A N és s S anyagcsere szabályoz

A N és S anyagcsere szabályozása, összefüggései a C anyagcserével A regulá reguláció cióval kapcsolatos diá diák (a tö többi a mű működés ismé ismétlé tlése): Nitrát asszimiláció: 10-16, 19-31 NIF: 33, 36-40, 42 Szulfát asszimiláció: 43-47 C, N, S asszimiláció összefüggései: 48-51

1

A növények N-forrásai

20-200 µM

1-100 µM

pKa – 9,3 lúgos talaj

Savas talaj

N-felesleg

N – 5-10%-a, 10% N2O >1-5 mM

N-hiá hiány Fló Flóravá raváltozá ltozás Acacia – D-Afrika

A szervetlen tápelemek közül a N limitálja leggyakrabban a növény növekedését. A légköri nitrogén, mint N-forrás felhasználására csak a nitrogén fixáló baktériumokkal szimbiózisban élő növények képesek. Aerob talajokban a legfontosabb N-forrás a nitrát, bár az ammónium iont - fajtól függően különböző mértékben – is képesek hasznosítani. A nitrát nem kötődik a talajszemcsékhez, gyorsan diffundál, könnyen kimosódva a talajvizeket szennyezi. Koncentrációja a talajban nagyságrendileg különbözhet mind szezonálisan, mind helyről-helyre még kis távolságokban is. Az ammónium ion kötődik a negatívan töltött talajszemcséken, tehát viszonylag lassú a diffúziója. Ha a gyökerek közelébe kerül, akkor azonban könnyebben veszik fel, mint a nitrátot. A talajban lévő aminosavakat is fel tudják venni a növények, de a lassú diffúzió alatt a talajban lévő mikroorganizmusok a nagy részét felhasználják. Jelentősége a magasabban fekvő, hideg helyeken lehet, ahol a szerves anyag mineralizációja lassú. A N-túltáplálás a volatilizációt és denitrifikációt növeli. Ez magas hőmérsékleten, anaerob körülmények közt kerül előtérbe (talajműveléstől is függ). Ezek a N-gázok környezetszennyezők. A túl sok N-nel történő műtrágyázás tehát plusz költség és környezetszennyező is. A N-hiány viszont erősen csökkenti a produkciót, és új fajok invázióját eredményezi (pl. N-fixáló ausztrál Acacia spp. elterjedése Dél-Afrikában, vagy az USA-ban, Angliában kimutatott flóraváltozások). Nagyon fontos tehát megérteni a szabályozó folyamatokat.

2

A nitrát asszimiláció folyamata reduktá reduktáns, ns, energia és szé szénvá nváz igé igény CNT

Lágyszárúak: levél (NADH-NR) Fásszárúak: gyökér(csúcs) (NADPH/NADH-NR) NRT

Általában a legtöbb lágyszárú növény a hajtásban építi be a nitrátot, míg a fás növényekben a gyökerekben mutatható ki a legnagyobb aktivitás. A gyökér hossztengelye mentén a NR aktivitás fejlődési állapottól függő gradienst mutat, a legnagyobb aktivitás közvetlenül a gyökércsúcs közelében található. A növényekben három fő NR izoforma mutatható ki: NADH, NADPH, vagy NADH/NADPH függő NR. A gyökerek a NADH-val és a NADPH-val (kb. 20%-ban) működő izoformát is tartalmazzák.

3

Reduktánsbiztosítás a levélben

A levélsejtbe a nitrát transzporteren (NT) bejutó nitrát redukciójához, bár a nitrát reduktáz (NR) a citoplazmában működik, a reduktáns fotoszintetikus eredetű és a plasztiszban képződik. A NADPH malát formájában (amelyet a NADPH-malát dehidrogenáz (NMDH) hoz létre a kloroplasztiszban) a dikarboxilát transzportereken keresztül jut ki a citoplazmába (oxálacetát-malát csere). A citoplazmában a NADH-függő malát dehidrogenáz (MDH) termeli a NADH-t a nitrát redukcióhoz. A nitrit, ami a kloroplasztisz nitrit transzporteren (CNT) jut be a plasztiszba és a nitrit reduktáz (NiR) katalizálja, redukciójához az elektronok a Fd közvetítésével közvetlenül a fotoszintetikus elektrontranszportláncból származnak.

4

Szénváz biztosítása a levélben

Az ammónia beépüléséhez szükséges szénváz is végső soron a fotoszintetikusan fixált CO2ból származik. A trióz-P-transzporteren már redukált szénvegyület, DHAP (GA3P) jut ki a citoplazmába, ami a glikolízis reakciói során foszfoenol piruváttá (PEP) alakul. A növényekben általánosan (nemcsak a C4-esekben) jelenlévő PEP-karboxiláz oxálacetáttá (OAA) alakítja, ami karboxilát transzporteren keresztül bejut a mitokondriumba. A Krebs (trikarbonsav) ciklusban keletkező citrát egy része az OAA-tal cserélődve kijut a citoplazmába, ahol citoplazmatikus akonitáz és NADP-izocitrát dehidrogenáz izoenzimek -ketoglutaráttá alakítják. Az így képződő -ketoglutarát karboxilát transzporter közvetítésével (malát/ketoglutarát csere) jut be a kloroplasztiszba (ld. köv. dia).

5

Ammónia (re)asszimiláció

CNT

5-10x

A NR során képződő, ill. a fotorespirációkor felszabaduló ammónia a glutamin szintetázglutamát szintáz (GS-GOGAT) renszer segítségével, a kloroplasztiszban történő beépüléséhez szükséges energia és reduktáns szintén fotoszintetikus eredetű.

6

Szénváz biztosítása a gyökérben

A gyökéren keresztül felvett nitrát egy része/a talajból felvett ill. a nitrát redukciójakor képződő ammónium ionok a gyökérsejtek plasztiszaiban redukálódnak/épülnek be. A szénváz (2-oxoglutarát(2OG)=-ketoglutarát) a mitokondriális pool-ból származhat, ill. hasonlóképpen, mint a levélben a citoplazmában citrátból szintetizálódhat. A glikolízisben felhasználódó szénvegyületek azonban, a levéltől eltérően, a floémben odaszállított szénhidrátok lebontásából származnak.

7

Reduktánsbiztosítás a gyökérben

NADPHNADPH-NR (~ (~ 20%)

(oxidatív foszforiláció)

A gyökérben a reduktánsokat is az odaszállított cukrok lebontása biztosítja. A nitrát redukcióhoz szükséges reduktánsok a citoplazmában a glikolízis/oxidatív pentóz-P ciklus (OPP) során képződnek (NADH- és NADPH- specifikus NR-ok). A nitrit redukcióhoz/ammónia beépüléshez (GOGAT) szükséges redukált Fd a plasztiszban is folyó OPP során képződő NADPH felhasználásával a NADPH/Fd oxidoreduktáz segítségével képződik. A GS működéséhez szükséges ATP az oxidatív foszforiláció során képződik, és adenilát transzporterek közvetítésével jut ki a mitokondriumból és jut be a plasztiszba.

8

A nitrát redukció összefoglalása Gyö Gyökér

Levé Levél

Nitrá Nitrát redukció redukció

fásszárúak

lágyszárúak

Nitrá Nitrát felvé felvétel energiaforrás (ATP)

glukóz-6P(légzés)

DHAP (fotosz.)

Nitrá Nitrát redukció redukció helye reduktáns (NADH/NADPH)

citoplazma glikolízis/OPP

citoplazma NMDH/MDH

Nitriti redukció redukció helye reduktáns

plasztisz Fd (NADPH - OPP)

plasztisz Fd (fotosz e-tr)

NH4+ asszimilá asszimiláció ció helye ATP (GS GS) reduktáns (GOGAT GOGAT) szénváz (PEPC, PEPC, iCDH) iCDH

plasztisz mito e-tr Fd (NADPH - OPP) -ketoglutarát

plasztisz fotosz. e-tr Fd (fotosz. e-tr) -ketoglutarát

9

A nitrát asszimiláció összefüggései a metabolikus és fejlődési folyamatokkal gyö gyökérfejlő fejlődés

levé levélfejlő fejlődés

virágzás

szeneszcencia

Nitrá Nitrát asszimilá asszimiláció ció N-metabolizmus

C-metabolizmus energiaterm. energiaterm. folyamatok

felvé felvétel

de novo NH4 asszim. asszim.

primer akceptor

fotoresp. fotoresp. NH4 asszim. asszim.

tárolá rolás és remobilizá remobilizáció ció

vakuolum

malá C-prekurzor malát (pH regul.) regul.)

asav szinté szintézis protein szintézis

speciális anyagok (tetrapirrol)

Sejt és egé egész nö növény szinten - Szabá Szabályozott metabolikus folyamatok - nitrogé nitrogén metabolizmus (nitrát felvétel és efflux; tárolás/remobilizáció; nitrát redukció; ammónia asszimiláció: de novo és fotorespiráció során képződött; aminosav szintézis) - szé szén anyagcsere - Energia és reduktánsok (cukorszármazékok, malát) - pH regulá reguláció ció (malát szintézis) - szénváz (oxoglutarát, asav prekurzorok) - Szabá Szabályozott nö növekedé vekedési és fejlő fejlődési folyamatok - gyö hajtás gyö gyökér ará arány csö csökkené kkenés (N(N-hiá hiány) gyökér, levé levél morfoló morfológia, hajtá - korai virá virágzá gzás indukció indukciója és szeneszcencia (N(N-hiá hiány)

10

A nitrát asszimiláció szabályozása

- Nitrát asszimiláció változása - nitrát reduktáz aktivitás változása - aminosav szintézis változásai - C metabolizmus átprogramozása - reduktáns-biztosítás (malát, Fd), - C-váz biztosítása (oxoglutarát) - pH reguláció (malát) Transzkripció Transzkripciós és posztposzt-transzkripció transzkripciós szintű szintű szabá á lyozá á s szab lyoz

A NO3- indukálja mind a nitrát asszimilációt, mind a C metabolizmus reprogramozását, ami reduktánsokat és C vázat biztosít a nitrát asszimilációhoz.

11

A nitrát reduktáz aktivitás szabályozása

A NR aktivitá aktivitás - transzkripció transzkripciós, - transzlá transzláció ciós és - poszttranszlá poszttranszláció ciós szinten is regulá regulált

Inaktiváció 5-20 min Inaktí Inaktív NR

A nitrát megoszlik a vakuoláris és az aktív citoplazmatikus pool közt. Mivel a vakuoláris pool csak remobilizáció után áll rendelkezésre, a nitrát fluxus (a citoplazmatikus nitrát cc. változása) a legfontosabb transzkripciós szintű szabályozó tényező. A NR fél-életideje csak néhány óra. A NiR a NR-zal együtt transzlációs szinten is regulált. A NR fény hiányában foszforilációval és a dimer 143-3 protein kötésével, amihez Mg is szükséges, inaktiválódik. A szignál transzdukciós út nem ismert, de a kináz aktiválásában Ca-függő protein kinázok (CDPK) is részt vesznek. A protein degradációja nem függ a NR ilyen inaktiválásától, fényen és sötétben is hasonló sebességgel megy. Tehát a NR aktivitás nemcsak a NR aktiváltsága miatt magas fényen, hanem mert a fény serkenti a nitrát felvételt, transzlokációt és a NR transzkripcióját és transzlációját is. A 14-3-3 proteinek (30 kDa) egy homológ protein családot alkotnak, amelyek minden eukarióta sejtben megtalálhatók a citoplazmában, a kloroplasztiszban és a sejtmagban is. Legjellegzetesebb tulajdonságuk más proteinekkel való kapcsolódási képességük, ami ezen proteinek aktivációjával vagy inaktivációjával jár.

12

Miért fontos a NR aktivitás gyors poszttranszlációs szabályozása? - Nitrit felhalmozó felhalmozódás mutagé mutagén, karcinogé karcinogén

O2•-

Tyr  peroxinitril ONOO-

- Szuperoxid ké képzé pzés (NADH (NADHO2) - NO felhalmozó felhalmozódás (NR NiRNiR-ként is működhet) peroxinitril gyö gyök Normál körülmények közt (magas nitrát, alacsony nitrit cc) nitrát redukció. NiR gátlódásakor NO képződés (NR NiR aktivitás – RuBisCO!).

A nitrit mutagén és karcinogén: nukleotidbázisok amino csoportjával diazovegyület  mutáció (citozin  uracil). Sav formájában szabadon diffundál a membránon keresztül, és nagyon toxikus a fotoszintetikus apparátusra. A RuBisCO oxigenáz aktivitásához hasonlóan a NR NiR aktivitása (NO képződéshez vezet) is elkerülhetetlen. A NR képes a NADH-ról az oxigénre is elektront transzportálni szuperoxid képződése mellett. Ez viszont a NO-dal reagálva erősen toxikus peroxinitril gyökök (ONOO-) képződéséhez vezet. Ezek képesek a Tyr oldalláncok nitrálására, ami megváltoztatja az aktivitást. A NO jelmolekula is, amiről kimutatták, hogy elősegíti a sztómazáródást, befolyásolja a növekedést és fejlődési folyamatokat.

13

A génexpresszió szabályozása

A nitrát a NR és a NiR expresszióját is indukálja, míg a redukált N represszálja. A fény (fitokróm) és cukor indukció fajtól függően változó.

14

A génexpresszió szabályozása: nitrát I. > 1000 gén regulált. Nitrát

Egyé Egyéb enzimek: NiRá NiRáz NRT, CNT (GS), GOGAT NMDH, PEPC PK, CS, iCDH, iCDH,

NRT – nitrát transzporter, CNT – kloroplasztisz nitrit transzporter, NMDH – NADPalmasav dehidrogenáz (kloropl.), PEPC – PEP karboxiláz, PK – piruvát kináz, CS – citrát szintáz, iCDH – izocitrát-dehidrogenáz

15

A génexpresszió szabályozása: nitrát II.

<10 μM

R-NI – plazmamembránhoz kötött receptor NR nitrát box – promoter szekvencia a nitráttal indukálható génekben  - konstitutíve expresszálódó, a promoterhez kötődő protein faktor

A NR (és más nitráttal indukálható gének) indukciója nem igényel protein szintézist. A DNS-hez kötődő protein faktorok konstitutíve expresszálódnak. Feltételezik, hogy a nitrát szignál nem a faktor kötődését idézi elő, hanem megváltoztatja a transzkripciót aktiváló képességét. A metabolit repressziót a gombákban (és lehetséges, hogy a növényekben is) Zn-finger DNS-hez kötődő proteinek közvetítik, amelyek GATA DNS motívumokhoz kötődnek.

16

Fényreceptorok: Fitokróm Fitokromobilin

Dimer protein Kovalensen kö kötött 1 bilin/protein

660 nm

Pr

730 nm

Pfr

(Asp)

(Ca2+/CAM, G-protein)

Bae et al. (08) ARPB – Fényreceptorokat ld. mé még Erdei Lá László szló: Nö Növekedé vekedés- és fejlő fejlődésélettan. lettan A fitokrómok (PHY) dimer proteinek, két azonos apoproteint tartalmaznak, melyek kovalensen kötik a kromofort, a fitokromobilint, ami lineáris tetrapirrol. Minden növényi PHY tartalmaz egy N terminális fotoszenzor domént, és egy C terminális dimerizációs és kináz domént. A PHY-k sötétben, fiziológiásan inaktív (Pr) formában szintetizálódnak. Vörös fényt (660 nm) abszorbeálva a Pr aktív Pfr formává izomerizálódik; ez a folyamat reverzibilis, a távoli vörös fény visszafordítja (730 nm). A Pfr forma a citoszolban vagy a sejtmagban (miután a sejtmagba transzlokálódott) kölcsönhat egyéb proteinekkel, amelyek szerepet játszanak a fényválasz kiváltásában. A jelátvitelben Ca-kalmodulin (pl. a sejtfal megnyúlás csökkentése), ill. G-protein függő szignál transzdukciós utak (pl. antocianin szintézis) jelenlétét mutatták ki.

17

A fitokróm fényindukált változásai Domé Domének Szenzor

Dimerizációs Smag szignalizáció Kinase

Fitokromobilin

Möglich et al. (10) ARPB, Bae et al. (08) ARPB A fitokromobilin C15-C16 kettős kötésének reverzibilis fotoizomerizációja a komplex strukturális változását okozza (az N- and C-terminális domének kölcsönhatása megszűnik). Ez szabaddá teszi azokat a doméneket, amelyek más proteinekkel való kölcsönhatásokban vesznek részt.

18

A génexpresszió szabályozása: fitokróm

TF (bZIP) H+

A fitokróm fény hatására aktív Pfr formává alakul, ami foszforilálódhat, de a nem foszforilált forma aktívabb. A szignál transzdukció komponensei közt legáltalánosabbak a HY5/HYH (bázikus leucin cipper transzkripciós faktorok bZIP). Ezek foszfoproteinek, de erősebben kötődnek a promoter régiókhoz, ha defoszforilálódnak. A defoszforilációs reakciókat protein foszfatázok (PP) katalizálják. A NR és sok fotoszintézisben szerepet játszó komponens génjei ezen az úton aktiválódnak. A NIR, a GS és a GOGAT szintén indukálódnak fény hatására fitokróm közreműködésével, de egyéb szignál transzdukciós úton. A fény fotoszintézis útján is stimulálja a génexpressziót (nitrát felvétel, transzlokáció és asszimiláció génjei). A szignál nem ismert, elképzelhető, hogy proton fluxus vagy valamilyen cukor (triózP). Aktív fotoszintézis esetén a sztróma lúgosodik, protonkiválasztás történik a citoplazmába, az acidifikáció pedig aktiválja a NR-t. A gyökérbe irányuló cukortranszport aktiválja a transzportereket (NITR, nitrit transzporter; NRT, nitrát transzporter), emiatt a gyökérbeli nitrát felvétel is fényfüggő.

19

A NR poszt-transzkripciós szabályozása

protein kinázok

A fotoszinté fotoszintézis - stimulá stimulálja a protein foszfatá foszfatázokat - gátolja a protein kiná kináz aktivá aktiválódást/aktivitá st/aktivitást protein foszfatáz

in vitro

A gének transzkriptum szintjei gyakran napi ciklust mutatnak, de a megfelelő protein szintek mérsékelten változnak, amit leginkább a protein stabilitása szab meg. A hosszú sötét periódus alacsony transzkript szintje azonban általában csökkent protein szinttel jár együtt. Mind a NR és NIR transzkriptumok napi ritmust mutatnak, de csak a NR protein szintje mutat jelentős napi változást. A NR aktivációja protein foszfatázzal történő defoszforilációnak köszönhető, amelyet a fotoszintézis aktivál, de a kloroplasztiszból a citoplazmába történő jeltovábbítás útja nem ismert. Sötétben a NR-t az SNRK1 kináz (in vitro Ca-dependens kináz is) foszforilálja. Ez sötétben szintetizálódik és foszforilált formában aktív, fény hatására defoszforilálódik (inaktiválódik). A foszforilált NR (NR-P) 14-3-3 proteint köt, és így inaktiválódik.

20

Szabályozás protein foszforilációval 1414-3-3 proteinek!

Szaharó Szaharóz szinté szintézis helyett szerves sav szinté szintézis

*

Glu – alloszt. alloszt. regul. regul.

Szabá Szabályozá lyozás az enzim foszforilá foszforiláció ciójával

SPS – szaharózP-szintetáz Az egyéb citoplazmában működő enzimek esetében is alapvetően a protein foszforiláció/defoszforiláció a poszt-transzlációs protein módosítás mechanizmusa. A 14-3-3 proteinek a szénhidrát metabolizmus enzimeinek (szaharóz-P szintáz és keményítő szintáz) aktivitását is befolyásolják. A Glu a PEPCáz allosztérikus regulátora.

21

Szabályozás TR/Trx rendszerrel

Szabá Szabályozá lyozás az enzim redukció redukciójával (FTR/Td (FTR/Td))

NMDH, DCT, NiR, NiR, GS, GOGAT

A kloroplasztiszban viszont a redox reguláció (Fd/tioredoxin reduktáz: FTR, tioredoxin: Td rendszer) szabályoz számos folyamatot. A Td-ok kis proteinek (kb. 12 kDa) amelyek a prokariótákban és az eukariótákban (különböző kompartmentekben különbözők) is előfordulnak. Erősen konzervatív aktív helyük, WC(G/P)PC, diS csoportot tartalmaz, amely reverzibilis redox átalakulásra képes a diS és ditiol állapotok közt. Hasonlóan a Calvin ciklus egyes enzimeihez (GA3PDH, Fr1,6BPáz, Se1,7BPáz, PRkináz), néhány enzimet, amely a redukált cukrok és dikarboxilátok létrehozásában (NMDH – NADP-malát dehidrogenáz) és a citoplazmába való transzportjában (DCT 1 – dikarboxilát transzporter) játszanak szerepet, az FTR/Td rendszer aktivál. A MNDH tehát nemcsak szubsztrát (NADPH) tekintetében függ a fotoszintézistől, hanem az enzim aktivációja is fotoszintézisfüggő. A nitrát asszimiláció kloroplasztiszban lokalizált enzimei (NiR, GS, GOGAT) is kötnek Td-okat (tehát a redox reguláció ezek aktivitását is befolyásolja).

22

Fény és sötét szabályozás

Fotoszintézis, fotorespiráció Malát sönt Nitrát transzport (sejt, vakuolum) Nitrát redukció és asszimiláció

OPP Nitrit redukció Ammónia asszimiláció

PII (N/C metabolizmus szenzor és transzkripciós faktor prokariótáknál), a nitrit transzportot befolyásolja, de nem sokat tudunk a funkciójáról a magasabbrendű növényekben.

23

A nitrát asszimiláció napi változásai A nitrát asszimiláció napi periodicitást mutat, ami génexpresszió nexpressziós és poszttranszlá poszttranszláció ciós változá ltozások kö következmé vetkezménye Optimá Optimális kö körülmé lmények magas nitrát cc kedvező fényviszonyok

Reggelre: NO3- red N  NR Megvilá Megvilágítás elejé elején: NR – éles maximum (fitokrómhatás)

A nitrát asszimiláció és az egyéb metabolikus folyamatok kölcsönhatásai és kölcsönös regulációja a nitrát asszimiláció diurnális ritmusában nyilvánul meg. A magasabbrendű növényekben a gének 10-30%-ának, köztük számos nitrát asszimilációval összefüggő komponens génexpressziója, napi ritmust mutat. A NR és a NIR transzkriptumok szintje kora reggel maximális. Ez összefügg a a nitrát szignál magas és a produktum represszió alacsony szintjével. A megvilágítás első órájában megfigyelt éles maximum azonban direkt (fitokróm indukált) fényregulációra is utal.

24

Transzkriptum, enzimaktivitás, metabolit szintek reggel

de

du

éjjel

Transzkriptum - nitrát redukció - NH4+ asszim. - C-metabolizmus

NIA,NII PPC

NIA NIA NIA GLN2 () GLU,cPK,mCS () ICDH,AGPS

Enzimaktivitá Enzimaktivitás - nitrát felvétel (NRT) - nitrát redukció (NR, NiR) - NH4+ asszim. - PEPC - cPK, mCS, cICDH (ADPG-PPáz)

0.75 1.50 1.00 

→ (30%) (0.75) * GS,GOGAT   () 

Metabolit (NH4+),Gln Gly, Ser malát

NH4+,Gln citrát malát

CS – citrát szintáz, ICDH – izocitrát-dehidrogenáz, PK – piruvát kináz, NIA - (NR), NII - (NiR), PEPC – PEP-karboxiláz; GLN – GS, GLU – GOGAT, AGPS – ADPGPP-áz regulátor su transzkriptum. A nitrát redukció folyamatához szorosan kapcsolódik a nitrát felvétel, a pH reguláció, a szénhidrát ellátás, az ammónium asszimiláció és az aminosav szintézis. Reggelre az éjszaka is folyó nitrát transzport következtében megnő a citoplazmatikus nitrát pool és ennek következtében a NIA (NR) transzkriptum szintje. A NR protein szinten is mutatja a napi változásokat, a fotoperiodus első részében (de) mutatva maximumot. A megvilágítás uis stimulálja a transzlációt és gyors poszt-transzlációs aktivációt okoz. A fényperiódus első részében a nitrát redukció (ammónium, Gln képződés) 2x gyorsabb, mint a nitrát felvétel, ami citoplazmatikus nitrát pool gyors csökkenését váltja ki. A NIA transzkriptum (NR) szint, ami a citoplazmatikus nitrát cc-tól, azaz a nitrát felvétel és redukció egyensúly-eltolódásától függ, tehát már a de folyamán lecsökken. (Valószínűleg a citoplazmatikus nitrát cc-tól függ a vakuolumba történő transzport is.) A GS (transzkriptum: GLN2) működés fontos már a kezdeti szakaszban, mert különben NH4+ halmozódna fel (ami a fotoszintetikus e-tr szétkapcsolója), ill. NH3 formájában elveszhetne a fixált nitrogén a sztómákon keresztül. A Gln nem represszálja a nitrát redukciót. Valószínűleg nem jó szabályozó szignál, mert a C3as növényekben a Gln szintje nem elsősorban a növény nitrogénellátottságától, hanem a fotorespiráció mértékének változásától függ. A nagymértékű nitrát redukció lúgosítja a citoplazmát, a citoplazma pufferkapacitása kicsi, a pufferolás malát felhalmozással történik. A levélben nappal felhalmozódó malát csökkenti a NR aktivitást, ami a NIA transzkriptum szint erős csökkenésével kapcsolt. A malát éjjel a gyökérbe szállítódik, ahol dekarboxilálódik, a HCO3--ot a gyökér leadja.

25

A du-i időszakban a nitrát redukció kb. a felére csökken, ill. éjszaka elhanyagolható. Ezek a változások a NIA transzkriptum szint, a NR protein (degragáció, ami fényen és sötétben is egyaránt folyik, előtérbe kerül) és aktivitás (termék gátlás), valamint a citoplazmatikus NADH csökkenésével, ill. a sötétedés után a NR poszt-transzlációs inaktivációjával függenek össze. Ezeket a megfigyeléseket alátámasztja, hogy a NR mutánsokban – gyengébb NR aktivitás – a nitrát redukció később inaktiválódik, NH4+tápláláskor a GS aktivitás éjjel is megmarad. A NR-éhoz hasonló poszt-transzlációs inaktiváció (P, 14-3-3-protein) a N és C metabolizmus számos enzimére jellemző (a NiR azonban nem inaktiválódik, csak degradálódik). A nap második felében a nitrát asszimiláció és asav szintézis kerül előtérbe. Ez a C metabolizmus enzimei (cPK, mCS, NADP-ICDH) (NR mutánsokkal, amelyek nitrátot halmoznak fel, kimutatható, hogy ezen enzimek transzkripcióját is a nitrát indukálja, ugyanakkor az AGPS transzkriptumot, ami az ADPGPP-áz – keményítő szintézis – regulátor alegysége, gátolja), valamint a GOGAT gén (GLU) génexpressziós (Gln) és metabolikus (2OG) aktivációjának következménye. A metabolitok közül a nitrát redukció szabályozásában a Glu, az Asn és a Cys szerepét mutatták ki (különböző asavkeverékeket és asavakat szívattak fel a levágott levéllel). A Glu szintje diurnálisan kevéssé változik a levélben, tehát a nitrogénellátottság érzékelése szempontjából jó szignál. A Glu feedback regulálja a nitrát asszimilációt (NR transzkripcióját represszálja, a GOGAT aktivitás feedback inhibitora, PEPC és cPK allosztérikus gátlója). A cukrok optimális körülmények közt nem befolyásolják a transzkripciót, de az alacsony cukorszint csökkenti a NIA transzkriptum szintet és a NR mennyiségét, csökken az asav, protein, Chl és másodlagos anyagok szintézise is. Ilyenkor a NR poszt-transzkripciós szabályozásában fontos szerepe van az Asn-nak, mert bár az asav szintézis csökken, de Asn nő és feedback gátolja a NR-t. Az alacsony cukorszint akkor is gátolja a nitrát redukciót, ha a nitrát szint magas (a növény ilyenkor C és N limitált lesz). A NR-t a Cys is gátolja, valószínűleg N-anyagcserét és a kénanyagcserét összehangoló szignál.

26

Az aktivitás fázisai 1. nitrá nitrát redukció redukció és pH regulá reguláció ció NR (NIA (NIA,, NIA), NIA), NiR (NII, NII, NII), NII), PEPC aktivitá aktivitás (NO3-) NH4+, Gln, Gln, malá malát mennyisé mennyisége ge 2. ammó ammónia asszimilá asszimiláció ció és asav szinté szintézis PK, CS, iCDH, Gln/2OG) iCDH, GOGAT GOGAT (NO3-, Gln/2OG citrá citrát, 2-oxoglutará oxoglutarát, Glu, Glu, AA  3. csö csökkenő kkenő aktivitá aktivitás (represszió (represszió, inaktivá inaktiváció ció, degradá degradáció ció) nitrá PEPC), Cys nitrát asszimilá asszimiláció ció termé termékei: Glu (NR, GOGAT, PEPC), C-anyagcsere: anyagcsere: szé szénhidrá nhidrátok tok (Asn Asn)

CS – citrát szintáz, iCDH – izocitrát-dehidrogenáz, PK – piruvát kináz, NIA - (NR), NII - (NiR), PEPC – PEP-karboxiláz, A fényperiódus első részében a nitrát redukció (ammónia, Gln) 2x gyorsabb, mint a nitrát felvétel és kb. 50%-kal haladja meg az ammónia asszimiláció sebességét. Ez a nitrát cc. gyors csökkenéséhez és ammónium, glutamin, glycin és szerin felhalmozódáshoz vezet. Hasonló maximumot mutat a NiRáz és a PEPCáz génexpressziója, ez utóbbi a pH regulációhoz szükséges (nitrát redukció lúgosít) malát szintézissel függ össze. Később megfigyelhető a PK, CS, és ICDH-1 génexpressziók emelkedése, ami helyreállítja a nitrát redukció és ammónium metabolizmus egyensúlyát. Az ammónium szétkapcsoló (tilakoidok) és az ammónia a sztómákon keresztül kijuthat, ezért hatékonyabb Gln-t felhalmozni és az ammónium asszimilációt a GOGAT reakció szintjén regulálni. A Glu az ammónium asszimiláció első olyan produktuma, amely nem változik nagyon a napi ciklus során, és ami a legtöbb aminosav és a N-tartalmú speciális anyagcseretermék direkt vagy indirekt kiindulási anyaga, a PEPCáz és a PK fontos allosztérikus regulátora. További regulátorok a N anyagcsere metabolitjai, pl a cisztein, az aszparagin, valamint a malát. Az alacsony szénhidráttartalom teljesen gátolja a nitrát asszimilációt, tekintet nélkül a nitrogén metabolizmus szignáljaira. A nitrát felvétel éjjel is folytatódik, feltöltve a levél nitrát készletet. A nitrát asszimiláció növényfajtól, fejlődési állapottól és a környezeti hatásoktól függően különböző mértékben történik a levélben és a gyökérben. Függ a transpiráció sebességétől (nitrát gyorsan a xilémbe kerül) és a gyökér szénhidrát ellátottságától. Gyökérben kissé más periodicitás: nappal citoplazmatikus NR, éjjel plazmamembrán-kötött NR indukálódik.

27

A nitrát metabolizmus szabályozása: Összefoglalás A szabá szabályozá lyozás cé célpontjai - transzporterek: transzporterek: NRT, CNT CNT - NR aktivitá á s <
28

Növekedési/fejlődési folyamatok regulációja

- Befolyá Befolyásolt folyamatok - gyökérelágazás - levél expanzió - Válaszreakció laszreakciók - integrált (hajtásgyökér szignalizáció) - lokális (függ az integráló szignáltól is!) - gyors (nitrát transzport) - lassú (oldalgyökér növekedés, levélfejlődés)

A NO3- nemcsak a metabolikus folyamatok fontos regulátora, hanem növekedési/fejlődési folyamatokat is befolyásol, mint pl. a gyökérelágazás és a levélexpanzió. Magasabbrendű növényekben a NO3- szignalizáció fontos aspektusa, hogy mind lokális, mind integrált szignál transzdukciós utak léteznek, sőt az integrált válaszreakciók befolyásolják a lokális válaszreakciót, a kétféle válasz is integrálódik.

29

N-ellá ellátottsá tottságtó gtól függő ggő szabá szabályozá lyozás

Gyors válaszreakciók: transzporterek

C és N anyagcsere koordiná koordináció ciója

NO3- szenzor

Loká Lokális szigná szignál transzdukció transzdukció

Plazmamembrán NR?

Amikor a növények NO3--ban gazdag talajrészhez érnek, egy gyors (min nagyságrendű) fiziológiai válasz figyelhető meg: egy gyors és átmeneti növekedés a NO3felvételben, ami a NRT gének megnövekedett expressziójának köszönhető. A válasz szenzora lehet a plazmamembránban lokalizált NR vagy az AtNRT1.1 transzporter. Ez a lokális válasz azonban integrált a növény N-ellátottságával, ami domináns, és feedback regulálja a transzportereket transzkripciós, transzlációs és poszt-transzlációs szinten, a szignál és a szignál transzdukciós út azonban nem ismert (asavak, regulátor proteinek?, hajtásban szintetizálódó citokininek). A szénhidrátellátás napi fluktuációja, azaz a floémen keresztül a gyökérbe kerülő szénhidrátok is fontos pozitív szignálok a nitrát transzporterek (AtNRT2.1 és AtNRT1.1) expressziójában. Ez segítheti a NO3- felvétel és a fotoszintézis kölcsönös regulációját.

30

Lassú válaszreakciók: oldalgyökér növekedés Integrá Integrált vá válaszreakció laszreakciók cukrok D-ciklin

Oldalgyö Oldalgyökér elongá elongáció ció

Loká Lokális vá válaszreakció laszreakció ANR1 – nitrát regulált MADS-box TF génje AXR4 (ARF) – „auxin response factor” génje

gyö gyökér elá elágazá gazás, oldalgyö oldalgyökér elongá elongáció ció

Amikor a növények NO3--ban gazdag talajrészhez érnek, nemcsak a nitrát felvétel gyors növekedése, hanem egy lassú fejlődési válasz is megfigyelhető: laterális gyökér proliferáció ebben a talajrétegben. Ez részben lokális válasz, a NO3- indukálja egy ANR1 transzkripciós faktor szintézisét elősegítve. Az oldalgyökér proliferáció azonban akkor a legintenzívebb, ha az egész növény N-ellátottsága alacsony, azaz távoli regulátor mechanizmusok is befolyásolják. Az auxin, mint a legfontosabb növényi növekedés regulátor, ami a hajtásban szintetizálódik és a gyökerekbe transzportálódik, fontos szerepet játszik a hajtás-gyökér kommunikációban, a gyökérbe irányuló auxin transzport gátlása uis jelentősen csökkenti a gyökérelágazást. Kimutatták, hogy alacsony nitrát cc. (NRT1.1. a szenzora – nemcsak transzporter, hanem receptor is) gátolja az auxin akkumulációját a gyökércsúcsban, és így a laterális gyökérnövekedést is. A magas N-ellátottság (Gln/Glu?) viszont egy miRNS szintjének emelésével gátolja az auxin response faktor génexpresszióját, és így az oldalgyökérnövekedést. Arra utaló eredmények is vannak, hogy a gyökérbe kerülő szénhidrátok is korrelálnak az oldalgyökér denzitással. A szaharóz a D-ciklinek egyik tagját, amely az oldalgyökér primordiumok képződésekor expresszálódik és sejtosztódást indukál, regulálja.

31

Lassú válaszreakciók: levél expanzió

Zeatin Zeatin ribozid

A levélexpanzió különösen érzékeny a NO3--ellátás fluktuációira: amikor nem áll rendelkezésre elég nitrát, a levélexpanzió leáll, de ez gyorsan revertálható a nitrátellátás helyreállításával (specifikus nitrátra, az ammóniumtáplálás nem revertálja). Mind sejtosztódásbeli, mind megnyúlással kapcsolatos változások hozzájárulnak a levélnövekedéshez. A levélnövekedés gátlása szoros korrelációt mutatott a Z-típusú citokininek (zeatin and zeatin ribozid) mennyiségének csökkenésével a xilémben. Tehát a citokinin képződés változása a gyökérben lehet az a távoli jel, ami regulálja a levél morfogenezist a nitrátellátással összhangban. A nitrát indukálja a citokinin szintézis kezdeti lépését katalizáló AtIPT3 (citokinin szintáz=AMP-izopenteniltranszferáz) génexpresszióját. A levelekben kétkomponensű regulátor rendszerek (His-to-Asp foszfo-relay szignal transzdukciós utak) expressziója indukálható citokininekkel vagy N-hiányos növények gyökereinek nitráttal való ellátásával.

32

Új eredmények Módszerek - Transzkriptomika - forward genetika - reverz genetika - miRNS kutatás

Eredmé Eredmények - receptorok - TF-ok - kinázok - miRNS

Castaings et al. (2011) nem megtanulandó Molecular players in N signalling and regulation. Schematic representation of players involved in N signalling. For simplicity, all players are presented in the same cell, which might not be the case in a plant. The dual-affinity nitrate transport NRT1.1 has a double role for transport and signalling of nitrate. The CBL-interacting protein kinase CIPK23 regulates the affinity of NRT1.1 for nitrate. CIPK8 is involved in the nitrateregulated mRNA accumulation of several nitrate-regulated genes. The putative transcription factor (TF) NLP7 is also necessary for full nitrate induction of gene expression. One direct target promoter seems to be the promoter of NRT2.1, a high affinity nitrate transporter. The LOB domain-containing TFs LDB37/38/39 are negative regulators of nitrate-mediated gene expression and they are involved in the regulation of anthocyanin synthesis. ANR1, another TF, regulates lateral root growth in response to nitrate. Regulation by the circadian clock pathway takes place via CCA1, a TF regulated by reduced N compounds such as glutamine. Regulation by microRNAs (miR393 and miR167) connects auxin to nitrate signalling via the auxin-responsive TF ARF8 and the auxin-binding protein ABF3. Further miRNAs are regulated by the N status of the plant (miR169 and miR398) and might play regulatory roles.

33

A nitrogenáz működése

E1-E8 NADH/Fd OR

MoFeMoFe-protein FeMoco P

Fizoló Fizológiá giás szabá szabályozá lyozás: energiaenergia- és reduktá reduktánsellá nsellátottsá tottság

4Fe4Fe-4S

ATP

FeFe-protein

34

Energia- és reduktánsbiztosítás

Malá Malát: - energiaforrá energiaforrás (aerob lé légzé gzés) - reduktá reduktáns forrá forrás (citrá citrát ciklus: NADH) NADH/Fd NADH/Fd OR

Bakteroid metabolizmus: Heldt Fig. 11.8

35

Az ammónia beépülése

reduktáns, szénváz energia

A nitrát redukciója során képződő ammónium a plasztiszban lokalizált GS és GOGAT segítségével épül be, míg a nodulusz parenchimasejtjeiben a GS (Gln szintézise) a citoplazmában, a GOGAT (Glu szintézise) a plasztiszban történik.

36

NIF vagy nitrát redukció 16 ATP + 8e-

8e-

Nitrá Nitrát – metabolikusan csö csökkenti a NIFNIF-t – gátolja a NIFNIF-s gének expresszió expresszióját – gátolja a nodulá noduláció ciót

37

A nitrát metabolikus szabályozó hatásai

NO

Nitrát CHO NO red N

NO-LegHgl posztranszlációs transzkripciós

A nitrát a NIF folyamatát is gátolja: 1.) N-áz és NR-áz kompetíciója a szénhidrátokért (nitrát csökkenti a szénhidrát transzportot SPS!) 2.) NO a Názhoz/leghgl-hoz kapcsolódva (oxigén parciális nyomásának csökkentése) gátolhatja a NIF-t, 3.) feedback génexpresszió gátlás - fixált nitrogén miatt.

38

A génexpresszió szabályozása O2 tenzió tenzió

Fixá Fixált nitrogé nitrogén Centrá Centrális nitrogé nitrogénfelhasznfelhasználást szabá szabályozó lyozó gének

NO3-

f.

NO3-

A Náz expressziója csak alacsony O2 cc-nál következik be. A FixL protein (kétkomponensű regulációs rendszer része) szabályozza azt a regulációs kaszkádot, ami a NIF-hoz szükséges gének transzkripcióját aktiválja. A FixL alacsony O2 cc-nál autofoszforilálódik, majd foszforilálja a FixJ-t. A foszforilált FixJ (transzkripciós faktor) aktiválja a NifA és FixK transzkripcióját, amelyek azután különböző nif és fix gének expresszióját szabályozzák. Az NtrC géntermék foszforilált állapotban aktiválja a nifA,L regulátor géntermékek, ezek pedig a nif gének szintézisét. A NtrB géntermék a GlnB géntermékkel (PII, a NtrB géntermék kofaktora) a körülményektől függően foszforilálja az NtrC génterméket. Ha ez a kofaktor aktivált állapotban van (a GlnD géntermék aktiválja alacsony redukált nitrogén szint esetén), akkor az NtrB géntermék kinázként működve aktiválja a nitrogénfixációt.

39

A noduluszfejlődés indukciója

Jobb fent: S. meliloti expressing a green fluorescent protein gene (GFP). Cell walls are counter-stained with propidium iodine (red). Lent: Frugier (08) TIPS A citokininek szerepe az infekciós folyamatokban és a nodulációban: A Nodfaktor érzékelése LysM (lysin motif-containing) receptorokkal Ca/CAM szignalizáció (CCaMK – Ca/CAM protein kináz, NSP1/2, ENR transzkripciós faktorok: TF) révén citokinin szintézist indukál, ami szignál transzdukciós út (HK – His kináz, RR – response regulators) közreműködésével génexpressziót (NIN – az infekciós fonal képződéséhez szükséges) eredményez. A szignál transzdukciós út egy részét helyettesítheti a baktériumok által termelt citokininszerű anyagok (Rhizobium pTZS) bejutása. Az epidermiszben termelt citokinin vagy egy messenger molekula ( de novo citokinin szintézist indukál a cortex-ben) a cortex-be diffundálhat (a), ahol citokinin receptorok (LHK1, MtCRE1) érzékelik és szignál transzdukciós út (RR-ok, TF-ok) közreműködésével nodulusz organogenezis történik. A citokininek a noduláció lokális (b,c) és szisztémikus (d) feed-back regulációját is szignalizálhatják.

40

A noduluszfejlődés lokális szabályozása 4. Nodulusz fejlő fejlődés - auxin/ auxin/citokinin  sejtosztó sejtosztódás gá gátlá tlás - GH3/ENOD40 szá szállí llító-elemek növ. - GA – elongá elongáció ció E - -amilá amiláz - ABA/LOX/NO organogenezis

1. Gyö Gyökérsző rszőr gö görbü rbülés etilé etilén – sfal regenerá regeneráció ció ROS – szab. infekció infekció ENOD40 – sejtciklus szab.

NO3-

NodNod-faktor  hormonvá hormonvált.  organogenezis 2. Nodulusz indukció indukció - uridin  etilé ázok): etilén (kitin (kitiná zok): 3. Citokinin: Citokinin: - auxin/ auxin/citokinin  sejtosztó sejtosztódás indukció indukció NO3ENOD gé gének aktivá aktiváció ciója szé szénhidrá nhidrát szint nö növelé velés

ACC: 1-aminociklopropán-1-karbonsav, GH3 – auxin responsive promoter, LOX – lipoxigenáz, MtLAX – auxin szintézissel kapcsolatos gén, ccd –cortical cell division, ENOD – early nodulin. A noduluszok primordiumai fajtól függően a külső vagy belső kérgi régióban keletkeznek, amelyekben már az invázió előtt megtörténik a citoszkeleton, a citoplazma és a membránrendszer reorganizációja. A kérgi sejtosztódás az infekciós csatorna növekedésével egyidejűleg folyik. A protoxylém zónában sztele-ből kidiffundáló uridin stimulálja a sejtosztódást. A floém pólusoknál a sejtosztódást a periciklusból kidiffundáló etilén (ACC oxidáz szintetizálja) gátolja. Az auxin kettős szerepet játszik a nodulációban: a kezdeti auxin transzport gátlás (Rhizobium manipulálhatja az auxin transzportot) csökkenti az auxin/citokinin arányt, ami kedvez a sejtosztódás megindulásának, később azonban a magasabb auxinszint gátolja a sejtosztódást. A citokinin sejtosztódást indukál, ENOD géneket aktivál, elősegíti a szénhidrát ellátást. Az etilén pozitívan befolyásolja az infekciós fonal növekedését, negatívan befolyásolja a noduluszfejlődést (kitinázokat indukál, amelyek lebontják a Nod faktorokat, gátolja az auxintranszportot). A gibberellinek (GA) elősegítik a sejtosztódást és elongációt, valamint a nitrogénfixáló baktériumok energiaellátását. A nitrát jelenléte a talajban (>1-5 mM) lokálisan gátolja a nodulációt (infekciót, nodulusz primordium iniciációt). A nitrát gátolja az ENOD40 indukcióját. Feltételezik, hogy a nitrát az auxintranszportot/gyökér auxinérzékenységét befolyásolva növeli az auxin/citokinin arányt, viszont a noduláció megindulásához az auxin/citokinin szint csökkenése szükséges. Ugyanakkor a N-hiány növeli a flavonoid szintézisben résztvevő gének expresszióját, hasonlóan, mint a foszfát a mikorrhiza kialakulását.

41

A noduláció autoregulációja: mutánsok

*

Nodulusz képződés magas talaj N szintnél  * Receptor-kináz (fotomorfogenezis) Hiperinfekció, de csak limitált zónában  etilén receptor gén Fény erősen gátolja a noduluszképződést bZip transzkripciós f.  Fotomorfogenetikus fejlődést befolyásolja

A szimbiotikus NIF hasznos a növények számára. A túl sok nodulusz, azonban megzavarja a gazdanövény növekedését azzal, hogy túl sok energiát von el a növénytől. Az egyensúly fenntartására a szimbionta növények szisztémikus negativ feedback regulátor rendszerrel rendelkeznek (a noduláció autoregulációja), amely távoli szignalizációval szabályozza a noduluszok számát a nodulációs zónában. Keveset tudunk azonban a reguláció mechanizmusáról. Hatékony módszer ennek a tanulmányozására a mutánsok vizsgálata.

42

A noduluszfejlődés integrált szabályozása Gyö Gyökér szigná szignál Nod-faktor (citokinin?) Hajtá Hajtás szigná szignál metil-jazmonát ABA Brassinolid (CDPK, CaMDPK)

Az autoregulációban mind gyökér, mind hajtásban lokalizált szignál transzdukciós rendszerek szerepet játszanak. A hajtásban lokalizált regulációs mutánsok vagy a gyökéreredetű autoregulációs jel érzékelésében és/vagy a hajtáseredetű autoregulációs jel átvitelében sérültek. A gyökéreredetű mutánsok viszont a gyökérből jövő jel átadásában vagy a hajtáseredetű jel érzékelésében defektesek. Ezek a mikorrhiza képzésben is sokszor defektesek, mert sok közös aspektusa van a nodulációval. A gyökéreredetű jel a Nod faktor lehet, ami tehát kettős szerepet tölt be, pozitívan regulálja a noduluszfejlődést, és szisztemikusan (citokinin?)represszálja mind a nodulációt, mind a mikorrizálást. A hajtáseredetű szignálok a levelekből jönnek. Brasszinolid (BL), egy brasszinoszteroid, ABA, és metil-jazmonát (MeJA) játszhat szerepet az autoregulációban. A CCaM-DPK (Ca,CaM dependent protein kinase) lehet tagja a szignál transzdukciós láncnak.

43

Szulfát asszimiláció

Gyö Gyökér!

Takahashi et al. (2011) ARPB Az enzimek és a transzporterek piros betükkel jelöltek, a szaggatott vonal hipotetikus utakat jelöl. Metabolitok: APS – adenozin-5’-foszfoszulfát; Cyst – cisztationin; GS-X – glutation konjugátum, Hcy – homoCys; OAS – O-acetylSer; OPH – O-foszfohomoSer; PAPS – 3’-foszfoadenozin-5’-foszfoszulfát; R-OH – hidroxil prekurzor; SAH – S-adenozilhomoCys; SAM – S-adenozilMet; X-CysGly – ciszteinilglicin konjugátum. Enzimek és transzporterek: APK – APS kináz; APR – APS reduktáz; ATPS – ATP szulfuriláz; CBL – cisztationin -liáz; CGS – cisztationin -szintáz; CLT – tiol transzporter; -ECS – -GluCys szintetáz; GGT – -glutamil transzferáz; GSHS – glutation szintetáz; GST – glutation-S-transzferáz; MRP – ABC transzporter; MS – Met szintetáz; OAS-TL – OAS(tiol)liáz; SAM – S-adenozilMet szintetáz; SAT – Ser transzacetiláz; SiR – szulfit reduktáz; SOT – szulfotranszferáz; SULTR – szulfát transzporter; TS – Thr szintáz.

44

A szulfid a kloroplasztiszban, a legtöbb OAS a mitokondriumban képződik, a Cys szintézis fő helye pedig a citoplazma. Tehát hatékony szulfid, OAS és Cys transzportnak kell léteznie az organelláris membránokon keresztül. A PAPS-ot a szulfotranszferázok használják fel a citoplazmában a glukozinolátok képződéséhez, ill. protein Tyr-ok szulfatációjához. A glukozinolátok lebomlási termékei toxikusak és riasztó anyagok (növényevők, patogének elleni védekezésben is fontosak, sőt antikarcinogén hatásuk is van). Flavonoidok, jazmonátok, brassinosteroidok szulfatálását is végzik (aktivitáshiány törpe fenotípust eredményez). A hormonális hatású szulfatált pentapeptidek (fitoszulfokinek) sejtosztódást stimulálnak (hiányuk korai öregedést okoz). A GSH, amely a sejt redox állapotának regulációjában (GSH reduktáz, glutaredoxinok) és a detoxifikációban (GST, fitokelatinok) játszik szerepet, szintézis regulációjában a fő tényező a -ECS, ami transzkripciós és poszttranszlációs szabályozás alatt is áll. Ez utóbbi redox szabályozás: két intramolekuláris diS híd állapota befolyásolja (oxidált formában aktív – a sejt oxidáltabb állapota, ami stresszek hatására következhet be, aktiválja). A TS-t a SAM aktiválja, ugyanakkor csökkenti a CGS mRNS stabilitását. SAM csökkenéskor a TS aktivitása kisebb és az OPH felhasználás a Met szintézis irányába nagyobb lesz.

45

A szulfát asszimiláció szabályozása

SULTR

C

APR Transzkripció Transzkripciós OAS GSH szaharó szaharóz hormonok PosztPoszt-transzlá transzláció ciós

N

APR (tiol dimer dimer→ →monomer) (tiol monomer) ATPSATPS-APRAPR-SiR komplex -ECS – redox regulá reguláció ció

S Kopriva (2006) A szulfát asszimiláció elsősorban a transzporterek és az APR transzkripció szintjén szabályozott, de poszttranszkripciós regulációs mechanizmusok is beleszólhatnak. Pl. az APR dimer t feleslegben lévő tiolok inaktív monomerré redukálják, ill. kimutatták, hogy az ATPS, APR, és a SiR szulfát redukáló komplexet alkotnak a plasztiszban. A reguláció mechanizmusa azonban még kevéssé tisztázott. A S-ellátottság hajtás gyökér szignalizációjában valószínűleg a GSH játszik szerepet. A legfontosabb transzkripciót befolyásoló regulátorok a szaharóz (Canyagcsere), az OAS (N-anyagcsere) és a GSH (S-anyagcsere). A növényi hormonok is fontos szerepet játszanak. A citokininek a transzporterek expresszióját befolyásolják. A jazmonát számos szulfát asszimilációban szerepet játszó gén expresszióját indukálja, és a jazmonát szintézis génjeit a szulfát hiány up-regulálja. Mind a jazmonát, mind a szalicilátok APR mRNS szint és aktivitásnövekedést indukálnak. Az ABA indukálja a citoplazmatikus OAS:TL-t. A szulfát asszimiláció fejlődési állapottól is függ. A legintenzívebb a fiatal szövetekben, ahol a leginkább szükséges a protein szintézishez.

46

A szulfid beépülés szabályozása CSC

SAT

OAS:TL

O-acetilSer-tiol liáz (OAS:TL, dimer), piridoxál foszfát prosztetikus csoporttal működik. Ser-acetiltranszferáz (SAT, trimer) és OAS:TL enzimek egy kis része komplexet képez (Cys szintáz komplex). Különböző komplexstruktúrák lehetnek a különböző növényfajokban (Arabidopsis: két SAT trimer dimerje kapcsolt egy OAS:TL dimerrel; szójában 3 OAS:TL dimer kötődik egy SAT trimerhez). A kötődéskor a SAT flexibilis C terminális része az OAS:TL katalitikus helyét tartalmazó barázdába fekszik be, inaktiválva a kötődő OAS:TL-t. Az utóbbi tehát a SAT reguláló alegységeként viselkedik, és csak amikor OAS:TL-t köt, akkor szintetizál OAS-t. A komplexképződést az OAS, ami kompetál a kötőhelyért a SAT C-terminális részével, megszünteti, a szulfid pedig (az OAS felhasználásával) elősegíti. Magához a Cys szintézishez szabad OAS:TL kell.

47

piruvát

A sejt kénanyagcseréje

Cys sulfhidriláz

SO2+H2O →HSO3– +H+ SO32– +2H+ SO32- + H2O+O2  SO SO42- + H2O2 SO32- + H2O2 * SO42- + H2O

Szulfit oxidáz (SO): szulfitolízis ellen véd

* - nem enzimatikus A szulfit oxidációja állatokban, mikroorganizmusokban és növényekben is kimutatható. Növényekben egy peroxiszómában lokalizált molibdoenzim, a szulfit oxidáz (SO, Moco kofaktorral működik, mint a NR) katalizálja. A reakcióban az elektron akceptor a molekuláris oxigén, a termékek szulfát és hidrogén peroxid. A szulfitot a hidrogén peroxid is képes nem-enzimatikusan oxidálni. Ez a folyamat és a peroxiszómában lokalizált kataláz detoxifikálja a hidrogén peroxidot. A SO biztonsági szelepként működik, ami detoxifikálja a felesleges szulfitot és megvédi a sejteket a szulfitolízistől: a szulfit (vagy a SO2 nagy ccban), mint nukleofil ágens, megnyitja a diS hidakat, ami protein inaktivációt okoz. A SO másik funkciója, hogy a sejtanyagok dekompozíciójakor keletkező redukált kénvegyületeket lebontja. Minden szövetben konstitutívan expresszálódó, állandó protein szintet mutató, poszt-transzlációs szinten regulált enzim. Általában a sejtek az összeférhetetlen reakcióutakat különböző kompartmentekbe lokalizálják: a szulfát asszimiláció a kloroplasztiszban, a szulfit oxidáció a peroxiszómában zajlik. Ezek az organellumok szoros kapcsolatban vannak a fotorespiráció során is, ami a szulfit átjutását is biztosítja. A szulfit oxidáció végtermékeként keletkező szulfát végső soron a vakuolumban tárolódik, ill. exportálódik a sejtből.

48

Reguláció kénhiány esetén

transzporterek ATPS APR

ROS

Takahashi et al. (2011) ARPB Szulfát hiány, ill. OAS felhalmozódás hatására a transzporter és az APR gének transzkripciója nő. A SLIM1 transzkripciós faktor a kénhasznosítás globális regulátora. Kénhiány esetén a szulfát felvételt és a glukozinolát bioszintézist ellentétesen regulálja. Kénhiányos állapotban azonban az APR transzkriptum szintje nem a SLIM1 közreműködésével szabályozott. A miR395 (amelynek szintjét a SLIM1 szulfát limitáció esetén növeli) elsősorban az ATPS és egyes transzporterek mRNSeinek poszttranszkripciós degradációját okozza. A MYB transzkripciós faktorok a glukozinolát bioszintézis pozitív regulátorai, a primer kénasszimiláció enzimeinek génexpresszióját is pozitívan szabályozzák, biztosítva s szubsztrátellátást a glukozinolát szintézishez. Kénhiányos állapotban a SLIM1 negatívan szabályozza (a MYB faktorokra gyakorolt hatással) a glukozinolát szintézist. A kénhiányos állapot csökkenti a nitrogén- és szénasszimilációt, és oxidatív stresszt indukál. Bizonyos stresszhatások (nehézfémek) a S metabolizmust stimulálják (fitokelatin szintézis). A CSC (SAT és OAS:TL asszociáltan) a fő metabolikus szabályozó. Kénhiányos állapotban a szulfid csökken, OAS halmozódik fel, ami inaktiválja. A jazmonát szintézis génjeit a szulfát hiány up-regulálja. A hosszú idejű kénhiányos állapot auxin szignálokat is indukál.

49

A szén, nitrogén és kén asszimiláció kölcsönhatásai

50

A kén, szén és nitrogén asszimiláció összehangolt regulációja.

Nitrát felvétel, redukció

A C-asszimiláció csökkenése redukálja a N-asszimilációt (Asn). A redukált Svegyületek (Cys, GSH) aktiválják a N redukció kulcsenzimét, a NR-t, a redukált Nvegyületek (Glu, Gln) viszont stimulálják a szulfát redukció kulcsenzimét, az APR-t transzkripciós szinten. Uezek a vegyületek feed-back regulálják a saját bioszintetikus reakcióútjaikat. A S-asszimiláció stimulációja N-limitált körülmények közt nem történik meg S-limitáltság esetén sem. Ez arra utal, hogy a redukált N-vegyületek szükségesek a S-asszimilációs enzimek de-repressziójához.

51

A szén, nitrogén és kén asszimiláció a C4-es növényekben Zea  Flaveria

Kopriva_PhRes05 Általában az egyszikű C4-es növényeknél a kukoricáéhoz hasonló eloszlást találtak. A kétszikű C4-es Flaveria fajoknál (BSC is tartalmaz PSII-t) a szulfát redukció mindkét sejttípusban megtalálható. A lokalizáltság okairól nem sokat tudunk. A szulfát asszimiláció feedback gátlója viszont nem a GSH, hanem a Cys a kukoricában.

52

A szén, nitrogén és kén asszimiláció összefüggései: Összefoglalás A fotoszintézis fontossága: szénváz-, energia- és reduktáns donor A fotoszinté fotoszintézis nemcsak C, hanem N és S asszimilá asszimiláció ció is! C → N 2020-25 S C-metabolizmus metab 2OG

1

N-metabolizmus metab Glu

Glc, Glc, szah. szah.

S-metabolizmus S2-

Cys,GSH

Asn OAS

Loká Lokális/integrá lis/integrált vá válaszreakció laszreakciók: nitrát/hormonok, cukrok

53