Agrin expresszió primer májtumorban

Agrin expresszió primer májtumorban Doktori értekezés

Dr. Batmunkh Enkhjargal Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Kiss András, egyetemi docens Hivatalos bírálók:

Prof. Dr. Tímár József, egyetemi tanár Dr. Abonyi Margit, egyetemi docens

Szigorlati bizottság elnöke: Prof. Dr. Jeney András, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Prof. Dr. Szentirmay Zoltán, egyetemi tanár Dr. Moldvay Judit, egyetemi docens

Budapest 2007

1.TARTALOMJEGYZÉK 1.TARTALOMJEGYZÉK ............................................................................................... 2 2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE....................................................................................... 4 3. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR .................................................................... 6 3.1. Primer májtumorok................................................................................................ 6 3.1.1. Hepatocellularis carcinoma ............................................................................ 6 3.1.2. Cholangiocarcinoma....................................................................................... 9 3.1.3. Hepatocellularis adenoma ............................................................................ 10 3.1.4 Cholangiocellularis adenoma ........................................................................ 10 3.1.5. Fokális Noduláris Hyperplasia ..................................................................... 11 3.2. Az extracelluláris mátrix (ECM) ......................................................................... 12 3.2.1. ECM: szintézis, lebontás, szabályozás ......................................................... 13 3.2.2. Az ECM szerepe a szöveti működés szabályozásában................................. 14 3.2.3. Az ECM és a tumorprogresszió.................................................................... 15 3.2.4. Az ECM összetétele humán májszövetben................................................... 16 3.2.5. Proteoglikánok mint ECM komponensek .................................................... 16 3.2.5.1. A proteoglikánok szerkezete ................................................................. 17 3.2.5.2. A proteoglikánok osztályozása.............................................................. 19 3.2.5.3. Az agrin mint BMHSPG ....................................................................... 24 3.2.5.3.1. Az agrin szerkezete................................................................................. 24 3.2.5.3.2. Az agrin típusai....................................................................................... 25 3.2.5.3.3. Az agrin funkciói .................................................................................... 26 3.3. A proteoglikánok szerepe májbetegségekben...................................................... 29 3.4. A BMHSPG-k szerepe az angiogenesisben ........................................................ 33 4. CÉLKITŰZÉSEK....................................................................................................... 36 5. ANYAG ÉS MÓDSZER ............................................................................................ 37 5.1. Beteganyag ......................................................................................................... 37 5.2. Módszerek ........................................................................................................... 38 5.2.1. Fehérjeexpressziós vizsgálatok .................................................................... 38 5.2.1.1. Immunhisztokémiai vizsgálatok ............................................................ 38 5.2.1.2. Immunfluoreszcens vizsgálat ................................................................ 40 5.2.1.3. Morfometriai elemzés............................................................................ 40 5.2.1.4. Proteoglikán izolálása............................................................................ 41 5.2.1.5. Western blot analízis ............................................................................. 41 5.2.2. mRNS szintű expressziós vizsgálatok .......................................................... 42 5.2.2.1. RNS izolálás .......................................................................................... 42 5.2.2.2. Primertervezés és grádiens PCR............................................................ 43 5.2.2.3. mRNS expresszió vizsgálata real-time RT-PCR módszerrel ................ 45 5.2.2.4. Statisztikai kiértékelés ........................................................................... 46 6. EREDMÉNYEK......................................................................................................... 48 6.1. Agrin fehérje expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel ................. 48 6.1.1. Agrin expresszió ép és cirrhotikus humán májszövetben............................. 48 6.1.2. Agrin expresszió hepatocellularis carcinomában ......................................... 48 6.1.3. Az agrin expressziója más kötőszöveti fehérjékkel kolokálizációban. ........ 50 6.1.4. Agrint termelő sejtek májelváltozásokban ................................................... 51 6.1.5. Az agrin expressziójának vizsgálata a cholangiocarcinomában................... 53 6.1.6. Az agrin expresszió vizsgálata hepatocellularis adenomában...................... 55

2

6.1.7. Az agrin expresszió vizsgálata fokális noduláris hyperplasiában ................ 56 6.2. Az agrin fehérje expresszió vizsgálata Western Blot technikával....................... 57 6.3. Az agrin mRNS kimutatása real time RT-PCR-vel............................................. 58 7. MEGBESZELÉS ........................................................................................................ 60 8. KÖVETKEZTETÉSEK.............................................................................................. 66 9. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................... 68 10. SUMMARY ............................................................................................................. 70 11. IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................... 72 12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ................................................................. 88 13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ................................................................................. 93

3

2. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ABC

avidin - biotin komplex

AchR

acetylcholine receptor

AEC

3-amino-9 ethyl-carbazole

AFP

alfa-fetoprotein

ATP

adenozin-trifoszfát

BM

bazális membrán

BMHSPG bazális membrán heparán szulfát proteoglikán bFGF basic fibroblast growth faktor, bázikus fibroblaszt növekedési faktor BSA

bovine serum albumin, borjú szérum albumin

CC

cholangiocarcinoma

CCA

cholangiocelullaris adenoma

CK

cytokeratin

CS

kondroitinszulfát

CSPG kondroitinszulfát proteoglikán DAB 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid DSPG dermatánszulfát proteoglikán ECL

enhanced chemiluminescence, erősített kemilumineszcencia

ECM extracelulláris mátrix EDTA ethylene -diamine-tetraacetic acid EGF

epidermal growth factor, epidermális növekedési faktor

EHS

Engelbreth-Holm-Swarm

GAG

glükózaminoglikán

GAPDH glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase, glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz GBM gromeruláris bazális membrán HBV hepatitis B vírus HCA hepatocellularis adenoma HCC

Hepatocellularis carcinoma

HCV

Hepatitis C vírus

HE

hematoxilin –eozin

HS

heparánszulfát

4

HSPG heparánszulfát proteoglikán HRP

horseradish peroxidase, tormaperoxidáz

IR

idegrendszer

KSPG keratánszulfát proteoglikán MuSK Muscle-specific tyrosine kinase, izom specifikus tirozin kináz MMP matrix metalloproteinase, matrix metalloproteináz NCAM neural-cell adhesion molecule, idegsejt adhéziós molekula NEM

N-etil- maleimid

NMJ

neuromuszkuláris junkció

PBS

phosphate-buffered saline, foszfát-pufferolt sóoldat

PCR

polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció

PDGF platelet-derived growth faktor, vérlemezke eredetű növekedési faktor PMSF fenil-metil-szulfonil-fluorid PG

proteoglikán

PTK

protein tirozin kináz

RT

reverse transcriptase, reverz transzkriptáz

SCG superior cervical ganglion, felső cervikális ganglion SD

standard deviation, standard deviancia

SDS-PAGE sodium-dodecil-szulfát -poliakrilamid gél elektroforézis SMA smooth muscle actin, simaizom aktin TBE tris-borát-EDTA TBS

tris-buffered saline, tris-pufferolt sóoldat

TGF transforming growth factor, transzformáló növekedési faktor TIMP tissue inhibitor of metalloprotease, metalloproteázok szöveti inhibítora TNF tumor necrosis factor, tumor nekrózis faktor VEGF vascular endothelial growth factor, vaszkuláris endotél eredetű növekedési faktor

5

3. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR 3.1. Primer májtumorok 3.1.1. Hepatocellularis carcinoma A daganatok okozta halálozások száma évente világszerte növekszik. Az utóbbi 15 év során a daganatos halálozások száma a férfiak esetében átlagosan 12-, a nők esetében pedig 9 százalékkal emelkedett az Európai Unióban. A Nemzetközi Rákkutató Intézet napokban közzétett tanulmánya szerint tavaly 39 európai országban mintegy 3,2 millió új daganatos megbetegedést diagnosztizáltak, ami 300. 000-rel több mint 2004ben volt. 2006-ban Európa-szerte 1,7 millióan haltak meg rákos megbetegedés következtében. (http://www.aerzteblatt.de/v4/news/news.asp). A daganatos elhalálozás 21,6%át teszi ki az összes halálozásnak. A hepatocellularis carcinoma (HCC) a világszerte előforduló rosszindulatú daganatoknak mintegy 4%-át teszi ki, férfiak között a hetedik, nők között a kilencedik helyen áll gyakoriságban. Világviszonylatban körülbelül félmillió új beteggel kell számolni évente (Bosch és mtsai, 2004). Magyarországon a rosszindulatú daganatos megbetegedések halálozási aránya rendkívül kedvezőtlen, a szív- és keringési rendszer-eredetű halálokok mögött a második helyet foglalja el, kb. 25%-os gyakorisággal. A nagy európai, illetve nemzetközi halálozási felmérésekben férfiaknál az első, nőknél pedig a második helyen állunk (Otto és Kasler, 2005). Az emésztőrendszer betegségeinek tulajdonítható halálozások gyakorisága a világon a második legmagasabb mortalitással jellemzi Magyarországot. Szembetűnő növekedés tapasztalható az elmúlt évtizedekben a krónikus májbetegségek, elsősorban májzsugor és májrák okozta halálozásban. 100 ezer lakosra számítva 66 haláleset jut, ami hétszerese az EU átlagnak (www.datanet.hu). Az ázsiai országokban az európai adatokkal szemben a daganatok okozta halálok között elsők között említendő a primer májrák. Ezen országok között különös helyet foglal el Mongólia, ahol a HCC legnagyobb előfordulási aranyát dokumentálták, 100.000 lakosra 99 esetet (www-dep.iarc.fr). Az utóbbi évek adatai szerint itt a primer

6

májrák a malignus tumorok okozta halálozások mintegy 44%-át teszi ki (Oyunsuren és mtsai, 2006). Etiológia A májdaganatok az utóbbi években növekvő számban kerülnek felismerésre. Ennek oka részben az, hogy a detektálás módszerei érzékenyebbé válnak, elsősorban a képalkotó eljárások fejlődése következtében. Másrészt viszont az emelkedés oka összefügghet egyes etológiai tényezők, elsősorban a hepatitis C-vírus (HCV) és a hepatitis B-vírus (HBV) fertőzés, az ipari mérgekkel és egyéb toxikus anyagokkal való expozíció nagyobb arányával (Schaff és mtsai, 2004). A krónikus vírusfertőzések gyakran vezetnek cirrhosishoz, ami önmaga is fontos kockázati tényező a májrák kialakulásában (Kiss és mtsai, 2002). A HBV és a HCC kapcsolatát azok a szeroepidemiológiai vizsgálatok vetették fel először, amelyek igazolták a szoros összefüggést a HBV-infekció és a HCC előfordulása között Ázsiában. A HCC előfordulása 100-szoros volt HBV- fertőzött személyekben a HBV negatívakhoz képest (Beasley és mtsai, 1981). Európában, ahol a HBV nem hiperendémias, mint Ázsiában, a HCV előfordulását sokkal gyakoribbnak találták HCC-ben, mint a HBV jelenlétet (el Serag, 2001). A HCV-infectiót követően a HCC kifejlődésére kb. 25-30 év elteltével lehet számítani. Bármilyen okból eredő krónikus májsejtkárosodás és a kísérő regeneráció kapcsán a mitózisok a DNS-t fogékonnyá teszik a genetikai alterációkra. Ezért a krónikus májbetegség más formái is kockázati tényezőt jelentenek májrákra, és e tekintetben

az

alkoholos

májbetegség,

egyéb

toxikus

tényezők,

valamint

anyagcserezavarok, így az α1-antitrypsin hiány, a haemochromatosis és a tyrosinaemia jön szóba. Afrikában és Dél-Kínában az Aspergillus flavusból és Aspergillus parasiticusból származó aflatoxin nagy közegészségügyi probléma (Henry és mtsai, 2002). Ez a mycotoxin potenciálisan carcinogen, a májrák gyakori előfordulásában ugyancsak jelentős, mégpedig azáltal, hogy a tumorszuppresszor gén p53 259-es kodonjában specifikus mutációt indukál (Smela és mtsai, 2001).

7

Hormonális tényezőkre utal a HCC gyakoribb előfordulása férfiakban, valamint az a tény, hogy a hosszan tartó androgen terápiával is kapcsolatos a tumor előfordulása. Egyébként orális anticoncipiensek, tórium-dioxid és vinil-klorid-expozíció is kockázati tényezőnek tekinthető a májdaganatok keletkezésében. A fent említett oki tényezők közül Mongóliában a vírusfertőzések és az alkoholfogyasztás szerepe említendő (Oyunsuren és mtsai, 2006). Pathologia A HCC makroszkóposan szoliter, multiplex nodularis vagy diffúz formában mutatkozhat (Schaff és mtsai, 2004). Az esetek közel 70%-ában cirrhosis talaján alakul ki. A tumor nagyságától függően vérzés, necrosis gyakori. A kisebb méretű HCC-k tokkal rendelkezhetnek. A progresszió mértékét a tokinfiltráció, a fiókdaganatok jelenléte és az érinvázió jelzi. Hisztológiailag trabecularis, acinaris (pseudoglandularis) és szolid (kompakt) szerkezetű formákat különíthetünk el. Emellett speciális szöveti szerkezetű tumorok is észlelhetőek, így a világossejtes, óriássejtes, eozinofil sejtes forma. Külön entitás a fibrolamellaris típusú HCC. Ezen jellegzetes szöveti szerkezetű daganat cirrhosis mentes májban, fiatalabb életkorban fordul elő, fokális noduláris hyperplasia (FNH)-hoz hasonló centrális heg és jobb prognózis jellemzi. A HCC TNM klasszifikációjának elve hasonló az egyéb tumorokéhoz. A T1-T3 kategóriák közötti differenciálást a tumorátmérő, a daganat szoliter vagy multiplex volta, a lebenyek érintettsége határozza meg. A HCC klinikai detektálásában a képalkotó módszerek mellett az alfafetoprotein (AFP) meghatározás jelentős, bár bizonyos korlátokkal. Az AFP hisztológiailag is detektálható, és fontos marker a HCC diagnosztikájában. Újabb adatok alapján a HCC-k két jól elhatárolható csoportra oszthatók az AFP termelés alapján (Lee és Thorgeirsson, 2002). Magasabban differenciált daganatokban az AFP mRNS expressziója alacsonyabb, mint a differenciálatlanokban. A HCC differenciáltsági fokozatai követik a I-IV beosztást, a magasan differenciált formától a differenciálatlan formáig, mely egyes szerzők szerint a prognózissal is összefügg (Nagy és mtsai, 2006).

8

3.1.2. Cholangiocarcinoma Kiindulhat az epeutak bármely szakaszából, a kis epecapillarisoktól a közös epevezetékig. A daganat elhelyezkedése alapján megkülönböztetünk intrahepatikus (510%) és extrahepatikus epeúti tumorokat (20-30%), valamint az Altemeier és Klatskin által leírt ún. hiliaris tumorokat (60-70%) (Klatskin-tumor) (Nakeeb és mtsai, 1996).A cholangiocarcinomák (CC) több mint 90%-a adenocarcinoma, a sejtek egyszerű duktularis elrendeződésével és fibrosus stromával. Epidemiológiájára jellemző, hogy ritkábban fordul elő, mint a HCC és a primer máj malignus tumorok 5-10%-át képviseli, kivéve a Távol-Keleten, ahol ez az arány 20% is lehet (Vauthey és Blumgart, 1994). Általában idősebbekben észlelhető, mint a HCC, jellemzően a 6. és 7. évtizedben levő férfiakban (Shaib és el-Serag, 2004). Az epeútrák kialakulásában különböző kémiai anyagok szerepéről számoltak be. A tórium-dioxid (thorotrast), mint korábban jól ismert röntgen-kontrasztanyag, bár ritkán, de oka lehet a CC-nek (Sahani és mtsai, 2003). Epeúti paraziták szerepe is igazolódott. Távol-Keleten a Clonorchis sinensis, hátsó-Indiában az Opisthorchis viverrini nevű intrahepaticus parazita szabadgyöktermelés révén stimulálja a sejtproliferációt (Watanapa és Watanapa, 2002). Colitis ulcerosában megnő a CC kockázata (10-szeres az átlag népességhez viszonyítva), főleg azokban a betegekben, akiknek több mint 10 éves a kórlefolyása (Broome és mtsai, 1996). Primer szklerotizáló cholangitisben is leírták a tumor gyakoribb előfordulását (Shaib és el Serag, 2004). Az epekő szerepét az extrahepatikus formák keletkezésében felvetették, de e téren az oki kapcsolat nem bizonyított (Su és mtsai, 1997). Makroszkóposan a CC szürkésfehér, tömött, szoliter vagy multiplex göb formájában mutatkozik. Esetenként mucin termelés, nagyobb daganatokban centrális necrosis észlelhető (Kopper L, Schaff Zs. 2004). Az epeúti tumorok szövettana 90%-ban adenocarcinoma. Lehet papillaris, ill. sclerosus, diffúzan terjedő. A papillaris típus a ritkább, de kevésbé agresszíven viselkedő forma (Albores-Saavedra és mtsai, 2000). A tumor esetek kb. 35%-a lokalizálódik

a

ductus

choledochusra

(Tompkins

és

Immunhisztokémiailag a daganatsejteket a CK7 pozitivitás jellemzi.

9

mtsai,

1991).

3.1.3. Hepatocellularis adenoma A hepatocytákból kiinduló, ritka, jóindulatú daganat. Leggyakrabban fiatal nőkben fordul elő; számos adat szól az orális fogamzásgátlókkal és az androgén szteroidokkal való kapcsolat mellett (Trotter és Everson, 2001a). A hepatocellularis adenoma (HCA) kialakulásának oka lehet a glikogéntárolási betegségek (Biecker és mtsai, 2003). Általában nem cirrhoticus májban, egyesével alakul ki, ritkán multiplex. Színe eltér a környezettől, halványabb, a felhalmozott zsír miatt többnyire sárgás, homogén szerkezetű, de az érgazdagság miatt vérzésekkel tarkított lehet. Mikroszkóposan szabályos, de az átlagos hepatocytáknál nagyobb sejtekből épül fel, amelyek két-három sorban helyezkednek el, trabeculákat és/vagy tubulusokat képezve. A tumorban nincsenek epeutak és portális mezők, vannak viszont szinuszoidok és az ezeket bélelő Kupffer-sejtek. Néha cytoplasmaticus eperögök, illetve canalicularis epedugaszok arra utalnak, hogy a májsejtekben megtörténik a bilirubin konjugációja. Egyes esetekben a daganaton belül kifejezett érhálózat van. Ezek vékonyabb-vastagabb falúak, bennük gyakoriak a frissebb és régebbi thrombusok. A HCA nem tartalmaz epeutakat és ebben különbözik a fokális noduláris hyperplasiától (Grazioli

és

mtsai,

2001).

Biopsziás

vizsgálattal

többnyire

biztonsággal

diagnosztizálható, kivéve a dysplasiával járó eseteket, melyek elkülönítése a magasan differenciált HCC-től nehéz lehet (Schaff Z és Nagy P, 1997). A HCA legnagyobb veszélye az esetleges malignus transzformáció lehetősége, mely különösen az anyagcserezavarok talaján kialakult formákban gyakori.

3.1.4 Cholangiocellularis adenoma Epeutak hámsejtjeiből indul ki. Szürkésfehér, tömött, szívós, szoliter vagy multiplex, nem ritkán szubkapszulárisan elhelyezkedő daganat. Változó nagyságú lehet, de többnyire 1 cm-nél kisebb. Szövettanilag a proliferáló epeutakra jellemző köb- vagy hengerhámmal bélelt dúctusok láthatók, tömött kötőszövetbe ágyazva. A makroszkópos képen

adenocarcinoma

metastasisával

vagy

cholangiocelluláris

carcinomával

téveszthető össze. Ez különösen akkor merül fel, ha az 1 cm körüli tumor multiplex és a tok alatt helyezkedik el.

10

3.1.5. Fokális Noduláris Hyperplasia A daganatszerű elváltozások közé tartozik. A fokális noduláris hyperplasia (FNH) gyakori jóindulatú fokális májelváltozás, az összes primer májtumor 8%-át teszi ki (Biecker és mtsai, 2003a). A kialakult sejttömeg inkább reaktív elváltozás (a cirrhosishoz hasonlóan) és nem rendelkezik a daganatok progresszív proliferációs sajátosságával, valamint a daganatokra jellemző génalterációkkal, beleértve a p53 mutációt is (Schaff és mtsai, 1995). Általában szoliter, ritkábban multiplex; változó nagyságú lehet, tok nem határolja. Jellegzetessége az igen kifejezett centrális, gyakran csillag alakú heg a lézió központjában, amely az atípusos vaskos falú kanyargós ereket tartalmazza. Az éranomáliák következtében a vérzés és ruptura gyakori. Szövettanilag a hepatocytákra igen hasonlító sejtek trabeculákat képeznek, köztük portális traktusoknak megfelelő képleteket láthatók. Az epeút proliferáció igen kifejezett (Hussain és mtsai, 2004). A nőkben gyakrabban fordul elő; orális contraceptivumok szedésével is összefüggésbe hozzák, ám sokan tagadják ezt a kapcsolatot (Trotter és Everson, 2001). A májtumor rizikócsoportok szűréséhez és a betegkövetéshez, a kiújulás és a progresszió megelőzéséhez megfelelően érzékeny és specifikus markerekre van szükség. Elsődleges fontosságú lenne a betegek kiszűrése minél korábbi stádiumban, amikor a tumor a helyi kezelésre még jobban reagál. Emellett olyan szisztémás kezelések kidolgozása is fontos cél, melyek hatékonyan gyógyítanák a betegeket előrehaladott stádiumban, lehetővé téve ezáltal a máj funkciójának megtartását és elkerülhetőek lennének a kiterjedt műtétek. A primer májtumorok kutatásának elsődleges célja, hogy a különböző biológiai viselkedésű daganatok kialakulásának, progressziójának genetikai hátterét megértsük és erre alapozva új, célzott terápiás eljárások kerüljenek kidolgozásra. A májtumorok patogenezisében a vírusfertőzések, illetve más etológiai tényezők különböző elváltozásokon keresztül vezetnek a máj tumoros elváltozásához. Ez is, mint általában

a

tumorgenesis,

többlépcsős

folyamat

eredménye.

Különböző

szignáltranszdukciós útvonalak aktivizálásán keresztül a stromának is jelentős szerep jut a daganat progressziójában. A daganatos szövetté fejlődés egyik alapfeltétele a

11

daganatos stroma kialakítása, így az utóbbi időben egyre inkább előtérbe került az extracelluláris mátrix kutatása, mely új megvilágításba helyezi a májban zajló patológiás elváltozásokat, többek közt a fibrogenesis, a cirrhosis valamint a carcinogenesis mechanizmusát.

3.2. Az extracelluláris mátrix (ECM) Az ECM elválasztja a különböző szöveti részeket, biztosítja a sejtek kapcsolódását és meghatározza a szöveti architektúrát. Az ECM, illetve annak egyes komponensei nemcsak a szövetspecifikus szerkezet kialakításáért felelősek és az intercelluláris kapcsolatok megteremtésében vesznek részt, hanem újabb megfigyelések szerint közreműködnek a sejtek proliferációjában, differenciációjában, szövetspecifikus működésében, életképességének fenntartásában, valamint a biokémiai és a celluláris szerkezetet szabályozó jelátvitelben. Az ECM-sejt interakció eltérése több kóros állapot, így a malignus transzformáció és progresszió jellemzője (Liotta, 1982). Az ECM mennyisége, struktúrája szervenként, szövetenként változó. Hámszövetekben normális körülmények között az ECM aránya nagyon alacsony, mindössze a sejtek bazális felszíne alatt végighúzódó bazális laminára korlátozódik, azonban a mesenchymális eredetű kötő- és támasztószövetekben – a sejtes elemekhez viszonyítva – nagy mennyiségben van jelen. Az ECM alkotórészek termelésére számos sejt képes, ezek közül a fibroblasztok, oszteoblasztok, simaizomsejtek, endothelsejtek érdemelnek említést. Az ECM-et alkotó fehérjék főbb csoportjai a strukturális fehérjék (elasztin, kollagén), adhéziós tulajdonságokkal rendelkező fehérjék (fibronektin, tenascin), proteoglikánok és bazális membrán fehérjék (kollagén IV, laminin, entactin) (Alberts és mtsai, 1989). Az ECM szinte minden fehérjéje képes a sejtek biológiai viselkedésének a befolyásolására. Főleg a proteoglikánok alkalmasak növekedési faktorok kötésére, tárolására, aktiválására és inaktiválására, esetleg ko-receptorként felkínálni a tumorsejtek felszíni receptorai számára.

12

3.2.1. ECM: szintézis, lebontás, szabályozás Sokáig az ECM-et csak támasztó szöveti komponensnek tekintették és passzív szerepet tulajdonítottak neki. Mai ismereteink szerint a stroma igen aktív kölcsönhatások színtere, jeltovábbító rendszere. A tumorok csupán növekedésük kezdeti szakaszában (az avaszkuláris fázisban) épülnek fel csak daganatos sejtekből. A szövetté fejlődés alapfeltétele a daganatos stroma kialakítása. A daganatos stroma nagymértékben eltér a normál szövet stromájától. A daganatszövet ezt újonnan szintetizálja vagy termelteti a nem tumoros mesenhymális eredetű sejtekkel (fibroblasztok, myofibroblasztok, histiocyták, endothel és gyulladásos sejtek). Egyes kutatók szerint a stroma termelése a tumorsejtek genetikus kontrollja alatt áll és a tumorprogresszió elősegítése a cél. Bizonyos változások jellegzetesek lehetnek egy tumortípusra. Számos proteoglikán, illetve a cukorláncok magas expressziója kedvez a tumorprogressziónak. Ezt az elképzelést támasztja alá az az eredmény is, hogy a magas metasztázis-hajlamú tumorok más proteoglikán expresszióval rendelkeznek, mint a nem metasztatizáló típusok (Timár és mtsai, 1995). A mátrix-szintézis fő stimulátora a transforming growth faktor β1 (TGFβ1), mely számos mátrixfehérje (fibronektin, I, III, IV típusú kollagén, elasztin) fokozott termelését indukálja (Cheng és Grande, 2002; Ronnov-Jessen és Petersen, 1993). Emellett más növekedési faktorok, többek között a tumor necrosis faktor (TNF), epidermal growth faktor (EGF), basic fibroblast growth faktor (bFGF), platelet-derived growth faktor (PDGF), valamint az interleukinek is részt vesznek a szintézis szabályozásában, részben a mátrix fehérjék termelésének stimulálásával, részben az ezeket termelő sejtek számának növelésével. Vérellátás nélkül a daganatszövet életképtelen, ezért a tumor növekedése és terjedése szempontjából lényeges növekedési faktorok a bFGF és a vascular endothelial growth faktor (VEGF), melyek az endothelsejtek proliferációját, a daganatos érújdonképződést stimulálják. Fontosságukat támasztja alá, hogy gátlásuk akadályozza a daganatnövekedést (Angelucci és Bologna, 2007).

13

Mivel a tumorprogresszió számos eseménye megköveteli a daganatsejtek és a környező mátrix kapcsolatát, feltételezhető, hogy az ECM minősége hatással van a sejtek biológiai viselkedésére. A pontos molekuláris mechanizmus ma még nem ismert. Az invazív tumorsejtekben számos mátrixbontó enzim expressziója fokozódik. A proteolitikus enzimek három csoportját különítik el: cisztein/aszpartil proteinázok, mátrix metalloproteinázok (MMP), szerin proteázok (Metayer és mtsai, 2002). Előfordul, hogy az invazív fenotípus kialakulásakor nem a mátrixbontó enzimek expressziója fokozódik, hanem a gátlófehérjék expressziója csökken. Mindhárom fő mátrixbontó enzimrendszernek megvan az inhibitora. Az MMP-9/2 kollagénáz IV gátlói például a TIMP1/2 fehérjék (tissue inhibitor of metalloprotease), a katepszinek gátlói a stefinek, míg a plazminogén aktivátor rendszer gátlói a plazminogén inhibitorok. A kollagenázok jelentőségét igazolja az a kísérletes adat, mely szerint TIMP-t tumorsejtekbe transzfektálva azok elvesztik invazív karakterüket (Gallegos és mtsai, 1995).

3.2.2. Az ECM szerepe a szöveti működés szabályozásában A szöveti kötelékben a sejteket egymástól az ECM választja el. Passzív, térkitöltő funkcióját is beleértve a szerv alakját, méretét, felépítését szabja meg, valamint különböző szignálok, növekedési faktorok, enzimek, hormonok tároló és továbbító helye. Ezek kötését, aktiválását, inaktiválását feltehetően a proteoglikánok végzik,

befolyásolva

a

sejt-sejt,

sejt-mátrix

kölcsönhatásokat,

valamint

a

sejtproliferációt. Napjaikban az ECM aktív szerepét a regenerációs folyamatokban is egyre inkább hangsúlyozzák. A bazális membrán molekulaszűrőként szerepel. Negatív töltésű cukorláncai révén szelektíven ereszt át bizonyos molekulákat a vesetubulusokba, vízmolekulákat kötve befolyásolja a szöveti hidratációt, és szövetspecifikus génexpresszió-regulátorként serkentő vagy gátló funkciót tölthet be. A normális ECM fehérjéinek gyakorlatilag mindegyike megtalálható a daganatos ECMben is: a szerkezetet biztosító fehérjék, mint a kollagének és az elasztin; az adhéziós és antiadhéziós molekulák mint a laminin, fibronektin, vitronektin, entaktin, tenascin, proteoglikánok (decorin, versican, syndecan), és szinte minden fehérje képes a sejtek biológiai viselkedésének a befolyásolására. Normális és daganatos sejtek egyaránt

14

rendelkeznek mátrixfehérje receptorokkal, melyek megfelelő ligand jelenlétében jeleket közvetítenek a sejt számára. Legismertebb receptorcsalád az integrinek családja, ezek főleg Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)-régiokon keresztül a laminint, fibronektint, kollagént képesek megkötni. Az ECM szerepei közé tartozik a mikrokörnyezet megváltoztatása. Egyes ECM fehérjék, elsősorban a proteoglikánok, nagy vízkötő képességgel rendelkeznek, így fokozott termelődésük laza mátrixot eredményez, mely a tumorsejtek terjedését segíti elő (Madri és Marx, 1992). Számos ECM fehérje multidomain szerkezetet mutat. A tenascin, laminin, trombospondin és az egyes proteoglikánok (pl. az agrin, perlecan) bizonyos domainjai növekedési faktorokkal mutatnak homológiát. Kísérletileg igazolták, hogy ezek a domainok képesek a növekedési faktor receptorához kötődni és stimuláló hatást kiváltani. Az ECM-mel kapcsolatban lévő növekedési faktorok közül a legismertebbek a heparint és heparánszulfátot kötők. Ilyenek a TNF és TGF család, melyek fontos szerepet játszanak a tumorok növekedésében.

3.2.3. Az ECM és a tumorprogresszió A tumorprogresszió alapvető feltétele a daganatos stroma kialakítása. Ez a neostroma támasztékot nyújtva lehetővé teszi a tumorsejtek jellemző elrendeződését, biztosítja a tumorszövet vérellátását, modulálja a biológiailag aktív molekulák transzportját. A daganatos stroma kedvezhet a tumor terjedésének és növekedésének, vagy tükrözheti a környező normál szövet védekezési, valamint elhatárolási törekvéseit, tehát lehet serkentő vagy gátló (Mueller és Fusenig, 2002). A tumorsejtek kapcsolódása az ECM molekuláihoz membránreceptorokon keresztül történik (integrinek), melyek szintézise és sejtfelszíni expressziója jellegzetes az adott tumorra ill. tumor régióra (Eble és Haier, 2006). A malignusan transzformált sejtek képesek olyan proteázokat (pl. mátrix metalloproteázok) ill. proteáz aktivátorokat termelni, melyek a tumorsejtek migrációját, invázióját a mátrix degradálásával teszik lehetővé. Továbbá a tumorsejtek képesek a gazdaszervezet sejtjeit (fibroblasztok)

15

mátrix molekulák termelésére késztetni és ezáltal a maguk számára megfelelő miliőt kialakítani. A tumorsejtek túlélésének, proliferációjának másik lényeges mozzanata a tumorsejteket tápláló tumorérhálózat létrehozása, amely folyamat elengedhetetlen, ha a tumor mérete 1-2 mm-nél nagyobbra nő és amikor már nem képes a környező szövetekből biztosítani az anyagcsere működését. A tumor angiogenesis elősegítésében a számos tumorszövetből izolált és tumorsejtek által szekretált vascular endothelial growth faktor / vascular permeability faktor szerepe tűnik kulcsfontosságúnak, amely növekedési faktorok serkentik az endothelialis sejtek proliferációját és fokozzák a permeabilitást (Timár és mtsai, 2006). A daganatsejtek a környező stromával állandó, dinamikus kapcsolatban vannak. Részben saját létükhöz új, ún. „neostromát” termelnek, vagy erre késztetik a kötőszöveti sejteket, másfelől növekedésük és terjedésük során a már levő stromát lebontják. A stroma felől szignálok jutnak el a daganatsejtek felé, melyek azok viselkedését befolyásolják.

3.2.4. Az ECM összetétele humán májszövetben A normál májban az ECM makromolekulák dinamikus komplexe, mely a máj rostos vázát képezi és részben a Disse-térben foglal helyet. Az ECM fehérjék termelődésének fokozódása vagy lebontásuk csökkenése az ECM felszaporodásához vezet, mely a Disse-tér lezárásával mechanikusan akadályozza a makromolékulák szabad cseréjét a hepatocyták és plazmatér között. Újabb ismereteink szerint a strukturális szerep mellett aktívan részt vesz a szervet alkotó sejtek működésének szabályozásában

és

nélkülözhetetlen

a

hepatocyták

differenciált

funkcióinak

ellátásához. Az ECM-et alkotó makromolekulák három csoportba sorolhatóak, 1. kollagének, 2. nem kollagén glikoproteinek és 3. proteoglikánok (PG).

3.2.5. Proteoglikánok mint ECM komponensek

16

3.2.5.1. A proteoglikánok szerkezete A proteoglikánok olyan ECM komponensek, melyek a sejtfelszínen, de a sejten belül is előforduló makromolekulák. Jellegzetességük, hogy vázfehérjéikhez savas karakterű cukorláncok, a glükózaminoglikánok (GAG) kapcsolódnak. A GAG-ok olyan elágazás nélküli poliszacharidok, amelyekben egy diszacharid egység ismétlődik, melynek egyik tagja mindig egy amino-cukor (N-acetil-glükózamin vagy N-acetilgalaktózamin), ami igen gyakran szulfatálódik is. A másik cukor általában egy uronsav (Gallagher és mtsai, 1986). Mind a szulfát-, mind a karboxil-csoport negatív töltést hordoz, így a GAG-ok az emlős sejtek által termelt leganionosabb molekulák. Ezáltal sok kationt képesek kötni, amiket pedig vízmolekulák kísérnek. Jellemző, hogy nagyon kiterjedt konformációt vesznek fel, miáltal nagy terek kitöltésére képesek. Négy nagy csoportra bonthatók a GAG-ok az őket felépítő cukorkomponensek alapján: 1) hialuronan (hialuronsav), 2) chondroitin-szulfát (dermatánszulfát), 3) heparánszulfát, 4) keratánszulfát (Taylor és Gallo, 2006). A glikoproteinekre általában 1-60 tömeg% szénhidráttartalom jellemző, míg a proteoglikánoknak hosszú (átlagosan 80), elágazásmentes szénhidrátláncai a teljes molekula tömegének 95%-át is kitehetik. Két példa proteoglikánokra: a porcszövet zömét adó aggrecan több mint 100 GAG lánccal rendelkező fehérjemolekula, míg a kollagénrostokhoz kapcsolódó decorinnak csak egyetlen GAG lánca van. A proteoglikán vázát adó fehérjemolekula a durva felszínű endoplazmatikus retikulumon szintetizálódik, annak üregébe kerül. A szénhidrát oldalláncok ezt követően a Golgi apparátusban kapcsolódnak e fehérjéhez. Első lépésként egy tetraszacharid csatoló (link) alakít ki kovalens kötést egy szerin oldallánccal. Egy fehérje sok szerint tartalmazhat és nem ismert az a mód, ami meghatározza, hogy ezek közül melyek kapcsolódjanak a poliszacharid lánccal. (Feltételezhetően a fehérje konformációja hordozza az információt.) Ezt követően a glikozil-transzferáz enzim a tetraszacharid lánchoz egyesével újabb monoszacharidokat kapcsol, úgy, hogy az újonnan létrejövő lánc leginkább ismétlődő diszacharid egységekből fog állni. Még mindig a Golgi apparátushoz kötött állapotban zajlik le a polimerizált cukormolekulák esetleges további kovalens módosítása (epimerizáció, szulfatálás). Figyelembevéve a vázfehérjeként szóba jövő proteinek és a GAG-ok felépítésére rendelkezésre álló cukorkomponensek

17

számát, a lehetséges proteoglikánok száma csaknem végtelen (Silbert és Sugumaran, 2002; Sugahara és Kitagawa, 2002). A proteoglikánok sokféleségét látva nem meglepő, hogy szerepük nem korlátozódik a sejtek közötti hidratált közeg létrehozására. A GAG oldalláncok variálásával pl. eltérő pórusméretű, töltésű géleket alakíthatnak ki, ami megszabja a proteoglikánon belüli diffúziós folyamatokat. Erre példa a vese glomerulusainak bazális laminájában található agrin és perlecan (heparánszulfátok közé tartoznak), amely megszabja, hogy mi juthat a vérből a szűrletbe (Rabenstein, 2002). A proteoglikánok kémiai jelátviteli folyamatokba is bekapcsolódnak. A fibroblast növekedési faktorok (FGF) számos sejtféleség osztódását serkentik. Ez a faktor heparán-szulfát oldalláncokhoz kötődve oligomerizálódik, ami szükséges receptorának aktiválódásához (Kato és mtsai, 1998). Egy másik növekedési faktor, a TGF-β nem GAG oldallánchoz, hanem a protein komponenshez kapcsolódik és ez a kötődés meggátolja a faktor működését (Hildebrand és mtsai, 1994). A proteoglikánokon nem csak növekedési faktorok, hanem egyéb fehérjék is megkötődnek. Ilyen módon szabályozódik az aktivitása számos szekretált fehérjének, köztük sok proteolítikus enzimnek (proteáznak) is. A GAG-ok és a proteoglikánok hatalmas, rendezett struktúrákat is felépíthetnek az ECM-ben. Például sok aggrecan molekula kapcsolódhat egyetlen hialuronsav molekulához, így egy baktérium méretű komplex keletkezik. De a proteoglikánok egyéb mátrixfehérjékkel is kapcsolódhatnak, pl. kollagénnel a bazális lamina felépítésekor. Magukhoz a kollagén fibrillumokhoz is kapcsolódik egy proteoglikán, a decorin, ami nélkülözhetetlen a kollagénrostok kialakulásához. Ezt bizonyítja, hogy a decorinhiányos egerek bőre törékeny, azaz nyújtással szemben kevéssé ellenálló (Reed és Iozzo, 2002). Az újabb eredmények szerint proteoglikánok befolyásolják a sejtszaporodást, az embriogenezist, a morfogenezist, a karcinogenezist, és jelentőségük lehet a betegségek kialakulásának megértésében (Iozzo, 2005). A daganatokban általában megnövekszik a proteoglikánok termelése, mennyiségük akár a normális szövetben mértnek 10-20szorosa is lehet. Vizsgálataink részletesen érintették a májbetegségekben - elsősorban a májrákokban - bekövetkező egyes proteoglikánok, elsősorban az agrin minőségi és mennyiségi változását.

18

3.2.5.2. A proteoglikánok osztályozása 1. táblázat. Proteoglikánok osztályozása. Cukor láncai

Intracellularis PG

Sejtfelszíni PG

ECM PG

Keratán szulfát

Fibromodulin Keratocan Lumican PRELP Osteoadherin Osteoglycin i-chain of HLADR CD44 Melanoma PG Neurocan NG2 Phosphocan Thrombomodulin

Heparán szulfát

Glypican 1,2,3,4,5,6 Syndecan 2,3, 4 Transferrinreceptor Betaglycan Syndecan 1 Amphiglycan

Egyszerű PG

Chondroitin szulfát/ ChromograninDermatán szulfát A

Serglycin

Összetett PG-k

Aggrecan Biglycan Decorin Versican Collagen IX, XII, XIV Embrionalis mesenchyma PG Epiphycan Perlecan Agrin Collagen XVIII

A) Cukorláncaik alapján (Tímár és mtsai, 1995) A proteoglikánokat osztályozzák a fehérjevázhoz kapcsolódó cukorlánc alapján. 1. Egyszerű proteoglikánok: a fehérjevázhoz egy vagy több azonos típusú cukorlánc

kapcsolódik.

Ilyen

módon

heparánszulfát

proteoglikán

(HSPG),

kondroitinszulfát proteoglikán (CSPG) és keratánszulfát proteoglikán (KSPG)

19

különíthető el. Ezektől eltérően a hyaluronsav soha nem kapcsolódik kovalens kötéssel a fehérjéhez. Az ECM-ben szabadon foglal helyet, vagy a porc esetén speciális kötőfehérjével óriás CSPG molekulák kapcsolódnak hozzá. 2. Összetett proteoglikánok: a fehérjevázhoz különböző típusú GAG láncok kapcsolódnak. B) Szerkezet, funkció és lokalizáció alapján Az ismeretek gyarapodásával kísérletek történnek arra, hogy a felosztásnál a molekulák funkcióját, lokalizációját is figyelembe vegyék. Ezt a törekvést tükrözi Gallagher 1989es felosztása. I. Intracelluláris proteoglikánok A

serglycinek felelősek

a

bazofil

és

hízósejtek szekretoros granulumainak

metakromáziás festődéséért. Hosszan ismétlődő Ser-Gly dipeptidjei miatt a molekulát így nevezték el. A kis, kb. 10 kDa méretű fehérjevázhoz HS vagy CS kapcsolódhat. Ez a cukorkötő régió, melyhez számos cukorlánc kapcsolódhat, rezisztenssé téve a molekulát proteázokkal szemben. Sajátos vonása a fehérjeváznak, hogy sejttípustól függően más cukorlánc kapcsolódik hozzá, így a hízósejtben heparin, az NK sejtben CS, a mucosa hízósejtjeiben CS a kapcsolódó GAG. A molekula feltehető funkciója proteolitikus enzimek tárolása a granulumokban, azok kötése által. A sejtekből kijutva szabályozza a bontó enzimek aktiválódását is. II. Sejtfelszíni proteoglikánok 1. CSPG-k A sejt-sejt interakciókban játszanak szerepet. A melanoma proteoglikán a melanomák és neuroektodermalis eredetű tumorok sejtfelszínén található (Nishiyama és mtsai, 1991). A thrombomodulin a hemosztázisban vesz részt, alvadásgátló aktivitásának jelentős hányadát a fehérjeváz határozza meg, a CS lánc kapcsolódása esetén azonban a molekula antikoaguláns kapacitása fokozódik (Sadler, 1997). A TAP-1 az idegrostok terminális membránján található, szerepe az axonok lokalizálásában van az izomsejtek felszínén (Arenson és Bissell, 1987). A HNK-1 a gliasejtek és idegsejtek interakciójának egyik letéteményese. A CD44 fakultatív proteoglikán, eredetileg a

20

lymphocyták felszínén kimutatott fehérje, mely fontos szerepet játszik a lymphocyták nyirokcsomókba történő recirkulációjában. Epithelialis sejtek felszínén is megtalálható, CS és HS lánc glikanálhatja. A variációk szövetspecifikusak. Feltételezhetően a sejtspecifikus felismerésben és adhézióban játszik szerepet (Naor és mtsai, 1997). 2. HSPG-k Syndecan 1-4, a név a görög syndein - összekötni - szóból származik. A molekula 3 HS és 1 CS láncot tartalmazhat, transzmembrán domain köti a felszínhez. A HS láncain keresztül képes kapcsolódni az I, III, V típusú kollagénhez, fibronektinhez, trombospondinhoz. Az epiteliális sejtek típusos proteoglikánja. Az elmúlt években számos, az eredetivel homológ molekulát szekvenáltak, melyek vázfehérjéinek mérete 31-90 kD között van (Woods, 2001). A syndecan csoporthoz tartozó syndecan-2-t (fibroglycan) embrionális tüdő és bőr fibroblasztokon mutatták ki, 125, 90, 60 és 45 kDa fehérjevázzal (Heremans és mtsai, 1988). A 90 és 45 kD fehérjeláncok a peptidanalízis

alapján

rokon

struktúráknak

bizonyultak.

Feltehetően

ez

is

transzmembrán proteoglikán, amelyhez valószínűleg három cukorlánc kapcsolódik. A fibroglikánnal nagyfokú szekvencia-homológiát találtak a patkány hepatocyták sejtfelszíni HSPG-jének klónozása során, így feltételezhető, hogy ezek felszínén is fibroglikán található. A betaglycan a TGBβl III típusú receptora. 110 kD fehérjevázához HS és CS lánc kapcsolódik. A GAG láncok nem szükségesek a ligandkötési funkcióhoz (Esko és mtsai, 1987). Feltehetően a növekedési faktor receptorkötődése által kiváltott fokozott mátrix-szintézis negatív regulációjában van szerepe (Cheifetz és mtsai, 1987). A vastagbélrák sejtek HSPG-je nagyfokú homológiát mutat a perlecannal (Dodge és mtsai, 1991). Transzmembrán fehérje, mely hidrofób domaint tartalmaz (Iozzo és mtsai, 1990). Northern blot analízissel hasonló proteoglikán messenger RNS szintű expresszióját igazolták normál vastagbél szövetben is. A proteoglikánok különböző módon kapcsolódhatnak a sejtfelszínhez, ennek egyik lehetséges módja a transzmembrán hidrofób domain segítségével történő kapcsolódás, egy másik lehetőség a beékelődés a lipid kettősrétegbe a proteoglikánon levő inozitolfoszfát segítségével, vagy egy specifikus membránreceptorhoz való kötődés a HS láncon vagy inozitolfoszfáton keresztül.

21

A sejtfelszíni HSPG molekulák szerepét a cukorláncok vagy a vázfehérjék határozhatják meg. Igen változatos szerepet játszhatnak, megszabják a sejt-sejt, sejtECM interakciókat, enzimeket, növekedési faktorokat, hormonokat képesek kötni, azokat serkentve, vagy éppen inaktiválva. Bizonyos rendszerekben a fehérjéről leváló HS láncok a sejtmagba jutva a sejtproliferáció szabályozásában vesznek részt. Felvetődik a lehetőség, hogy egyes HS láncok információt is hordoznak pl. specifikus, bázikus FGF és thrombospondin kötő régiót sikerült kimutatni rajtuk. III. Az ECM proteoglikánjai 1. Térkitöltő CSPG-k az ECM-ben Az aggrecan a porc proteoglikánja (Doege és mtsai, 1990), a human fibroblaszt proteoglikán versican, az embrionalis mesenchyma proteoglikán (Kimata és mtsai, 1986) és az agy CSPG-i a legismertebbek. Jellegzetességük, hogy egységekből épülnek fel, így pl. a versican EGF, lektinszerű, complement regulatory protein (CRP) és hyalin kötő régiókat tartalmaz. A sejtek adhézióját általában gátolják (Cattaruzza és mtsai, 2002). 2. Kollagén rostokhoz kapcsolódó CSPG-k A proteoglikán-2/decorin, kb. 40 kD fehérjevázzal rendelkező molekula a kollagén I d és e csíkjaihoz kapcsolódik, gátolja a kollagénrost képződést. Csak 1 cukorkötő helye van, DS vagy CS kapcsolódik ehhez. A kötőszövetben csaknem mindenütt megtalálható (Krusius és Ruoslahti, 1986). A proteoglikán-1/biglycan szintén kis CS- vagy DSPG, mely DNS szinten nagyfokú szekvenciahomológiát mutat a decorinnal, azonban bizonyíthatóan elkülöníthető gén terméke (Fisher és mtsai, 1989). Nevét azért kapta, mert két cukorlánc kapcsolódik hozzá. Kollagénhez való kötődését eddig még nem bizonyították, ugyanakkor erősen kötődik az ECM egyéb komponenseihez. A biglycan és decorin együtt a rostos kötőszövet proteoglikánjainak a 95%-át teszik ki. A kollagén IX-ről az utóbbi időben tisztázódott, hogy ez a molekula is proteoglikán, 1 CS lánc kapcsolódik hozzá (Konomi és mtsai, 1986). A hyalin porcban található rostos hálózat része, a cukorlánc különösen alkalmassá teszi, hogy egyéb mátrix proteinekhez kapcsolódjon.

22

3. KSPG-k A cornea állományának egyik fő alkotórésze egy KSPG, alapvető szerepe van az optikailag átlátszó, rendezett rosthálózat kialakításában. Keratánszulfát láncot mutattak ki ezen túlmenően az aggrecanon, az ín és az aorta proteoglikánjai között. A fibromodulin egy KS proteoglikán, mely jelentős homologiát mutat a decorinnal és a biglycannal (Chakravarti, 2002). Szintén képes a kollagénhez kötődni. 4. Bazális membrán HSPG-k (BMHSPG) A perlecan (Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) sarcoma proteoglikán) a legjobban tanulmányozott BMHSPG (Gallai és mtsai, 1996). Fehérjeváza kb. 400 kD, ehhez 4 GAG lánc kapcsolódik. Szerkezetében a lineáris struktúrát 7 globuláris régió szakítja meg, mint gyöngyfüzér. Innen kapta a nevét is. Számos domainje homologiát mutat egyéb fehérjékkel, így ciszteingazdag régiója a laminin B láncával, egy többhurkos struktúrája az NCAM-al és egyéb az immunglobulin szupercsaládba tartozó fehérjékkel. Az endothelsejtek és a humán fibroblaszt nagy HSPG-je feltehetően hasonló struktúrák (Heremans és mtsai, 1988). A kollagen XVIII a HS láncai miatt a bazális membrán HSPG-k közé tartozik (Halfter és mtsai, 1998). A BMHSPG-k egyik fontos tagja az agrin, amelyikről következő fejezetben írok részletesebben. A BMHSPG-k elsődleges funkciója a molekulaszűrés. Ezen túlmenően az idegrostok növekedésében a lamininnal alkotott komplexének jelentőségét írták le, úgy tűnik szoros kapcsolata van az NCAM fehérjével is elősegítve ezáltal az idegrostok regenerációját (Cole és Burg, 1989). Újabb adatok szerint HS láncaival növekedési faktorok tárolására képes. A proteoglikán kutatás felgyorsult üteme a csoportok egyre újabb tagjait deríti fel. Nyilvánvalóvá vált, hogy méretükben, szerkezetükben és funkcióikban nagyon heterogén molekulákról van szó. Ismereteink gyarapodásával egyre több adat támasztja alá, hogy ezen molekulák jelentősége messze nagyobb, mint feltételeztük. A proteoglikánok fiziológiás körülmények között a következő folyamatokban játszanak szerepet: 1. A kötőszövet és támasztószövet alkotórészei.

23

2.

Negatív töltésük miatt megszabják a szövetek hidratációját; molekulaszűrőként

funkcionálnak. 3. Meghatározóak a sejt-sejt és sejt-ECM kapcsolatokban. 4. Részt vesznek a sejtek szövetté történő szerveződésében. 5. Növekedési faktorok, enzimek, hormonok, citokinek kötése, prezentálása és semlegesítése révén aktív részesei a sejt- és szövetműködés fiziológiás szabályozásának.

3.2.5.3. Az agrin mint BMHSPG 3.2.5.3.1. Az agrin szerkezete Agrin, a név görög „agrein”-összegyűjteni (assemble) - szóból származik, ami azt jelenti, hogy képes acetylcholine receptor (AChR) aggregációra. Az agrin nagy méretű, erős negatív töltésű multidomain HSPG (Tsen és mtsai, 1995). Az emberi agrin gén (AGRN) locusa: 1p36.1-1, ami viszonylag közel helyezkedik a perlecan génhez (1p35-36.1) (Dodge és mtsai, 1991). Az emberi agrin mRNA hosszában meghaladja a 7 kb-t és több mint 2,000 aminosavból álló, 212 kDa molekuláris tömegű fehérjét kódol (Rupp és mtsai, 1992). Szerkezetileg az agrin egy globularis laminin-kötő domaint (NtA), kilenc follistatin-szerű proteáz inhibitor domaint (FS), két laminin-szerű epidermális növekedési faktor ismétlődést (LE), két serine/threonine gazdag domaint (S/T), a SEA module-t (SEA), négy EGF ismétlődést (EG) és három laminin α-lánchoz homológ laminin globuláris domaint (LG) tartalmaz (1. ábra) (Rupp és mtsai, 1991; Tsim és mtsai, 1992). Az intenzíven N- és O- glikolizált N-terminális miatt az agrin molekuláris tömege oldallánccokkal együtt eléri a 600 kDa-t (Tsen és mtsai, 1995). Az aminocsoportokhoz kapcsolódó szénhidrátok és a GAG az agrin szekvencia egész hosszában megtalálhatók, de HS-GAG formája főként a fehérje N-terminális szakaszára korlátózódik. Ezek a régiók ugyancsak részt vesznek az idegsejt adhéziós molekulák (NCAM) és a heparin kötő növekedési faktorok megkötésében (Cole és Halfter, 1996). A C-terminálisan helyezkedő, 95-kDa része (ahol az első epidermális növekedési faktor (EGF)-szerű domain (EG) kezdődik) szerepet játszik az AChR aggregacióban, valamint tartalmaz α-dystroglycan, heparin, egyes integrin és még nem

24

azonosított „agrin receptor” kötő szakaszokat (Ferns és mtsai, 1993; Gesemann és mtsai, 1995; Ruegg és mtsai, 1992)

1. ábra. Agrin szerkezete: NtA-N-terminális globularis laminin-kötő domain, TM- transzmembrán domain, FS-follistatin-szerű proteáz inhibitor domain, LElaminin-szerű ismétlődő szekvenciák, S/T-serine/threonine gazdag domain, a SEA-SEA module, EG-EGF ismétlődés, LG-laminin α-lánchoz homológ laminin globuláris domain. (Bezakova és Ruegg 2003).

3.2.5.3.2. Az agrin típusai Burger és munkatársai (2000) a patkány agrin két, különböző N-terminálissal rendelkező izoformáját írták le: az SN-agrint (rövid izoforma, TM agrin) és LN-agrint (hosszú izoforma, NtA agrin), amelyek a szubcelluláris lokalizációban, a szöveti eloszlásban és a funkcióban is különböznek egymástól. Az SN-agrin elsősorban az idegrendszerben (IR) található, míg az LN-agrin a központi IR-en kívül más szervekben (vese, tüdő, NMJ) is előfordul (Ruegg és Bixby, 1998). Az SN-agrin sejtmembránhoz kötődve, az LN-agrin az ECM bazális laminájához társultan fordul elő (Bezakova és Ruegg, 2003). Knockout egerekben az LN-agrin expressziójának csökkenése a neuromuszkularis junkció működésének csökkenéséhez vezetett (Gautam és mtsai, 1996; Lin és mtsai, 2001). Az LN-agrin a bazális lamina egyik komponenseként, fontos

25

szerepet játszik a neuromuszkuláris junkció (NMJ) jeltovábbításában, míg az SN-agrin elsősorban az idegsejtek közötti jelátvitelben vesz részt. Mind a LN-agrin és a SN-agrin izoformák alternatív splicing következtében különbözhetnek még legalább két további – A/y- és B/z-ként ismert – pozícióban, melyek a karboxi-terminális laminin-globuláris (LG) LG2, illetve LG3 tartományban vannak. Az e helyekre való beillesztés olyan fehérje variánsokat hoz létre, melyek 0 vagy 4 aminosavat tartalmazhatnak az A/y pozícióban, és 0, 8, 11 vagy 19 (8+11) aminosavat a B/z pozícióban. A Lys-Ser-Arg-Lys (Lys =lysin, Ser=serin, Arg=arginin) A/y helyre történő beillesztése a heparin kötéséhez szükséges, továbbá modulálja az agrin kötődését az α-dystroglycanhoz, egy erősen glikozilált periferiális membrán fehérjéhez, mely számos szövetben, így az izomban is expresszálódik. Ezen beillesztés fiziológiai fontossága az A/y helyen tisztázatlan, mivel látszólag normálisak azok az egerek, melyekben nem található ez a bizonyos exon (Bezakova és Ruegg, 2003). Ezzel ellentétben, az aminosav beillesztések a B/z helyen döntőek az agrin-indukált AChR

aggregáció

szempontjából.

Tenyésztett

myotubusok

esetében

csak

a

beillesztéssel (agrin –B/z+) rendelkező izoformok indukálnak AChR aggregációt és ez az aktivitás nincs jelen, amennyiben hiányzik a beillesztés a B/z helyen (agrin B/z-). Az AChR aggregációs aktivitást mutató agrin mRNS-t kódoló izoformák a motoneuronokban expresszálódnak, míg a nem idegi szövetek sejtjei (tüdő, vese és izom) olyan agrin transzkriptumokat szintetizálnak, melyeknél hiányoznak a beillesztések az A/y és B/z helyeken. A nem izomszövetek esetében az agrin a dystroglycan nagy affinitású kötő fehérjéje (Gesemann és mtsai, 1998). 3.2.5.3.3. Az agrin funkciói AChR aggregáció: Az agrin legfontosabb és legrészletesebben tanulmányozott funkciója az NMJben az AChR aggregáció kiváltása. A B/z+ agrin posztszinaptikus differenciálódást kiváltó képessége bizonyított, ennek molekuláris folyamata azonban csak részlegesen ismert. Az AChR-aggregáló képességhez az LN-agrinnak rendelkeznie kell karboxiterminális 95-kDa domainnal. Érdékes, hogy in vitro a B/z+ agrin LG3 domaint tartalmazó 21-kDa fragmentje is kiváltja az AChR aggregációt (Gesemann és mtsai, 1995; Yang és mtsai, 2001), de jóval kisebb mértekben, mint a teljes hosszúságú vagy a

26

95-kDA-os fragment. Valószínűsíthető, hogy a B/z+ agrin a LG3-B/z+ domainen keresztül kapcsolódik a receptorával (receptoraival) (McMahan, 1990), másrészt az agrin α-dystroglycanhoz kötődve, valamint a muscle-specific receptor tyrosine kinase (MuSK) aktiválásával részt vesz az AChR aggregálásában (Ruegg és Bixby, 1998). Az agrin-deficiens egerek az NMJ súlyos funkciózavara következtében közvetlenül születés után elpusztulnak (Gautam és mtsai, 1996). Embrionalis szövetekben az agrin a motoneuronokban szintetizálódik, majd axonalis transzport révén terminálisan szekretálódik, így az NMJ szinaptikus résben a bazális laminában állandóan jelen van (Magill-Solc és McMahan, 1988). NMJ kialakulásakor a motoneuronok által expresszált agrin izoformák indukálják a posztszinaptikus membránban az AChR-ok aggregációját. Ezzel szemben az izomsejtek által expresszált izoformáknak nincs aggregáló hatásuk (Ruegg és mtsai, 1992). A strukturális és funkcionális vizsgálatok kimutatták, hogy az agrin különböző sejtfelszíni és ECM fehérjékhez kötődik, például a lamininhez (Denzer és mtsai, 1997; Denzer és mtsai, 1998; Kammerer és mtsai, 1999) és az α-dystroglycanhoz (Gesemann és mtsai, 1998). A laminin az LN-agrin amino-terminális részén levő NtA véghez kötődik (2. ábra). Az agrin elsősorban a laminin 2, 4-hez kötődik és ez a két laminin jelen van az izom bazális laminájában. Az agrin erős kötődése a laminin-4-hez megmagyarázhatja, hogy miért marad az agrin a sejtes elemek degenerálódása után is a szinaptikus bazális laminához társultan (Reist és mtsai, 1987). Az agrin karboxi-terminális részén található az α-dystroglycan kötő rész (Bowe és Fallon, 1995). Az α-dystroglycan a prekurzor fehérje poszttranszlációs hasítását követően alakul ki, erősen glikolizált perifériás membránfehérje, a lamininhez, az agrinhoz és a transzmembrán β-dystroglycanhoz kötődik (Gesemann és mtsai, 1998). Az α- és a β-dystroglycan különböző fehérjékkel együtt alkotja a dystrophin- glycoprotein complexet. Igy az agrin a bazálmembránt a cytoskeletonhoz rögzítve jeltovábbításban vehet részt (Bowe és mtsai, 1994; Bowe és mtsai, 1994; Gee és mtsai, 1994).

27

2.ábra.

Az

agrin

a

postsynaptikus

differenciálódásban:

(www.cgap.nci.nih.gov/Pathways) Más kísérletek két további fehérje szerepét támasztják alá az agrin jelátvitelben játszott szerepében. Az egyik az izom-specifikus tirozin kináz (MuSK) (Jennings és Burden, 1993), a másik cytoplasma membrán fehérje a rapsyn (Frail és mtsai, 1988). Az agrin neurogenesisben játszott szerepét alátámasztja, hogy magas agrin expressziós szintet mutattak ki a fejlődő agy ventricularis és subventicularis zónáiban és a gerincvelőben; ezzel ellentétben a felnőtt agyból hiányzik. Ezen kívül agrin-hiányos egerek agya sokkal kisebb volt, mint a vad típusé (Serpinskaya és mtsai, 1999). Az agrin létfontosságú a kolinerg idegsejtek szinaptikus működésének szabályozásában a felső cervicalis ganglionban (SCG). Az agrin-deficiens embriók a pre- és postsynaptikus struktúrák szabálytalan illeszkedést és jeltovábbítási hibáit mutatják (mismatch-et és synaptikus transmission hibát). (Gingras és Ferns, 2001). Az SCG-ben

28

az agrin SN izoformája expresszálódik, és a MuSK-on keresztül hatással van a synaptogenesisre (Ip és mtsai, 2000). Az agrin immunreakcióját mutattak ki az agy mikrovaszkulatúrájában, ahol az agrin az α-dystroglycanhoz és a lamininhoz kötődve stabilizálja a specifikus bazális laminát, ami a vér-agy gát felépítésében játszik szerepet (Donahue és mtsai, 1999). Az agrin βamyloid-hoz is kötődik (Cotman és mtsai, 2000), ami az Alzheimer-es beteg amyloid plaque-jában felhalmozódik; ennek a kórnak egyik tipikus következménye a vér-agy gát fokozott permeabilitása (Donahue és mtsai, 1999). Agrin a glomerularis bazális membránban Az agrin a vese glomeruláris bazális membránjában (GBM) is kimutatható (Groffen és mtsai, 1998). Itt részt vesz a töltésszelektív ultrafiltrációs folyamatban. Az agrin a GBM-ben elsősorban a lamininhoz kötődik. Ez a kötődés a laminin hosszú kar centrális régiójára lokalizálódik. A GBM és a sejt felszíne közötti térben az agrin fontos szerepet játszhat a sejtmatrix adhézióban. Az agrin egyik sejtfelszíni receptora, az α-dystroglycan a vese érett és fejlődő epitheliumában magas expressziót mutatott (Durbeej és mtsai, 1998). Az érett glomerulus GBM-ben az α-dystroglycan az agrinhoz hasonlóan expresszálódik (Durbeej és mtsai, 1998).

Így az agrin és az α-dystroglycan kolokalizációja a GBM-ben

támogatja a sejt-mátrix kölcsönhatás funkciót. Ebben a kapcsolatban az agrinnak kihorgonyzó szerepe lehet a citoszkeleton és BM közötti szerkezeti kölcsönhatás biztosításában. A citoszkeletonnak a GBM-mel való szoros kölcsönhatása nem csak a magas helyi vérnyomás fenntartásához nélkülözhetetlen, de a glomerularis filtráció hemodinamikai változásokhoz történő alkalmazkodásában is szerepet játszik. Az agrin a transzmembrán jelátvitelben az integrinen keresztül is részt vesz. Az agrin kötődik a αvβ1-integrinhez (Martin és Sanes, 1997), amelynek fontos szerepe van a sejtek differenciálódásában.

3.3. A proteoglikánok szerepe májbetegségekben Az orvostudományban elsődleges kérdésként vetődik fel, mi a jelentősége a proteoglikánoknak bizonyos kórfolyamatokban. Az elmondottakból nyilvánvaló, hogy a

29

proteoglikánoknak kitüntetett szerepe lehet mindenütt, ahol az ECM felhalmozódása zajlik, pl. májcirrhosis, májfibrosis, egyéb fibrosisok, sebgyógyulás, keloid képződés, arteriosclerosis. Ugyancsak fontos az agrin azon folyamatokban, ahol a sejtek vándorlása történik az ECM-on keresztül, pl. gyulladás, tumorinvázió, metasztatizálás, valamint ahol a sejtek, szövetek autoregulációja kerül előtérbe, pl. tumorok autonóm szabályozása, valamint a szervezet védekező funkciói zajlanak, pl. citotoxicitás, cellularis immunreakciók. A felsoroltak közül a májra vonatkozó ismereteket szeretném röviden összefoglalni. A máj proteoglikánjai és változásuk kóros körülmények között A máj proteoglikánjai Az ép májban egyéb fehérjékhez képest a proteoglikánok mennyisége elenyésző. A cukorláncok analízise alapján 65—70%-uk HSPG. A fehérjeváz(ak) méretét, aminosav és nukleinsav szekvenciáját még nem határozták meg teljes egészében. Feltehetően több HSPG típus is megtalálható, amelyek vagy a hepatocyták sejtfelszínéhez kötődnek, vagy az ECM-ben rakódnak le. Leírtak kicsi, kb. 27 kD-os molekulát, melyhez három vagy négy, egyenként 14 kD tömegű cukorlánc kapcsolódik (Oldberg és mtsai, 1979). Beszámoltak egy, a hepatocyták által termelt, az ECM-be lokalizálódó HSPG-ról, melynek mérete 150— 300 kD, 40 kD tömegű fehérjevázzal. Izoláltak egy sejtfelszíni HSPG-t, melynek mérete 200 kD körüli, a fehérjeváz pedig 77 kD (Gallagher, 1989; Lyon és Gallagher, 1991). Ez a molekula feltehetően homológ a fibroglikánnal. Az ismert proteoglikánok közül a syndecan expressziója is kimutatható a humán májban. Megtalálhatók ezen kívül a decorin, a biglycan, a perlecan és a versican is (Kovalszky, I és mtsai, 1997). Ezeket nagy valószínűséggel nem a hepatocyták, hanem a nonparenchymalis májsejtek (Ito sejt: decorin, biglycan, perlecan, Kupffer sejt: syndecan, endothelsejt: decorin, perlecan) termelik. A proteoglikánok változása májcirrhosisban A proteoglikánok a kötőszövet és a bazális membrán szerves alkotórészei, így természetes, hogy mennyiségük a cirrhotikus májban felszaporodik, összetételük

30

megváltozik. Elsősorban a kötőszöveti szeptumoknak megfelelően rakódnak le, döntő többségük DS-CSPG (Arenson és Bissell, 1987). Előrehaladott cirrhosisban a humán máj ötször több HS-ot, tízszer több CS-ot és tizenhatszor több DS-ot tartalmaz, mint a normál máj (Murata és mtsai, 1985). Hasonló nagyságrendű fokozódás a teljes proteoglikán molekulák esetében nem volt kimutatható, így feltehetően a vázfehérjék glikanációja is növekszik (Kovalszky és mtsai, 1993). A cukorláncok szulfatáltsága fokozódik. Az elmúlt években vált ismertté, hogy cirrhosisban a proteoglikánok fokozott termelését, egyéb mátrixfehérjékhez hasonlóan, a nem-parenchymalis májsejtek, elsősorban az Ito-sejtek végzik (Senoo, 2004). A fokozott szintézis TGFβl hatására következik be (Kiss és mtsai, 1998). A perlecan és versican fokozódó expressziója cirrhosisban szintén a nem parenchymalis sejtekben figyelhető meg (Kovalszky, I és mtsai, 1997). A syndecan expresszióját humán biliaris cirrhosisban real-time RT PCR vizsgálattal fokozottnak találták, míg kísérletes széntetraklorid cirrhosisban nem észleltek érdemi változást (Sebestyen és mtsai, 2000). A proteoglikánok felszaporodása azonban nemcsak a fokozott szintézis, hanem a progresszióval párhuzamosan csökkenő lebontás következménye is. A lizoszómális endohexozaminidázok aktivitása csökken, és különösen nehezítetté válik a DS láncok degradációja. Részben ez magyarázza a DS mennyiségének kitüntetett emelkedését. Kérdés, hogy a proteoglikánok mennyiségének és összetételének változása pusztán, mint a szövetproliferáció egyik részjelensége értékelendő, vagy ennél többről van szó és ezek a változások hatással vannak a cirrhosis kimenetelére is. Több adat utal arra, hogy bizonyos proteoglikánok részesei a mátrixképződés szabályozásának. Ismert, hogy a decorin a kollagén rostokhoz kötődve gátolja azok érését, tehát a kötőszövetképzés gátlásának irányába hat. A decorin a TGFβl inaktiválására képes, erről a növekedési faktorról köztudott, hogy a fibrogenezis egyik fő stimulátora (Kovalszky és mtsai, 1998). Proteoglikánok és májtumor A témával foglalkozó kutatók kivétel nélkül egyetértenek abban, hogy a proteoglikánoknak fontos szerepük van a daganatos betegségek progressziójában. Nem tudjuk, csak feltételezzük, hogy a tumorok indukciójában is szerepük lehet. Elsősorban leíró adatok állnak rendelkezésre, bemutatva, hogy szinte nincs olyan daganat, melyben

31

a proteoglikánok mennyisége és minősége ne változna meg az eredeti szövethez viszonyítva. Így van ez a máj esetében is. Kémiai karcinogenezis során az úgynevezett alterált fókuszokban intenzív GAG festődést mutató anyag jelenik meg a májsejtek citoplazmájában. A kialakult májrákban ez a felhalmozódás tovább fokozódik. A humán hepatoma sejtek citoplazmája is alcián kék pozitív és a pozitivitás kondroitináz enzim emésztést követően eltűnik. Immunhisztokémiával erős HSPG pozitivitás is megfigyelhető a tumorsejtek citoplazmájában. Kémiai módszerekkel analizálva a májrákokban a kondroitinszulfát kb. hússzoros felhalmozódását találták, a heparánszulfáttartalom kb. tízszer nagyobb, mint a normál májban, a GAG-ok egymáshoz viszonyított aránya is megváltozik. Nemcsak a májrákok proteoglikán tartalma és összetétele változik meg a normál májhoz képest, hanem a tumor körüli látszólag ép májszövetben is GAG halmozódik fel morfológiai és kémiai módszerrel vizsgálva egyaránt (Kovalszky és mtsai, 1990). A fehérjeváz analízise arra utal, hogy nem a molekulák véletlenszerű felhalmozódásáról, hanem szelektív eltolódásról van szó, mivel egyes proteoglikánok, mint a syndecan, expressziója gyakorlatilag eltűnik a májrákból. Ugyanakkor a decorin és egy a bazális membrán HSPG-nek megfelelő proteoglikán felhalmozódik. Nem tisztázott még a felhalmozódó proteoglikánok forrása. Nagyon valószínű azonban, hogy a tumorsejtek részben proteoglikánokat termelnek nagy mennyiségben, részben pedig olyan faktorokat, melyek a környezet nem tumoros sejtjeit fokozott proteoglikán szintézisre késztetik. Mi a jelentősége ezeknek a változásoknak? A tumorsejtek felszínén és környezetükben felhalmozódó megváltozott összetételű mátrix, melyben a CSPG-k dominálnak, a sejtek egymástól való elszakadását segíti elő. Megkönnyíti a tumorsejtek invázióját, a mátrix degradációját. Ugyanakkor mintegy körülbástyázza a daganatot, lehetőséget nyújtva annak fokozott autonómiájára. Ezt a feltételezést támasztja alá az a tény, hogy a proteoglikánok növekedési faktorokat, cytokineket, hormonokat képesek kötni, tárolni és semlegesíteni (Ruoslahti és Yamaguchi, 1991). A bFGF receptora egy syndecannal homológ HSPG (Qiao és mtsai, 2003). A TGFβl III. típusú receptora, a betaglycan, egy HS/CSPG. A decorin a TGFβl-et semlegesíti. Hasonló funkció más proteoglikánokról is elképzelhető. Így a megváltozott proteoglikán-összetétel folytán teljesen más információk jutnak el a tumorsejtekhez, mint normális proteoglikán-összetétel esetén. Ismert, hogy a TGFβ1 a hepatocyták

32

proliferációját gátolja. Hatásának felfüggesztése proliferációs stimulust jelenthet. A syndecan az egyik fő letéteményese a sejtek lehorgonyzásának (Saunders és mtsai, 1989), eltűnése a sejtfelszínről elősegíti a sejtek anyatumortól való elszakadását. A hepatoma sejtek felszínén kimutattak egy HSPG-t, mely bizonyos ingerek hatására internalizálódik, majd HS lánca a fehérjéről leválva a sejtmagba jut és proliferációgátlást idéz elő (Fedarko és mtsai, 1989). Amennyiben egy ilyen HSPG mennyisége csökken, a következmény ismét a proliferáció fokozódása lesz. Újabb adatok szerint a magban a HS lánc az egyes gének derepressziójában, aktiválásában fontos szerepet játszó topoizomeráz enzimet gátolja. Ismert tény, hogy a hepatocyták sejtfelszíni HSPG-jai heparinszerű, tehát antithrombin aktivitással

rendelkeznek.

Ezen

proteoglikánok

arányának

csökkenése

a

kondroitinszulfát proteoglikánok javára, a HS láncok szulfatáltságának csökkenése, melyet számos tumor esetén leírtak és magunk májrákok vizsgálata során is megfigyeltünk, a hemosztázis egyensúlyát az alvadás irányába billentheti el. Egy daganat biológiai viselkedése természetesen számos, ma még nem minden részletében ismert, tényezőtől függ. A proteoglikánok megváltozása csak egy ezek közül, de úgy tűnik, nem jelentéktelen. Jobb megismerésük, észlelt változásaik modellezése kísérleti rendszerekben remélhetőleg pontosabb választ fog adni arra, hogyan képesek e fehérjék befolyásolni egy tumor aktuális progresszióját. Nagy a valószínűsége annak is, hogy a jövőben bizonyos proteoglikánok a daganat-terápia targetjeiként is számításba jönnek. A fehérjeváz, vagy a cukorláncok szintézisének gátlásával kísérletes körülmények között már ma is lehet daganat-, illetve metasztázisgátló hatást elérni.

3.4. A BMHSPG-k szerepe az angiogenesisben

A HSPG-k nélkülözhetetlenek az endothelsejtek strukturális és funkcionális épségéhez. A HSPG-k a endothelsejtek bazális felszínen vannak jelen, és mátrixreceptorként viselkednek a különböző bazális membrán fehérjék számára. Továbbá a BMHSPG-k felelősek a töltésszelektív filtrációs folyamatokért az endotheliumban (Morita és mtsai, 2005), és gátolják a simaizomsejtek proliferációját, migrációját

33

(Castellot, Jr. és mtsai, 1981). HSPG-k az endothelsejtek luminális felszínen is jelen vannak, ahol részt vesznek a lipoprotein-lipáz kötődésében és internalizációjában (Moon és mtsai, 2005). Ezek a luminális HSPG-k ugyancsak fontos szerepet játszanak az erek felszíni antikoagulatív tulajdonságának a meghatározásában is az intrinsic véralvadási kaszkád-proteázok, thrombin és proteáz inhibitorok, beleértve az antithrombin III kötésével. Végül az endothel felszíni HSPG-k számos angiogenikus növekedési faktor koreceptoraként is működnek, és ezzel az angiogenezis szabályozásában is részt vesznek. Mind a makro-, mind a mikrovaszkuláris endothelsejtek termelnek HSPG-ket. Az

endotheliális

HSPG-k

előfordulhatnak

intracellulárisan,

ECM-hez

vagy

plazmamembránhoz kötődve, valamint szolubilis formában is (Yamamoto és mtsai, 2005). A syndecan-1 a leggyakrabban előforduló HSPG a mikrovaszkuláris endothelsejtekben. A syndecan-4 is expresszálódik az endothelsejtek felszínén, míg a perlecan az endothel ECM-ben gyakori. Az endothelsejtek tenyészetének mediumából 28-800 kD molekuláris tömegű, nehezen meghatározható szolubilis HSPG-ket izoláltak (Kainulainen és mtsai, 1996). Megfigyelték, hogy mikrovaszkuláris endothelsejtekben 10-15-ször nagyobb mennyiségben vannak jelen HSPG-k, mint a makrovaszkuláris endothelsejtekben. Az endothelsejtek felszíni HSPG-inek eltávolítása gátolja a neovaszkularizációt (Cavari és Vannucchi, 1993). Az

angiogenezis

HSPG-függő

szabályozása

részben

összefügg

az

angiogenetikus növekedési faktorok kötő kapacitásával és aktivitásuk módosításával. Például a tisztított perlecan fokozza az FGF-2-függő angiogenezist, míg más HSPGknek nincs hatásuk az angiogenezisre (Knox és Whitelock, 2006). A NIH 3T3 sejtek felszínén túlexpresszálódó syndecan-1 gátolja a FGF-2-indukált sejtproliferációt. Ezzel ellentétben a syndecan-1 a mátrixhoz kötődve stimulálja az FGF-2-közvetített sejtnövekedést. Azonban olyan mutáns sejteknél, melyek deficiensek sejtfelszíni HSPGre, a szolubilis syndecan és a glypican a heparin/HS-indukált FGF2-receptorkötést gátolja. Ez azt jelenti, hogy a szolubilis HS eltávolítja a sejtfelszínről az FGF2-t, vagyis vetélkedik a sejtfelszíni kötött HS-sel. Ezek az adatok azt sugallják, hogy az angiogenesist negatívan befolyásoló

34

hatások inkább a szolubilis HSPG-k vagy GAG-ok angiogenetikus növekedési faktorkötésével magyarázhatók, mintsem a sejthez társult HSPG-k hatásával. A receptorkötést módosító kapacitáson kívül a HSPG-k hatással lehetnek az angiogenesisre azáltal, hogy megvédik az angiogenetikus növekedési faktorokat a hőtől és a proteolitikus bomlástól, valamint növelik diffúziós hatósugarukat (Saksela és mtsai, 1988). Végül az ECM-ben levő HSPG-k az angiogenetikus

növekedési faktorok

rezervoárjaként szolgálhatnak, amelyek így magas helyi koncentrációt elérve az endothelsejtek hosszú távú stimulálását biztosítják (Mongiat és mtsai, 2001). Az a megállapítás, hogy az endothelsejtek HSPG-t expresszálnak az angiogenezis során, nagy jelentőségű. Ennek a mechanizmusnak a szabályozása különböző szinteken juthat érvényre: a HSPG molekulák típusainak kvantitatív és kvalitatív differenciált expressziója révén, a GAG oldalláncok összetételének változatossága révén, illetve a HSPG-k sejtfelszínről történő indukcióján és mobilizációján keresztül érvényesül. (3. ábra)

3. ábra: HSPG-k és a növekedési faktorok közötti összefüggés az angiogenezisben.

35

4. CÉLKITŰZÉSEK A fentiekben vázolt adatok alapján vizsgálataink a következő kérdések köré csoportosulnak: 1. Hogyan változik mennyiségében és lokalizációjában az agrin expressziója a cirrhotikus májban, összehasonlítva normál májszövettel? 2. Változik-e az agrin expressziója humán hepatocellularis carcinomában (HCC) a normál májszövethez képest? 3. Kimutatható-e eltérés az agrin mRNS és fehérje expressziójában a HCC-ben és cholangiocarcinomában (CC)? 4. Kimutatható-e agrin a jóindulatú májtumorokhoz sorolt hepatocellularis adenomában (HCA) és fokális noduláris hyperplasiában (FNH)? 5. A májdaganatokban észlelt kifejezett neoangigenezist kíséri-e fokozott agrin expresszió, felvetve ezáltal az agrin lehetséges szerepét neoangiogenezisben? 6. Található-e összefüggés az agrin-expresszió és a tumorok (HCC, CC) differenciáltsága között?

36

5. ANYAG ÉS MÓDSZER 5.1. Beteganyag A Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében archivált valamint újonnan gyűjtött humán májmintákat használtuk fel vizsgálatainkhoz. Összességében 104 primer májtumor (35 HCC, 35 CC, 14 HCA, 20 FNH) és környező normál vagy cirrhotikus máj, valamint 10 balesetben vagy nem májbetegség miatt elhunyt emberből származó normál májszövet került feldolgozásra (2.táblázat). A humán vizsgálatokat a betegek írásos hozzájárulásával és az illetékes etikai bizottságok engedélyének birtokában végeztük (TUKEB engedély 2/2004). A HCC-t illetően 19 jól differenciált, 11 közepesen differenciált, valamint 5 rosszul differenciált esetet vizsgáltunk. A csoportosítás az Edmonson-Steiner féle klasszifikáció alapján történt (G1-G3). A 35 eset közül 15 esetben a hepatocellularis carcinoma cirrhosis talaján fejlődött ki. A vizsgált betegek átlagéletkora 64,8 (42-82), a férfi/nő arány 27/8 volt. A CC-ket intrahepatikus (n=7), Klatskin tumor (n = 9), valamint extrahepatikus (n = 19) csoportokra osztottuk. A sebészileg eltávolított tumormintákat a környező nem tumoros szövetekkel együtt, valamint a normál máj mintákat 10% neutrális pufferolt formalinban fixáltuk 24 órán keresztül, utána dehidráltuk és paraffinba ágyaztuk. A rutin hisztológia, a morfológiai elváltozások kimutatása és a tumor grade megítélése hematoxilin-eozinnal (HE) festett 3-5 µm-os metszeteken történt. Diagnózis céljából a következő festéseket is elvégeztük: alciánkék-PAS, Shikata-féle orcein, picrosirius-vörös. Molekuláris biológiai vizsgálatokra a minták egy részet RNA-laterben (Sigma, St. Louis, MO, USA) (13 HCC, 13 HCC tumormentes környező májszövet, 9 CC, 7 CC tumormentes környező májszövet, 10 normál máj) fixáltuk, vagy folyékony nitrogénben történt fagyasztás után -80°C-on archiváltuk.

37

2. táblázat. A vizsgálatokhoz használt beteganyag.

Vizsgált csoport

CC

Eset Kor

Nem 12M/23F

Intrahepatikus típus Klatskin típus Extrahepatikus típus

35 7 9 19

61,56 53,14 61 64,36

HCC

35

64,83

3M/4F 2M/7F 7M/12F 27M/8F

24

6M/4F

I

II

a. cirrhotikus talajú HCC

15

b. nem cirrhotikus talajú HCC

20

1. jól differenciált HCC (G1)

19

2.közepesen differenciált HCC (G2)

11

3. rosszul differenciált HCC (G3)

HCA FNH Normál máj Összesen

5 14

20 10 114

5.2. Módszerek 5.2.1. Fehérjeexpressziós vizsgálatok 5.2.1.1. Immunhisztokémiai vizsgálatok A formalinban fixált, paraffinba ágyazott anyagok antigén feltárása a deparaffinálást követően proteáz emésztéssel (0,01% tripszin, 10 perc, szobahőn) vagy mikrohullámú feltárással történt. Az agrin antigén-feltárása mikrohullámú sütőben, DAKO antigénfeltáró oldatban (DAKO Cytomation, Glostrup, Dánia) történt. Ezt követően az endogén peroxidáz aktivitásának gátlását 3%-os hidrogén peroxiddal (10 perc) végeztük. Az antitest aspecifikus kötődését ló szérum (Novocastra, New Castle, UK) inkubálással blokkoltuk (20 perc, szobahőn). 1:100 hígításban használtuk a monoklonális agrin ellenes antitestet (clone 7E12, MAB 458, Chemicon International Inc., Temecula, CA, USA), melyet egy glomerulus bazális membránból izolált HSPG ellen termeltettek Kemeny és msai (1998). Az antitest specifitását munkacsoportunk tömeg-spektrometriával igazolta (Tatrai és mtsai, 2006). A további antitesteket az alábbi hígításokban használtuk: monoklonális laminin, (clone: Lam89) 1:500 (Novacastra, New Castle, UK), monoklonális CD34 (clone QBEnd/10) 1:80 (Novocastra), monoklonális Ki67 (clone MIB-1) 1:120 (DAKO), monoklonális CK7 (M7018, DAKO)

38

1:600, monoklonális CK19 (RCK108, DAKO) 1:100. Másodlagos antitestként peroxidáz-jelölt IgG-t (DAKO) és biotinilált IgG-t (Vectastain Elite ABC Kit, Vector Laboratories, USA) használtunk 1:200 hígításban, 30 percig szobahőn. Biotinilált másodlagos antitest alkalmazása esetén ezt az avidin-biotin-komplexszel (ABC) történő inkubálás követte (30 perc szobahőn). Az agrin esetében az immunreakció érzékenységét biotinilált tiramiddal fokoztuk a Merz és munkatársai (1995) által leírt módszer szerint (7mM biotinilált tiramid törzsből 1:125+0,033% H2O2, 10 min) (4. ábra). Ismételt ABC reakció után az immunreakciót 0,05 mg/ml 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) (Biogenex HK 129-5K, San Ramon, USA) vagy diaminobenzidin (DAB) (Genetex, San Antonio, USA) kromogénekkel hívtuk elő. Háttérfestésként hematoxilint alkalmaztunk és glicerines fedőanyaggal fedtük a metszeteket. Pozitív kontrollként humán vesét használtunk, míg negatív kontrollként az elsődleges ellenanyaggal való inkubálást kihagytuk és az előhívórendszer specifitásának bizonyítására az elsődleges ellenanyagnak megfelelő nem immunszérumot használtunk az elsődleges ellenanyagnak megfelelő hígításban.

39

4. ábra. A biotinilált tiramidos immunhisztokémiai reakció vázlata. Az elsődleges, ill. biotinilált másodlagos antitestet és ABC-t követően a hozzáadott biotinilált tiramid torma-peroxidáz hatására H2O2 jelenlétében aktiválódik. Az aktivált biotinilált tiramid hozzákötődik a minta fehérjének tirozin oldalláncaihoz, és ABC-vel újra amplifikálható.

5.2.1.2. Immunfluoreszcens vizsgálat

A fagyasztott metszeteket metanol-aceton módszerrel fixáltuk (15 perc metanol –20°Con, 3 másodperc aceton), majd 20 percig blokkoltuk 5% BSA – PBS oldattal (pH:6.5). A primer antitestek a következőek voltak: poliklonális agrin 2µg/ml (R&D Systems, Abingdon, UK), poliklonális laminin 1:200 (DAKO), αν-integrin 10µg/ml (clone P2W7, R&D Systems), poliklonális bFGF 1:50 (R&D Systems), smooth muscle α-actin (SMA) 1:100 (clone 1A4, DAKO). A primer antitest reakcióját az Alexa Fluor (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) másodlagos antitesttel tettük láthatóvá. Az előhívást mosási lépések követték, a vizsgálandó mintákat floureszcens fedővel (DAKO) fedtük és BioRad MRC 1024 konfokális lézer scanning mikroszkóppal vizsgáltuk (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Pozitív kontrolként humán veseszövetet használtunk, míg negatív kontrolként primer antitest helyett 5% BSA-val inkubáltuk a metszeteket.

5.2.1.3. Morfometriai elemzés Az

agrin

immunhisztokémiai

reakciókat

fénymikroszkóp

segítségével

fotódokumentáltuk (200X nagyítás, Olympus BX microscope). Tíz, egymást nem fedő területet értékeltünk. Az agrin immunreakció mennyiségi meghatározására a Leica QWin software-t (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd., Cambridge, UK) használtuk fel. Az immunpozitív területet kijelölve végeztük el a méréseket. A vörös, zöld, kék összetevők alapján állítottuk be a küszöbértékeket, amelyeket minden metszet esetében állandónak fogadtunk el az összevethetőség érdekében.

40

5.2.1.4. Proteoglikán izolálása A proteoglikán-izolálás azonos mennyiségű fagyasztott mintákból (2 HCC, 2 CC, 1 normál máj) történt Lyon és munkatársai (1994) módszere alapján. A mintákat 10ml homogenizáló pufferben (50 mM/L Tris-HCl, [pH 7.4], 10 mM EDTA, 5mM Nethylmaleimid [NEM], 0.5mM phenylmethylsulphonyl fluoride [PMSF], 3.4M NaCl, 5% Gordox) történő homogenizálás után inhibitorokat (5 mM NEM, 0.5 mM PMSF, 0,001%-os tripszin inhibitor, 5%-os Gordox) tartalmazó extraháló pufferrel (4 M guanidin-HCl, 50 mM Na-acetát, 1% Triton X-100) felszuszpendáltuk és 2 napon át rázattuk 4°C -on. Majd 4°C -on, 30 percig centrifugáltuk 11000 rpm-el, ezt követően a felülúszót dializáltuk az extraháló pufferból 7 M-os urea pufferbe (10 mM Tris pH:7.4, 0.5% Triton X-100, 0.5 mM N-etilmaleimid, 0.5 mM PMSF, 0.001% tripszin inhibitor). Minden alkalommal megmértük a vezetőképességet és összehasonlítottuk az eredeti 7 M-os urea puffer vezetőképességével. Amint az eredeti oldat vezetőképessége megegyezett a végső oldat vezetőképességével, ioncserélő oszlopkromatográfiát végeztünk a proteoglikán elválasztás céljából DEAE-cellulóz (diethylaminoethyl cellulose) oszlopon. Az izolált anyagok tárolása -80°C-on történt. További analízishez a proteoglikán frakciót abszolút alkohollal kicsaptuk, lecentrifugáltuk (12000 rpm, 4°C, 10 perc), 70% alkohollal mostuk és újra centrifugáltuk. Vákuumban történő beszárítás után a proteoglikánt 3-15%-os poliakrilamid gradiens gélen futattuk meg. A futtatást követően Alcian kék 8GX-el és Coomassie Brillant kék oldattal festettük meg a gélt.

5.2.1.5. Western blot analízis A western blotthoz poliakrilamid gélen elválasztott fehérjéket elektrotranszferrel nitrocellulóz membránra (Bio Rad, Hercules, CA, USA) blottoltuk. A blottolás 330 mA–rel 90 percig tartó elektrotranszferrel történt. A membránt TBS-ben oldott 5% (v%) BSA-val blokkoltuk. Az agrin monoklonális antitestet 1:500 hígításban, 5%-os BSAban higítva használtuk. A biotinilált másodlagos antitest és peroxidázzal jelölt ABC inkubálást követően az előhívást kemilumineszcenciával (ECL, Amersham Biosciences, UK) végeztük. A kiértékelést képanalizátorral (Kodak, Hemel Hempstead, UK) végeztük.

41

5.2.2. mRNS szintű expressziós vizsgálatok 5.2.2.1. RNS izolálás

RNS izolálás RNA later-ben fixált mintákból A RNS izolálás RNA-laterben fixált (24 óra), majd –80 C°-on tárolt mintákból történt. A kiindulási szövet mennyisége egyenként 200 mg volt (13 HCC, 13 HCC tumormentes környező májszövet, 9 CC, 7 CC tumormentes környező májszövet, 10 normál máj). Homogenizálás után Trizol reagensben (Sigma, T 9424) inkubáltuk a mintákat szobahőmérsékleten (15 percig). Steril Eppendorf-csövekbe pipettáztuk át a folyadékot, majd 0,2 ml kloroform hozzáadása után vortexeltük és centrifugáltuk. Ezután a felülúszót, amely az RNS-t tartalmazta, kloroformmal tovább tisztítottuk, majd az RNS-t izopropanollal kicsaptuk, vortexeltük és tíz perc állás után újra centrifugáltuk. Ezután leöntöttük a felülúszót és 75 %-os etanollal mostuk, majd centrifugáltuk. Roche RNS tisztító kitből (Roche, Indianapolis, Indiana, USA) származó elúciós pufferben feloldottuk az RNS-t, DNáz-zal emésztettük, majd a Roche RNS-tisztító kitjével (Roche) tovább tisztítottuk, végül megmértük az optikai denzitását (O.D.) és az RNS koncentrációját a kapott folyadéknak. További felhasználásig a tisztított RNS-t -80°Con tároltuk. A teljes RNS épségét 2%-os agaróz gélen ellenőriztük. Reverz transzkripció Az RNS (1µg 10µl mixben) átírása M-MulV reverz transzkriptázzal (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) történt (10 perc 25ºC-on, 50 perc 42°C-on, és 5 perc 95ºC-on) RNáz inhibitor (Applied Biosystems) jelenlétében, Random Hexamerek (Applied Biosystems) felhasználásával. Az RT-PCR reakcióhoz használt reakcióelegy összetételét a 3. táblázat foglalja össze.

42

3. táblázat. Az RT-PCR reakcióhoz használt komponensek Komponensek

Térfogat

A komponenst gyártó cég

RT Puffer

2 µl

Boehringer 145376

Hexamer

0,5 µl

Applied Biosystems, CA, USA

dNTP mix

0,5 µl

Roche D 8220

20 U/ µl RN-áz gátló

0,5 µl

Applied Biosystems, CA, USA

50U/ µl Reverz

1 µl

Applied Biosystems, CA, USA

dH2O

4,5 µl

Eppendorf 0032006159

RNS templát

1 µg

Összesen

10 µl

Transzkriptáz

5.2.2.2. Primertervezés és grádiens PCR A kísérletek elvégzéséhez a PubMed adatbázisból rendelkezésre álló szekvenciák alapján a Primer Expressz 2.00 program (ABI) segítségével megterveztük a lehetőségek szerinti legideálisabb primereket. A tervezésnél figyelembe vettük, hogy bizonyos fehérjéknek több transzkripciós variánsa is létezik; ezeknél olyan primereket használunk, amely valamennyi transzkripciós variáns expressziójának kimutatására alkalmas. A PCR-hez megkerestük az optimális primer kötődési hőmérsékletet grádiens PCR-rel. Ehhez a reakcióhoz MgCl2-at tartalmazó PCR puffert (Roche J 0051), dNTP mixet (Applied Biosystems, D8220), forward és reverz primert, AmpliTaq Gold enzimet (Roche, G 0448), desztillált vizet (Eppendorf, 0032006159) és a korábban előállított cDNS-t használtuk fel. A reakció végtérfogata 25 µl. Az azonos tartalmú PCR csöveket úgy helyeztük el a készülékben, hogy 50°C és 69,7°C közötti hőmérsékleten történjen meg a primer kötődés. A reakció paraméterei: 95°C-on 10 perc, 95°C-on 20 másodperc, 60°C-on

60 másodperc, 72°C-on 60 másodperc, és 4°C Ciklusszám: 40. A

grádiens PCR reakcióelegy komponenseit a 4. táblázatban tüntettük fel.

43

4. táblázat. A grádiens PCR reakcióelegy komponensei Komponensek

Térfogat

A kompnenst gyártó cég

10x PCR puffer MgCl2dal

2,5 µl

Roche J 0051

10mM dNTP mix

0,5 µl

Applied Biosystems, D8220

25 µM forwar primer

0,5 µl

25 µM forwar primer

0,5 µl

5U/ µl AmpliTaq Gold

0,5 µl

Roche G0448

dH2O

19,5 µl

Eppendorf 0032006159

cDNS

1 µl

Összesen

25 µl

Enzim

Agaróz gélelektroforézis A grádiens PCR reakciók során kapott PCR termékeket 2%-os agaróz gélben futtattuk meg (5. ábra). A gélkészítésnél 1 g agarózhoz (GIBCO 15510-019) 50 ml 1xes Tris borát EDTA (TBE) puffert adtunk, majd forralással feloldottuk az agarózt és 2,5 µl etídium-bromidot (BIO-RAD 161 0433) adtunk hozzá. Gélöntő formába öntöttük, szilárdulás után pedig a gélt 1x-es TBE pufferrel feltöltött futtatókádba tettük és a létrehozott zsebekbe bemértünk 12 µl előre előkészített mintát. Az előkészítés úgy történt, hogy 10 µl mintához 2 µl futtató puffert adtunk (Novagen 69180). A mintákkal párhuzamosan a gélre 5 µl DNS létrát (Novagen 70539) vittünk fel. A futtatás 100 V-on 40 mA áramerősség mellett 20-30 percig történt. Ezután a SYNGENE MultiGenius Bio Imaging rendszerével, a GeneSnap szoftver felhasználásával fotódokumentáltuk a gélt. Ez alapján azt tapasztaltuk, hogy a primer optimális kötődési hőmérséklete 60°C (5. ábra). A későbbiekben elvégzett real-time RT PCR reakcióban ezt állítottuk be primer kötődési hőmérsékletként.

44

5. ábra. A grádiens PCR termékek 2%-os agaróz gélben futtatva: 1. 50°C

2. 51.4°C

3. 55.5°C 4. 60.8°C 5. 66°

6. 69.7°C

5.2.2.3. mRNS expresszió vizsgálata real-time RT-PCR módszerrel A real-time PCR reakciókhoz 2 µl cDNS-oldatot használtunk, a méréseket ABI Prism 7000 készüléken (Applied Biosystems) végeztük. Minden egyes PCR reakciót 25 µl reakcióelegyben, SYBR Green PCR Master Mix (AB4309155, Foster City, USA) felhasználásával végeztünk. A primer szekvenciák az alábbiak voltak: AGRN (GI:51459422, 149bp), forward 5’-CATGGCTGTGTTCTTCATGTGTT-3’ 23, reverse 5’-GGTCATTCTGAGACAAGGACGACT-3’ 24; gliceraldehid 3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) (GI:7669491, 141bp) forward 5’-CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT-3’ 23, reverse 5’-TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT-3’ 22). A mérések 96-os plate-eken, triplikátumokban történtek: 2 percig 95°C-on, majd 40 cikluson keresztül 95°C-on 20 másodperc, 60°C-on 30 másodperc és 72°C-on 30 másodperc. Az adatok elemzéséhez és a relatív expresszió statisztikai kiértékeléséhez a REST-programot (relative expression software tool, www.wzw.tum.de/gene-quantification) használtunk, a génexpressziót minden gén esetében a GAPDH háztartásgénhez mint referenciagénhez viszonyítottuk. A relatív expressziót az alábbi képlet alapján számítottuk ki:

45

R= a relatív expresszió E =a PCR reakció hatékonysága (azaz ciklusonként észlelt PCR növekedés szorzója. CP= crossing point, az a ciklusszám, ahol az RNS mennyisége meghaladja a detektálhatóság küszöb (treshold) értékét. t - treshold, küszöbérték: exponenciális fázisban; Ct – treshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája ezt a szintet – a kiindulási DNS mennyiséggel arányos; A PCR termékek méretének ellenőrzésére a reakció termékekből 10 µl-t futtattunk 2%-os agaróz gélen, majd etídium-bromidos festéssel tettük láthatóvá az amplikonokat (6. ábra).

A

B

6. ábra. Az (A) ábrán az agaróz gélen futatott real-time RT-PCR termékek láthatók. (B) A termékek olvadáspont görbéje látható.

5.2.2.4. Statisztikai kiértékelés

46

A statisztikai kiértékelést a GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Inc. San Diego,

CA,

USA)

software

segítségével

végeztük.

A

csoportok

közötti

összehasonlításra a Mann-Whitney U tesztet alkalmaztuk. A különbséget p <0,05 esetén tartottuk szignifikánsnak.

47

6. EREDMÉNYEK

6.1. Agrin fehérje expresszió vizsgálata immunhisztokémiai módszerrel 6.1.1. Agrin expresszió ép és cirrhotikus humán májszövetben A normál májban, illetve tumor melletti ép májszövetekben az agrin a portális térben, az erek és az epeutak bazális membránjában fordult elő. A májparenchymában a szinuszoidok mentén nem volt agrin pozitivitás. A reakció a centrális vénák körül sem mutatott pozitivitást (7.A. ábra). A vizsgált HCC-k 42.8%-a cirrhotikus talajon alakult ki. A cirrhotikus májszövetben az agrin expresszió a májparenchymában és a szinuszoidok mentén nem volt megfigyelhető, viszont erős pozitivitás volt látható a kötőszövetes sövényekben, a portális erek és a felszaporodott epeduktusok bazális membránjában (7.B. ábra). Jellegzetesen a cirrhotikus nodulusok széli részen duktuláris reakció volt megfigyelhető, a ductusok körül erős agrinexpresszió volt látható.

A

B

7. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja (A) normál (200x, AEC) és (B) cirrhotikus májban (400x, AEC). A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

6.1.2. Agrin expresszió hepatocellularis carcinomában

48

Az agrin protein expressziót 35 formalinban fixált, paraffinba ágyazott HCC-n vizsgáltuk. Mindegyik tumor minta tartalmazott ép vagy cirrhotikus peritumorális májszövetet.

A HCC-ben erős agrin expresszió volt megfigyelhető az újonnan

képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában. A tumorsejtek nem tartalmaztak agrint (8. ábra). A peritumorális ép és cirrhotikus szövet nem mutatott lényeges eltérést a normál, illetve cirrhotikus májszövethez képest. Az agrin neovaszkuláris BM lokalizációjának megerősítésére végeztük a CD34, mint endothel marker expressziójának kimutatását. A vártnak megfelelően a CD34 expressziója megegyezett az agrin protein expressziójával a HCC-ben (8.D. ábra). Az agrin expresszió nem mutatott összefüggést a tumor differenciáltsági fokával. Ellentétben az agrin expressziójával, a laminin az egész tumor stromában kimutatható.

A

B

C

D

8. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja (A) cirrhotikus talajú HCC 200x, AEC (B, C) HCC-ben (600x, AEC). (D) CD34 reakció a HCC-ben (600x, DAB). A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

49

6.1.3. Az agrin expressziója más kötőszöveti fehérjékkel kolokálizációban. Más szövetekhez hasonlóan az agrin a májban a lamininnal együtt fordul elő a bazális membránokban (9.A. ábra). Az agrin-pozitív bazális membránban a bFGF fehérje felhalmazódása is látható. (9.B. ábra). Nemcsak a növekedési faktor kötődik az agrinhoz, de az agrin maga is ligandként szolgál azon sejtfelszíni receptorok számára, amelyek a bazális membránhoz kötődnek, elsősorban az αν-integrinen keresztül. Az ανintegrin az endothel és epeúti epithelsejtekben expresszálódik, és kapcsolatban volt az agrinnal (9.C,D. ábra). Az epeutakban az αν-integrin immunpozitivitást a sejtek bazolaterális felszínének egész hosszában megfigyeltük (9.D. ábra), ami azt sugallja, hogy az αν-integrinnek a bazális membrántól független szerepe is van. Az αν-integrint a daganatsejtek is termelik, de azok az agrint nem koexpresszálják (9.C. ábra). Ennek ellenére úgy tűnik, hogy az agrin és az αν-integrin valószínűleg kapcsolatban áll egymással a bazális membránban.

A

B

C

50

D

9. ábra. Az agrin lehetséges molekuláris partnerei. Kettős immunfloureszcens vizsgálat fagyasztott humán HCC mintákon (A-C) és a cirrhotikus májszövetben (D); konfokális felvételek. Piros: agrin (R&D System), zöld: a képen látható feliratoknak megfelelő struktúrákat jelöli, kék: sejtmag. Az összeadott képekben, a legalsó sorban a sárga szín kolokalizációt/átfedést jelent. Az agrin a bazális membránban a lamininhoz kötődve immobilizálódik (A); az agrin képes kötni FGF-2 szerű növekedési faktorokat (B). (C) A tumor vérerekben az endothelsejtek által expresszált αν-integrin (vékony nyíl a középső soron) receptorként szerepelhet a BM-ban expresszálódó agrin számára (vastag nyíl a felső soron). (D) A biliaris epithel sejtek a bazolaterális membrán egész hosszában expresszálják az αν-integrint (bazális felszín: vékony nyíl; laterális felszín: nyílhegy). Az agrin a bazális felszínen látható. Hosszmértékek: a: 50µm, b:25µm, c, d: 20µm.

6.1.4. Agrint termelő sejtek májelváltozásokban Szemmel láthatóan az agrin reakció erőssége az artériák és vénák falaiban erősen korrelál az érfal izomrétegének vastagságával. Az érfal simaizomsejtei teljes átfedést mutatnak az agrin felhalmozódásával (10. ábra). Ennek alapján úgy tűnik, hogy a simaizomsejtek szekretálják az agrint a sejteket burkoló bazális membránba, és az is elképzelhető, hogy az endothelium bazális membránjába is. Noha az epeutakat nem veszik körül szorosan a simaizom-aktin (SMA) - pozitív sejtek, ennek ellenére az epeutakat övező bazális membrán erős agrin- immunreakciót mutat. Ezért, feltételezhető, hogy az epeúti hámsejtek is termelnek az agrint.

51

10. ábra. Az agrint termelő sejtek a májelváltozásokban.

Kettős

immunfluoreszcencia

fagyasztott

cirrhotikus

humán

máj

mintákon.

Piros: agrin (R&D System), zöld: az SMA, kék: sejtmag. Az agrin és az SMA immunreakció átfedést mutat a vérerek

falaiban.

Ennek

alapján

következtettünk arra, hogy a vérerek falában az agrint elsősorban az érfal simaizomsejtjei termelik. Minthogy az epeutakban

nem

látható

SMA+

reakcíó, így itt feltehetőleg az epeúti hámsejtek termelik az agrint. Bár: 50.

A tumorok kapillárisainak bazális membránjában az agrint a stróma SMA+ myofibroblasztjai, az endothelsejtek, illetve mindkettő termelheti (11. ábra).

A

B

52

11. ábra. Kettős immunfluoreszcencia humán HCC fagyasztott metszeten. A HCC stromájában mind az SMA-pozitív mesenchymális sejtek mind a CD31-pozitív endotheliális sejtek a bazális membránnal határosak. Hosszmérték: 10 µm

6.1.5. Az agrin expressziójának vizsgálata a cholangiocarcinomában Immunhisztokémiával az agrin protein expressziót 35 formalinban fixált és paraffinba ágyazott CC-n vizsgáltuk. CC-s mintákból intrahepatikus (n=7), Klatskin (n=9), és extrahepatikus (n=19) CC-ket vizsgáltunk. Egyes minták a lokalizáció folytán nem tartalmaztak peritumorális szövetet. Az epeúti rákokat a WHO kritériumok szerint osztályoztuk jól differenciált (n=5), közepesen differenciált (n=24), valamint rosszul differenciált (n=6) tumorokra. Erős agrin expresszió figyelhető meg a tumorsejtekből álló glanduláris és trabekuláris szövetszerkezetet körülvevő bazális membránban a jól és közepesen differenciált CC-ákban (12.A, B, E ábra).

Ezzel szemben a rosszul differenciált

tumorokban, valamint a környezetbe betörő tumorszöveteknél az agrin expresszió fragmentálódott, csökkent, sőt el is tűnik (12.C, D ábra). A tumorsejtekben, valamint a lamininnal ellentétben a tumor stromájában sem volt megfigyelhető agrin expresszió. A CD34 endothel-marker expressziója megegyezett az agrin expresszióval a tumor stroma ereiben, viszont nem volt megtalálható a tumorban a glanduláris és trabekuláris struktúrákat körülvevő bazális membránban (12.F ábra).

53

12. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja (A, B) közepes diffenciált (G2), (C, D) rosszul differenciált (G3) és (E) jól differenciált (G1) CC-ben. (A 200x, B-E 600x, AEC) (F) CD34 immunreakció látható a jól differenciált (G1) CC-ben (600x, DAB). A nyilak a pozitív reakciót jelzik.

54

Az agrin immunhisztokémiai reakciónak morfometriai elemzése Az agrin-pozitív területek kvantitatív morfometriai elemzése az összterület százalékában a következő eredményeket hozta: Normál máj: 0.22 ± 0.029%, HCC: 1.55 ± 0.121%, CC: 3.72 ± 0.277%. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy CC-ben szignifikánsan (p<0,0001) több agrin expresszálódik, mint a HCC-ben. Mind a HCC, mind a CC szignifikánsan (p<0,0001) több agrint tartalmaz, mint a normál máj (13.A. ábra). A jól és közepesen differenciált CC-ben az immunpozitív területek aránya szignifikánsan (p< 0.0001; p< 0.0001) magasabb volt a rosszul differenciált tumorokhoz viszonyítva. A jól és közepesen differenciált tumorok között nem volt szignifikáns különbség (13.B. ábra).

13. ábra. Az agrin immunhisztokémiai reakciónak morfometriai elemzése HCCben, CC-ben és normál májban. (A) Normál, CC és HCC csoportok összehasonlítása. (B) Különböző differenciáltságú CC-k összehasonlítása. A * a csoportok közötti szignifikáns eltérést jelöli.

6.1.6. Az agrin expresszió vizsgálata hepatocellularis adenomában Tizennégy hepatocellularis adenomában (HCA) vizsgáltuk az agrin fehérje expressziót immunhisztokémiai módszerrel. Az agrin expressziója a tumorokon belül eltéréseket mutat. Egyes területeken erős immunpozitivitás látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén (14.A,C. ábra), míg máshol a tumorszövet teljesen negatív

55

(14.A,D.

ábra).

A

CD34

párhuzamos

metszeteken

az

előző

kísérletekben

kolokalizációt mutatott az agrinnal, ezért hasonló vizsgálatokat végeztünk az adenomákban. A HCC-vel szemben az adenomákban az agrin és a CD34 festődés nem teljesen fedi egymást (14.A,B. ábra). A CD34 egy korábban megjelenő markernak mutatkozik a „neovaszkularizáció” során.

A

B

Agrin C

CD34 D

Agrin

Agrin

14. ábra. Az agrin (A) és CD34 (B) immunhisztokémiai reakciója párhuzamos metszeteken a HCA-ban. Egyes területeken erős immunopozitivitás látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén (A, C), míg máshol a tumorszövet teljesen negatív (A. D). A: 100x, AEC. B, C, D: 200x, AEC. A nyilak a pozitív reakciót jelzik. 6.1.7. Az agrin expresszió vizsgálata fokális noduláris hyperplasiában Az FNH szövettani jellegzetessége az igen kifejezett centrális, gyakran csillag alakú heg; a hepatocytákra igen hasonlító sejtek trabeculákat képeznek, köztük portális

56

traktusoknak megfelelő képletek láthatóak. Az epeút proliferáció igen kifejezett. Közepesen erős agrin expresszió figyelhető a proliferáló epeútak bazális membránjában. Centrálisan szembetűnő nagyszámú vaskos falú ér, melyek BM-ja is agrin pozitiv. A szinuszoidok mentén agrin expresszió nem látható.

A

B

15. ábra. Az agrin immunhisztokémiai lokalizációja a FNH-ban (A 200x, B 600x, AEC). Az agrin expressziója (nyilak) proliferáló epeutak és az erek BM-jében figyelhető meg a FNH-ban.

6.2. Az agrin fehérje expresszió vizsgálata Western Blot technikával Két gramm szövetből izolált proteoglikán azonos hányadát futtatva, mind a HCCben, mind a CC-ben a normál máj proteoglikán tartalmának sokszorosa detektálható. A 16. ábrán láthatóak a Western blottal kimutatott eredmények. Az agrin Western bloton azt láthatjuk, hogy CC-ben erősebb a reakciók mint HCC-ben; a normál májban összehasonlítva CC-vel és a HCC-vel nem volt látható az agrin fehérje expresszió.

16. ábra. Agrin fehérje-expresszió detektálása Western blot technikával normál májban (1), HCC-ben (2) és CC-ben (3).

57

6.3. Az agrin mRNS kimutatása real time RT-PCR-vel Az „Anyagok és módszerek” fejezetnek megfelelően, a real-time-RT PCR-rel kapott adatokat egy relatív kvantifikációra alkalmas szoftver segítségével értékeltük ki. Referencia génként a GAPDH-t használtuk. Az 17. ábrán látható, hogy HCC-ben a normál májhoz képest az agrin mRNS expressziója fokozott, de nem mutatott szignifikáns változást. A CC mintákban az agrin szignifikánsan magasabb volt mind a normál májban (10,75-szer), mind a HCC-ben (3,4-szer). CC-t környező tumormentes szövetekben az agrin mRNS szintje magasabb, mint a normál májban. A CC-ben, annak tumormentes környezetéhez viszonyítva 2.8szoros emelkedést mértünk, bár ez statisztikailag nem volt szignifikáns (17. ábra). A PCR vizsgálat megerősítette az immunhisztokémiai vizsgálat eredményeit: az agrin fehérje- és mRNS- expressziója CC-ben szignifikánsan magasabb volt a normál májhoz és HCC-hez képest, és emelkedést mutatott a környező tumormentes szövetekhez viszonyítva. A real-time RT-PCR eredmények számértékeit a 4. táblázatban foglaltuk össze.

* *

17. ábra. Az agrin expresszió real-time RT-PCR reakció eredmények alapján kimutatott mennyiségi eltérései különböző csoportokban. Az oszlopok az agrin mRNS expresszió n-szeres mennyiségi különbséget ábrázolják a vizsgált csoportokban

58

a kontrollnak vett csoportokhoz képest. Minden esetben az aláhúzott csoportot hasonlítjuk a másik csoporthoz; N: normál máj, HCC: hepatocellularis carcinoma, CC: cholangiocarcinoma, kHCC: HCC tumormentes környező májszövet, kCC: CC tumormentes környező májszövet. *- szignifikáns különbséget jelöli. 4. táblázat. Az agrin mRNS expresszió mennyiségi összehasonlítása real-time RTPCR reakció alapján. Csoportok n-HCC n-CC HCC-CC n-kHCC kHCC-HCC kCC-CC n-kCC kHCC-kCC

Agrin relatív mRNS expresszió U 2,271 NS, P=0,089 U 10,755 S, P=0,001 U 3,374 S, P=0,022 U 1,723 NS, P=0,238 D 1,003 NS, P=0,85 U 2,807 NS, P=0,0545 U 1,838 NS, P=0,29 U 1,199 NS P=0,77

N: normál máj, HCC: hepatocellularis carcinoma, CC: cholangiocarcinoma, kHCC: HCC tumormentes környező májszövet, kCC: CC tumormentes környező májszövet. Az U – „ upregulált”, D- „ downregulált”, NS-nincs szignifikáns eltérés, S – szignifikáns eltérés,

59

7. MEGBESZELÉS A malignusan transzformált sejtek a gazdaszervezeten belül túlélésre, sőt szaporodásra és invázióra képesek. Ez jelzi, hogy a daganatsejtek mielőtt elpusztítják, azelőtt leigázzák a gazdaszervezetet, azaz áthangolják különböző sejtjeinek, sejtvonalainak

működését:

kikapcsolják

a

védekező

mechanizmusokat,

saját

szolgálatukba állítják a gazdaszervezet sejtjeit. Utóbbira példa a daganatnövekedés egyik domináns mozzanata, a tumormátrix-képződés folyamata, azaz a daganatsejtek sajátos

mikrokörnyezetének

kialakulása,

mely

nem

pusztán

a

tumorsejtek

gazdaszervezeten belüli túlélésének, de kontrollálatlan szaporodásának színtere. Ma már egyre sokasodnak az irodalomban azok a közlések, amelyek a tumormátrixot – ezen belül is elsősorban a proteoglikánok depozícióját – terápiás intervenciók célpontjaként jelölik meg, hangsúlyozván, hogy a gazdaszervezet stromális sejtjeinek áthangolódását kellene megakadályozni, vagyis gátolni a tumorsejteket túléltető mikrokörnyezet kialakulását. A HSPG-k alkalmasak számos szabályozó- illetve növekedési faktor kötésére, tárolására, képesek azokat aktiválni vagy inaktiválni, prezentálni, ko-receptorként felkínálni a tumorsejtek felszíni receptorai számára, így minőségbeli és mennyiségbeli változásaik új, a normálistól eltérő információk közvetítését eredményezhetik. Ilyen funkcionális változások tisztázásának előfeltétele a daganatos proteoglikán expresszió és az azt befolyásoló faktorok pontos feltérképezése. A megváltozott proteoglikán expressziónak mind a daganatok kialakulásában, mind pedig progressziójában szerepe lehet. A májbetegségekben a proteoglikánok képződésében és szerkezetében szembetűnő változás következik be. A bazális membrán HSPG családjába tartozó proteoglikánok közül egyesekről már bebizonyították, hogy fontos szerepük van a különböző típusú daganatok pathogenezisében. E csoport legnagyobb képviselőjéről, a perlecanról már leírták, hogy részt

vesz

a

tumor

terjedésében,

a

metasztázis-képződésben,

valamint

a

neoangiogenezisben. A perlecan mRNS szintje jelentősen emelkedett a humán metasztatizáló melanomában a normál szövethez képest. A kórosan expresszálódott perlecan a pericelluláris mátrixban lerakódik és megjelenése a melanoma sejtek erős

60

metasztatizáló képességével összefügghet (Marchetti és mtsai, 1993). A perlecan HS láncairól kiderült, hogy különböző növekedési faktorokkal (pl: bFGF) kölcsönhatásba lépve stimulálják a tumornövekedést és az érképződést (Aviezer és mtsai, 1994). Bebizonyították, hogy a perlecannak szerepe van az intrahepatikus CC (Sabit és mtsai, 2001), emlő (Iozzo és mtsai, 1994), petefészek, nyálmirigy (Kimura és mtsai, 2000), colon (Sharma és mtsai, 1998) valamint a prosztata rák (Jiang és Couchman, 2003) kialakulásban és terjedésben. Érdékes, hogy a perlecan C-terminális része, az endorepellin gátolja az angiogenesist (Mongiat és mtsai, 2003). A BMHSPG-k nemrég felfedezett másik tagjáról, a collagen XVIII-ról kimutatták, hogy egy fragmense, az endostatin mind in vivo, mind in vitro antiangiogenikus hatással bír (Marneros és Olsen, 2005). Kevesebbet

tudunk

az

agrinnak

daganatok

kialakulásában

és

progressziójában játszott szerepéről. Csupán a glioblastoma multiforméban a vaszkuláris barrier érésében és differenciálódásában való részvételét írták le (Rascher és mtsai, 2002). Mind az agrin, mind a perlecan megtalálható a BM-ban, és mindkettőt kódoló gén az 1. emberi kromoszoma rövid karján helyezkedik el. Az agrin C-terminális része a perlecanéhoz hasonló, ezért feltehetőleg a perlecanhoz hasonlóan szerepe lehet különböző sejtproliferációs folyamatokban. Számos vizsgálat feltárta a neuronalis agrin szerepét embriógenezis során (Kim és mtsai, 2007). Felnőttekben a non-neuronális szövetek közül a tüdőben és a vesében levő agrinnal foglalkoztak (Groffen és mtsai, 1998). Az agrin májban, ill. májbetegségek során bekövetkező mennyiségi és minőségi változásairól eddig nem jelent meg közlemény. Munkacsoportunkkal az agrin expresszióját vizsgáltuk a különböző májbetegségekben, elsősorban a primer májtumorokban. A normál májszövet egyik fontos jellemzője, hogy nagyon kevés proteoglikánt tartalmaz. Ezek többsége sejtfelszíni, illetve transzmembrán HSPG, és elhanyagolható az ECM proteoglikánok mennyisége. A formalin-fixált, paraffinba ágyazott normál humán májakon az agrin fehérje komponensét immunhisztokémiával detektáltuk. Az agrin az epeutak BM-jában, a portális artériák és vénák BM-jában volt erős intenzitással

61

kimutatható, míg a centrális vénában, a nyirokerek BM-jában immunohisztokémiai módszerrel nem volt detektálható. Az agrin immunhisztokémiai megjelenése a perlecanétól abban különbözik, hogy a perlecan periszinuszoidális pozitivitást is mutat a normál májban. A normál májszövetben látottakat összehasonlítva a májrák körüli, látszólag ép, cirrhosismentes májszövettel nem volt különbség az agrin immunhisztokémiájában. Cirrhotikus májban fokozódik az agrin depozíciója a proliferáló epeutakban. A fibrotikus szeptumokban megfigyelhető reakció (erek, epeutak BM) mellett a cirrhotikus göbök széli részen bizonyos sejtcsoportok körül megjelenik az agrin pozitivitás, ami a duktularis reakciónak felelhet meg. Maga a duktularis reakció a károsult

májszövetek

regenerációjának

részjelensége,

amelynek

következtében

periportális ill. cirrhotikus nodulusok széli részen levő őssejtek aktiválódnak és hepatocytákka differenciálódnak (Desmet és mtsai, 1995). Az agrin e nodulusok körüli megjelenésnek feltehetőleg szerepe lehet az őssejtek differenciálódásában. Egyes esetekben a cirrhotikus göbök közepén enyhe periszinuszoidális agrin pozitivitás jelenik meg amely a szinuszoidalis cirrhotikus májkárosodás egyik legsúlyosabb eseménye, ez vezet végső soron a hepatocyták elégtelen funkciójához . Kérdés, hogy az agrin mennyiségének és összetételének változása pusztán mint a szövetproliferáció egyik részjelensége értékelendő, vagy ennél többről van szó és ezek a változások hatással vannak a cirrhosis kimenetelére is. Több adat utal arra, hogy bizonyos proteoglikánok részesei a mátrixképződés szabályozásának. Ismert, hogy a decorin a kollagén rostokhoz kötődve gátolja azok érését, tehát a kötőszövetképzés gátlásának irányában hat. A decorin a TGFβl inaktiválására képes, mely a növekedési faktorról köztudott, hogy a fibrogenezis egyik fő stimulátora (Hildebrand és mtsai, 1994; Kovalszky és mtsai, 1998). Az FNH a máj daganatszerű elváltozásai közé tartozik. Jellemző, hogy a hepatocytákra igen hasonlító sejtek trabekulákat képeznek, körülöttük kifejezett epeútproliferáció látható. Az agrin itt a proliferált epeutak bazális membránjában található. Jellegzetes, hogy FNH-ban a nodulusok széli részén a duktularis reakció körül fokozott agrin pozitivitás látható. A proliferáló epeúti sejtek eredete nem tisztázott, szerepe lehet benne a differenciálódó őssejteknek.

62

A humán májtumorok esetében az agrin fehérje-expresszió fokozott, de megjelenése tumor típusától függően váltózó. A HCA-ban változatos az agrin expresszió. Egyes tumorok erős agrin pozitivitást mutatnak a tumor-szinuszoidoknak megfelelő képletek és az erek BM-je mentén. Ez a jelenség a tumoron belül is változó erősségű, a tumorok egyes részei teljesen negatívak. Ezzel ellentétben az immunhisztokémiai reakció CD34-gyel kiterjedtebb szinuszoidalis pozitivitást mutat az adenomákban. A CK7 viszont az adenomákon belül teljesen negatív, ami arra utal, hogy nincsenek bennük epeutak. A fentiekből következik, hogy az adenomán belüli neovaszkularizációs folyamatnak több lépcsője lehet. Ott, ahol csak a CD34 pozitivitás mutatható ki, csak az endothelsejtek képeznek érfalat, míg az agrinpozitív területeken már fokozottabb strukturális átrendeződés alakulhatott ki. A HCC-ben intenzív agrin fehérje-expressziót találtunk az újonnan képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában. A HCC-ben nincsenek epeutak, és vaszkularizáció indul meg a tumor területén. Az így kialakuló erek biztosítják a tumor tápanyagellátását. Ezen újonnan képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában agrin immunpozitivitás figyelhető meg. Az agrin neovaszkuláris BM lokalizációjának megerősítésére végzett CD34 és CD31, mint endothel-markerek immunohisztokémiai reakciója kolokalizációt mutatott az agrinéval a HCC-ben. Az agrin mint HSPG feltehetően képes kötni különböző növekedési faktorokat, beleértve az FGF-2-t is. Ennek bizonyítására végeztünk immunfloureszcens vizsgálatot a HCC-n FGF-2- és agrin-ellenes antitestekkel. Elképzeléseinknek megfelelően az agrin pozitív BM-ben az FGF-2-t találtunk. Az agrin-expresszió a tumor differenciáltságával nem mutat összefüggést HCC-ben, bár a jól differenciált HCC erős trabekuláltságának megfelelően nagyon erezett, ezért erősen agrin pozitív. Mindebből az következtethető ki, hogy az agrinnak szerepe van az angiogenesisben. Feltehetően az agrin HS láncai különböző növekedési faktorokat (bFGF, VEGF, stb) kötve stimulálják a neovaszkularizációt és a tumornövekedést. Ezen kívül az agrin azáltal is segítheti a neoangiogenesist, hogy a különböző növekedési faktorok agrinhoz való kötődése megvédi őket a proteolitikus bomlástól és a hőtől (Saksela és mtsai, 1988). Lehetséges, hogy az agrin nem csak HS láncaival vesz részt az angiogenetikus és proliferaciós folyamatokban, hanem közvetlenül vázfehérjéje

63

segítségével is, mivel ezzel kapcsolódni tud az integrinhez és a lamininhoz. Míg a laminin a HCC stromájában mind az erek BM-jében, mind a kötőszövetben előfordul, addig az agrin expresszió csak az erek BM-jére korlátozódik. A CC-ben erős agrin immunreakciót kaptunk. Az agrin immunpozitivitás a glanduláris szerkezetű tumorsejteket körülvevő BM-ra lokalizálódik. A tumor stromája az erek BM-je kivételével negatív volt. Az agrin fehérjeexpresszió intenzitása a tumor differenciáltságtól függően eltért. Magasan és közepesen differenciált tumorban, a tumorfészkek körüli BM-ben jóval erősebb agrin expresszió volt detektálható, mint rosszul differenciált tumorokban. A kevésbé differenciált tumorok egyre kevesebb agrint tartalmaznak, ami arra utal, hogy az agrin csökkenése a tumor progressziójával és nem a malignus transzformáció tényével függ össze. Itt az agrin eltünése a bazális membrán degradálódásával, az intraendothelialis kapcsolatok fellazulásával járhat együtt, és az endothelsejt migrációjának elindítása, az angiogén stimulus irányában hathat. A megfigyelt változások feltehetõen maguk után vonják a mikrokörnyezet módosulását, eltérő szabályozó faktorok kötődését és érvényre jutását a daganatos sejtek környezetében, elősegítve a daganatok növekedési autonómiájának kialakulását. Mind a real-time RT-PCR, mind a Western blot, mind pedig az immunhisztokémiai vizsgálatok arra utalnak, hogy a környező, illetve normál májhoz és a HCC-hez képest a CC-ben az agrin expresszió jelentősen fokozott. Az RNS- és fehérje-szintű vizsgálatok igen jól egyeztek egymással, ami arra utal, hogy a vizsgált mintákban az expresszió elsősorban a transzkripció szintjén szabályozódik. Mások közlése szerint előfordul, hogy viszonylag magas RNS szint mellett a fehérje nem íródik át, tehát számítani kell a transzláció szintjén ható szabályozó mechanizmusokra is (Benjamin és Moroni, 2007). Még nem tisztázott az agrin fokozott expressziójának a forrása. A CC-ben valószínű, hogy a tumorsejtek részben agrint termelnek, részben pedig olyan faktorokat, amelyek a környezet nem tumoros sejtjeit fokozott agrin-szintézisre késztetik. A fokozott agrin expresszió egyrészt különböző növekedési faktorok kötésével, koreceptorként közvetlenül segíti a tumor proliferációját, invázióját, ugyanakkor mintegy körülbástyázza a daganatot, lehetőséget nyújtva annak fokozott autonómiájára.

64

Összeségében eredményeink alapján elmondhatjuk, hogy az agrin expresszió kimutatható normál májban, cirrhotikus májban, HCA-ban, FNH-ban, HCC-ben, valamint CC-ben. A fokozott agrin expresszió HCC-ben és HCA-ban e fehérjének a kapillarizációban és a neovaszkularizációban betöltött szerepére utalhat. Elképzelhető, hogy CC-ben az agrin a tumor-progresszióban játszik fontos szerepet.

65

8. KÖVETKEZTETÉSEK 1. A normál humán májszövetben az agrin fehérje a portális terek ereinek és epeútjainak bazális membránjában fordul elő. A szinuszoidok mentén agrin nem expresszálódik. 2.

A cirrhotikus májszövetben az agrin fehérje-expresszió a felszaporodott

kötőszövetben a proliferáló epeutak és az erek bazális membránjában mutatható ki. A cirrhotikus májban - a normál májhoz hasonlóan - a parenchymában a szinuszoidok mentén nem volt megfigyelhető agrin pozitivitás. 3. A hepatocellularis carcinomákban (HCC) erős agrin expresszió figyelhető meg az újonnan képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában. 4. Az endothelt jellemző CD34 fehérje expresszió a HCC-ben kolokalizációt mutatott az agrin expresszióval. 5. A jól és közepesen differenciált cholangiocarcinomákban (CC) erős agrin expresszió jellemzi a tumorsejtek alkotta glanduláris és trabekuláris struktúrák körüli bazális membránt, amelyhez nem kapcsolódik CD34 pozitivitás. 6. Ezzel szemben a rosszul differenciált cholangiocarcinomákban, valamint a környezetet infiltráló tumorszövetben az agrin expresszió csökkent, fragmentálódott, sőt el is tűnt. 7. Sem a cholangiocarcinoma sejteiben, sem - a lamininnal ellentétben - a tumor stromájában nem volt megfigyelhető az agrin fehérje-expresszió. 8. Összességében az agrin fehérje-expressziója a HCC-ben fokozottabb, mint a normál májban, azonban a HCC-nél is magasabb a CC-ben. Az mRNS expresszió

66

vizsgálata hasonló eltérést mutatott és a Western blot analízis megerősítette az immunhisztokémiai módszerrel detektált fehérje-expressziós eredményeket. 9. Az agrin expressziója a tumorokon belül változatos expressziót mutat a hepatocellularis adenomákban (HCA). Egyes területeken erős immunopozitivitás látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén, míg máshol a tumorszövet teljesen negatív. 10. A fokális noduláris hyperpláziában (FNH) közepesen erős agrin expresszió figyelhető meg a proliferáló epeútak bazális membránjában. A centrálisan szembetűnő, nagyszámú vaskos falú ér bazális membránja is agrin pozitív, míg a szinuszoidok fala negatív.

67

9. ÖSSZEFOGLALÁS A heparánszulfát-proteoglikánok (HSPG) az ECM fehérjék családjába tartozó molekulák. Részben fehérje-, részben cukorláncaik részvételével aktív részesei a sejtműködés szabályozásának. A máj károsodása során a proteoglikánok mennyisége igen jelentősen változik. Mennyiségi és minőségi változásuk hozzájárul a daganatos fenotípus kialakításához. Az agrin egy multidomain HSPG, amely különböző szervek bazális membránjában található. Jelenleg kevés irodalmi adat áll rendelkezésünkre az agrin karcinogenezisben betöltött szerepéről. Munkánk során célul tűztük ki az agrin mRNS- és fehérje-expressziójának tanulmányozását egészséges májban és különböző májbetegségekben, elsősorban primer májrákokban. Az immunohisztokémiai vizsgálatokat 114 formalinban fixált, paraffinba ágyazott humán mintán (35 HCC, 35 CC, 14 HCA, 20 FNH, 10 normál máj) végeztük. Az agrin mRNS-expresszóját 52 sebészetileg eltávolított és RNA laterben fixált mintán vizsgáltuk (13 HCC, 13 HCC tumormentes környező májszövet, 9 CC, 7 CC tumormentes környező májszövet, 10 normál máj). A fenti vizsgálatok megerősítésére Western blot analízist végeztünk. A normál humán májban, illetve tumor melletti ép májszövetben az agrint a portális tér ereiben, az epeutak és a portális erek bazális membrán zónájában detektáltuk; a szinuszoidokban nem volt kimutatható agrin fehérje expresszió. A cirrhotikus májszövetben az agrin-expresszió a májparenchymában és a szinuszoidok mentén nem volt megfigyelhető, viszont erős pozitivitás volt látható a kötőszövetes sövényekben,

a

portális

erek

és

a

felszaporodott

epekanalikulusok

bazális

membránjában. A HCC-ben intenzív agrin fehérje expressziót találtunk az újonnan képződött kapillárisok és az erek bazális membránjában, amely a tumorok differenciáltsági fokával nem mutatott összefüggést. Erős agrin-expresszió figyelhető meg a tumorsejtekből álló glanduláris és trabekuláris szövetszerkezetet körülvevő bazális membránban a jól és közepesen differenciált CC-kben. Ezzel szemben a rosszul differenciált CC-ben, valamint a környezetbe betörő tumorszövetben az agrinexpresszió csökkent, fragmentálódott, sőt el is tűnt. A HCA-ban az agrin expressziója a tumorokon belül változatos expressziót mutat. Egyes területeken erős immunpozitivitás látható a szinuszoidoknak megfelelő képletek mentén, míg máshol a tumorszövet

68

teljesen negatív. A FNH-ban intenzív agrin expresszió figyelhető meg a proliferáló epeutak bazális membránjában. A fokozott agrin expresszió HCA-ban és HCC-ben e fehérjének a kapillarizációban és a neovaszkularizációban betöltött szerepére utalhat. Elképzelhető, hogy CC-ben az agrin a tumor-progresszióban játszik fontos szerepet.

69

10. SUMMARY Heparan sulphate proteoglycans mediate cell adhesion and control the activities of numerous growth and motility factors. They play a critical role in carcinogenesis and tumour progression. Agrin is a large, multidomain heparan sulphate proteoglycan which is associated with basement membranes of several tissues. Recently, the tissue expression of agrin was described in several organs, including the liver, under physiological conditions. So far, little is known about its role in malignancies, especially in primary liver tumours. Our goal, therefore, was to investigate mRNA and protein expression of agrin in primary liver tumors (HCC, CC, HCA and FNH) to analyze its involvement in tumorigenesis. The mRNA expression was measured on 52 surgically resected, RNA later fixed samples by real-time PCR method. Agrin immunostaining was carried out on 114 formalin fixed, paraffin-embedded surgical biopsy specimens (35 CC, 35 HCC, 14 HCA, 20 FNH, 10 normal liver). Western blot analysis on representative samples was also performed. Immunohistochemistry showed mild positivity around the bile ducts and the blood vessels within the portal area in normal liver, however, no expression within the hepatic lobules was found. HCC presented intense expression along the neovascular basement membrane. CC samples showed increased mRNA expression of agrin in comparison to both normal liver and HCC. Intense protein expression of agrin was observed in the tumor-specific basement membrane in well differentiated areas of CCs, which staining was fragmented, decreased or even disappeared in less differentiated fields and sites of infiltration. Western blot analysis confirmed the presence of increased agrin expression. In HCA, agrin expression was variable within the tumors. In the some fields agrin showed strong expression along the sinusoids, while elsewhere it was negative. In FNH intensive agrin expression was detected in the basement membrane of the proliferated bile ducts, while no agrin expression was observed along the sinusoids.

70

Agrin may play an important role in neoangiogenesis in human HCCs and HCAs, as part of the newly formed vasculature. In CCs, agrin is also thought to play an important role in tumour progression.

71

11. IRODALOMJEGYZÉK

Albores-Saavedra,J, L Murakata, J E Krueger, D E Henson, 2000, Noninvasive and minimally invasive papillary carcinomas of the extrahepatic bile ducts: Cancer, 89: 508515. Angelucci,A, M Bologna, 2007, Targeting vascular cell migration as a strategy for blocking angiogenesis: the central role of focal adhesion protein tyrosine kinase family: Curr.Pharm.Des, 13: 2129-2145. Arenson,DM, D M Bissell, 1987, Glycosaminoglycan, proteoglycan, and hepatic fibrosis: Gastroenterology, 92: 536-538. Aviezer,D, D Hecht, M Safran, M Eisinger, G David, A Yayon, 1994, Perlecan, basal lamina proteoglycan, promotes basic fibroblast growth factor-receptor binding, mitogenesis, and angiogenesis: Cell, 79: 1005-1013. Beasley,RP, L Y Hwang, C C Lin, C S Chien, 1981, Hepatocellular carcinoma and hepatitis B virus. A prospective study of 22 707 men in Taiwan: Lancet, 2: 1129-1133. Benjamin,D, C Moroni, 2007, mRNA stability and cancer: an emerging link?: Expert.Opin.Biol.Ther., 7: 1515-1529 Bezakova,G, M A Ruegg, 2003, New insights into the roles of agrin: Nat.Rev.Mol.Cell Biol., 4: 295-308. Biecker,E, H P Fischer, H Strunk, T Sauerbruch, 2003, Benign hepatic tumours: Z.Gastroenterol., 41: 191-200. Bosch,FX, J Ribes, M Diaz, R Cleries, 2004, Primary liver cancer: worldwide incidence and trends: Gastroenterology, 127: S5-S16.

72

Bowe,MA, K A Deyst, J D Leszyk, J R Fallon, 1994, Identification and purification of an agrin receptor from Torpedo postsynaptic membranes: a heteromeric complex related to the dystroglycans: Neuron, 12: 1173-1180. Bowe,MA, J R Fallon, 1995, The role of agrin in synapse formation: Annu.Rev.Neurosci., 18: 443-462. Broome,U, R Olsson, L Loof, G Bodemar, R Hultcrantz, A Danielsson, H Prytz, H Sandberg-Gertzen, S Wallerstedt, G Lindberg, 1996, Natural history and prognostic factors in 305 Swedish patients with primary sclerosing cholangitis: Gut, 38: 610-615. Burgess,RW, W C Skarnes, J R Sanes, 2000, Agrin isoforms with distinct amino termini: differential expression, localization, and function: J.Cell Biol., 151: 41-52. Castellot,JJ, Jr., M L Addonizio, R Rosenberg, M J Karnovsky, 1981, Cultured endothelial cells produce a heparinlike inhibitor of smooth muscle cell growth: J.Cell Biol., 90: 372-379. Cattaruzza,S, M Schiappacassi, A Ljungberg-Rose, P Spessotto, D Perissinotto, M Morgelin, M T Mucignat, A Colombatti, R Perris, 2002, Distribution of PG-M/versican variants in human tissues and de novo expression of isoform V3 upon endothelial cell activation, migration, and neoangiogenesis in vitro: J.Biol.Chem., 277: 47626-47635. Cavari,S, S Vannucchi, 1993, Glycosaminoglycans exposed on the endothelial cell surface. Binding of heparin-like molecules derived from serum: FEBS Lett., 323: 155158. Chakravarti,S, 2002, Functions of lumican and fibromodulin: lessons from knockout mice: Glycoconj.J., 19: 287-293.

73

Cheifetz,S, J A Weatherbee, M L Tsang, J K Anderson, J E Mole, R Lucas, J Massague, 1987, The transforming growth factor-beta system, a complex pattern of cross-reactive ligands and receptors: Cell, 48: 409-415. Cheng,J, J P Grande, 2002, Transforming growth factor-beta signal transduction and progressive renal disease: Exp.Biol.Med.(Maywood.), 227: 943-956. Cole,GJ, M Burg, 1989, Characterization of a heparan sulfate proteoglycan that copurifies with the neural cell adhesion molecule: Exp.Cell Res., 182: 44-60. Cole,GJ, W Halfter, 1996, Agrin: an extracellular matrix heparan sulfate proteoglycan involved in cell interactions and synaptogenesis. [Review] [86 refs]: Perspectives on Developmental Neurobiology.3(4):359-71. Cotman,SL, W Halfter, G J Cole, 2000, Agrin binds to beta-amyloid (Abeta), accelerates abeta fibril formation, and is localized to Abeta deposits in Alzheimer's disease brain: Mol.Cell Neurosci., 15: 183-198. Denzer,AJ, R Brandenberger, M Gesemann, M Chiquet, M A Ruegg, 1997, Agrin binds to the nerve-muscle basal lamina via laminin: J.Cell Biol., 137: 671-683. Denzer,AJ, T Schulthess, C Fauser, B Schumacher, R A Kammerer, J Engel, M A Ruegg, 1998, Electron microscopic structure of agrin and mapping of its binding site in laminin-1: EMBO J., 17: 335-343. Desmet,V, T Roskams, P Van Eyken, 1995, Ductular reaction in the liver: Pathol.Res.Pract., 191: 513-524. Dodge,GR, I Kovalszky, M L Chu, J R Hassell, O W McBride, H F Yi, R V Iozzo, 1991, Heparan sulfate proteoglycan of human colon: partial molecular cloning, cellular expression, and mapping of the gene (HSPG2) to the short arm of human chromosome 1: Genomics, 10: 673-680.

74

Doege,K, M Sasaki, Y Yamada, 1990, Rat and human cartilage proteoglycan (aggrecan) gene structure: Biochem.Soc.Trans., 18: 200-202. Donahue,JE, T M Berzin, M S Rafii, D J Glass, G D Yancopoulos, J R Fallon, E G Stopa, 1999, Agrin in Alzheimer's disease: altered solubility and abnormal distribution within microvasculature and brain parenchyma: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 96: 64686472. Durbeej,M, M D Henry, M Ferletta, K P Campbell, P Ekblom, 1998, Distribution of dystroglycan in normal adult mouse tissues: J.Histochem.Cytochem., 46: 449-457. Eble,JA, J Haier, 2006, Integrins in cancer treatment: Curr.Cancer Drug Targets., 6: 89105. el Serag,HB, 2001, Epidemiology of hepatocellular carcinoma: Clin.Liver Dis., 5: 87107, vi. Esko,JD, J L Weinke, W H Taylor, G Ekborg, L Roden, G Anantharamaiah, A Gawish, 1987, Inhibition of chondroitin and heparan sulfate biosynthesis in Chinese hamster ovary cell mutants defective in galactosyltransferase I: J.Biol.Chem., 262: 1218912195. Fedarko,NS, M Ishihara, H E Conrad, 1989, Control of cell division in hepatoma cells by exogenous heparan sulfate proteoglycan: J.Cell Physiol, 139: 287-294. Ferns,MJ, J T Campanelli, W Hoch, R H Scheller, Z Hall, 1993, The ability of agrin to cluster AChRs depends on alternative splicing and on cell surface proteoglycans: Neuron, 11: 491-502. Fisher,LW, J D Termine, M F Young, 1989, Deduced protein sequence of bone small proteoglycan I (biglycan) shows homology with proteoglycan II (decorin) and several nonconnective tissue proteins in a variety of species: J.Biol.Chem., 264: 4571-4576.

75

Frail,DE, L L McLaughlin, J Mudd, J P Merlie, 1988, Identification of the mouse muscle 43,000-dalton acetylcholine receptor-associated protein (RAPsyn) by cDNA cloning: J.Biol.Chem., 263: 15602-15607. Gallagher,JT, 1989, The extended family of proteoglycans: social residents of the pericellular zone: Curr.Opin.Cell Biol., 1: 1201-1218. Gallagher,JT, M Lyon, W P Steward, 1986, Structure and function of heparan sulphate proteoglycans: Biochem.J., 236: 313-325. Gallai,M, I Kovalszky, T Knittel, K Neubauer, T Armbrust, G Ramadori, 1996, Expression of extracellular matrix proteoglycans perlecan and decorin in carbontetrachloride-injured rat liver and in isolated liver cells: Am.J.Pathol., 148: 1463-1471. Gallegos,NC, C Smales, F J Savage, R M Hembry, P B Boulos, 1995, The distribution of matrix metalloproteinases and tissue inhibitor of metalloproteinases in colorectal cancer: Surg.Oncol., 4: 21-29. Gautam,M, P G Noakes, L Moscoso, F Rupp, R H Scheller, J P Merlie, J R Sanes, 1996, Defective neuromuscular synaptogenesis in agrin-deficient mutant mice: Cell, 85: 525-535. Gee,SH, F Montanaro, M H Lindenbaum, S Carbonetto, 1994, Dystroglycan-alpha, a dystrophin-associated glycoprotein, is a functional agrin receptor: Cell, 77: 675-686. Gesemann,M, A Brancaccio, B Schumacher, M A Ruegg, 1998, Agrin is a high-affinity binding protein of dystroglycan in non-muscle tissue: J.Biol.Chem., 273: 600-605. Gesemann,M, A J Denzer, M A Ruegg, 1995b, Acetylcholine receptor-aggregating activity of agrin isoforms and mapping of the active site: J.Cell Biol., 128: 625-636.

76

Gingras,J, M Ferns, 2001, Expression and localization of agrin during sympathetic synapse formation in vitro: J.Neurobiol., 48: 228-242. Grazioli,L, M P Federle, G Brancatelli, T Ichikawa, L Olivetti, A Blachar, 2001, Hepatic adenomas: imaging and pathologic findings: Radiographics, 21: 877-892. Groffen,AJ, C A Buskens, T H van Kuppevelt, J H Veerkamp, L A Monnens, L P van den Heuvel, 1998a, Primary structure and high expression of human agrin in basement membranes of adult lung and kidney: Eur.J.Biochem., 254: 123-128. Groffen,AJ, M A Ruegg, H Dijkman, T J van de Velden, C A Buskens, B J van den, K J Assmann, L A Monnens, J H Veerkamp, L P van den Heuvel, 1998b, Agrin is a major heparan sulfate proteoglycan in the human glomerular basement membrane: Journal of Histochemistry & Cytochemistry.46(1):19-27. Halfter,W, S Dong, B Schurer, G J Cole, 1998, Collagen XVIII is a basement membrane heparan sulfate proteoglycan: J.Biol.Chem., 273: 25404-25412. Henry,SH, F X Bosch, J C Bowers, 2002, Aflatoxin, hepatitis and worldwide liver cancer risks: Adv.Exp.Med.Biol., 504: 229-233. Heremans,A, J J Cassiman, B H Van den, G David, 1988, Heparan sulfate proteoglycan from the extracellular matrix of human lung fibroblasts. Isolation, purification, and core protein characterization: J.Biol.Chem., 263: 4731-4739. Hildebrand,A, M Romaris, L M Rasmussen, D Heinegard, D R Twardzik, W A Border, E Ruoslahti, 1994, Interaction of the small interstitial proteoglycans biglycan, decorin and fibromodulin with transforming growth factor beta: Biochem.J., 302 ( Pt 2): 527534.

77

Hussain,SM, T Terkivatan, P E Zondervan, E Lanjouw, S de Rave, J N Ijzermans, R A de Man, 2004, Focal nodular hyperplasia: findings at state-of-the-art MR imaging, US, CT, and pathologic analysis: Radiographics, 24: 3-17. Iozzo,RV, 2005, Basement membrane proteoglycans: from cellar to ceiling: Nat.Rev.Mol.Cell Biol., 6: 646-656. Iozzo,RV, I R Cohen, S Grassel, A D Murdoch, 1994, The biology of perlecan: the multifaceted heparan sulphate proteoglycan of basement membranes and pericellular matrices: Biochem.J., 302 ( Pt 3): 625-639. Iozzo,RV, I Kovalszky, N Hacobian, P K Schick, J S Ellingson, G R Dodge, 1990, Fatty acylation of heparan sulfate proteoglycan from human colon carcinoma cells: J.Biol.Chem., 265: 19980-19989. Ip,FC, D G Glass, D R Gies, J Cheung, K O Lai, A K Fu, G D Yancopoulos, N Y Ip, 2000, Cloning and characterization of muscle-specific kinase in chicken: Mol.Cell Neurosci., 16: 661-673. Jennings,CG, S J Burden, 1993, Development of the neuromuscular synapse: Curr.Opin.Neurobiol., 3: 75-81. Jiang,X,

J

R

Couchman,

2003,

Perlecan

and

tumor

angiogenesis:

J.Histochem.Cytochem., 51: 1393-1410. Kainulainen,V, L Nelimarkka, H Jarvelainen, M Laato, M Jalkanen, K Elenius, 1996, Suppression of syndecan-1 expression in endothelial cells by tumor necrosis factoralpha: J.Biol.Chem., 271: 18759-18766. Kammerer,RA, T Schulthess, R Landwehr, B Schumacher, A Lustig, P D Yurchenco, M A Ruegg, J Engel, A J Denzer, 1999, Interaction of agrin with laminin requires a

78

coiled-coil conformation of the agrin-binding site within the laminin gamma1 chain: EMBO J., 18: 6762-6770. Kato,M, H Wang, V Kainulainen, M L Fitzgerald, S Ledbetter, D M Ornitz, M Bernfield, 1998, Physiological degradation converts the soluble syndecan-1 ectodomain from an inhibitor to a potent activator of FGF-2: Nat.Med., 4: 691-697. Kemeny,E, H M Fillit, S Damle, R Mahabir, N A Kefalides, J D Gregory, T Antonovych, S Sabnis, J B Zabriskie, 1988, Monoclonal antibodies to heparan sulfate proteoglycan: development and application to the study of normal tissue and pathologic human kidney biopsies: Connect.Tissue Res, 18: 9-25. Kim,MJ, I H Liu, Y Song, J A Lee, W Halfter, R J Balice-Gordon, E Linney, G J Cole, 2007, Agrin is required for posterior development and motor axon outgrowth and branching in embryonic zebrafish: Glycobiology, 17: 231-247. Kimata,K, Y Oike, K Tani, T Shinomura, M Yamagata, M Uritani, S Suzuki, 1986, A large chondroitin sulfate proteoglycan (PG-M) synthesized before chondrogenesis in the limb bud of chick embryo: J.Biol.Chem., 261: 13517-13525. Kimura,S, J Cheng, H Ida, N Hao, Y Fujimori, T Saku, 2000, Perlecan (heparan sulfate proteoglycan) gene expression reflected in the characteristic histological architecture of salivary adenoid cystic carcinoma: Virchows Arch., 437: 122-128. Kiss,A,

G

Lotz,

N

P

Kaposi,

Z

Schaff,

2002,

[Hepatitis

viruses

and

hepatocarcinogenesis]: Orv.Hetil., 143: 83-86. Kiss,A, A Szepesi, G Lotz, P Nagy, Z Schaff, 1998, Expression of transforming growth factor-alpha in hepatoblastoma: Cancer, 83: 690-697. Knox,SM, J M Whitelock, 2006, Perlecan: how does one molecule do so many things?: Cell Mol.Life Sci., 63: 2435-2445.

79

Konomi,H, J M Seyer, Y Ninomiya, B R Olsen, 1986, Peptide-specific antibodies identify the alpha 2 chain as the proteoglycan subunit of type IX collagen: J.Biol.Chem., 261: 6742-6746. Kopper L, Schaff Zs. Patológia tankönyv 2. Medicina, Budapest, 2004: 872-874 Kovalszky,I, A Jeney, K Lapis, 1993, [Proteoglycans (their structure, function and role in liver diseases)]: Orv.Hetil., 134: 2019-2026. Kovalszky,I, I, J O Nagy, M Gallai, A Sebestyen, Z Schaff, S Paku, A Jeney, R V Iozzo, 1997, Altered Proteoglycan Gene Expression in Human Biliary Cirrhosis: Pathol.Oncol.Res., 3: 51-58. Kovalszky,I, P Nagy, B Szende, K Lapis, F Szalay, A Jeney, Z Schaff, 1998, Experimental and human liver fibrogenesis: Scand.J.Gastroenterol.Suppl, 228: 51-55. Kovalszky,I, G Pogany, G Molnar, A Jeney, K Lapis, S Karacsonyi, A Szecseny, R V Iozzo, 1990, Altered glycosaminoglycan composition in reactive and neoplastic human liver: Biochem.Biophys.Res.Commun., 167: 883-890. Krusius,T, E Ruoslahti, 1986, Primary structure of an extracellular matrix proteoglycan core protein deduced from cloned cDNA: Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A, 83: 7683-7687. Lee,JS, S S Thorgeirsson, 2002, Functional and genomic implications of global gene expression profiles in cell lines from human hepatocellular cancer: Hepatology, 35: 1134-1143. Lin,W, R W Burgess, B Dominguez, S L Pfaff, J R Sanes, K F Lee, 2001, Distinct roles of nerve and muscle in postsynaptic differentiation of the neuromuscular synapse: Nature, 410: 1057-1064. Liotta,LA, 1982, Tumor extracellular matrix: Lab Invest, 47: 112-113.

80

Lyon,M, J A Deakin, K Mizuno, T Nakamura, J T Gallagher, 1994, Interaction of hepatocyte growth factor with heparan sulfate. Elucidation of the major heparan sulfate structural determinants: J.Biol.Chem., 269: 11216-11223. Lyon,M, J T Gallagher, 1991, Purification and partial characterization of the major cellassociated heparan sulphate proteoglycan of rat liver: Biochem.J., 273(Pt 2): 415-422. Madri,JA, M Marx, 1992, Matrix composition, organization and soluble factors: modulators of microvascular cell differentiation in vitro: Kidney Int., 41: 560-565. Magill-Solc,C, U J McMahan, 1988, Motor neurons contain agrin-like molecules: J.Cell Biol., 107: 1825-1833. Marchetti,D, D Menter, L Jin, M Nakajima, G L Nicolson, 1993, Nerve growth factor effects on human and mouse melanoma cell invasion and heparanase production: Int.J.Cancer, 55: 692-699. Marneros,AG, B R Olsen, 2005, Physiological role of collagen XVIII and endostatin: FASEB J., 19: 716-728. Martin,PT, J R Sanes, 1997, Integrins mediate adhesion to agrin and modulate agrin signaling: Development, 124: 3909-3917. McMahan,UJ, 1990, The agrin hypothesis: Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol., 55: 407-418. Merz,H, R Malisius, S Mannweiler, R Zhou, W Hartmann, K Orscheschek, P Moubayed, A C Feller, 1995, ImmunoMax. A maximized immunohistochemical method for the retrieval and enhancement of hidden antigens: Lab Invest, 73: 149-156. Metayer,S, F Dacheux, J L Dacheux, J L Gatti, 2002, Comparison, characterization, and identification of proteases and protease inhibitors in epididymal fluids of domestic

81

mammals. Matrix metalloproteinases are major fluid gelatinases: Biol.Reprod., 66: 1219-1229. Mongiat,M, J Otto, R Oldershaw, F Ferrer, J D Sato, R V Iozzo, 2001, Fibroblast growth factor-binding protein is a novel partner for perlecan protein core: J.Biol.Chem., 276: 10263-10271. Mongiat,M, S M Sweeney, J D San Antonio, J Fu, R V Iozzo, 2003, Endorepellin, a novel inhibitor of angiogenesis derived from the C terminus of perlecan: J.Biol.Chem., 278: 4238-4249. Moon,JJ, M Matsumoto, S Patel, L Lee, J L Guan, S Li, 2005, Role of cell surface heparan sulfate proteoglycans in endothelial cell migration and mechanotransduction: J.Cell Physiol, 203: 166-176. Morita,H, A Yoshimura, K Inui, T Ideura, H Watanabe, L Wang, R Soininen, K Tryggvason, 2005, Heparan sulfate of perlecan is involved in glomerular filtration: J.Am.Soc.Nephrol., 16: 1703-1710. Mueller,MM, N E Fusenig, 2002, Tumor-stroma interactions directing phenotype and progression of epithelial skin tumor cells: Differentiation, 70: 486-497. Murata,K, Y Ochiai, K Akashio, 1985, Polydispersity of acidic glycosaminoglycan components in human liver and the changes at different stages in liver cirrhosis: Gastroenterology, 89: 1248-1257. Nagy,P, V Laszlo, Z Schaff, 2006, [Hepatocarcinogenesis in human liver]: Magy.Onkol., 50: 107-113. Nakeeb,A, H A Pitt, T A Sohn, J Coleman, R A Abrams, S Piantadosi, R H Hruban, K D Lillemoe, C J Yeo, J L Cameron, 1996, Cholangiocarcinoma - A spectrum of intrahepatic, perihilar, and distal tumors: Annals of Surgery, 224: 463-473.

82

Naor,D, R V Sionov, D Ish-Shalom, 1997, CD44: structure, function, and association with the malignant process: Adv.Cancer Res., 71: 241-319. Nishiyama,A, K J Dahlin, W B Stallcup, 1991, The expression of NG2 proteoglycan in the developing rat limb: Development, 111: 933-944. Oldberg,A, L Kjellen, M Hook, 1979, Cell-surface heparan sulfate. Isolation and characterization of a proteoglycan from rat liver membranes: J.Biol.Chem., 254: 85058510. Otto,S, M Kasler, 2005, [Trends in cancer mortality and morbidity in Hungarian and international statistics. Characteristics and potential outcome of public health screening programs]: Magy.Onkol., 49: 99-7. Oyunsuren,T, R Sanduijav, D Davaadorj, D Nansalmaa, 2006, Hepatocellular carcinoma and its early detection by AFP testing in Mongolia: Asian Pac.J.Cancer Prev., 7: 460-462. Qiao,D, K Meyer, C Mundhenke, S A Drew, A Friedl, 2003, Heparan sulfate proteoglycans as regulators of fibroblast growth factor-2 signaling in brain endothelial cells. Specific role for glypican-1 in glioma angiogenesis: J.Biol.Chem., 278: 1604516053. Rabenstein,DL, 2002, Heparin and heparan sulfate: structure and function: Nat.Prod.Rep., 19: 312-331. Rascher,G, A Fischmann, S Kroger, F Duffner, E H Grote, H Wolburg, 2002, Extracellular matrix and the blood-brain barrier in glioblastoma multiforme: spatial segregation of tenascin and agrin: Acta Neuropathol.(Berl), 104: 85-91. Reed,CC, R V Iozzo, 2002, The role of decorin in collagen fibrillogenesis and skin homeostasis: Glycoconj.J., 19: 249-255.

83

Reist,NE, C Magill, U J McMahan, 1987, Agrin-like molecules at synaptic sites in normal, denervated, and damaged skeletal muscles: J.Cell Biol., 105: 2457-2469. Ronnov-Jessen,L, O W Petersen, 1993, Induction of alpha-smooth muscle actin by transforming growth factor-beta 1 in quiescent human breast gland fibroblasts. Implications for myofibroblast generation in breast neoplasia: Lab Invest, 68: 696-707. Ruegg,MA, J L Bixby, 1998, Agrin orchestrates synaptic differentiation at the vertebrate neuromuscular junction: Trends Neurosci., 21: 22-27. Ruegg,MA, K W Tsim, S E Horton, S Kroger, G Escher, E M Gensch, U J McMahan, 1992, The agrin gene codes for a family of basal lamina proteins that differ in function and distribution: Neuron, 8: 691-699. Ruoslahti,E, Y Yamaguchi. Proteoglycans as modulator of growth factor activities. 56, 867-869. 1991. Rupp,F, T Ozcelik, M Linial, K Peterson, U Francke, R Scheller, 1992, Structure and chromosomal localization of the mammalian agrin gene: J.Neurosci., 12: 3535-3544. Rupp,F, D G Payan, C Magill-Solc, D M Cowan, R H Scheller, 1991, Structure and expression of a rat agrin: Neuron, 6: 811-823. Sabit,H, K Tsuneyama, T Shimonishi, K Harada, J Cheng, H Ida, T Saku, K Saito, Y Nakanuma, 2001, Enhanced expression of basement-membrane-type heparan sulfate proteoglycan in tumor fibro-myxoid stroma of intrahepatic cholangiocarcinoma: Pathol.Int., 51: 248-256. Sadler,JE, 1997, Thrombomodulin structure and function: Thromb.Haemost., 78: 392395.

84

Sahani,D, S R Prasad, K K Tannabe, P F Hahn, P R Mueller, S Saini, 2003, Thorotrastinduced cholangiocarcinoma: case report: Abdom.Imaging, 28: 72-74. Saksela,O, D Moscatelli, A Sommer, D B Rifkin, 1988, Endothelial cell-derived heparan sulfate binds basic fibroblast growth factor and protects it from proteolytic degradation: J.Cell Biol., 107: 743-751. Saunders,S, M Jalkanen, S O'Farrell, M Bernfield, 1989, Molecular cloning of syndecan, an integral membrane proteoglycan: J.Cell Biol., 108: 1547-1556. Schaff Z., Nagy P. Pathology techniques and grading systems in the diagnosis of HCC. 111-133. 1997. Churchill Livingstone New York, Liver Cancer. Schaff,Z, I Sarosi, C C Hsia, A Kiss, E Tabor, 1995, p53 in malignant and benign liver lesions: Eur.J.Cancer, 31A: 1847-1850. Schaff,Z, E Szekely, B Jaray, A Kiss, 2004, [Pathology of liver tumors]: Orv.Hetil., 145: 368-374. Sebestyen,A, M Gallai, T Knittel, T Ambrust, G Ramadori, I Kovalszky, 2000, Cytokine regulation of syndecan expression in cells of liver origin: Cytokine, 12: 15571560. Senoo,H, 2004, Structure and function of hepatic stellate cells: Med.Electron Microsc., 37: 3-15. Serpinskaya,AS, G Feng, J R Sanes, A M Craig, 1999, Synapse formation by hippocampal neurons from agrin-deficient mice: Dev.Biol., 205: 65-78. Shaib,Y, H B el Serag, 2004, The epidemiology of cholangiocarcinoma: Semin.Liver Dis., 24: 115-125.

85

Sharma,B, M Handler, I Eichstetter, J M Whitelock, M A Nugent, R V Iozzo, 1998, Antisense targeting of perlecan blocks tumor growth and angiogenesis in vivo: J.Clin.Invest, 102: 1599-1608. Silbert,JE, G Sugumaran, 2002, Biosynthesis of chondroitin/dermatan sulfate: IUBMB.Life, 54: 177-186. Smela,ME, S S Currier, E A Bailey, J M Essigmann, 2001, The chemistry and biology of aflatoxin B(1): from mutational spectrometry to carcinogenesis: Carcinogenesis, 22: 535-545. Su,CH, Y M Shyr, W Y Lui, F K P'Eng, 1997, Hepatolithiasis associated with cholangiocarcinoma: Br.J.Surg., 84: 969-973. Sugahara,K, H Kitagawa, 2002, Heparin and heparan sulfate biosynthesis: IUBMB.Life, 54: 163-175. Tatrai,P, J Dudas, E Batmunkh, M Mathe, A Zalatnai, Z Schaff, G Ramadori, I Kovalszky, 2006, Agrin, a novel basement membrane component in human and rat liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma: Lab Invest, 86: 1149-1160. Taylor,KR, R L Gallo, 2006, Glycosaminoglycans and their proteoglycans: hostassociated molecular patterns for initiation and modulation of inflammation: FASEB J., 20: 9-22. Timar,J, C Diczhazi, A Ladanyi, E Raso, W Hornebeck, L Robert, K Lapis, 1995a, Interaction of tumour cells with elastin and the metastatic phenotype: Ciba Found.Symp., 192: 321-335. Timar,J, A Jeney, I Kovalszky, I, L Kopper, 1995b, Role of Proteoglycans in Tumor Progression: Pathol.Oncol.Res., 1: 85-93.

86

Timar,J, S Paku, J Tovari, B Dome, 2006, [Rationale of antiangiogenic therapy]: Magy.Onkol., 50: 141-151. Tompkins,RK, B M Aizen, K D Saunders, J J Roslyn, W P Longmire, Jr., 1991, Carcinoma of the ductus choledochus: Am.J.Surg., 161: 235-238. Trotter,JF, G T Everson, 2001, Benign focal lesions of the liver: Clin.Liver Dis., 5: 1742, v. Tsen,G, W Halfter, S Kroger, G J Cole, 1995, Agrin is a heparan sulfate proteoglycan: J.Biol.Chem., 270: 3392-3399. Tsim,KW, M A Ruegg, G Escher, S Kroger, U J McMahan, 1992, cDNA that encodes active agrin: Neuron, 8: 677-689. Vauthey,JN, L H Blumgart, 1994, Recent advances in the management of cholangiocarcinomas: Semin.Liver Dis., 14: 109-114. Watanapa,P, W B Watanapa, 2002, Liver fluke-associated cholangiocarcinoma: Br.J.Surg., 89: 962-970. Woods,A, 2001, Syndecans: transmembrane modulators of adhesion and matrix assembly: J.Clin.Invest, 107: 935-941. Yamamoto,C, S Shimada, Y Fujiwara, J B Lee, T Hayashi, T Kaji, 2005, Proteoglycans released from cultured bovine aortic endothelial cell layers by sodium spirulan are both perlecan and biglycan: Biol.Pharm.Bull., 28: 32-36. Yang,JF, G Cao, S Koirala, L V Reddy, C P Ko, 2001, Schwann cells express active agrin and enhance aggregation of acetylcholine receptors on muscle fibers: J.Neurosci., 21: 9572-9584.

87

12. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés alapjául szolgáló közlemények jegyzéke: Batmunkh E., Tátrai P., Szabó E., Lódi C., Holczbauer A., Páska C., Kupcsulik P., Kiss A., Schaff Z., Kovalszky I. (2007) Comparison of the expression of agrin, a basement membrane heparan sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma. Human Pathol, 38: 1508-1515 (IF: 2,810) Tátrai P., Dudás J., Batmunkh E., Máthé M., Zalatnai A., Schaff Z., Ramadori G., Kovalszky L. (2006) Agrin, a novel basement membrane component in human and rat liver, accumulates in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Lab Invest 86: 1149-1160, (IF: 3.753) Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: Szijártó A.*, Batmunkh E. *, Hahn O., Mihály Z., Kreiss A., Kiss A., Lotz G., Schaff Z., Váli L., Blázovics A., Geró D., Szabó C., Kupcsulik P. (2007) Effect of PJ-34 Parpinhibitor on rat liver microcirculation and antioxidant status. J Surg Res. Sep;142(1):7280 ( * megosztott első szerzők) (IF: 2.038) Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Szíjártó A., Kupcsulik P., Kovalszky I., Paku S., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. (2006) Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas: Mod. Pathol 19: 460-469 (IF: 3,753) Szabó E., Lódi C., Korpos E., Batmunkh E., Rottenberger Z., Deák F., Kiss I, Tőkés AM., Lotz G., László V., Kiss A., Schaff Z., Nagy P. (2007) Expression of Matrilin-2 in oval cells during rat liver regeneration. Matrix Biol, 26: 554-560 (IF: 3,679)

88

E. Szabó, É. Korpos, E. Batmunkh, G. Lotz, Á. Holczbauer, I. Kovalszky, F. Deák, I. Kiss, Zs. Schaff, A. Kiss. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Pathol Oncol Res. Közlésre elfogadva (2007, augusztus) (IF: 1,241) Szijártó A., Hahn O., Batmunkh E., Stangl R., Kiss A., Lotz G., Schaff Z., Váli L., Blázovics A., Gerő D.,. Szabó C, Kupcsulik P., Harsányi L. (2007) Short-term alanylglutamine dipeptide pretreatment in liver ischemia-reperfusion model: effects on microcirculation and antioxidant status in rats. Clinical Nutrition 26, 640-648. (IF: 2,474) Megjelent, illetve elfogadott in extensio közlemények impakt faktora összesen: 20.448 Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstactok: Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Tátrai P, Páska C, Kiss A, Kupcsulik P, Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver April 13-17, 2005, Paris, France. Abstract: Journal of Hepatology Supplement No.2 Volume 42, 2005 Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Tátrai P, Páska C, Kiss A, Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology June 07-11, 2005 Balatonaliga, Hungary. Abstract: Zeitschrift für Gastroenterologie; Issue 5, Volume 43, 2005 Egyéb kutatási témákból lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstactok: Szabó E., Páska C., Deák F., Kiss I., Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis

89

and hepatocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver April 13-17, 2005, Paris, France. J. of Hepatol 42. S2. 2005 Szabó E, Páska C, Lódi C, Batmunkh E, Holczbauer Á, Korpos É, Deák F, Kiss I, Kiss A, Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology June 07-11, 2005 Balatonaliga, Hungary. Abstract: Zeitschrift für Gastroenterologie; Issue 5, Volume 43, 2005 Lódi Cs., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kiss A., Kupcsulik P., Illyés Gy, Schaff Zs. High expression of claudin-4 in biliary carcinomas. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005 Virchows Arch 447: 404, 2005. Lódi C, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Kovalszky I, Paku S, Kiss A, Illyés G, Schaff Z. High expression of claudin-4 in human biliary cancers. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology June 07-11, 2005 Balatonaliga, Hungary. Abstract: Zeitschrift für Gastroenterologie; Issue 5, Volume 43, 2005 Egyéb kutatási témákból készült nem idézhető abstractok:

Batmunkh E, Tátrai P, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Páska C, Kiss A, Kupcsulik P, Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in cholangiocarcinoma. Falk Symposium October 10-11, 2006, Freiburg, Germany Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Szabó E, Tátrai P, Páska C, Kiss A, Kupcsulik P, Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. Falk Symposium, October 3-4, 2005, Berlin, Germany Lódi C, Szabó E, Holczbauer Á, Batmunkh E, Kiss A, Illyés G, Paku S, Schaff Z, Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. Falk Symposium, October 3-4, 2005, Berlin, Germany

90

Tátrai P., Batmunkh E., Dudás J., Egedi K., Ramadori G., Schaff Z., Kovalszky L, Agrin in the diseased liver: a multifunctional proteoglycan recently found in the liver may promote bile duct proliferation and tumour angiogenesis FEBS 2005 Congress Szabó E, Páska C, Lódi C, Batmunkh E, Holczbauer Á, Korpos E, Deák F, Kiss I, Kiss A, Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Falk Symposium, October 3-4, 2005, Berlin, Germany Lódi C, Szíjártó A, Holczbauer Á, Szabó E, Batmunkh E, Kiss A, Illyés G, Schaff Z, Kupcsulik P; High expression of claudin-4 in human cholangiocarcinomas. 6th Congress of the European Hepato-Pancreato-Biliary Association May 25-28, 2005, Heidelberg, Germany Szabó E, Páska C, Deák F, Kiss I, Batmunkh E, Lódi C, Holczbauer Á, Kiss A, Kovalszky I, Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver April 13-17, 2005, Paris, France. Abstract: Journal of Hepatology; Supplement No.2 Volume 42, 2005 Holczbauer Á, Halász J, Lódi C, Szabó E, Batmunkh E, Benyó G, Galántai I, Kiss A, Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 7th Ph.D. Conference at Semmelweis University, April 14-15, 2005, Budapest, Hungary Lódi C, Kiss A, Holczbauer Á, Batmunkh E, Paku S, Illyés G, Kupcsulik P, Schaff Z. High expression of claudin 4 in human cholangiocellular carcinomas. Falk Symposium October 16-17, 2004, Freiburg, Germany Holczbauer Á, Lódi Cs, Batmunkh E, Kiss A, Kupcsulik P, Schaff Zs. Decreased expression of prepro-nociceptin/OFQ and nociceptin/OFQ receptor in human hepatocellular carcinoma. 63rd Hungarian Congress of Pathology September 23-25, 2004, Siófok-Balatonszéplak, Hungary

91

Lódi C, Szabó E, Batmunkh E, Holczbauer Á, Kiss A, Illyés G, Paku S, Schaff Z, Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. 41th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver April 26-27, 2006, Vienna, Austria Lódi C, Szabó E, Batmunkh E, Holczbauer Á, Paku S, Kupcsulik P, Illyés G, Kiss A, Schaff Z. Different claudin-4 expression on biliary and hepatocellular carcinomas. 41th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver April 26-27, 2006, Vienna, Austria

92

13. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet fejezem ki mindazoknak, akik munkámhoz útmutatásaikkal és segítségükkel hozzájárultak. Szeretném megköszönni témavezetőmnek, Dr. Kiss Andrásnak, aki mindig nagy türelemmel bíztatott a tudományos munkában való elmélyülésre, és aki évek óta figyelemmel irányítja kísérletes munkámat. Külön köszönettel tartozom Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, aki lehetővé tette, hogy munkámat az II. sz. Patológiai Intézetben végezhessem és mindig támogatott a munkámban. Hálás vagyok Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanár segítségéért és tanácsaiért, mivel jelen munkám nem jöhetett volna létre korábbi ilyen tárgyú kutatásai nélkül. Külön köszönet illeti Tátrai Pétert, akinek munkája és segítsége nélkül ez a munka nem jött volna létre. Külön köszönöm Szabó Erzsébetnek, PhD társamnak, aki mindig segítségemre volt. Köszönöm a munkatársaimnak, Dr. Holczbauer Ágnesnek, Dr. Lódi Csabának, Németh Zsuzsának, Dr. Szász Attila Marcellnak, Dr. Tőkés Anna-Máriának és Dr Páska Csillának munkámhoz nyújtott segítségüket. Köszönetet szeretnék mondani Szik Ágnesnek és Pekár Zoltánnénak ez idő alatt végzett pontos, lelkes és lelkiismeretes munkájukért. Továbbá köszönettel tartozom az II. sz. Patológiai Intézet minden tagjának, akik munkám elvégzéséhez segítő, baráti légkört teremtettek. Köszönetet mondok a Mongol és Magyar Oktatási Minisztériumnak, a Mongol Nagykövetségnek, akik ösztöndíjat bocsátottak rendelkezésemre. Végül, de nem utolsó sorban hálás vagyok szüleimnek és páromnak, akik lehetővé tették számomra azt, hogy eljuthassak idáig, mindig mindenben mellettem álltak és biztosították a hátteret a terveim megvalósításához.

93