch Onderzoek (VITO), de Universiteit Hasselt, de Vrije Universiteit Brussel (VUB) en de Universiteit Gent. Het onderzoek dat wordt uitgevoerd door het Steunpunt Milieu en Gezondheid is een initiatief van de Vlaamse Regering. De Vlaamse ministers bevoegd voor Volksgezondheid en Leefmilieu, de afdeling Toezicht Volksgezondheid van het Vlaams Agentschap Zorg en Gezondheid, de dienst Milieu en Gezondheid van het departement Leefmilieu, Natuur en Energie en de administratie Wetenschapsbeleid volgen de werkzaamheden van het Steunpunt op.

Mannelijke case-control studie Doelstelling. Het doel van de mannelijke case-control studie was om na te gaan of verhoogde blootstelling aan endocrien verstorende stoffen zoals PCB’s, gechloreerde pesticiden, dioxineachtige stoffen, gebromeerde vlamvertragers, zware metalen, ftalaten, perfluorderivaten, bisfenol A of triclosan geassocieerd was met een verhoogd voorkomen van mannelijke subfertiliteit. Methode. Subfertiliteit werd gedefinieerd als een gestoorde spermakwaliteit op basis van Total Motile Count (TMC), nl. een TMC van minder dan 20 miljoen/ml op basis van één of twee spermaanalyses. Blootstelling aan polluenten werd gemeten door middel van biomerkers van blootstelling in bloed en urine (humane biomonitoring). Met behulp van regressie analyses werd bestudeerd of verhoogde waarden van de biomerkers van blootstelling geassocieerd waren met een toegenomen risico op subfertiliteit (logistische regressie), en met veranderingen in de spermakwaliteit (concentratie, motiliteit, morfologie) en serumconcentratie van geslachtshormonen (lineaire regressie). Resultaten: inclusie van cases en controles. In totaal werden 163 patiënten gerekruteerd die voldeden aan de inclusiecriteria, nl. een leeftijd jonger dan 50 jaar, een body-mass index van 35 kg/m² of lager, geen congenitale, genetische of verworven oorzaak van subfertiliteit en een ondertekend toestemmingsformulier (‘informed consent’). De totale studiepopulatie bestond uit 77 cases en 86 controles, gedefinieerd op basis van de resultaten van minstens één (n=21) en bij voorkeur twee (n=142) sperma-analyses, genomen met minstens 1 week tussentijd. Daarnaast werd een subpopulatie gedefinieerd, nl. de groep met twee consistente sperma-analyses. Deze bestond uit 40 cases (2 spermastalen met TMC < 20 miljoen/ml) en 80 controles (2 spermastalen met TMC ≥ 20 miljoen/ml) Resultaten: beschrijving studiepopulatie. Er waren geen significante verschillen tussen cases en controles voor leeftijd (geometrisch gemiddelde (GM): 31,9 vs. 33,5 jaar; p=0,06), body-mass index (GM: 25,5 vs. 24,5 kg/m²; p=0,07), roken (24% rokers, 21% ex-rokers en 55% niet-rokers vs. 19% rokers, 31% ex-rokers en 50% niet-rokers; p=0,36) en andere basiskarakteristieken zoals opleidingsniveau, gewichtsverandering, blootstelling aan passief roken, verkeersblootstelling, consumptie van lokale voeding. Cases rapporteerden een signficant lagere alcoholconsumptie (1,4% vs. 11,8% dagelijkse consumptie; p=0,03); cases gebruikten meer frequent cholesterolverlagende medicatie (5,6% vs. 0,0%; p=0,04); en cases deden frequenter aan zware fysieke activiteit (GM: 0,92 vs. 0,18 uren/dag; p=0,03). Het urinair creatininegehalte (maat voor verdunningsgraad van urinestalen) en het bloedvetgehalte (matrix waarin persistente,

II

Samenvatting

vetoplosbare stoffen worden gemeten) waren niet significant verschillend tussen cases en controles. Resultaten: endocrien verstorende stoffen en subfertiliteit. Binnen de groep met twee consistente sperma-analyses was blootstelling aan oxychlordaan geassocieerd met een hoger risico op subfertiliteit. Het geometrisch gemiddelde (P25 – P75) van oxychlordaan in serum bedroeg 16,8 (12,0 – 26,0) ng/l. Na correctie voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en bloedvet was de odds ratio voor subfertiliteit bij een stijging van de serum concentratie van oxychlordaan met één interkwartiel range (IQR) gelijk aan 1,98 (95% BI: 1,07-3,69; p=0,03). Voor twee andere gechloreerde pesticiden, nl. trans-nonachloor en HCB, was er een borderline nietsignificant effect. De gemiddelde (P25-P75) blootstelling was 10,7 (5,0 – 19,0) ng/l voor transnonachlor en 46,8 (34,0 – 71,0) ng/l voor HCB; de odds ratios bij stijging van 1 IQR waren respectievelijk 2,87 (95% BI: 0,94-8,73; p=0,06) en 1,67 (95% BI: 0,88-3,18; p=0,12). Indien de blootstelling aan de gechloreerde pesticiden in verband werd gebracht met de afzonderlijke spermaparameters werd een sigificante relatie gedectecteerd met sperma concentratie en sperma motiliteit. Een stijging van serum oxychlordaan met 50% (bijv. van 17 ng/l naar 25 ng/l) was geassocieerd met een daling van de spermaconcentratie met 33% (p=0,02) en een daling van de motiliteit met 5% (p=0,047); een stijging van de serum concentratie van HCB met 50% (bijv. van 43 ng/l naar 64 ng/l) was geassocieerd met een vermindering van de spermaconcentratie met 28% (p=0,008). Blootstelling aan gebromeerde vlamvertragers was geassocieerd met een hoger risico op subfertiliteit. In de totale groep had 8,1% van de deelnemers een detecteerbare waarde van BDE209 in het serum (waarde > kwantificatielimiet van 40 ng/l). Een detecteerbare waarde van BDE209 in serum was geassocieerd met een odds ratio van 7,22 (95% BI: 1,03-50,6; p=0,047) op subfertiliteit, en dit na correctie voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en bloedvet. Indien de serum concentratie van de gebromeerde vlamvertragers werd bestudeerd in relatie met de verschillende sperma parameters, werd een detecteerbare waarde van BDE209 (>40 ng/l) geassocieerd met 35% daling van de motiliteit (p=0,02). Resultaten: endocrien verstorende stoffen en geslachtshormonen. In de totale groep van 163 patiënten waren de urinaire concentraties van ftalaatmetabolieten (MEHP, MiBP) en triclosan negatief geassocieerd met de serum concentratie van inhibine B en positief met LH concentraties. De geobserveerde resultaten zouden kunnen wijzen op een toxisch effect van deze polluenten op de Sertoli cellen (inhibine B productie) en op de Leydig cellen (verminderde testosteron productie, en via een negatief feedback systeem verhoging van LH gehaltes). Zowel voor ftalaten als voor triclosan is hiervoor evidentie uit proefdier- of in vitro onderzoek in de literatuur. Voorzichtigheid is echter geboden omdat de resultaten niet gepaard gaan met veranderde testosteron concentraties, of veranderingen in spermakwaliteit. Interpretatie. Het gebruik van de gechloreerde pesticiden, zoals oxychlordaan, trans-nonachlor en HCB, is momenteel verboden, maar wegens hun massaal gebruik in het verleden en het persistente karakter zijn deze polluenten nog in meetbare concentraties aanwezig in het leefmilieu, de voedselketen en het menselijk lichaam. Gebromeerde vlamvertragers zijn ‘nieuwere’ stoffen in ons milieu, maar zijn eveneens gekend als persistente stoffen die zich opstapelen in de voedselketen en in het menselijke lichaam. Al deze persistente stoffen zijn gekend als hormoonverstoorders of endocriene disrupters. De serum concentraties weerspiegelen geaccumuleerde blootstelling. Een mogelijke hypothese is dat de huidige concentratie een maat is voor de blootstelling uit het verleden, en dat de endocriene verstoring is terug te brengen tot verstoring van de spermatogenese in de gevoelige perioden van het leven, nl. bij jong volwassenen, tijdens de puberteit, of zelfs tijdens de perinatale periode. Uit proefdieronderzoek en uit epidemiologische studies blijkt inderdaad dat serum concentraties van gechloreerde pesticiden en van gebromeerde vlamvertragers geassocieerd worden met het testiculaire dysgenese syndroom (TDS), een aantal aandoeningen zoals cryptorchidie, testiskanker en verstoring van de fertiliteit die hun oorspong III

Samenvatting

vinden in prenatale blootstelling aan endocrien verstorende stoffen. De bevindingen in deze studie zijn dus in overeenstemming met de hypothese en met de internationale literatuur.

Vrouwelijke case-control studie Doelstelling. Het doel van de vrouwelijke case-control studie was om na te gaan of verhoogde blootstelling aan endocrien verstorende stoffen zoals PCB’s, gechloreerde pesticiden, gebromeerde vlamvertragers of zware metalen geassocieerd was met een verhoogd voorkomen van vrouwelijke subfertiliteit. Methode. Subfertiliteit werd gedefinieerd als een onverklaarde subfertiliteit gedurende meer dan 12 maanden. Blootstelling aan polluenten werd gemeten door middel van biomerkers van blootstelling in bloed en urine (humane biomonitoring). Met behulp van logistische regressie analyses werd bestudeerd of verhoogde waarden van de biomerkers van blootstelling geassocieerd waren met een toegenomen risico op subfertiliteit. Resultaten. In totaal werden 47 patiënten gerekruteerd die voldeden aan de inclusiecriteria, nl. een leeftijd jonger dan 40 jaar, een body-mass index van 35 kg/m² of lager, normaal klinisch onderzoek en een ondertekend toestemmingsformulier (‘informed consent’). De studiepopulatie bestond uit 8 cases en 28 controles, gedefinieerd op basis van onverklaarde subfertiliteit (> 12 maanden) in de cases en bewezen zwangerschap in de controles. Bij 11 deelnemers kon de toewijzing tot case of controle nog niet gebeuren op basis van de beschikbare klinische informatie. Omwille van de moeilijke definitie en lange wachttijd voor het confirmeren van de case/control, was het zeer moeilijk om binnen de voorziene studietijd voldoende patiënten te rekruteren. Daarom werd beslist tot een interim analyse van de gegevens. Voor de gebromeerde vlamvertragers waar gewerkt wordt met de detectiefrequentie (
Algemene conclusies en beleidsrelevantie Deze studie toont aan dat blootstelling aan milieuvervuilende stoffen, zowel van historische polluenten (gechloreerde pesticiden) als van nieuwere polluenten (gebromeerde vlamvertragers) geassocieerd is met subfertiliteit bij mannen. De resultaten bevestigen dat beleidsacties uit het verleden, nl. het verbieden van gechloreerde pesticiden in de jaren ’80 en ’90, noodzakelijke acties waren om de volksgezondheidheid te beschermen. Ze tonen echter ook aan dat het relevant blijft om verdere maatregelen te nemen, hetzij via regelgeving, hetzij via sensibilisatie, om de niveau’s van historische polluenten én van nieuwe polluenten verder te doen dalen. Verder blijft het belangrijk om monitoringstudies uit te voeren, zowel in het milieu als in de mens, om de niveau’s op te volgen in de tijd. Op die manier is het mogelijk om de relatie met gezondheidseffecten verder te bestuderen, en tevens laten nieuwe blootstellingsgegevens toe om beleidsmaatregelen te evalueren om ze zo nodig aan te passen .

IV

Samenvatting

De huidige studie toont aan dat blootstelling aan gechloreerde en gebromeerde persistente polluenten een rol speelt in het ontwikkelen van subfertiliteit. Aangezien de relatie enkel werd geobserveerd voor persistente polluenten die historische blootstelling weerspiegelen, en aangezien er op basis van de literatuur argumenten zijn dat vooral prenatale bloostelling aan persistente endocrien verstorende stoffen een invloed hebben op de mannelijke fertiliteit, rijst de vraag of de effecten die in deze studie worden gevonden zijn toe te schrijven aan prenatale blootstelling. Om deze vraag te beantwoorden zijn andere types van studie nodig, bij voorkeur prospectieve geboortecohortes waarbij de prenatale blootstelling in verband gebracht wordt met gezondheidseffecten op latere leeftijd. De rol van de overheid en beleidsmakers zou kunnen bestaan in het faciliteren en financieren van geboortecohortes, een rol opnemen als betrouwbare partner voor de opbouw van een biobank, en de uitbouw van een efficiënt registratiesysteem van ziekte- en gezondheidsgegevens die toelaten om op een correcte, eenvoudige en efficiënte manier risicofactoren zoals milieublootstelling te koppelen aan ziekte en gezondheid.

V

Inhoud

INHOUD HOOFDSTUK 1.

Inleiding _______________________________________________________ 1

HOOFDSTUK 2.

Mannelijke case-control studie: Methode ____________________________ 3

2.1. Rekrutering 2.1.1. Inclusiecriteria ______________________________________________________ 2.1.2. Selectie van cases ____________________________________________________ 2.1.3. Selectie van controles _________________________________________________

3 3 4 4

2.2.

Studieverloop

5

2.3.

Sperma analyse

6

2.4. Hormoon analyses in serum 2.4.1. Bepaling van totaal testosteron en vrij testosteron __________________________ 2.4.2. Bepaling van totaal oestradiol en vrij oestradiol ____________________________ 2.4.3. Bepaling van SHBG ___________________________________________________ 2.4.4. Bepaling van LH _____________________________________________________ 2.4.5. Bepaling van FSH ____________________________________________________ 2.4.6. Inhibine B __________________________________________________________

7 7 7 7 8 8 8

2.5. Toxicologische metingen 9 2.5.1. Zware metalen ______________________________________________________ 9 2.5.2. Persistente gechloreerde en gebromeerde verbindingen ____________________ 10 2.5.3. Ftalaat metabolieten in urine __________________________________________ 11 2.5.4. Bisfenol A in urine___________________________________________________ 12 2.5.5. Triclosan in urine ___________________________________________________ 12 2.5.6. Perfluorderivaten in serum ___________________________________________ 13 2.6.

Statistische analyse

HOOFDSTUK 3.

13

Mannelijke case-control studie: resultaten __________________________ 14

3.1. Studiepopulatie in mannelijke case-control studie 14 3.1.1. Inclusie van controles en cases_________________________________________ 14 3.1.2. Beschrijving van controles en cases _____________________________________ 15 3.2. Blootstelling: controles vs. cases 18 3.2.1. Vergelijking van gemiddelde concentratie van polluenten tussen mannelijke cases en controles 18 3.2.2. Relatie tussen blootstelling en kans op subfertiliteit in mannelijke case-control studie 21 3.2.3. Relatie tussen blootstellingmerkers en sperma-analyses in mannelijke case-control studie 27 3.2.4. Relatie tussen blootstellingsmerkers en geslachtshormonen in mannelijke casecontrol studie ______________________________________________________________ 32 HOOFDSTUK 4.

Mannelijke case-control studie: discussie ___________________________ 37

HOOFDSTUK 5.

Vrouwelijke case-control studie: interim analyse _____________________ 44

5.1. Methode 44 5.1.1. Rekrutering ________________________________________________________ 44

VI

Inhoud

5.1.2. 5.1.3. 5.1.4.

Studieverloop ______________________________________________________ 46 Toxicologische metingen ______________________________________________ 47 Statistische analyse __________________________________________________ 48

5.2. Resultaten 48 5.2.1. Inclusie van vrouwelijke controles en cases _______________________________ 48 5.2.2. Beschrijving van vrouwelijke controles en cases ___________________________ 49 5.2.3. Vergelijking van gemiddelde concentratie van polluenten tussen vrouwelijke cases en controls ________________________________________________________________ 51 5.2.4. Relatie tussen blootstelling en kans op subfertiliteit in vrouwelijke case-control studie 51 5.3.

Discussie en besluit

HOOFDSTUK 6.

53

Besluit en beleidsaanbevelingen ___________________________________ 55

VII

Lijst van tabellen

LIJST VAN TABELLEN Tabel 1: Indeling van mannelijke controles en cases op basis van resultaat sperma-analyse _____ 14 Tabel 2: Karakterisiteken van mannelijke controles en cases _____________________________ 16 Tabel 3: Beschrijving sperma-analyse bij mannelijke controles en cases ____________________ 17 Tabel 4: Beschrijving hormoonconcentraties bij mannelijke controles en cases_______________ 18 Tabel 5: Blootstelling aan polluenten: vergelijking van mannelijke controles en cases _________ 20 Tabel 6: Definitie van mannelijke controles en cases voor logistische regressie analyse ________ 21 Tabel 7: Relaties tussen blootstellingsmerkers en spermaparameters in mannelijke case-control studie ____________________________________________________________________ 30 Tabel 8: Relaties tussen blootstellingsmerkers en geslachtshormonen in mannelijke case-control studie: estimates (β-coefficiënt), standard error (se) en p-waarde uit multiple regressie analyses __________________________________________________________________ 33 Tabel 9: Significante relaties tussen blootstellingsmerkers en hormoonconcentraties bij totale groep (mannelijke cases en controles): verandering in homoonconcentratie bij een stijging van blootstellingsmerker met 50% (* factor 1,50) _____________________________________ 35 Tabel 10: Blootstellingsmerkers in mannelijke controles en cases in vergelijking met Vlaamse referentiewaarden __________________________________________________________ 38 Tabel 11: Karakterisiteken van vrouwelijke controles en cases ____________________________ 50 Tabel 12: Blootstelling aan polluenten: vergelijking van vrouwelijke controles en cases ________ 52 Tabel 13: Risico op subfertiliteit bij toename van de blootstelling met 1 interkwartiel range (IQR, van 25e naar 75e percentiel) in vrouwelijke case-control studie _______________________ 53

VIII

Lijst van figuren

LIJST VAN FIGUREN Figuur 1: Schematisch overzicht van rekrutering in mannelijke case-control studie _____________ 3 Figuur 2: Schematisch overzicht van studieverloop van mannelijke case-control studie _________ 5 Figuur 3: Verdeling van mannelijke controles en cases over de vier fertiliteitscentra ___________ 15 Figuur 4: Risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie zware metalen in bloed of urine met 1 interkwartiel range (IQR) ____________________________________________ 22 Figuur 5: Risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie van gechloreerde persistente stoffen in het serum met 1 interkwartiel range (IQR) ______________________ 23 Figuur 6: Risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie serum PCB’s met 1 interkwartiel range (IQR)______________________________________________________ 24 Figuur 7: Risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie aan gebromeerde vlamvertragers (PBDE’s en HBCD) in serum met 1 interkwartiel range (IQR) _____________ 25 Figuur 8: Risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie ftalaatmetabolieten in urine met 1 interkwartiel range (IQR) ____________________________________________ 26 Figuur 9: Risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie bisfenol A in urine, triclosan in urine of PFOS/PFOA in serum met 1 interkwartiel range (IQR) _______________ 27 Figuur 10: Vergelijking tussen morfologie meting in 3 individuele centra (Brussel, Gent, Leuven) en in referentiecentrum (ZOL). ___________________________________________________ 28 Figuur 11: Schematisch overzicht van rekrutering van de vrouwelijke case-control studie ______ 44 Figuur 12: Schematisch overzicht van studieverloop van de vrouwelijke case-control studie ____ 46 Figuur 13: Verdeling van vrouwelijke controles en cases over de vier fertiliteitscentra _________ 48

IX

Lijst van afkortingen

LIJST VAN AFKORTINGEN 5-OH-MEHP 5-oxo-MEHP AMAP BDE BMI BI BPA Cd Cu DEHP dl-PCB’s E2 ELISA EQAS FSH G-EQUAS GM HCB HPLC HR-ICP-MS IC IRMA LH LOD LOQ MBP MBzP MEHP MEP MiBP Mn MS Pb PCB PCDD/PCDF’s PFOA PFOS POP’s p,p’-DDE SHBG SPE TCS TDS TMC WHO

X

mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl ftalaat mono-2-ethyl-5-oxohexyl ftalaat Arctic Monitoring and Assessment Program gebromeerde difenyl ethers Body-Mass Index betrouwbaarheidsinterval bisfenol A cadmium koper di-2-ethylhexyl ftaaat dioxine-achtige PCB’s oestradiol Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay External Quality Assurance Services Follikel Stimulerend Hormoon German External QUality Assessment Scheme geometrisch gemiddelde hexachlorobenzeen High Pressure Liquid Chromatography High Resolution - Inductively Coupled Plasma - Mass Spectrometry Informed Consent ImmunoRadiometric Assay Luteïniserend Hormoon limit of detection limit of quantification monobutyl ftalaat monobenzyl ftalaat mono-2-ethylhexyl ftalaat mono-ethyl ftalaat mono-isobutyl ftalaat mangaan Mass Spectrometry lood polychlorinated biphenyls som van dioxines en furanen perfluoro-octaansulfonaat perfluoro-octaanzuur Persistente Organische Polluenten para, para’-dichlorodifenyl dichloroethyleen Sex-Hormone Binding Globulin Solid Phase Extraction triclosan Testicular Dysgenesis Syndrome Total Motile Count World Health Organisation

Lijst van afkortingen

XI

Lijst van symbolen

LIJST VAN SYMBOLEN dl I125 ml ng pg

XII

deciliter jodium 125 milliliter nanogram picogram

HOOFDSTUK 1. INLEIDING

In 1985 publiceerden Hull et al. (Hull et al. 1693-97) de resultaten van een epidemiologische studie bij 708 koppels in Engeland en concludeerden dat één op zes koppels ooit gespecialiseerde hulp nodig had omwille van fertiliteitsproblemen. Deze bevindingen werden bevestigd door twee prospectieve studies in Nederland, waarbij de cumulatieve incidentie voor subfertiliteit bij vrouwen tussen de 15 en 45 jaar oud werd geschat op 10,4% (Beurskens, Maas, and Evers 235-38) en 9,9% (Snick et al. 1582-88). Ook in recentere Britse reviews worden prevalenties van subfertiliteit gerapporteerd van 13% bij de eerste zwangerschap tot 17% bij de tweede zwangerschap in een groep van 25-44-jarige vrouwen (Greenhall and Vessey 978-83) en van 16% bij een groep van 40 tot 55-jarigen (Oakley, Doyle, and Maconochie 447-50). Algemeen wordt aangenomen dat de verminderde vruchtbaarheid in geïndustrialiseerde landen deels is toe te schrijven aan sociale en economische evoluties, zoals de toegenomen carrièremogelijkheden voor de vrouw, uitgestelde kinderwens, verminderde kinderwens (daling van ideale gezinsgrootte), minder stabiele relaties, enz… Daarnaast is er echter ook evidentie voor een toename van vruchtbaarheidsproblemen. In onze moderne maatschappij komen we - gewild of ongewild - meer en meer in contact met mengsels van chemische en natuurlijke producten met potentiële effecten op de gezondheid van de mens. Naast immunologische, genotoxische en neurologische effecten worden vaak endocriene effecten toegeschreven aan polluenten in onze omgeving. Begin jaren ’90 werd het begrip van de ‘endocriene verstoorders’ gelanceerd. Wetenschappers (Sharpe and Skakkebaek 1392-95;Toppari et al. 741-803) suggereerden dat polluenten met een oestrogene, anti-oestrogene of antiandrogene werking de natuurlijke hormonale balans verstoren. Prenatale blootstelling aan endocriene verstoorders werd in verband gebracht met het ‘Testicular Dysgenesis Syndrome’ (TDS), namelijk een verminderde sperma-kwaliteit, een toegenomen incidentie van testiskanker, cryptorchidie (niet-ingedaalde testis) en hypospadias. Biomonitoring is een techniek om humane blootstelling aan chemische stoffen uit de omgeving te meten (Calafat et al.;Metcalf and Orloff). Indien er polluenten worden gemeten bij de mens bijvoorbeeld in bloed, urine, haar, nagels, speeksel, moedermelk - spreken we van biomerkers van blootstelling. Indien deze blootstellingsmerkers gerelateerd worden aan specifieke gezondheidseffecten, kunnen dosis-effect relaties bestudeerd worden. In deze studie willen we de associatie onderzoeken tussen subfertiliteit en blootstelling aan endocriene verstoorders. Via een case-control design zal subfertiliteit gelinkt worden met blootstelling aan milieuvervuilende stoffen via ons dagelijks leven, zowel van polluenten die historisch in onze omgeving aanwezig zijn, als van ‘nieuwere’ contaminanten in onze omgeving. De historische polluenten zoals PCBs, dioxines, pesticiden en zware metalen hebben zich sinds decennia geaccumuleerd in onze omgeving en zijn momenteel nog steeds in relevante hoeveelheden aanwezig in het Vlaamse milieu (Koppen et al. 59-67;Staessen et al. 1660-69). De nieuwere polluenten zoals ftalaten, bisphenol A of perfluorcomponenten krijgen in de wetenschappelijke literatuur toenemende aandacht omdat ze massaal aanwezig zijn in zeer diverse producten zoals kleding, verpakkingsmateriaal, elektronisch materiaal, verzorgingsproducten, enz… Van al deze stoffen zijn hormoonverstorende eigenschappen bekend uit proefdieronderzoek en in vitro onderzoek, maar de relevantie bij de 1

HOOFDSTUK 1 Inleiding

mens en bij de huidige blootstellingsniveau’s is vaak nog onzeker. Dioxines zijn goed gekend voor hun anti-oestrogene werking (Connor et al.); PCB’s kunnen zowel oestrogene als anti-oestrogene effecten hebben, afhankelijk van het congeneer (Connor et al.); ftalaten zijn mogelijk antiandrogeen (Latini, Verrotti, and De Felice); van bisphenol A zijn estrogene activiteiten aangetoond (Maffini et al.); bij proefdieren werden een gestoorde ontwikkeling en verstoorde hormoonconcentraties aangetoond na blootstelling aan perfluorocomponenten (Austin et al.;Lau, Butenhoff, and Rogers); cadmium (Schoeters et al.) en lood (Pant et al.) werden in verband gebracht met verminderde spermakwaliteit. Al deze chemische stoffen zijn in verband gebracht met verminderde vruchtbaarheid bij proefdieren of bij de mens.

2

HOOFDSTUK 2. MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE: METHODE

2.1.

REKRUTERING

Het rekruteringsschema van de mannelijke case-control studie wordt samengevat in Figuur 1.

Inclusiecriteria: , leeftijd < 50 jr., BMI ≤ 35 kg/m², normaal klinisch onderzoek, geïnformeerd toestemmingsformulier

Case: total motile sperm count (TMC) < 20 miljoen

Selectie criterium: sperma analyse

Control: total motile sperm count (TMC) ≥ 20 miljoen

TMC = aantal progressief bewegende sperma cellen voor capacitatie TMC = volume * concentratie in miljoen/ml * (%A+%B/100)

Figuur 1: Schematisch overzicht van rekrutering in mannelijke case-control studie

2.1.1.

INCLUSIECRITERIA

Voor alle deelnemers in de mannelijke studie waren de inclusiecriteria: - Jonger zijn dan 50 jaar; - BMI ≤ 35 kg/m²; - Normaal klinisch onderzoek, d.w.z. geen gekende congenitale, genetische of andere gekende verworven oorzaken van mannelijke infertiliteit; - Voldoen aan selectiecriteria voor case of selectiecriteria voor controle op basis van spermakwaliteit; - ‘Informed consent’ (IC) geven; - Nederlands-, Frans- of Engelstalige vragenlijst kunnen invullen (NB: nationaliteit is geen inclusiecriterium; buitenlandse patiënten werden dus ook toegelaten op voorwaarde dat ze voldoende Nederlands, Frans of Engels spraken).

3

HOOFDSTUK 2 Mannelijke case-control studie: Methode

2.1.2.

SELECTIE VAN CASES

Als ‘cases’ werden subfertiele mannen met een abnormale spermakwaliteit geselecteerd (WHO, 1999), zonder dat hiervoor na andrologische anamnese en klinisch onderzoek een oorzaak kon gevonden worden. * Abnormale spermakwaliteit Een abnormale spermakwaliteit werd gedefinieerd als: total motile sperm count (TMC) < 20 miljoen progressief bewegende zaadcellen voor capacitatie, met uitzondering van azoöspermie. Motiliteit en morfologie werden niet beschouwd als inclusiecriterium omwille van mogelijke interlaboratorium variabiliteit op deze parameter, maar werden voor iedere sperma-analyse wel geregistreerd. De plaatjes voor morfologie werden bewaard zodat post hoc analyse van de stalen nog kon gebeuren (scoring door éénzelfde analist). Toewijzing als case gebeurde op basis van minimum 1 sperma-analyse in het labo andrologie/labo Fertiliteitscentrum van UZ Brussel, UZ Gent, ZOL of UZ Leuven. Indien mogelijk werd een tweede spermastaal gecollecteerd in hetzelfde lab (als deel van het diagnostisch proces, of later tijdens behandeling met inseminaties of met medisch begeleide bevruchting). Deze data werden ook genoteerd voor deze studie. Deze tweede sperma-analyse heeft geen invloed op de inclusie, maar de resultaten werden wel gebruikt in de statistische analyse als criterium voor toewijzing aan de case/control. * Normaal klinisch onderzoek Congenitale, genetische of andere gekende verworven oorzaken van mannelijke infertiliteit, bijvoorbeeld chromosomale abnormaliteit, Y chromosoom microdeletie, werden uitgesloten. Deze gegevens werden overgenomen uit het medisch dossier en vereisten dus geen extra klinisch onderzoek in het kader van deze studie. Een voorgeschiedenis van cryptorchidie, infecties of post-vasectomie werd bevraagd in de vragenlijst aan de patiënt (zelfrapportering) en was een exclusiecriterium. 2.1.3.

SELECTIE VAN CONTROLES

Als ‘controles’ werden mannen geselecteerd met normale spermakwaliteit, volledig normale andrologische anamnese en klinisch onderzoek. Daarnaast kwamen ook spermadonoren in aanmerking als controles. Bewezen zwangerschap was geen inclusiecriterium, maar werd wel gedocumenteerd indien mogelijk. * Normale spermakwaliteit Een normaal spermastaal moest voldoen aan volgende criteria: total motile sperm count (TMC) ≥ 20 mil. prgressief bewegende zaadcellen voor capacitatie. Motiliteit en morfologie werden niet beschouwd als inclusiecriterium omwille van mogelijke interlaboratorium variabiliteit op deze parameter, maar werden voor iedere sperma-analyse wel geregistreerd. De plaatjes voor morfologie werden bewaard zodat post hoc analyse van de stalen nog kan gebeuren (scoring door éénzelfde analist). Toewijzing als controle gebeurde op basis van minimum 1 sperma-analyse in het labo andrologie/labo Fertiliteitscentrum van UZ Brussel, UZ Gent, ZOL of UZ Leuven Indien mogelijk

4

werd een tweede spermastaal gecollecteerd in hetzelfde laboratorium (als deel van het diagnostisch proces, of later tijdens behandeling met inseminaties of met medisch begeleide bevruchting. Deze data werden ook genoteerd voor deze studie. Deze tweede sperma-analyse had geen invloed op de inclusie, maar de resultaten werden gebruikt in de statistische analyse als criterium voor toewijzing aan de case/control. * Normaal klinisch onderzoek Congenitale, genetische of andere gekende verworven oorzaken van mannelijke infertiliteit, bijvoorbeeld chromosomale abnormaliteit, Y chromosoom microdeletie, werden uitgesloten. Deze gegevens werden overgenomen uit het medisch dossier en vereisten dus geen extra klinisch onderzoek in het kader van deze studie. Een voorgeschiedenis van cryptorchidie, infecties of post-vasectomie werd bevraagd in de vragenlijst aan de patiënt (zelfrapportering) en was een exclusiecriterium. 2.2.

STUDIEVERLOOP

Het studieverloop van de mannelijke case-control studie wordt samengevat in Figuur 2.

Selectie van cases en controles Case: TMC < 20 mil.

Controle: TMC ≥ 20 mil.

Meting van de blootstelling Biomerkers van blootstelling in bloed en urine

Logistische regressie analyse Uitkomst = risico op subfertiliteit, geassoceerd met blootstellingsniveau Figuur 2: Schematisch overzicht van studieverloop van mannelijke case-control studie Mannen die in aanmerking kwamen voor de studie (jonger dan 50 jaar, BMI onder de 35 kg/m², bereid om vragenlijst in te vullen en toestemming geven (IC ondertekenen)), werden gevraagd om een sperma-analyse. Op basis van de resultaten van de sperma-analyse werden ze ingedeeld in de case of controle groep (cfr. 2.3). Cases en controles ondergingen hetzelfde studie-protocol: - Indien mogelijk werd een tweede spermastaal afgenomen. Deze analyse werd uitgevoerd om eerste analyse te bevestigen (consistentie nagaan). - Er werd een urinestaal gecollecteerd in een metaalvrije urinecontainer (minimum 30 ml) voor de meting van polluenten. Het urinestaal werden binnen de 6 uur gealiquoteerd in de

5


-

-

-

2.3.

geschikte tubes en containers en onmiddelijke ingevroren in de fertiliteitscentra. Er gebeurde regelmatig transport naar het centrale laboratorium. Er werd 36 ml bloed afgenomen door een ervaren verpleegster voor de meting van geslachtshormonen en polluenten. De bloed- (en serum-) stalen werden binnen de 6 uur gealiquoteerd in de geschikte tubes en containers en onmiddelijke ingevroren in de fertiliteitscentra. Er gebeurde regelmatig transport naar het centrale laboratorium. De deelnemer vulde een vragenlijst in (beschikbaar in Nederlands, Frans of Engels) die informatie verschafte over voedingsgewoonten, huisvesting, sociale klasse, blootstelling aan verkeer, roken, alcohol en algemene gezondheid. Deze gegevens waren nodig voor beschrijving van de onderzoeksgroep en als corrigerende factoren (confounders en covariaten) in de statistische analyse. Een aantal klinische gegevens werden geregistreerd: congenitale, genetische of andere gekende verworven oorzaken van mannelijke infertiliteit, bijvoorbeeld chromosomale abnormaliteit, Y chromosoom microdeletie, zijn exclusiecriteria. Deze gegevens werden overgenomen uit het medisch dossier. Een voorgeschiedenis van cryptorchidie, infecties en post-vasectomie waren eveneens exclusiecriteria. Deze werden bevraagd aan de patiënt (zelfrapportering). SPERMA ANALYSE

Het spermastaal werd binnen het uur na afname op het laboratorium afgeleverd voor een routine sperma-onderzoek (zie schema). Allereerst gebeurde een controle van het volume van het staal: er was minimum 2 ml nodig om een geldige analyse toe te laten. In de telkamer gebeurde een bepaling van het aantal zaadcellen in het ejaculaat (concentratie) en een beweeglijkheidsanalyse van de zaadcellen (motiliteit). Via een uitstrijkje werden de vorm en het uitzicht van de zaadcellen geëvalueerd. Bij één van de twee sperma-analyses die gebeurde in het kader van de case-control studie werd het glaasje voor de morfologie in duplo gemaakt en naar een centraal laboratorium verstuurd. Ook de vitaliteit van de zaadcellen werd gecheckt. Daarnaast werd de zuurtegraad van het staaltje gemeten (pH) en werd de consistentie (viscositeit) ervan beoordeeld.

6

2.4. 2.4.1.

HORMOON ANALYSES IN SERUM BEPALING VAN TOTAAL TESTOSTERON EN VRIJ TESTOSTERON

Totaal testosteron. Het principe van de test, een radioimmuno-assay van Orion Diagnostics, is gebaseerd op een competitie tussen het ongemerkt product (onbekende of standaard) en een bepaalde hoeveelheid gemerkt I125testosteron voor een beperkt aantal bindingsplaatsen van het antilichaam (gecoate buizen). Na incubatie wordt de vrije fractie van de gebonden fractie gescheiden door afgieten van de vloeistof, de gebonden fractie wordt gemeten. De competitie veroorzaakt door onbekende concentraties in de stalen, zal vergeleken worden met deze veroorzaakt door standaarden met gekende concentraties. De gemeten radioactiviteit kan uitgezet worden tegenover de concentratie standaard; met behulp van deze standaardcurve worden de concentraties van de onbekende stalen afgeleid uit de hoeveelheid gemeten radioactiviteit voor die onbekende stalen. Aantoonbaarheidsgrens (LOD) = 10 ng/dl. Kwaliteitscontroles: bindingsanalyse SKML (LWBA) / Bio-RAD Laboratories EQAS. Vrij testosteron: evenwichtsberekening aan de hand van SHBG en testosteron waarden (Vermeulen, Verdonck, and Kaufman 3666-72). 2.4.2.

BEPALING VAN TOTAAL OESTRADIOL EN VRIJ OESTRADIOL

Totaal oestradiol. Het basisprincipe voor deze methode is een 2-stappen competitieve immunoassay techniek. Eerst wordt 35 µl staal geincubeerd met een aan biotine gebonden oestradiolspecifiek antilichaam. Hierbij wordt een immuuncomplex gevormd waarvan de hoeveelheid afhankelijk is van de concentratie analyt in het staal.Vervolgens worden micropartikels gecoat met streptavidine en een ruthenium gelabeld oestradiolderivaat complex toegevoegd. De nog beschikbare plaatsen op de biotine gebonden antilichamen worden ingenomen met vorming van een antilichaam-hapteen complex. Dit complex wordt gebonden aan een vaste fase via de interactie biotine-streptavidine. Het reactiemengsel wordt afgezogen naar de meetcel waar de partikels magnetisch worden vastgehouden op de oppervakte van een electrode. De ongebonden fracties worden verwijderd met ProCell (tripropylamine in fosfaatbuffer). Door het aanleggen van een spanning op de electrode wordt de chemiluminescentie geïnduceerd. De lichtemissie wordt gemeten in een fotomultiplier. Vervolgens wordt de meetcel nagespoeld met CleanCell (KOH + detergentoplossing). De resultaten worden bekomen via een calibratiecurve (calibratie t.o.v. mastercurve). De praktische implementatie hiervan gebeurt op een autoanalyser Modular E170 (T0470) en Cobas 6000 (T0080). De aantoonbaarheidsgrens (LOD) voor totaal oestradiol bedraagt 5 pg/ml. Kwaliteitscontroles: Bio-RAD Laboratories EQAS. Vrij oestradiol: evenwichtsberekening aan de hand van SHBG en oestradiol waarden (Vermeulen, Verdonck, and Kaufman 3666-72). 2.4.3.

BEPALING VAN SHBG

Sex-hormone binding globuline (SHBG). Het principe van de test is een niet-competitieve immunoradiometric assay (IRMA) van Orion Diagnostics. Verdunde serum stalen, standaarden en controles worden toegevoegd aan een buis gecoat met een mengsel van twee monoklonale muis antilichaam tegen humaan SHBG. Vervolgens wordt gemerkt I125 SHBG muis monoklonaal

7


antilichaam toegevoegd. Na incubatie 3uur bij 37°C wordt de vrije fractie van de gebonden fractie gescheiden door afgieten van de vloeistof gevolgd door een wasstap. De gebonden fractie wordt gemeten. De tellingen veroorzaakt door onbekende concentraties in de stalen, zal vergeleken worden met deze veroorzaakt door standaarden met gekende concentraties. De gemeten radioactiviteit kan uitgezet worden tegenover de concentratie standaard; met behulp van deze standaardcurve worden de concentraties van de onbekende stalen afgeleid uit de hoeveelheid gemeten radioactiviteit voor die onbekende stalen. Aantoonbaarheidsgrens (LOD) = 1 nmol/l. Kwaliteitscontroles: Bindingsanalyse SKML (LWBA) / Bio-RAD Laboratories EQAS. 2.4.4.

BEPALING VAN LH

Luteïniserend hormoon (LH). De basis voor deze test is het sandwich principe. In een eerste fase wordt 20 µl serumstaal geïncubeerd met twee verschillende LH-specifieke antilichamen: één ervan gelabeld met biotine, het andere met een rutheniumcomplex. Vervolgens worden micropartikels gecoat met streptavidine toegevoegd. De LH-antlichaam-biotine fractie wordt aan de vaste fase gebonden via de interactie biotine-streptavidine. Het reactiemengsel wordt afgezogen naar de meetcel waar de partikels magnetisch worden vastgehouden op de oppervakte van een electrode. De ongebonden fracties worden verwijderd met ProCell (tripropylamine in fosfaatbuffer). Door het aanleggen van een spanning op de electrode wordt de chemiluminescentie geïnduceerd. De lichtemissie wordt gemeten in een fotomultiplier. Vervolgens wordt de meetcel nagespoeld met CleanCell (KOH + detergentoplossing). De resultaten worden bekomen via een calibratiecurve (calibratie t.o.v. mastercurve) De praktische implementatie hiervan gebeurt op een autoanalyser: Modular E170 (0T470) en Cobas 6000 (T0080). Aantoonbaarheidsgrens (LOD) = 0,1 mIU/ml. Kwaliteitscontroles: Bio-RAD Laboratories EQAS. 2.4.5.

BEPALING VAN FSH

Follikel stimulerend hormoon (FSH). De basis voor deze test is het sandwich principe. In een eerste fase wordt 40 µl serumstaal geïncubeerd met twee verschillende FSH-specifieke antilichamen: één ervan gelabeld met biotine, het andere met een rutheniumcomplex. Vervolgens worden micropartikels gecoat met streptavidine toegevoegd. De FSH-antilichaam-biotine fractie wordt aan de vaste fase gebonden via de interactie biotine-streptavidine. Het reactiemengsel wordt afgezogen naar de meetcel waar de partikels magnetisch worden vastgehouden op de oppervakte van een electrode. De ongebonden fracties worden verwijderd met ProCell (tripropylamine in fosfaatbuffer). Door het aanleggen van een spanning op de electrode wordt de chemiluminescentie geïnduceerd. De lichtemissie wordt gemeten in een fotomultiplier. Vervolgens wordt de meetcel nagespoeld met CleanCell (KOH + detergentoplossing). De resultaten worden bekomen via een calibratiecurve (calibratie t.o.v. mastercurve). De praktische implementatie hiervan gebeurt op een autoanalyser: Modular E170 (T0470). Aantoonbaarheidsgrens (LOD) = 0,1 mIU/ml. Kwaliteitscontroles: Bio-RAD Laboratories EQAS. 2.4.6.

INHIBINE B

Inhibine B. Inhibine B in serum wordt gemeten d.m.v. de Gen II Elisa (Enzyme Linked Immunosorbent assay) kit. De basis voor deze test is een enzymatische drie-staps “sandwich”

8

assay. Stalen worden via drie stappen geïncubeerd met verschillende enzymen in microtitratie platen. De mate van enzymatische turnover wordt gemeten d.m.v. absorbantie metingen. Resultaten worden bekomen door een calibratiecurce. Aantoonbaarheidsgrens (LOD) = 2,6 pg/ml.

2.5.

TOXICOLOGISCHE METINGEN

De keuze van de biomerkers van blootstelling in de case-control studie is gebaseerd op twee criteria, nl. 1) ervaring met de meting en 2) evidentie voor endocriene verstoring op basis van de internationale literatuur. Concreet betekent dit dat vertrokken wordt van de biomerkers die in het Vlaams Humaan Biomonitoringsproject 2007-2011 werden gemeten aangezien voor deze biomerkers gevalideerde meetmethoden (staalafname, analysetechniek) beschikbaar zijn. Van alle polluenten die in het Steunpunt worden gemeten, wordt binnen de huidige studie een selectie gedaan van de polluenten die gekend zijn als endocriene verstoorders bij de man omwille van oestrogene of antiandrogene effecten, of rechtstreekse effecten op de semen kwaliteit, zoals ze in de internationale literatuur worden gerapporteerd vanuit in vitro onderzoek, proefdieronderzoek of epidemiologische studies bij de mens. De stoffen die op basis van deze criteria werden geselecteerd zijn: zware metalen (lood, cadmium, mangaan en koper), PCB’s, dioxine-achtige stoffen (Calux assay), gechloreerde pesticiden (HCB, p,p’-DDE), gebromeerde vlamvertragers (polygebromeerde diphenylethers en hexabromocyclododecaan), ftalaten, bisfenol A, triclosan en perfluorderivaten (PFOS, PFOA). Tevens worden twee andere gechloreerde pesticiden toegevoegd aan de lijst, namelijk oxychlordaan en trans-nonachloor. Deze stoffen zijn belangrijke endocrien verstorende stoffen en ze kunnen op eenvoudige wijze mee worden gemeten met de andere POP’s. Ze werden in het verleden niet gemeten in de campagnes van het Steunpunt Milieu en Gezondheid, maar wel in moedermelk campagnes (WHO, LNE) in Vlaanderen. 2.5.1.

ZWARE METALEN

De zware metalen lood (Pb), cadmium (Cd), mangaan (Mn) en koper (Cu) werden bepaald in volbloed na een zuurdigestie om de organische matrix af te breken. De uiteindelijke analyse gebeurde met behulp van een hoge resolutie inductief gekoppelde plasma spectrometer (HR-ICPMS), zoals beschreven door Schroijen et al. (Schroijen et al. 1317-25). 500 µl bloed werd met behulp van 500 µl gedestilleerd salpeterzuur (ultrapuur 65%, pro analyse) en 100 µl waterstofperoxide gedigesteerd in een gesloten buizen systeem (PFA-tubes). Deze tubes werden als volgt onderworpen aan een verhoogde temperatuur: 8 minuten stijging tot 70 °C, 8 minuten houden op 70 °C, 8 minuten stijgen tot 100 °C, 8 minuten houden op 100 °C, 8 minuten stijgen tot 120 °C, 20 minuten houden op 120 °C en 10 minuten afkoelen. Tijdens het digestieprogramma werd de druk beneden de 75 psi gehouden. Na digestie werd 3,9 mL Milli Q water toegevoegd aan de stalen vooraleer de analyse met de HR-ICP-MS werd uitgevoerd. De detectielimiet (Limit of Detection, LOD) voor Pb, Cd, Mn, en Cu bedroeg respectievelijk 1,02 µg/l, 0,03 µg/l, 0,73 µg/l, en 1,07 µg/l. Als kwaliteitscontrole werd de methode gevalideerd aan de hand van gecertificeerde referentiematerialen (Sero A.S.). Bij de analyse van de bloedstalen werden in elke batch twee seronormen (seronorm 1 en seronorm 2) mee geanalyseerd en werden ook stalen gespiked met standaarden in verschillende concentraties. Er werd succesvol deelgenomen aan ringtesten van GEQUAS (German External Quality Assessment Scheme) voor milieublootstelling (Cd, Pb) en voor occupationele blootstelling (Cd, Mn, Pb).

9


Cadmium (Cd114) in urine werd gemeten door middel van ICP-DRC-MS (Perkin Elmer). De LOD bedroeg 10 ng/l; de LOQ bedroeg 100 ng/l. De interne kwaliteitscontrole bestond uit: 1) eerstelijnscontrole; 2) tweedelijnscontrole Seronorm urine; 3: derdelijnscontrole Clincheck 1; 4) beoordeling reagensblanco (contaminatiecontrole). Externe kwaliteitscontrole bestond uit deelname aan ringtesten van G-EQUAS. 2.5.2.

PERSISTENTE GECHLOREERDE EN GEBROMEERDE VERBINDINGEN

De polygechloreerde bifenyls - merker PCB99, 118, 138, 153, 156, 170, 180, 183 en 187 - en de organochloorpesticiden - hexachlorobenzeen (HCB), p,p’-DDE, oxychlordaan en trans-nonachlor werden bepaald in serum. De gebruikte procedure is gebaseerd op de procedures beschreven in twee publicaties van Covaci et al. (Covaci and Schepens 439-47;Covaci and Voorspoels). PCB’s, HCB, p,p’-DDE, oxychlordaan en trans-nonachlor werden geëxtraheerd uit serum door middel van vaste-fase extractie (SPE) op OASIS HLB cartouches en zo weerhouden op de kolom. Vervolgens werd er geëlueerd met 10 ml dichloromethaan. Het extract werd geconcentreerd tot ~0,5 ml en daarna opgezuiverd op 0,5 g zure silica (44% w/w, geconc. zwavelzuur). PCBs, HCB en p,p’-DDE werden met 8 ml hexaan:dichloromethaan (1:1, v/v) geëlueerd. Het opgezuiverde extract werd droog gedampt onder stikstof en gereconstitueerd in 80 µl iso-octaan. Het extract werd gescheiden van de andere nog aanwezige componenten door middel van gas chromatografie en gedetecteerd met een massaspectrometer operatief in electron impact ionisatie. Er werd gebruik gemaakt van een 25 m × 0.22 mm × 0.25 µm HT-8 kolom. De kwantificatielimiet (LOQ, Limit of Quantification) bedroeg 10 ng/l voor oxychlordaan en transnonachloor; 20 ng/l voor HCB, p,p’-DDE, PCB99, PCB138, PCB153, PCB180 en 10 ng/l voor de overige PCB congeneren. De kwaliteitscontrole is gebaseerd op regelmatige bepalingen van recoveries van analieten en interne standaarden in gespikete serum en water stalen, regelmatige controle van procedureblanco’s en succesvolle deelname aan internationale ringtesten (Arctic Monitoring and Assessment Program AMAP – 3 maal per jaar). Polygebromeerde difenylethers (BDE28, 47, 99, 100, 153, 154, 183 en 209) en hexabromocyclododecaan (HBCD) werden bepaald in serum. De gebruikte procedure is gebaseerd op de procedures beschreven in 2 publicaties van Covaci et al. (Covaci and Schepens 439-47;Covaci and Voorspoels). PBDE’s en HBCD werden gelijktijdig gemeten met de PCB’s en gechloreerde pesticiden. De methode is dus analoog aan de procedure zoals hierboven beschreven, namelijk extractie uit serum door middel van vaste-fase extractie (SPE), opzuivering op zure silica, scheiding van de componenten met gas chromatografie en detectie met een massaspectrometer operatief in negatieve chemische ionisatie. Voor de bepaling van TBBPA werd voor de GC-analyse een derivatisatie uitgevoerd. Het extract werd droog gedampt en heropgelost in methanol en 1% trimethylsilyldiazomethaan werd als derivatisatiereagens toegevoegd. De methylering vond gedurende 30 minuten plaats bij 60°C. Hierna werd het extract opnieuw droog gedampt en gereconstitueerd in iso-octaan. De LOQ bedroeg 2 ng/l voor BDE28, BDE99, BDE100, BDE153, BDE154 en BDE183, 3 ng/l voor BDE47, 15 ng/l voor HBCD en 40 ng/l voor BDE209. De kwaliteitscontrole is gebaseerd op regelmatige bepalingen van recoveries van analieten en interne standaarden in gespikete serum en water stalen, regelmatige controle van procedureblanco’s en succesvolle deelname aan internationale ringtesten (Arctic Monitoring and Assessment Program AMAP – 3 maal per jaar).

10

De dioxine-achtige activiteit, namelijk dioxines en furanen (PCDD’s en PCDF’s) in serum en dioxine-achtige PCB’s in serum, werd bepaald door middel van de UDC-Calux (muizencellijn). De methode is gebaseerd op de procedures beschreven door Van Wouwe et al. (Van et al. 1157-67) en Schroijen et al. (Schroijen et al. 1317-25). De dioxine-achtige stoffen werden eerst geëxtraheerd uit het serum (5 ml) met aceton (20 ml) en hexaan (3 x 5 ml). De hexaanfractie werd op een celite kolom (1.3cc celite en 4.3cc natriumsultaat) gebracht om de proteïnen te verwijderen en de vetfractie werd gecollecteerd door elutie met hexaan (10 ml). Na bepaling van het vetgehalte (gravimetrisch), werd het extract terug opgelost in hexaan (3 x 5 ml) en verder opgezuiverd m.b.v. een zure silica kolom (1.3cc natriumsulfaat, 4.3cc zure silica met 33% gecon. zwavelzuur en 1.3cc natriumsulfaat) in serie geschakeld met een koolstofkolom (0.5cc natriumsulfaat, 1cc X-Carb en 0.5cc natriumsulfaat). Na het opbrengen van het vetextract werden de kolommen gespoeld met 30 ml hexaan. Nadien werd de silica kolom verwijderd en werd de koolstof kolom gespoeld met 8 ml hexaan/aceton (9/1), waarna de PCB- en dioxine fractie geëlueerd werden met resp. 15 ml hexaan/ethylacetaat/tolueen (8/1/1) en 20 ml tolueen. Beide extracten werden geëvaporeerd en heropgelost in een gekend volume hexaan. Dit opgezuiverde extract werd overgebracht in DMSO en gedoseerd aan de muizencellen. Voor de bepaling van de PCB fractie werd gebruik gemaakt van de nieuw ontwikkelde en gevoeligere H1L7.5c1 muizencellijn. De dioxinefractie, die een hogere affiniteit heeft voor de celreceptor, kan zowel met de H1L7.5c1 als met de H1L6.1c3 cellijnen gemeten worden. Bij iedere bepaling werden ook een procedureblanco en een gepoold serumstaal gemeten als kwaliteitscontrole. Tevens werden op iedere Calux celplaat een calibratiecurve (10 standaarden), 3 kwaliteitscontrolestandaarden, en 3 DMSO blanco’s gemeten. De kwantificatielimiet (LOQ) wordt bepaald door de ondergrens van het “lineaire” werkgebied van de sigmoïdale curve en is hoger of gelijk aan de LOD en bedroeg 0,05 pg Calux BEQ/g serum. 2.5.3.

FTALAAT METABOLIETEN IN URINE

Volgende ftalaatmetabolieten werden gemeten in de urine:  metabolieten van di-2-ethylhexyl ftalaat (DEHP): het primaire metaboliet mono-2ethylhexyl ftalaat (MEHP) en de secundaire metabolieten mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl ftalaat (5-OH MEHP) en mono-2-ethyl-5-oxohexyl ftalaat (5-oxo MEHP);  metaboliet van dibutyl ftalaten: monobutyl ftalaat (MBP);  metaboliet van benzylbutyl ftalaat: monobenzyl ftalaat (MBzP);  metaboliet: mono-ethyl ftalaat (MEP);  metabolite: mono-isobutyl ftalaat (MiBP). Het urinestaal wordt gevortexed en 5 min gesoniceerd. De staalinname bedraagt 1 ml. Na additie van enzyme-buffer oplossing (beta-glucuronidase E. Coli type K12 ) en interne standaarden (13CMnBP, 13C-MEHP, 13C-OH-MEHP, 13C-oxo-MEHP) wordt gedurende 90 min. bij 37°C geïncubeerd. Het mengsel wordt vervolgens geëxtraheerd d.m.v. SPE (Oasis HLB). De componenten worden geëlueerd met ACN en ethylacetaat. Het extract wordt drooggedampt en opgenomen in 200 µl HPLC-water. De meting gebeurt met UPLC-MS (kolom: phenylfase). De kalibratieoplossingen worden aangemaakt in ACN:HPLC-water (1:9). De kwaliteitscontrole is gebaseerd op het volgende: - Opvolging van de procedureblanco (in elke meetreeks); - Bepaling van de terugvinding a.d.h.v. een gedopeerd staal in water (elke meetreeks); - Bepaling van de terugvinding a.d.h.v. een gedopeerd urinestaal (elke meetreeks); - Duplo-bepalingen (1 per meetreeks); - Deelname aan een internationale ringtest (G-EQUAS). 11


Rekening houdend met de concentratie in de procedureblanco bedragen de rapporteergrenzen: Rapporteergrens 0.2 µg/L 0.2 µg/L 0.2 µg/L 0.2 µg/L 0.3 µg/L 0.2 µg/L 1 µg/L

MEHP MEHHP MEOHP MBP MBZP MEP MIBP

2.5.4.

BISFENOL A IN URINE

De methode voor de meting van BPA in urine werd beschreven door Geens et al. (Geens, Neels, and Covaci 4042-46). BPA kan in de urine voorkomen onder zijn vrije én gegluceronideerde vorm. Om het totale BPA te meten wordt het geglucuronideerd BPA eerst vrijgezet door middel van enzymatische hydrolyse met 50 µl β-glucuronidase/arylsulfatase. Aangezien deze enzymatische hydrolyse optimaal plaatsvindt bij pH 4.5-5 wordt ook 0.75 ml acetaatbuffer 2M toegevoegd. BPA wordt vervolgens geëxtraheerd uit de urine door middel van vaste-fase extractie (SPE) op OASIS HLB cartouches (60 mg, 3 mL). BPA wordt weerhouden op de kolom en vervolgens geëlueerd met 5 ml methanol:dichloromethaan (1:1, v/v). Het extract wordt volledig drooggedampt en heropgelost in 1 ml water en 2 ml hexaan. Na ioniseren van BPA met KOH en vervolgens toevoegen van het derivatisatiereagens pentafluorobenzoylchloride (PFBCl) verdelen de gevormde derivaten zich naar de hexaanfase. Deze hexaanfase wordt vervolgens opgezuiverd op 0.2 g zure silica (10% w/w, geconc. zwavelzuur), waarna het BPA-derivaat met 6 ml dichloromethaan geëlueerd wordt. Tenslotte wordt het opgezuiverde extract drooggedampt onder stikstof en gereconstitueerd in 100 µl iso-octaan. Het extract wordt gescheiden van de andere nog aanwezige componenten door middel van gas chromatografie en gedetecteerd met een massaspectrometer operatief in negatieve chemische ionisatie. Er wordt gebruik gemaakt van een 30 m × 0.25 mm × 25 µm DB-5 kolom. De LOQ bedraagt 0,2 µg/l. Simultaan met de meting van BPA gebeurt ook de analyse van triclosan in urine (zie 2.5.5.). De kwaliteitscontrole is gebaseerd op bepalingen van recoveries van analieten en interne standaarden in gespikete urinestalen en controle van procedureblanco’s. 2.5.5.

TRICLOSAN IN URINE

De methode voor de meting van triclosan (TCS) in urine werd beschreven door Geens et al. (Geens, Neels, and Covaci 4042-46). Om het totaal (vrij en geglucuronideerd) TCS te kunnen bepalen, wordt 50 µl β-glucuronidase/arylsulfatase toegevoegd. Deze enzymatische hydrolyse vindt optimaal plaats bij pH 4,5-5. Hiervoor wordt er 0,75 ml acetaatbuffer 2M toegevoegd. TCS wordt vervolgens geëxtraheerd uit de urine door middel van vaste-fase extractie (SPE) op OASIS HLB cartouches (60 mg, 3 ml). BPA en TCS wordt weerhouden op de kolom en vervolgens geëlueerd met 5 ml methanol:dichloromethaan (1:1, v/v). Het extract wordt volledig drooggedampt en heropgelost in 1 ml water en 2 ml hexaan. Na het toevoegen van het derivatisatiereagens pentafluorobenzoylchloride (PFBCl) verdelen de gevormde derivaten zich naar de hexaanfase. Deze hexaanfase wordt vervolgens opgezuiverd op 0.2 g zure silica (10% w/w, geconc. zwavelzuur), waarna het TCS-derivaat met 6 ml dichloromethaan geëlueerd wordt.

12

Tenslotte wordt het opgezuiverde extract drooggedampt onder stikstof en gereconstitueerd in 100 µl iso-octaan. Het extract wordt gescheiden van de andere nog aanwezige componenten door middel van gas chromatografie en gedetecteerd met een massaspectrometer operatief in negatieve chemische ionisatie. Er wordt gebruik gemaakt van een 30 m × 0.25 mm × 25 µm DB-5 kolom. De LOQ bedraagt 0,1 µg/l. Simultaan met de meting van TCS gebeurt ook de analyse van bisphenol A (BPA) in urine (zie 2.5.4.). 2.5.6.

PERFLUORDERIVATEN IN SERUM

Perfluoro-octaansulfonaat (PFOS) en perfluoro-octaanzuur (PFOA) werden bepaald in serum. De gebruikte procedure is gebaseerd op de procedures beschreven in 2 publicaties van Midasch et al. (Midasch, Schettgen, and Angerer 489-96;Midasch et al. 643-48). De analytische methode bestond uit een offline proteïne precipitatie met acetonitrile, gevolgd door een scheiding d.m.v. HPLC en een MS/MS detectie (Apllied Biosystems API2000 triple quadrupole mass spectrometer (Foster City, CA,USA) in negative ionization MS/MS mode met MRM (multiple reaction monitoring)). De kwantificatielimiet (LOQ) bedoeg 0,3 µg/l, zowel voor PFOA als voor PFOS. Kwaliteitscontroles gebeurden door meenemen van reagentia blanco’s, serum blanco’s, calibratie standaarden (PFOS en PFOA 10, 50, 100, 500 µg/l) en kwaliteitscontrole stalen (PFOS en PFOA 25 µg/l). Er werd op succesvolle wijze deelgenomen aan internationale ringtesten. 2.6.

STATISTISCHE ANALYSE

De gegevens uit de patiëntendossiers en de vragenlijsten werden manueel ingegeven in de databank en samengevoegd met de toxicologische data van de laboratoria. Metingen onder de kwantificatielimiet (LOQ) werden vervangen door de helft van de LOQ voor continue berekeningen. De beschrijvende statistiek van continue gegevens gebeurde door middel van het geometrisch gemiddelde met 25e en 75e percentiel. Categorische gegevens (bijv. roken) werden gegeven als frequenties. Voor vergelijking van 2 groepen werd gebruik gemaakt van Mann-Whitney U test voor continue data en van de Fisher exact test voor categorische data. Multipele regressie analyses werden uitgevoerd door middel van logistische regressie modellen voor de binaire uitkomst subfertiliteit en door middel van lineaire regressie modellen voor continue uitkomsten (spermakwaliteit en serumconcentratie geslachtshormonen. Indien herhaalde metingen (bijv. 2 sperma-analyses van dezelfde persoon) beschikbaar waren, werd gebruik gemaakt van mixed models voor de statistische analyse. De confounders meegenomen in de statistische modellen werden vooraf gedefinieerd op basis van de literatuur. De beschreven statistische analyses werden uitgevoerd op de totale groep, nl. patiënten met minstens één en bij voorkeur twee sperma-analyses, genomen met minstens 1 week tussentijd. Voor sommige subanalyses werd een subpopulatie gedefinieerd, nl. de groep met twee consistente sperma-analyses. Patiënten in deze sugroep werden gedefinieerd als volgt: cases: mannen met 2 spermastalen met TMC < 20 miljoen/ml; controles: mannen met 2 spermastalen met TMC ≥ 20 miljoen/ml. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SAS versie 9.2. De p-waarde voor significantie werd gedefinieerd als 0,05.

13

HOOFDSTUK 3 Mannelijke case-control studie: resultaten

HOOFDSTUK 3. MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE: RESULTATEN

3.1. 3.1.1.

STUDIEPOPULATIE IN MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE INCLUSIE VAN CONTROLES EN CASES

Voor de selectie van mogelijke studiepatiënten werden eerst de selectiecriteria nagekeken. Alle deelnemers waren jonger dan 50 jaar en hadden een BMI lager dan 35 kg/m². Op basis van het klinisch onderzoek en anamnese was er geen congenitale, genetische of verworven oorzaak voor subfertiliteit. Deelnemers waren bereid om een bloed-, urine en spermastaal te doneren, een uitgebreide vragenlijst in te vullen en het geïnformeerd toestemmingsformulier te ondertekenen. De toewijzing tot case of controle gebeurde op basis van de resultaten van minstens één spermaanalyse. Indien mogelijk werd een 2e spermastaal geanalyseerd. In totaal kwamen 163 patiënten in aanmerking voor de studie. Voor 142 patiënten gebeurde de toewijzing tot de controle of case groep op basis van 2 spermastalen, genomen met minstens 1 week tussentijd. Van de 142 mannen hadden 80 patiënten bij beide sperma-analyses een normale TMC; zij werden ingedeeld bij de controles. De overige 62 mannen hadden een verstoorde TMC bij beide (n=40) of één van beide (n=22) analyses en werden ingedeeld in de case groep. Bij 21 deelnemers was er slechts 1 spermastaal beschikbaar; hiervan hadden 6 mannen een normale TMC (controles) en 15 mannen een verstoorde TMC (cases). De finale groep bestond bijgevolg uit 86 controles en 77 cases (zie Tabel 1). De verdeling van cases en controles in de vier fertiliteitscentra wordt weergegeven in Figuur 3.

Tabel 1: Indeling van mannelijke controles en cases op basis van resultaat sperma-analyse

2e zaadanalyse VERSTOORD (TMC < 20) 2e zaadanalyse NORMAAL (TMC ≥ 20) 2e zaadanalyse GEEN blauwe vlakken: cases

14

1e zaadanalyse VERSTOORD (TMC < 20)

1e zaadanalyse NORMAAL (TMC ≥ 20)

n = 40

n = 14

n=8

n = 80

n = 15

n=6

gele vlakken: controles

Controls

26

30

8 22

Cases

Leuven Genk Brussel Gent

3

10 29 35


Figuur 3: Verdeling van mannelijke controles en cases over de vier fertiliteitscentra

3.1.2.

BESCHRIJVING VAN CONTROLES EN CASES

Tabel 2 vergelijkt de voornaamste eigenschappen van de cases en controles in de totale groep. De gemiddelde leeftijd in de controlegroep lag iets hoger, maar het verschil tussen controles en cases was niet significant (p=0,06). Ondanks de hogere leeftijd hadden controles gemiddeld een lagere body-mass index (BMI), maar ook hier waren de verschillen net niet significant (24,5 kg/m² bij de controles vs. 25,5 kg/m² bij de cases; p=0,07). Het percentage deelnemers dat aangeeft dat hun lichaamsgewicht tijdens de voorbije vijf jaar is veranderd bedroeg ongeveer 55% in de twee groepen (p=0,63). De gemiddelde gewichtstoename over een periode van vijf jaar bedroeg 5,4 kg bij de controles en 7,1 kg bij de cases (p=0,11). De gemiddelde gewichtsafname bedroeg 7,6 kg in beide groepen (p=0,81). Veranderingen in lichaamsgewicht zijn belangrijk omdat ze een effect kunnen hebben op de serum concentraties van vetoplosbare polluenten: bij vermageren (vetafbraak) komen er polluenten vanuit het vetweefsel vrij in het serum; bij verdikken (vetopstapeling) worden er polluenten opgeslagen in het vetweefsel en zal de serum concentratie dalen. In de totale onderzoeksgroep had 51,5% nooit gerookt (50,0% bij de controles en 54,7% bij de cases); ongeveer 25% was ex-roker en ongeveer 25% was huidig roker. Van deze laatste groep rookte ongeveer 20% dagelijks en 5% rookte sporadisch. De rookgewoonten waren niet significant verschillend tussen cases en controles (p=0,36). De blootstelling aan passief roken was zeer scheef verdeeld in de steekproef. De gemiddelde blootstelling bedroeg 0 uur per week in beiden groepen; het 75e percentiel van blootstelling aan passief roken bedroeg 2 uur/week in de controlegroep en 4 uur/week in de case groep; het 90e percentiel bedroeg respectievelijk 6 en 5 uur/week. Verschillen waren niet significant (p=0.08). Over het algemeen was het opleidingsniveau in de onderzoeksgroep hoog (meer dan 50% met een diploma hoger onderwijs), maar het percentage hoger opgeleiden was zeer vergelijkbaar tussen cases en controles (p=0,87). Alcoholverbruik op basis van frequenties was significant hoger in de controlegroep: 11,8% van de controles dronk dagelijks alcohol tegenover 1,4% van de cases (p=0,03). Het caffeïnegebruik daarentegen, was zeer vergelijkbaar in de twee groepen en bedroeg gemiddeld ongeveer 9 à 10 eenheden per week (uitgedrukt in aantal eenheden per week, berekend op basis van porties koffie, thee en cola). Het gebruik van lokale voeding (groenten, fruit, eieren, zelfgevangen vis) was zeer vergelijkbaar tussen de twee groepen (p-waardes variëren tussen 0,31 en 0,64). Op basis van vragen over fysische inspanning op het werk en fysische inspanning bij hobby’s werd een score berekend voor lichte activiteit en zware activiteit. Het aantal uren zware fysieke activiteit per week lag significant hoger in de case groep (p=0,03).

15


Tabel 2: Karakterisiteken van mannelijke controles en cases Leeftijd (jaar) Body-mass index (kg/m²) Gewichtsverandering % met stabiel gewicht verdikt, gemiddeld aantal kg op 5 jaar vermagerd, gemiddeld aantal kg op 5 jaar Roken % nooit gerookt % ex-rokers % sporadisch roker % dagelijks roker Passief roken (uren/week) Opleidingsniveau % maximum hoger secundair % HOBU/universitair Alcohol % minder dan maandelijks % maandelijks tot wekelijks % dagelijks Caffeïne gebruik (eenheden/week) Consumptie lokale voeding % lokale eieren (vaak/altijd) % zelfgevangen vis (af en toe/vaak/altijd) % lokale groenten (af en toe/vaak/altijd) % lokaal fruit (af en toe/vaak/altijd) Fysiek activiteit lichte fysieke activiteit (aantal uren/week) zware fysieke activiteit (aantal uren/week) Medicatie % cholesterolverlagers % slaap/kalmeermiddelen % anti-depressiva Ziekten % hypertensie % migraine Biochemie urinair creatinine (mg/dl) densiteit urine (g/cm³) bloedvet in serum (mg/g)

Controles (n=88) 33,5 (30,0 – 38,0) 24,5 (22,5 – 26,3)

Cases (n=75) 31,9 (29,0 – 35,0) 25,5 (23,1 – 27,7)

p-waarde 0,06 0,07

45,9% 5,4 (4,0 – 7,0) 7,6 (4,5 – 11,0)

41,3% 7,1 (5,0 – 10,0) 7,6 (4,0 – 12,0)

0,63 0,11 0,81

50,0% 31,4% 5,8% 12,8% 0,0 (0,0 – 2,0)

54,7% 21,3% 4,0% 20,0% 0,0 (0,0 – 4,0)

0,36 0,08

47,1% 52,9%

48,7% 51,4%

0,87

21,2% 67,1% 11,8% 8,9 (7,0 – 21,9)

21,6% 77,0% 1,4% 10,2 (7,0 – 21,9)

0,03 0,97

20,0% 5,9% 45,9% 22,4%

26,0% 9,3% 50,0% 14,9%

0,45 0,55 0,64 0,31

0,1 (0,0 – 4,0) 0,0 (0,0 – 5,0)

0,1 (1,0 – 4,0) 0,1 (1,0 – 9,0)

0,65 0,03

0,0% 2,4% 0,0%

5,6% 4,1% 1,4%

0,04 0,66 0,47

1,2% 5,8%

4,0% 5,3%

0,34 1,00

141 (106 – 211) 1,019 (1,014 – 1,024) 439 (354 – 533)

147 (116 – 208) 1,019 (1,014 – 1,024) 417 (330 – 523)

0,88 0,83 0,27

Data zijn percentages voor categorische variabelen en geometrische gemiddeldes (P25-P75) voor continue variabelen; P-waarden: Fisher exact test voor categorische variabelen, Mann-Whitney U-test voor continue variabelen.

Het voorkomen van chronische ziekten zoals diabetes, hypertensie, migraine en gebruik van medicatie zoals antidepressiva, cholesterolverlagende middelen werd bevraagd. Over het algemeen was de frequentie van ziekten in deze relatief jonge populatie laag, maar de frequentie

16

lag meestal iets hoger in de case groep (significant meer gebruik van cholesterolverlagende middelen). Voor de interpretatie van de biomerkers in urine is de verdunningsgraad van de urine belangrijk. Urinair creatinine en de densiteit van de urine waren zeer vergelijkbaar tussen controles en cases wat betekent dat de sampling procedure vergelijkbaar is. Het bloedvetgehalte in serum werd gravimetrisch bepaald en is van belang voor de interpretatie van vetoplosbare polluenten in serum (gechloreerde en gebromeerde POP’s). Het bloedvetgehalte was zeer goed vergelijkbaar tussen cases en controles. De resultaten van de sperma-analyses worden samengevat in Tabel 3. De standaard parameters van zaadanalyses, nl. concentratie, motiliteit en morfologie, en de berekende TMC werden vergeleken tussen controles en cases. Zowel voor de 1e als voor de 2e sperma-analyse waren alle parameters van spermakwaliteit significant lager in de cases in vergelijking met de controles (p<0,0001). Het aantal dagen onthouding was niet significant verschillend.

Tabel 3: Beschrijving sperma-analyse bij mannelijke controles en cases 1e zaadanalyse spermaconcentratie (milj./ml) motiliteit: %A + %B % normale motiliteit (%A+%B ≥ 50) morfologie: % normalen Total Motile Count (TMC)* (milj.) % normale TMC (≥ 20 milj.) aantal dagen abstinentie 2e zaadanalyse spermaconcentratie (milj./ml) motiliteit: %A + %B % normale motiliteit (%A+%B ≥ 50) Total Motile Count (TMC)* (milj.) % normale TMC (≥ 20 milj.) morfologie: % normalen aantal dagen abstinentie

Controles (n=86) n=86 57,0 (38,0 – 101,8) 56,6 (48,0 – 70,0) 72,1% 3,4 (5,0 – 12,0) 107,1 (57,0 – 199,5) 100% 3,1 (2,0 – 4,0) n=80 65,1 (38,8 – 106,0) 54,9 (47,5 – 68,0) 65,0% 113,8 (59,5 – 189,6) 100% 5,9 (5,0 – 11,0) 2,7 (3,0 – 4,0)

Cases (n=77) n=77 7,1 (3,3 – 17,2) 17,3 (18,0 – 44,0) 20,8% 0,3 (1,0 – 4,0) 3,5 (1,8 – 15,8) 10,4% 2,4 (2,0 – 3,0) n=62 7,5 (4,0 – 20,0) 30,7 (20,0 – 52,0) 30,7% 4,5 (2,7 – 17,9) 22,6% 0,2 (0,5 – 7,0) 3,5 (3,0 – 4,0)

p-waarde <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 0,44 <0,0001 <0,0001 < 0,0001 <0,0001 <0,0001 <0,0001 1,00

Data zijn percentages voor categorische variabelen en geometrische gemiddeldes (P25-P75) voor continue variabelen; P-waarden: Fisher exact test voor categorische variabelen, Mann-Whitney U-test voor continue variabelen* TMC = % progressief bewegende zaadcellen voor capacitatie = volume * concentratie * (%A+%B)/100

De gemiddelde hormoonconcentraties bij cases en controles worden gegeven in Tabel 4. Voor testosteron wordt tevens het % deelnemers met een waarde boven de normale grens voor volwassenen berekend, nl. 321 ng/dl voor totaal testosteron en 6 ng/dl voor vrij testosteron. Totaal testosteron, vrij testosteron, oestradiol, vrij oestradiol, FSH en SHBG waren niet significant verschillend tussen cases en controles. LH was significant hoger in de cases. Inhibine B, een merker die geassocieerd is met testisfunctie, was significant lager in de case groep in vergelijking met de controles.

17


Tabel 4: Beschrijving hormoonconcentraties bij mannelijke controles en cases testosteron (ng/dl) % testosteron > 321 ng/dl vrij testosteron (ng/dl) % vrij testosteron > 6 ng/dl LH (mU/ml) FSH (mU/ml) SHBG (nmol/l) oestradiol (pg/ml) vrij oestradiol (pg/ml) inhibine B (pg/ml)

Controles (n=88) 473 (388 – 582) 91,9% 8,2 (6,8 – 11,6) 80,2% 4,0 (3,2 – 5,1) 4,1 (3,0 – 5,3) 30,7 (23,6 – 41,7) 26,3 (21,9 – 31,4) 0,4 (0,3 – 0,6) 165 (138 – 204)

Cases (n=75) 443 (357 – 560) 85,7% 6,8 (4,9 – 11,6) 68,8% 4,6 (3,4 – 6,3) 5,0 (3,1 – 8,0) 30,7 (23,9 – 39,4) 26,9 (23,6 – 31,0) 0,3 (0,3 – 0,6) 120 (95 – 188)

p-waarde 0,22 0,22 0,21 0,11 0,03 0,06 0,80 0,54 0,90 0,001

Data zijn percentages voor categorische variabelen en geometrische gemiddeldes (P25-P75) voor continue variabelen; P-waarden: Fisher exact test voor categorische variabelen, Mann-Whitney U test voor continue variabelen. SHBG = sex hormone binding globuline; LH = luteïniserend hormoon; FSH = follikel stimulerend hormoon

3.2. 3.2.1.

BLOOTSTELLING: CONTROLES VS. CASES VERGELIJKING VAN GEMIDDELDE CONCENTRATIE VAN POLLUENTEN TUSSEN MANNELIJKE CASES EN CONTROLES

Tabel 5 geeft de gemiddelde niveaus van de polluenten in de controlegroep in vergelijking met de case groep. De vergelijking gebeurde op basis van de ruwe data (univariate anaylses), d.w.z. dat er niet gecorrigeerd werd voor de achtergrondkarakteristieken (bijv. roken, voeding, enz..) die mogelijk gelinkt zijn met de blootstelling en kunnen verschillen tussen controles en cases. Voor de zware metalen (cadmium, lood, mangaan, koper) werden geen significante verschillen vastgesteld tussen controles en cases. In deze studie werden verschillende gechloreerde POP’s gemeten, nl. PCB’s, dioxineachtige stoffen (gemeten met Calux assay) en een aantal gechloreerde pesticiden: hexachloorbenzeen (HCB), oxychlordaan (OxC), trans-nonachlor (TN), p,p’-DDT en p,p’-DDE (metabolieten van DDT). Het gebruik van deze stoffen is momenteel verboden, maar omwille van massaal gebruik in het verleden en door hun persistentie en hoge vetoplosbaarheid zijn het nog steeds belangrijke milieupolluenten in de omgeving. Blootstelling gebeurt vooral via de voeding, en deels via de lucht. De gemeten concentraties in het lichaam weerspiegelen cumulatieve blootstelling. De som van merker PCB’s 138, 153 en 180 geeft een goede maat voor de blootstelling aan totale PCB’s aangezien deze 3 congeneren kwantitatief de belangrijkste zijn. De blootstelling aan de merker PCB’s was niet verschillend tussen cases en controles. Voor de andere individuele PCB’s die minder frequent voorkomen werd een hogere gemiddelde blootstelling vastgesteld in de controles in vergelijking met de cases voor PCB170 (p=0,03). De Calux assay is een bio-assay die geen chemische concentratie meet, maar een activiteit (binding aan de Ah-receptor). Door fractionering van de stalen is het mogelijk om twee groepen stoffen met dioxineachtige activiteit te meten, nl. de dioxineachtige PCB’s en de som van dioxines en furanen (PCDD/PCDFS’s). De fractie dioxineachtige PCB’s, gemeten met de Calux, was significant hoger in de controles in vergelijking met de cases (p=0,03), terwijl er geen verschil werd vastgesteld voor de PCDD/PCDF’s.

18

In de groep van de gechloreerde pesticiden werd bij de cases een significant hogere blootstelling gemeten voor HCB (p=0,03). Voor de overige gechloreerde pesticiden was er geen significant verschil tussen beide patiëntengroepen. Gebromeerde vlamvertragers worden gebruikt als brandwerende stoffen in heel wat consumptieproducten. Net als de gechloreerde POP’s zijn ze persistent en vetoplosbaar, waardoor ze zich opstapelen in het milieu en in de voedselketen. Daarnaast is ook stof een belangrijke blootstellingroute omdat gebromeerde vlamvertragers via de lucht vrijkomen uit heel wat consumptieproducten (elektronica, textiel, meubels, enz….). De halfwaardetijd in het menselijke lichaam varieert van een 10-tal dagen tot meer dan 26 jaar voor de verschillende gebromeerde vlamvertragers. In deze studie lag de concentratie van gebromeerde POP’s in serum voor de meeste congeneren dicht bij de kwantificiatielimiet (LOQ). Enkel BDE47 en BDE153 komen in aanzienlijke concentratie voor in het serum en laten dus toe om de gemiddelde blootstelling te berekenen. Voor de berekening van de gemiddelde blootstelling werden waarden onder de LOQ vervangen door ½ LOQ. De detectiefrequentie van BDE47 bedroeg 38,8% bij controles en 37,0% bij cases. De gemiddelde concentratie was niet verschillend in beide groepen. BDE153 lag hoger dan de kwantificatielimiet bij 94,1% van de controles en 90,4% van de cases. Er was een trend voor gemiddeld hogere waarden in de controlegroep maar deze was borderline niet-significant (p=0.053). Voor de overige BDE’s was de detectiefrequentie laag en is het bijgevolg niet betrouwbaar om een gemiddelde blootstelling te berekenen. Cases en controles werden daarom vergeleken door het % deelnemers met een waarde boven de LOQ te berekenen. Voor geen van de BDE’s (BDE28, 99, 100, 154, 183 en 209), noch voor hexabromocyclododecaan (HBCD) was er een significant verschil in detectiefrequentie tussen cases en controles. Er was geen duidelijk trend voor de totale groep van vlamvertragers; waarden lagen soms hoger in de controlegroep en soms in de case groep. Ftalaten zijn weekmakers in plastic. De urinaire metabolieten geven een maat voor de recente blootstelling. De gemiddelde concentratie van de verschillende ftalaatmetabolieten was zeer vergelijkbaar tussen cases en controles. Voor geen enkele van de metabolieten werden significante verschillen in blootstelling gedetecteerd. Bisfenol A is een eveneens een component in plastic. Het wordt gebruikt in de productie van polycarbonaten en epoxyharsen en komt vooral voor in harde plastieksoorten. Bisfenol A in urine geeft een maat voor recente blootstelling. De gemiddelde urinaire concentratie van bisfenol A in cases en controles was zeer vergelijkbaar. Triclosan is een anti-bacterieel product dat vaak wordt toegevoegd aan verzorgingsproducten en cosmetica, maar ook wordt gebruikt als additief in voeding. De urinaire concentratie weerspiegelt recente blootstelling. De blootstelling aan triclosan was zeer vergelijkbaar tussen cases en controles. Perfluors worden gebruikt om producten water-, stof- en vetafstotend te maken. Ze worden onder meer gebruikt in voedingsverpakking (kartonnen drinkbekers, schaaltjes, enz..), in kookmateriaal (tefal) en in stoffen voor meubels en auto’s. PFOS en PFOA zijn perfluorderivaten en hun concentratie in serum weerspiegelt middellange blootstelling aan perfluors. De gemiddelde concentratie van PFOS en PFOA was niet verschillend tussen cases en controles.

19


Tabel 5: Blootstelling aan polluenten: vergelijking van mannelijke controles en cases Blootstellingmerker Controles (n=86) Zware metalen cadmium in urine (ng/l) 260 (159 – 400) cadmium in bloed (µg/l) 0,23 (0,14 – 0,36) lood in bloed (µg/l) 21,6 (16,0 – 29,4) mangaan in bloed (µg/l) 8,2 (6,7 – 9,7) koper in bloed (µg/l) 790 (739 – 861) Persistente gechloreerde polluenten in serum som PCB138, 153 en 180 (ng/l) 406 (272 – 548) PCB99 (ng/l) 17,2 (10,0 – 26,0) PCB118 (ng/l) 22,9 (15,0 – 35,0) PCB156 (ng/l) 20,1 (14,0 – 30,0) PCB170 (ng/l) 58,9 (40,0 – 81,0) PCB183 (ng/l) 11,1 (5,0 – 18,0) PCB187 (ng/l) 29,2 (19,0 – 42,0) hexachlorobenzeen (ng/l) 42,6 (31,0 – 66,0) oxychlordaan (ng/l) 16,6 (12,0 – 24,0) trans-nonachlor (ng/l) 10,8 (5,0 – 19,0) p,p'-DDE (ng/l) 418 (240 – 649) p,p’-DDT (ng/l) 15,5 (10,0 – 26,0) Calux-assay: dl-PCB's (pg BEQ/g) 0,069 (0,050–0,080) Calux-assay: PCDD/PCDF’s (pg BEQ/g) 0,19 (0,16 – 0,22) Persistente gebromeerde polluenten in serum BDE47 (ng/l) 2,5 (1,5 – 4,0) BDE153 (ng/l) 3,9 (3,0 – 5,0) BDE28, % > LOQ 0,0% BDE99, % > LOQ 9,4% BDE100, % > LOQ 8,2% BDE154, % > LOQ 36,5% BDE183, % > LOQ 0,0% BDE209, % > LOQ 4,7% Hexabromocyclododecaan, % > LOQ 11,8% Plastic componenten: ftalaatmetabolieten in urine MEHP (µg/l) 2,4 (1,3 – 5,1) 5-OH-MEHP (µg/l) 10,4 (5,4 – 19,0) 5-oxo-MEHP (µg/l) 7,4 (3,6 – 14,0) MnBP (µg/l) 18,7 (11,0 – 40,0) MBzP (µg/l) 4,6 (2,5 – 9,3) MEP (µg/l) 49,7 (20,0 – 109,0) MiBP (µg/l) 54,5 (27,0 – 107,0) Andere plastic component Bisfenol A in urine (µg/l) 1,5 (0,8 – 2,3) Componenten van persoonlijke hygiëne producten Triclosan in urine (ng/l) 2,7 (0,5 – 5,3) Perfluorderivaten PFOS in serum (µg/l) 10,5 (7,7 – 13,9) PFOA in serum (µg/l) 2,8 (2,4 – 3,7)

Cases (n=77)

p-waarde

244 (156 – 380) 0,25 (0,15 – 0,40) 19,5 (14,5 – 23,6) 7,9 (6,6 – 9,6) 814 (760 – 861)

0,62 0,93 0,06 0,36 0,09

349 (254 – 517) 15,8 (10,0 – 25,5) 22,9 (15,5 – 35,5) 16,5 (12,0 – 25,5) 47,6 (35,0 – 71,0) 9,6 (5,0 – 15,0) 24,1 (16,0 – 38,0) 52,0 (38,0 – 82,0) 17,0 (13,0 – 28,0) 10,7 (5,0 – 18,5) 425 (240 – 658) 16,0 (10,0 – 32,5) 0,062 (0,050–0,070) 0,22 (0,16 – 0,31)

0,12 0,41 0,88 0,07 0,03 0,20 0,14 0,03 0,47 1,00 0,98 0,99 0,03 0,20

2,2 (1,5 – 4,0) 3,3 (3,0 – 4,0) 1,3% 5,3% 6,6% 26,3% 0,0% 11,8% 5,3%

0,43 0,05 0,47 0,38 0,77 0,18 / 0,15 0,17

2,5 (1,5 – 5,4) 10,5 (5,9 – 18,0) 7,3 (4,2 – 14,0) 20,9 (11,0 – 35,0) 4,6 (2,3 – 9,5) 43,0 (13,0 – 118,0) 52,6 (34,0 – 104,0)

0,81 0,98 0,97 0,86 0,91 0,43 0,98

1,7 (1,0 – 2,4)

0,56

2,0 (0,5 – 5,4)

0,31

8,7 (5,7 – 13,5) 2,6 (2,1 – 3,6))

0,23 0,21

Data zijn percentages voor categorische variabelen en geometrische gemiddeldes (P25-P75) voor continue variabelen; P-waarden: Fisher exact test voor categorische variabelen, Mann-Whitney U test voor continue variabelen.

20

PCB: polygechloreerde biphenyl; dl-PCB’s: dioxineachtige PCB’s; PCDD/PCDF: polygechloreerde dibenzodioxines en dibenzofuranen; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; MEHP: mono-2ethylhexyl ftalaat; 5OH-MEHP: mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl ftalaat; 5oxo-MEHP: mono-2-ethyl-5oxohexyl ftalaat; MBP: mono-n-butyl ftalaat; MBzP: mono benzyl ftalaat; MEP: mono-ethyl ftalaat; MiBP: mono-isobutyl ftalaat; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur.

3.2.2.

RELATIE TUSSEN BLOOTSTELLING EN KANS OP SUBFERTILITEIT IN MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE

Met behulp van logische regressie werd de verhoging in het risico op fertiliteitsproblemen berekend bij een stijging van de blootstelling. In alle analyses werd gecorrigeerd voor leeftijd, bodymass index (BMI), roken, passief roken en opleidingsniveau. Voor alle urinaire merkers werd bijkomend gecorrigeerd voor urinair creatinine; voor alle vetgerelateerde merkers in serum (alle gechloreerde en gebromeerde POP’s) werd bijkomend gecorrigeerd voor bloedvet. De odds ratio weerspiegelt de verhouding “kans op een fertilliteitsprobleem/kans op geen fertiliteitsprobleem” (m.a.w. verhouding “kans om case te zijn/kans om controle te zijn”) indien de blootstelling toeneemt van de 25e naar de 75e percentiel, dus voor een stijging van de biomerker van blootstelling met één interkwartiel range (IQR). Een odds ratio groter dan 1 geeft een verhoogde kans, bijv. een odds ratio van 1,10 betekent dat er 10% meer kans is op een fertiliteitsprobleem. Een odds ratio kleiner dan 1 geeft een verminderd risico, bijv. een odds ratio van 0,80 betekent dat er 20% minder kans is op een fertiliteitsprobleem. Odds ratios worden gepresenteerd samen met hun 95% betrouwbaarheidsinterval (BI). Voor de logistische regressie analyses werden de criteria van case en controle zo streng mogelijk genomen: enkel patiënten met twee consistente resultaten kwamen in aanmerking voor statistische analyse, d.w.z. dat cases gedefinieerd werden op basis van twee zaadanalyses met een verstoorde TMC (< 20 miljoen) en controles op basis van twee zaadananalyse met een normale TMC (≥ 20 miljoen) (zie Tabel 6). Door het kleiner aantal observaties zal de analyse minder krachtig zijn (verlies aan statistische power), maar anderzijds zal de indeling in groepen consistenter zijn aangezien het oorspronkelijk onderzoeksscenario gerespecteerd wordt.

Tabel 6: Definitie van mannelijke controles en cases voor logistische regressie analyse

2e zaadanalyse VERSTOORD (TMC < 20) 2e zaadanalyse NORMAAL (TMC ≥ 20) 2e zaadanalyse GEEN blauwe vlakken: cases

1e zaadanalyse VERSTOORD (TMC < 20)

1e zaadanalyse NORMAAL (TMC ≥ 20)

n = 40

n = 14

n=8

n = 80

n = 15

n=6

gele vlakken: controles

grijze vlakken: niet in analyse

Blootstelling aan zware metalen was in deze studie niet geassocieerd met een toegenomen risico op subfertiliteit (Figuur 4). Voor alle metalen in bloed (cadmium, lood, mangaan en koper) lagen de odds ratio’s in de buurt van 1 en waren niet significant. Deze metalen reflecteren middellange blootstelling (Cd, Pb) en recente blootstelling (Mn en Cu). Urinair cadmium, daarentegen, reflecteert levenslange blootstelling (accumulatie van cadmium in de nier), en is dus ook een maat

21


voor blootstelling uit het verleden. Urinar cadmium was positief geassocieerd met het risico op subfertiliteit, nl. een odds ratio van 1,73 (95% BI: 0,60 – 4,88), maar deze relatie was niet significant (p=0,31).

6

p=0,31

p=0,62

p=0,56

p=0,40

p=0,94

Odds ratio

5 4 3

2

1,72

1

0,82

0,86

0,75

0,94

0 urinair cadmium

bloed cadmium

bloed lood

bloed mangaan

bloed koper

Cd in urine Cd in bloed Pb in bloed Mn in bloed Cu in bloed P25 168 0,14 15,8 6,70 746 P75 398 0,35 27,6 9,60 857 IQR 230 0,21 11,8 2,90 110 e e P25: 25 percentiel; P75: 75 percentiel; IQR: interkwartiel range; Cd: cadmium, Pb: lood; Mn: mangaan; Cu: koper. Alle analyses zijn gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, passief roken en opleidingsniveau; analyse van urinair cadmium is bijkomend gecorrigeerd voor urinair creatinine.

Figuur 4: Verhoging in risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie zware metalen in bloed of urine met 1 interkwartiel range (IQR)

De associatie tussen persistente gechloreerde stoffen en subfertiliteit wordt gegeven in Figuur 5. De odds ratio voor de som van de merker PCB’s (som van PCB138, 153 en 180) lag zeer dicht in de buurt van 1 wat betekent dat er geen verhoogde kans is op subfertiliteit. Uit in vitro onderzoek blijft dat de individuele PCB congeneren in verschillende mate een oestrogene of anti-androgene activiteit kunnen hebben (Hansen 171-89). Daarom werden er ook odds ratio’s berekend voor de aparte PCB congeneren (Figuur 6). Voor alle PCB’s lag de odds ratio dicht bij 1; de resultaten waren niet significant. Voor de gechloreerde pesticiden HCB, oxychloordaan en trans-nonachlor (Figuur 5) lagen de odds ratio’s hoger dan 1, wat wil zeggen dat blootstelling geassocieerd is met een groter risico op subfertiliteit. Er was een duidelijke trend voor een toegenomen risico op subfertiliteit bij blootstelling aan HCB (odds ratio (95% BI): 1,67 (0,88 – 3,18); p=0,12) en trans-nonachlor (odds ratio (95% BI): 2,87 (0,94 – 8,73); p=0,06). Er werd een significant verhoogde kans op subfertiliteit geobserveerd bij hogere blootstelling aan oxychlordaan (odds ratio (95% BI): 1,98 (1,07 – 3,69);

22

p=0,73 p=0,12 p=0,03 p=0,06 p=0,99 p=0,30

p=0,12 p=0,07

2,87 1,98

1,59

PCDD/F's

0,45

dl-PCB's

0,74

DDT

p,p'-DDE

TN

1,00

OXC

1,14

1,67

HCB

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

som PCB's

Odds ratio

p=0,03). De odds ratio’s van de DDT metabolieten - p,p’-DDE en p,p’-DDT - lagen dicht bij 1. Er werd dus geen relatie geobserveerd tussen blootstelling aan DDT en subfertiliteit. Voor de Calux assay (Figuur 5) was er een opvallend verschil in effect tussen de fractie dioxineachtige PCB’s en de fractie dioxines en furanen. De odds ratio voor de dioxine-achtige PCB’s bedroeg 0,45 (p=0,12), dit wil zeggen dat er bij een stijging van de Calux waarde van 0,05 pg BEQ/g serum naar 0,08 pg BEQ/g serum 55% minder kans was op subfertiliteit. Voor de dioxines en furanen ging de associatie in de omgekeerde richting: bij een stijging van de Calux waarde van 0,16 pg BEQ/g serum naar 0,235 pg BEQ/g serum was er een grotere kans op subfertiliteit, nl. een odds ratio van 1,59 (95% BI: 0,96-2,65); p=0,07). Beide Calux resultaten tonen een tegengestelde trend, maar geen van beide biomerkers waren significant geassocieerd met het risico op subfertiliteit.

som HCB oxy T-nona p,p’p,p’Calux Calux PCB’s chlordaan chloor DDE DDT dl-PCB’s PCDD/F’s P25 261 32,0 13,0 5,0 239 10,0 0,050 0,160 P75 525 71,0 26,0 19,0 656 25,0 0,080 0,235 IQR 264 39,0 13,0 15,0 417 15,0 0,030 0,074 e e P25: 25 percentiel; P75: 75 percentiel; IQR: interkwartiel range; som PCB’s = som PCB 138, 153 en 180; PCB: polygechloreerde biphenyl; HCB: hexachlorobenzeen; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; dl-PCB’s: dioxine-achtige PCB’s; PCDD/F’s: polygechloreeerde dibenzodioxines en dibenzofuranen. Alle analyses zijn gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en bloedvet.

Figuur 5: Verhoging in risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie van gechloreerde persistente stoffen in het serum met 1 interkwartiel range (IQR)

23


4

p=0,44 p=0,59 p=0,67 p=0,69 p=0,90 p=0,97 p=0,91 p=0,92 p=0,84

Odds ratio

3

2 1,41

1

1,20

1,16

1,16

0,97

1,01

1,04

1,05

0,95

PCB187

PCB183

PCB180

PCB170

PCB156

PCB153

PCB138

PCB118

PCB99

0

PCB99 PCB118 PCB138 PCB153 PCB156 PCB170 PCB180 PCB183 PCB187 P25 10 15 66 117 14 37 73 5 19 P75 26 35 136 237 26 75 155 18 41 IQR 15 20 70 120 12 38 82 13 22 e e P25: 25 percentiel; P75: 75 percentiel; IQR: interkwartiel range; PCB: polygechloreerde biphenyl Alle analyses zijn gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en bloedvet.

Figuur 6: Verhoging in risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie serum PCB’s met 1 interkwartiel range (IQR)

De gebromeerde vlamvertragers BDE47 en BDE153 kwamen in voldoende hoge concentratie voor om als continue merkers te beschouwen. De odds ratio voor beide merkers lag dicht bij 1, d.w.z. dat blootstelling niet geassocieerd was met een hoger risico op subfertiliteit (Figuur 7). Voor BDE28 (1 meetbare waarde in de totale groep) en BDE 183 (geen meetbare waarden) kon geen statistische analyse worden uitgevoerd. Voor de overige BDE’s (BDE99, 100, 154 en 209) en HBCD was de detectiefrequentie laag, maar er waren wel tussen 4,7% en 36,5% van de individuen met een meetbare waarden. Voor deze biomerkers werd de analyse binair uitgevoerd, d.w.z. er werd nagegaan of het hebben van meetbare waarden (>kwantificatielimiet, LOQ) geassocieerd was met een verhoogd risico op subfertiliteit. Detecteerbare concentraties van BDE209 in serum waren geassocieerd met 7,2 maal meer kans op subfertiliteit (odds ratio (95% BI): 7,22 (1,03 – 50,62); p=0,04). Een voorzichtige interpretatie is wel nodig omwille van het zeer grote betrouwbaarheidsinterval, en bijgevolg relatief grote onzekerheid op het resultaat. Voor de andere BDE’s werd geen verhoogd risico vastgesteld.

24

10

p=0,52

p=0,82

p=0,41

9

p=0,92

p=0,70 p=0,047 p=0,57

Odds ratio

8 7,22

7

(95% BI: 1,03 - 50,6)

6 5 4 3

2 1

1,25

0,95

0,91 0,39

0

BDE47 BDE153

0,80

0,65

BDE99 BDE100 BDE154 BDE209 HBCD * * * * *

BDE47 BDE153 BDE99 BDE100 BDE154 BDE209 HBCD P25 10 15 LOQ: LOQ: LOQ: LOQ: LOQ: P75 26 35 2 ng/l 2 ng/l 2 ng/l 40 ng/l 15 ng/l IQR 15 20 e e * binaire analyses:
Figuur 7: Verhoging in risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie aan gebromeerde vlamvertragers (PBDE’s en HBCD) in serum met 1 interkwartiel range (IQR)

25


Odds ratio

3,0

p=0,81 p=0,60 p=0,64 p=0,50 p=0,92 p=0,53 p=0,78

2,0

1,27

1,0

0,94

1,09

1,03 0,84

0,83

0,80

0,0 MEHP

5OHMEHP

5oxoMEHP

MBP

MBzP

MEP

MiBP

MEHP

5OH5oxoMBP MBzP MEP MiBP MEHP MEHP P25 1,5 5,8 4,1 12 2,1 19 29 P75 5,8 19,0 14,0 38 9,5 106 106 IQR 4,3 13,2 9,9 26 7,4 87 80 e e P25: 25 percentiel; P75: 75 percentiel; IQR: interkwartiel range; MEHP: mono-2-ethylhexyl ftalaat; 5OHMEHP: mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl ftalaat; 5oxo-MEHP: mono-2-ethyl-5oxohexyl ftalaat; MBP: mono-nbutyl ftalaat; MBzP: mono benzyl ftalaat; MEP: mono-ethyl ftalaat; MiBP: mono-isobutyl ftalaat. Alle analyses zijn gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en urinair creatinine.

Figuur 8: Verhoging in risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie ftalaatmetabolieten in urine met 1 interkwartiel range (IQR)

Blootstelling aan ftalaten was geassocieerd met niet significante odds ratio’s, meestal lager dan 1 (Figuur 8) wat betekent dat er geen associatie werd gevonden tussen huidige blootstelling aan ftalaten en subfertiliteit. Ook de biomerkers voor blootstelling aan bisfenol A, triclosan en perfluors – die eveneens kortdurende blootstelling weerspiegelen - waren niet significant geassocieerd met fertiliteitsproblemen (Figuur 9).

26

Odds ratio

3,0

p=0,55

p=0,98

p=0,32

p=0,40

2,0

1,0

1,17 0,99 0,72

0,70

0,0 BPA

TCS

PFOS

PFOA

BPA TCS PFOS PFOA P25 0,95 0,5 7,9 2,56 P75 2,92 8,2 14,3 3,78 IQR 1,97 7,7 6,4 1,22 e e P25: 25 percentiel; P75: 75 percentiel; IQR: interkwartiel range; BPA: bisfenol A; TCS: triclosan; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur Alle analyses zijn gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau; analyse van BPA en TCS is bijkomend gecorrigeerd voor urinair creatinine.

Figuur 9: Verhoging in risico op subfertiliteit bij mannen bij toename van concentratie bisfenol A in urine, triclosan in urine of PFOS/PFOA in serum met 1 interkwartiel range (IQR)

3.2.3.

RELATIE TUSSEN BLOOTSTELLINGMERKERS EN SPERMA-ANALYSES IN MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE

De indeling van cases en controles gebeurde op basis van Total Motile Count (TMC) en is zowel gebaseerd op spermaconcentratie als op motiliteit. Om een beter inzicht te krijgen in mogelijke mechanismen, is het ook relevant om de relatie te bestuderen tussen polluenten en de afzonderlijke parameters van sperma-analyse, nl. concentratie, motiliteit en morfologie. Van de morfologie meting is geweten dat de inter-laboratorium variabiliteit vrij groot kan zijn. Er wordt microscopisch gemeten hoeveel % van de spermatozoa een normale/abnormale morfologie heeft. Deze manier van scoren is sterk onderhevig aan inter-observer variabiliteit. Daarom werd bij iedere patiënt bij één van de spermacollecties die gebeurde in het kader van deze studie een dubbele voorbereiding gedaan voor de morfologie telling (aanmaak van extra glaasje voor telling). De meting van de morfologie gebeurde enerzijds via de normale routine in ieder ziekenhuis, en anderzijds werd er een dubbel gemeten in een referentielaboratorium. Het laboratorium van het Ziekenhuis Oost-Limburg (Genk) werd aangeduid als referentielab. Zij voerden de extra morfologie

27


metingen uit van de stalen van UZ Brussel, UZ Gent en UZ Leuven. De resultaten van de vergelijkende analyse worden weergegeven in Figuur 10. In totaal werden 68 stalen dubbel gemeten. Voor ieder staal werd bepaald hoeveel % van de spermatozoa een normale morfologie hadden. Het % normalen bedroeg gemiddeld (SD) 8,7% (12,2%) in de stalen die in de centra werden gemeten tegenover 5,0% (3,8%) in de centraal gemeten stalen. Het verschil tussen beide metingen was hoog significant (signed rank test: p<0,001). Dit betekent dat er een grote variabiliteit was in de meting van de morfologie tussen de verschillende laboratoria, en dat het dus niet te verantwoorden was om de metingen van verschillende laboratoria samen te voegen in een gemeenschappelijke regressie analyse. Daarom werd beslist om voor de morfologie gebruik te maken van de centraal geanalyseerde data.

morfologie (% normale) - in aparte centrum gemeten

25

20 y = 0.642x + 5.4936 R² = 0.0393

15

10

5

0 0

5

10

15

20

25

morfologie (% normale) - centraal gemeten Figuur 10: Vergelijking tussen morfologie, gemeten in de afzonderlijke centra en gemeten in het referentiecentrum (ZOL). De centra worden niet apart voorgesteld maar als 1 groep beschouwd.

De relatie tussen blootstelling aan polluenten en elk van de sperma parameters wordt gegeven in Tabel 7. In de tabel wordt de estimate (β coëfficiënt) van de regressievergelijking tussen polluent en sperma parameter gegeven, na correctie voor vooraf gedefinieerde covariaten. Voor spermaconcentratie en motiliteit werden de data van 2 sperma-analyses geanalyzeerd gebruik makend van lineaire mixed modellen die rekening houden met het feit dat de 2 sperma-analyses van eenzelfde patient gecorreleerd zijn. Voor de morfologie werden de data van het centraal geanalyseerde staal gebruikt, en werden multipele lineaire regressie analyses uitgevoerd. Er werd een significant negatief effect gevonden van blootstelling aan HCB op spermaconcentratie; een significant negatief effect van blootstelling aan oxychlordaan op de spermaconcentratie en de spermamotiliteit en een significant negatieve relatie tussen blootstelling aan BDE209 en de spermamotiliteit (Tabel 7). Een stijging van 50% van de serum concentratie van HCB – bijv. van 43 ng/l, het gemiddelde in de controlegroep, naar 64 ng/l – was geassocieerd met een vermindering van de spermaconcentratie met 28% (p=0,008), en dit na correctie voor leeftijd, BMI, roken, 28

bloedvet, periode van abstinentie, pH van het sperma en volume van sperma. Na correctie voor dezelfde factoren, was een toename van de serum concentratie van oxychlordaan met 50% – bijv. van 17 ng/l naar 25 ng/l – geassocieerd met een verminderde spermaconcentratie van 33% (p=0,02) en een verminderde sperma motiliteit van 5% (p=0,049). Meetbare concentraties van BDE209 in het serum was geassocieerd met een 35% mindere spermakwaliteit (p=0,02) in vergelijking met serum concentraties van BDE209 onder de kwantificatielimiet. In deze analyse werd gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, bloedvet, periode van abstinentie, pH van het sperma en volume van het sperma.

29


Tabel 7: Relaties tussen blootstellingmerkers en spermaparameters in mannelijke case-control studie Blootstelling a

Cadmium in urine (ng/l) Cadmium in bloed (µg/l) Lood in bloed (µg/l) Mangaan in bloed (µg/l) Koper in bloed (µg/l) Som PCB’s (ng/l) Hexachlorobenzeen (ng/l) Oxychlordaan (ng/l) trans-nonachlor (ng/l) p,p’-DDE (ng/l) p,p’-DDT (ng/l) Calux, dl-PCB’s (pg BEQ/g) Calux, PCDD/F’s (pg BEQ/g) BDE47 (ng/l) BDE153 (ng/l) BDE99, % > LOQ BDE100, % > LOQ BDE154, % > LOQ BDE209, % > LOQ HBCD, % > LOQ MEHP (µg/l) 5-OH-MEHP (µg/l) 5-oxo-MEHP (µg/l) MnBP (µg/l) 30

SPERMACONCENTRATIE MOTILITEIT estimate (SE) voor p-waarde estimate (SE) voor p-waarde b b 1-unit stijging 1-unit stijging Zware metalen +0,71 (0,51) 0,17 +4,34 (7,90) 0,59 +0,44 (0,37) 0,24 -4,25 (5,64) 0,45 +0,44 (0,50) 0,38 +6,52 (7,38) 0,38 +0,06 (0,94) 0,95 +18,9 (13,7) 0,17 +0,01 (0,01) 0,70 +0,07 (0,04) 0,07 Gechloreerde persistente polluenten +0,25 (0,52) 0,64 -5,94 (7,81) 0,45 -0,80 (0,29) 0,008 -5,81 (4,55) 0,21 -0,98 (0,40) 0,02 -12,3 (6,10) 0,049 -0,31 (0,35) 0,38 -3,50 (5,23) 0,51 -0,38 (0,29) 0,20 -6,07 (4,36) 0,17 -0,18 (0,30) 0,55 -1,45 (4,47) 0,75 -0,41 (0,80) 0,61 -2,30 (12,2) 0,85 -0,57 (0,38) 0,14 -2,60 (5,97) 0,67 Gebromeerde persistente polluenten -0,18 (0,29) 0,54 -3,16 (4,30) 0,46 +0,52 (0,42) 0,22 +1,26 (6,33) 0,84 +0,67 (0,64) 0,30 -1,79 (9,99) 0,86 +0,35 (1,04) 0,74 +9,52 (16,1) 0,56 +0,34 (0,45) 0,45 +5,19 (6,75) 0,45 -1,35 (1,00) 0,18 -35,3 (14,1) 0,02 +0,66 (0,84) 0,44 +12,6 (12,6) 0,34 Plastic componenten: ftalaatmetabolieten in urine -0,03 (0,26) 0,84 +0,77 (2,32) 0,74 +0,03 (0,26) 0,92 +1,21 (3,84) 0,76 +0,18 (0,28) 0,53 +1,73 (4,15) 0,68 +0,24 (0,35) 0,49 +4,21 (5,20) 0,42

MORFOLOGIE estimate (SE) voor p-waarde 1-unit stijging c -1,11 (0,75) -0,49 (0,54) +0,41 (0,62) -0,67 (1,13) -0,01 (0,01)

0,14 0,36 0,50 0,55 0,17

+0,73 (0,61) -0,80 (0,51) -0,13 (0,50) +0,23 (0,46) -0,04 (0,36) -0,07 (0,41) +1,35 (1,25) -0,99 (0,72)

0,23 0,12 0,80 0,61 0,92 0,86 0,28 0,17

-0,05 (0,47) +0,38 (0,57) +0,53 (1,10) -0,82 (1,09) +0,80 (0,70) -0,34 (1,07) +0,52 (1,02)

0,91 0,51 0,63 0,45 0,26 0,75 0,61

+0,03 (0,25) -0,13 (0,40) -0,12 (0,42) -0,25 (0,42)

0,92 0,75 0,78 0,55

MBzP (µg/l) MEP (µg/l) MiBP (µg/l) Bisfenol A in urine (µg/l) Triclosan in urine (ng/l) PFOS in serum (µg/l) PFOA in serum (µg/l)

-0,03 (0,17) +0,24 (0,19) +0,16 (0,24)

0,88 -1,44 (2,57) 0,58 0,21 +4,62 (2,78) 0,10 0,53 +4,81 (3,59) 0,19 Andere plastic componenten -0,08 (0,22) 0,71 -0,99 (3,21) 0,76 Componenten van persoonlijke hygiëne producten -0,08 (0,08) 0,33 -0,45 (1,20) 0,71 Perfluorderivaten +0,50 (0,53) 0,34 +14,0 (7,39) 0,07 +0,22 (0,22) 0,31 +2,37 (3,20) 0,46

+0,30 (0,27) +0,05 (0,24) +0,10 (0,33)

0,26 0,85 0,75

-0,30 (0,37)

0,42

+0,01 (0,13)

0,99

+0,56 (0,51) +0,24 (0,25)

0,28 0,35

Resultaten met p<0,10 in vetgedrukt; resultaten met p<0,05 in vetgedrukt en rood. a alle blootstellingsmerkers op ln-schaal, behalve Cu in bloed en PFOA in serum op oorspronkelijke schaal; BDE99, 100, 154, 183, 209 en HBCD op binaire schaal. b gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, periode abstinentie, volume ejaculatie, pH sperma, plus creatinine voor urinaire merkers en bloedvet voor persistente stoffen in serum. c gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, plus creatinine voor urinaire merkers en bloedvet voor persistente stoffen in serum. PCB: polygechloreerde biphenyl; som PCB’s = som van merker PCB138, 153 en 180; dl-PCB’s: dioxine-achtige PCB’s; PCDD/PCDF: polygechloreerde dibenzodioxines en dibenzofuranen; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; MEHP: mono-2-ethylhexyl ftalaat; 5OH-MEHP: mono-2-ethyl-5hydroxyhexyl ftalaat; 5oxo-MEHP: mono-2-ethyl-5oxohexyl ftalaat; MBP: mono-n-butyl ftalaat; MBzP: mono benzyl ftalaat; MEP: mono-ethyl ftalaat; MiBP: monoisobutyl ftalaat; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur.

31


3.2.4.

RELATIE TUSSEN BLOOTSTELLINGSMERKERS EN GESLACHTSHORMONEN IN MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE

Simultaan met de bepaling van de blootstellingsmerkers in bloed en urine, werden ook serumstalen genomen voor de meting van geslachtshormonen, nl. totaal testosteron, vrij testosteron, oestradiol (E2), vrij oestradiol (fE2), SHBG, LH, FSH en inhibine B. Een volledig overzicht van de assocaties tussen iedere blootstellingsmerkers en elk van de serum hormonen wordt gegeven in Tabel 8. Voor iedere berekende relatie wordt de β-coëfficiënt (SE) en p-waarde uit de multipele lineaire regressie modellen gegeven, na correctie voor vooraf gedefinieerde confounders. Vanuit de significante relaties uit Tabel 8 worden de effect sizes berekend, en deze worden samengevat in Tabel 9. Voor de zware metalen werd enkel een borderline significante (p=0,03) en positieve relatie gevonden tussen urinair cadmium en inhibine B. Inhibine B geeft een maat voor de testisfunctie. Bij de gechloreerde POP’s werden significante associaties geobserveerd voor hexachlorobenzeen (HCB) en de DDT metabolieten, maar in tegengestelde richting. Serum concentraties van HCB waren significant positief geassocieerd met SHBG en negatief met vrij testosteron en vrij oestradiol. P,p’-DDE (p=0,08) en p,p’-DDT (p=0,01) waren negatief geassocieerd met SHBG en p,p’DDE vertoonde een positieve relatie met vrij testosteron en vrij oestradiol. Voor de gebromeerde POP’s werden (op één uitzondering na) consistente relaties geobserveerd, nl. een significant negatieve relatie tussen BDE47, 100 en 209 met serum concentraties van SHBG; een significant positieve relatie tussen BDE153 en 154 met serum concentraties van vrij testosteron; een significant positieve relatie tussen BDE153 en 154 met serum concentraties van vrij oestradiol. Voor totaal testosteron werden tegenstrijdige resultaten gevonden, nl. een positieve relatie met BDE154 en een negatieve relatie met BDE209. De ftalaatconcentraties in urine vertoonden weinig significante relaties met de hormoonconcentraties. MEHP in urine was negatief geassocieerd met inhibine B concentraties in serum; MiBP in urine vertoonde een positieve associatie met serum niveau’s van LH, maar deze relatie was slechts borderline significant (p=0,03). Triclosan in urine was borderline significant geassocieerd met LH (positieve relatie; p=0,048) en met inhibine B (negatieve relatie; p=0,046). Ook voor bisfenol A in urine werd een borderline significante relatie (p=0,04) geobserveerd, nl. een negatieve associatie met totaal testosteron in serum.

32

Tabel 8: Relaties tussen blootstellingsmerkers en geslachtshormonen in mannelijke case-control studie: estimates (β-coefficiënt), standard error (se) en pwaarde uit multipele lineaire regressie analyses Blootstelling

SHBG a β se p

TESTO b β se p

0.46 0.06 0.99 0.05 0.34 -0.07 0.92 -0.03 0.32 0.00

fTESTO b β se p

U. Cadmium (ng/l) B. cadmium (µg//l) B. lood (µg/l) B. mangaan (µg/l) B. koper (µg/l)

-0.06 0.00 -0.06 -0.01 0.00

0.08 0.05 0.06 0.12 0.00

0.07 0.05 0.05 0.10 0.00

0.34 0.11 0.31 0.01 0.17 0.17 0.79 -0.04 0.05 0.00

0.13 0.09 0.10 0.19 0.00

Som PCB’s (ng/l) HCB (ng/l) Oxychlordaan (ng/l) t-nonachlor (ng/l) p,p’-DDE (ng/l) p,p’-DDT (ng/l) dl-PCB’s (pg BEQ/g) PCDD/F’s (pg BEQ/g)

0.00 0.19 -0.04 -0.03 -0.07 -0.10 0.13 0.05

0.07 0.05 0.05 0.05 0.04 0.04 0.12 0.07

0.06 0.05 0.05 0.04 0.03 0.04 0.10 0.06

0.89 0.11 0.11 -0.24 0.18 -0.15 0.25 0.05 0.76 0.14 0.37 0.04 0.41 0.11 0.21 -0.03

0.11 0.09 0.09 0.08 0.06 0.07 0.18 0.12

BDE47 (ng/l) BDE153 (ng/l) BDE99, % > LOQ BDE100, % > LOQ BDE154, % > LOQ BDE209, % > LOQ HBCD, % > LOQ

-0.11 0.07 -0.13 -0.31 0.12 -0.42 0.16

0.05 0.04 0.01 0.06 0.29 0.10 0.11 0.26 0.02 0.11 0.01 -0.05 0.07 0.10 0.18 0.10 <0.001 -0.27 0.11 0.15 0.13

0.05 0.88 0.05 0.06 0.10 0.86 0.10 0.57 0.06 0.002 0.09 0.003 0.09 0.15

MEHP (µg/l) 5-OH-MEHP (µg/l) 5-oxo-MEHP (µg/l) MnBP (µg/l) MBzP (µg/l) MEP (µg/l) MiBP (µg/l)

0.04 -0.04 -0.02 -0.05 0.01 -0.01 -0.02

0.03 0.04 0.04 0.04 0.03 0.02 0.04

0.15 0.35 0.60 0.26 0.85 0.54 0.49

0.00 -0.03 -0.03 -0.03 -0.02 0.01 0.00

0.02 0.03 0.04 0.03 0.02 0.02 0.03

0.86 -0.05 0.41 0.09 0.45 0.07 0.36 0.08 0.37 0.00 0.64 0.00 0.87 0.10

0.04 0.07 0.07 0.06 0.05 0.04 0.06

Bisfenol A (µg/l)

-0.02

0.04

0.57 -0.07

0.03

0.04 -0.05

0.06

E2 c β se p Zware metalen

0.40 0.08 0.90 0.05 0.10 -0.05 0.85 0.08 0.73 0.00

0.05 0.03 0.04 0.07 0.00

0.12 0.12 0.27 0.28 0.76

β

fE2 c se

0.12 0.01 0.23 0.07 0.00

0.15 0.10 0.12 0.21 0.00

p

β

LH c se

p

β

FSH c se

p

inhibine B c β se p

0.42 -0.07 0.94 0.07 0.05 -0.08 0.73 0.12 0.64 0.00

0.09 0.06 0.07 0.13 0.00

0.40 -0.09 0.24 -0.03 0.27 0.00 0.33 -0.17 0.34 0.00

0.11 0.08 0.09 0.17 0.00

0.41 0.22 0.68 0.01 0.99 -0.02 0.32 0.09 0.71 0.00

0.10 0.07 0.08 0.15 0.00

0.03 0.84 0.80 0.54 0.56

0.13 0.28 -0.09 0.11 0.002 0.00 0.11 0.24 -0.07 0.10 0.19 -0.08 0.07 0.01 -0.02 0.08 0.28 -0.02 0.21 0.84 -0.14 0.14 0.53 0.00

0.07 0.06 0.06 0.06 0.04 0.05 0.13 0.08

0.20 1.00 0.22 0.13 0.72 0.63 0.28 0.98

-0.14 0.10 -0.04 -0.10 -0.06 -0.03 -0.15 0.01

0.09 0.08 0.07 0.07 0.05 0.06 0.16 0.10

0.12 0.11 0.21 -0.05 0.61 -0.01 0.13 0.04 0.22 0.06 0.64 0.05 0.35 0.01 0.95 -0.08

0.08 0.07 0.07 0.06 0.05 0.05 0.14 0.09

0.17 0.51 0.82 0.51 0.23 0.30 0.93 0.35

0.06 0.07 0.13 0.13 0.08 0.12 0.12

0.77 0.17 0.13 0.28 0.20 0.26 0.54

-0.08 -0.13 -0.25 -0.13 -0.15 -0.21 -0.03

0.07 0.09 0.16 0.16 0.10 0.16 0.15

0.24 0.12 0.13 0.42 0.13 0.19 0.84

0.06 0.11 0.23 0.09 0.13 0.21 0.23

0.06 0.08 0.14 0.14 0.09 0.14 0.13

0.36 0.14 0.11 0.54 0.15 0.13 0.09

Gechloreerde persistente polluenten 0.97 0.001 0.49 0.60 0.08 0.01 0.26 0.49

0.01 0.08 -0.06 -0.05 -0.01 -0.03 0.08 0.08

0.31 0.01 0.01 0.01 0.10 -0.01 0.58 0.01 0.03 0.02 0.61 0.03 0.56 -0.01 0.80 0.03

0.04 0.04 0.03 0.03 0.02 0.03 0.07 0.05

0.87 0.14 0.89 -0.34 0.78 -0.12 0.74 0.13 0.36 0.19 0.23 0.09 0.85 0.04 0.45 -0.09

Gebromeerde persistente polluenten 0.10 0.33 0.00 0.25 0.35 0.03 0.06

0.09 0.10 0.18 0.18 0.11 0.18 0.17

0.25 0.001 0.99 0.17 0.003 0.85 0.74

0.02 0.04 0.11 0.06 0.05 0.08 0.01

0.03 0.04 0.07 0.07 0.05 0.07 0.07

0.50 0.11 0.28 0.35 0.12 0.08 0.44 0.34 0.31 0.28 0.23 0.35 0.89 -0.04

0.10 0.30 0.02 0.12 0.003 -0.10 0.21 0.70 -0.19 0.21 0.11 -0.14 0.13 0.04 -0.10 0.20 0.09 -0.14 0.20 0.86 0.07

Plastic componenten: ftalaatmetabolieten in urine 0.29 0.19 0.33 0.24 0.94 0.90 0.10

-0.01 -0.02 -0.02 0.00 0.01 0.02 -0.01

0.02 0.03 0.03 0.03 0.02 0.02 0.02

0.46 -0.06 0.46 0.11 0.39 0.09 0.94 0.12 0.72 0.03 0.24 0.01 0.82 0.11

0.05 0.08 0.08 0.07 0.05 0.04 0.07

0.27 0.02 0.14 0.01 0.27 0.01 0.10 0.02 0.57 -0.04 0.90 0.04 0.11 0.09

0.03 0.05 0.05 0.04 0.03 0.03 0.04

0.57 0.06 0.79 0.01 0.92 -0.02 0.57 -0.04 0.23 -0.06 0.15 0.04 0.03 0.04

0.04 0.06 0.06 0.06 0.04 0.03 0.05

0.10 0.93 0.76 0.50 0.12 0.28 0.37

-0.09 -0.06 -0.03 -0.03 0.01 -0.04 -0.04

0.03 0.05 0.06 0.05 0.04 0.03 0.04

0.01 0.29 0.55 0.60 0.80 0.23 0.42

0.07

0.79

0.04

0.49

0.06

0.83

0.00

0.05

0.94

Andere plastic componenten 0.43 -0.04

0.03

0.15 -0.02

0.03

0.01

33


Componenten van persoonlijke hygiëne producten Triclosan (µg/l)

-0.01

0.01

0.55

0.00

0.01

0.74

0.02

0.02

0.35

0.00

0.01

0.59

0.02

0.02

0.38

0.03

0.12 0.07

0.10 0.05

0.24 -0.05 0.18 -0.04

0.01 0.048

0.02

0.02

0.42 -0.03

0.02 0.046

0.45 -0.13 0.24 -0.05

0.08 0.04

0.11 0.23

0.08 0.04

Perfluroderivaten PFOS (µg/l) PFOA (µg/l)

-0.03 -0.03

0.06 0.03

0.56 -0.07 0.34 0.01

0.05 0.03

0.17 0.80

0.04 0.06

0.10 0.05

0.69 -0.02 0.21 0.01

0.04 0.02

0.70 0.64

0.07 0.03

0.12 0.07

0.11 0.08

Resultaten met p<0,10 in vetgedrukt; resultaten met p<0,05 in vetgedrukt en rood. a b gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken, nuchter (ja/neen) + bijkomend: creatinine voor urinaire metingen en bloedvet voor persistente polluenten in serum; gecorrigeerd c voor leeftijd, BMI, roken, bloedafname voor 11 uur (ja/neen) + bijkomend: creatinine voor urinaire metingen en bloedvet voor persistente polluenten in serum; gecorrigeerd voor leeftijd, BMI, roken + bijkomend: creatinine voor urinaire metingen en bloedvet voor persistente polluenten in serum SHBG: sex-hormone binding globuline in serum (nmol/l); TESTO: testosteron in serum (ng/dl); fTESTO: vrij testosteron in serum (ng/dl); E2: oestradiol in serum (pg/ml); vrij oestradiol in serum (pg/ml); LH: luteïniserend hormoon (mU/ml); FSH: follikel stimulerend hormoon (mU/ml); inhibine B in pg/ml. PCB: polygechloreerde biphenyl; som PCB’s = som van merker PCB138, 153 en 180; dl-PCB’s: dioxine-achtige PCB’s; PCDD/PCDF: polygechloreerde dibenzodioxines en dibenzofuranen; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; MEHP: mono-2-ethylhexyl ftalaat; 5OH-MEHP: mono-2-ethyl-5hydroxyhexyl ftalaat; 5oxo-MEHP: mono-2-ethyl-5oxohexyl ftalaat; MBP: mono-n-butyl ftalaat; MBzP: mono benzyl ftalaat; MEP: mono-ethyl ftalaat; MiBP: monoisobutyl ftalaat; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur.

34

Tabel 9: Significante relaties tussen blootstellingsmerkers en hormoonconcentraties bij totale groep (mannelijke cases en controles): verandering in homoonconcentratie bij een stijging van blootstellingsmerker met 50% (* factor 1,50) Blootstelling

Effect

Confounder

gemiddelde hormoonconc.

% verandering in hormoonconc. a,b

p-waarde

Zware metalen Urinair cadmium

inhibine B

leeftijd, BMI, roken, urinair creatinine

136 pg/ml

+ 9,4% a

0,02

leeftijd, BMI, roken, nuchter, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, nuchter, bloedvet

30,7 nmol/l

+ 7,9% a

0,0009

7,4 ng/dl

- 9,3% a

0,01

0,36 pg/ml

- 12,8% a

0,002

7,4 ng/dl

+ 5,9% a

0,03

0,36 pg/ml

+7,8% a

0,01

30,7 nmol/l

- 4,1% a

0,01

leeftijd, BMI, roken, nuchter, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, nuchter, bloedvet

30,7 nmol/l

- 4,3%a

0,04

7,4 ng/dl

+ 14,5% a

0,001

0,36 pg/ml

+ 15,3% a

0,003

457 ng/dl

- 48,1% b

0,04

30,7 nmol/l

- 26,8% b

0,005

Gechloreerde pesticiden in serum HCB SHBG HCB

vrij testosteron

HCB

vrij oestradiol

p,p’-DDE

vrij testosteron

p,p’-DDE

vrij oestradiol

p,p’-DDT

SHBG

Gebromeerde vlamvertragers in serum BDE47 SHBG BDE153

vrij testosteron

BDE153

vrij oestradiol

BDE28 (bin)

testosteron

BDE100 (bin)

SHBG

35

HOOFDSTUK 3 Mannelijke case-control studie: resultaten leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet leeftijd, BMI, roken, nuchter, bloedvet leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, bloedvet

457 ng/dl

+ 20,3% b

0,002

7,4 ng/dl

+ 41,3% b

0,003

0,36 pg/ml

+ 32,1% b

0,04

30,7 nmol/l

- 34,0% b

0,001

457 ng/dl

- 23,8% b

0,003

leeftijd, BMI, roken, urinair creatinine leeftijd, BMI, roken, urinair creatinine

4,4 mU/ml

+ 3,5% a

0,03

136 pg/ml

- 3,7% a

0,007

testosteron

leeftijd, BMI, roken, uur bloedname, urinair creatinine

457 ng/dl

- 2,6% a

0,04

Triclosan TCS

LH

4,4 mU/ml

+ 1,2% a

0,048

TCS

inhibine B

leeftijd, BMI, roken, urinair creatinine leeftijd, BMI, roken, urinair creatinine

136 pg/ml

- 1,4% a

0,046

BDE154 (bin)

testosteron

BDE154 (bin)

vrij testosteron

BDE154 (bin)

vrij oestradiol

BDE209 (bin)

SHBG

BDE209 (bin)

testosteron

Ftalaten MiBP

LH

MEHP

inhibine B

Bisfenol A BPA

a

b

% stijging/daling van hormoonconcentratie bij toename van polluentconcentratie met 50% (* factor 1,50); % stijging/daling van hormoonconcentratie voor polluentconcentratie boven LOQ tegenover polluentconcentratie onder LOQ. PCB: polygechloreerde biphenyl; HCB: hexachlorobenzeen; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; MEHP: mono-2-ethylhexyl ftalaat; MiBP: mono-isobutyl ftalaat; BPA: bisfenol A; TCS: triclosan; SHBG: sex-hormone binding globuline; LH: luteïneserend hormoon.

36

HOOFDSTUK 4. MANNELIJKE CASE-CONTROL STUDIE: DISCUSSIE

In deze studie werd bestudeerd of blootstelling aan endocrien verstorende stoffen geassocieerd is met verhoogd voorkomen van mannelijke subfertiliteit via een case-control design. De studiepopulatie bestond uit 77 cases en 86 controles, gedefinieerd op basis van de resultaten van minstens één (n=21) en bij voorkeur twee (n=142) sperma-analyses, genomen met minstens 1 week tussentijd. Subfertiliteit werd gedefinieerd als een Total Motile Count (TMC) van minder dan 20 miljoen/ml in minstens één spermastaal. Zowel bij cases als bij controles werd via humane biomonitoring (metingen in bloed en urine) de blootstelling gemeten aan PCB’s, gechloreerde pesticiden, dioxine-achtige stoffen (Calux assay), gebromeerde vlamvertragers, ftalaten, perfluorderivaten, bisphenol A en triclosan. Blootstelling aan gechloreerde pesticiden en aan gebromeerde vlamvertragers was gerelateerd met een hoger risico op subfertiliteit. Een stijging van de serumconcentratie van oxychlordaan met één interkwartiel range (IQR) was significant geassocieerd met een 98% hogere kans op subfertiliteit (odds ratio: 1,98 (95% CI: 1,07-3,69); p=0,03), na correctie voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en bloedvet. Voor twee andere gechloreerde pesticiden, nl. trans-nonachlor en hexachlorobenzeen (HCB), waren de respectieve odds ratio’s borderline non-significant, nl. 2,87 (95% BI: 0,94-8,73; p=0,06) en 1,67 (95% BI: 0,88-3,18; p=0,12). Een detecteerbare waarde van de gebromeerde vlamvertrager BDE209 in serum was geassocieerd met een odds ratio van 7,22 (95% BI: 1,03-50,6; p=0,047) op subfertiliteit, en dit na correctie voor leeftijd, BMI, roken, passief roken, opleidingsniveau en bloedvet. Analyse van de afzonderlijke spermaparameters (concentratie, motiliteit, morfologie) toonde een significant negatief verband tussen spermaconcentratie en serum concentraties van oxychlordaan en HCB, en een significant negatieve relatie tussen spermamotiliteit en serum concentraties van oxychlordaan en BDE209. De blootstellingsniveaus die geobserveerd worden in deze studie komen overeen met de te verwachten niveaus in Vlaanderen. Tabel 10 vergelijkt de blootstelling bij cases en controles met de Vlaamse referentiewaarden bij representatieve subgroepen van de populatie (Schoeters et al. 102-08). Omwille van verschillen in leeftijd (adolescenten) en geslacht (volwassen referentiegroep bevat zowel vrouwen als mannen) moet de interpretatie voor sommige biomerkers voorzichtig gebeuren. De blootstelling aan zware metalen in de case-control studie was zeer goed vergelijkbaar met volwassenen en jongeren van de algemene Vlaamse bevolking. De verschillen in bloed lood zijn vermoedelijk toe te schrijven aan een leeftijdseffect. De PCB’s en gechloreerde pesticiden in serum zijn persistente polluenten (halfwaardetijd van tientallen jaren) die zich opstapelen in het lichaam, en bijgevolg waren de niveaus bij de jong volwassen mannen in de case-control studie hoger in vergelijking met de adolescenten uit de Vlaamse referentiegroep. De Calux assay meet geen concentratie in het lichaam, maar een activiteit in het serum en is dus minder afhankelijk van de leeftijd. De gebromeerde polluenten zijn minder persistent (halfwaardetijd in grootte-orde van maanden tot enkele jaren) en dus vergelijkbaar voor de leeftijdsklassen. Opvallend is de hogere detectiefrequenties van BDE154 in de case-control studie in vergelijking met de Vlaamse referentie. De dectectielimiet is nochthans dezelfde (2 ng/l). Deze verschillen kunnen niet worden verklaard. Voor hexabromocyclododecaan (HBCD) bedraagt de detectielimiet 15 ng/l in de casecontrol studie en 20 ng/L in de Vlaamse referentie; dit verklaart bijgevolg de hogere detectiefrequentie in de case-control studie. De blootstelling aan ftalaten, bisfenol A, triclosan en perfluors bij de mannelijke subfertileitspatiënten was vergelijkbaar of iets lager dan de blootstelling bij de algemene Vlaamse bevolking. 37

HOOFDSTUK 4 Mannelijke case-control studie: discussie

Tabel 10: Blootstellingsmerkers in mannelijke controles en cases in vergelijking met Vlaamse referentiewaarden Blootstellingsmerkers

huidige studie CONTROLES (n=86) GM (95% BI)

Zware metalen cadmium in urine (ng/l) 260 (159 – 400) cadmium in bloed (µg/l) 0,23 (0,14 – 0,36) lood in bloed (µg/l) 21,6 (16,0 – 29,4) mangaan in bloed (µg/l) 8,2 (6,7 – 9,7) koper in bloed (µg/l) 790 (739 – 861) Persistente gechloreerde polluenten in serum som PCBs (ng/l) 406 (272 – 548) Calux: dl-PCB's (pg BEQ/g) 0,07 (0,05–0,08) Calux: PCDD/PCDF’s (pg BEQ/g) 0,19 (0,16 – 0,22) hexachlorobenzeen (ng/l) 42,6 (31,0 – 66,0) p,p'-DDE (ng/l) 418 (240 – 649) Persistente gebromeerde polluenten in serum BDE47 (ng/l) 2,5 (1,5 – 4,0) BDE153 (ng/l) 3,9 (3,0 – 5,0) BDE28, % >LOQ 0,0% BDE99, % >LOQ 9,4% BDE100, % >LOQ 8,2% BDE154, % >LOQ 36,5% BDE183, % >LOQ 0,0% BDE209, % >LOQ 4,7% HBCD, % >LOQ 11,8% Plastic componenten: ftalaatmetabolieten in urine MeHP (µg/l) 2,4 (1,3 – 5,1) 5-OH-MeHP (µg/l) 10,4 (5,4 – 19,0) 5-oxo-MeHP (µg/l) 7,4 (3,6 – 14,0)

38

huidige studie CASES (n=77) GM (95% BI)

Vlaamse referentiegroep volwassenen (20-40 jr.) (n=204) GM (95% BI) P90

Vlaamse referentiegroep jongeren (14-15 jr.) (n=210) GM (95% BI) P90

244 (156 – 380) 0,25 (0,15 – 0,40) 19,5 (14,5 – 23,6) 7,9 (6,6 – 9,6) 814 (760 – 861)

239 (224 – 256) -

444 -

0,21 (0,19 – 0,23) 14,8 (14,0 – 15,6) 9,7 (9,3 – 10,1) 790 (774 – 807)

0,73 27,6 13,6 938

349 (254 – 517) 0,06 (0,05–0,07) 0,22 (0,16 – 0,31) 52,0 (38,0 – 82,0) 425 (240 – 658)

-

-

217 (203 – 233) 0,11 (0,11 – 0,12) 0,38 (0,36 – 0,40) 36,5 (34,0 – 39,2) 307 (277 – 341)

401 0,19 0,58 64,1 868 7,4 5,9

12,4 75,1 116,5

2,2 (1,5 – 4,0) 3,3 (3,0 – 4,0) 1,3% 5,3% 6,6% 26,3% 0,0% 11,8% 5,3%

-

-

2,5 (2,2 – 2,7) 2,3 (2,1 – 2,5) 1,0% 8,1% 13,3% 2,9% 0,0% 5,7% 0,0%

2,5 (1,5 – 5,4) 10,5 (5,9 – 18,0) 7,3 (4,2 – 14,0)

2,7 (2,4 – 3,1) 13,2 ( 11,7 – 14,9) 16,1 (14,0 – 18,6)

9,9 35,7 71,9

3,6 (3,2 – 4,1) 21,9 ( 20,1 – 23,9) 29,2 ( 26,3 – 32,5)

Blootstellingsmerkers

MnBP (µg/l) MBzP (µg/l)

huidige studie CONTROLES (n=86) GM (95% BI) 18,7 (11,0 – 40,0) 4,6 (2,5 – 9,3)

Bisfenol A in urine (µg/l) 1,5 (0,8 – 2,3) Componenten van persoonlijke hygiën producten Triclosan in urine (ng/l) 2,7 (0,5 – 5,3) Perfluorderivaten PFOS in serum (µg/l) 10,5 (7,7 – 13,9) PFOA in serum (µg/l) 2,8 (2,4 – 3,7)

huidige studie Vlaamse referentiegroep CASES volwassenen (20-40 jr.) (n=77) (n=204) GM (95% BI) GM (95% BI) P90 20,9 (11,0 – 35,0) 30,6 (27,4 – 34,2) 84,5 4,6 (2,3 – 9,5) 19,3 (16,9 – 22,1) 71,6 Andere plastic componenten 1,7 (1,0 – 2,4) -

Vlaamse referentiegroep jongeren (14-15 jr.) (n=210) GM (95% BI) P90 39,2 (35,8 – 42,9) 87,6 32,2 (28,7 – 36,1) 109,4 2,2 (2,0 – 2,5)

6,6

2,0 (0,5 – 5,4)

-

-

2,2 (1,7 – 2,9)

91,5

8,7 (5,7 – 13,5) 2,6 (2,1 – 3,6))

12,6 (11,6 – 13,6) 1,5 (1,4 – 1,6)

24,8 2,6

-

-

PCB: polygechloreerde biphenyl; som PCB’s: som van PCB138, 153 en 180; dl-PCB’s: dioxine-achtige PCB’s; PCDD/PCDF: som van dioxines en furane; p,p’-DDE: metaboliet van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; MEHP: mono-2-ethylhexyl ftalaat; 5OH-MEHP: mono-2-ethyl-5-hydroxyhexyl ftalaat; 5oxo-MEHP: mono-2-ethyl5oxohexyl ftalaat; MBP: mono-n-butyl ftalaat; MBzP: mono benzyl ftalaat; MEP: mono-ethyl ftalaat; MiBP: mono-isobutyl ftalaat; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur.

39


De primaire onderzoeksvraag van deze studie is het bestuderen van het verband tussen blootstelling aan polluenten en spermakwaliteit. We vonden een significant negatief verband tussen spermakwaliteit en een aantal persistente polluenten, nl. de gechloreerde pesticiden – oxychlordaan, trans-nonachlor en hexachlorobenzeen – en de gebromeerde vlamvertrager BDE209. De biomerkers voor deze polluenten weerspiegelen cumulatieve blootstelling over meerdere of zelfs meerdere tientallen jaren. De gevonden associaties zijn dus consistent met de hypothese dat spermakwaliteit vroeg in het leven en zelfs prenataal bepaald wordt. Chlordaan is een mengsel van meer dan 140 isomeren van organochlorines. De meest voorkomende isomeren zijn trans-chlordaan, cis-chlordaan, trans-nonachlor, beta-chlordaan en heptachloor. Deze stoffen komen in de natuur niet voor, maar werden door de mens geproduceerd als pesticide. Ze werden in het verleden zeer uitgebreid gebruikt als insecticide in de landen tuinbouw en voor de bestrijding van termieten, maar zijn in België verboden sinds 1988. Chlordanen zijn vetoplosbaar en persistent (halfleven van 10 tot 20 jaar) waardoor ze bioaccumuleren in het milieu en in de mens. Ondanks een verbod van meer dan 20 jaar komen chlordanen nog in betekenisvolle concentraties voor in het milieu (voornamelijk in de bodem), in de voedselketen (voornamelijk in dierlijke, vette voedingsmiddelen) en in het menselijk lichaam. In deze studie werden trans-nonachlor en oxychlordaan in serum gemeten als biomerkers van blootstelling aan chlordanen. Deze biomerkers weerspiegelen geaccumuleerde blootstelling over een periode van meerdere (tientallen) jaren. Hexachlorobenzeen (HCB) is een schimmelwerend middel dat in het verleden vooral werd gebruikt op planten, zaden en granen. Het werd vroeger ook gebruikt in de productie van vuurwerk, munitie en synthetisch rubber. Momenteel is het gebruik van HCB verboden maar het komt nog in het milieu terecht als bijproduct in de chemische industrie, in afvalstromen van chlooralkali- en houtbeschermingsindustrie en bij de verbranding van huishoudelijk afval. HCB is zeer persistent en vetoplosbaar waardoor het in de voedselketen accumuleert. HCB dat in het verleden in onze omgeving terecht gekomen is of dat momenteel nog als afvalproduct in de omgeving wordt geloosd, wordt slechts heel traag afgebroken (halfwaardetijd: 3 tot 6 jaar). Het is als persistente component aanwezig in de voedselketen, de lucht, de bodem en het water. In de algemene bevolking gebeurt de voornaamste blootstelling aan HCB via de voeding, onder meer via (vette) vis, melk, zuivelproducten en vlees. HCB bij de mens stapelt zich voornamelijk op in het vetweefsel en wordt slechts heel traag afgebroken. Het gehalte aan HCB in het lichaam stijgt met de leeftijd. De halfwaardetijd in de mens bedraagt ongeveer 6 jaar. De meting van HCB in het serum geeft een maat voor geaccumuleerde blootstelling (tientallen jaren). De negatieve relatie tussen blootstelling aan gechloreerde pesticiden (significant voor oxychloor en trend voor trans-nonachlor en hexachlorobenzeen) en vruchtbaarheid die geobserveerd wordt in deze studie is in overeenstemming met de literatuur. In proefdieronderzoek werd aangetoond dat chlordaan kan interfereren met het steroid hormoon metabolisme (Cassidy et al. 326-37), mogelijk door inductie van het cytochroom oxidase enzyme (Welch et al. 234-46). Ook voor HCB werd in proefdieronderzoek aangetoond dat het de mannelijke fertiliteit kan verstoren na langdurige blootstelling, nl. via een verlaging van het serum testosteron gehalte in muizen (waarschijnlijk als gevolg van inductie van microsomale leverenzymen) en via histologische veranderingen van de testis bij varkens (Toppari et al. 741-803). Chlordaan en HCB worden beschouwd als een endocriene verstoorders (endocrine disruptors) die mogelijk bijdragen tot het testiculaire dysgenesie syndroom (testicular dysgenesis syndrome, TDS) in onze Westerse landen, nl. een gestegen prevalentie van verstoorde spermakwaliteit, aangeboren afwijkingen van de testis zoals crytorchidie en hypospadias en testiskanker (Sharpe and Skakkebaek 1392-95;Skakkebaek, Rajpert-De Meyts, and Main 972-78). Er zijn geen epidemiologische studies die een duidelijk verband leggen tussen blootstelling aan chlordaan/HCB en verminderde vruchtbaarheid of spermakwaliteit. Er zijn echter wel studies die de blootstelling 40

aan chlordaan en/of HCB in verband brengt met andere aandoeningen van het TDS. In een Deense case-control studie (Damgaard et al. 1133-38) werd vastgesteld dat jongens met cryptorchidie via de moedermelk significant hoger blootgesteld waren aan gechloreerde pesticiden (p=0,03 voor som van pesticiden), en specifiek aan trans-chlordaan (p=0,01). Deze resultaat werden echter niet bevestigd in een recente Amerikaanse case-control studie; hier werd ook geen relatie met hypospadias vastgesteld (Trabert et al.). Chlordaan en HCB werden in meerdere epidemiologische studies geassocieerd met testiskanker. In een retrospectieve case-control studie bij 61 patiënten met testiskanker en 58 leeftijd-gematchte controles (Hardell et al. 930-34) werd een significant hogere concentratie van cis-nonachlor gevonden in het serum van de kankerpatiënten in vergelijking met de gezonde controles; bovendien werd bij de moeders van de cases significant verhoogde waarden gemeten van serum PCB’s, hexachloorbenzeen, cis-nonachlor, trans-nonachlor en de som van chlordanen. Dit suggereert dat de negatieve gezondheidseffecten van gechloreerde pesticiden en andere gechloreerde polluenten reeds geïnitieerd worden in de prenatale periode. In een prospectieve Amerikaanse studie (McGlynn et al. 663-71) werd de concentratie van gechloreerde POP’s gemeten in serum stalen van vόόr de diagnose bij 754 testiskankerpatiënten en in serum stalen van 928 gezonde controles. Testiskanker was significant geassocieerd met een toegenomen blootstelling (toename van Q1 tot Q4) van p,p’-DDE (odds = 1,71 (1,23-2,38); p=0,0002), cis-chlordaan (odds = 1,56 (1,11-2,18); p=0,009), trans-chlordaan (odds = 1,46 (1,072,00); p=0,03). Blootstelling aan oxychlordaan was geassocieerd met een verhoogd risico voor seminoom (odds = 1,64 (1,04-2,60); p=0,048). In een vergelijkbare prospectieve Noorse studie (Purdue et al. 1514-19) werden 49 patiënten met testiskanker geïdentificeerd via het Noorse kankerregister en gematcht met 51 controles. Gechloreerde pesticiden en PCB’s werden gemeten in biobankstalen van deze groep. De verhoging van het risico op testiskanker was borderline niet significant voor een toename van de blootstelling van de 1e naar 3e tertiel, nl. odds = 2,2 (0,7-6,5) voor p,p’-DDE; 3,2 (0,6-16,8) voor oxychlordaan; 2,6 (0,7-8,9) voor trans-chlordaan en 2,0 (0,6-7,2) voor de som van chlordanen. Mogelijk zijn de resultaten niet significant omwille van een power probleem (kleine groepen). In een Italiaanse case-control studie (Giannandrea et al. 780-87) bij 50 cases en 48 controles was testis kanker significant geassocieerd met een hoger pesticidengebruik, gerapporteerd via vragenlijsten (odds = 3,23 (1,15-9,11); p<0,05) en hogere serum waarden voor de som van p,p’-DDE en HCB (odds = 3,15 (1,00-9,91); p<0,05). We kunnen dus besluiten dat de gevonden associatie tussen blootstelling aan chlordaan en HCB en verstoorde spermakwaliteit in overeenstemming is met mechanistische proefdierstudies en ook aansluit bij epidemiologische studies die een verhoogde blootstelling aan chlordaan en HCB in verband brengen met het testiculair dysgenesie syndroom, meer specifiek met cryptorchidie en testiskanker. Gebromeerde vlamvertragers zijn een groep van chemisch geproduceerde stoffen die gebruikt worden om producten minder brandbaar te maken. De voornaamste groepen van brandvertragers zijn polygebromeerde difenylethers (PBDE’s), hexabromocyclodecaan (HBCD) en tetrabromobisfenol A (TBBPA). Deze laatste wordt in de huidige studie niet gemeten. Polygebromeerde difenylethers (PBDE’s) vormen een klasse van chemisch zeer vergelijkbare structuren van gebromeerde koolwaterstoffen met twee tot tien broomatomen en worden voornamelijk gebruikt in textiel, plastic en elektronische apparatuur. De gemeten congeneren in deze studie behoren tot de tri-BDE’s (BDE28), tetra-BDE’s (BDE47), penta-BDE’s (BDE99, 100), hexaBDE’s (BDE153, 154), hepta-BDE’s (BDE183) en deca-BDE’s (BDE209). Gebruik van penta- en octaBDE in elektrisch en elektronisch materiaal is in de Europese unie verboden sinds 2006. DecaBDE mocht in Europa gebruikt worden tot 30 juni 2008. HBCD wordt voornamelijk toegepast in polystyreenschuim, dat gebruikt wordt als thermische isolatie in de bouwnijverheid. HBCD wordt ook in textiel bestemd voor het stofferen van meubels. Het Europees Chemicaliënagentschap (ECHA) heeft HBCD op de eerste kandidatenlijst van ‘zeer zorgwekkende stoffen’ gezet in het kader van de REACH-richtlijn. Gebromeerde vlamvertragers komen gemakkelijk vrij uit de producten 41


waarmee ze behandeld zijn en komen zo in de omgeving terecht. Ze binden aan stofdeeltjes en verspreiden zich in de lucht, water en bodem. De algemene bevolking wordt vooral blootsgesteld aan brandvertragers via het inademen van gecontamineerde binnenhuislucht en huisstof en via dierlijke voeding (opstapeling van deze persistente stoffen in de voedselketen). Bij kinderen is de opname van brandvertragers via stofdeeltjes door hand-aan-mond gedrag tien maal hoger dan bij volwassenen en bij zeer jonge kinderen is opname van gebromeerde vlamvertragers via de moedermelk een belangrijke blootstellingsweg. De halfwaardetijd verschilt naargelang de chemische structuur. Lagere PBDE’s met maar 1 tot 5 broomatomen worden als de gevaarlijkste beschouwd omdat de kleinere moleculen makkelijker worden opgenomen door het lichaam. Hoe minder broomatomen de PBDE’s bevatten, hoe langer de halfwaardetijd. De halfwaardetijden voor decaBDE in de mens bedraagt 11-18 dagen, maar dit loopt op tot 68-120 dagen voor octaBDE en 2 tot 26 jaar voor pentaBDE. De halfwaardetijd van HBCD wordt geschat op 64 dagen. Metingen van PBDE’s en HBCD in serum weerspiegelen dus middellange (weken/maanden) tot lange (jaren) termijn blootstelling. De negatieve relatie tussen blootstelling aan gebromeerde vlamvertragers (significant voor BDE209) en vruchtbaarheid die geobserveerd wordt in deze studie is in overeenstemming met de literatuur. In een aantal epidemiologische studies werd een verband geobserveerd tussen blootstelling aan gebromeerde vlamvertragers en sperma kwaliteit. In een Canadese studie bij 52 mannen uit, gerekruteerd via een fertiliteitskliniek, was de motiliteit van het sperma negatief gecorreleerd met serum concentraties van BDE47, BDE100 en de som van BDE; er werd geen verband gevonden met serum PCB’s of met p,p’-DDE (Abdelouahab, Ainmelk, and Takser 546-50). In een groep van gezonde, jonge mannen uit Japan (n=45) werd een significante en negatieve relatie geobserveerd tussen serum BDE153 en sperma concentratie (r= -0,84; p=0,002) en tussen serum BDE153 en testisvolume (r= -0,76; p=0,01) (Akutsu et al. 345-50). In een Nederlandse geboortecohorte werden gechloreerde en gebromeerde POP’s, gemeten in het serum van de moeders tijdens de 35 e week van de zwangerschap, in verband gebracht met penislengte en testisvolume op de leeftijd van 3 en 18 maanden (n=55). Serum BDE154 niveau’s correleerden positief met testisvolume op 18 maanden (p=0,34) (Meijer et al. 867-72). Er zijn dus geen specifieke humane studies die relaties rapporteren tussen BDE209 en spermakwaliteit. Hiervoor is echter wel evidentie in proefdieronderzoek. Tseng et al. toonde aan dat prenatale blootstelling aan hoge dosissen BDE209 (1500 mg/kg) geassocieerd was met verstoring van de testiculaire histopathologie, meer kopdefecten in het sperma, een kortere anogenitale afstand (anogenital distance, AGD) en meer chromatine DNA-schade bij de mannelijke nakomelingen in de muis (Tseng et al. 640-47). In dezelfde onderzoeksgroep werd aangetoond dat neonatale blootstelling aan BDE209 bij muizen resulteerde in cellulaire veranderingen van het sperma (mitochondriaal membraan potentiaal, amplitude van de laterale kopbewegingen en inductie van H2O2 productie), zonder effecten op concentratie, motiliteit of morfologie van het sperma (Tseng et al. 33-43). We kunnen dus besluiten dat de gevonden associatie tussen blootstelling aan de gebromeerde vlamvertrager BDE209 en verstoorde spermakwaliteit in overeenstemming is met proefdieronderzoek en ook aansluit bij epidemiologische studies die een verhoogde blootstelling aan verschillende vlamvertragers in verband brengen met verstoring van de spermakwaliteit of testisfunctie. De analyses van de hormoonconcentraties werden uitgevoerd op de totale groep van 163 patiënten. Bij cases was de serum concentratie van inhibine B significant lager in vergelijking met controles (p=0,001) en de serum concentratie van LH was significant hoger bij de cases (p=0,03). Indien hormoonconcentraties worden gerelateerd aan de blootstelling aan polluenten werden hogere urinaire waarden van ftalaatmetaboliet MiBP (maat voor blootstelling aan DiBP) en hogere

42

urinaire waarden van triclosan negatief geassocieerd met de serum concentratie van inhibine B. Inhibine B wordt geproduceerd door de Sertoli cellen en geeft een maat voor testistfunctie (zaadcelproductie). Effecten van polluenten op Sertoli cel functie zijn in proefdieronderzoek aangetoond voor ftalaten (Aydogan and Barlas 123-36); voor triclosan zijn er geen specifieke studies beschikbaar. De bevindingen van de hormoonconcentraties worden niet bevestigd in de resultaten van de spermakwaliteit: er werd namelijk geen associatie geobserveerd tussen blootstelling aan ftalaten of triclosan en spermakwaliteit, die gerelateerd is aan de inhibine B productie. Dit heeft mogelijk te maken met de design van de studie, met de power van de studie, of met het feit dat hormonale effecten zich manifesteren bij lagere concentraties dan effecten op spermakwaliteit. De LH concentraties was significant positief gecorreleerd met blootstelling aan DEHP (ftalaatmetaboliet MEHP in urine) en met blootstelling aan triclosan. Een mogelijke hypothese voor deze bevinding is dat ftalaten en triclosan een toxisch effect hebben op de Leydig cellen, wat – via een negatief feedback systeem – zou kunnen resulteren in een verhoging van LH concentraties. Zowel voor ftalaten (Wakui et al.;Forgacs et al. 391-402) als voor triclosan (Kumar, Balomajumder, and Roy 124-31) werden effecten op de Leydig cellen aangetoond in in vitro onderzoek. Het feit dat er geen effect op testosteron concentratie wordt geobserveerd, zelfs geen trend voor een negatieve relatie, is contradictorisch met bovenstaande resultaten. Op basis van de literatuur is er geen biologisch mechanisme beschreven dat deze effecten kan verklaren. Mogelijk heeft dit te maken met de design van de studie of een gebrek aan power. Biomerkers met een kort tot middellang halfleven zoals zware metalen, ftalaten, bisfenol A, triclosan en perfluors zijn enkel een goede maat voor de blootstelling in het verleden indien het blootstellingspatroon niet verandert doorheen de tijd. Voor deze ‘moderne’ polluenten is dit vermoedelijk niet het geval aangezien ze de laatste jaren sterk zijn toegenomen in het Westerse consumptiepatroon, dus de blootstelling van jong volwassen mannen is nu hoogstwaarschijnlijk groter dan bij de geboorte of tijdens de kindertijd. Bovendien verandert doorheen de jaren het metabolisme en het individueel gedrag van een individu waardoor biomerkers bij volwassenen geen goede maat zijn voor pre- en perinatale blootstelling. Dit kan verklaren waarom er geen verband gevonden wordt tussen blootstelling aan polluenten met korte of middellang halfleven en verstoorde spermakwaliteit, maar wel met hormoonconcentraties.

43

HOOFDSTUK 5 Vrouwelijke case-control studie: interim analyse

HOOFDSTUK 5. VROUWELIJKE CASE-CONTROL STUDIE: INTERIM ANALYSE

5.1. 5.1.1.

METHODE REKRUTERING

Het rekruteringsschema van de vrouwelijke case-control studie wordt samengevat in Figuur 11Figuur 1.

Inclusiecriteria: ♀, leeftijd < 40 jr., BMI ≤ 35 kg/m², primaire zwangerschap (G0), geïnformeerd toestemmingsformulier

Case: onverklaarde subfertiliteit (>12 maanden)

Selectie criterium: fertiliteit

Controle: normale fertiliteit

Figuur 11: Schematisch overzicht van rekrutering van de vrouwelijke case-control studie  Inclusiecriteria Voor alle vrouwelijke deelnemers in de studie waren de inclusiecriteria: - Jonger zijn dan 40 jaar; - BMI ≤ 35 kg/m²; - primaire zwangerschap (G0), d.w.z. nooit zwanger geweest (geen bewezen zwangerschap door vaststellen van vruchtzak, curettage, echografie of overtuigend verhaal van patiënt), tenzij biochemisch; - voldoen aan selectiecriteria voor case of selectiecriteria voor controle op basis van fertiliteit; - ‘Informed consent’ (IC) geven; - Nederlands-, Frans- of Engelstalige vragenlijst kunnen invullen (NB: nationaliteit is geen inclusiecriterium; buitenlandse patiënten worden dus ook toegelaten op voorwaarde dat ze voldoende Nederlands, Frans of Engels spreken).

44

 Selectie van cases Als ‘cases’ werden vrouwen met onverklaarde subfertiliteit geselecteerd, namelijk: - vrouwen met een voorgeschiedenis van minstens 12 maanden subfertiliteit; - met een regelmatige menstruele cyclus, i.e. frekwentie van menstruatie om de 24 tot 38 dagen, met een cyclus-tot-cyclus variatie van 2 tot maximum 20 dagen tijdens de laatste 12 maanden (Fraser, Critchley et al. 2007); - met 2 ovaria; - met een normaal klinisch onderzoek; - met een normale echografie; Indien er data beschikbaar zijn van een uitgevoerde laparoscopie, worden deze opgenomen in het studiedossier. Laparoscopiegegevens zullen gebruikt worden om de cases en controles te vergelijken, maar ze zijn niet noodzakelijk als inclusiecriterium. - en waarvan een normale spermakwaliteit bij de partner is aangetoond (minstens 20 miljoen zaadcellen per milliliter, minstens 50% voorwaartse progressiviteit) Interpretatie van spermakwaliteit gebeurt op basis van 1 sperma-analyse in het labo andrologie/labo Fertiliteitscentrum van UZ Brussel, UZ Gent of UZ Leuven. Sperma morfologie wordt niet in rekening gebracht.  Selectie van controles Als controles werden vrouwen met normale fertiliteit geselecteerd, namelijk: - vrouwen zonder problemen van subfertiliteit; - met een regelmatige menstruele cyclus, i.e. frekwentie van menstruatie om de 24 tot 38 dagen, met een cyclus-tot-cyclus variatie van 2 tot maximum 20 dagen tijdens de laatste 12 maanden (Fraser, Critchley et al. 2007); - met 2 ovaria; - met een normaal klinisch onderzoek; - met een normale echografie; Indien er data beschikbaar zijn van een uitgevoerde laparoscopie, worden deze opgenomen in het studiedossier. Laparoscopiegegevens zullen gebruikt worden om de cases en controles te vergelijken, maar ze zijn niet noodzakelijk als inclusiecriterium. - Voor vrouwen van heterokoppels moet bijkomend een duidelijke subfertiliteit bij de man worden vastgesteld, i.e. Total Motile sperm Count (TMC) < 5 miljoen progressief bewegende zaadcellen vóór capacitatie (Hargreave, 1983). Kwamen in aanmerking als controle: vrouwen zonder vruchtbaarheidsprobleem die de fertiliteitskliniek raadplegen: - hetzij vrouwen van koppels waarbij infertiliteit bij de man werd vastgesteld; - hetzij vrouwen zonder mannelijke partner (alleenstaande vrouwen of vrouwen van lesbische koppels).

45


5.1.2.

STUDIEVERLOOP

Het studieverloop wordt samengevat in Figuur 12.

Selectie van cases en controles Case: onverklaarde subfertiliteit

Controle: normale fertiliteit

Meting van de blootstelling Biomerkers van blootstelling in bloed en urine

Logistische regressie analyse Uitkomst = risico op subfertiliteit, geassoceerd met blootstellingsniveau Figuur 12: Schematisch overzicht van studieverloop van de vrouwelijke case-control studie Vrouwen die in aanmerking kwamen voor de studie (jonger dan 40 jaar, BMI onder de 35 kg/m², primaire zwangerschap, bereid om vragenlijst in te vullen en toestemming geven (IC ondertekenen)), werden gevraagd om een bloed- en urinestaal te geven en de vragenlijst in te vullen. Op basis van de resultaten van de fertiliteit werden ze ingedeeld in de case of controle groep (cfr. definitie cases/controles). Toewijzing tot case of control groep was in sommige gevallen pas mogelijk op termijn (bij bewezen zwangerschap of na 12 maanden onverklaarde subfertiliteit). Cases en controles ondergingen hetzelfde studie-protocol: - Volgende parameters werden nagekeken in een klinisch onderzoek: o Regelmatige menses: frekwentie van menstruatie om de 24 tot 38 dagen, met een cyclus-tot-cyclus variatie van 2 tot maximum 20 dagen tijdens de laatste 12 maanden (Fraser, Critchley et al. 2007). o Exclusie van mogelijke externe oorzaken van fertiliteit zoals: voorgaande chemotherapie, radiotherapie, chirurgie ter hoogte van voortplantingsorganen, pelvische infectie; o Serologisch onderzoek (Hepatitis B en C); o Abdominaal en pelvisch gynaecologisch onderzoek; o Gynaecologische echografie. - Indien er data beschikbaar waren van een uitgevoerde laparoscopie, werden deze opgenomen in het studiedossier. - Er werd 36 ml bloed afgenomen door een ervaren verpleegster voor de meting van geslachtshormonen en polluenten. De bloed- (en serum-) stalen werden binnen de 6 uur gealiquoteerd in de geschikte tubes en containers en onmiddelijke ingevroren in de fertiliteitscentra. Er gebeurde regelmatig transport naar het centrale laboratorium.

46

-

-

5.1.3.

Er werd een urinestaal gecollecteerd in een metaalvrije urinecontainer (minimum 30 ml) voor de meting van polluenten. Het urinestaal werden binnen de 6 uur gealiquoteerd in de geschikte tubes en containers en onmiddelijke ingevroren in de fertiliteitscentra. Er gebeurde regelmatig transport naar het centrale laboratorium. De deelnemer vulde een vragenlijst in (beschikbaar in Nederlands, Frans of Engels) die informatie verschafte over voedingsgewoonten, huisvesting, sociale klasse, blootstelling aan verkeer, roken, alcohol en algemene gezondheid. Deze gegevens waren nodig voor beschrijving van de onderzoeksgroep en als corrigerende factoren (confounders en covariaten) in de statistische analyse.

TOXICOLOGISCHE METINGEN

De methodologie voor de meting van de polluenten in bloed/serum van de vrouwelijke casecontrol studie was identiek aan die van de mannelijke case-control studie. De metingen van de mannelijke en vrouwelijke studie werden simultaan uitgevoerd. Voor een gedetailleerde beschrijving van de methoden en van de kwaliteitscontroles (QC/QA), wordt verwezen naar §2.5). Een korte samenvatting van de gebruikte methoden wordt hieronder gegeven. De zware metalen lood (Pb), cadmium (Cd), mangaan (Mn) en koper (Cu) werden bepaald in volbloed na een zuurdigestie om de organische matrix af te breken. De uiteindelijke analyse gebeurde met behulp van een hoge resolutie inductief gekoppelde plasma spectrometer (HR-ICPMS), zoals beschreven door Schroijen et al. (Schroijen et al. 1317-25). De detectielimiet (Limit of Detection, LOD) voor Pb, Cd, Mn, en Cu bedroeg respectievelijk 1,02 µg/l, 0,03 µg/l, 0,73 µg/l, en 1,07 µg/l. De polygechloreerde bifenyls - merker PCB99, 118, 138, 153, 156, 170, 180, 183 en 187 - en de organochloorpesticiden - hexachlorobenzeen (HCB), p,p’-DDE, oxychlordaan en trans-nonachlor werden bepaald in serum. De gebruikte procedure is gebaseerd op de procedures beschreven in twee publicaties van Covaci et al. (Covaci and Schepens 439-47;Covaci and Voorspoels), nl. namelijk extractie uit serum door middel van vaste-fase extractie (SPE), opzuivering op zure silica, scheiding van de componenten met gas chromatografie en detectie met een massaspectrometer operatief in negatieve chemische ionisatie. De kwantificatielimiet (LOQ, Limit of Quantification) bedroeg 20 ng/l voor HCB, p,p’-DDE, PCB99, PCB138, PCB153, PCB180 en 10 ng/l voor de overige PCB congeneren. Polygebromeerde difenylethers (BDE28, 47, 99, 100, 153, 154, 183 en 209) en hexabromocyclododecaan (HBCD) werden bepaald in serum. De gebruikte procedure is gebaseerd op de procedures beschreven in 2 publicaties van Covaci et al. (Covaci and Schepens 439-47;Covaci and Voorspoels). PBDEs en HBCD werden gelijktijdig gemeten met de PCB’s en gechloreerde pesticiden. De LOQ bedroeg 2 ng/l voor BDE28, BDE99, BDE100, BDE153, BDE154 en BDE183, 3 ng/l voor BDE47, 15 ng/l voor HBCD en 40 ng/l voor BDE209. Perfluoro-octaansulfonaat (PFOS) en perfluoro-octaanzuur (PFOA) werden bepaald in serum. De gebruikte procedure is gebaseerd op de procedures beschreven in 2 publicaties van Midasch et al. (Midasch, Schettgen, and Angerer 489-96;Midasch et al. 643-48). De analytische methode bestond uit een offline proteïne precipitatie met acetonitrile, gevolgd door een scheiding d.m.v. HPLC en een MS/MS detectie (Apllied Biosystems API2000 triple quadrupole mass spectrometer (Foster City, CA,USA) in negative ionization MS/MS mode met MRM (multiple reaction monitoring)). De kwantificatielimiet (LOQ) bedoeg 0,3 µg/l, zowel voor PFOA als voor PFOS.

47


5.1.4.

STATISTISCHE ANALYSE

De gegevens uit de patiëntendossiers en de vragenlijsten werden manueel ingegeven in de databank en samengevoegd met de toxicologische data van de laboratoria. Metingen onder de kwantificatielimiet (LOQ) werden vervangen door de helft van de LOQ voor continue berekeningen. De beschrijvende statistiek van continue gegevens gebeurde door middel van het geometisch gemiddelde met 25e en 75e (of 5e en 95e) percentiel. Categorische gegevens (bijv. roken) werden gegeven als frequenties. Voor vergelijking van 2 groepen werd gebruik gemaakt van de MannWhitney U testvoor continue data en van de Fisher exact test voor categorische data. Multipele regressie analyses werden uitgevoerd door middel vanlogistische regressie modellen voor binaire data. De confounders in de multipele regressie analyses werden vooraf gedefinieerd op basis van de literatuur. Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SAS versie 9.2. De p-waarde voor significantie werd gedefinieerd als 0,05.

5.2. 5.2.1.

RESULTATEN INCLUSIE VAN VROUWELIJKE CONTROLES EN CASES

Voor de selectie van mogelijke studiepatiënten werden eerst de selectiecriteria nagekeken. Alle deelnemers waren jonger dan 40 jaar en hadden een BMI lager dan 35 kg/m². Geen van de patiënten had een eerdere zwangerschap ondergaan. Alle vrouwen hadden regelmatige menses en een normaal abdominaal en pelvisch gynaecologisch onderzoek. Er was geen sprake van mogelijke externe oorzaken van subfertiliteit (chemotherapie, radiotherapie, chirurgie, infecties). De toewijzing tot case of controle gebeurde op basis van de beoordeling van de fertiliteit. In totaal werd de studie opgestart bij 47 vrouwen. Bij 11 vrouwen was er nog geen toewijzing gebeurd tot de case of controle groep (termijn voor beoordeling te kort). Deze 11 vrouwen werden niet mee opgenomen in de analyses. Van de overige 36 vrouwen werden 8 gedefinieerd als case (onverklaarde subfertiliteit voor periode van minimum 12 maanden) en 28 gedefinieerd als controle (normale fertiliteit). De verdeling van cases en controles in de vier fertiliteitscentra wordt weergegeven in Figuur 13. Controls

9

1

10

8

Cases


0 1 1 6


Figuur 13: Verdeling van vrouwelijke controles en cases over de vier fertiliteitscentra De rekrutering van de vrouwelijke patiënten, vooral de case groep, verliep zeer moeizaam. Vermoedelijk was dit te wijten aan de complexe definitie van cases en controles (inclusie in sommige gevallen pas mogelijk na 12 maanden). De vooropgestelde doelstelling van 75 controles en 75 cases werd dus niet gehaald. Daarom werd beslist om een preliminiaire interim analyse uit te

48

voeren op beperkt aantal polluenten. Er werd bij voorkeur gekozen voor persistente polluenten die een middellange of lange termijn blootstelling reflecteren, nl. zware metalen, PCB’s, gechloreerde pesticiden, gebromeerde vlamvertragers en perfluorderivaten (metingen in serum) en niet voor de kortdurende metabolieten die recente blootstelling weerspiegelen, nl. ftalaten, bisfenol A (metingen in urine). Op die manier was het mogelijk om een eerste indicatie te bekomen over de blootstelling van vrouwelijke subfertiliteitspatiënten in vergelijking met vrouwen met normale fertiliteit. De reststalen van de patiënten worden bewaard voor eventuele bijkomende analyses indien er relevante aanwijzingen zijn voor nieuwe metingen, of indien de studie zou worden uitgebreid.

5.2.2.

BESCHRIJVING VAN VROUWELIJKE CONTROLES EN CASES

Tabel 11 vergelijkt de voornaamste eigenschappen van de cases en controles. Deze gegevens moeten met zeer grote voorzichtigheid geïnterpreteerd worden aangezien de aantallen zeer laag zijn, bijv. in de case groep vertegenwoordigt 1 persoon 12,5% van de groep (totaal aantal = 8). De p-waarden zijn dus eerder indicatief. Vrouwen waren gemiddeld 30,7 jaar oud en hadden een gemiddelde BMI van 23,2 kg/m². Eén vierde van de vrouwen rapporteerde gewichtsschommelingen in de voorbije 5 jaar. Zes deelnemers (16,7%) waren rokers, met uitsluitend dagelijkse rokers (n=5) in de controlegroep tegenover 1 sproradisch roker in de case groep. De gerapporteerde alcoholconsumptie was laag: 46% gebruikte minder dan 1x per maand alcohol; 54% gebruikte wekelijks tot maandelijks alcohol. Het opleidingsniveau van de groep was vrij hoog: 39% had een diploma van lager of secundair onderwijs; 61% had een diploma hoger onderwijs (bachelar, master, PhD). Op de totale groep rapporteerde 30% van de deelnemers gebruik van lokale eieren, 50% van lokale groenten en 22% van lokaal fruit; slechts 1 deelneemster at zelfgevangen vis. Bijna iedereen (92%) had in het verleden hormonale anticonceptie gebruikt, voornamelijk de klassieke pil. Er werden weinig gezondheidsproblemen gemeld: 1 vrouw rapporteerd schildklierproblemen en 3 deelnemers maakten melding van migraine. Geen van de deelnemers rapporteerde medicatiegebruik in volgende categorieën: cholesterolverlangende medicatie, slaap- of kalmeermiddelen, antidepressiva.

49


Tabel 11: Karakterisiteken van vrouwelijke controles en cases Leeftijd (jaar) Body-mass index (kg/m²) Gewichtsverandering % met stabiel gewicht verdikt, gemiddeld aantal kg op 5 jaar vermagerd, gemiddeld aantal kg op 5 jaar Roken % nooit gerookt % ex-rokers % sporadisch roker % dagelijks roker Passief roken (uren/week) Opleidingsniveau % maximum hoger secundair % HOBU/universitair Alcohol % minder dan maandelijks % maandelijks tot wekelijks % dagelijks Caffeïne gebruik (eenheden/week) Consumptie lokale voeding % lokale eieren (vaak/altijd) % zelfgevangen vis (af en toe/vaak/altijd) % lokale groenten (af en toe/vaak/altijd) % lokaal fruit (af en toe/vaak/altijd) Fysiek activiteit lichte fysieke activiteit (aantal uren/week) zware fysieke activiteit (aantal uren/week) Gebruik anticonceptie pil hormoonspiraal ring hormoonimplantaat andere (zonder hormonen) Ooit miskraam

Controles (n=28) 30,8 (27,5 – 33,5) 23,7 (20,5 – 26,4)

Cases (n=8) 30,5 (28,0 – 32,0) 21,6 (18,8 – 25,6)

p 0,99 0,12

25,0% 7,3 (5,0 – 10,0) 11,1 (5,5 – 21,0)

25,0% 3,6 (3,0 – 5,0) 1,4 (1,0 – 2,0)

1,00 0,11 0,04 0,02

46,4% 35,7% 0,0% 17,9% 0,0 (0,0 – 2,0)

87,5% 0,0% 12,5% 0,0% 0,0 (0,0 – 3,0)

46,4% 53,6%

12,5% 87,5%

0,61 0,11

0,053 53,6% 46,4% 0,0% 9,2 (4,4 – 21,1)

12,5% 87,5% 0,0% 1,0 (1,8 – 12,2)

0,046

25,0% 0,0% 42,9% 22,2%

50,0% 12,5% 75,0% 50,0%

0,21 0,22 0,23 0,19

1,3 (2,0 – 3,0) 0,0 (0,0 – 1,5)

0,1 (0,5 – 3,3) 0,0 (0,0 – 1,0)

0,71 0,94 /

75,0% 3,6% 7,1% 7,1% 7,1% 0.0%

87,5% 0,0% 0,0% 0,0% 12,5% 0.0%

/

Data zijn percentages voor categorische variabelen en geometrische gemiddeldes (P25-P75) voor continue variabelen; P-waarden: Fisher exact test voor categorische variabelen, Mann-Whitney U-test voor continue variabelen.

50

5.2.3.

VERGELIJKING VAN GEMIDDELDE CONCENTRATIE VAN POLLUENTEN TUSSEN VROUWELIJKE CASES EN CONTROLS

Tabel 12 geeft de gemiddelde niveau’s van de polluenten in de controlegroep in vergelijking met de case groep. De vergelijking gebeurde op basis van de ruwe data, d.w.z. dat er niet gecorrigeerd werd voor de achtergrondkarakteristieken (bijv. roken, voeding, enz..) die mogelijk gelinkt zijn met de blootstelling en kunnen verschillen tussen controles en cases. Voor geen enkele van de gemeten stoffen was er een significant verschil tussen cases en controles. Dit is voor een deel te wijten aan de kleine groepen (28 controles en 8 cases), waardoor er een gebrek aan power is in de analyses, en de resultaten slechts indicatief zijn. Vooral de data van de gebromeerde vlamvertragers moeten voorzichtig geïnterpreteerd worden, aangezien bij de meerderheid van de stalen de waarden onder de kwantificatielimiet lagen.

5.2.4.

RELATIE TUSSEN BLOOTSTELLING EN KANS OP SUBFERTILITEIT IN VROUWELIJKE CASE-CONTROL STUDIE

Met behulp van logische regressie werd berekend de verhoging in het risico op fertiliteitsproblemen berekend bij een stijging van de blootstelling (Tabel 13). De odds ratio weerspiegelt de verhouding “kans op een fertilliteitsprobleem/kans op geen fertiliteitsprobleem” (m.a.w. verhouding “kans om case te zijn/kans om controle te zijn”) indien de blootstelling toeneemt van de 25e naar de 75e percentiel, dus voor een stijging van de biomerker van blootstelling met één interkwartiel range (IQR). Een odds ratio groter dan 1 geeft een verhoogde kans, bijv. een odds ratio van 1,10 betekent dat er 10% meer kans is op een fertiliteitsprobleem. Een odds ratio kleiner dan 1 geeft een verminderd risico, bijv. een odds ratio van 0,80 betekent dat er 20% minder kans is op een fertiliteitsprobleem. Odds ratios worden gepresenteerd samen met hun 95% betrouwbaarheidsinterval (BI). Voor de gebromeerde vlamvertragers werden geen odds ratio’s berekend omdat er te veel waarden onder de kwantificatielimiet voorkwamen, en het dus niet relevant is om een interkwartiel range te berekenen. Er werden geen significante odds ratio’s geobserveerd. Dit is vermoedelijk te wijten aan de kleine onderzoeksgroep, en daardoor een gebruik aan power. Het is opmerkelijk dat alle odds ratio’s, behalve die voor bloed cadmium – groter waren dan 1, dus een trend voor een toegenomen risico weerspiegelen. Voor de meeste persistente stoffen, d.w.z. zowel verschillende PCB congeneren als gechloreerde pesticiden (HCB, DDT metabolieten, chlordaan), werd een odds ratio in de buurt van 1.5 tot 2 geobserveerd, maar het betrouwbaarheidsinterval is wel breed, want duidt op een grote onzekerheid op de meting. Dit is te wijten aan de kleine studiegroep.

51


Tabel 12: Blootstelling aan polluenten: vergelijking van vrouwelijke controles en cases Blootstellingsmerker Controles (n=28) Zware metalen cadmium in bloed (µg/l) 0,4 (0,2 – 0,6) lood in bloed (µg/l) 11,9 (8,9 – 16,3) mangaan in bloed (µg/l) 9,3 (7,4 – 12,1) koper in bloed (µg/l) 945 (813 – 1066) Persistente gechloreerde polluenten in serum som PCB138, 153 en 180 (ng/l) 295 (214 – 405) PCB99 (ng/l) 13,8 (10,0 – 21,0) PCB118 (ng/l) 27,2 (20,0 – 35,0) PCB156 (ng/l) 10,9 (5,0 – 18,5) PCB170 (ng/l) 34,8 (23,5 – 53,0) PCB183 (ng/l) 7,0 (5,0 – 11,0) PCB187 (ng/l) 17,4 (12,5 – 25,5) hexachlorobenzeen (ng/l) 41,6 (34,0 – 55,5) oxychlordaan (ng/l) 15,0 (11,0 – 21,5) trans-nonachlor (ng/l) 7,5 (5,0 – 12,0) p,p'-DDE (ng/l) 432 (304 – 601) p,p’-DDT (ng/l) 15,8 (10,0 – 24,0) Persistente gebromeerde polluenten in serum BDE47 (ng/l) 1,6 (1,5 – 1,5) BDE153 (ng/l) 1,9 (1,0 – 3,0) BDE28, % > LOQ 0,0% BDE99, % > LOQ 0,0% BDE100, % > LOQ 3,6% BDE154, % > LOQ 3,6% BDE183, % > LOQ 0,0% BDE209, % > LOQ 0,0% Hexabromocyclododecaan, % > LOQ 7,1% Perfluorderivaten PFOS in serum (µg/l) 7,1 (4,9 – 8,4) PFOA in serum (µg/l) 2,3 (1,7 – 3,0)

Cases (n=8)

p-waarde

0,2 (0,2 – 0,3) 12,7 (9,4 – 14,1) 10,5 (9,0 – 11,6) 979 (899 – 1035)

0,27 0,92 0,49 0,70

336 (238 – 528) 18,1 (10,0 – 33,0) 35,5 (25,0 – 53,0) 13,5 (8,0 – 27,0) 41,4 (29,0 – 68,5) 9,0 (5,0 – 15,5) 18,0 (11,5 – 35,0) 48,6 (35,5 – 85,0) 19,5 (14,5 – 31,5) 8,8 (5,0 – 21,0) 584 (460 – 850) 15,9 (10,0 – 31,0)

0,37 0,22 0,13 0,51 0,36 0,27 0,88 0,53 0,39 0,57 0,14 0,72

2,0 (1,5 – 13,0) 2,7 (2,0 – 3,5) 0,0% 12,5% 12,5% 12,5% 12,5% 0,0% 0,0%

0,34 0,21 / 0,22 0,40 0,40 0,22 / 1,00

8,6 (7,2 – 10,6) 2,7 (2,1 – 3,3)

0,12 0,34

Data zijn percentages voor categorische variabelen en geometrische gemiddeldes (P25-P75) voor continue variabelen; P-waarden: Fisher exact test voor categorische variabelen, Mann-Whitney U test voor continue variabelen. PCB: polygechloreerde biphenyl; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur.

52

Tabel 13: Verhoging in risico op subfertiliteit bij toename van de blootstelling met 1 interkwartiel range (IQR, van 25e naar 75e percentiel) in vrouwelijke case-control studie Blootstellingsmerker

Blootstelling P25 – P75

Zware metalen cadmium in bloed (µg/l) 0,19 – 0,54 lood in bloed (µg/l) 8,8 – 16,1 mangaan in bloed (µg/l) 7,6 – 11,8 koper in bloed (µg/l) 817 – 1067 Persistente gechloreerde polluenten in serum som PCB138, 153 en 180 (ng/l) 214 – 408 PCB99 (ng/l) 10 – 23 PCB118 (ng/l) 20,5 – 38,5 PCB156 (ng/l) 5 – 19 PCB170 (ng/l) 24 – 53,5 PCB183 (ng/l) 5 – 12,5 PCB187 (ng/l) 12 – 28 hexachlorobenzeen (ng/l) 34 – 58 oxychlordaan (ng/l) 11,5 – 23,5 trans-nonachlor (ng/l) 5 – 12,5 p,p'-DDE (ng/l) 319 – 619 p,p’-DDT (ng/l) 10 – 25,5 Perfluorderivaten PFOS in serum (µg/l) 1,9 – 3,0 PFOA in serum (µg/l) 5,1 – 9,2 e

odds ratio (95% BI)

p-waarde

0,41 (0,10– 1,65) 1,15 (0,45 – 2,93) 1,25 (0,50 – 3,09) 1,39 (0,40 – 4,80)

0,21 0,76 0,63 0,60

1,39 (0,52 – 3,72) 1,82 (0,64 – 5,17) 1,98 (0,70 – 5,57) 1,79 (0,39 – 8,11) 1,58 (0,51 – 4,86) 1,72 (0,58 – 5,11) 1,06 (0,39 – 2,90) 1,55 (0,78 – 3,05) 1,79 (0,64 – 5,06) 1,50 (0,46 – 4,88) 1,90 (0,72 – 4,99) 1,02 (0,40 – 2,56)

0,51 0,26 0,19 0,45 0,42 0,33 0,90 0,20 0,27 0,50 0,19 0,97

1,39 (0,40 – 4,80) 1,47 (0,63 – 3,42)

0,60 0,37

e

P25: 25 percentiel; P75: 75 percentiel; 95% BI: 95% betrouwbaarheidsinterval; PCB: polygechloreerde biphenyl; p,p’-DDE en p,p’-DDT: metabolieten van DDT; BDE: gebromeerde diphenylether; PFOS: perfluoro octaansulfonaat; PFOA: perfluoro octaanzuur.

5.3.

DISCUSSIE EN BESLUIT

De definitie voor case in de vrouwelijke studie was ‘onverklaarde subfertiliteit’. Deze definitie is klinisch relevant maar bleek in praktijk moeilijk interpreteerbaar omdat ze heel wat beslissingmomenten vergt in de kliniek en soms ook een lange wachttijd vergde (tot 12 maanden) vooraleer aan de definitie voldaan was. Omwille van deze praktische belemmeringen was de definitie moeilijk werkbaar. De rekrutering van de vrouwelijke patiënten verliep dan ook zeer moeizaam, was sterk variabel per centrum en de studie diende te worden stopgezet: na 2 jaar rekruteren waren er slechts 47 patiënten in de studie (28 controles, 8 cases en 11 niet gedefinieerd) en was er geen zicht op beterschap. Na het stopzetten van de studie werd beslist om toch een beperkt aantal analyses uit te voeren op de studie, nl. meting van persistente polluenten die een middellange of lange termijn blootstelling reflecteren: zware metalen, PCB’s, gechloreerde pesticiden, gebromeerde vlamvertragers en perfluorderivaten (metingen in serum). Er werd beslist om de metingen van de kortdurende metabolieten die recente blootstelling weerspiegelen, nl. ftalaten, bisfenol A (metingen in urine), voorlopig niet uit te voeren. Een interim analyse op de data toonde geen significante associaties tussen blootstelling aan milieuvervuilende stoffen en subfertiliteit bij vrouwen. Dit is vermoedelijk voor een groot deel te wijten aan het gebrek aan power omwille van de kleine studiegroep. Opvallend was wel dat voor

53


de gechloreerde persistente stoffen (PCB’s, gechloreerde pesticiden) de odds ratio schommelde in de buurt van 1,5 tot 2 wat mogelijk kan wijzen op een trend voor een negatief effect van de gechloreerde POP’s op de vrouwelijke fertiliteit.

54

HOOFDSTUK 6. BESLUIT EN BELEIDSAANBEVELINGEN

In dit rapport worden de resultaten beschreven van twee parallelle case-control studies, één bij mannelijke en één bij vrouwelijke subfertiliteitspatiënten. Het doel van beide case-control studies was om na te gaan of verhoogde blootstelling aan endocrien verstorende stoffen zoals PCB’s, gechloreerde pesticiden, dioxine-achtige stoffen, gebromeerde vlamvertragers, zware metalen, ftalaten, perfluorderivaten, bisfenol A of triclosan geassocieerd was met een verhoogd voorkomen van subfertiliteit. In de mannelijke studie werd subfertiliteit gedefinieerd aan de hand van spermakwaliteit. Op basis van de analyses in 77 cases en 86 controles werd een significant negatief verband gevonden tussen spermakwaliteit en blootstelling aan een aantal persistente polluenten, nl. de gechloreerde pesticiden – oxychlordaan, trans-nonachlor en hexachlorobenzeen – en de gebromeerde vlamvertrager BDE209. De biomerkers voor deze polluenten weerspiegelen cumulatieve blootstelling over meerdere of zelfs meerdere tientallen jaren. De gevonden associaties zijn dus consistent met de hypothese dat spermakwaliteit vroeg in het leven en zelfs prenataal bepaald wordt. Daarnaast werden voor de gechloreerde en de gebromeerde verbindingen en korte-termijn biomerkers (ftalaten, triclosan) relaties geobserveerd met hormoonconcentraties. In de vrouwelijke studie werd subfertiliteit gedefinieerd als ‘onverklaarde subfertiliteit’ na een periode van minimum 12 maanden. Op basis van deze definitie bleek het moeilijk om voldoende patiënten te rekruteren. Een interim analyse bij 8 cases en 28 controles toonde geen significante effecten van milieupolluenten op de vruchtbaarheid. Dit is mogelijk te wijten aan een gebrek aan statististische power. De vastgestelde resultaten zijn belangrijk naar beleidsrelevantie en –interpretatie. Het feit dat er een relatie gevonden werd tussen historische polluenten – de gechloreerde pesticiden – en vruchtbaarheid is een belangrijk gegeven voor beleidsmakers. De data tonen aan dat deze stoffen, die in het verleden in Vlaanderen massaal gebruikt werden, tot belangrijke gezondheidseffecten leiden bij de algemene bevolking. Op basis van deze resultaten kan worden gesteld dat het verbieden van deze stoffen via wetgeving en het nemen van maatregelen om de concentraties in het milieu te verlagen zeer belangrijk en nuttig zijn. Alle stoffen die in deze studie een significante relatie vertoonden met subfertiliteit, nl. hexachlorobenzeen, trans-nonachlor en oxychlordaan, zijn reeds gedurende meerdere jaren verboden in Vlaanderen. Verschillende studies (in het milieu en in de mens) tonen ook duidelijk aan dat de niveau’s van deze stoffen een dalende trend vertonen en bevestigen dus dat de genomen beleidsacties effectief werken. Anderzijds tonen de data van deze case-control studie aan dat er bij de huidige blootstellingsniveau’s nog steeds gezondheidseffecten optreden en dat het dus belangrijk blijft om bijkomende inspanningen te doen. Dit kan op meerdere manieren. Een blijvende monitoring van de omgeving en een inventarisiatie van de blootstelling bij de mens zijn belangrijke beleidsinstrumenten om de niveau’s verder op te volgen, en na te gaan of de ingezette daling wordt doorgezet. Verdere blijft het ook belangrijk om de bevolking te sensibiliseren en informatie te verstrekken over de manier waarom men kan worden blootgeseld, bijv. door aan te geven wat mogelijk bronnen zijn (bijv. eenzijdige voeding van dierlijke oorsprong) en waar mogelijk risicogedrag vermeden kan worden (bijv. gebruik van oude pesticiden). Tot slot blijft het belangrijk om de wetgeving omtrent deze stoffen verder op te volgen, bijv. sommige gechloreerde pesticiden zijn nog toegelaten in een aantal landen. In deze studie werd eveneens een significant verband gevonden tussen blootstelling aan nieuwere polluenten – de gebromeerde vlamvertragers – en vruchtbaarheid. Deze gegevens tonen aan dat 55

HOOFDSTUK 6 Besluit en beleidsaanbevelingen

het zeer belangrijk is om aandacht te hebben voor de ‘new emerging chemicals’ in onze omgeving. Naast proefdieren in vitro onderzoek is het belangrijk om ook te beschikken over humane data om de bewijslast te verhogen dat deze stoffen schadelijk kunnen zijn voor de menselijke gezondheid. Net als voor de historische polluenten is het belangrijk om een meersporenbeleid te volgen wat betreft beleidsacties. Allereerst is het belangrijk om via wetgeving en regelgeving te zorgen dat deze stoffen verboden worden en de mens dus niet meer wordt blootgesteld aan concentraties die schadelijk zijn voor de gezondheid. Op Europees vlak bestaat er reeds wetgeving. Zo is het gebruik van penta- en octaBDE (BDE99, 100) in elektrisch en elektronisch materiaal is in de Europese unie verboden sinds 2006. DecaBDE (BDE209) mocht in Europa gebruikt worden tot 30 juni 2008. Het Europees Chemicaliënagentschap (ECHA) heeft HBCD op de eerste kandidatenlijst van ‘zeer zorgwekkende stoffen’ gezet in het kader van de REACH-richtlijn. Ondanks het verbod op het gebruik van BDE209, vinden we in deze studie toch een significant effect van BDE209 op de fertiliteit. Verder opvolging via wetgeving en via controles is dus zeker nodig. Daarnaast is het ook belangrijk om de bevolking te informeren en sensibiliseren in verband met mogelijke blootstelling aan nieuwe polluenten zoals vlamvertragers. Het zou nuttig zijn om de juiste informatie te verschaffen over blootstelling zodat een individu hiermee kan rekening houden in zijn gedrag (bijv. bij de aankoop van electronica, meubels, kleding, enz…) en zodat een persoon maatregelen kan nemen om de blootstelling te verminderen (bijv. via stofcontrole in de woning). Vanuit beleidsniveau is het ook essentieel om de concentraties van nieuwe polluenten – o.m. gebromeerde vlamvertragers, maar ook andere potentiële endocriene verstoorders zoals ftalaten, bisphenol A, perfluorderivaten, componenten van persoonlijke hygiëne producten – zowel in de mens als in het milieu te blijven opvolgen. Alleen op basis van herhaalde metingen is het mogelijk om tijdstrends op te volgen en piekblootstelling te herkennen zodanig dat de gepaste beleidsmaatregelen mogelijk worden gemaakt. De huidige studie toont de meest duidelijke resultaten voor persistente stoffen (gechloreerde en gebromeerde POP’s). De blootstellingsmerkers van persistente polluenten weerspiegelen geaccumuleerde blootstelling uit het verleden en laten dus beter toe om de link te leggen met gevoelige periodes (‘sensitive windows’) in het leven die belangrijk zijn voor de ontwikkeling van het lichaam en mogelijk ook voor de ontwikkeling van ziekten en afwijkingen. De ontwikkeling van fertiliteitsproblemen is in vele gevallen niet een acuut probleem, maar een chronisch proces met oorzaken in de puberteit, de perinatale of zelfs de prenatale periode. Blootstelling aan endocrien verstorende stoffen tijdens deze belangrijke ontwikkelingsperiodes dienen dus op de juiste manier in kaart te worden gebracht. Voor persistente stoffen weerspiegelt de huidige blootstelling vaak voor een groot deel de blootstelling uit het verleden en is het dus mogelijk om de link te leggen tussen huidige effecten en vroegere blootstelling. Voor korte-termijn merkers zoals ftalaatmetabolieten in urine of bisfenol A in de urine is het minder relevant om de huidige blootstelling te relateren aan chronische gezondheidseffecten, tenzij men aanneemt dat de blootstelling vrij constant is. Voor ‘new emerging chemicals’ die in de loop van de jaren sterk zijn toegenomen in het milieu is het echter weinig waarschijnlijk dat de huidige blootstelling een maat is voor de blootstelling uit het verleden. Voor deze stoffen is het belangrijk om krachtiger studies te ontwerpen, nl. om lange-termijn opvolging te voorzien in longitudinale studies. Aangezien de basis voor fertiliteitsproblemen vaak prenataal bepaald wordt, zijn geboortecohortes de meest geschikte studiedesign om deze gezondheidseffecten te bestuderen. De prenatale blootstelling bij de baby kan worden gemeten door middel van bloed- of urinestalen van de zwangere moeder en via metingen in navelstrengbloed. Lange-termijn opvolging van gezondheidseffecten (en bijkomende metingen van blootstelling) gedurende meerdere gevoelige periodes van het leven kunnen zeer kostbare informatie opleveren om de inzichten in de relaties tussen milieublootstelling en gezondheid, en onderliggende mechanismen te verbeteren. Afhankelijk van het gezondheidseffect waarin men geïnteresseerd is, kunnen bij voorkeur de specifieke gevoelige periodes (‘sensitive windows’) worden bestudeerd. Wat betreft endocriene verstoring bij de man is geweten dat de 56

seksuele differentiatie gebeurt op het einde van het eerste trimester van de zwangerschap en compleet is op week 16 van de zwangerschap. Testosteron-afhankelijke ontwikkelingsprocessen gebeuren tussen week 8 en week 38 van de zwangerschap, en na de geboorte, voornamelijk tijdens de puberteit. Belangrijke toegevoegde waarde bij het bestuderen van geboortecohortes zijn de aanleg van een biobank zodat eventuele nieuwe wetenschappelijke inzichten retrospectief getoetst kunnen worden, en de aanwezigheid van een goed registratiesysteem van ziekte- en gezondheidsgegevens. Vooral voor deze laatste aspecten is de rol van de overheid en de juiste beleidsondersteuning zeer belangrijk. Voor de aanleg van een biobank is een betrouwbare, solide partner nodig die garant kan staan voor de financiële en logistieke ondersteuning op lange termijn, en die respect voor de privacy en ethische regels kan garanderen. Een ondersteunende rol van de overheid kan hier garanties bieden voor een stabiele en betrouwbare basis. Een centraal registratiesysteem van ziekte- en gezondheidsgegevens dat onder strikte voorwaarden toegankelijk is en toelaat om op een eenvoudige manier (bijv. via het rijksregisternummer) gegevens op te vragen, met respect voor de privacy en de gepaste ethische regels, zou van onschatbare waarde zijn voor lange-termijn opvolging en prospectieve studies. Ook hier zou de overheid een belangrijke rol kunnen spelen als beheerder van een efficiënte en goed beheerde kruisdatabank. Daarnaast kan de overheid een belangrijke rol spelen in het faciliteren en mee financieren van goed opgezette geboortecohortes. Indien dit soort onderzoek parallel zou kunnen worden opgezet in een algemene bevolking zou dit een grote meerwaarde kunnen zijn voor het wetenschappelijk onderzoek en voor maatschappelijk relevante vragen. Daarnaast zou het ook interessant zijn om geboortecohortes op te zetten in een meer klinische setting (bijv. bij kinderen geboren na IVF fertilisatie, bij prematuur geboren baby’s, enz..). Enerzijds biedt dit interessante extra onderzoeksvragen aangezien deze baby’s mogelijk op een andere manier zijn blootgesteld aan omgevingspolluenten, maar anderzijds maakt het de interpretatie mogelijk meer ingewikkeld aangezien er meerdere klinische factoren een rol spelen. Dit kan worden opgevangen door het definiëren van een goede studiedesign (bijv. vergelijking met controlegroep) en nauwkeurig geformuleerde onderzoeksvragen. Naast de wetenschappelijk uitkomsten in deze studie i.v.m. de relatie tussen milieublootstelling en subfertiliteit heeft het huidige onderzoeksconsortium ook een belangrijke strategische waarde. Een zeer belangrijke meerwaarde voor de studie is het samenbrengen van de juiste expertise. In deze studie waren vier belangrijke fertiliteitscentra in Vlaanderen betrokken. Deze vier centra zijn niet alleen binnen Vlaanderen maar ook op wereldvlak gerenomeerd omwille van vooruitstrevend onderzoek. De klinische expertise die aanwezig was via de fertiliteitscentra werd vanuit het Steunpunt Milieu en Gezondheid aangevuld met relevante kennis omtrent epidemiologische studie-design, chemisch-analytische metingen, statistische analyse en toxicologische interpretatie. De ervaring die werd opgedaan binnen het consortium is belangrijk en zou – met de nodige ondersteuning vanuit het beleid – in de toekomst ook benut kunnen worden voor verder aanvullend beleidsrelevant onderzoek.

57

Literatuurlijst

LITERATUURLIJST Abdelouahab, N., Y. Ainmelk, and L. Takser. "Polybrominated diphenyl ethers and sperm quality." Reprod Toxicol 31.4 (2011): 546-50. Akutsu, K., et al. "Polybrominated diphenyl ethers in human serum and sperm quality." Bull.Environ Contam Toxicol 80.4 (2008): 345-50. Austin, M. E., et al. "Neuroendocrine effects of perfluorooctane sulfonate in rats." Environ Health Perspect 111 (2003). Aydogan, Ahbab M. and N. Barlas. "Developmental effects of prenatal di-n-hexyl phthalate and dicyclohexyl phthalate exposure on reproductive tract of male rats: Postnatal outcomes." Food Chem Toxicol 51C (2012): 123-36. Beurskens, M. P., J. W. Maas, and J. L. Evers. "[Subfertility in South Limburg: calculation of incidence and appeal for specialist care]." Ned Tijdschr Geneeskd 139.5 (1995): 235-38. Calafat, A. M., et al. "Human exposure assessment to environmental chemicals using biomonitoring." Int J Androl 29.1 (2006). Cassidy, R. A., et al. "The effects of chlordane exposure during pre- and postnatal periods at environmentally relevant levels on sex steroid-mediated behaviors and functions in the rat." Toxicol Appl Pharmacol 126.2 (1994): 326-37. Connor, K., et al. "Hydroxylated Polychlorinated Biphenyls (PCBs) as Estrogens and Antiestrogens: Structure-Activity Relationships. Tox Appl Pharmacol 1997; 145:111-123." Tox Appl Pharmacol 145 (1997). Covaci, A. and P. Schepens. "Improved determination of selected POPs in human serum by solid phase disk extraction and GC-MS." Chemosphere 43 (2001): 439-47. Covaci, A. and S. Voorspoels. "Optimization of the determination of polybrominated diphenyl ethers in human serum using solid-phase extraction and gas chromatography-electron capture negative ionization mass spectrometry." J Chromatogr B 827.216-223 (2005). Damgaard, I. N., et al. "Persistent pesticides in human breast milk and cryptorchidism." Environ Health Perspect 114.7 (2006): 1133-38. Forgacs, A. L., et al. "BLTK1 murine Leydig cells: a novel steroidogenic model for evaluating the effects of reproductive and developmental toxicants." Toxicol Sci 127.2 (2012): 391-402.

Geens, T., H. Neels, and A. Covaci. "Sensitive and selective method for the determination of bisphenol-A and triclosan in serum and urine as pentafluorobenzoate-derivatives using GCECNI/MS." J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 877.31 (2009): 4042-46. Giannandrea, F., et al. "Pesticide exposure and serum organochlorine residuals among testicular cancer patients and healthy controls." J Environ Sci Health B 46.8 (2011): 780-87. Greenhall, E. and M. Vessey. "The prevalence of subfertility: a review of the current confusion and a report of two new studies." Fertil Steril 54.6 (1990): 978-83. Hansen, L. G. "Stepping backward to improve assessment of PCB congener toxicities." Environ Health Perspect 106 Suppl 1 (1998): 171-89. Hardell, L., et al. "Increased concentrations of polychlorinated biphenyls, hexachlorobenzene, and chlordanes in mothers of men with testicular cancer." Environ Health Perspect 111.7 (2003): 930-34. Hull, M. G., et al. "Population study of causes, treatment, and outcome of infertility." Br Med J (Clin Res Ed) 291.6510 (1985): 1693-97. Koppen, G., et al. "Comparison of CALUX-TEQ values with PCB and PCDD/F measurements in human serum of the Flanders Environmental and Health Study (FLEHS)." Toxicology Letters 123 (2001): 59-67. Kumar, V., C. Balomajumder, and P. Roy. "Disruption of LH-induced testosterone biosynthesis in testicular Leydig cells by triclosan: probable mechanism of action." Toxicology 250.2-3 (2008): 124-31. Latini, G., A. Verrotti, and C. De Felice. "DI-2-ethylhexyl phthalate and endocrine disruption: a review." Curr Drug Targets Immune Endocr Metabol Disord 4 (2004). Lau, C., J. L. Butenhoff, and J. M. Rogers. "The developmental toxicity of perfluoroalkyl acids and their derivatives." Toxicol Appl Pharmacol 198.2 (2004). Maffini, M. V., et al. "Endocrine disruptors and reproductive health: the case of bisphenol-A." Mol Cell Endocrinol 254-255 (2006). McGlynn, K. A., et al. "Persistent organochlorine pesticides and risk of testicular germ cell tumors." J Natl Cancer Inst 100.9 (2008): 663-71. Meijer, L., et al. "Influence of prenatal organohalogen levels on infant male sexual development: sex hormone levels, testes volume and penile length." Hum Reprod 27.3 (2012): 867-72.

Literatuurlijst

Metcalf, SW. and KG. Orloff. "Biomarkers of exposure in community setting." J Toxicol Environ Health 67 (2004). Midasch, O., et al. "Transplacental exposure of neonates to perfluorooctanesulfonate and perfluorooctanoate: a pilot study." Int Arch Occup Environ Health 80.7 (2007): 643-48. Midasch, O., T. Schettgen, and J. Angerer. "Pilot study on the perfluorooctanesulfonate and perfluorooctanoate exposure of the German general population." Int J Hyg Environ Health 209.6 (2006): 489-96. Oakley, L., P. Doyle, and N. Maconochie. "Lifetime prevalence of infertility and infertility treatment in the UK: results from a population-based survey of reproduction." Hum Reprod 23.2 (2008): 447-50. Pant, N., et al. "Lead and cadmium concentration in the seminal plasma of men in the general population: correlation with sperm quality." Reprod Toxicol 17 (2003). Purdue, M. P., et al. "Prediagnostic serum concentrations of organochlorine compounds and risk of testicular germ cell tumors." Environ Health Perspect 117.10 (2009): 1514-19. Schoeters, G., et al. "Cadmium and children: exposure and health effects." Acta Paediatr Suppl 95.50-54 (2006). Schoeters, G., et al. "Concept of the Flemish human biomonitoring programme." Int J Hyg Environ Health 215.2 (2012): 102-08. Schroijen, C., et al. "Internal exposure to pollutants measured in blood and urine of Flemish adolescents in function of area of residence." Chemosphere 71.7 (2008): 1317-25. Sharpe, R. M. and N. E. Skakkebaek. "Are oestrogens involved in falling sperm counts and disorders of the male reproductive tract?" Lancet 341.8857 (1993): 1392-95. Skakkebaek, N. E., E. Rajpert-De Meyts, and K. M. Main. "Testicular dysgenesis syndrome: an increasingly common developmental disorder with environmental aspects." Hum Reprod 16.5 (2001): 972-78. Snick, H. K., et al. "The spontaneous pregnancy prognosis in untreated subfertile couples: the Walcheren primary care study." Hum Reprod 12.7 (1997): 1582-88. Staessen, J. A., et al. "Renal function, cytogenetic measurements, and sexual development in adolescents in relation to environmental pollutants: a feasibility study of biomarkers." Lancet 357.9269 (2001): 1660-69.

Toppari, J., et al. "Male reproductive health and environmental xenoestrogens." Environ Health Perspect 104 Suppl 4 (1996): 741-803. Trabert, B., et al. "Maternal Pregnancy Levels of Trans-Nonachlor and Oxychlordane and Prevalence of Cryptorchidism and Hypospadias in Male Offspring." Environ Health Perspect (2011). Tseng, L. H., et al. "Postnatal exposure of the male mouse to 2,2',3,3',4,4',5,5',6,6'-decabrominated diphenyl ether: decreased epididymal sperm functions without alterations in DNA content and histology in testis." Toxicology 224.1-2 (2006): 33-43. Tseng, L. H., et al. "Developmental exposure to decabromodiphenyl ether (PBDE 209): effects on thyroid hormone and hepatic enzyme activity in male mouse offspring." Chemosphere 70.4 (2008): 640-47. Van, Wouwe N., et al. "Validation of the CALUX bioassay for PCDD/F analyses in human blood plasma and comparison with GC-HRMS." Talanta 63.5 (2004): 1157-67. Vermeulen, A., L. Verdonck, and J. M. Kaufman. "A critical evaluation of simple methods for the estimation of free testosterone in serum." J Clin Endocrinol Metab 84.10 (1999): 3666-72. Wakui, S., et al. "Atypical Leydig Cell Hyperplasia in Adult Rats with Low T and High LH Induced by Prenatal Di(n-butyl) Phthalate Exposure." Toxicol Pathol. (2012). Welch, R. M., et al. "Effect of halogenated hydrocarbon insecticides on the metabolism and uterotropic action of estrogens in rats and mice." Toxicol Appl Pharmacol 19.2 (1971): 23446.

Associatie tussen milieublootstelling en fertiliteit: een case-control studie bij subfertiele mannen en een interim analyse bij subfertiele vrouwen

Recommend Documents