Aplikace hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometr měří pouze hmotnost, na nás je jak toho využijeme.
Peptide mass fingerprinting • Rozštěpení neznámého proteinu specificky štěpící proteasou. • Stanovení hmotností vzniklých peptidů pomocí MALDI-TOF MS. • Porovnání naměřených hmotností s vypočtenými. Všechny sekvence v dostupné proteinové databázi jsou virtuálně naštěpeny za stejných podmínek jako stanovovaný vzorek a data porovnány.
Peptide mass fingerprinting
Peptide mass fingerprinting
Peptide mass fingerprinting
Často používané enzymy
Co ovlivňuje identifikaci • Velikost peptidů – příliš velké nebo malé. • Nespecifické štěpení proteinů (aktivní proteasy). • Modifikace proteinu – oxidace M, acetylace N-konce, nečekané modifikace. • Vlastní měření – kalibrace. • Bioinformatika – databáze, taxonomie. • Kontaminace – keratiny, BSA, … • Vzájemné potlačení signálů peptidů. • Vzorek obsahuje směs proteinů.
Peptidové mikrosekvenování • Důvěryhodnější než PMF. • Vhodné i pro velmi komplexní směsi proteinů (až celobuněčné lyzáty). • Většinou spojeno s kapalinovou chromatografií (i vícedimenzionální). • Lokalizace modifikací (posttranslačních, chemických).
Peptidové mikrosekvenování
Výhody a nevýhody • • • •
• • • •
Snadná automatizace. Identifikace proteinů ze složitých směsí, lokalizace PTM. Identifikace homologních proteinů z jiných organismů. Možná identifikace peptidů nesoucích nepředpokládané modifikace, SNPs, štěpených nespecifickými proteasami. K identifikaci lze použít nukleotidové databáze. Ke spolehlivé identifikaci stačí jen dva peptidy (popř. 1 – one hit wonders). Ve srovnání s PMF nutná dražší instrumentace, delší doba experimentu (chromatografická separace). Identifikují se peptidy!!! Určení přítomných proteinů může být obtížné.
Od peptidů k proteinům • Vytvořit minimální seznam proteinů, které by vysvětlily přítomnost identifikovaných peptidů.
Protein A
Peptide 1
Protein B
Peptide 1
Protein C
Peptide 2
Peptide 3 Peptide 3
Peptide 2
Od peptidů k proteinům
Nesvizhskii, A. I. and Aebersold, R. (2005). Interpretation of shotgun proteomic data - The protein inference problem. Mol. & Cellular Proteomics, 4, 1419-1440.
Bottom-up vs. Top-down • Bottom-up – protein je nejprve rozštěpen na peptidy, peptidy fragmentovány (MS/MS), identifikace peptidů z MS/MS spekter, nalezení proteinů. • Top-down – protein je rovnou fragmentován v hmotnostním spektrometru, identifikace proteinu z MS/MS spektra.
Proteomika • Termín zaveden v 1994 pro označení veškerého proteinového komplementu kódovaného genomem. • Problém - 22 000 lidských genů kóduje přinejmenším 500 000 proteinů. • Výzkum zahrnuje: identifikaci veškerých proteinů produkovaných buňkou, definici vzájemných interakcí těchto proteinů nezbytných pro určitou biologickou funkci a stanovení přesné trojrozměrné struktury proteinů klíčové pro identifikaci nízkomolekulárních ligandů. • Základní nástroje - 2D elektroforéza, 2D kapalinová chromatografie, hmotnostní spektrometrie. • High throughput analýzy (robotizace), diferenční analýzy normální vs patogenní stav, kvantifikace.
Biomarker • Látka sloužící jako indikátor biologického stavu. • Po pečlivé validaci slouží jako indikátor normálního nebo patogenního stavu či odezvy na léčebný zásah. • V literatuře navrhováno mnoho potenciálních biomarkerů, ale velice málo z nich je užíváno v klinické praxi. • Příklad - odlišná glykosylace, odlišná exprese isoforem proteinů za patologických podmínek. • Problém – často stejné proteiny uváděné jako biomarkery velmi odlišných chorob.
2D elektroforéza
Proč 2D elektroforéza • Vyzrálá technika, známy výhody i limity. • Snadné spojení s imunoblottingem, hmotnostní spektrometrií, vysoké rozlišení. • Separace na úrovní proteinů – identifikace isoforem, PTM. • Kvantifikace ještě před MS – drastické snížení počtu spotů pro identifikaci. • Precipitace během isoelektrické fokusace, zvláště membránové proteiny. • Více proteinů v jednom spotu – který protein je regulován?!? • Nízká reprodukovatelnost 2D gelů. • Omezená hloubka pokrytí proteomu – detekovány pouze nejabundantnější proteiny, nutná frakcionace, odstranění proteinů (rubisco, sérum – HSA, komplement, imunoglobuliny).
Barvení 2D gelů • Citlivost, linearita, kompatibilita s hmotnostní spektrometrií.
• Koloidní Coomassie Brilliant Blue – střední citlivost, velmi dobrá linearita, excelentní kompatibilita s MS. • Stříbro – citlivější než CBB, omezená linearita, reprodukovatelnost barvení, kompatibilita s MS občas problematická.
• Fluorescenční barviva – dobrá citlivost, linearita a kompatibilita s MS (ale jsou výjimky!!!). • Klíčová analýza obrazu – výsledky odlišné i mezi různými verzemi stejného programu.
Difference gel electrophoresis (DIGE)
Difference gel electrophoresis (DIGE) • Označení vzorků (max. 2) a směsného standardu před vlastní 2D elektroforézou. • Po elektroforéze se laserovým skenerem získají obrazy, kde se kvantitativně vyhodnotí změny intenzit skvrn vzorků a standardu. • Mnohem reprodukovatelnější než klasická denzitometrické kvantifikace spotů. • Značná úspora času a materiálu – menší počet elektroforéz při stejném počtu vzorků. • Vysoký dynamický rozsah kvantifikace – čtyři řády (100x více než stříbro, také vyšší citlivost). • Nevýhody – značky extrémně drahé a mají omezenou životnost, nutnost pořízení fluorescenčního skeneru.
DIGE – praktický příklad • Šest odrůd pšenice, odběr vzorků ve čtyřech časových bodech, tři biologická opakování.
6 x 3 x 4 = 72 vzorků DIGE – 36 elektroforéz Klasické 2D elfo – min. 216 elektroforéz (72 x 3 technická opakování)
2D a více kapalinová chromatografie • Cílem snížit komplexitu vzorku před MS analýzou. • Kombinace chromatografických metod pracujících na různém principu (orthogonalita). • Nejčastější uspořádání: SCX-RP LC, dále SAX-RP nebo RP vysoké pH – RP nízké pH, GPC (proteiny) – rozštěpení na peptidy, dále SCX-RP LC. • Kombinace s elektroforetickými technikami: IEF (peptidy)-RP LC, GeLC – 1D SDS-PAGE (proteiny) – RP. • Kapilární a nano kolony, nízké průtoky, UHPLC.
Kvantifikace pomocí MS • MS není v zásadě kvantitativní technika - různé peptidy se neionizují stejně, vzájemné potlačování ionizace ve směsi…
• Absolutní kvantifikace – isotopově značený standard, Hi3. • Relativní kvantifikace - sledování změny koncentrace proteinů mezi různými vzorky/fyziologickými stavy. • Label free metody. • Metody se značkou - SILAC, iTRAQ, TMT, ICAT, 18O.
Isotope coded affinity tag (ICAT) • Kovalentně se váže na cystein, obsahuje i biotin pro afinitní purifikaci. • Lehká a těžká forma (značená uhlíkem 13C) se liší o 9 Da. • Kvantifikace dosaženo porovnáním intenzit píků lehké a těžké formy.
Isotope coded affinity tag (ICAT) • Kvantifikace pouze peptidů obsahujících cystein – zjednodušení MS spekter, ale problémem membránové proteiny.
Isobaric tag for relative and absolute quantification (iTRAQ) • Metoda založena na kovalentní modifikaci postranního řetězce lysinu nebo N-konce peptidu. • Možnost porovnat až 8 fyziologických stavů během jednoho experimentu. • Značky mají stejnou hmotnost (isobarické) - nerozlišitelné při MS. • Během MSMS analýzy dochází k odštěpení reportérového fragmentu (113-121 Da, mimo 120). • Kvantifikace dosaženo porovnáním intenzit reportérových fragmentů.
iTRAQ značka
Schéma iTRAQ experimentu
Stable isotope labelling with amino acids in cell culture (SILAC) • Použitelné pro buňky rostoucí na živném médiu. • Jedna část buněk roste na normálním médiu, druhá část na 13 médiu obsahujícím AK značenou C (často arginin, lysin). • Obě části smíchány, rozštěpeny trypsinem, rozděleny 2D-LC a analyzovány MS(MS). • Kvantifikace z intensit párů lehký – těžký.
Absolute quantification of abundance (AQUA) • Absolutní kvantifikační metoda. • Kvantifikace signálu peptidu se signálem identického, izotopově značeného peptidu. • Kvantifikace jednoho nebo několika vybraných peptidů (proteinů) – targeted quantification. • Kritická je volba peptidu a optimalizace chromatografie.
Label free kvantifikace • Bez použití značky. • Vzorek je naštěpen trypsinem, směs peptidů rozdělena 2D-LC nebo kombinací IEF a 1D-LC a změřena MSMS spektra. • Kvantifikace – intensita píků nebo spectral counting, Hi3. • Intensita píků – porovnání intensit píků příslušných peptidů mezi vzorky (EIC). • Spectral counting – počítá se výskyt peptidů příslušejících určitému proteinu (čím častěji jsou peptidy vybírány pro MS/MS analýzu tím více je proteinu ve vzorku). • Hi3 – absolutní metoda, intenzita tří nejintenzivnějších peptidů daného proteinu je úměrná jeho koncentraci, kvantifikace umožněna porovnáním intenzit se standardem přidaným ve známém množství.
Multiple reaction monitoring (MRM) • Cílená kvantifikace peptidů ve vzorku. • Vysoká citlivost, specifita, dobrá prostupnost vzorků. • Možná absolutní kvantifikace při použití izotopově značeného standardu. • Scheduled MRM (sMRM) – využití znalosti elučních časů analyzovaných peptidů – možno kvantifikovat 10ky až 100ky proteinů.
Se značkou nebo bez? • Se značkou – isotopicky značené značky jsou drahé, kvantitativnost značení?!, ale možnost multiplexnosti analýzy – možnost analyzovat více vzorků během jednoho LC-MS/MS nástřiku, značení, měření a analýza dat poměrně nenáročná.
• Bez značky – žádné náklady na značení, ale nutnost provádět opakované nástřiky pro statistické vyhodnocení – přístrojový čas drahý, nutná vysoká stabilita LC-MS, reprodukovatelnost přípravy vzorku pro analýzu, pečlivé natrénování na modelových vzorcích před analýzou ostrých vzorků.
MALDI Biotyping • Identifikace mikroorganismů v rutinních klinických vyšetřeních, kontrolách kvality potravin i armádní využití (biologické zbraně). • Založeno na předpokladu, že proteiny uvolněné během přípravy vzorku jsou charakteristické pro každou bakterii. • Bakterie naneseny na MALDI terčík a překryty matricí, nebo nejdříve ošetřeny organickým rozpouštědlem (ethanol, acetonitril) pro rozrušení buněčné stěny. • Identifikace bakterie – porovnání změřeného spektra s knihovnou referenčních spekter.
Spektra bakterií
Identifikace Mykobakterií
Identifikace plísní
MALDI Imaging • Technika umožňující zobrazit distribuci proteinů, léčiv a jejich metabolitů, biomarkerů na tenkém řezu tkáně. • Tenký plátek tkáně pokryt matricí a zaveden do MALDI spektrometru. • Spektrometr postupně zaznamenává prostorovou distribuci látek (peptidy, proteiny, malé molekuly) v tkáni. • Získaná data jsou příslušným softwarem zobrazena na optickém snímku tkáně. • Nejsou třeba žádné protilátky, sondy, fluorescenční barviva nebo radioaktivní značení.
Studium posttranslačních modifikací • Posttranslační modifikace (PTM) významně ovlivňují funkci proteinu. • PTM mění hmotnost proteinu/peptidu - přístupné pro MS analýzu. • Velmi časté - glykosylace, fosforylace, methylace, hydroxylace, acetylace… • Často nutná afinitní purifikace - např. izolace glykopeptidů pomocí lektinů.
Fosforylace • Jedna z nejdůležitějších a nejrozšířenějších PTM, zároveň velmi obtížně studovatelná. • Fosfoserin (90 %), fosfothreonin (10 %), fosfotyrosin (0,01 %) • Velmi heterogenní, často jen malá část zbytků je fosforylovaná, mění se v čase. • Specialita MS - špatná ionizace fosfopeptidů díky záporně nabité fosfoskupině/fosfoskupinám. • Afinitní purifikace před MS - protilátky, ionty kovů (Fe3+, Ga3+), oxidy kovů (TiO2, ZrO2).
Fosforylace - lokalizace • Posun hmotnosti (80 Da) - možno v případě je-li v sekvenci pouze jeden fosforylovatelný zbytek. • Sekvenování peptidu - problém - fosforylace velmi labilní během ToF/ToF nebo CID experimentu. • Lepší výsledky s ECD/ETD - jemnější než výše zmíněné techniky, lepší pokrytí sekvence.
Peptid DIGSESTEDQAMEDIK
Glykosylace 3 main structural types of N-glycans: High-mannose type
Complex type
Hybrid type
Glykosylace Core structures of O-glycans: GalNac is common sensus core
Proč je studium glykosylace obtížné? • Makroheterogenita – různé molekuly téhož proteinu mají rozdílné sacharidové řetězce. • Mikroheterogenita – jedno glykosylační místo může nést rozdílné sacharidové řetězce.
250 500 750 1000 1172.477
1250 1500 1750 2000 2250
2430.903
83.05
2487.920
120.00
2634.040
2529.755
2375.842
2268.893
2122.714
1538.544
Peptide moiety
1673.369 1741.612
1595.598
1502.489
204.090
1272.535
x105 2.0
1392.540
1313.564
1014.438
897.383
751.276 817.269
606.209
459.101 526.218
0.5 168.077
1.0
258.084 321.120 387.096
126.052
Intens. [a.u.]
Příklad fragmentace MALDI-ToF/ToF
Example: Fragmentation of mAB N-glycopeptides in MALDI-TOF/TOF
Glycan moiety
1.5
17.00
0.0 2500 m/z
Příklad fragmentace ESI-CID Example: CID-MS/MS of mAB N-glycopeptide on amaZon: +
pep
N-acetylglucosamine galactose mannose fucose sialic acid
++
peptide
1229.0 1200.2
+
pep
+
pep
+
pep +
pep
1046.5
944.9 1025.6
2400.0
1709.8
1506.7
1098.9
+
pep
1887.8
++
pep
893.3
1360.7
++
pep
pep
400
800
1200
1600
2000
2400 m/z
Studium prostorové struktury • Vhodné pro • špatně krystalizující proteiny • malé množství proteinu k dispozici
• směsi proteinů • Studium • interakce proteinů, protein/DNA • konformačních změn (vazba substrátů, aktivátorů…) • membránových proteinů • potvrzení predikovaných modelů • Specifické modifikace aminokyselin, prokřižování pomocí bifunkčních činidel, výměna vodíku za deuterium.
Specifické modifikace aminokyselin • Pomocí činidel specificky reagujících s určitými aminokyselinami zmapovat povrch proteinu. • Reaktivní aminokyseliny - Tyr, Trp, Lys, His, Arg, Cys, Glu, Asp. • Používaná činidla - tetranitromethan, jod (Tyr), Sulfo-NHSacetát (Lys), diethylpyrokarbonát (His), p-hydroxyfenylglyoxal (Arg), N-ethylmaleinimid (Cys). • Modifikační činidlo způsobí definovaný hmotnostní posun (např. acetylace - 42 Da). • Nespecifická činidla – hydroxyl footprinting. • Problémy – reaktivitu ovlivňuje i mikrookolí dané AK, udržení nativní struktury.
Obecný postup Modifikace proteinu 72 Da
Odstranění přebytku činidla Enzymové štěpení proteinu Změření hmotnostních spekter Identifikace modifikovaných AK zbytků
Lokalizace chemické modifikace – peptid HFQFQSPYEGGR
Prokřižování pomocí bifunkčních činidel • Používají se činidla s dvěma reaktivními skupinami, které specificky reagují s dostupnými aminokyselinami. • Činidlo má určitou délku, reagující AK musí být blízko u sebe. • Studium interakce proteinů - nejen, že spolu interagují, ale jak se k sobě proteiny vážou. • Studium jednotlivých proteinů - vzdálenosti mezi reaktivními zbytku mohou být užity při modelování prostorové struktury proteinu.
Používaná činidla
Výměna vodíku za deuterium (HDX) • Chemická reakce během které je amidový atom vodíku peptidové vazby nahrazen deuteriem. • Nahrazovány pouze atomy přístupné rozpouštědlu. • Protein rozpuštěn v D2O při neutrálním pH, reakce ukončena prudkým snížením pH na 2,2 a je přidán pepsin k rozštěpení proteinu. • Každý nahrazený atom vodíku představuje nárůst hmotnosti o 1 Da. • Skvělé pro analýzu interakcí proteinů - porovnání výměny volných proteinů a vázaných v komplexu lze určit interagující regiony. • Rychlost výměny závisí i na tom, zda se daný amidový vodík účastní vodíkové vazby.
