Anyagcsere markerek analitikai mérésének és informatikai feldolgozásának kutatása a gombakomposzt gyártástechnológiájának fejlesztése érdekében Project célja A gombakomposzt gyártása során 150-200 tonna töltőtömegű zárt alagutakban történik az alapanyagok fermentálása és a pasztörizálása. Egy ilyen alagútban 9-10 millió Ft értékű gombakomposzt gyártása folyik, tehát esetleges technológiai hiba folytán komoly az anyagi kár. A fermentálás hatékonysága attól függ, hogy az azt végző mikroszervezeteknek biztosítani tudjuk a szükséges környezeti feltételeket. Amennyiben a környezeti paraméterek valamelyike kedvezőtlenül változik, a mikroszervezetek arányának egyensúlya felborul. A környezeti paraméterek kedvezőtlen változása nem kívánt mikroorganizmusok elszaporodásának kedvez, amelyek negatívan hatnak a komposzt minőségére és termésátlag csökkenést eredményezhetnek. Célkitűzésünk az, hogy GC-MS analitikai módszer segítségével kimutassuk a káros mikroszervezetek anyagcsere termékeit és ezeket markerezésre, azaz faji identifikálásra felhasználjuk. Az anyagcsere markerek segítségével következtetni tudunk arra, hogy milyen szükséges beavatkozást kell elvégezni, a gépészeti egységek segítségével, a komposzt jobb minősége érdekében. A gombakomposzt fermentálásának hatékonysága attól függ, hogy az azt végző mikroszervezeteknek biztosítani tudjuk a szükséges környezeti feltételeket. A gombakomposzt gyártásánál alkalmazott környezeti paramétereket speciális légtechnika segítségével befolyásoljuk. A fermentáció előrehaladásának követésére jelenleg csak a hőmérséklet, az oxigén szint és az elhasznált levegő ammónia tartalmának mérése ad lehetőséget. Nincs olyan kidolgozott analitikai, mérési eljárás, amely a nagy tömegű komposzt minőségét befolyásoló mikroszervezetek elszaporodásáról és dominancia viszonyairól alkalmazható információt tudna adni. A kidolgozásra váró mérési technológia a gázkromatográfia elválasztás technológiájára épül, amely egy tömegspektrometriás detektor segítségével pontosan mérni tudja az anyagcsere markereket és azok mennyiségeit. Ilyen kutatások a múltban nem történtek. Eredmények 1) A kutatás egyik célkitűzése volt olyan kísérleti elrendezés kifejlesztése, mely alkalmas anyagcsere markerek gyors kimutatására. A kutatási terv szerint gázfázisú komponensek mintavétele alapján szeretnénk döntést hozó rendszereket fejleszteni, így az 1990-es évek elején kifejlesztett szilárd-fázisú mikroextrakció (SPME) (1. ábra) alkalmazása tűnt a legkecsegtetőbbnek, mely rendszert korábban többen is alkalmazták gázfázisú mintavételre élelmiszeripari termékek penészedésének nyomonkövetésekor.
1. ábra: SPME kísérleti elrendezés kifejlesztése További célfeladat volt olyan gázkromatográf-tömegspektrométer (GC-MS) alkalmazása, mely képes a jellemző komponensek elválasztására, a lehető legtöbb információt gyűjti az igen/nem (adott penész megjelenik/vagy sem) válasz eldöntéséhez (háromdimenziós adathalmaz). Amíg a klasszikus GC technikák a hosszú (30-40 m) oszlopok viszonylag lassú felfűtésével 40 perces kromatogrammokat és 10 perces lehűtésekkel közel egy órás időközökkel képesek információ képzésére, addig a jelen kutatásnál célfeladatul tűztük ki a teljes ciklus 10-15 perces lefutását (2. ábra), és így a viszonylag gyors döntéstámogatás megalapozását a nagy felbontás terhére, viszont a rendszer bizonytalanságait több mérési eredménnyel –párhuzamos méréssel alátámasztani.
2. ábra: Kromatográfia kifejlesztése, elválasztás optimálása 2) A kísérleti rendszer kidolgozásánál a legfőbb célkitűzés az volt, hogy olyan mérőrendszer alakuljon, ki, amely ugyanabból a légtérből több minta vételére alkalmas. Nyilvánvaló volt a feladat tervezésekor, hogy a GC-MS rendszer installálásán túl, olyan rendszert alakítsunk ki, mely viszonylag olcsó működési költséggel (He vivő gáz helyett hidrogénnel) működik. A szoftver kialakításánál és tervezésénél alapvető volt az a feltételezés, hogy a mérések háttereként szolgáló komposzt illóanyag összetétele jóval komponens dúsabb, mint a penészgombák illóanyag spektruma, ezért egy háromdimenziót figyelembevevő „Masshunter” kiértékelő szoftverrel szereltük fel a műszerállományt. A tervezés során figyelembe kívánjuk venni a mintavételi körülmények tervezésekor azt, hogy az SPME szálak eltérő szelektivitással rendelkeznek és számunkra fontosabb paraméter a jellemző komponensek regisztrálása, mint a nagy mennyiségű, de információval (penészre jellemző) nem rendelkező komponensek kimutatása. A mintavétel optimáláskor, figyelembe vettük, azt, hogy a penészek élettartama paraméter (gázatmoszféra, pH, nedvességtartalom, hőmérséklet, stb.) függő, tehát az optimális mintavételi idő, sok paraméter függvénye oltott és oltatlan komposztok esetében is és a szinergikus és antagonisztikus hatások megismerése további kutatások célfüggvénye lehet. 3) Kidolgoztuk és megépítettük a megfelelő kísérleti elrendezést: 1. Mintavevő edény 2. Mintavevő adszorber szál 3. Kromatográfiás lefűtő fej 4. Kromatográfiás elválasztó rendszer 5. Tömegspektrometriás elválasztó rendszer 6. Adatrögzítő és adatértékelő szoftver 4) A megbízható eredmények elérése érdekében belső standard alkalmazását tűztük ki célul, mely célja elsősorban a manuális injektálásból származó esetleges kromatogram csúszások fixálása. Számtalan párhuzamos injektálás során kiderült, hogy a kromatogramok jól kézbentarthatók és stabilan tartják a retenciós időket. A kidolgozott zárt légterű mintavevő edényzetben olyan
standardokat tudtunk alkalmazni, amelyek a rendszer memória hatását kihasználva 4 napig tudják biztosítani a standard vegyületek jelét (3. ábra).
3. ábra: Alkán standardok memória hatása a mérések során A megfelelő eredmény eléréséhez az alkán homológ sor tagjaiból választottuk standardot, retenciós idejük figyelembe vételével. Ezzel a módszerrel a mikroorganizmusok növekedését nem befolyásoló, 4 napig stabil, memóriahatáson alapuló standardizálást értünk el. 5) Különböző statisztikai módszerek alkalmazásával a vizsgált, gombatermesztésben kártékony mikroorganizmusokat el tudtuk különíteni illékony anyagcseretermékeik által. PCA (főkomponens analízis) segítségével (4. ábra) 2 nagyobb csoportra tudtuk választani a mintahalmazunkat, és a főkomponensek mentén időbeli elkülönítésről is informálódhatunk.
4. ábra: Elkülönítés PCA-val
Lineáris diszkriminancia elemzéssel (LDA) mind az egyes leoltott minták (5. ábra), mind pedig a leoltások időtartama (6. ábra) elkülöníthető. A leoltások időtartama egyértelműen a 4. napig különíthető el, utána sajnos pontosabb elkülönítést ezzel a technikával nem tudtunk elérni.
5. ábra: Minták csoportosítása LDA-val
6. ábra: Leoltási napok elkülönítése LDA-val Kitekintés További méréseinkből sikeresen meghatároztuk a Trichderma aggressivum és egyéb más, gombatermesztésben kártékony penészek illékony anyagcsere termékeit. Továbbá ezen anyagcseretermékek időbeli lefutását is tanulmányoztuk, mely során a penész korai detektálására tudtunk következtetni. PLS regressziós modell segítségével a penészes fertőzés korát, tehát a
leotlástól eltelt napok számát is becsülni tudjuk. A felsorolt eredmények bővebb részletezése az alábbi, már megjelent publikációnkban olvasható: Dalma Radványi, Attila Gere, Zsuzsa Jókai, Péter Fodor (2015) Rapid evaluation technique to differentiate mushroom disease-related moulds by detecting microbial volatile organic compounds using HS-SPME-GC-MS, Anal Bioanal Chem (2015) 407:537–545, DOI 10.1007/s00216-014-8302-x
