APO seminář 5: OPTICKÉ METODY v APO

APO seminář 5:

OPTICKÉ METODY v APO Princip: fyzikální metody založené na interakci vzorku s elektromagnetickým zářením nebo na sledování vyzařování elektromagnetického záření vzorkem

nespektrální metody—sledujeme změny vlastností záření (změny rychlosti záření, otáčení roviny polarizovaného světla, rozptyl záření) např.: refraktometrie, interferometrie, polarimetrie, nefelometrie, turbidimetrie

 spektrální metody—založeny na výměně energie mezi látkou a zářením (emisní a absorpční metody)

ELEKTROMAGNETICKÉ SPEKTRUM Frekvence [Hz]

1 Hz

1 kHz

1 MHz

1 GHz Mikrovlny Rentgenové paprsky AM FM, TV

Viditelné světlo

Rozhlasové vlny

UV IČ

1 km

1 m 1 cm

1 µm

1 nm

Vlnová délka [m]

Gama paprsky

ELEKTROMAGNETICKÉ SPEKTRUM  20 nm

20-200 nm

RTG + - vzdálená záření (vakuová) UV

200-380 nm UV

přechody elektronů

380-780 nm VID

0,78-2,5 m Blízká IČ

2,5-25 m Střední IČ

25-50 m Dlouhovlnná IČ

 0,05 mm Rádiové mikrovlny*

vibrace, rotace (funkční skupiny)

Vakuová UV oblast - v oblasti pod 200 nm je záření absorbováno vzdušným kyslíkem tato oblast je přístupná pouze ve vakuu *Užší dělení: Mikrovlny, ultrakrátké rádiové vlny, krátké rádiové vlny

POLARIMETRIE v APO Princip: metoda založená na měření úhlu otočení roviny polarizovaného světla opticky aktivními látkami a jejich roztoky  opticky aktivní látky—jejich molekuly nelze prostým otáčením ztotožnit s jejich zrcadlovým obrazem  nejčastější příčina asymetrie: přítomnost asymetrického uhlíku

 opticky aktivní látky—stáčí rovinu polarizovaného světla vpravo (po směru hod. ručiček) – pravotočivé (+) vlevo (proti směru hod. ručiček) – levotočivé (-)

POLARIZACE SVĚTLA Normální světelné vlnění (nepolarizované světlo)  vektory elektrického pole a k němu kolmého magnetického pole ve všech rovinách protínajících se ve směru šíření

Kruhově (cirkulárně) polarizované světlo  kmitá tak, že elektrický a magnetický vektor koná rotační pohyb ve směru paprsku. (stejné amplitudy, 90° posun fází)

Lineárně (rovinně) polarizované světlo  kmitá v jedné rovině proložené paprskem (elektrická složka v jedné rovině, magnetická složka v druhé, na ni kolmé rovině)

Elipticky polarizované světlo  kmitá tak, že elektrický a magnetický vektor koná rotační pohyb ve směru paprsku. (rozdílné amplitudy, nebo jiný než 90° posun fází) 5

Praktická realizace polarizace světla pro měření Normální světelné vlnění (nepolarizované světlo) se po průchodu NICOLovým HRANOLem (Islandský dvojlomný vápenec) rozdělí na 2 polarizované paprsky:

řádný: kolmý k polarizační rovině (odfiltruje se začerněným obalem hranolu) mimořádný: rovnoběžný s polarizační rovinou (používá se k měření)

tj. získá se paprsek světla stejné vlnové délky, ale polarizovaný v jedné rovině 6

PRINCIP POLARIMETRU I Směr šíření světla

Zdroj Normální Polarizátor světla (nepolarizované) světlo

Polarizované Trubice obsahující roztok Polarizované Analyzátor Detektor (popř. oko) světlo s chirální sloučeninou světlo (pootočené)

• Otočí-li opticky aktivní látka v kyvetě rovinu polarizovaného světla o určitý úhel, na detektor začne dopadat světlo.

• Pokud otočíme o stejný úhel analyzátorem, opět bude intenzita světla prošlého k detektoru nulová. • Signál z detektoru je vyhodnocován a servomotor otáčí analyzátorem, dokud není nalezeno minimum intenzity

7

PRINCIP POLARIMETRU II Část polarizovaného světla, která projde analyzátorem, je určena úhlem, který svírá polarizační rovina analyzátoru s polarizační rovinou polarizátoru

 rovnoběžné—svírají úhel 0°, 180°, 360° - světlo projde analyzátorem v plné intenzitě  kolmé—svírají úhel 90°, 270°- analyzátor nepropouští žádné světlo  úhel < 90°—analyzátor propouští část světla z polarizátoru

8

Stupnice polarimetru

 kruhové stupně  sacharimetrické stupně (°S)  stupně Ventzkeho (°V) 1

= 2,8885 °S = 2,8854 °V

1 °V = 0,3466

= 1,001 °S

1 °S = 0,3462

= 0,999 °V

9

Optická otáčivost – parametry měření Faktory ovlivňující optickou otáčivost:

 asymetrie struktury molekuly ↑  vlnová délka světla   teplota (roztoku)   počet molekul s nimiž polarizované světlo vstupuje do interakce ↑ - koncentrace roztoku - tloušťka vrstvy (délka kyvety)  chemická povaha rozpouštědla

 pH a čas (změny)

10

Zajištění potřebné optické kvality vzorku – eliminace rušivých látek ČIŘENÍ A ODBARVOVÁNÍ (CUKERNÝCH EXTRAKTŮ)

Zákal roztoků zvyšuje chyby Zabarvení roztoku zcela znemožňuje měření Neutrální octan olovnatý  čiření neutrálních roztoků  odstranění opticky aktivních organických kyselin (odstranění bílkovin není dokonalé) Zásaditý octan olovnatý  čiření neutrálních a mírně alkalických roztoků  odstranění opticky aktivních organických kyselin a bílkovin Čiření podle Carreze  síran zinečnatý a kyanoželeznatan draselný  čiření v kyselém prostředí  odstranění bílkovin, méně slizových látek 11

POLARIMETRIE Úhel stočení

 vyjadřuje optickou otáčivost roztoku opticky aktivní látky

Měrná otáčivost (specifická rotace)

 úhel stočení pro = 1 dm, cw = 1 g.mL–1, t = 20 °C,  = vlnová délka dubletu spektrálních čar sodíku (D: 589,0 a 589,6 nm)

12

POLARIMETRIE Pravidlo o aditivitě  roztok dvou opticky aktivních látek A a B o hmotnostní koncentraci cwA a cwB vykazuje otáčivost, která je dána součtem příspěvků obou opticky aktivních složek



    

20 D ( A)

 cw A  

20 D ( B)



 cw B

 využití: stanovení sacharózy vedle jiné opticky aktivní látky dvojím měřením (před a po hydrolýze sacharózy, která je doprovázena změnou optické otáčivosti – inverzí)

13

POLARIMETRIE Specifická rotace vybraných sacharidů

Látka

 

dextrin D-fruktóza D-galaktóza D-glukóza invertní cukr laktóza

+ 194,8 –93,78 + 80,47 + 52,74 –20,59 + 55,3

20 D

Látka

 

maltóza rafinóza sacharóza škrob xylóza

–137,5 + 123,01 + 66,53 + 196,4 + 196,4

1 g/ml FRU -93,78 1 g/ml GLU +52,74 (2 g/ml) -41,04 : 2 (1 g/ml) = -20,52 INVERT

20 D

APLIKACE POLARIMETRIE Stanovení koncentrace jedné opticky aktivní látky

 jediným měřením optické otáčivosti roztoku lze určit koncentraci

 cw  20    D 

 D20

15

Příklad č. 1: Polarimetrické stanovení sacharózy Určete koncentraci roztoku sacharózy, u kterého byla měřením ve 2 dm kyvetě zjištěna otáčivost 17,31 ° (= 50 °S).

APLIKACE POLARIMETRIE V ANALÝZE POTRAVIN Stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem

 měří se optická otáčivost roztoku před a po inverzi sacharózy kyselinou chlorovodíkovou.  hydrolýza sacharózy probíhá dle rovnice H

C12H22O11  H2O  C6H12O6 ( glukóza)  C6H12O6 (fruktóza) Mr

342

 D20 +66,53°

18

180 +52,74°

180 –93,78°

Mr 360 invertní cukr  D20 –20,59°

APLIKACE POLARIMETRIE V ANALÝZE POTRAVIN

Stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem  pro hodnotu otáčivosti před inverzí platí





1     D ( S)  cw S  D ( M)  cw M 20

20

 pro hodnotu otáčivosti po inverzi (hydrolýze) sacharózy platí:





 2     D ( I )  cw I   D ( M)  cw M 20

360 cw I   cw S 342

20

S…sacharóza M…monosacharid I…invertní cukr

APLIKACE POLARIMETRIE V ANALÝZE POTRAVIN

Stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem  získáme soustavu dvou rovnic



1    

20 D ( S)

 cw S 

20 D ( M)



 cw M

 20 360  20  2      D ( I )   cw S  D ( M)  cw M 342   S…sacharóza M…monosacharid I…invertní cukr

Příklad č. 2: Polarimetrické stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem

20 ml vzorku (S, G) 20 ml vzorku inverze (I, G)

100 ml, α1 = 11,1° 100 ml, α2 = 4,1°

Příklad č. 2: Polarimetrické stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem  cws a dosadit do α2