Anomálie očí u kolií (CEA)

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat

Anomálie očí u kolií (CEA) Bakalářská práce

Vedoucí práce: Ing. Petra Bartoňová

Vypracovala: Michaela Paldusová

Brno 2011

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma „Anomálie očí u kolií (CEA)“ vypracovala samostatně a vyuţila pouze pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném přehledu pouţité literatury. Bakalářská práce je školním dílem a můţe být pouţita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně.

V Brně dne ………………………………………. Podpis bakalanta ….………………..……………

PODĚKOVÁNÍ Na tomto místě bych ráda poděkovala mé konzultantce Ing. Petře Bartoňové za odborné vedení, cenné rady a připomínky, které mi poskytla během zpracování bakalářské práce. Dále rodině za poskytnutí vhodného zázemí pro psaní práce a hlavně svým přátelům za trpělivost a podporu.

ANOTACE Cílem této bakalářské práce bylo vypracovat literární přehled o autozomálně recesivním onemocnění „Anomálie očí u kolií“ (CEA), charakterizovat vybrané onemocnění a uvést způsob jeho detekce molekulárně-biologickými metodami. Zkratkou CEA je označován soubor geneticky podmíněných autozomálně recesivních chorob postihující oční aparát psů. Toto dědičné onemocnění vyvolává defekty převáţně na zadní stěně oční koule. Tyto problémy variují od dírek v sítnici, přes uvolnění sítnice aţ po krvácení v oční bulvě. Choroba se projevuje jiţ v raném věku psa a její klinická diagnostika můţe být komplikovaná, proto je genetický test vhodným doplňkem či alternativou k oftalmologickému vyšetření. Test se provádí 1krát za ţivot jedince, neboť dědičné zaloţení zvířete se v průběhu ţivota nemění. Genetický test je moţné provést z výtěru ústní sliznice, či ze vzorku krve. Chorobu nelze vyléčit, ale lze ji v chovech eliminovat genetickým testováním vrhů a vhodným výběrem rodičů. Klíčová slova: DNA, hypoplasie cévnatky, molekulární biologie, mutace, PCR, variabilita.

SUMMARY The aim of this thesis was to create a literary summary on autosomal recessive disease „Collie Eye Anomally“ (CEA), to characterize the disease and specify ways of detecting it through molecular biological methods. CEA stands for a range of genetic autosomal recessive diseases affecting the ocular apparatus of dogs. This hereditary disease causes defects mainly on the back of the eyeball, e. g. holes in the retina, release of the retina or haemorrhage in the eyeball. Since CEA manifests itself in the early age of the dog and its diagnosis may be complicated, genetic testing is a viable alternative to ophthalmologic examination. The test is performed once in the animal's lifetime because the genetic foundation of its life remains unchanged in time. The genetic test can be done with oral mucosa or a blood sample. The disease can not be cured but can be eliminated through genetic testing of litters and the choice of parents.

Keywords: DNA, choroidal hypoplasia, molecular biology, mutation, PCR, variability.

OBSAH 1 ÚVOD .......................................................................................................... 7 2 LITERÁRNÍ PŘEHLED ............................................................................... 9 2.1 Predisponovaná plemena pro toto onemocnění .................................................. 9 2.2 Vývoj nemoci .......................................................................................................... 9 2.2.1 Klinické příznaky ............................................................................................. 10 2.2.2 Formy nemoci.................................................................................................. 10 2.2.2.1 Střední forma onemocnění CEA .......................................................................... 10 2.2.2.2 Těţká forma onemocnění CEA ............................................................................ 12

2.3 Genetické podklady onemocnění........................................................................ 14 3 CÍL PRÁCE................................................................................................ 16 4 MATERIÁL A METODIKA ........................................................................ 17 4.1 Oftalmologické vyšetření .................................................................................... 17 4.2 Molekulární diagnostika ..................................................................................... 18 4.2.1 Izolace DNA z genetického materiálu ............................................................. 19 4.2.2 PCR ................................................................................................................. 19 4.2.2.1 Metoda Direct PCR ...................................................................................... 21 4.2.3 RFLP ............................................................................................................... 22 4.2.4 ELFO ............................................................................................................... 23 5 VÝSLEDKY A DISKUZE............................................................................ 27 5.1 Výsledky oftalmologického vyšetření ................................................................ 27 5.2 Výsledky genetických testů ................................................................................. 27 5.3 Udávání výsledků vyšetření ................................................................................ 29 5.4 Výskyt onemocnění .............................................................................................. 30 6 ZÁVĚR ...................................................................................................... 32 7 PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY ......................................................... 33 8 SEZNAM ZKRATEK.................................................................................. 36 9 SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................. 37

1 ÚVOD V současné době je studiu problematiky dědičně podmíněného onemocnění oka u kolií věnována stále větší pozornost. Při detekci této choroby stále více nabývají na významu především molekulárně-biologické metody. Aby však tato problematika nebyla vytrţena z kontextu, je vhodné se hned na začátku lehce zmínit o obecných poznatcích studia molekulární biologie. Základem

moderní

genetiky

je

molekulární

biologie,

která

vychází

z biochemických poznatků a studuje přenos genetické informace na molekulární úrovni. Základními „molekulami dědičnosti“ jsou nukleové kyseliny a nejvýznamnější z nich je deoxyribonukleová kyselina – DNA (KOČÁREK, 2004). Chemické sloţení psí DNA, bylo rozluštěno v roce 2005. Dnes tedy víme, ţe karyotyp psa obsahuje 39 párů chromozomů, které jsou sestaveny z 2 385 119 138 párů bází. Tyto báze jsou heterocyklické dusíkaté sloučeniny - puriny: adenin „A“ a guanin „G“, a pirimidiny: thymin „T“ a cytosin „C“ (DOSTÁL, 2007). Molekula DNA se skládá ze dvou dlouhých polynukleotidových vláken sloţených z výše uvedených čtyř typů nukleotidových podjednotek. Obě tato vlákna jsou nazývána řetězce DNA, anebo vlákna DNA a jsou vzájemně spojena vodíkovými můstky mezi bázemi nukleotidů. Báze se však nepárují náhodně, toto komplementární uspořádání jim umoţňuje zaujmout energeticky nejvýhodnější konformaci (ALBERTS et al., 1998). Adenin s thyminem se pojí dvěma vodíkovými můstky mezi sebou a třemi vodíkovými můstky je spojen cytosin s guaninem. Tato skutečnost udává molekule DNA její typickou strukturu dvoušroubovice a řád (DOSTÁL, 2007). Nukleotidy jsou tvořeny pěti-uhlíkatým sacharidem, na němţ jsou navázány dusíkaté báze a jedna, či více fosfátových skupin. V případě nukleotidů v DNA je tímto sacharidem deoxyribosa s jednou navázanou fosfátovou skupinou. Způsob, jakým jsou nukleotidy spojeny, udává řetězci DNA polaritu, čímţ omezuje spojení nukleotidů na jediné moţné, a to orientovaným způsobem. Díky této polaritě řetězce DNA je konvenčně jeden konec označován jako 3´(končí – OH skupinou sacharidu) a druhý jako 5´(končí fosfátovou skupinou), (ALBERTS et al., 1998). Vláknitá molekula DNA obsahuje instrukce pro tvorbu jednotlivých proteinů, které pak přímo, či nepřímo ovlivňují vznik konkrétních znaků (KOČÁREK, 2004). Gen pak tedy není nic

7

jiného, neţ určitý úsek DNA, přičemţ vţdy jedno jeho vlákno kóduje určité znaky a vlastnosti a druhé je pouze komplementární. Geny jsou různě velké, od několika desítek aţ po tisíce bází (DOSTÁL, 2007). Jedná se o nositele biologické informace, která je velice přesně předávána z generace na generaci během buněčného dělení (ALBERTS et al., 1998). Soubor všech genů daného organismu nazýváme genom. Genom eukaryotických organismů je tvořen jaderným genomem (souborem genů přítomných v jaderné DNA) a mimo jaderným genomem (souborem genů přítomných v mitochondriální či chloroplastové DNA), (KOČÁREK, 2004). Určité trojice bází obsaţených v genech pak následně kódují, která aminokyselina bude zabudována do polypeptidického řetězce bílkoviny – enzym, který následně plní funkci v organismu (DOSTÁL, 2007). V dostupné literatuře je uváděno, ţe pes je obdařen 20 439 geny. Tyto geny však činí pouze 5% z celkového mnoţství DNA. Zbývající část pravděpodobně nic nekóduje. U psů bylo popsáno přes 500 dědičných chorob, ale pouze 50 jich je dokonale objasněno aţ na molekulární úroveň. To znamená, ţe pouze u těchto chorob je mutace DNA povaţována za příčinu jejich vzniku (DOSTÁL, 2007). Mutace jsou významným zdrojem variability. Jejich působením vznikají nové alely určitého genu, které následně ovlivňují podobu příslušného znaku. Mutace tak přispívají k širší variabilitě potomstva a mohou mít klíčový význam pro jeho přeţití a následný vývoj. Některé mutace jsou však škodlivé, neboť ve svých důsledcích způsobují těţké vývojové vady, poškození a v některých případech i nádorová onemocnění. Jiné mutantní alely jsou naopak pro své nositele přínosem, neboť podmiňují vznik takových znaků, které zvyšují jejich ţivotaschopnost, či odolnost vůči nepříznivým vlivům vnějšího prostředí. Takto se mutace významně podílejí na vývoji ţivých organismů a jsou proto nepostradatelným předpokladem evoluce (KOČÁREK, 1998). Jelikoţ se řada dědičně podmíněných onemocnění a defektů psů obdobně vyskytuje i u člověka, bude to právě pes, daný postiţený jedinec, který bude slouţit k vývoji metod genetické terapie perspektivně vyuţitelné i u člověka (DOSTÁL, 2007).

8

2 LITERÁRNÍ PŘEHLED Anomálie očí u kolií - toto onemocnění bývá v odborné literatuře uváděno pod zkratkou CEA (Collie eye anomaly). Do podvědomí chovatelů psů v České Republice se však zkratka CEA dostala spíše ve spojitosti s onemocněním hypoplasie cévnatky, ale v tomto případě se jedná o nepřesné označení (ANONYM, 2005), neboť je tato zkratka celosvětově uznávaným označením souboru několika dědičných očních chorob. Jedná se tedy o různé defekty, které se projevují na cévách sítnice a následně na sítnici oka samotné (DOSTÁL, 1995). Tyto problémy variují od dírek v sítnici přes uvolnění sítnice, aţ po krvácení v oční bulvě (VERHORF-VERHSELEM, 2002). Z toho je patrné, ţe hypoplasie cévnatky je pouhou podmnoţinou souboru onemocnění, jeţ řadíme do skupiny očních chorob projevující se jiţ v raném věku psa (STAŇA, 2001).

2.1 Predisponovaná plemena pro toto onemocnění Tato choroba je nejvíce frekventovaná u amerických kolií, ale ve světě se vyskytuje i u krátkosrstých a dlouhosrstých kolií, border kolií, australského ovčáckého psa či shetlandského ovčáckého psa (ANONYM, 2005). Mezi tzv. CEA-like (onemocnění s podobnými příznaky) náchylná plemena patří také australská kelpie, anglický kokršpaněl, bígl, erdelteriér, jezevčík, barzoj, maltézský psík, německá doga, německý ovčák, pudl či sibiřský husky (STAŇA, 2001).

2.2 Vývoj nemoci Zdrojem genetické informace pro výskyt nemoci je „CEA defektní alela.“ Kolem 30. dne embryonálního vývoje dochází k morfologickému poškození zadní stěny očního bulbu, coţ je způsobeno následkem narušení syntézy bílkovin vlivem indukce abnormálního enzymu. Podle intenzity zasaţení jednotlivých zárodečných listů v tomto období nacházíme postnatálně vlastní defekty v různých částech oční koule (STAŇA, 2001).

9

2.2.1 Klinické příznaky Klinické příznaky mohou být značně rozdílné mezi nemocnými psy v rámci jednoho plemene, mezi rodiči a potomky, a dokonce i mezi štěňaty v jednom vrhu. To vede ke vzniku rozdílných situací, kterým se musí chovatel daných psů přizpůsobit.

2.2.2 Formy nemoci K poškození oka dochází jiţ v období prenatálního vývoje plodu v těle matky. Odchylky od standardního vývoje oční koule štěněte jsou patrné jiţ 30. den březosti. Tkáně oka u vyvíjejícího se plodu mohou být zasaţeny nemocí v různé míře, a proto se u štěňat po narození střetáváme s chorobou CEA ve dvou základních formách – střední a těžké (CHMELÍKOVÁ et al., 2006).

2.2.2.1 Střední forma onemocnění CEA V případě postiţení mezodermu, ze kterého se vyvíjí cévnatka, dochází k nedostatečnému cévnímu zásobení a úbytku pigmentu oka (ANONYM, 2008). Výsledkem je hypoplasie cévnatky - poškození vrstvy oka, která je uloţena mezi světločivou sítnicí a vnější ochrannou vrstvou oka, bělimou (Obr. 2). V tomto případě hovoříme o „střední formě onemocnění CEA". Střední forma je na očích štěňat patrná jiţ ve věku 5 – 8 týdnů. Při střední formě této choroby bývají krevní kapiláry v cévnatce špatně vyvinuté a můţe dojít k markantnímu úbytku pigmentu v cévnatce. Cévnatka je pak bledá a ztenčená. Při vyšetření očního pozadí pomocí fundus kamery a oftalmoskopu připomínají tato ztenčená místa cévnatky "okna,“ kterými lze zahlédnout jinak skryté vrstvy cév a pod nimi leţící bělimu (Obr. 3). Výskyt cév je v tomto místě značně omezený a není výjimkou, ţe je jejich tvar abnormální. Ve věku 3 měsíců od narození dochází k úplnému dozabarvení sítnice a pigment často chorobné změny na cévnatce skryje, z tohoto důvodu je velmi důleţité, aby byla štěňata vyšetřována jiţ v raném věku. Psi postiţení střední formou onemocnění CEA obvykle totálně neoslepnou, ale jejich potomci mohou zdědit těţkou formu této nemoci (CHMELÍKOVÁ et al., 2006).

. 10

Obr. 1 – Zdravé oko psa (ANONYM, 2010)

Obr. 2 – Hypoplasie cévnatky (ANONYM, 2010)

Obr. 3 - Neúplně vyvinutá cévnatka (ANONYM, 2010)

11

2.2.2.2 Těžká forma onemocnění CEA Je-li postiţen ektoderm, pozorujeme na sítnici oka vinutý průběh primárních cév, záhyby či odchlípení sítnice, popřípadě i nitrooční krvácení. Typickým symptomem je například nepravidelný tvar zornice (STAŇA, 2001). Těţká forma onemocnění CEA postihuje přibliţně 25 % všech psů postiţených touto chorobou. Poškození oka je na první pohled zřetelné a váţné. Cévy cévnatky jsou nenávratně zkroucené a cévnatka je často zprohýbaná (Obr. 4). Vyrůstají zde i nové abnormální cévy, které snadno praskají, čímţ způsobují masivní krvácení uvnitř oční koule. U těţké formy bývá dost často postiţen i optický nerv v důsledku nedovření fetální oční štěrbiny, který odvádí signál ze sítnice oka do mozku a je tedy nezbytný pro vytvoření zrakového vjemu (Obr. 5). Mohou se zde tvořit tzv. kolobomy, coţ jsou útvary duhovky nebo sítnice, kde chybí oční tkáň (Obr. 6). V případě jejich výskytu na sítnici, můţe dojít k jejímu úplnému odchlípnutí. Takto postiţená sítnice je totálně „slepá.“ Nejzávaţnějšími komplikacemi těţké formy onemocnění CEA trpí cca 5 – 10 % psů postiţených touto dědičnou chorobou. Defekty cévnatky a kolobomy jsou patrné jiţ u štěňat ve věku 8 – 12 týdnů a obvykle postihují obě oči. Mírou i typem postiţení se však mohou oči jednoho zvířete výrazně lišit. Menší defekty bývají časem překryty pigmentem, coţ můţe vést k jejich obtíţné prokazatelnosti i při vyšetření oka odborníkem. Vyhlídky do budoucnosti psa trpícího těţkou formou CEA nejsou prognosticky optimální. Kolobomy a zkroucení cév se s věkem sice významně nemění, ale riziko nitroočního krvácení či odchlípnutí sítnice se zvyšuje (CHMELÍKOVÁ et al., 2006).

12

Obr. 4 - Zkroucené cévy (ANONYM, 2009)

Obr. 5 - Díra ve zrakových nervech (ANONYM, 2010)

Obr. 6 - Kolobom – chybějící tkáň (ANONYM, 2009)

13

2.3 Genetické podklady onemocnění CEA je povaţována za jednoduše autozomálně recesivní onemocnění. Nositelem je tedy recesivní alela, která není vázána na pohlavní chromozomy. Vazbu vlohy na barvu potvrzuje častější výskyt defektní alely CEA u variety blue merle. Pro F1 generaci po heterozygotních rodičích by měl platit II. Mendelův zákon (Tab. 1). Tab. 1 - Předpokládané výsledky kombinace rodičů různých genotypů CEA

OTEC MATKA

Normal

Carrier

Affected

Normal

Carrier

celý vrh

½ vrhu = Normal

= Normal

½ vrhu = Carriers

½ vrhu

¼ vrhu = Normal

1/2 vrhu = Carriers

½ vrhu = Carriers

1/2 vrhu

= Carriers

¼ vrhu= Affected

= Affected

celý vrh

½ vrhu = Carriers

= Carriers

½ vrhu= Affected

= Normal ½ vrhu

Affected

celý vrh = Carriers

celý vrh = Affected

V praxi se však neřídí výskyt onemocnění CEA v populaci přesně Mendelovými zákony. Nejdále pokročili s terénními depistáţemi ve Švédsku. V této zemi probíhala v letech 1989 - 1997 rozsáhlá studie, při níţ bylo vyšetřeno 8 204 kolií ve 4 generacích. Počítačové zpracování nálezů však přineslo nečekané závěry: A. Kříţením klinicky negativních rodičů by mělo vzniknout maximálně 25 % pozitivních jedinců v F1 – první filiální generaci (ve skutečnosti 43 %). 14

B. Kříţením klinicky pozitivních rodičů (recesivních homozygotů) by mělo vzniknout 100 % pozitivních jedinců v F1 generaci (ve skutečnosti 85 %). Niţší výskyt pozitivních potomků po pozitivních rodičích (recesivních homozygotech) by mohl být způsoben neúplnou dominancí této choroby, popř. intermediárním fenotypem. Klinicky není tato vada úplně zřetelná, a tudíţ daný jedinec můţe být povaţován za 100% zdravého. Stejná chyba se však můţe vyskytnout i v případě vyšetření zdánlivě klinicky negativních rodičů, coţ má za následek zvýšený výskyt pozitivních jedinců v první filiální generaci (STAŇA, 2001). Tyto negativní skutečnosti zvyšují tlak na nutnost včasné diagnostiky screeningovým vyšetřením kaţdého vrhu. Všechna štěňata musí být ve věku 8 aţ 12 týdnů po narození oftalmologicky vyšetřena na dědičné oční choroby. Vyšetření v takto brzkém věku se provádí z důvodu následného překrytí moţného poškození části oka zdravou tkání (pigmentem), ke kterému dochází přibliţně ve třech měsících. Toto je také důvod, proč oftalmologické vyšetření u dospělých jedinců jiţ není moţné povaţovat za zcela objektivní. Nebezpečím špatně provedené detekce u jedince s nízkou či střední formou onemocnění CEA je to, ţe se nám můţe klinicky jevit jako 100% zdravý jedinec. Ještě donedávna bylo tedy běţně moţné zařadit do chovu a dále dokonce i rozmnoţovat psy, kteří se klinicky zdáli být zdravý, ale genotypově byli přenašeči této choroby. Díky vědeckému postupu v oblasti genetiky je od roku 2005 moţno provádět testy DNA, které nejsou věkově omezeny a z jejichţ výsledků je naprosto jasné, zdali je pes poškozeného genu prostý, či je jeho přenašečem (ANONYM, 2004).

15

3 CÍL PRÁCE Cílem této bakalářské práce bylo naučit se vyhledávat a zpracovávat podstatné informace potřebné pro řešení dané problematiky. V úvodní části práce byla ze současné literatury vypracována literární rešerše týkající se „Anomálie očí u kólií.“ Dále se práce zabývá moţnými způsoby detekce vybraného onemocnění molekulárněbiologickými metodami. Tato část práce byla věnována především charakteristice laboratorní detekce a to z toho důvodu, ţe genetické zaloţení jedince se během jeho ţivota jiţ nemění. Takţe na rozdíl od oftalmologického vyšetření se genetické testování provádí pouze jedenkrát za ţivot a koncové výsledky mají vyšší vypovídající hodnotu.

16

4 MATERIÁL A METODIKA

4.1 Oftalmologické vyšetření Jelikoţ je v posledních letech frekvence výskytu dědičně podmíněných chorob v chovu psů značná, ve většině západních zemí je studiu jejich moţné detekce věnována vysoká pozornost. Hlavním cílem je rychlé a plošné ozdravení co největšího počtu chovů, které jsou těmito onemocněními relativně vysoce zatíţeny (BERÁNEK, 1998). U postiţených jedinců je moţné pozorovat onemocnění oftalmoskopem na sítnici oka jiţ od věku 6 týdnů (DOSTÁL, 1995). Proto je nezbytné, aby byla štěňata jiţ v útlém věku vyšetřena očním specialistou, který odborně zdokumentuje stav jejich očního aparátu. Výsledek tohoto vyšetření je následně dokládán při prodeji štěňat, bonitaci a v neposlední řadě v době rozhodování o případném zařazení do plemenitby. Po celou dobu, kdy je pes vyuţíván v plemenitbě, jsou vyšetření periodicky opakována. Jejich výsledky je nezbytné doloţit fotodokumentací (BERÁNEK, 1998). Všichni jedinci, kteří podstupují toto vyšetření v České Republice, obdrţí od vyšetřujícího veterinárního specialisty protokol o vyšetření (příloha č. 3) s celosvětovou platností a fotodokumentaci vyšetřeného očního pozadí předvedeného psa. Kopie tohoto protokolu a druhý snímek je veterinář povinen archivovat (BERÁNEK, 1998). Vlastní vyšetření se skládá z kompletního klinického vyšetření, které je završeno prohlídkou očního pozadí za pouţití kamery KOWA - 2 s fotografickým záznamem. Samotné vyšetření oka trvá přibliţně 10-20 minut a je prováděno za plného vědomí zvířecího pacienta. Anestezie, byť lokální, by v tomto případě mohla výrazně znesnadnit správnou diagnostiku daného jedince.

17

Obr. 7 - Vyšetření štěněte fundus kamerou (BERÁNEK, 1998)

Obr. 8 - Štěrbinová lampa a fundus kamera (BERÁNEK, 1998)

4.2 Molekulární diagnostika Jak jiţ bylo výše popsáno, CEA je autozomálně recesivní dědičné onemocnění. Autozomální znamená, ţe tato choroba je rovnoměrně přenosná na samčí i samičí potomky, není tedy vázaná na pohlaví. Recesivní znamená, ţe jedinec můţe ve svém genotypu nést „špatnou“ mutovanou alelu, kterou předává svým potomkům, u kterých se nemoc můţe, ale také vůbec nemusí projevit. Autozomálně recesivní dědičnost tedy znamená, ţe aby se příznaky choroby projevily, musí daný jedinec zdědit poškozenou alelu od kaţdého z rodičů (50 % od matky a 50 % od otce). Postiţený pes se v takovém případě označuje jako „recesivní homozygot.“ V případě, ţe jedinec zdědí poškozenou alelu pouze od jednoho z rodičů,

18

nemoc se u něj neprojeví, ale stává se nositelem - heterozygotním přenašečem vadné alely. V případě zařazení tohoto jedince do plemenitby hrozí riziko, ţe jej bude dál přenášet na své potomky (ANONYM, 2008).

4.2.1 Izolace DNA z genetického materiálu Cílem této metody je získání co největšího moţného mnoţství čisté a nedegradované DNA, coţ spočívá v uvolnění DNA z vazby na jaderné proteiny a následném odstranění kontaminujících příměsí. Genetický materiál je moţno získat z velkého mnoţství biologických vzorků (např. z krve, mléka, masa, tkání, ejakulátu, chlupů, či ze stěrů sliznic), (ŢUROVEC, 1999).

4.2.2 PCR Polymerázovou řetězovou reakci (polymeráze cháni reaktivní) je moţno povaţovat za jednu ze základních molekulárně-genetických metod, které pouţíváme k získávání dostatečného mnoţství specifické DNA pro další analýzy (KNOLL a VYKOUKALOVÁ, 2002). Princip této metody byl popsán jiţ před více neţ 30ti lety, ale v praxi je PCR vyuţívána aţ od roku 1985. V témţe roce za ni její autor Kary Mullis obdrţel Nobelovu cenu. Polymerázová řetězová reakce je proces, u kterého dochází k namnoţení určité sekvence DNA, která je vymezena tzv. primery. Primery jsou specifické fragmenty oligonukleotidů vázající se na oblast úseku DNA, který se má namnoţit. Výhodou PCR metody je to, ţe umoţňuje získání poţadované specifické sekvence genomové DNA bez jejího předchozího klonování. Princip metody PCR je zaloţen na replikaci nukleových kyselin, která je základním molekulárním procesem všech ţivých organismů. Podstatou PCR metody je cyklicky se opakující enzymová syntéza nových řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA ve směru 5´ → 3´ pomocí DNA polymerázy. Detekovaný úsek nukleotidové sekvence je vymezen připojením dvou primerů, jeţ se váţí na protilehlé řetězce DNA a to tak, ţe jejich 3´- konce směřují proti sobě. Po přidání DNA polymerázy a nukleotidů probíhá syntéza nových vláken protisměrně na obou matricových řetězcích (ŠMARDA et al., 2005). 19

K syntéze DNA se pouţívá reakční směs obsahující určité komponenty, které vytvářejí specifické prostředí pro průběh reakce. Jedná se především o termostabilní DNA polymerázu, která je izolována z termofilních bakterií a vykazuje dostatečnou enzymovou aktivitu realizující replikaci DNA při elongaci. Nejčastěji se pouţívá Taq polymeráza, která pochází z eubakterie Thermus aquaticus odolávající teplotám, při nichţ DNA denaturuje. To umoţňuje, aby syntéza DNA probíhala opakovaně formou cyklů (ŠMARDA et al., 2005). Dále jsou to jiţ zmiňované primery, směs nukleotidů, které představují stavební jednotku pro vytváření úseků DNA – dNTP, nezbytný komponent pro činnost DNA polymerázy – Mg2+ a pufr, který udrţuje stálé prostředí iontů během reakce. Tato metoda je zaloţena na extenzi primerů, které se připojují na komplementární úseky DNA, čímţ vymezují úsek DNA k amplifikaci. Ke geometrické amplifikaci neboli k namnoţení molekul DNA dochází za cyklického opakování tří kroků (Obr. 9) lišících se pouze teplotními podmínkami (ŠMARDA et al., 2005).

Dvoušroubovice Denaturace - rozpojení vláken DNA

Annealing - nasedání primerů na rozpojená vlákna DNA

Elongace - namnoţení úseku DNA působením enzymu polymerasy

Obr. 9 – Princip PCR

20

K amplifikaci vzorku dochází po průběhu 30 cyklů. 1. denaturace - vede ke vzniku jednořetězové DNA – dochází k rozpletení dvou vláknité dsDNA na jedno vláknitou ssDNA 2. annealing – připojení primerů ke komplementárním úsekům DNA (30 cyklů), řídí další syntézu nových vláken 3. elongace – extense připojených primerů termostabilní DNA polymerázou Reakce se provádějí v zařízení nazývaném termální cykler, v němţ se teplota mění automaticky v naprogramovaných časových intervalech (ŠMARDA et al., 2005). V kaţdém takovémto cyklu se mnoţství DNA zdvojnásobí, čímţ se zároveň zdvojnásobí i mnoţství templátu pro následující cyklus – můţeme tedy říci, ţe mnoţství DNA roste geometrickou řadou (=> geometrická amplifikace). Jelikoţ výsledkem PCR je mnohonásobné zmnoţení vybraného úseku DNA, lze ji označit za moţný způsob klonování DNA (ŠMARDA et al., 2005). Přesnost a úspěšnost metody PCR při amplifikaci určitého genu nebo části sekvence genomové DNA je závislá na pečlivém návrhu obou primerů, při němţ je nezbytné přihlíţet k celkové sekvenci detekovaného genomu. V daném genomu by měla být sekvence o této délce jedinečná a měla by se vázat pouze k jedinému místu (ŠMARDA et al., 2005).

4.2.2.1 Metoda Direct PCR Pro molekulárně biologickou detekci dědičného onemocnění CEA je v dnešní době nejčastěji vyuţívána PCR metoda Piko

TM

. Nespornou výhodou této metody je, ţe

se pracuje s krví samotnou, nedochází tedy k poškození či kontaminaci DNA při její izolaci. Dalšími pozitivy této metody je její rychlost (celý proces trvá méně neţ 15 minut), snadné provedení, spotřeba polovičního mnoţství materiálu a čtvrtiny energie oproti normálnímu termálnímu cykleru. A v neposlední řadě i fakt, ţe k jejímu provedení potřebujeme pouze 0,5 µl krve testovaného jedince, která nemusí být 100% čistá, neboť výsledek detekce nebývá ovlivněn ani přítomnost heparinu či citrátů. Tímto se 21

tato metoda stává nesmírně šetrnou i při její aplikaci na vyšetření štěňat, či zástupců malých plemen psů (DOSTÁL et al., 2010).

Obr. 10 – Termální cykler Piko® (ANONYM, 2011)

4.2.3 RFLP Polymorfismus délky restrikčních fragmentů (restriction fragment length polymorphism) se pouţívá k identifikaci alel na základě přítomnosti či nepřítomnosti specifického restrikčního místa (KNOLL a VYKOUKALOVÁ, 2002). Jedná se vlastně o analýzu genomu, při níţ je moţné vyuţít rozdílů v restrikčních mapách jedinců téhoţ druhu. Tyto rozdíly jsou podmíněny různou délkou a počtem restrikčních fragmentů vytvořených štěpením genomové DNA restrikčními endonukleázami na specifických místech. Rozdíly ve velikosti restrikčních fragmentů lze snadno detekovat gelovou elektroforézou za pouţití 1,5% agarosového gelu (ŠMARDA et al., 2005). Tato metoda je nejčastěji vyuţívána při detekci polymorfismů DNA, multiplexovém stanovení polymorfismů u více genů nebo u celogenomového screeningu polymorfismů. A v neposlední řadě i při detekci mutací, které vedou k vytvoření či ztrátě rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy či vznikají jako důsledek přítomnosti různého počtu opakujících se sekvencí, delecí, inzercí a přestaveb ve specifických oblastech chromozomů (ŠMARDA et al., 2005). 22

Nespornou výhodou této metody je spotřeba velmi malého mnoţství DNA. Jedná se o relativně jednoduchou a rychlou metodu, která je s oblibou pouţívána kvůli vysoké reprodukovatelnosti a snadné interpretovatelnosti jejích výsledků. Mezi její nevýhody patří vysoké náklady na pořízení materiálu, hlavně restrikčních endonukleáz. Restrikční endonukleázy jsou sekvenčně specifické enzymy, které jsou schopné rozpoznat určité sekvence nukleotidů (restrikční místo – RES). Třídy restrikčních endonukleáz: I. štěpí mimo RES II. štěpí v nebo blízko RES, nejdůleţitější III. kódovaní dvěma geny, mimo RES Nejčastěji restrikční endonukleázy štěpí v místech, kde je pořadí bází v obou vláknech totoţné při protisměrném čtení => tzv. palindromy (Obr. 11).

Obr. 11 - Palindromy Kaţdý enzym reaguje pouze za přítomnosti pro něj specifického pufru, který má své jedinečné sloţení a vlastnosti (př.: určité sloţky, aditiva, pH atd.) a vyţaduje specifické teplotní podmínky pro štěpení (ŠMARDA et al., 2005).

4.2.4 ELFO Po PCR analýze genů je obvykle prováděna kontrola výsledku elektroforézou na agarózovém (AGE), či polyakrylamidovém (PAGE) gelu. V molekulární biologii se tato metoda řadí k nejpouţívanějším separačním technikám. Principem elektroforetické se23

parace je pohyb nabitých molekul v elektrickém poli. Vzhledem k tomu, ţe pentózofosfátová kostra všech nukleových kyselin nese velký záporný náboj, všechny fragmenty v elektrickém poli migrují vţdy k opačně nabité elektrodě – anodě (ŠMARDA et al., 2005). Rychlost této migrace je závislá výhradně na velikosti daných fragmentů. Kratší fragmenty putují rychleji, z čehoţ plyne, ţe urazí větší vzdálenost, neţ fragmenty dlouhé. Z praktických důvodů je vhodnější provádět elektroforézu v optimálním nosiči, neţ přímo v roztoku. Takovýmto nosičem bývá nejčastěji gel tvořený polyakrylem či agarózou, který vytváří sloţitou síťovou strukturu polymerních molekul s póry, jejichţ velikost lze ovlivnit sloţením roztoku a koncentrací polymeru. Polyakrylamidové gely se pouţívají pro separaci malých fragmentů o velikosti 10 aţ 1 000 bp. Agarózové gely jsou naopak vhodné pro separaci velkých fragmentů o velikosti od 100 bp aţ po zhruba 50 kb. Podle polohy gelu v elektroforetické aparatuře rozlišujeme horizontální (Obr. 12) a vertikální (Obr. 13) gelovou elektroforézu (ŠMARDA et al., 2005).

Obr. 12 – Horizontální gelová elektroforéza (ANONYM a, 2007)

24

Obr. 13 – Vertikální gelová elektroforéza (ANONYM b, 2007) Agarózové gely ve většině případů, a tedy i v tomto, umisťujeme horizontálně a zcela je noříme do pufru (nejčastěji Tris-borát-EDTA neboli TBE). Při přípravě gelu v něm vytváříme jamky, do nichţ po jeho vychladnutí nanášíme vzorky. Tyto vzorky pomocí špičky pipety mícháme s nanášecím pufrem, který obsahuje barvivo (zpravidla bromfenolovou modř) a glycerol (nebo sacharózu) napomáhající rychlejšímu klesání vzorku na dno jamky. Následně vzniklou směs vnášíme do předem připravených jamek. Potom komoru uzavřeme a připojíme zdroj elektrického napětí. Vzorky amplifikované DNA migrují směrem ke kladné elektrodě. Rychlost pohybu molekul DNA v gelu je označovaná jako elektroforetická pohyblivost a je nepřímo úměrná logaritmu jejich velikosti. Při posuzování elektroforetické pohyblivosti dané molekuly DNA není třeba brát v úvahu velikost náboje, neboť nukleové kyseliny mají náboj rovnoměrně rozloţen a jeho velikost je na jednotku délky molekuly stejná. Velikost molekuly DNA nebo jejího fragmentu lze tedy stanovit i v případě, ţe neznáme jejich velikost, a to srovnáním jejich elektroforetické pohyblivosti s elektroforetickou pohyblivostí molekul či fragmentů DNA o známé velikosti (ŠMARDA et al., 2005). Je tedy vhodné do jedné z jamek nanést standard neboli „ţebřík“ (ladder), který je nejčastěji tvořen směsí restrikčních fragmentů plazmidových molekul či genomů bakteriofágů, jejichţ přesná velikost byla 25

stanovena sekvenováním DNA. Srovnáním s jednotlivými prouţky standardu pak snáze odhadneme, jak velké fragmenty jsme při PCR získali. K identifikaci polohy separovaných molekul po dokončení elektroforézy je třeba jejich zviditelnění, neboť nejsou pouhým okem viditelné. Nejčastěji je pouţíván ethidiumbromid, kterým lze molekuly snadno zviditelnit. Toto fluorescenční barvivo přítomné v gelu se vmezeřuje mezi sousední páry bází v DNA a vytváří s ní komplex, který po osvětlení ultrafialovým světlem červeně fluoreskuje. Molekuly DNA o stejné velikosti se na gelu jeví jako prouţky, jejichţ intenzita je úměrná koncentraci DNA (ŠMARDA et al., 2005).

26

5 VÝSLEDKY A DISKUZE

5.1 Výsledky oftalmologického vyšetření Hlavním (patognomickým) příznakem onemocnění CEA je hypoplasie cévnatky. Jiţ tento defekt sám o sobě k jejímu potvrzení obvykle stačí. Vhodnější je však přítomnost alespoň dvou dalších příznaků nemoci. Například kolobom + zkroucení cév, kolobom + odchlípení sítnice, zkroucení cév + hypoplazie cévnatky, atd. Nitrooční krvácení je nespecifickým příznakem, neboť se vyskytuje u celé řady dalších nemocí (STAŇA, 2001).

5.2 Výsledky genetických testů Mnoţství analýz odhalilo, ţe všichni psi postiţení dědičným onemocněním CEA sdílejí shodnou homozygotní deleci 7 799 bp ve 4. intronu postiţeného genu NHEJ 1 (nonhomologous end-joining factor 1) leţícím na 37. chromozomu (PARKER et al., 2007). Při pouţití prvního setu primerů (F 17 a R17) PCR fragmenty byly amplifikovány u zdravých jedinců a přenašečů. U postiţených homozygotů se daný fragment neamplifikoval (Obr. 14). Při pouţití druhého setu primerů (F 20 a R 23) se PCR fragment u zdravých homozygotů neutvořil, naopak u přenašečů a nemocných jedinců ano (Obr. 14).

27

Obr. 14 – Prezentace výsledků PCR analýzy genů NHEJ 1( nonhomologous end-joining factor 1), detekované pomocí 2 kroků, za použití setu NHEJ 1 – F 17 a NHEJ 1 – R 17, a setu NHEJ 1 – F 20 a NHEJ 1 – R 23.

M – marker 100 – 1000 bp H – zdravý jedinec C – přenašeč A – nemocný jedinec

(Zdroj: CZECH JOURNAL OF ANIMAL SCIENCE)

28

5.3 Udávání výsledků vyšetření Často bývají chovatelé zmateni udáváním výsledků genetických vyšetření. Kaţdá laboratoř si totiţ můţe nastavit systém udávání výsledků dle svého uváţení. V takovýchto případech je však třeba připojit legendu, která výsledek daného testu objasní tak, ţe mu porozumí i chovatelé bez odborného vzdělání. Genetickými testy DNA pro detekci onemocnění CEA se v České Republice zabývá pouze jediná genetická laboratoř, a to laboratoř Genomia. Proto je vhodné na prvním místě uvést systém udávání výsledků, který právě tato laboratoř jednotně pouţívá pro všechna svá vyšetření:

N = negativní - hledaný znak (např. mutace, delece) není přítomen P = positivní - hledaný znak (např. mutace, delece) je přítomen

Genotyp N/N znamená, ţe mutace není přítomna ani v jedné alele genotypu, tzn., ţe jedinec není ohroţen chorobou /NORMAL/. Genotyp N/P znamená, ţe mutace je přítomna v jedné alele, jedinec je tedy přenašečem dané choroby /CARRIER/. Genotyp P/P znamená, ţe mutace je přítomna v obou alelách, je ohroţen vznikem konkrétní choroby /AFFECTED/. Daný jedinec zdědil jednu kopii poškozeného genu od jednoho rodiče (matky) a druhou kopii genu s delecí zdědil od druhého rodiče (otce).

Některé laboratoře ve světě volí označení symboly + a -. V těchto případech je však nutné věnovat zvýšenou pozornost legendě výsledků. Neboť některé laboratoře pouţívají symbol + ve smyslu našeho P (+ = mutace je přítomna) a symbol - ve smyslu našeho N (mutace není přítomna).

29

Nicméně je moţné se setkat také s opačným označením tedy: -/- pro jedince mutovaného homozygota (tedy jedince, který má mutaci (deleci) v obou alelách) +/+ pro zdravého jedince (tedy jedince bez přítomnosti mutace - delece), (BORDERHOLIC, 2006).

Tab. 2 - Udávání výsledků genetických testů jednotlivými světovými laboratořemi

Optigen/Wilton

Genomia

Další označení

Zdravý nepřenašeč

NORMAL

N/N

+/+

Zdravý přenašeč

CARRIER

N/P

+/-

Nemocný přenašeč

AFFECTED

P/P

-/-

5.4 Výskyt onemocnění Podle celosvětového průzkumu je zhruba 1/3 jedinců plemen kolií genetickým přenašečem onemocnění CEA (BORDERHOLIC, 2006). Ze všech psů trpících touto chorobou je cca 30 % postiţeno tzv. kolobomem, který zasahuje především optický nerv, optický disk a peri-papilární bělimu (BREDFORD, 2002). Totální slepota ohroţuje přibliţně 6 % nemocných jedinců. Kontrola této nemoci je obtíţná, neboť přibliţně 30% štěňat, která jsou vyšetřovaná fundus kamerou a oftalmoskopem, mají jiţ ve věku 6ti týdnů kompletně pigmentované oči. V těchto případech vzniká stejný problém jako při vyšetření dospělých jedinců, a to ten, ţe případné poškození oka je jiţ plně překryto pigmentovanou tkání. Takový pes se pak jeví jako fenotypově normální i v případě, ţe můţe být genotypově přenašečem (BREDFORD, 2002).

30

Následující tabulka uvádí frekvenci variant onemocnění CEA. Obsahuje data získaná americkou organizací CERF registrující výskyt hypoplasie cévnatky, poškození optického disku/nervu a oddělené sítnice u psů v Americe od roku 1991 do roku 1999.

Tab. 3 – Frekvence výskytu různých forem onemocnění (ANONYM, 2005)

Frequencies Based on CERF Eye Exams in the U. S. from 1991 to 1999 Choroidal Hypo-

Coloboma

Retinal Detachment

66,7%

8,75%

1,88%

Border Collie

2,12%

0,57%

0,06%

Shetland Sheepdog

0,39%

0,79%

0,05%

Australian Shepherd

0,22%

0,27%

0,13%

plasia Collie – Rough & Smooth

31

6 ZÁVĚR Frekvence výskytu geneticky podmíněných chorob je v dnešní době obrovská a mnoţství chovů jimi zatíţených je značné. Úmysl rychlého a plošného ozdravení těchto chovů je jedním z hlavních důvodů, proč je studiu těchto onemocnění ve většině západních zemí věnována značná pozornost. V dnešní době si jiţ většina klubů zabývajících se chovem psů dala do stanov, ţe chovatelé, kteří chtějí své psi reprodukovat, jsou povinni minimálně 2krát nechat všechna svá štěňata vyšetřit na oční choroby. Poprvé ve věku 6 – 8 týdnů a následně ve věku minimálně 12ti měsíců. V případě, ţe tak neučiní, nejsou jejich štěňata mateřským chovatelským klubem připuštěna k bonitaci, která je nezbytnou podmínkou k vystavení průkazu původu, do kterého je výsledek tohoto testu zaznamenáván (příloha č. 2). Platnost těchto vyšetření je u chovných psů stanovena na 2 roky a u chovných fen na 3 roky. Poté je nutno vyšetření opětovně absolvovat a kopii s výsledky výstupního formuláře (příloha č. 3) s fotodokumentací zaslat poradci chovu. V případě, ţe se chovatel rozhodne daného jedince neuplatnit v plemenitbě, postačí mu pouze dvě výše uvedená vyšetření ve štěněčím věku. Stále častěji vyuţívanou alternativou oftalmologického vyšetření štěňat je pro chovatele doloţení originálu certifikátu o provedeném testu DNA na onemocnění CEA s výsledkem NORMAL, alespoň u jednoho z rodičů. Výsledky DNA testu na CEA se uznávají pouze z krve psa odebrané veterinářem, který je zároveň povinen potvrdit totoţnost odebíraného jedince. Převáţná většina kynologických klubů výsledky testů DNA ze slin neuznává s ohledem na podvody a nekorektní chováni „rádoby“ chovatelů, které v souvislosti s těmito testy proběhli v minulosti. S ohledem na tuto skutečnost, ani laboratoře tento genetický materiál nepřijímají, neboť pomůcky potřebné pro odběr DNA z bukální sliznice jsou snadno dostupné a ani samotný stěr není nikterak obtíţný.

32

7 PŘEHLED POUŢITÉ LITERATURY ALBERTS B., BRAY D., JOHNSON J., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., WALTER P, 1998: Základy buněčné biologie. 2. vyd. Espero Publishing, s.r.o., Ústí nad Labem, 630 s. ANONYM, 2004: Health and Genetics of Border Collies. Databáze online [cit. 201010-23]. Dostupné na: http://www.americanbordercollie.org/Health%20and%20Genetics%20of%20Border%20Collies.htm/ ANONYM, 2005: Collie Eye Anomally/ Choroidal Hypoplasia (CEA) Test. Databáze online [cit. 2010-8-13]. Dostupné na: http://www.optigen.com/opt9_test_cea_ch.html/ ANONYM a, 2007: Horizontální elektroforézy. Databáze online [cit. 2011-4-14]. Dostupné na: http://www.thermofisher.cz/eshop/8006_1004.html/ ANONYM b, 2007: Vertikální elektroforézy. Databáze online [cit. 2011-4-14]. Dostupné na: http://www.thermofisher.cz/eshop/8006_2002.html/ ANONYM, 2008: CEA – Anomálie očí u kólií. Databáze online [cit. 2010-10-3]. Dostupné na: http://www.genomia.cz/cz/test/cea-collie-eye-anomaly/ ANONYM, 2009: CEA – Collie Eye Anomally. Databáze online [cit. 2011-3-13]. Dostupné na: http://www.shelties.ic.cz/ramec.htm/ ANONYM, 2010: CEA – Anomálie očí u kólií. Databáze online [cit. 2011-3-13]. Dostupné na: http://planetarough.info/CZ/collie_rough/collie_cea.htm/ ANONYM, 2011: 24-well and 96-well Piko® Thermal Cyclers. Databáze online [cit. 2011-4-14]. Dostupné na: http://www.finnzymes.com/products/piko/piko_cyclers.html/ BERÁNEK J., 1998: Praktická oftalmologie psa – dědičné choroby. Databáze online [cit. 2010-09-23]. Dostupné na: http://www.veterina-pce.cz/Oftalmologie.html/ 33

BORDERHOLIC – časopis pro členy Border Collie Club Czech Republic, č. 20 1/2006

BREDFORD P. G. C., 2002: The known hereditary diseases of the canine. Databáze on-line [cit. 2010-10-23]. Dostupné na: http://www.vetweb.cz/ DOSTÁL J., 1995: Chov psů - Genetika v kynologické praxi. DONA, České Budějovice, 206 s. DOSTÁL J., 2007: Genetika a šlechtění plemen psů. DONA, České Budějovice, 260 s. DOSTÁL J., HORÁK P., HRDLICOVÁ A. a STRATIL A., 2010: Simplified PCR analysis of a station in the NHEJ 1 gene causing CEA in some dog Leeds. Czech Journal of Animal Science, 55, 2010 (8): 346-350. Databáze online [cit. 2010-11-19]. Dostupné na: http://www.journals.uzpi.cz/ CHMELÍKOVÁ E., LÁNSKÁ V., SEDMÍKOVÁ M., HÄRTLOVÁ H. a PETR J., 2006: Strašák zvaný CEA. Planeta zvířat. 2, 2006. Databáze online [cit. 2010-10-24]. Dostupné na: http://casopis.planetazvirat.cz/060202-strasak-zvany-cea-1.html/ KNOLL A. a VYKOUKALOVÁ Z., 2002. Molekulární genetika zvířat: Metody detekce polymorfismů DNA genů. 1. vyd., Brno, Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 168 s. KOČÁREK E., 2004. Genetika: obecná genetika a cytogenetika, molekulární biologie, biotechnologie, genomika. 1. vyd., Scientia, Praha, 211 s. Biologie pro gymnázia.

PARKER H. G., KUKELOVA A. V., AKEY D. T., GOLDSTEIN O., KIRKNEES E. F., BAYSAC K. C., MOSHER D. S., AGUIRRE G. D., ACLAND G. M. a OSTRANDER E. A., 2007: Breed relationships facilitate fine-mapping studies: a 7.8-kb deletion cosegregates with Collie eye anomaly across multiple dog breeds. Genome Res. 17: 1562-1571, 2007. PubMed ID: 17916641. Databáze online [cit. 2010-10-24]. Dostupné na: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed 34

ROSYPAL S., 2005: Úvod do molekulární biologie. 4. vyd., S. Rosypal, Brno, 289 s. STAŇA P., 2001: Anomálie oka u kolií. Databáze online [cit. 2010-10-20]. Dostupné na: http://www.veterina-info.cz/script/articledetail.asp?rid=94 ŠMARDA J., DOSTÁL J., PANTŮČEK R., RŮŢIČKOVÁ V. a KOPTÍKOVÁ J., 2005: Metody molekulární biologie. 1. vyd., Nakladatelství MU Brno, 194 s. VERHOEF-VERHALLEN E., 2002: Border Collie. Rebo [s.l.] : [s.n.], Česlice, 127 s. ŢUROVEC, M., 1999: Soubor materiálů k předmětu metody molekulární biologie. 1. vyd., Jihočeská univerzita, České Budějovice, 260 s.

35

8 SEZNAM ZKRATEK A

Adenin

AGE

Gelová elektroforéza na agarózovém gelu

AMK

Aminokyselina

bp

Pár bází

C

Cytosin

cDNA Komplementární DNA CEA

Anomálie očí u kolií

dsDNA Dvouvláknová deoxyribonukleová kyselina DNA

Deoxyribonukleová kyselina

EDTA Ethylendiamintetraoctová kyselina ELFO

Gelová elektroforéza

G

Guanin

kb

Kilobáze ( jednotka o 1 000 bázích)

dNTP

Deoxynukleotidtrifosfát

PAGE

Gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu

PCR

Polymerázová řetězová reakce

RFLP

Polymorfismus délky restrikčních fragmentů

RNA

Ribonukleová kyselina

T

Thymin

U

Uracil

36

9 SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1

Obrázek zdravého oka ………………………………………………….11

Obr. 2

Hypoplasie cévnatky …………………………………………………...11

Obr. 3

Neúplně vyvinutá cévnatka ………………………..…………………...11

Obr. 4

Zkroucené cévy ………………………………………………………...13

Obr. 5

„Díra“ ve zrakových nervech …………………………………………..13

Obr. 6

Kolobom – chybějící tkáň ……………………………………………...13

Obr. 7

Vyšetření štěněte fundus kamerou ……………………………………..18

Obr. 8

Štěrbinová lampa a fundus kamera …………………………………….18

Obr. 9

Princip PCR …..…………………………………….…………………..20

Obr. 10

Termální cykler ……..………………………………………………….22

Obr. 11

Palindromy ……………………………………………………………..23

Obr. 12

Horizontální gelová elektroforéza ……………………………………...24

Obr. 13

Vertikální gelová elektroforéza …………………………….…………..25

Obr. 14

Prezentace výsledků PCR analýzy genů NHEJ 1 ……………………...28

37