APLIKASI EKSTRAK BIJI KECIPIR (PsophocarpusTetragonolobus) TERFERMENTASI DALAM MENGHAMBAT PEMBENTUKAN SENYAWA PEROKSIDA MINYAK KEDELAI
KARYA TULIS ILMIAH
OLEH NURUL INAYAH NIM 13.035
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG JULI 2016
APLIKASI EKSTRAK BIJI KECIPIR (PsophocarpusTetragonolobus) TERFERMENTASI DALAM MENGHAMBAT PEMBENTUKAN SENYAWA PEROKSIDA MINYAK KEDELAI
KARYA TULIS ILMIAH
Diajukan kepada Akademi Analis Farmasi Putra Indonesia Malang untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam menyelesaikan program D-3 bidang Analis Farmasi dan Makanan
OLEH NURUL INAYAH NIM 13.035
AKADEMI ANALIS FARMASI DAN MAKANAN PUTRA INDONESIA MALANG JULI 2016
KARYA TULIS ILMIAH
APLIKASI EKSTRAK BIJI KECIPIR (PsophocarpusTetragonolobus) TERFERMENTASI DALAM MENGHAMBAT PEMBENTUKAN SENYAWA PEROKSIDA MNYAK KEDELAI
Oleh : NURUL INAYAH
NIM. 13.035
Telah diperiksa dan di setujui untuk diujikan
Pembimbing,
Fitri Eka Lestari S.Gz.
APLIKASI EKSTRAK BIJI KECIPIR (PsophocarpusTetragonolobus) TERFERMENTASI DALAM MENGHAMBAT PEMBENTUKAN SENYAWA PEROKSIDA MINYAK KEDELAI Inayah, Nurul. 2016. Aplikasi Ekstrak Biji Kecipir (Psophocarpus Tetragonolobus)Terfermentasi Dalam Menghambat Pembentukan Senyawa Peroksida Minyak Kedelai. Karya Tulis Ilmiah. Akademi Analis Farmasi Putra Indonesia Malang.Pembimbing : Fitri Eka Lestari S.Gz. ABSTRAK Selama ini pemanfaatan antioksidan dalam industri cenderung menggunakan antioksidan sintetik untuk mencegah proses oksidasi. Namun berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh (Basma dkk, 2011) didapat bahwa antioksidan sintetik (BHA dan BHT) dapat menyebabkan kerusakan pada hati dan bersifat karsinogenik, sehingga diperlukan alternatif lain pengganti antioksidan sintetik yaitu dengan memanfaatkan antioksidan alami, salah satunya ekstrak biji kecipir.Penelitian ini bertujuan melihat aktivitas antioksidan pada ekstrak biji kecipir dengan melihat kenaikan angka peroksida pada periode waktu penyimpanan 16 hari dan mengetahui stabilitasnya terhadap suhu pengolahan pangan .Metode penelitian yang digunakan menggunakan prinsip titrasi iodometri. Perlakuan yang dicoba adalah dengan menambahkan ekstrak fermentasibiji kecipir pada media berupa minyak kedelai dengan 3 perbedaan konsentrasi yaitu 1,8 %, 3,6% dan 5,4% dari minyak kedelai.Ekstrak fermentasibiji kecipir pada ketiga perlakuan konsentrasi tersebut dapat menghambat pembentukan senyawa peroksida pada media minyak kedelai.Berdasarkan hasil penelitian dari ketiga perlakuan konsentrasi, pada konsentrasi 5,4% memiliki aktivitas antioksidan tertingi.Hasil uji stabilitas ekstrak setelah dipanaskan pada suhu pasteurisasi dan sterilisasi komersilmenunjukkan bahwa aktivitas antioksidan menurun pada waktu penyimpanan hari ke 12 . Kesimpulan : Ekstrak fermentasi biji kecipirmemiliki aktivitas sebagai antioksidan alami dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida Kata kunci : Angka peroksida, Antioksidan, Biji kecipir, Fermentasi, Isoflavon.
i
KATA PENGANTAR
Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Karya Tulis Ilmiah yang berjudul “Aktivitas Antioksidan Alami Ekstrak biji kecipir Biji Kecipir (Psophocarpus Tetragonolobus) Dalam Menghambat Pembentukan Senyawa Peroksida Minyak Kedelai” ini tepat pada waktunya. Tujuan penulisan karya tulis ilmiah ini sebagai persyaratan untuk menyelesaikan program D-3 di Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang. Sehubungan dengan terselesainya karya tulis ilmiah ini, saya mengucapkan terimakasih kepada pihak pihak sebagai berikut. 1.
Dra. Wigang Solandjari,selaku Direktur Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang.
2.
Fitri Eka Lestari S.Gz., selaku dosen pembimbing
3.
Nela Agustin Kusuma W.,S.TP, MP., selaku dosen penguji
4.
Endang S., M.Farm-Klin, Apt., selaku dosen penguji
5.
Bapak dan Ibu dosen Akademi Analis Farmasi dan Makanan PutraIndonesia Malang beserta staf
6.
Orang tua tercinta yang telah memberikan dorongan secara spiritual materil serta restunya dalam menuntut ilmu
7.
Rekan rekan mahasiswa dan semua pihak yang langsung/ tak langsung telah memberikan bimbingan, bantuan, serta arahan kepada penulis. Penulis menyadari bahwa Karya Tulis Ilmiah ini masih mempunyai
beberapa kekurangan. Oleh karena itu, saran-saran akan sangat diharapkan. Semoga Karya Tulis Ilmiah ini bermanfaat.
Malang, 21 Juli 2016
Nurul Inayah
ii
DAFTAR ISI
ABSTRAK ............................................................................................................... i KATA PENGANTAR ............................................................................................ ii DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii DAFTAR TABEL ................................................................................................... v DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. vi DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................................... vii BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1 1.1.
Latar Belakang Masalah ........................................................................... 1
1.2.
Rumusan Masalah ..................................................................................... 3
1.3.
Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3
1.4.
Ruang Lingkup dan Keterbatasan Penelitian ............................................ 3
1.5.
Definisi Istilah dan Singkatan ................................................................... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA........................................................................... 5 2.1.
Tanaman Kecipir ....................................................................................... 5
2.2.
Lemak dan Minyak ................................................................................. 10
2.3.
Minyak Kedelai ....................................................................................... 12
2.4.
Hidrolisis Minyak ................................................................................... 14
2.5.
Oksidasi Asam Lemak ............................................................................ 14
2.6.
Oksidan dan Radikal Bebas .................................................................... 15
2.7.
Antioksidan ............................................................................................. 18
2.8
Tinjauan Umum Determinasi .................................................................. 20
2.9
Pengujian Angka Peroksida Lemak dan Minyak .................................... 21
2.10 Kerangka Teori ....................................................................................... 22 2.11 Hipotesis Penelitian ................................................................................ 23
iii
BAB IIIMETODE PENELITIAN ..................................................................... 24 3.1.
Rancangan Penelitian .............................................................................. 24
3.2
Populasi dan Sampel Penelitian .............................................................. 25
3.3.
Lokasi dan Waktu Penelitian .................................................................. 25
3.4.
Definisi Operasional Variabel................................................................. 25
3.5.
Alat dan Bahan ........................................................................................ 26
3.6.
Prosedur Penelitian ................................................................................. 26
3.7.
Analisis Data ........................................................................................... 32
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ................................... 33 4.1.
Hasil Determinasi Tumbuhan ................................................................. 33
4.2.
Hasil Fermentasi Biji Kecipir ................................................................. 34
4.3.
Ekstraksi Biji Kecipir Terfermentasi ...................................................... 36
4.4.
Hasil Uji Aktivitas Antioksidan .............................................................. 39
4.5.
Kestabilan Aktivitas Antioksidan Terhadap Panas ................................. 42
BAB V PENUTUP ............................................................................................... 46 5.1.
Kesimpulan ............................................................................................. 46
5.2.
Saran ....................................................................................................... 46
DAFTAR RUJUKAN ........................................................................................... 47 LAMPIRAN .......................................................................................................... 51
iv
DAFTAR TABEL
Tabel 2.1 Komposisi Nutrisi Berbagai Bagian Tanaman Kecipir........................... 7 Tabel 2.2 Kandungan Vitamin Pada Kecipir (Anonim, 1981)................................ 7 Tabel 2.3 Komposisi Minyak Kedelai (Semon, 2006) .......................................... 13 Tabel 4.1 Karakteristik Ekstrak biji kecipir .......................................................... 37 Tabel 4.2 Hasil Uji Fitokimia Ektrak Kasar Biji Kecipir ................................... 388 Tabel 4.3 Hasil Uji Angka Peroksida ................................................................... 39
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Tanaman Kecipir ................................................................................. 6 Gambar 2.2 Biji kecipir ........................................................................................... 6 Gambar 2.4 Reaksi hidrolisis Isoflavon glukan menjadi aglukan......................... 10 Gambar 2.5 Struktur Trigliserida ........................................................................ 110 Gambar 2.6 Reaksi Hidrolisis Minyak dan Lemak ............................................... 14 Gambar 4.1 Hasil Fermentasi Biji Kecipir Selama Dua Hari ............................... 36 Gambar 4.1 Reaksi Flavonoid dengan Asam Klorida dan Mangnesium. ......... 3838 Gambar 4.2 Grafik Hubungan Antara Dosis Dengan Angka Peroksida ............... 40 Gambar 4.3 Grafik Hubungan Antara Dosis Dengan Angka Peroksida ............. 433
vi
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji Kecipir ......................................................... 52 Lampiran 2. Proses Pembuatan Tempe dari Biji Kecipir ...................................... 53 Lampiran 3. Proses Pembuatan Ekstrak Biji Kecipir .......................................... 534 Lampiran 4. Penambahan Ekstrak Biji Kecipir Pada Minyak Kedelai ............... 545 Lampiran 5. Hasil Analisis Data Mengunakan SPSS One Way Anova ............ 556
vii
BAB I PENDAHULUAN
1.1. Latar Belakang Masalah Minyak dan lemak merupakan salah satu kebutuhan penting bagi manusia. Minyak dan lemak dapat memberikan rasa gurih, tekstur dan penampakan bahan pangan menjadi lebih menarik dan permukaannya kering (Ketaren,1986). Lebih dari 50 persen pangan dibuat dari lemak dan minyak, terutama margarin dan shortening (Semon 2006). Oksidasi pada lemak atau minyak dapat menyebabkan bau tengik.Bau tengik pada minyak disebabkan oleh terbentuknya senyawa peroksida dan hidroperoksida yang mengalami konversi menjadi aldehid dan keton (Ketaren, 1986).Reaksi oksidasi dapat dihambat dengan inhibitor, yaitu antioksidan. Antioksidan dapat menghambat proses oksidasi dengan memutus rantai reaksi pembentuk radikal bebas ataupun dengan mengikat radikal bebas supaya lebih stabil sehingga tidak bereaksi dengan komponen lain (Winarsi, 2007). Selama ini pemanfaatan antioksidandalamindustricenderung menggunakan antioksidan sintetikuntuk mencegah proses oksidasi seperti butil hidroksi anisol (BHA), butil hidroksi toluene (BHT), dan tetra butil hidroksi quinon (TBHQ), karena dianggap lebih efektif, lebih ekonomis dan mudah diperoleh. Namun berdasarkan penelitian yang dilakukanoleh (Basma dkk, 2011) didapat bahwa antioksidan sintetik (BHA danBHT) dapat menyebabkan kerusakan pada hati dan bersifat karsinogenik, sehingga diperlukan alternatif lain pengganti antioksidan sintetikdengan memanfaatkan antioksidan alami.
1
2
Salah
satu
tanaman
sumber
antioksidan
terdapat
pada
familyleguminoceaeBeberapa tanamanfamilyleguminoceae diantaranya adalah kedelai, buncis dan kecipir.Dari beberapa tanaman tersebut aktivitas antioksidan tertinggi terdapat pada biji kecipir yaitu 85,19%, pada biji kedelai aktivitas antioksidannya 81,4%, sedangkan pada biji buncis aktivitas antioksidannya 52,95% (Wahyuni, 2010).Adanya aktivitas antioksidan pada tanaman tersebut karena kandungan isofavon. Isoflavon terdiri atas komponen polar (terikat gula atau glikon) dan komponen nonpolar (tidak terikat gula atau aglikon). Senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui proses hidrolisis atau dengan difermentasi menggunakan kapang rhizopus sp. sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas (aglikon) yang lebih tinggi aktivitasnya (Purwoko, 2001). Isoflavon diperoleh melalui ekstraksi dengan pelarut organik seperti etil eter, kloroform, etanol dan metanol secara maserasi (Tensiska, 2007) .Metanol 90% merupakan pelarut optimum untuk mengekstrak biji kecipir, namun penggunaanya untuk skala komersial masih perlu dikaji lebih lanjut karena bersifat toksik.Pelarut etanol 70% diharapkan dapat mengganti metanol, karena kepolaran etanol mendekati metanol dan relatif tidak beracun (Ariani, 2009). Berdasarkan uraian diatas, maka dilakukan penelitian tentangaktivitas ekstrak biji kecipir sebagai antioksidan alami penghambat pembentukan senyawa peroksida dengan menggunakan media minyak kedelai, identifikasi senyawa golongan flavonoiddan uji stabilitas panas ektrak biji kecipir terfermentasi.
3
1.2. Rumusan Masalah Berdasarkan pendahuluan diatas, maka rumusan masalah dalam penelitian ini: Bagaimana
aplikasiekstrak
biji
kecipirterfermentasi
dalam
menghambat
pembentukan senyawa peroksida pada media minyak kedelai?
1.3. Tujuan Penelitian Mengetahui aktivitas ekstrak biji kecipir terfermentasi dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida pada media minyak kedelai.
1.4. Ruang Lingkup dan Keterbatasan Penelitian Ruang lingkup dalam penelitian ini yaitu : Determinasi tanaman kecipir, Fermentasi biji kecipir, ekstraksi hasil fermentasi biji kecipir menggunakan pelarut etanol 70% dengan metode maserasi. Uji aktivitas antioksidan ekstrak biji kecipir terfermentasi dilakukan dengan melihat penurunan angka peroksida menggunakan metode titrasi iodometri.Aktivitas antioksidan ekstrak diperoleh dengan mengamati penurunan angka peroksida selama periode penyimpanan hari ke 1, 4, 8, 12 dan 16. Keterbatasan dalam penelitian ini meliputi: sampel yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan adalah hasil ekstrak dan tidak dilakukan isolasi, tidak dilakukan fraksinasi untuk memisahkan ekstrak berdasarkan kelarutan atau sifat kepolarannya, pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan melihat penurunan angka peroksida menggunakan media minyak kedelai dengan metode
4
titrasi iodometri yang tidak menutup kemungkinan terjadi kesalahan selama proses analisis. 1.5. Definisi Istilah dan Singkatan 1. Ektrak biji kecipir terfermentasi merupakan hasil ekstraksi tanaman biji kecipir terfermentasi yang telah dipisahkan dari pelarut 2. Aktivitas antioksidan adalah senyawa yang memiliki aktivitas dalam mencegah terjadinya ketengikan pada pangan akibat proses oksidasi lemak atau minyak.
3. Senyawa peroksida merupakan senyawa hasil oksidasi lemak atau minyak yang memiliki ikatan rangkap dan menimbulkan ketengikan
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Tanaman Kecipir Tanaman kecipir tumbuh subur didaerah tropis basah dengan curah hujanlebih besar dari 1600 m di atas permukaan laut.Tanah-tanah yang baik untukkecipir adalah tanah dengan bahan organik yang rendah, berpasir atau lempung.Tanaman kecipir tahan terhadap kekeringan. (Di beberapa daerah, tanaman ini dikenal dengan nama kacang belimbing (Sumatera Utara, Sumatera Barat), kacang embing (Palembang), jaat (Sunda), cipir, kecipir (Jawa), kelongkang (Bali), biraro (Menado, Ternate) (Handyani, 2013) 2.1.1. Morfologi tanaman Tanaman kecipir tumbuh merambat sehingga memerlukan bantuan penopang dalam penanamannya. Akarnya berupa akar tunggang dengan akar lateral yang panjang dan menebal serta mampu membentuk umbi. Karakter perakaran tersebut menyebabkan tanaman kecipir dapat beradaptasi dengan baik pada berbagai kondisi lingkungan dan tanah, serta dapat bertahan dan tumbuh dengan baik di lingkungan kering. Daun berupa daun trifoliat (beranak tiga) dengan leaflet atau anak daun umumnya berbentuk deltoid dengan ujung lancip. Sebagaimana tanaman kacang-kacangan lainnya, bunga kecipir berupa bunga kupu-kupu, dengan warna sayap bervariasi biru muda, biru, ungu muda atau ungu. Buah berbentuk polong bersayap 4 memanjang, umumnya berwarna hijau dan
5
6
kadang-kadang mempunyai bercak ungu .Biji berbentuk bulat dan berkulit sangat keras, biji tua berwarna krem, coklat atau hitam (Handayani,. 2013)
Gambar 2.1 Tanaman Kecipir (Wahyuni, 2010)
Gambar 2.2 Biji kecipir (Wahyuni, 2010)
2.1.2. Klasifikasi Tanaman Klasifikasi tanaman kecipir adalah sebagai berikut : Kingdom
: Plantae-plants
Subkingdom : Trachebionta Subdivision
: Spermatophyta
Division
: Magnoliopsida
Class
: Magnoliopsida
Subclass
: Rosidae
Order
: Fabales
Family
: Fabaceae
7
Genus
: Psophocarpus
Species
: Psophocarpus Tetragonolobus(Handayani, 2013)
2.1.3. Kandungan Kecipir Semua bagian tanaman kecipir, kecuali batang, dapat dikonsumsi yaitu daun, bunga, polong muda, biji baik biji segar maupun kering dan umbi. Oleh karena itu, kalangan ilmuwan menyebut tanaman ini sebagai supermarket on the stalk.Masyarakat juga memanfaatkan bagian-bagian tanaman kecipir sebagai bahan obat tradisional, misalnya untuk penambah nafsu makan, obat radang telinga, obat bisul, dan lain-lain. Beberapa manfaat lain dari kecipir ialah menyuburkan tanah karena kemampuannya mengikat nitrogen bebas dari udara, sebagai pakan ternak, tanaman penutup tanah dan dapat ditumpangsarikan dengan tanaman kehutanan (Handayani, 2013). Komposisi nutrisi pada berbagai bagian tanaman kecipir tercantum pada tabel 2.1 Tabel 2.1 Komposisi nutrisi berbagai bagian tanaman kecipir (g/100 g bobot)(Anonim, 1981) Bunga Daun Polong muda Biji muda Biji Tua Air 84,2-87,5 64,2-85,8 76,0-93,0 35,8-88,1 8,7-24,6 Energy(mJ) 0,17 0,20 0,19 0,10-1,71 1,61-1,89 Protein 2,8-5,6 5,0-7,6 1,9-4,3 4,6-10,7 29,8-39,0 Lemak 0,5-0,9 0,5-2,5 0,1-3,4 0,7-10,4 15,0-20,4 Karbohidrat 3,0-8,4 3,0-8,5 1,1-7,9 5,6-42,1 23,9-42,0 Serat 3,0-4,2 0,9-3,1 1,0-2,5 3,7-16,1 Abu 0,8 1,0-2,9 0,4-1,9 1,0 3,3-4,9 Tabel 2.2 Tabel 2.2 Kandungan Vitamin Pada Kecipir (Anonim, 1981) Daun Polong muda Biji tua Vitamin A IU 5,249-20,800 300-900 0,08 Thiamin mg/100g 3,6 0,06-0,24 0,2-0,5 Riboflavin/100g 2,6 0,080-0,12 0,1-0,25 Pyridoxine 1,0 2,0 3,1-4,6 Niacin mg/100g 15,0 0,5-1,2 25,6-63,5 Folic acid µg/100g 67 Ascorbit acid mg/100g 14,5-128 20-37 22,8 Tocopherol mg/100g 3,5 05
Umbi 54,9-65,2 0,63 3,0-15,0 0,4-1,1 27,2-30,5 1,6-17,0 0,9-1,7
8
Pada tanaman leguminoceae salah satunya kecipir mengandung senyawa isoflavon. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Sri Wahyuni dalam tanaman golongan leguminoceae (kedelai, buncis, kecipir) kandungan isoflavon tertinggi terdapat pada biji kecipir. Hasil penelitian Sri Wahyuni menunjukkan bahwa biji kedelai, buncis dan kecipir mentah memiliki total isoflavon masing-masing sebanyak (0,18%), (0,15%), dan (0,21%). Pada kedelai mentah tidak ditemukan isoflavon factor-2, tetapi buncis dan kecipir mentah ditemukan sebanyak (0,006%) dan (0,001%).Pada hasil fermentasi buncis, kecipir, kedelai kuning ditemukan jenis isoflavon factor-2, daidzein, glisitein, genistein. Hasil uji aktivitas antioksidan, berurutan dari tinggi ke rendah adalah tempe kecipir 0-hr (85,19%), tempe kedelai 3-hr (81,43%), BHT (81,15%), α-tokoferol (76,41%), vitamin C (75,62%),tempe buncis 0-hr (52,95%) dan β-karoten (43,25%). Aktivitas antioksidan pada tempe kecipir 0-hr signifikan lebih besar dari kedelai kuning fermentasi 3-hr maupun BHT, berarti kecipir berpotensi sebagai sumber antioksidan yang prospektif untuk digunakan sebagai pengganti kedelai kuning dan BHT. Aktifitas antioksidan pada buncis signifikan lebih rendah dari antioksidan BHT, α-tokoferol, vitamin C tetapi masih lebih tinggi dari antioksidan β-karoten. Senyawa isoflavon ini pada umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan glukosida.Jenis senyawa isoflavon ini terutama adalah genistin, daidzin, dan glisitin (Pradana, 2008).Bentuk glikosida dipertahankan oleh tanaman sebagai bentuk inaktif sehingga dibutuhkan sebagai antioksidan.Bentuk aktif glikosida adalah aglukon, yang dihasilkan dari pelepasan glukosa (Anderson dkk, 1998).
9
Misalnya pada kedelai mengalami berbagai perubahan setelah menjadi tempe. Perubahan-perubahan tersebut diataranya adalah rasanya menjadi lebih enak, lebih bergizi, dan lebih mudah dicerna. Salah satu faktor penting dalam perubahan tersebut adalah terbebasnya senyawa-senyawa isoflavon dalam bentuk bebas (aglukon), dan hadirnya Faktor-II, yang terdapat pada tempe tetapi tidak terdapat pada kedelai, ternyata berpotensi tinggi (dibanding dengan jenis isoflavon yang lainnya) sebagai antioksidan (Gyorgy dkk., 1964), antihemolitik (Murata, 1985), penurun tekanan darah, anti kanker (Zilleken, 1986) Perubahan tersebut disebabkan oleh proses fisik maupun proses enzimatik oleh adanya aktivitas mikroorganisme. Keterlibatan mikroorganisme pada proses pembuatan tempe terutama terjadi pada proses perendaman oleh bakteri-bakteri pembentuk asam dan proses fermentasi oleh kapang khususnya Rhizopus sp. Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses nonfermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melaluiproses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebutaglukan yang lebih tinggi aktivitasnya. Senyawa aglukan tersebut adalah genistein, daidzein dan glisitein (Pawiroharsono, 2001).Reaksi hidrolisis glukosida isoflavon menjadi aglukan isoflavon ditampilkan pada gambar 2.4
Gambar 2.3 Struktur Dasar Isoflavon
10
Gambar 2.4 Reaksi hidrolisis Isoflavon glukan menjadi aglukan (Wahyuni, 2010)
Hasil penelitian yang telah dilakukan oleh Sri Karyati 2012 menunjukkan, bahwa isoflavon pada dosis 1,3 mg isoflavon mempunyai aktivitas antioksidan sebesar 32,59 % 2,6 mg isoflavon sebesar 52,37% , 3,9 mg isoflavon sebesar 68,21 % , 5,2 mg isoflavon sebesar 82,32% dan 6,5 mg isoflavon sebesar 92,74%. Konsentrasi isoflavon yang diperlukan untuk menghambat 50 % radikal bebas atau minimum inhibition concentration 50 % (IC 50%) sebesar 2,45 mg/ml ( Rimbach, 2003)
2.2.
Lemak dan Minyak
11
Gambar 2.5 Struktur Trigliserida (Budimarwanti, 2008) Lemak dan minyak adalah trigliserida atau gliserol, kedua istilah ini berarti “ triester (dari) gliserol. Perbedaan suatu lemak dan minyak bersifat bersebrangan, pada temperature kamar lemak berbentuk padat dan minyak berbentuk cair.Sebagian besar gliserida pada hewan adalah berupa lemak, sedangkan gliserida dalam tumbuhan cenderung berupa minyak, karena itu biasa terdengar ungkapan lemak hewani (lemak babi, lemak sapi) dan minyak nabati (minyak jagung, minyak biji bunga matahari). Asam karboksilat yang diperoleh dari hidrolisis suatu lemak atau minyak, yang disebut asam lemak, umumnya mempunyai rantai hidrokarbon panjang dan tak bercabang. Lemak dan minyak sering diberi nama sebagai derivate asam asam lemak ini. Misalnya, tristearat dari gliserol diberi nama tristearin dan tripalmitat dari gliserol disebut tripalmitin. Minyak dan lemak dapat juga diberi nama dengan cara yang biasa dipakai untuk penamaan suatu ester. Sebagai contoh gliseril tristearat dan gliseril tripalmitat. Rantai hidrokarbon dalam suatu asam lemak dapat bersifat jenuh atau dapat pula mengandung ikatan rangkap.Asam lemak yang tersebar paling merata dalam alam, yaitu asam oleat mengandung satu ikatan rangkap. Asam asam lemak
12
dengan lebih dari satu ikatan rangkap adalah tak lazim, terutama dalam minyak nabati; minyak minyak ini disebut Poliunsaturat Konfigurasi disekitar ikatan rangkap apa saja dalam asam lemak alamiah adalah cis, suatu konfigurasi yang menyebabkan titik leleh minyak itu rendah. Asam lemak jenuh membentuk rantai “zig-zag” yang dapat cocok satu sama lain, secara mampat, sehingga gaya tarik van der waalsnya tinggi, oleh karena iu lemak lemak jenuh itu bersifat padat. Jika beberapa ikatan rangkap cis terdapat dalam rantai, molekul itu tak dapat membentuk kisi yang rapi dan mampat, tetapi cenderung untuk melingkar; trigliseridan tak jenuh ganda (polyunsaturated) cenderung berbentuk minyak (Fessenden,1992)
2.3.
Minyak Kedelai Kandungan minyak dan komposisi asam lemak dalam kedelai dipengaruhi
oleh varietas dan keadaan iklim tempat tumbuh.Lemak kasar terdiri dari trigliserida sebesar 90-95 persen, sedangkan sisanya adalah fosfatida, asam lemak bebas, sterol dan tokoferol. Minyak kedelai mempunyai kadar asam lemak jenuh sekitar 15% sehingga sangat baik sebagai pengganti lemak dan minyak yang memiliki kadar asam lemak jenuh yang tinggi seperti mentega dan lemak babi. Hal ini berarti minyak kedelai sama seperti minyak nabati lainnya yang bebas kolestrol, seperti yang ditunjukkan dalam komposisi dari minyak nabati dibawah ini. Kadar minyak kedelai relatif lebih rendah dibandingkan dengan jenis kacang-kacangan lainnya, tetapi lebih tinggi daripada kadar minyak serelia. Kadar
13
protein kedelai yang tinggi menyebabkan kedelai lebih banyak digunakan sebagai sumber protein daripada sebagai sumber minyak. Asam lemak dalam minyak kedelai sebagian besar terdiri dari asam lemak esensial yang sangat dibutuhkan oleh tubuh.Dibawah ini disajikan komposisi kimia minyak kedelai. Tabel 2.3 Komposisi Minyak Kedelai (Semon, 2006)
Asam Lemak Tidak Jenuh (85%)
Terdiri dari :
Asam linoleat
15-64%
Asam oleat
11-60%
Asam linolenat
1-12%
Asam arachidonat
1,5%
Asam lemak jenuh (15%), terdiri dari : Asam palmitat
7-10%
Asam stearat
2-5%
Asam arschidat
0,2-1%
Asam laurat
0-0,1%
Fosfolipida
Jumlahnya sangat kecil (trace)
Lesitin
-
Cephalin
-
Lipositol
-
Nilai gizi asam lemak esensial dalam minyak dapat mencegah timbulnya athero-sclerosis atau penymbatan pembuluh darah. Kegunaan minyak kedelai yang sudah dimurnikan dapat digunakan untuk pembuatan minyak salad, minyak goreng (cooking oil) serta untuk segala keperluan pangan. Lebih dari 50 persen pangan dibuat dari minyak kedelai, terutama margarin dan shortening. Hampir 90 persen dari produksi minyak kedelai digunakan di bidang pangan dan dalambentuk telah dihidrogenasi, karena minyak kedelai mengandung lebih kurang 85 persen asam lemak tidak jenuh (Semon, 2006).
14
2.4. Hidrolisis Minyak Reaksi hidrolisis minyak dan lemak akan dirubah menjadi asam lemak bebas dan gliserol (Gambar 2.6). Reaksi hidrolisis akan dapat mengakibatkan kerusakan minyak atau lemak dan dapat terjadi karena terdapatnya sejumlah air dalam minyak atau lemak tersebut (Ketaren, 2008). Reaksi ini akan mengakibatkan ketengikan hidrolisis yang menghasilkan rasa dan bau tengik pada minyak tersebut.
Gambar 2.6 Reaksi Hidrolisis Minyak dan Lemak
Proses hidrolisis seperti ini dapat terjadi secara alamiah terhadap minyak/lemak dan akan dapat dipercepat oleh mikroorganisme seperti lipase. Proses hidrolisis yang disengaja, biasanya dilakukan dengan penambahan basa, proses ini dikenal sebagai reaksi penyabunan.
2.5.
Oksidasi Asam Lemak Oksidasi asam lemak dimulai dengan pembentukan peroksida dan
hidroperoksida asam lemak sebagai produk primer (yang bersifat labil dan akan mudah mengalami dekomposisi oleh proses isomerisasi dan polimerisasi), selanjutnya terurainya asam lemak disertai konversi hidroperoksida menjadi aldehid dan keton (senyawa karbonil) serta asam lemak dengan berat molekul yang lebih rendah (terutama dengan jumlah atom karbon C
1
– C ) dan 9
15
persenyawaan tidak jenuh yang labil terhadap oksidasi dan perubahan panas, yang cenderung berbau tidak enak dan berwarna lebih gelap. Pembentukan peroksida cenderung bertambah dengan bertambahnya bilangan iodium (iodine value) dan kenaikan suhu.Dengan demikian intensitas ikatan rangkap atau bilangan iodium asam lemak, sangat mempengaruhi intensitas warna asam lemak sebagai hasil oksidasi asam lemak.Semakin besar nilai bilangan iodium semakin mudah teroksidasi atau semakin mudah pada pembentukan warna asam lemak yang lebih gelap.Hal ini dipengaruhi juga oleh suhu.Kenaikan suhu memepercepat perubahan warna asam lemak yang lebih gelap (Ketaren, 1986).
2.6.
Oksidan dan Radikal Bebas Pada kepustakaan kedokteran pengertian oksidan dan radikal bebas (free
radicals) sering dibaurkan karena keduanya memiliki sifat-sifat yang mirip. Aktivitas kedua jenis senyawa ini sering menghasilkan akibat yang sama walaupun prosesnya berbeda.Walaupun ada kemiripan dalam sifat-sifatnya namun dipandang dari sudut ilmu kimia, keduanya berbeda. Oksidan dalam pengertian ilmu kimia adalah senyawa penerima elektron (electron acceptor) atau senyawasenyawa yang dapat menarik elektron. Misalnya ion ferri (Fe3+) Fe3+
+ e-
Fe2+
Sedangkan radikal bebasdalam pengertian ilmu kimiaadalah atom atau molekul (kumpulan atom) yang memiliki elektron yang tak berpasangan (unpaired electron). Sebagai contoh marilah kita perhatikan molekul air (H2O), bila terdapat sumber energi yang cukup besar, misalnya radiasi, molekul air dapat mengalami pembelahan homolitik (homolytical cleavage ) :
16
H:O:H H
+
OH
atom Hradikal hidroksil
Atom H ( H) memiliki elektron yang tak berpasangan sehingga dapat pula dianggap sebagai radikal.Elektron yang tak berpasangan cenderung untuk membentuk pasangan, dan ini terjadi dengan menarik elektron dari senyawa lain disekitarnya seperti asam lemak tak jenuh, protein, polisakarida dan asam nukleat Seluruh reaksi radikal bebas dapat dijabarkan menjadi 3 (tiga) tahap, yaitutahap inisiasi, tahap propagasi dan tahap terminasi. (Rizqiana, 2012)Sebagai contoh marilah kita perhatikan reaksi-reaksi yang menyangkut reaksi radikal hidroksil sebagai berikut: Inisiasi
: RH + OH
R• + H2O
Propagasi
: R• + O2
ROO•
ROO• + RH
ROOH + R•
: ROO• + ROO•
ROOR + O2
ROO• + R•
ROOR
R• + R•
RR
Terminasi
(Rizqiana, 2012) Adanya logam walaupun dalam jumlah kecil (trace) mempunyai peran sebagai prooksidan karena menambah radikal bebas akibat perannya sebagai pemecah peroksida. M++ ROOH
RO• + OH- + M++
M++ + ROOH
ROO• + OH+ + M+
---------------------------------------------- + 2 ROOH
RO• + ROO• + H2
Logam-logam seperti Cu+ dan Cu2+ atau Fe2+ dan Fe3+ mengkatalis hydrogen peroksida, mudah mengalami pemecahan menjadi radikal RO• dan ROO•, karena logam ini dapat mengalami oksidasi-reduksi (Neczk M., 1994;
17
Stavros Lalas, 2002). Adanya panas juga sangat memacu proses oksidasi terutama pada suhu di atas 600C. Peningkatan suhu di atas 150C laju oksidasi menjadi dua kali lipat (Tranggono, 1990). Di samping itu aerasi yang membawa oksigen juga akan meningkatkan laju oksidasi (Hernani, 2005). Reaksi oksidasi pada lemak atau minyak dapat menyebabkan bau tengik. Reaksi tingkat lanjut mengakibatkan terurainya asam lemak menjadi aldehid, keton, alkohol, aromatik dan hidrokarbon, Secara menyeluruh reaksi oksidasi minyak dan lemak lebih khusus kepada asam lemak tidak jenuh.Asam lemak tidak jenuh semakin reaktif terhadap oksidasi dengan bertambahnya ikatan rangkap pada rantai molekul. Reaksi oksidasi tidak hanya merusak asam lemak atau lemak itu sendiri, tetapi juga merusak karotenoid.Hal ini menyebabkan warna asam lemak atau lemak cenderung semakin gelap.Pengujianangka peroksida dapat digunakan untuk mengidentifikasi tingkat oksidasi minyak.Minyakyang mengandung asam- asam lemak tidak jenuh dapat teroksidasi oleh oksigen yangmenghasilkan suatu senyawa peroksida. Radikal bebas dapat dihambat melalui 3 cara berikut, yaitu: Mencegah atau menghambat pembentukan radikalbebas baru. Menginaktivasi atau menangkap radikal danmemotong propagasi(pemutusan rantai). Memperbaiki kerusakan oleh radikal (Winarsi,2007)
18
2.7.
Antioksidan Antioksidan
didefinisikan
sebagai
senyawa
yang
dapat
menunda,memperlambat, dan mencegah proses oksidasi. Dalam arti khusus, antioksidanadalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi oksidasiradikal bebas dalam oksidasi lipid, protein dan karbohidrat, dalam prosesmetabolisme yang berlangsung dalam tubuh (Hery Winarsi, 2007) Antioksidan dapat berasal dari dalam tubuh dan luar tubuh.Didalamtubuh kita memiliki sistem enzym antioksidan yang bekerja secara simultan memetabolisme radikal bebas sehingga tidak meninggalkan kerusakan pada jaringan (Hodgson and Levi, 2000).Berbagai bukti ilmiah menunjukkan bahwa senyawa antioksidanmengurangi resiko terhadap penyakit kronis, seperti kanker dan penyakit jantung koroner (Amrun dkk, 2007). Berdasarkan mekanisme kerjanya antioksidan digolongkan menjadi tiga kelompok, yaitu : Antioksidan Primer (Antioksidan Endogenus). Antioksidanprimer disebut juga antioksidan
enzimatis.Antioksidan
primer
meliputi
enzim
super
oksidadismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase(GSH-Px).Sebagai antioksidan, enzim-enzim tersebutmenghambat pembentukan radikal bebas, dengan caramemutus reaksi berantai (polimerisasi), kemudianmengubahnya menjadi produk yang lebih stabil.Enzim katalase dan glutation peroksidase bekerjadengan mengubah H2O2 menjadi H2O dan O2. Antioksidan Sekunder (Antioksidan Eksogenus). Antioksidan sekunder disebut jugaantioksidan eksogenus atau antioksidan nonenzimatis.Kerja antioksidan non-enzimatis yaitu dengan caramenangkap atau mengikat radikal bebas.
19
Akibatnya,
radikalbebas
tidak
akan
bereaksi
dengan
komponen
lain.Antioksidan sekunder meliputi vitamin E,vitamin C, -karoten, flavonoid, asam urat, bilirubindan albumin. vitamin C dan karotenoid banyakterdapat dalam buah-buahan dan sayuran. Antioksidan tersier. Kelompok antioksidan tersier meliputi system enzim DNARepair dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim ini berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas (Hery,winarsi.,2007) Mekanisme kerja antioksidan dibagi menjadi dua yaitu Mekanisme pemutusan reaksi berantai radikal bebas dengan mendonorkan atom hidrogen. Antioksidan (AH) dapat memberikan atom hidrogen secara cepat pada radikal bebas (R , ROO ), sementara radikal antioksidan (A ) yang terbentuk memiliki keadaan yang lebih stabil dibandingkan radikal bebas. Contoh antioksidan ini adalah flavonoid, tokoferol, dan senyawa tiol Memperlambat laju autoantioksidan dengan berbagai mekanisme diluar mekanisme pemutusan rantai autoantioksidan dengan pengubahan radikal bebas kebentuk yang lebih stabil. Mekanismenya antara lain menghilangkan penginisiasi radikal oksigen maupun enzim yang menginisiasi radikal bebas yaitu dengan menghambat enzim pengoksidasi, penginisiasi enzim peroduksi dan mereduksi oksigen tanpa membentuk spesies radikal yang reaktif. Contoh antioksidan ini adalah Vitamin C, bilirubin, dan albumin (Wulan.,2010) Mekanisme kerja isoflavon sebagai antioksidan adalah dengan manangkap atau mengikat suatu radikal bebas.Isoflavon merupakan agen pereduksi yang menjadi donor hidrogen untuk molekul radikal dan pengelat metal (metal
20
chelator) yangberpotensi sebagai radikal bebas. Kemampuan isoflavon dalam mereduksiROS cukup kuat, sehingga mampu memberi perlindungan yang baik bagi tubuh agar dapat bertahan saat terpapar oleh radikal bebas endogen yang dihasilkan sendiri oleh tubuh.
2.8 Tinjauan Umum Determinasi Determinasi tumbuhan merupakan proses dalam menentukan nama atau jenis tumbuhan secara spesifik. Determinasi bertujuan untuk mendapatkan suatu spesies dengan tepat, karena dalam proses pemanfaatannya, tumbuhan memiliki berbagai jenis varietas yang kadang membingungkan.Untuk itulah dibutuhkan suatu acuan yang mendetail untuk menentukan spesies suatu tumbuhan, agar tepat sasaran dalam pemanfaatannya. Pengklasifikasian makhluk hidup didasarkan pada banyaknya persamaan dan perbedaan, baik morfologi, fisiologi maupun anatominya.Makin banyak persamaan di antara makhluk hidup makin dekat kekerabatannya, makin sedikit persamaan
makhluk
kekerabatannya.Pengklasifikasian
hidup
dikatakan tanaman
makin dapat
jauh dilakukan
denganmendeterminasi ataupun identifikasi. Determinasi merupakan upaya membandingkan suatu tumbuhan dengan tumbuhan lain yang sudah dikenal sebelumnya (dicocokkan atau dipersamakan). Karena di dunia ini tidak ada dua benda yang identik atau persis sama, maka istilah determinasi dianggap lebih tepat daripada istilah identifikasi (Anonim, 2008) Determinasi tumbuhan dilakukan dengan mempelajari sifat morfologi tumbuhan tersebut ( seperti posisi, bentuk, ukuran dan jumlah bagian bagian daun,
21
bunga, buah dan lainnya) langkah berikut adalah membandingkan atau mempersamakan ciri-ciri tumbuhan tadi dengan tumbuhan lainnya yang sudah dikenal identitasmya, dengan mengunakan salah satu cara dibawah ini: 1. Membandingan contoh tumbuhan yang dijumpai di lapangandengan contoh tumbuhan yang telah diketahui sifat-sifatnyadan namanya dalam herbarium 2. Membandingkan atau menyamakan tumbuhan yang ingindiketahui dengan gambar-gambar yang ada dalam manual identifikasi 3. Dengan pertolongan kunci pengenalan yang terdapat dalambuku flora 4. Bertanya kepada seoarang ahli pengenalan jenis tumbuhan (Lawrence, 1951)
2.9
Pengujian Angka Peroksida Lemak dan Minyak Angka peroksida sangat penting untuk identifikasi tingkat oksidasi
minyak.Minyakyang mengandung asam- asam lemak tidak jenuh dapat teroksidasi oleh oksigen yangmenghasilkan suatu senyawa peroksida.Cara yang sering digunakan untuk menentukanangka peroksida adalah dengan metoda titrasi iodometri.Dalam metoda ini minyakdilarutkan ke dalam larutan asam asetat glacial-kloroform (3:2) yang kemudianditambahkan KI. Dalam campuran tersebut akan terjadi reaksi KI dalam suasana asamdengan peroksida yang akan membebaskan I2. Kemudian I2 yang dibebaskan selanjutnyadititrasi dengan larutan standar natrium tiosulfat (Anwar, 1996:396).
22
2.10 Kerangka Teori Kecipir merupakan tanaman yang sangat mudah tumbuh, tanaman ini dapat tumbuh didataran rendah maupun dataran tinggi, tidak memerlukan banyak air serta daya tahan terhadap kekeringanpun juga baik.Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Sri Wahyuni tahun 2010, tanaman dari family leguminoceae yang memiliki kandugan antioksidan tertinggi adalah kecipir. Penelitian ini untuk memanfaatkan kandungan antioksidan yaitu isoflavon pada ekstrak biji kecipir untuk mencegah terjadinya oksidasi pada pangan yang berbasis lemak dan minyak.Senyawa isoflavon ini pada umumnya berupa senyawa kompleks atau konjugasi dengan senyawa gula melalui ikatan glukosida. Selama proses pengolahan, baik melaui fermentasi maupun proses nonfermentasi, senyawa isoflavon dapat mengalami biokonversi, terutama melalui proses hidrolisis sehingga dapat diperoleh senyawa isoflavon bebas yang disebut aglukan yang lebih tinggi aktivitasnya sebagai antioksidan untuk mengikat radikal bebas sehingga lebih stabil. Antioksidan merupakan senyawa yang dapat menunda dan mencegah proses oksidasi. Oksidasi adalah proses pemecahan suatu senyawa menjadi radikal atau disebut dengan reaksi pelepasan oksigen. Proses oksidasi meningkat dengan bertambahnya ikatan rangkap pada rantai molekul. Molekul yang memiliki ikatan rangkap salah satunya adalah asam lemak tidak jenuh.Asam lemak tidak jenuh biasanya terdapat dalam minyak nabati. Proses oksidasi dapat dipengaruhi dipengaruhi juga oleh suhu dan oksigen. Reaksi oksidasi pada lemak atau minyak dapat menyebabkan bau tengik.Hal tersebut otomatis dapat menurunkan mutu minyak. Reaksi dapat dihambat dengan inhibitor, yaitu antioksidan
23
Antioksidan
didefinisikan
sebagai
senyawa
yang
dapat
menunda,
memperlambat, dan mencegah proses oksidasi. Antioksidan dalam arti khusus adalah zat yang dapat menunda atau mencegah terjadinya reaksi oksidasi radikal bebas dalam oksidasi lipid, protein dan karbohidrat, dalam proses metabolisme yang berlangsung dalam tubuh (Winarsi, 2004). Berdasarkan mekanisme kerjanya antioksidan dibedakan menjadi tiga kelompok yaitu antioksidan primer, antioksidan sekunder dan antioksidan tersier. Antioksidan primer bekerja dengan cara memutus reaksi berantai, antioksidan sekunder bekerja dengan mengikat atau menangkap suatu radikal sedangkan antioksidan tersier bekerja dengan memperbaiki molekul yang rusak akibat radikal bebas. Isoflavon yang terdapat dalam biji kecipir merupakan antioksidan sekunder. Isoflavon merupakan agen pereduksi yang menjadi donor hidrogen untuk molekul radikal dan pengelat metal (metal chelator) yang berpotensi sebagai radikal bebas. Pengujian aktivitas antioksidan pada ekstak kasar kecipir dapat dilakukan dengan mengukur senyawa peroksida yang terbentuk pada minyak.Minyak mengandung asam- asam lemak tidak jenuh
yang dapat teroksidasi oleh oksigen dan
menghasilkan suatu senyawa peroksida. Pengujian tambahan, melihat stabilitas antioksidan pada ekstrak biji kecipir terhadap panas. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui kestabilan ekstrak biji kecipir sebagai antioksidan terhadap panas
2.11 Hipotesis Penelitian Ekstrak biji kecipir pada biji kecipir dapat menghambat pembentukan senyawa peroksida pada minyak kedelai
BAB III METODE PENELITIAN
3.1. Rancangan Penelitian Penelitian ini menggunakan metode penelitian jenis eksperimental dengan tujuan untuk mengetahui aktivitas ekstrak biji kecipir sebagai antioksidan alami penghambat pembentukan senyawa peroksida pada minyak.Adapun tahapan dalam proses penelitian ini meliputitahap persiapan, pengujian dan analisis data. Tahap persiapan meliputi persiapan alat dan bahan yang diperlukan sesuai dengan kebutuhan, pengumpulan bahan baku biji kecipir, fermentasi biji kecipir, dan ekstraksi .Tahap pengujian merupakan tahap dilakukannya pengujian aktivitas antioksidan ekstrak biji kecipir terhadap pembentukan senyawa peroksida pada minyak. Pengujian aktivitas antioksidan dilakukan dengan mengukur bilangan peroksida, pengujian stabilitas ketahanan panas ekstrak biji kecipir pada suhu pasteurisasi dan sterilisasi komersial dan pengujian senyawa golongan flavonoid Analisis data pengujian angka peroksida digunakan untuk membuat kesimpulan tentang aktivitas antioksidan alami padaekstrak biji kecipir dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida pada minyak dan kestabilan antioksidan terhadap panas.
24
25
3.2
Populasi dan Sampel Penelitian Populasi yang digunakan dalam penelitian ini adalah ekstrak biji kecipir,
sedangkan sampel yang digunakan adalah ekstrak biji kecipir dengan konsentrasi 1,8%, 3,6% dan 5,4% dari minyak kedelai
3.3. Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Farmakognosi Akademi Analis Farmasi dan Makanan Putra Indonesia Malang.Penelitian ini dimulai sejak pembuatan proposal pada bulan Desember hingga akhir penelitian pada bulan April-Juni 2016.
3.4. Definisi Operasional Variabel Variabel
Sub Variabel
Variabel bebas : -Konsentrasi ekstrak fermentasi biji kecipir
Variabel terikat : -Aktivitas antioksidan
Definisi Operasional
Alat Ukur
Hasil Ukur
-konsentrasi ekstrak Timbangan Nominal merupakan angka analitik yang menunjukan jumlah ekstrak biji kecipir dalam 400 g sampel
-Angka peroksida
-Angka yang menunjukkan tingkat oksidasi minyak tiap Biuret 1000 g sampel
-Stabilitas antioksidan terhadap panas
-Parameter yang menunjukan kestabilan antioksidan ketika Biuret dipanaskan pada suhu pasteurisasi (750C, 15 menit) dan suhu sterilisasi (1210C, tekanan 15 psi , 15 menit)
25
Nominal
Nominal
26
3.5. Alat dan Bahan 3.5.1. Alat Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi :timbangan kasar, timbangan analitik, oven, autoklaf, erlenmeyer, gelas ukur, beaker glass, lampu spirtus, kaki 3, kawat kassa, klem, statif, buret , waterbath.
3.5.2. Bahan Adapun bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu : biji kecipir, ragi tempe (Rhizopus sp.), etanol 70%, NaOH, HCl, logam Mg, minyak kedelai, dan tween 80. Bahan untuk evaluasi meliputi asam asetat, kloroform, KI, Na2S2O3, aquades
3.6. Prosedur Penelitian 3.6.1. Tahap Prosedur Determinasi Tanaman 1. Dikumpulkan informasi sebanyak mungkin tentang ciri tumbuhan yang akan dideterminasi 2. Dibaca pengantar tersebut dan semua singkatan atau hal hal lain yang lebih rinci 3. Dipilih kunci yang sesuai dengan ciri tumbuhan 4. Perhatikan pilihan yang ada secara hati hati 5. Jika ciri-ciri yang terdapat pada kunci determinasi sesuai dengan ciri yang dimiliki organisme yang diamati, dicatat nomor kunci determinasi 6. Konfirmasikan pilihan tersebut dengan membaca deskripsinya
27
3.6.2. Fermentasi biji kecipir 1. Pilih biji kecipir kering yang sudah tua (berwarna coklat) dengan kualitas yang bagus 2. Timbang biji kecipirsebanyak 400 g 3. Rendam biji kecipir selama 3x24 jam, ganti air perendamnya setiap 8 jam 4. Kupas kulitbiji kecipir 5. Kukus selama 60 menit 6. Tunggu dingin, lalu tambahkan ragi tempe (Rhizopus sp) sebanyak 0,4 gram 7. Bungkus biji kecipir menggunakan daun pisang 8. Biarkanselama 2 X 24 jam 9. Biji kecipir siap untuk diekstraksi
3.6.3. Pembuatan ekstrak biji kecipir Metode yang digunakan dalam hal ini yaitu metode maserasi. Adapun prosesnya adalah sebagai berikut 1. Sebanyak 400 g sampel (biji kecipir yang telah difermentasi) diblender hingga terbentuk bubur, kemudiandimaserasi dalam 750 ml etanol 70 % selama 24 jam 2. Pisahkan ampas atau residu dengan ekstrak yang dihasilkan 3. Residu ditambah dengan 400 ml etanol 70 %, kemudiandimaserasi selama 24 jam 4. Filtrasi dan filtratnya ditampung 5. Residu kedua ditambah dengan 400 ml etanol 70 %. kemudiandimaserasi selama 24 jam 6. Filtrasi dan filtratnya ditampung
28
7. Filtrat hasil maserasi kemudiandipekatkan dengan waterbath pada suhu 500C hingga diperoleh ekstrak kental (Wahyuni, 2010)
3.6.4. Pembuatan larutan pereaksi untuk analisis Angka Peroksida 3.6.4.1. Larutan KI jenuh 1. Tambahakan kristal Kalium Iodida pada aquades sampai kristal tersebut tidak larut dalam 50 mL aquadest 3.6.4.2. Larutan Na2S2O3 (0,1 N, 100 mL) 1. Siapkan alat 2. Hitung massa Na2S2O3 yang digunakan 3. Timbang zat yang dibutuhkan dengan menggunakan timbangan kasar dahulu, kemudian ditimbang lagi dengan timbangan analitik 4. Tulis massa botol timbang kosong dan massa botol timbang dengan massa Na2S2O3 5. Masukkan Na2S2O3 ke dalam botol timbang, lalu larutkan 6. Masukkan larutan Na2S2O3 ke labu ukur 100 mL, tambahkan aquades sampai tanda tara lalu kocok larutan 3.6.4.3. Larutan KIO3 0,1 N ; 50 mL ( Mr : 214,002g/mol ) 1. Siapkan alat 2. Hitung massa KIO3 yang digunakan 3. Timbang zat KIO3 yang dibutuhkan dengan menggunakan timbangan kasar dahulu, kemudian ditimbang lagi dengan timbangan analitik 4. Tulis massa botol timbang kosong dan massa botol timbang dengan massa KIO3
29
5. Masukkan KIO3 ke dalam botol timbang, lalu larutkan 6. Masukkan larutan KIO3ke labu ukur 50 mL, tanbahkan aquades hingga tanda tara lalu kocok larutan sampai homogen 3.6.4.4. Membuat KI 0,9 N ; 50 mL ( Mr : 166 g/mol ) 1. Siapkan alat dan bahan 2. Hitung massa KI yang digunakan 3. Timbang zat KI yang dibutuhkan dengan menggunakan timbangan kasar dahulu, kemudian ditimbang lagi dengan timbangan analitik 4. Tulis massa botol timbang kosong dan massa botol timbang dengan massa KI 5. Masukkan KI ke dalam botol timbang, lalu larutkan 6. Masukkan larutan KI ke labu ukur 50 mL, tambahkan aquades hingga tanda tara dan kocok larutan
3.6.5. Pembuatan indikator (pati/amilum) 1. Timbang 1 g amilum 2. Didihkan aquades sebanyak 100 mL 3. Campur amilum dengan dengan 100 mL aquades yang mendidih
3.6.6. Pembakuan Na2S2O3 1. Ambil larutan KIO3 + KI masing-masing sebanyak 5 mL menggunakan pipet volum 2. Tambah H2SO4 5 mL 3. Tambahkan indikator amylum 1-3 tetes 4. Titrasi dengan Na2S2O3 sampai ada perubahan warna dari biru menjadi tidak berwarna
30
5. Hitung volume Na2S2O3 yang digunakan 6. Lakukan titrasi sebanyak 3 kali, sebagai pembanding
3.6.7. Pencampuran ekstrak fermentasi biji kecipir dengan minyak kedelai Pencampuran ekstrak fermentasi biji kecipir dengan minyak kedelai dilakukan dengan penambahan emulglator.Emulglator yang ditambahkan sebesar 1% dari berat minyak kedelai.Emulglator yang digunakan adalah tween 80 1. Siapkan bahan yang akan digunakan 2. Bagi minyak kedelai dibagi menjadi 5 bagian masing masing berisi 150 g minyak kedelai (1 bagian kontrol positif ; 1 bagian kontrol negatif ; 3 bagian perlakuan ) 3. Tambahkan ekstrak fermentasi biji kecipir dengan konsentrasi (1,8%, 3,6% dan 5,4% dari minyak) 4. Kontrol positif ditambahkan BHT sebanyak 0,1% 5. Kontrol negatif tanpa diberi ekstrak biji kecipir maupun BHT 6. Amati angka peroksida pada penyimpanan hari ke 1, 4, 8, 12, dan 16
3.6.8. Uji angka peroksida 1. Timbang 5,00 +0,05 g contoh dalam Erlenmeyer bertutup dan tambahkan 30 mL larutan asam asetat-kloroform (3:2). Goyangkan larutan sampai bahan terlarut semua. Tambahkan 0,5 mL larutan KI jenuh 2. Diamkan selama 1 menit dengan kadangkala digoyang kemudian tambahkan 30 mL aquades
31
3. Titrasilah dengan 0,1 N Na2S2O3 sampai warna kuning hampir hilang. Tambahkan 0,5 mL larutan 1% pati. Lanjutkan titrasi sampai warna biru mulai hilang 4. Angka peroksida dinyatakan dalam mili-aquivalen dari peroksida dalam tiap 1000 g contoh Angka peroksida =
mL Na 2S2O3 X N Na 2S2O3 X 1000 𝑏𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑜 ℎ
3.6.9. Uji stabilitas ekstrak fermentasi biji kecipir pada suhu sterilisasi 1. Sterilisasi campuran minyak kedelai dan ekstrak biji kecipirpada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15 menit 2. Analisis bilangan peroksidanya
3.6.10. Uji stabilitas ekstrak fermentasi biji kecipir pada suhu pasteurisasi 1. Panaskan campuran minyak kedelai dan ekstrak biji kecipir pada suhu 75oC selama 15 menit 3. Analisis bilangan peroksidanya
3.6.11. Uji Fitokimia Pemeriksaan golongan flavonoid dapatdilakukan dengan uji warna yaitu : 1. Test Wilstatter :Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan HCl dan 2-3potong kecil logam Mg. Perubahan warnayang terjadi diamati dari kuning tua menjadiorange. 2. Test dengan NaOH 10% :Beberapa mililiter sampel dalam alcohol ditambahkan 2-4 tetes larutan NaOH 10%.Perubahan warna yang terjadi diamati darikuning tua menjadi kuning muda.
32
3.7. Analisis Data Analisis data untuk aktivitas antioksidan ekstrakfermentasibiji kecipir diperoleh dari pengujian angka peroksida. Masing-masing data yang diperoleh akan diakumulasikan dan dilakukan analisis one way anova. Data juga diperoleh dari uji stabilitas ketahanan panas antioksidan ekstrak pada suhu pesteurisasi dan sterilisasi.Data
hasil
yang
dibandingkan dan disimpulkan.
didapat
melalui
pengujian
angka
peroksida
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Determinasi Tumbuhan Tanaman yang digunakan dalam penelitian adalah biji kecipir yang diperoleh di Malang, Jawa Timur. Dari beberapa tanaman familyleguminoceae diantaranya adalah kedelai, buncis dan kecipir, aktivitas antioksidan tertinggi terdapat pada biji kecipir tua yaitu 85,19% (Wahyuni, 2010). Bagian tanaman yang digunakan dalam adalah biji kecipir (Psophocarpus Tetragonolobus L.)yang telah dilakukan determinasi di UPT Balai Materia Medika Batu.Hasil determinasi menunjukkan bahwa biji kecipir yang digunakan adalah kecipir jenis (Psophocarpus Tetragonolobus ). Kunci determinasi yang diperoleh adalah 1b-2b-4b-6b-7b-9a-41b- 42b- 43b-54a-55b-57b-58b. Berikut hasil determinasi tanaman kecipir : Kingdom
: Plantae
Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh) Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji) Divisi
: Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)
Kelas
: Magnoliopsida (Berkeping dua/ dikotil)
Sub Kelas
: Rosidae
Ordo
: Fabales
Famili
: Faboceae (Suku polong polongan)
Genus
: Psophocarpus
Spesies
: Psopocarpus tetragonolobus Dc
33
34
4.2. Hasil Fermentasi Biji Kecipir Fungsi utama fermentasi dalam penelitian ini untuk menkonversikan isoflavon yang terdapat pada biji kecipir, yang awalnya berbentuk senyawa isoflavon glikon menjadi isoflavon jenis aglikon yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan lebih tinggi. Senyawa aglikon tersebut adalah genistein, daidzein, glisitein dan faktor-2 Perubahan tersebut terjadi karena adanya reaksi hidrolisis selama proses fermentasi (Pawiroharsono, 2001). Pada fermentasi biji kecipir dilakukan beberapa tahap, diantaranya adalah tahap perendaman, pencucian, pengupasan, pemasakan, pendinginan, penambahan inokulum dan pemeraman. Tahap perendaman dilakukan selama dua hari, tujuan dilakukan permendaman diantarnya untuk melunakkan biji, menghilangkan pengotor yang menempel pada keping biji, menghilangkan lendir dan menghilangkan bau langu (Atikoh dan Supriyanti, 1997).Hal terpenting dilakukan perendaman adalah terbebasnya senyawa isoflavon aglikon yaitu daidzein, genistein dan glistein. Senyawa senyawa turunan tersebut memiliki aktivitas antioksidan yang lebih tinggi dibanding
isoflavon glikosida (daidzin, genistin, glisten)
(Handajani,
2002). Hal itu terjadi karena adanya proses fermentasi oleh bakteri bakteri yang berada pada air rendaman (Lactobacillus casei, Streptococcus faecium, dan Streptococcus epidermidis). Terjadinya fermentasi ditandai dengan terbentuknya busa dan bau kecut air rendaman.(Kasmidji, 1990). Pencuciandimaksudkan untuk menghilangkan kotoran danmengurangi mikroorganisme lain yang tumbuh selama perendaman, juga untukmembuang kelebihan asam dan lendir yang terproduksi. Lendir dan bakteri apabila tidak
35
tercuci bersih akan mengganggupertumbuhan kapang Rhizopus sp dan dapat menyebabkan kegagalan proses fermentasi (Atikoh dan Supriyanti, 1997 ). Selanjutnya dilakukan proses pengupasan kulit, hal tersebut dilakukan supaya miselium kapang dapat menembus lapisan kulit ari biji kecipir.Pada biji kecipir terdapat zat tanduk (kitin). Zat tersebut dapat menghalangimiselium mengambil nutrisi pada biji kecipir sehingga bila kulit tidak dikupas, produk tempeyang dihasilkan tidak atau kurang kompak. (Sri Wahyuni, 2010) Proses
keempat
adalah
pemasakan.
Pemasakan
dilakukan
dengan
pengukusan bukan perebusan.Hal ini dilakukan untuk mencegah terlarutnya kandungan dalam biji kecipir dalam air rebusan.Proses pemasakan dilakukan selain untuk melunakkan biji, jugasebagai proses sterilisasi untuk mematikan bakteri-bakteri yang tumbuh selamaproses perendaman (Susanto et al., 1998). Langkah selanjutnya adalah pendingan yang berguna untuk mengkondisikan suhu agar sesuai dengan pertumbuhan kapang (Kasmidjo, 1990). Setelah suhu sesuai lalu ditambahkan inokulum berupa kapang Rhizopus sp. Inokulum tersebut dapat memberi perubahan sehingga mengasilkan zat yang berbeda disaat proses fermentasi (Judoamidjojo at all, 1992). Fermentasi yang dilakukan pada biji kecipir selama dua hari menghasilkan tempe yang bertekstur padat, berwarna putih, berbau khas tempe dan bermiselium tebal. Perubahan tekstur serta munculnya miselium pada hasil fermentasi dengan menggunakan kapang rhizopus sp disebabkan oleh penembusan kapang pada biji yang keras untuk mengambil makanan dari biji tersebut sebagai nutrisi pertumbuhannya.
36
Proses awalnya kapang hanya melunakkan biji dengan dorongan mekanis akibat pertumbuhannya, selanjutnya akan diikuti oleh proses enzimatis. Ujung ujung miselium hasil pertumbuhan kapang akan melepaskan enzim antara lain enzim
lipase,
fitase,
proteolitik
dan
enzim
b-glikosidase
(Kasmidjo,
1990;Suwaryono dan Ismeini, 1998). Enzim yang dihasilkan tersebut akan menguraikan senyawa yang terkandung dalam biji kecipir. Senyawa komplek yang terkandung dalam biji kecipir seperti karbohidrat, protein, lemak akan lebih mudah dicerna
(Astuti, 1995) , sedangkan senyawa
aglikon (daidzein, dan
glistein) akan mengalami biokonversi lebih lanjut menghasilkan senyawa factor2. Hasil fermentasi biji kecipir dapat dilihat pada gambar 4.1.
Gambar 4.1 Hasil Fermentasi Biji Kecipir Selama Dua Hari
4.3. Ekstraksi Biji Kecipir Terfermentasi Ekstraksi biji kecipir dilakukan dengan cara maserasi menggunakanpelarut etanol 70%. Etanol 70% diketahui mampu mengekstrak biji kecipir secaraoptimal (Kudou et al., 1991).Etanol 70% bersifat semi polar, sehingga senyawa aktif yang memiliki kepolaran berbeda dalam biji kecipir dapat terekstrak seluruhnya, karena menurut (tensiska dkk, 2007) isoflavon memiliki dua komponen, yaitu glikon (terikat gula) yang bersifat polar dan aglikon (tidak terikat gula) yang bersifat non
37
polar. Oleh karena itu penggunaan pelarut etanol 70% yang bersifat semi polar tepat untuk mengekstrak kedua komponen isoflavon (glikon dan aglikon). Biji kecipir yang dibutuhkan dalam pembuatan ekstrak adalah 400 g biji kecipir yang terfermentasi dimaserasi dengan pelarut etanol 70% selama satu hari, kemudian disaring sehingga didapatkan ekstrak cair, selanjutnya ekstrak di pekatkan
dengan
rotary
evaporatorsampai
didapatkan
ekstrak
yang
kental.Penguapan pelarut dilakukan pada suhu 50O C supaya senyawa yang terdapat dalam ekstrak tidak rusak namun pelarut dapat menguap.Salah satu senyawa yang terdapat dalam ekstrak adalah isoflavon yang diketahui titik didihnya diatas 200OC (Ariani dan Hastuti, 2009), sehingga ketika ekstrak dipisahkan dari pelarut dengan suhu 50O C senyawa tersebut tidak rusak.Karakteristik ekstrak biji kecipir dapat dilihat pada tabel 4.1. Tabel 4.1 Karakteristik Ekstrak Fermentasi Biji Kecipir Karakteristik Organoleptis
Rendemen
Hasil pengamatan Warna = coklat Aroma = khastempe Bentuk = sangat kental 39,85%
Apabila dilihat dari karakteristik ekstrak fermentasi biji kecipir yang diperoleh, ekstrak tersebut tidak memenuhi syarat untuk dijadikan antioksidan pada produk pangan karena menurut (Schuler, 1990) persyaratan antioksidan untuk produk pangan adalah tidak berasa, tidak berwarna dan tidak berbau.Olehkarena itu supaya antioksidan dari biji kecipir dapat dimanfaatkan pada produk pangan maka perlu dilakukan pemurnian terhadap ekstrak biji kecipir.
38
Pada ekstrak biji kecipir diduga mengandung senyawa isoflavon, untuk memastikan hal tersebut maka dilakukan uji secara fitokimia. Hasil uji fitokimia dapat dilihat pada tabel 4.2 Tabel 4.2 Hasil Uji Fitokimia Ektrak Biji Kecipir Reagen Hasil Pengamatan Test Wilstatter Dari warna coklat muda menjadi kuning keorangean Test dengan NaOH 10%
Dari warna coklat menjadi kuning kecoklatan
+
+
Uji fitokimia pada ekstrak biji kecipir memberikan hasil positif adanya senyawa golongan falvonoid.Hal tersebut dibuktikan dengan terbentuknya warna jingga ketika ekstrak bijikecipir direaksikan dengan HCl dan logam magnesium. Logam magnesium dan HCl bereaksi membentuk gelembung gelembung yang merupakan gas H2. Logam Mg dan HCl pekat pada uji ini berfungsi untuk mereduksi inti benzopiron yang terdapat pada struktur flavonoid sehingga terbentuk perubahan warna menjadi jingga.Reaksi dapat dilihat pada gambar 4.1.
Gambar 4.1 Reaksi antara sampel yang mengandung flavonoid dengan asam klorida dan mangnesium.
39
Ketika direaksikan dengan natrium hidroksida terjadi perubahan warna menjadi kuning.Hal ini terjadi karena flavonoid termasuk golongan senyawa fenol.Jika fenol direaksikan dengan basa, senyawa fenol akan membentuk warna kuning yang terjadikarena sistem konjugasi dari gugus aromatik.
4.4. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan Uji aktivitas antioksidan pada ekstrak fermentasi biji kecipir dilakukan dengan menghitung angka peroksida yang terdapat dalam sampel minyak kedelai selama periode waktu penyimpanan 16 hari. Minyak kedelai digunakan sebagai media penelitian, karena minyak kedelai mengandung asam lemak tidak jenuh yang cukup tinggi, yaitu 85% (Deni,2004) sehingga lebih mudah teroksidasi dibandingkan minyak sawit. Hal tersebut dilakukan untuk mempersingkat waktu penelitian.Hasil uji angka peroksida dapat dilihat pada tabel 4.3. Tabel 4.3 Hasil Uji Angka Peroksida Selama Periode Waktu Penyimpanan 16 Hari
(+) C B A (-)
Ruang 6,5625 10,3189 9,3578 12,2478 11,3239
(+) C B A (-)
Hari ke-1 P 11,0646 13,3859 10,4799 9,5556 19,555
S 12,4695 9,1996 14,9236 14,3890 17,9754
R 13,2299 13,9312 13,3625 19,7136 17,8361
R 10,4903 6,2093 9,0195 11,2738 19,0764
Hari ke-12 P 15,7547 13,0041 10,9823 17,1819 21,4397
Hari ke-4 P 7,5383 8,8067 7,444 7,4395 15,1498
S 17,2793 13,1637 15,8786 24,6603 21,3523
S 13,3471 13,2226 14,2988 14,3736 17,1313
R 13,3949 17,6191 15,3232 20,0365 20,4723
R 4,0779 12,4541 12,2965 12,5644 13,2796
Hari ke-16 P 14,1376 18,0099 20,7303 22,5626 21,7802
Hari ke P 10,4999 12,3980 9,5042 15,1279 13,5034
S 7,9664 15,0065 10,6754 15,5916 9,1029
S 17,1831 17,9210 23,8000 16,6320 27,7959
Keterangan: C:konsentasi ekstrak 5,4% ; B:konsentrasi 3,6%; A:konsentrasi ekstrak 1,8% ;(-):kontrol negative ; (+):BHT ; R: Peralakuan suhu ruang ; P:Perlakuan suhu pasteurisasi ; S:Perlakuan suhu sterilisasi
40
Pada sistem emulsi, aktivitas antioksidan diukur menggunakan metode iodometri.Metode ini prinsipnya adalah mengukur angka peroksida yang terdapat dalam emulsi (w/o).Hasil analisis angka peroksida dinyatakan dalam meq peroksida per kg minyak kedelai.Hasil analisis angka peroksida pada sistem emulsi minyak kedelai dapat dilihat pada gambar 4.2.
Angka Peroksida (meq/kg)
25.0000 20.0000 15.0000
(+) C
10.0000
B A
5.0000
(-) 0.0000 1
4
8
12
16
Periode Waktu Penyimpanan (Hari) Keterangan: C:konsentasi ekstrak5,4% ; B:konsentrasi 3,6%; A;konsentrasi ekstrak 1,8% ; (-):kontrol negative ; (+):BHT
Gambar 4.2 Grafik Hasil Pengujian Aktivitas AntioksidanEkstrak biji kecipir Dengan Angka Peroksida Minyak Kedelai
Hasil uji angka peroksida menunjukkan adanya aktivitas antioksidan pada ekstrak biji kecipir terfermentasi, hal tersebut ditunjukkan dengan lebih rendahya angka peroksida minyak yang ditambahkan ekstrak biji kecipir dibandingkan dengan yang tidak diberi ekstrak. Dari ketiga perlakuan konsentrasi penambahan ekstrak biji kecipir, diketahui bahwa aktivitas antioksidan tertinggi terdapat pada penambahan ekstrak terbanyak, yaitu 5,4%. Hasil uji analisis secara statistika dengan SPSS 15 menggunakan uji t menunjukkan bahwa antara kontrol negatif dan penambahan ekstrak pada
41
konsentrasi 1,8% tidak ada perbedaan yang nyata karena nilai sig yang didapatkan adalah 0,116. Sedangkan pada penambahan ekstrak dengan konsentrasi 3,6%, nilai signya adalah 0,000 yang artinya bahwa ada perbedaan yang signifikan antara kontrol negatif dengan perlakuan tersebut. Pada penambahan ekstrak sebanyak 5,4% menunjukkan nilai sig 0,001 yang berarti bahwa ada perbedaan yang nyata antara perlakuan tersebut. Dari hasil analisis dapat disimpulkan bahwa aktivitas antioksidan dari tinggi ke rendah adalah, 5,4%, 3,6% dan 1,8%. Penambahan ekstrak dengan konsentrasi 1,8% tidak memiliki pengaruh yang signifikan dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida. Ekstrak biji kecicpir terfermentasi memiliki pengaruh dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida pada konsentrasi 3,6% dan 5,4%. Senyawa yang memiliki aktivitas sebagai antioksidan pada ekstrak biji kecipir terfermentsi salah satunya adalah isoflavon.Mekanisme kerja isoflavon sebagai antioksidan
adalah
dengan
manangkap
atau
mengikat
suatu
radikal
bebas.Isoflavon merupakan agen pereduksi yang menjadi donor hidrogen untuk molekul radikal dan pengelat metal (metal chelator) yang berpotensi sebagai radikal bebas. Kemampuan isoflavon dalam mereduksi ROS cukup kuat. Dari hasil analisis angka peroksida dapat dilihat bahwa angka peroksida terendah ditunjukkan oleh BHT dalam sistem emulsi lebih baik dibanding ekstrak biji kecipir.BHT lebih non polar dibandingkan ekstrak biji kecipir sehingga kelarutannya lebih baik dalam minyak yang menjadi medium uji. Kenyataan tersebut sama seperti pada penelitian (Almunady, 2010) yang membandingkan antioksidan alami dari bubuk bawang merah dengan BHT dalam sistem minyak. Menurut (Pratt, 1992) senyawa golongan flavonoid tertentu kelarutannya rendah
42
dalam lemak yang sering dianggap suatu kelemahan serius jika digunakan dalam sistem lemak ataupun minyak, oleh karena itu perlu dilakukan fraksinasi untuk mendapat ekstrak yang lebih larut dalam fase minyak dan lemah. Hasil uji aktivitas antioksidan oleh (Sri Wahyuni, 2010) menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan pada biji kecipir terfermentasi masih lebih tinggi dari BHT.Hal ini berbeda dengan penelitian ini.Pada penelitian ini antioksidan sintetik (BHT) masih lebih baik dibanding ekstrak biji kecipir dalam menurunkan angka peroksida.Perbedaan hasil uji tersebut karena pada penelitian aktivitas antioksidan (Sri Wahyuni, 2010) ekstrak tidak diaplikasikan pada media minyak, sehingga tidak dibutuhkan emulsifier sebagai media pencampuran antara minyak dan ekstrak.Dari hasil tersebut menunjukkan bahwa penggunaan emulsifier dapat menurunkan nilai aktivitas antioksidan. Menurut (Schwarz et all, 2000), rendahnya aktivitas antioksidan dalam suatu sitem emulsi dimungkinkan karena peran prooksidan dari pengemulsi. Minyak utuh dengan penambahan emulsifier akan membentuk hidroperoksida lebih besar daripada tanpa adanya penambahan emulsifier.
4.5. Kestabilan Aktivitas Antioksidan Terhadap Panas Ketahanan panas merupakan syarat utama bila antioksidan akan digunakan pada pangan, karena kebanyakan pengguanaan minyak ataupun lemak membutuhkan pengolahan dengan suhu tinggi seperti pelelehan, pengorengan dan pemanggangan. Pengujian stabilitas panas antioksidan ekstrak biji kecipir dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida dilakukan dengan memberi perlakuan panas,
43
yaitu dengan pasteurisasi dan sterilisasi.Hasil uji stabilitas antioksidan pada perlakuan pemanasan dapat dilihat pada gambar grafik 4.3 dan 4.4.
Angka Peroksida (meq/kg)
25.0000 20.0000 15.0000
(+) C
10.0000
B A
5.0000
(-)
0.0000 1
4
8
12
16
Periode Waktu Penyimpanan (Hari) Keterangan: C:konsentasi ekstrak5,4% ; B:konsentrasi ekstrak 3,6%; A;konsentrasi ekstrak 1,8% ; (-):kontrol negative ; (+):BHT
Gambar 4.3 Grafik Hasil Pengujian Stabilitas AntioksidanEkstrak Biji KecipirPada Suhu Pasteurisasi.
Angka Peroksida (meq/kg)
30.0000 25.0000 20.0000 (+) 15.0000
C
10.0000
B A
5.0000
(-)
0.0000 1
4
8
12
16
Periode Waktu Penyimpanan (Hari) Keterangan: C:konsentasi ekstrak5,4% ; B:konsentrasi ekstrak 3,6%; A;konsentrasi ekstrak 1,8% ; (-):kontrol negative ; (+):BHT
Gambar 4.4 Grafik Hasil Pengujian Stabilitas Antioksidan Ekstrak Biji Kecipir Pada Suhu Sterilisasi
44
Pada grafik 4.3 menunjukkan bahwa antioksidan yang memiliki stabilitas terbaik ketika
diberi perlakuan suhu, baik suhu pasteurisasi maupun suhu
sterilisasi adalah antioksidan sintetis (BHT). Cara kerja BHT dalam menghambat senyawa peroksida pada minyak adalah dengan memberikan atom hidrogen secara cepat pada senyawa radikal sehingga senyawa radikal menjadi lebih stabil. Cara kerja isoflavon dalam menghambat senyawa peroksida minyak memang sama dengan BHT namun kestabilan aktivitasnya berbeda. Hasil penelitian ini sama dengan penelitian (Tensiska dkk, 2007) bahwa stabilitas BHT lebih baik dari ekstrak etil asetat maupun etanol dari ampas tahu. Proses pemanasan pada saat perlakuan mengakibatkan aktivitas antioksidan pada ekstrak biji kecipir menjadi lebih tidak sabil. Hasil pengujian angka peroksida pada suhu sterilisasi menunjukkan hasil yang hampir sama dengan pengujian pada pasteurisasi perbedaannya hanya terletak pada lebih tingginya pelonjakan angka peroksida pada masa penyimpanan, semakin lama waktu simpan, lonjakan angka peroksidanya semakin besar. Angka peroksida pada hari terakhir penyimpanan, yaitu pada hari ke 16 meununjukkan angka peroksida lebih tinggi dari perlakuan suhu pasteurisasi. Proses pemanasan dengan adanya tekanan pada saat perlakuan mengakibatkan aktivitas antioksidan pada ekstrak biji kecipir menjadi sangat tidak sabil, hal tersebut berbeda dengan BHT yang tetap memiliki aktivitas antioksidan stabil walaupun setelah diberi perlakuan sterilisasi. Hasil analisis data berdasarkan statistik menggunakan SPSS one way anova menunjukkan bahwa perlakuan pada suhu ruang, pasteurisasi dan sterilisasi tidak ada perbedaan yang signifikan, karena nilai sig hasil uji SPSS adalah 0,782 atau
45
lebih dari 0,05, sehingga dapat disimpulkan bahwa ekstrak kasar pada biji kecipir dapat menurunkan angka peroksidawalaupun dengan pemanasan. Jadi ekstrak kasar
biji
kecipir
dapat
dimanfaatkan
sebagai
pengganti
antioksian
sintetik.Penggunaan antioksidan ekstrak biji kecipir paling baik pada sistem pangan yang tidak membutuhkan pemanasan dengan suhu terlalu tingi.
BAB V PENUTUP
5.1. Kesimpulan Dari hasil penelitian yang telah dilakukan, dapat disimpulkan bahwa ekstrak biji kecipir yang telah difermentasi dengan kapang rhizopus sp.memiliki aktivitas sebagai antioksidan alami dalam menghambat pembentukan senyawa peroksida.
5.2. Saran 1. Perlu dilakukan pemurnian senyawa isoflavon dari ekstrak biji kecipir untuk memperbaiki mutu fisik dari antioksidan supaya dapat diaplikasikan dalam sistem pangan sehingga dapat dijadikan sebagai pengganti antioksidan sintetik. 2. Perlu dilakukan pengkajian fraksinasi ekstrak biji kecipir untuk memisahan ekstrak berdasarkan sifat kepolarannya, sehingga mampu meminimalisasi penggunaan emulglator
46
DAFTAR RUJUKAN
Aprilianti, Wulan Nur. 2010.Penentuan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Beras Merah dan Beras Hitam dan Produk Olahannya Berupa Nasi.Skripsi, Bandung: Program Strata Satu Universitas Pendidikan Indonesia.
Amrun, M., Umiyah dan Umayah E. 2007.Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Air dan Ekstrak Metanol Bberapa Varian Buah Kenitu ( Chysophyllum cainito L.) dari Daerah Jember. Berk.Penel. Hayati2007;13:45-50
Anderson JJB, Carner SC. 1997.The effect of phytoestrogens on bone. Nutr.Res. 17: 1617-1623.
Anonim. 1981. The Winged Bean A High-Protein Crop for the Tropics. Second edition.Report of an Ad Hoc Panel of the Advisory Committee on Technology Innovation, Board on Science and Technology for International Development. Commission on International Relation.National Research Council. Washington: National Academy Press.
Anwar, Chairil dkk. 1996. Pengantar Praktikum Kimia Organik. Jakarta: DepartemenPendidikan dan Kebudayaan, DIKTI.
Ariani,S.R.D. dan Hastuti W. 2009. Analisis Isoflavon dan Uji Aktivitas Antioksidan pada Tempe dengan Variasi Lama Waktu Fermentasi dan Metode Ekstraksi. Surakarta: FKIP. Atikoh dan Supriyanti.1997.Perlakuan Perendaman, Pengukusan, Prebusanserta Kombinasinya terhadap Kandungan asam Fitat dan antiKemotripsin pada Kacang Tholo dan Gude. Skripsi S1. UGM.Yogyakarta. Basma et al. 2011.Antioxidant activity and phytochemical screening of the Methanol Extracts of Euphorbia hirta L. Asian Pasific Journal of Tropical Medicine. Budimarwanti, C. 2008. Analisis Lipida Sederhana dan Lipida Kompleks. (Online), (http://www.Word-to-PDF-Converter.net, diakses pada tanggal 20 April 2013 pukul 18.06 WITA).
47
48
Chang, S.S., Bostric-Matijasevic, O.A.L., Hsieh and C.L. Huang. 1977. Natural Antioxidants from Rosemary and Sage.J.Food Sci.42:574.
Departemen Kesehaan Republik Indonesia. 2012. Undang Undang Republik Indonesia Nomor 033 Tahun 2012tentang Kesehatan
Doloksaribu, Rianto. 2011. Isolasi Senyawa Flavionoid dari Daun Tumbuhan Harimonting ( Rhodomyrtus Tementosa W.ait). Sumatera Utara: Universitas Sumatera Utara Institutional Respository.
Eddy Afrianto dkk.2008. Pengawasan Mutu atau Produk Pangan.Jakarta: Direktorat Pembinaan Sekolah MenengahKejuruan.
Fessenden dan Fessenden. 1992. Kimia Organik, Cetakan ketiga, Jilid 1. Jakarta: Erlangga.
Karadita, Galuh Dian. 2011. Studi Aktivitas Antioksidan Vigin Coconut Oil Dengan Penambahan Ekstrak Etanol Tempe Koro Bengkuk Selama Penyimpanan Pada Suhu Ruang. Surakarta : Universitas Sebelas Maret
Goffman, F.D. 2003. Genetic diversity for Lipid Content and Fatty Acid Profile in Rice Bran. J. Am. Oil Chem. Soc.80:485-490
Gyorgy, P., Murata K., Ikehata H. 1964. Antioxidant isolated from fermented soybeans (tempe). Nature, 203 (4947), 870-871.
Handajani S dan Windi Atmaka. 1993. Analisa Sifat Phisis-khemis Beberapa Biji Kacang-kacangan, Kekerasan, Kualitas Tanah, Protein, dan Kandungan Mineralnya.Surakarta: Lembaga Penelitian UNS.
Handayani, Tri. 2013. Kecipir (Psophocarpus Tetragonolobus) Terpinggirkan. Bandung: Balai Penelitian Tanaman dan Sayuran
Hernani dan Mono Raharjo. 2005.Tanaman Berkhasiat Antioksidan.Jakarta: Penerbit Swadaya.
49
Judoamidjojo M, Darwis AA, Gumbira. 1992. Teknologi Fermentasi. Jakarta: Rajawali Press.
Kasmidjo, R.B. 1990. Tempe: Mikrobiologi dan Biokimia, Pengolahan SertaPemanfaatannya. Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi.UGMYogyakarta.
Ketaren, S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan.Jakarta, Universitas Indonesia Press (UI-Press).
Kudou, S., Y.Fleury., Welti, D., Magnolato,D., Kitamura,K. dan Okubo K. 1991. Malonyl Isoflavone Glycosides in Soybeans Seed (Glycine max Merril). Agric. Biol. Chem. 55: 2227-2233.
Kusumawati, Yuwida. 2014. Pemanfaatan Biji kecipir Sebagai Pengganti Kedelai Dalam Pembuatan Kecap Dengan Menggunakan Ekstrak Nanas dan Ekstrak Pepaya.Skripsi. Surakarta: Program Sarjana Universitas Muhammadiya Surakarta.
Lawrence, G.H.M. 1951.Taxonomy of Vascular Plants.New York: The Macmillan Company.
O. Suprijana, Ace, T. Hidayat dan Ukun MS Soedjanaatmadja. 2002. Jurnal Bionatura. Bandung: Fakultas MIPA Universitas Padjadjaran
Pawiroharsono, S.1998. Benarkah Tempe Sebagai Anti Kanker. Jurnal Kedokteran dan Farmasi MEDIKA.12: 815-817
Prabowo, Adityo., Siti Ari Budhianti dan Amir Husni. 2013. Ekstrak Sargassum sp. Sebagai Antioksidan Dalam Sistem Emulsi Minyak Ikan Selama Penyimpanan Pada Suhu Kamar. Yogyakarta: Universitas Gadjah Mada . Pradana, S. 2008. Prospek dan Manfaat Isoflavon sebagai Fitoestrogen Bagi Kesehatan.Jakarta.
Purwoko, T., S,Pawiroharsono dan I,Ginandjar. 2001. Biotransformasi Isoflavon oleh Rhizopus oryzae UICC 524. BioSMART, 3(2), 36-39.
50
Rizqiana Dewi, Aktivitas Antioksidan dan Sitotoksisitas Metabolit Sekunder Daun Salam(Syzygium polyanthum Wight) Dan Daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia Lamk.). Skripsi.Bogor :Program studi strata satu Institut Pertanian
Semon, M., Patterson, M., Wyborney, P., Blumfield, A. and Tageant, A. 2006. Soybean Oil.http://www.wsu.edu/~gmhyde/433_web_pages/433Oil-webpages/Soy/soybean1.html. Diakses tanggal 1 Desember 2006.
Susanto T, B Zubaidah, S.B.Wijanarko.. 1998. Studi Tentang Aktivitas Antioksidan pada Tempe Terhadap Lama Fermentasi, Jenis Pelarut dan Ketahanan Terhadap Proses Pemanasan. Malang: Fakultas Teknologi Pertanian Universitas Brawijaya.
Tensiska, Marsetio, dan Silvia Oktavia Nur Yudiastuti. 2007. Pengaruh Jenis Pelarut Terhadap Aktivitas AntioksidanEkstrak biji kecipir Dari Ampas Tahu. Jurusan Teknologi Industri Pangan, FTIP. Universitas Padjadjaran.
Wahyuni, Sri. 2010. Karakterisasi Senyawa Bioaktif IsoflavonDan Uji Aktivitas Antioksidan Dari EkstrakTempe Berbahan Baku Buncis (Phaseolus Vulgaris) dan Kecipir (Psophocarpus Tetragonolobus). Tesis. Surakarta: Universitas Sebelas Maret
Winarsi,Hery. 2007.Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, (Yogyakarta: Kanisius)
Wulan Nur Aprilianti. 2010.Penentuan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Beras Merah dan Beras Hitam dan Produk Olahannya Berupa Nasi.Skripsi. Bandung: Program Strata Satu Universitas Pendidikan Indonesia
Ziliken, F.I. 1987. Production of Novel Isoflavons.Material Meeting.BMBF, Bonn,Germany.
51
Lampiran 1. Hasil Determinasi Biji Kecipir
52
Lampiran 2. Proses Pembuatan Tempe dari Biji Kecipir
Biji kecipir sebanyak 400 g
Hasil fermentasi biji kecipir
Direndam selama 2 hari, lalu cuci dengan air mengalir
Kupas kulit ari
Tambahkan kapang rhizopius sp, lalu fermentasi selama 2 hari
Kukus selama 1 jam
53
Lampiran 3. Proses Pembuatan Ekstrak Biji Kecipir
Biji kecipir hasil fermentasi
Pekatkan ekstrak dengan waterbath
Haluskan sampai menjadi bubur
Maserasi dengan etanol 70% selama 2 hari
Hasil ekstrak dipisahkan dengan pelarut
Pisahkan ampas dengan ekstrak
54
Lampiran 4. Hasil Penambahan Ekstrak Biji Kecipir Pada Minyak Kedelai
8,1g/150g minyak
2,7g/150g minyak 5,4g/150g minyak
Control (-) Control (+)
55
Lampiran 5. Hasil Analisis Data Mengunakan SPSS One Way Anova
