Albumini humani solutio
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.3- 1
01/2006:0255
ALBUMINI HUMANI SOLUTIO Humán albumin oldat DEFINICIÓ A humán albumin oldat olyan vizes fehérje oldat, melyet a Humán plazma frakcionálás céljára (0853) cikkely előírásainak megfelelő plazmából nyernek. ELŐÁLLÍTÁS Az albumin elválasztása ellenőrzött körülmények között történik, különös tekintettel a pH-ra, az ionerősségre és a hőmérsékletre annak érdekében, hogy a végtermék összes fehérje tartalmának legalább 95%-a albumin legyen. A humán albumint 150–250 g/l összes fehérje-tartalmú koncentrált oldatként vagy 35–50 g/l összes fehérje-tartalmú izotóniás oldatként készítik. A hőmérsékleti hatások kivédésére, megfelelő koncentrációban, megfelelő stabilizáló anyagok adhatók a készítményhez, például nátrium-kaprilát (nátrium-oktanoát), N-acetil-triptofán vagy a kettő keveréke. Mikrobiológiai tartósítószer az előállítás egyik szakaszában sem alkalmazható. Az oldatot baktériumszűrőn bocsátják át, steril tartályokba aszeptikusan letöltik, amelyeket azután a szennyeződés elkerülése céljából lezárnak. Az oldatot a végső tartályban 60 ± 1,0 °C-ra melegítik, és legalább 10 órán keresztül ezen a hőmérsékleten tartják. A tartályokat ezután legalább 14 napig 30–32 °C-on, vagy legalább négy hétig 20–25 °C-on inkubálják, végül vizuálisan vizsgálják mikrobiológiai szennyeződésre. SAJÁTSÁGOK Tiszta, enyhén viszkózus folyadék; csaknem színtelen, sárga, borostyánszínű vagy zöld. AZONOSÍTÁS Megfelelő immunelektroforézis technikával vizsgáljuk. Normál humán szérumfehérjék elleni antiszérumot használva összehasonlítjuk a normál humán szérumot és a vizsgálandó készítményt, amelyeket 10 g/l fehérjetöménységűre hígítottunk. A vizsgálandó készítmény fő összetevője feleljen meg a normál
Albumini humani solutio
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.3- 2
humán szérum fő összetevőjének. A készítményben kis mennyiségben más plazmafehérjék is jelen lehetnek. VIZSGÁLATOK pH (2.2.3): 6,7–7,3. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 10 g/l fehérjetöménységű oldatot nyerjünk. Összes fehérje. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 2 ml oldat kb. 15 mg fehérjét tartalmazzon. Az oldat 2,0 ml-éhez kerek aljú centrifugacsőben R nátrium-molibdenát 75 g/l töménységű oldatának 2 ml-ét, valamint 1 térfogatrész R nitrogénmentes tömény kénsav és 30 térfogatrész R víz elegyének 2 ml-ét adjuk. Az elegyet összerázzuk, 5 percig centrifugáljuk, a felülúszó folyadékot leöntjük, és a nyílásával lefelé fordított csövet szűrőpapírra állítjuk, hogy az felszívja a nedvességet. A csapadék nitrogéntartalmát kénsavas roncsolásos módszerrel (2.5.9) meghatározzuk, és az eredményt 6,25-dal szorozva kiszámítjuk a fehérjetartalmat. A készítménynek a címkén megjelölt fehérjemennyiség 95– 105%-át kell tartalmaznia. Fehérjeösszetétel. Zónaelektroforézis (2.2.31). Hordozó közegként megfelelő cellulóz-acetát gél csíkokat, elektrolitoldatként R1 barbitál–tompítóoldatot (pH 8,6) használunk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy az oldat fehérjekoncentrációja 20 g/l legyen. Összehasonlító oldat. BRP elektroforézisre szánt humán albumint R nátriumklorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 20 g/l fehérjekoncentrációjú oldatot nyerjünk. 10 mm széles sávban 2,5 μl, vagy keskenyebb csíkot használva milliméterenként 0,25 μl vizsgálati oldatot viszünk fel a csíkra. Egy másik csíkra ugyanilyen módon ugyanekkora térfogatú összehasonlító oldatot viszünk fel. Megfelelő nagyságú elektromos térerőt alkalmazunk, úgy, hogy a leggyorsabb sáv legalább 30 mm-t vándoroljon. Ezután 5 percen keresztül R amidofekete-10B–oldattal, majd 10 térfogatrész R tömény ecetsav és 90 térfogatrész R metanol elegyével kezeljük a csíkokat, amíg a háttér éppen el nem színtelenedik. A csíkokat ezután 19 térfogatrész R tömény ecetsav és 81 térfogatrész R metanol elegyével átlátszóvá tesszük, majd 600 nm-en megmérjük a sávok abszorbanciáját, olyan műszerrel, mely a méréstartományon belül lineáris választ ad. Csíkonként 3 mérés átlagából
Albumini humani solutio
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.3- 3
számítjuk az eredményt. A vizsgálati oldat elektroferogramján a fehérjék legfeljebb 5%-ának lehet a fő sávétól eltérő mozgékonysága. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha az összehasonlító készítmény elektroferogramján a fősávban található fehérjék aránya az összehasonlító készítmény kísérőiratában megjelölt határok közé esik. Molekulaméret eloszlás. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával olyan töménységűre hígítjuk, mely a használt kromatográfiás rendszerben alkalmazható. 4–12 g/l töménység és 50–600 μg injektált fehérje általában megfelelő. Oszlop: – méretei: l = 0,6 m, ∅ = 7,5 mm, vagy l = 0,3 m, ∅ = 7,8 mm, – állófázis: 10 000–500 000 relatív molekulatömegű globuláris fehérjék frakcionálására alkalmas R kromatográfiás célra szánt hidrofil szilikagél. Mozgófázis: 4,873 g R vízmentes dinátrium-hidrogén-foszfátot, 1,741 g R nátrium-dihidrogén-foszfát-monohidrátot, 11,688 g R nátrium-kloridot és 50 mg R nátrium-azidot 1 liter R vízben oldunk. Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc Detektálás:spektrofotométerrel, 280 nm-en. A polimerek és aggregátumok csúcsa a kromatogram azon részén helyezkedik el, mely a kizárásos térfogatot képviseli. A stabilizáló anyaghoz tartozó csúcsot nem vesszük figyelembe. A polimerekhez és aggregátumokhoz tartozó csúcs a kromatogram teljes területének legfeljebb 10%-a lehet (ez kb. 5% polimernek és aggregátumnak felel meg). Hem. A vizsgálandó készítményt R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatával úgy hígítjuk, hogy 10 g/l fehérjetartalmú oldatot kapjunk. Az oldat 403 nm-en mért abszorbanciája (2.2.25) legfeljebb 0,15 lehet. Kompenzáló folyadékként R vizet használunk. Prekallikrein aktivátor (2.6.15): legfeljebb 35 NE/ml. Alumínium. legfeljebb 2,0 · 102 μg/l. Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, I. vagy II. módszer). Atomizáló egységként grafitkemencét használunk.
Albumini humani solutio
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.3- 4
Az oldatok elkészítéséhez műanyag tartályokat, és ahol csak lehetséges, műanyag eszközöket használunk. Használat előtt az üvegeszközöket (vagy egyéb eszközöket) salétromsavval (200 g/l HNO3) mossuk. Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt használjuk, amelyet szükség esetén hígítunk. Összehasonlító oldatok. Legalább három összehasonlító oldatot készítünk – pl. úgy, hogy R alumínium–mértékoldatot (10 ppm Al) R oktoxinol 10 1 g/l töménységű oldatával hígítunk – olyan koncentrációtartományban, amelybe a vizsgálandó készítmény alumínium-koncentrációja várhatóan beleesik. Monitoroldat. A vizsgálati oldathoz R alumínium–mértékoldatot (10 ppm Al) vagy egyéb alkalmas bizonylatolt referenciaanyagot adunk olyan mennyiségben, hogy az oldat alumínium-koncentrációját 20 μg/l-rel növeljük. Üres oldat. R oktoxinol 10 1 g/l töménységű oldata. Hullámhossz: 309,3 nm vagy más alkalmas hullámhossz. Résszélesség: 0,5 nm. Grafitcső: pirolitikusan bevont, beépített platformmal. Háttérkorrektor: kikapcsolva. Atomizáló egység: grafitkemence; a leolvasások között kiizzítjuk. A 0255.-1 táblázatban példaként megadott működési beállítások egy adott készülék esetében megfelelőnek bizonyultak. Az optimális körülmények létrehozása érdekében a beállítások módosíthatók. Injektálás: a következő oldatokból 3–3 alkalommal injektálunk: üres oldat, összehasonlító oldat, vizsgálati oldat, monitoroldat.
Albumini humani solutio
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.3- 5
0255.-1. táblázat. – Példaként megadott, megfelelőnek talált működési beállítások. Lépés
Végső hőmérséklet (°C)
Hőmérséklet beállási idő (s)
Hőmérséklet tartási idő (s)
Gáz
1
120
10
80
argon
2
200
5
20
argon
3
650
5
10
argon
4
1300
5
10
argon
5
1300
1
10
nincs
6
2500
0,7
4
nincs
7
2600
0,5
3
argon
8
20
12,9
3
nincs
Rendszeralkalmasság: – a monitoroldathoz adott alumínium visszanyerése 80–120%. Az összehasonlító oldat segítségével kapott eredményekből kalibrációs egyenest készítünk, és a kalibrációs egyenes felhasználásával meghatározzuk a vizsgálandó készítmény alumínium-tartalmát. Kálium: legfeljebb 0,05 mmol K, 1 gramm fehérjére számítva. Atomemissziós spektrometria (2.2.22, I. módszer). Hullámhossz: 766,5 nm. Nátrium: legfeljebb 160 mmol Na/liter; a deklarált Na-tartalom 95–105%-a. Atomemissziós spektrometria (2.2.22, I. módszer). Hullámhossz: 589 nm. Sterilitás (2.6.1). A készítmény feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Pirogének (2.6.8). A készítmény feleljen meg a pirogén vizsgálat követelményeinek. 35–50 g/l fehérjetartalmú oldat esetén a nyulaknak testtömeg kilogrammonként 10 ml-t, 150–250 g/l fehérjét tartalmazó oldat esetén testtömeg kilogrammonként 5 ml-t fecskendezünk be a vizsgálandó készítményből.
Albumini humani solutio
Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.5.3- 6
ELTARTÁS Fénytől védve. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: – a készítmény nevét, – a készítmény térfogatát, – a fehérjetartalmat, g/l-ben kifejezve, – a nátriumtartalmat, mmol/l-ben kifejezve, – hogy a terméket nem szabad felhasználni, ha az zavaros, vagy ha üledék képződött benne, – minden adalékanyag (pl. stabilizáló anyag) nevét és koncentrációját.
