ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga DISERTASI

ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga

DISERTASI

MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella asiatica (Pegagan) DALAM MENINGKATKAN APOPTOSIS SEL ALVEOLAR MAKROFAG DARI JARINGAN PARU TIKUS YANG DIINFEKSI Mycobacterium tuberculosis

Arifa Mustika

PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012

Disertasi

MEKANISME EKSTRAK ETANOL HERBA Centella asiatica ... MUSTIKA ARIFA


DISERTASI


Arifa Mustika

PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012

ii Disertasi




DISERTASI

Untuk memperoleh Gelar Doktor Dalam Progran Studi S3 Ilmu Kedokteran Pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Telah dipertahankan dihadapan Panitia Ujian Doktor Terbuka Pada hari : Selasa Tanggal : 12 Juni 2012 Pukul : 10.00 – 12.00 WIB

Oleh : ARIFA MUSTIKA 090810047D

iii Disertasi



LEMBAR PENGESAHAN

Disertasi ini telah disetujui pada tanggal 26 September 2012

Oleh : Promotor,

Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih,dr.,MS,Sp.MK NIP. 195703071984032001

Ko Promotor I,

Ko Promotor II,

Prof. Sri Agus Sudjarwo, Ph.D.,drh. NIP. 19560904 1984031 004

Prof. Dr. Mangestuti Agil, Apt.,MS NIP. 195004221980022001

iv Disertasi



Disertasi ini telah diuji dan dinilai oleh panitia penguji pada Tertutup (Tahap I) Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Pada Tanggal 20 April 2012

Panitia Penguji, Ketua

: Dr. Suwarno,drh.,M.Si.

Anggota

:

1. 2. 3. 4. 5. 6.

Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih,dr.,MS,Sp.MK Prof. Sri Agus Sudjarwo, Ph.D.,drh. Dr. Mangestuti Agil, Apt.,MS Prof. Dr. Aulani’am, drh.,DES Dr. JF Palilingan, dr.,Sp.P. Dr. Hari Basuki N,dr.,M.Kes

Ditetapkan dengan Surat Keputusan Rektor Universitas Airlangga Nomor : 583/H3/KR/2012 Tanggal : 2 Mei 2012

v Disertasi



UCAPAN TERIMA KASIH

Alhamdulillahi Robbil ‘Alamin, segala puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan naskah disertasi ini. Disertasi ini dapat diselesaikan berkat bimbingan, saran dan koreksi tim Promotor. Dengan segala kerendahan hati saya menyampaikan terima kasih serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat : Prof. Dr. Ni Made Mertaniasih,dr.,MS,Sp.MK selaku Promotor yang membimbing, memberikan wawasan dan falsafah berfikir yang sangat bermanfaat selama proses penyusunan proposal, penelitian dan penyusunan naskah disertasi. Prof. Sri Agus Sudjarwo, Ph.D.,drh selaku Ko-Promotor I yang membimbing, memberikan wawasan dan mengarahkan logika berfikir selama proses penyusunan proposal, penelitian dan penyusunan naskah disertasi. Dr. Mangestuti Agil, Apt.,MS selaku Ko-Promotor II yang telah meluangkan waktunya untuk membimbing, memberikan saran dan nasehat selama proses penyusunan proposal, penelitian dan penyusunan naskah disertasi. Ucapan terima kasih saya sampaikan pada Pemerintah Republik Indonesia melalui Menteri Pendidikan dan Kebudayaan yang telah memberikan kesempatan serta bantuan dana beasiswa studi BPPS, Hibah Program Doktor dan Program Sandwich-Like, sehingga saya dapat mengikuti Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga dan menyelesaikan disertasi.

vi Disertasi



Ucapan terima kasih juga saya sampaikan kepada: Rektor Universitas Airlangga Prof.Dr.Fasich,Apt yang telah memberikan ijin dan berkenan menerima saya sebagai mahasiswa Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga. Dekan Fakultas Kedokteran Prof.Dr.Agung Pranoto,dr.,M.Kes.,SpPD. KEMD.,FINASIM

dan mantan Dekan Prof.Dr.Muhammad Amin,dr.,Sp.P (K)

yang telah memberikan ijin dan kesempatan pada saya untuk mengikuti pendidikan Doktor dan membantu pembiayaan selama studi. Ketua Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Prof. Dr. Teddy Ontoseno,dr.,Sp.A(K).,Sp.JP.,AKK dan mantan Ketua Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Prof. Dr. Harjanto, JM., dr. AIF atas nasehat dan perhatian yang diberikan untuk menyelesaikan pendidikan Doktor. Direktur Program Pascasarjana Universitas Airlangga Prof.Dr.Hj.Sri Hajati,SH.,MS, mantan Wakil Direktur Bidang Akademik Prof.Dr.H.R.Eddy Raharjo,dr., Ank.Ic dan Wakil Direktur Akademik Bidang Pendidikan Prof. Dr. Sri Suhariningsih,Ir yang telah memberikan fasilitas untuk mengikuti Program Doktor di Universitas Airlangga. Para penguji disertasi mulai dari ujian kualifikasi sampai ujian terbuka yaitu : Prof. Dr. Sarmanu, drh.,MS, Prof. Soetjipto,dr,MS,Ph.D, Prof. Dr. Aulani’am, drh.,DES, Prof. Dr. Juliati Hood A.,dr.,MS.,Sp.PA(K) FIAC, Prof. Win

Darmanto,

M.Si.,Ph.D,

Prof.

Dr.

Achmad

Basori,Drs.,MS.,Apt,

Dr.Suwarno,drh.,M.Si., Dr. JF Palilingan, dr.,Sp.P(K), Dr. Hari Basuki N,dr.,M.Kes., Dr. Umi Athiyah Dra.,MS.,Apt, Dr. Isnaeni.,MS.,Apt,

Dr.

vii Disertasi



Koesnoto,drh.,M.Si, Dr. Ira Arundina, drg.,M.Si yang telah memberikan saran dan perbaikan naskah disertasi. Para guru besar dan dosen di Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberikan ilmu, bimbingan dan saran selama menempuh menempuh pendidikan Doktor. Ketua

Departemen

Farmakologi

Fakultas

Kedokteran

Universitas

Airlangga Roostantia Indrawati,dr.,M.Kes dan mantan ketua Departemen Farmakologi Ramadhani,dr.,M.Kes yang telah memberikan ijin dan kesempatan pada saya untuk mengikuti pendidikan Doktor Teman sejawat di Departemen Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberikan bantuan dan perhatian selama saya menempuh pendidikan Doktor. Anny Setijo Rahaju, dr.,Sp.PA di Departemen Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah membantu dalam menyelesaikan penelitian disertasi. Para staf yang membantu dalam menyelesaikan penelitian Pak Sugeng, Mbak Agnes, Pak Heri, Bu Leni, dan Pak Sudjarwo. Para staf di bagian pendidikan Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Universitas Airlangga. Rekan di Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah bekerjasama dengan baik dan saling memberi motivasi untuk menyelesaikan pendidikan ini. Saya sampaikan rasa hormat dan kasih sayang yang tak terhingga kepada: Orangtua saya Achsan Karim (Alm) dan Rubi’ah. Mertua saya Sodikun (Alm) dan Sunarsih. Suami saya Ariefudin Achmad,Ir. dan anak saya Hasby Fahrudin,

viii Disertasi



Zumara Ma’rifah Azzahra dan Aqila Rashida. Abi Ihya Ullumuddin yang telah memberikan pelajaran berharga bagi saya untuk menyikapi kehidupan ini. Akhirnya kepada semua pihak yang namanya tidak bisa saya sebutkan satu persatu, yang telah membantu selama penelitian berlangsung hingga tahap penulisan, saya sampaikan terima kasih yang sebesar-besarnya. Semoga hasil penelitian dalam disertasi ini bermanfaat bagi masyarakat dan Semoga Allah SWT meridloiNya. Amiin ya Rabbal Alamin.

Penulis

ix Disertasi



RINGKASAN

Mekanisme Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica (pegagan) Dalam Meningkatan Apoptosis sel Alveolar Makrofag dari Jaringan paru Tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri intraseluler di dalam makrofag yang mempunyai kemampuan untuk menghindari antibiotika dan mengubah respons imunologi dari makrofag. Secara umum, respons imun tubuh akan berusaha untuk melakukan eliminasi patogen khususnya

melalui apoptosis.

yang masuk ke dalam tubuh,

Pada infeksi tuberkulosis ditemukan bahwa

Mycobacterium tuberculosis mempunyai kemampuan untuk menghambat apoptosis sel makrofag sehingga Mycobacterium tuberculosis berkembang biak di dalam makrofag. Ekstrak etanol Centella asiatica mempunyai kemampuan untuk membunuh Mycobaterium tuberculosis dan meningkatkan respons imun seluler dan apoptosis pada sel kanker. Bukti ini menimbulkan harapan bahwa tumbuhan tersebut dapat berfungsi sebagai imunostimulan terutama untuk meningkatkan apoptosis makrofag dengan infeksi Mycobacterium tuberculosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui efek dan mekanisme ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap apoptosis sel makrofag jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Metode yang digunakan pada penelitian ini

adalah eksperimental

laboratories pada tikus. Tiga puluh lima tikus jantan dinfeksi secara intratrakeal dengan Mycobacterium tuberculosis dan dibagi secara random menjadi 5

x Disertasi



kelompok. Kelompok 1, 2, dan 3 mendapat ekstrak etanol Centella asiatica dengan dosis 375mg/Kgbb, 750mg/KgBB, 1500mg/KgBB, sekali sehari secara peroral selama 14 hari. Sedangkan kelompok 4 tidak memperoleh ekstrak etanol Centella asiatica. Pemberian ekstrak etanol Centella asiatica dimulai pada hari ke-29 setelah tikus diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Kelompok 5 adalah kelompok tikus yang diterminasi pada hari ke 28 untuk menentukan adanya infeksi tuberkulosis pada hewan coba. Pemeriksaan ekspresi protein Bcl-2, protein Bax, Caspase-8 dan antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag dilakukan dengan menggunakan metode imunohistokimia. Apoptosis sel alveolar makrofag diperiksa dengan pengecatan TUNEL assay. Pemeriksaan jumlah Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru dilakukan dengan kultur jaringan paru pada media Midllebrook 7H10. Pemeriksaan kerusakan jaringan paru dilakukan dengan pengecatan Hematoksilin Eosin dan penilaian kerusakan jaringan berdasarkan skor Dormans. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Ekstrak etanol herba Centella asiatica tidak secara linier menurunkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag jaringan paru tikus seiring dengan peningkatan dosis yang diberikan. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500 mg/KgBb

memberikan perbedaan yang

signifikan pada penurunan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag bila dibandingkan dengan kontrol, tetapi diantara ketiga dosis tersebut tidak memberikan perbedaan yang bermakna.

xi Disertasi



Efek ekstrak etanol

herba Centella asiatica pada penelitian ini

meningkatkan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium

tuberculosis secara bermakna

dibandingkan dengan kontrol. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb pada ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol, sedangkan dosis 750 mg/Kgbb ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag meningkat secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dari dosis 375 mg/KgBb ke 750 mg/KgBb menyebabkan peningkatan ekspresi protein Bax, tetapi pemberian ekstrak pada dosis 1500mg/KgBb menyebabkan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag menurun. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica secara bermakna meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Peningkatan dosis ekstrak etanol

herba Centella asiatica yang diberikan dengan dosis 375

mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier meningkatkan ekspresi protein caspase 8 pada sel alveolar makrofag, karena hanya dosis 750 mg/KgBb yang dapat meningkatkan ekspresi Caspase-8 secara bermakna. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis secara bermakna bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dengan dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier meningkatkan

xii Disertasi



apoptosis sel alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb memberikan peningkatan apoptosis yang tertinggi. Hasil

dari penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba

Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis. Peningkatan dosis ekstrak etanol

herba Centella asiatica yang

diberikan dengan dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis yang paling rendah. Penelitian

ini

menunjukkan

penurunan

jumlah

Mycobacterium

tuberculosis yang signifikan akibat pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica terutama pada dosis 750 mg/kgBB dan 1500mg/KgBB. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus secara signifikan terutama pada perivaskulitis, alveolitis dan pembentukan granuloma pada dosis optimum 750 mg/KgBB. Kesimpulan penelitian ini adalah ekstrak etanol herba Centella asiatica memiliki bahan aktif yang mempunyai kemampuan untuk meningkatkan respons sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis,

melalui

peningkatan

apoptosis

sel

makrofag.

Mekanisme

peningkatan apoptosis sel alveolar makrofag tersebut melalui peningkatan eskpresi protein Caspase 8, peningkatan ekspresi protein Bax dan penurunan ekspresi protein Bcl-2. Hasil dari proses tersebut menyebabkan penurunan jumlah

xiii Disertasi



Mycobacterium tuberculosis dan penurunan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.

xiv Disertasi



SUMMARY

Mechanism of Ethanol Extracts of Centella asiatica herb in enhancing Apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis is an intracellular bacterium within macrophages. The bacterium has the ability to evade antibiotics and manipulate host defense pathways. In general, when a cell is infected by pathogens, the immune response will effort to eliminate pathogens through various mechanisms, particularly to inhibit apoptosis of infected host cells. Mycobacterium tuberculosis can induced the anti-apoptotic protein in macrophages infected by Mycobacterium tuberculosis, therefore the bacteria can multiply within macrophages. Ethanol extract of Centella asiatica is medicinal plant which is able to reduce growth of Mycobaterium tuberculosis and enhance the cellular immune response and apoptosis in cancer cells. This evidence raises the hope that the plants can be used as imunostimulant,

particularly to enhance the apoptosis of macrophages in

Mycobacterium tuberculosis infection. The aim of this research is to determine the effect and mechanism of the ethanol extract of Centella asiatica herbs in enhancing apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis. The research method is an experimental laboratory in rats. Thirty-five male rats were infected by Mycobacterium tuberculosis using intratrachea method

xv Disertasi



and they were divided randomly into 5 groups. Groups 1, 2, and 3 were given ethanol extracts of Centella asiatica herbs at

375mg/KgBW, 750mg/KgBW,

1500mg/KgBW, peroral daily for 14 days. The fourth group were not given ethanol extract of Centella asiatica herbs. The fifth group were terminate at 28 days after infected by Mycobacterium tuberculosis. The treatment of ethanol extracts of Centella asiatica herbs were begin on day 29th after rats infected by Mycobacterium tuberculosis. Apoptosis, expression of Bcl 2, expression of Bax, expression of Caspase 8 and expression of antigen of Mycobacterium tuberculosis were performed by using immunohistochemistry. The bacillary load were evaluated by culture on Middlebrook 7H10. The damaging of rats lung tissue were analyzed by histopathological and the damaging of tissue was assessed based on the score of Dormans. The results have shown that the etanol extract of Centella asiatica herbs at 375 mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW were able to reduce significantly Bcl2 expression of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis. The effect of etanol extract of Centella asiatica herbs at 750 mg/KgBW were able to increase significantly Bax expression of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis. Administration of etanol extract of Centella asiatica herbs 375 mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW increased significantly caspase 8 expression of alveolar macrophages. Interestingly, the increasing of caspase 8 expression decreased at dose 1500 mg/KgBW.

xvi Disertasi



The Effect of etanol extract of Centella asiatica herbs at 375 mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW were able to enhance significantly apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis, but the dose of 750 mg/KgBW gave the highest increase. Administration of etanol extract of Centella asiatica herbs at 375 mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW decreased significantly expression of antigen Mycobacterium tuberculosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis, but the dose of 750 mg/KgBW gave the lowest decrease. This extract were able to reduce the growth of

Mycobacterium

tuberculosis. The optimum dose of this extract were able to reduce the growth of Mycobacterium tuberculosis was 750 mg/KgBW and 1500 mg/KgBW. The ethanol extract of Centella asiatica herbs at 375 mg/KgBW, 750 mg/KgBW, and 1500 mg/KgBW decreased significantly rats lung tissue damage, especially in perivasculitis, alveolitis, and granuloma formation, but the optimum dose of this extract to decrease rats lung tissue damage was 750 mg/KgBW. In conclusion, the ethanol extract of Centella asiatica herbs have active ingredients to enhance of apoptosis alveolar macrophages from rat lung tissue that were infected by Mycobacterium tuberculosis through increasing of Caspase 8’s expression, Bax’expression and decreasing of Bcl-2’s expression. The effect of ethanol extract of Centella asiatica herb is a chain reaction that occurs in various stages until decrease the bacillary load of Mycobacterium tuberculosis and reduce rats lung tissue damage.

xvii Disertasi



ABSTRACT Mechanism of Ethanol Extracts of Centella asiatica herbs in enhancing Apoptosis of alveolar macrophages from rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis has capacity to manipulate host defense pathway, particularly the ability to inhibit apoptosis of infected host cells. Centella asiatica is a medicinal plant which is able to reduce growth of Mycobacterium tuberculosis and enhance the cellular immune response and apoptosis in cancer cells. The aim of this research is to determine the effect and mechanism of the ethanol extract of Centella asiatica herbs in enhancing apoptosis of alveolar macrophages from rat lung tissue that has been infected by Mycobacterium tuberculosis. . The research method is an experimental laboratory in. Thirty five male rats were infected by Mycobacterium tuberculosis using intratrachea method and they were divided randomly into 5 groups. Group 1, 2, and 3 were given ethanol extracts of Centella asiatica herbs at 375mg/KgBW, 750mg/KgBW, 1500mg/KgBW, daily for 14 days. The fourth group were not given ethanol extract of Centella asiatica herbs. The fifth group were terminate at 28 days after infected by Mycobacterium tuberculosis. Apoptosis, expression of Bcl 2, Bax, Caspase 8 and antigen of Mycobacterium tuberculosis were performed by using immunohistochemistry. The bacillary loads were evaluated by culture in Middlebrook 7H10. The damaging of rats lung tissue were analyzed by histopathological. The results have shown that the ethanol extract of Centella asiatica herbs were able to reduce expression of Bcl-2 and antigen of Mycobacterium tuberculosis, increase expression of Bax, increase expression of Caspase 8 and enhance the apoptosis of alveolar macrophages in rats lung tissue infected by Mycobacterium tuberculosis. Ethanol extract of Centella asiatica herbs have decreased the number of Mycobacterium tuberculosis and reduced lung tissue damage of rats infected by Mycobacterium tuberculosis. . In conclusion, the ethanol extract of Centella asiatica herbs have active ingredients to enhance of apoptosis alveolar macrophages from rat lung tissue that were infected by Mycobacterium tuberculosis through increasing of Caspase 8’s expression, Bax’expression and decreasing of Bcl-2’s expression. The effect of ethanol extract of Centella asiatica herb is a chain reaction that occurs in various stages until decrease the bacillary load of Mycobacterium tuberculosis and reduce rats lung tissue damage. Key words : Extracts ethanol of Centella asiatica, Mycobacterium tuberculosis, macrophages, apoptosis, rats lung tissue

xviii Disertasi



DAFTAR ISI Halaman

Sampul Depan

i

Sampul Dalam

ii

Lembar Pengesahan

iii

Penetapan Panitia Penguji

iv

UCAPAN TERIMA KASIH

v

RINGKASAN

ix

SUMMARY

xiv

ABSTRACT

xvii

DAFTAR ISI

xviii

DAFTAR TABEL

xxiii

DAFTAR GAMBAR

xxvi

DAFTAR LAMPIRAN

xxvii

DAFTAR ARTI / LAMBANG / SINGKATAN / ISTILAH

xxviii

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang

1

1.2 Rumusan Masalah

5

1.3 Tujuan Penelitian

6

1.4 Manfaat Penelitian

7

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Centella asiatica

9

2.1.1 Taksonomi Centella asitica

10

xix Disertasi



2.1.2 Profil farmakokinetik dan toksisitas Centella asiatica

10

2.1.3 Khasiat Centella asiatica

12

2.2 Mycobacterium tuberculosis

14

2.2.1 Patogenesis tuberkulosis

16

2.2.2 Gejala klinis tuberkulosis

19

2.2.3 Pengobatan tuberkulosis

19

2.3 Respons Imun terhadap Mycobacterium tuberculosis

20

2.4 Apoptosis

30

2.4.1 Perbedaan apoptosis dengan nekrosis

31

2.4.2 Protein Caspase

34

2.4.3 Protein Bax dan Bcl-2

35

2.4.4 Apoptosis pada tuberkulosis

36

2.5 Sel Alveolar Makrofag

41

2.6 Kerusakan Jaringan Paru

42

BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS PENELITIAN 3.1 Kerangka Konseptual

47

3.2 Hipotesis

49

BAB 4 MATERI DAN METODE PENELITIAN 4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

51

4.2 Unit eksperimen dan replikasi

52

4.3 Variabel Penelitian

55

4.4 Bahan dan Alat Penelitian

57

4.5 Lokasi dan Waktu Penelitian

59

xx Disertasi



4.6 Prosedur Penelitian

59

4.7 Analisis Data

69

4.8 Kelaikan Etik

69

Bab 5 HASIL DAN ANALISIS HASIL 5.1 Hasil Ekstraksi dan identifikasi herba Centella asiatica

70

5.2 Hasil Model Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada tikus

71

5.3 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

73

5.4 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

75

5.5 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

78

5.6 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

81

5.7 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis

xxi Disertasi



dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

84

5.8 Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis(CFU/ml) dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

87

5.9. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

89

BAB 6 PEMBAHASAN

98

6.1 Ekstraksi dan identifikasi herba Centella asiatica

99

6.2 Model Infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus

100

6.3 Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

102

6.4 Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

106

6.5 Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis

109

6.6 Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

111

6.7 Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan

xxii Disertasi



jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar Makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

113

6.8 Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis(CFU/ml) dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

114

6.9 Efek ekstrak etanol Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

117

6.10. Temuan baru

121

BAB 7. PENUTUP 7.1. KESIMPULAN

122

7.2. SARAN

123

DAFTAR PUSTAKA

124

LAMPIRAN

134

xxiii Disertasi



DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 4.1 Skala Dormans

67

Tabel 5.1 Perhitungan statistik ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

75

Tabel 5.2 Perhitungan statistik ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

77

Tabel 5.3 Perhitungan statistik ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

80

Tabel 5.4 Perhitungan statistik apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

83

Tabel 5.5 Perhitungan statistik ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

87

Tabel 5.6 Perhitungan statistik jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml/gram)jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

89

Tabel 5.7 Perhitungan statistik peribronkiolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

91

Tabel 5.8 Perhitungan statistik perivaskulitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

92

Tabel 5.9 Perhitungan statistik alveolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x),

xxiv Disertasi



simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Tabel 5.10 Perhitungan statistik granuloma jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Tabel 5.11 Perhitungan statistik jumlah total skor Dormans kerusakan jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum)

93

95

96

xxv Disertasi



DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Centella asiatica

9

Gambar 2.2 Struktur dinding sel Mycobacterium tuberculosis

15

Gambar 2.3. Kemungkinan Luaran bila individu terpapar

21

Gambar 2.4. Maturasi Fagosom dan blokade fagolisosom

24

Gambar 2.5. Mekanisme apoptosis

31

Gambar 2.6. Infeksi bakteri tuberkulosis virulen

37

Gambar 2.7. Histopatologi paru mencit

43

Gambar 3.1. Skema Kerangka Konseptual

47

Gambar.4.1. Bagan rancangan penelitian

51

Gambar 4.2. Skema alur penelitian

69

Gambar 5.1. Hasil KLT ekstrak etanol Centella asiatica

71

Gambar 5.2. Histopatologi kerusakan jaringan paru tikus pada minggu ke-4 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis makrofag pada jaringan paru tikus.

72

Gambar 5.3. Rerata ekspresi protein Bcl 2 positif sel alvelolar makrofag pada jaringan paru tikus

73

Gambar 5.4. Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru Tikus

74

Gambar 5.5. Rerata ekspresi protein Bax positif sel alvelolar makrofag pada jaringan paru tikus

76

Gambar 5.6. Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag jaringan paru tikus.

77

Gambar 5.7. Rerata ekspresi enzim Caspase-8 positif sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus

79

Gambar 5.8. Ekspresi protein caspase-8 sel alveolar makrofag

xxvi Disertasi



jaringan paru tikus

80

Gambar 5.9. Hasil rerata apoptosis alveolar makrofag pada jaringan paru

82

Gambar 5.10. Apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus

83

Gambar 5.11. Rerata ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis positif dari sel alveolar makrofag

85

Gambar 5.12. Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus

86

Gambar 5.13. Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis pada MidlleBrook 7H10

88

Gambar 5.14. Hasil rerata jumlah Mycobacterium tuberculosis CFU/ml/gram dari jaringan paru tikus

88

Gambar 5.15. Peribronkiolitis

90

Gambar 5.16. Perivaskulitis

92

Gambar 5.17. Alveolitis

94

Gambar 5.18. Granuloma

95

Gambar 5.19. Skema Analisis Jalur

97

xxvii Disertasi



DAFTAR LAMPIRAN Halaman

Lampiran 1. Determinasi Centella

135

Lampiran 2. Ethical Clearance

136

Lampiran 3. Data Penelitian pretest

137

Lampiran 4. Data Penelitian

138

Lampiran 5. Hasil uji statistik

139

Lampiran 6. Prosedur pemeriksaan Tunnel assay

160

xxviii Disertasi



DAFTAR ARTI LAMBANG / SINGKATAN / ISTILAH ANAVA

= Analysis of Variance

BCG

= Bacillus Calmette Guerin

BCL

= Burkitt Cell Lymphoma

BTA

= Basil Tahan Asam

BSL

= Bio Safety Level

C

= Complement

CCR

= Chemokine Receptor

CD

= Cluster Differentiation

CFU

= Colony Forming Unit

CMC Na

= Carboxyl Methyl Cellulose Natrium

CMI

= Celluler Mediated Immunity

DAB

= Diamino benzidine

DC SIGN

= Dendritic Cell Specific Interceluller adhesion molecule Grabing Non integrin

DISC

= Death Inducing Signaling Complex

DNA

= Deoxyribonucleat

DTH

= Delayed Type Hypersensitif

EMCA

= Ekstrak Metanol Centella Asiatica

ESAT-6

= Early Secretory Antigenic Target-6

HIV

= Human Immunodefesiensi Virus

HPLC

= High Performance Liquid Chromatography

HNP

= Human Neutrofil Defensin

xxix Disertasi



IFN-γ

= Interferon Gamma

INH

= Isoniazid

IL

= Interleukin

kD

= kilo Dalton

KLT

= Kromatografi Lapis Tipis

LAM

= Lipoarabinomannan

LJ

= Lowenstein Jensen

MDR

= Multiple Drug Resitance

MMP

= Matrix Metalloproteinase

MHC

= Major Histocompatibility Complex

MTSA

= Mycobacterium Tuberculosis Secreted Antigen

OAT

= Obat Anti Tuberculosis

NFκB

= Nuclear Factor Kappa Beta

NK

= Natural Killer

ROI

= Reactive Oxygen Intermediate

TACO

= Tryptophan Aspartate Coat Protein

TDT

= Terminal Deoxynucleotidyl Transferase

TB

= Tuberkulosis

TGF-β

= Tumor Growth Factor Beta

Th

= T Helper

TIMPs

= Tissue Inhibitor of Matrix Metalloproteinase

TLR

= Toll Like Receptor

TNF-α

= Tumor Necrosis Factor Alfa

TRADD

= TNF receptor associated death domain

xxx Disertasi



VATP-ase

= Vesicular Proton-Pump Adenosin Triphosphatase

WHO

= World Health Organization

xxxi Disertasi



BAB 1 PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Tuberkulosis (TB) adalah penyakit yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis. Penyakit tersebut sudah ada sejak sebelum pencatatan sejarah dimulai. Penyakit ini meninggalkan tanda dalam berbagai kehidupan manusia termasuk musik, seni dan budaya, serta mempengaruhi kemajuan ilmu biomedis dan perawatan kesehatan dan telah membunuh lebih banyak manusia dibandingkan dengan mikroba patogen yang lain (Daniel, 2006). Bakteri tuberkulosis ditemukan pada tahun 1882, dan dunia optimis mampu memberantas penyakit tersebut dengan obat antibiotika. Berbagai macam antibiotika untuk membunuh bakteri tuberkulosis telah ditemukan pada tahun 1944 dan tahun 1950, terapi tuberkulosis dengan menggunakan kombinasi berbagai antibiotika. Berbagai bukti menunjukkan bahwa sepertiga penduduk dunia telah terinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Pada tahun 2009, jumlah penderita tuberkulosis di dunia 9,4 juta atau 137 kasus per 100.000 penduduk, sebanyak 35% adalah wanita. Jumlah penderita baru dan kambuh 292.753 per tahun Penderita yang paling banyak terdapat di Asia 55%, Afrika 30%, timur Tengah 7%, Eropa 4% dan Amerika 3%. Angka kematian 1,7 juta pertahun. Jadi hampir di seluruh dunia tidak terbebas dengan infeksi tuberkulosis. Indonesia menduduki peringkat kelima setelah India, Cina, Afrika Selatan dan Nigeria (WHO, 2010). Berbagai strategi pengobatan telah digunakan untuk menurunkan insiden dan angka kematian karena tuberkulosis, tetapi kasus dan angka kematiannya tetap tinggi bahkan cenderung meningkat terlebih lagi dengan adanya infeksi 1 Disertasi



2 human immunodeficiency virus (HIV). Jumlah penderita tuberkulosis yang juga menderita HIV sebesar 27% di dunia, sedangkan di Indonesia sebesar 2,8%. Jumlah penderita HIV dengan tuberkulosis meningkat setiap tahunnya dari tahun 2005 sebesar 8,5% menjadi 27% pada tahun 2009. Pada penderita acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) tuberkulosis merupakan penyebab kematian nomor satu. Data ini menunjukkan bahwa respons imun tubuh memegang peranan penting pada infeksi tuberkulosis (WHO, 2010). Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri intraseluler di dalam makrofag. Bakteri tersebut selain mempunyai kemampuan menghindar dari antibiotika juga mampu mengubah respons makrofag. Kemampuan bakteri untuk mengubah respons makrofag juga ditentukan oleh respons imun penderita. Apabila terjadi gangguan respons imun pada inang maka bakteri akan terhindar dari mekanisme eliminasi

sistem imun. Oleh karena itu, respons imun

memegang peranan yang fundamental bagi luaran infeksi bakteri tuberkulosis. Diduga bahwa salah satu penyebab kegagalan penanganan tuberkulosis, karena kegagalan respons imun dari penderita itu sendiri (Kritski et al., 2007). Secara umum, bila suatu sel terinfeksi oleh suatu patogen, maka respons imun tubuh akan berusaha mengeliminasi patogen melalui berbagai macam mekanisme. Salah satunya

melalui mekanisme apoptosis. Pada infeksi tuberkulosis

ditemukan suatu fenomena bahwa pada makrofag justru terjadi anti apoptosis yang ditandai dengan peningkatan berbagai protein anti apoptosis seperti Bcl-2 dan penurunan protein proapoptosis seperti Bax (Mustafa et al., 2001; Mogga et al., 2002; Velmurugan et al., 2007; Rodrigues et al., 2009). Berbagai proses ini menyebabkan bakteri Mycobacterium tuberculosis mampu berkembang biak di dalam makrofag. Jadi hambatan proses apoptosis pada makrofag oleh

Disertasi



3 Mycobacterium tuberculosis merupakan faktor virulensi bagi bakteri (Zhang et al., 2005; Patel et al., 2009; Behar et al., 2010; Danelishvili et al., 2010; Maziar et al., 2010; Miller et al., 2010; Rudel et al., 2010). Berdasarkan

berbagai penelitian yang berhubungan dengan mekanisme

imunopatogenesis tuberkulosis di atas, maka perlu dilakukan suatu penelitian tentang metode penanganan tuberkulosis yang lebih tepat. Karena respons imun mempunyai peranan penting dalam perkembangan infeksi tuberkulosis, maka penanganan tuberkulosis tidak hanya dengan menggunakan antibiotika tetapi perlu

ditambahkan

imunostimulan

terhadap

respons

imun.

Pemberian

imunostimulan tersebut terutama untuk meningkatkan apoptosis pada makrofag yang terinfeksi bakteri, sehingga respons imun dapat berfungsi sebagai suatu sistem yang mampu mengeliminasi bakteri. Keuntungan dari apoptosis ini adalah meningkatkan eliminasi bakteri tanpa ada bahan intraseluler yang keluar ke ekstraseluler sehingga bakteri tidak bisa tersebar keluar dari sel. Selain itu, proses apoptosis ini akan meminimalkan reaksi inflamasi yang akan merusak jaringan sekitarnya (Elmore, 2007; Samali et al., 2010; Peter et al., 2010). Berbagai penelitian telah dilakukan untuk mengetahui tanaman yang diduga mempunyai khasiat sebagai imunodulator. Penelitian ekstrak tanaman sebagai imunostimulan pada infeksi tuberkulosis masih perlu dilakukan. Pemerintah Indonesia mendukung pengembangan obat dari tanaman untuk capaian tujuan temuan obat baru, termasuk untuk mengatasi masalah infeksi. Hal ini juga sejalan dengan strategi WHO (Gitawati et al., 2005). Salah satu bahan imunomodulator yang saat ini sedang dikembangkan adalah tanaman obat. Centella asiatica adalah tumbuhan yang banyak terdapat di Indonesia. Tumbuhan ini sudah sejak lama digunakan sebagai bahan obat

Disertasi



4 terutama untuk penyembuhan luka. Beberapa peneliti membuktikan bahwa Centella asiatica yang mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, polifenol dan polisakarida juga memiliki khasiat antimikroba (Suratman et al., 1996; Mamtha et al., 2004; Wang et al., 2004; Gitawati et al., 2005). Kandungan senyawa yang terbesar dalam tumbuhan tersebut adalah senyawa golongan madecasic acid, asiatic acid, madecasoside dan asiaticoside. Kandungan lainnya adalah asiatiquercetin-3-glycoside, kämpferol-3-glycoside (Bunyapraphatsara et al., 1999). Ekstrak

etanol

Centella

asiatica

menghambat

pertumbuhan

Mycobaterium tuberculosis invitro dan meningkatkan produksi imunoglobulin G pada mencit (Gitawati et al., 2005; Mustika dkk, 2009). Peneliti lain juga menunjukkan peningkatan titer antibodi pada mencit yang memperoleh ekstrak Centella asiatica (Fatmasari et al., 2007). Ekstrak air dan etanol Centella asiatica mampu meningkatkan kadar tumor necrosis factor-α (TNF-α) pada kultur sel makrofag sehat (Punturee et al., 2004). Ekstrak tersebut meningkatkan ekspresi sel cluster differentiation (CD)4, CD8, makrofag dan meningkatkan produksi sitokin TNF-α, interferon-γ (IFN-γ) dan menghambat

transforming growth

factor-β (TGF-β) pada sel makrofag (Taib, 2000; Punturee et al., 2005; Lyu et al., 2005). Ekstrak etanol Centella asiatica telah dibuktikan meningkatkan kadar IFN-γ secara bermakna pada makrofag terinfeksi Mycobacterium tuberculosis bila dibandingkan dengan kontrol (Mustika dkk, 2009). Asiatic acid salah satu kandungan senyawa kimia yang dimiliki oleh Centella asiatica menginduksi apoptosis makrofag melalui peningkatan sitokrom-c dan protein caspase-3 (Cho et al., 2003). Berbagai penelitian membuktikan bahwa baik ekstrak Centella asiatica maupun derivatnya asiatic acid menginduksi apoptosis pada berbagai

Disertasi



5 sel kanker (Lee et al., 2002; Cho et al., 2003; Parka et al., 2005; Babykutty et al., 2009; Tang et al., 2009). Bukti ini menimbulkan harapan bahwa tumbuhan tersebut dapat berfungsi sebagai imunostimulan terutama untuk meningkatkan apoptosis makrofag pada infeksi Mycobacterium tuberculosis. Berdasarkan

latar belakang

di atas, peneliti tertarik pada efek dan

mekanisme Centella asiatica terhadap aktivitas respons imun terutama kemampuannya

untuk menginduksi apoptosis makrofag yang terinfeksi

tuberkulosis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap mekanisme apoptosis sel makrofag jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Mekanisme ini penting untuk diketahui karena apoptosis pada makrofag akan meningkatkan eliminasi bakteri dan mencegah bakteri tersebar ke ekstraseluler, sehingga bakteri tersebut tidak dapat menginfeksi sel di sekitarnya. Dengan demikian proses penyakit infeksi tuberkulosis serta penyebaran infeksi ke populasi sekitarnya dapat dihentikan atau disembuhkan.

1.2. Rumusan Masalah Berdasarkan latar belakang dari penelitian ini, maka dapat dirumuskan permasalahan sebagai berikut : 1. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica protein Bcl-2

menurunkan ekspresi

sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ? 2. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein

Bax sel alveolar pada jaringan paru tikus yang diinfeksi

Mycobacterium tuberculosis ?

Disertasi



6 3. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ? 4. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag (fragmentasi DNA) pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ? 5. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica

menurunkan jumlah

ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ? 6. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica

menurunkan jumlah

Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ? 7. Apakah ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis ?

1.3. Tujuan Penelitian 1.3.1. Tujuan umum Membuktikan efek dan mekanisme ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap peningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 1.3.2. Tujuan khusus 1. Membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2

sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus

yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.

Disertasi



7 2. Membuktikan

bahwa

ekstrak

etanol

herba

Centella

asiatica

meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 3. Membuktikan

bahwa ekstrak etanol

meningkatkan ekspresi

herba Centella asiatica

protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada

jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 4. Membuktikan

bahwa

ekstrak

etanol

herba

Centella

asiatica

meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag (fragmentasi DNA) pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. 5. Membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. 6. Membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. 7. Membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

1.4. Manfaat Penelitian 1.4.1. Manfaat teoritik Temuan pada penelitian ini memberikan informasi ilmiah berupa konsep baru : Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada infeksi tuberkulosis dan mekanisme kerja Centella asiatica dalam membantu penyembuhan penyakit tuberkulosis yaitu melalui peningkatan apoptosis sel makrofag jaringan paru tikus yang dapat menurunkan kerusakan jaringan.

Disertasi



8 1.4.2. Manfaat praktis Hasil temuan pada penelitian ini dapat dilanjutkan sampai tingkat uji klinis lengkap dan diharapkan berguna menunjang pengembangan obat dari ekstrak etanol herba Centella asiatica untuk terapi kombinasi pada pengobatan penyakit tuberkulosis yang diperlukan masyarakat. Sedangkan bagi industri farmasi, hasil penelitian ini berguna pada skala produksi setelah melalui berbagai uji klinis.

Disertasi



9

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Centella asiatica Centella asiatica adalah tanaman liar yang banyak tumbuh di perkebunan, tepi jalan, serta pematang sawah. Tanaman ini berasal dari daerah Asia tropik, tersebar di Asia Tenggara, termasuk Indonesia, India, Republik Rakyat Cina, Jepang dan Australia kemudian menyebar ke berbagai negaranegara lain. Nama yang biasa dikenal untuk tanaman ini selain pegagan adalah daun kaki kuda dan antanan (Bunyapraphatsara et al., 1999).

Gambar 2.1 Centella asiatica (Mustika, 2011). Sejak zaman dahulu, pegagan telah digunakan untuk obat kulit, gangguan saraf dan memperbaiki peredaran darah. Masyarakat Jawa barat mengenal tanaman ini sebagai salah satu tanaman untuk lalapan. Pegagan merupakan tanaman herba tahunan yang tumbuh menjalar dan berbunga sepanjang tahun. Tanaman akan tumbuh subur bila tanah dan lingkungannya sesuai hingga dijadikan penutup tanah. Jenis pegagan yang banyak dijumpai adalah pegagan hijau. Pegagan hijau sering banyak dijumpai di daerah pesawahan dan diselasela rumput. Tempat yang disukai oleh pegagan hijau yaitu tempat agak

Disertasi



10 lembab dan terbuka atau agak ternaungi. Selain itu, tanaman yang mirip pegagan atau antanan ada empat jenis yaitu antanan kembang, antanan beurit, antanan gunung dan antanan air (Bunyapraphatsara et al.,1999). 2.1.1 Taksonomi Centella asiatica Taksonomi

Centella

tumbuhan

asiatica

adalah

(Bailey,

1953;

Bunyapraphatsara et al.,1999): Divisi

: Spermatophyta

Sub divisi

: Angiospermae

Kelas

: Dicotyledonae

Bangsa

: Umbilliferae

Suku

: Umbilliferae

Marga

: Centella

Jenis

: Centella asiatica(L)Urb. Kandungan kimia utama pegagan adalah asiaticoside, madecasoside,

asiatic acid dan madecasic acid. Kandungan kimia lainnya adalah asiaticoside,

asiatoside,

asiatic

acid

oxyasiaticoside,

thankuniside,

isothankuniside, inositol, centellose, carotenoids, berbagai garam mineral seperti garam kalium, natrium, magnesium, kalsium, besi, vellarine, zat samak (Bunyapraphatsara et al.,1999). 2.1.2 Profil farmakokinetik dan toksisitas Centella asiatica Pada penelitian toksisitas akut diketahui bahwa ekstrak etanol Centella asiatica pada mencit secara peroral sampai pada dosis 10.000mg/KgBB tidak terjadi kematian. Pengamatan ini dilakukan sampai hari ke-7 ( Djatmiko dkk, 2009). Penelitian lain menunjukkan bahwa asiaticoside, salah satu kandungan dari Centella asiatica, diberikan pada mencit secara peroral sampai pada dosis

Disertasi



11 1g/kg BB mencit tidak menunjukkan tanda toksik. Pemberian ekstrak Centella asiatica pada mencit dan kelinci menimbulkan efek toksik pada pemberian secara intramuskular pada dosis 40-50 mg/KgBB. Penelitian teratogenik pada kelinci juga menujukkan bahwa ekstrak Centella asiatica tidak menujukkan efek teratogenik (Pizzorno et al., 1996). Penelitian tentang profil farmakokinetika terpenoid dari ekstrak Centella asiatica telah dilakukan pada manusia sehat. Kadar terpenoid dari ekstrak Centella asiatica yang diukur di dalam plasma adalah kadar asiatic acid. Kadar asiatic acid di dalam plasma diukur dengan menggunakan metode high performance liquid chromatography (HPLC). Hasil penelitian tersebut menunjukkan bahwa setelah pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica pada dosis tunggal 30 mg secara peroral, kadar maksimum asiatic acid di dalam plasma adalah 0,70 ± 0,11 µg/ml dan waktu paruhnya adalah 2,20 ± 0,30 jam. Kadar maksimum asiatic acid di dalam plasma setelah pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica pada dosis tunggal 60 mg secara peroral adalah 1.36 ± 0,13 µg/ml dan waktu paruhnya adalah 3,4 ± 0,68 jam. Pada pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica dengan dosis dua kali sehari 30 mg secara peroral selama 7 hari menunjukkan kadar maksimum asiatic acid di dalam plasma adalah 1,03 ± 0,05 µg/ml dan waktu paruhnya adalah 6,33 ± 1.82 jam. Kadar maksimum asiatic acid di dalam plasma setelah pemberian terpenoid dari ekstrak Centella asiatica pada dosis dua kali sehari 60 mg secara peroral selama 7 hari adalah 1,69 ± 0,07 µg/ml dan waktu paruhnya adalah 10,28 ± 1,80 jam (Grimaldi et al., 1990).

Disertasi



12 2.1.3

Khasiat Centella asiatica Centella asiatica adalah tumbuhan yang digunakan sebagai bahan obat terutama

untuk mempercepat

penyembuhan

luka.

Beberapa

peneliti

membuktikan bahwa Centella asiatica menstimulasi sintesis kolagen pada penyembuhan luka pada tikus (Djatmiko dkk., 2008). Terpenoid dari ekstrak Centella asiatica meningkatkan sintesis glikosaminoglikan dan menstimulasi sintesis kolagen sehingga mempercepat penyembuhan luka pada tikus (Shomashekar et al., 2006). Peneliti lainnya juga mampu membuktikan bahwa ekstrak Centella asiatica yang mengandung senyawa golongan terpenoid, flavonoid, polifenol dan polisakarida juga memiliki khasiat antimikroba. Pada dosis yang bervariasi antara 100 mg/ml sampai 400mg/ml ekstrak etanol pegagan mampu menghambat

mikroorganisme

antara

lain

:

E.coli,

S.

aureus,

V.

parahaemolyticus, P. aeruginossa, V. cholerae, S. typhimurium (Suratman et al., 1996; Mamtha et al., 2004; Wang et al., 2004). Ekstrak etanol Centella asiatica (pegagan) juga dibuktikan mampu menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis invitro pada media Lowenstein Jensen (LJ) dan 7H10. Dosis minimal yang mampu menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis adalah 15 mg/ml (Gitawati et al., 2005).

Mustika, 2009

melaporkan bahwa ekstrak etanol Centella asiatica mampu menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H 37 Rv yang dikultur pada media LJ. Ekstrak

metanol

Centella

asiatica

telah

dibuktikan

sebagai

imunomodulator pada tikus dengan cara meningkatkan eksprei dari CD4, CD8, makrofag, imunoglobulin G, M dan A. Hal ini membuktikan bahwa

Disertasi



13 ekstrak tersebut dapat mempengaruhi respons imunologi baik humoral maupun seluler. Pada penelitian ini mengungkapkan bahwa terdapat perbedaan modulasi respons imun antara ekstrak metanol Centella asiatica (EMCA) dengan tablet yang hanya mengandung asiaticoside, asiatic acid dan madecaside (FTECA). EMCA memodulasi respons imun melalui presentasi oleh molekul MHC klas II sedangkan FTECA memodulasi respons imun melalui MHC klas I (Taib, 2000). Ekstrak

etanol

Centella

asiatica

(pegagan)

juga

dibuktikan

meningkatkan produksi imunoglobulin G mencit (Gitawati et al., 2005). Peneliti lain juga

membuktikan bahwa ekstrak tumbuhan tersebut

meningkatkan kadar IFN-γ secara bermakna pada makrofag terinfeksi Mycobacterium tuberculosis dan meningkatkan produksi TNF-α tetapi tidak bermakna secara statistik (Mustika dkk, 2009). Peneliti lain juga menunjukkan peningkatan titer antibodi pada pemberian ekstrak tumbuhan tersebut pada mencit (Fatmasari et al., 2007). Ekstrak air dan etanol Centella asiatica mampu meningkatkan kadar TNF-α pada sel kultur makrofag sehat (Punturee et al., 2004). Centella asiatica

juga terbukti tidak bersifat toksik

dan

memiliki khasiat hepatoprotektif pada hewan coba tikus yang diinduksi dengan carbon tetrachloride (Anthony et al., 2006). Ekstrak Centella asiatica meningkatkan apoptosis pada sel kanker payudara secara invitro. Peningkatan apoptosis diduga karena perubahan permeabilitas membran mitokondria, yang akhirnya menyebabkan kondensasi nukleus dan fragmentasi deoxyribonuclease (DNA) (Babykutty et al., 2009). Bunpo et al., juga menemukan bahwa ekstrak Centella asiatica menghambat proses karsinogenesis pada usus tikus. Pada tahun 2005, Bunpo et al.,

Disertasi



14 membuktikan bahwa salah satu kandungan ekstrak Centella asiatica yaitu asiatic acid meningkatkan apoptosis pada kultur sel kanker usus besar HT-29 melalui perubahan ratio protein Bcl-2 dan Bak-xl. Asiatic acid yang diisolasi dari ekstrak Centella asiatica menginduksi apoptosis sel kanker melanoma melalui peningkatan reactive oxygen species, perubahan ratio Bax/Bcl-2 dan aktivasi protein caspase 3 (Park et al., 2005).

Selain itu, asiatic acid

mempunyai kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker melalui peningkatan apoptosis pada jalur intrinsik (Tang et al., 2009). Derivat dari asiatic acid salah satu kandungan senyawa kimia yang dimiliki oleh pegagan mampu menginduksi apoptosis makrofag. Pada penelitian yang menggunakan makrofag sel line Raw 264,7 juga membuktikan adanya peningkatan sitokrom-c, aktivasi caspase 3 dan pemecahan poly(ADPribose) pada proses apoptosis yang diinduksi oleh pegagan (Cho et al., 2003).

2.2. Mycobacterium tuberkulosis Bakteri ini di isolasi pertama kali oleh Robert Koch pada tahun 1882, dan pada tahun yang sama Ehrlich membuktikan bahwa bakteri tuberkulosis bersifat tahan asam. Morfologi bakteri ini berbentuk batang langsing lurus atau sedikit membengkok (membentuk kurva), terkadang berbentuk filamen atau bercabang membentuk huruf X,Y,V dengan ukuran 1- 4 mikron x 0,2-0,5 mikron, tersusun secara terpisah dan soliter atau membentuk gerombolan yang menyerupai tali (serpentine cord). Bakteri ini tidak membentuk spora, tidak membentuk kapsul dan tidak bergerak. Bersifat tahan asam, dinding selnya seperti dinding sel bakteri gram negatif tetapi lebih banyak mengandung lipid (sampai 60% dari berat bakteri kering) yang sebagian besar terikat dengan

Disertasi



15 polisakarida dan protein. Dengan pemberian lisosim akan terbentuk spheroplast. Sitoplasmanya mengandung granula metakromatik (Jawetz, 2007).

Gambar 2.2 Struktur dinding sel Mycobacterium tuberculosis (Park et al., 2000). Sifat utama dari bakteri tuberkulosis adalah ketahanannya terhadap zat peluntur yang bersifat asam. Ketahanan bakteri terhadap asam disebabkan oleh lapisan lilin pada dinding sel. Hal itu juga menyebabkan bakteri tuberkulosis mempunyai daya tahan di alam lebih kuat dari pada bakteri tidak berspora lainnya, dengan sinar matahari atau panas, bakteri akan mati dalam beberapa menit. Mikobakterium membentuk sedikit asam dari glukosa, maltosa, trihalosa dan gliserol. Mycobacterium tuberkulosis adalah katalase positif dan beberapa spesies membentuk sedikit H 2 S. Medium yang di gunakan untuk isolasi primer bakteri ini harus

mengandung sumber karbon (C) sumber

nitrogen (N) yang ditambah dengan serum atau telur, kentang, dan asam amino (asparagine). Salah satu contoh medium tersebut adalah medium Lowenstein Jensen. Medium lainnya adalah Petragnani / kentang gliserin dalam suasana aerob (Barrera, 2007).

Disertasi



16 Bakteri ini dapat tumbuh pada pH 6-7,6 (optimumnya 6,8) dan suhu 30˚C-41˚C (optimumnya 37˚C). Bersifat obligat aerob dan waktu generasinya 20-24 jam, karena waktu generasinya panjang maka waktu inkubasinya yang diperlukan adalah 6-8 minggu. Koloni pada medium Lowenstein Jensen kecil, kering, kasar berwarna putih kuning. Pada medium kultur bakteri tahan selama 2-8 bulan, bila terkena sinar matahari secara langsung tahan selama 2 jam, bakteri ini sangat tahan terhadap asam bila di bandingkan dengan bakteribakteri yang lain (Jawetz, 2007). Salah satu kunci patogenisitas dari Mycobacterium tuberkulosis adalah kemampuan bakteri tersebut untuk mengubah metabolismenya pada stadium yang berbeda. Setelah menginfeksi sel alveolar makrofag, Mycobacterium tuberkulosis melakukan perubahan pada sistem metabolismenya dengan menghentikan akumulasi masa biologi dan meningkatkan akumulasi asam mikolat dan asam lemak pada dinding selnya. Perubahan ini bertujuan untuk meningkatkan daya tahan bakteri terhadap lingkungan fagosom yang miskin nutrisi, hipoksia, nitrosatif dan oksidatif. Asam mikolat dan asam lemak merupakan faktor yang esensial pada resistensi Mycobacterium tuberkulosis terhadap antibiotika (Bordbar et al., 2010). 2.2.1 Patogenesis tuberkulosis Tuberkulosis adalah penyakit menular langsung yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberkulosis. Sebagian besar bakteri tersebut menyerang paru, tetapi dapat juga mengenai organ tubuh lainnya (Kritski, 2007). Sumber penularan adalah penderita tuberkulosis dengan pemeriksaan basil tahan asam (BTA) positif. Pada waktu batuk atau bersin, penderita

Disertasi



17 menyebarkan bakteri ke udara dalam bentuk droplet (percikan dahak). Droplet yang mengandung bakteri dapat bertahan diudara pada suhu kamar selama beberapa jam. Orang dapat terinfeksi kalau droplet tersebut terhirup kedalam saluran pernapasan. Selama Mycobacterium tuberculosis masuk kedalam tubuh manusia melalui saluran pernapasan, bakteri tersebut dapat menyebar dari paru ke bagian tubuh lainnya, melalui sistem peredaran darah, sistem saluran limfe, saluran napas, atau penyebaran langsung kebagian tubuh lainnya. Daya penularan dari seorang penderita ditentukan oleh banyaknya bakteri yang dikeluarkan dari parunya. Makin tinggi derajat positif hasil pemeriksaan dahak, makin menular penderita tersebut. Jika hasil pemeriksaan dahak negatif (tidak terlihat bakteri), maka penderita tersebut dianggap tidak menular. Kemungkinan seseorang terinfeksi Mycobacterium tuberculosis ditentukan oleh konsentrasi droplet dalam udara dan lamanya menghirup udara tersebut (Kritski, 2007).

.

Riwayat terjadinya tuberkulosis, di dahului dengan infeksi primer, dimana seseorang terpapar pertama kali dengan bakteri tuberkulosis. Droplet yang terhirup sangat kecil ukurannya, sehingga dapat melewati sistem pertahanan mukosillier bronkus, dan terus berjalan sehinga sampai di alveolus dan menetap disana. Infeksi dimulai ketika bakteri berhasil berkembang biak dengan cara pembelahan diri, yang mengakibatkan peradangan di dalam paru. Saluran limfe akan membawa Mycobacterium tuberculosis ke kelenjar limfe disekitar hilus paru, dan ini disebut sebagai kompleks primer. Waktu antara terjadinya infeksi sampai pembentukan kompleks primer adalah 4 - 6 minggu. Adanya infeksi dapat dibuktikan dengan terjadinya perubahan reaksi tuberkulin dari negatif menjadi positif. Kelanjutan setelah infeksi primer

Disertasi



18 tergantung bakteri yang masuk dan besarnya respons daya tahan tubuh (imunitas seluler). Pada umumnya reaksi daya tahan tubuh tersebut dapat menghentikan perkembangan bakteri. Meskipun demikian, ada beberapa bakteri akan menetap sebagai bakteri persisten atau dorman (tidur). Hal ini karena daya tahan tubuh tidak mampu menghentikan perkembangan bakteri, akibatnya dalam beberapa bulan, yang bersangkutan akan menjadi penderita tuberkulosis. Masa inkubasi, yaitu waktu yang diperlukan mulai terinfeksi sampai menjadi sakit, diperkirakan sekitar 6 bulan (Kritski, 2007). Setelah beberapa bulan atau beberapa tahun setelah infeksi primer dapat terjadi tuberkulosis pasca primer. Hal tersebut terjadi karena daya tahan tubuh menurun akibat terinfeksi human immunodefisiensi virus (HIV) atau status gizi yang buruk. Ciri khas dari tuberkulosis pasca primer adalah kerusakan paru yang luas dengan terjadinya kavitas atau efusi pleura (Kritski, 2007). Komplikasi pada penderita tuberkulosis, terutama terjadi pada stadium lanjut, antara lain, adalah : hemoptisis yang berat, bronkiektasis, fibrosis paru, pneumotoraks spontan, dan penyebaran infeksi ke organ lain. Lebih dari 50 % penderita tuberkulosis akan meninggal dalam jangka waktu 5 tahun tanpa pengobatan, 25 % akan sembuh sendiri dengan daya tahan tubuh tinggi, dan 25 % sebagai kasus kronik yang tetap menular (WHO, 1996). Pada infeki oleh HIV menyebabkan kerusakan luas sistem daya tahan tubuh seluler, sehingga jika terjadi infeksi oportunistik, seperti tuberkulosis. Jika hal tersebut terjadi, maka yang bersangkutan akan menjadi sakit parah bahkan mengakibatkan kematian. Bila jumlah orang terinfeksi HIV meningkat, maka jumlah penderita tuberkulosis akan meningkat, dengan

Disertasi



19 demikian penularan tuberkulosis di masyarakat akan meningkat pula (Aditama, 2007). 2.2.2 Gejala Klinis infeksi tuberkulosis paru Gejala umum tuberkulosis, batuk terus menerus dan berdahak selama 3 minggu atau lebih, gejala lain yang sering dijumpai ialah dahak purulen bercampur darah, batuk darah, sesak napas dan rasa nyeri dada, badan lemah, nafsu makan menurun, berat badan turun, rasa kurang enak badan (malaise), berkeringat malam walaupun tanpa kegiatan, demam lebih dari sebulan. Pada pemeriksaan fisik inspeksi ditemukan adanya penarikan organ lain ke daerah yang sakit, misalnya trakea. Fosa supra dan infraklavikuler menjadi cekung, ruang antar iga menyempit dan gerakan pernafasan menurun. Pada palpasi ditemukan adanya gerakan pernafasan yang menurun, fremitus raba yang meningkat. Perkusi, suara ketok menurun. Pada auskultasi, terdengar suara nafas dengan intensitas yang menurun dan suara nafas bronkial atau bronko vesikuler (Rai dkk, 2005). 2.2.3 Pengobatan tuberkulosis Pengobatan anti tuberkulosis terbagi atas 2 fase yaitu fase intensif selama 2-3 bulan dan fase lanjutan selama 4-7 bulan. Paduan obat yang digunakan terdiri dari paduan obat utama dan tambahan (Rai dkk, 2005). Obat anti tuberkulosis (OAT) yang utama atau lini pertama yang digunakan adalah: isoniazid (INH), rifampisin, pirazinamid, streptomisin, etambutol. Jenis obat tambahan lainnya (lini kedua) adalah: golongan aminoglikosida (kanamisin dan amikasin), golongan kuinolon (ciprofloxacin dan levofloxacin), golongan makrolid dan kombinasi antara amoksilin dengan asam klavulanat. Beberapa obat yang belum tersedia di Indonesia yaitu

Disertasi



20 kapreomisin, sikloserin, PAS, thioamides (ethionamide dan prothionamide) derivat rifampisin dan INH (Rai dkk, 2005). Pengembangan pengobatan tuberkulosis paru sangat penting untuk menyembuhkan pasien dan menghindari multidrug resistant tuberculosis (MDR TB). WHO menyarankan untuk mengganti obat tunggal dengan kombinasi dosis tetap dalam pengobatan tuberkulosis primer. Keuntungan kombinasi dosis tetap adalah: penatalaksanaan sederhana dengan kesalahan pembuatan resep minimal, peningkatan kepatuhan dan penerimaan pasien dengan penurunan kesalahan pengobatan yang tidak disengaja, peningkatan kepatuhan tenaga kesehatan terhadap penatalaksanaan yang benar dan standar, perbaikan manajemen obat karena jenis obat lebih sedikit, menurunkan risiko penyalahgunaan obat tunggal dan MDR akibat penurunan penggunaan monoterapi (WHO, 2010).

2.3. Respons Imun terhadap Mycobacterium tuberculosis Tuberkulosis berawal dari inhalasi bakteri Mycobacterium tuberculosis ke dalam alveoli paru. Bakteri berikatan dengan reseptor fagosit yang terdapat diberbagai sel seperti alveolar makrofag, sel dendritik dan monosit yang masuk dari pembuluh darah. Makrofag dan sel dendritik mengkespresikan reseptor fagosit dan toll like receptors (TLR). Ikatan spesifik antara TLR dengan patogen akan menciptakan sebuah signal transduksi pada host. Sinyal ini akan mengaktifkan NF-kβ, selanjutnya akan menginduksi sitokin dan kemokin. Jadi aktivasi TLR merupakan penghubung yang penting antara respons imun alami dengan respons imun selular. Oleh karena itu, respons imun terhadap Mycobacterium tuberculosis memegang peranan penting dalam

Disertasi



21 hasil keluaran infeksi Mycobacterium tuberculosis (Bhat et al., 2007). Bila seseorang terpapar bakteri tersebut maka keluaran penyakit tergantung respons imun individu tersebut, seperti yang digambarkan pada gambar 2.3.

Imunitas alami tinggi

M.tuberculosis mati

Imunitas alami rendah

Imunitas didapat cacat

Infeksi <10%

Imunitas alami rendah

Imunitas didapat

Infeksi laten

Tidak infeksi

Penyakit atau rekativasi <10%, bila terjadi imunosupresi

Containment> 90%

Gambar 2.3 Kemungkinan luaran bila individu terpapar Mycobacterium tuberculosis (Bhatt et al.,2007). Meskipun makrofag merupakan target utama untuk infeksi M. tuberkulosis tetapi berbagai sel juga berperan pada perkembangan penyakit. Neutrofil adalah sel pertama yang dimobilisasi ke tempat dimana agen patogen masuk ke dalam tubuh atau ketika dipicu oleh sinyal inflamasi. Sel tersebut mempunyai mekanisme mikrobisidal yang tergantung oksigen dan mampu membentuk “neutrofil ekstraseluler trap” (Urban, 2006). Pada penelitian infeksi tuberkulosis pada hewan, neutrofil dapat dideteksi pada awal infeksi dan memegang peranan mengontrol pertumbuhan mikobakterium tetapi sampai saat ini kemampuan neutrofil dalam membunuh bakteri

tersebut

masih

diragukan

(Pedrosa,

2000;

Fulton,

2002).

Kemungkinan peranan neutrofil dalam infeksi tuberkulosis adalah melalui produksi kemokin yang menginduksi terbentuknya granuloma dan bertindak sebagai sel penyaji Mycobacterium tuberculosis

Disertasi

kepada makrofag. Jadi,



22 keterlibatan neutrofil ada pada proses patogenesis bukan pada proteksi host (Keller, 2006). Sel mast adalah sel efektor yang memegang peranan pada reaksi alergi dan perkembangan sel Th2. Mereka dapat ditemukan pada mukosa respirasi, gastrointestinal, traktus urinarius, pembuluh darah dan pembuluh limfe. Sel mast mengekspresikan reseptor terhadap IgE dan interaksi antara IgE dan reseptor pada permukaan sel mast menyebabkan sel tersebut mensekresi berbagai molekul seperti berbagai mediator dan mediator untuk sintesa “de Novo”. Berbagai mediator tersebut antara lain: histamin, triptose, kimase, karboksipeptidase dan heparin. Mediator pada sintesis de Novo adalah leukotrien C4, prostaglandin D2, faktor agregasi platelet, TNF-α, TGF-β, FGF-2, IL-4, IL-5, IL-8 (Turner,1999; William, 2000; Sayama, 2002). Selain interaksi antara IgE dengan antigen, agen lain dapat menginduksi aktivasi sel mast dan pelepasan sitokin. Produk mikroba juga menstimulasi sel mast melalui TLR-2 dan TLR-4 (Pando et al., 2007). Sel mast di paru memegang peran dasar untuk pertahanan terhadap mikobakteria. Sebuah studi menunjukkan bahwa terjadi peningkatan jumlah sel mast dan granulasinya pada binatang percobaan yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Kehadiran sel mast juga dibuktikan di duodenum dan ileum sapi yang diinfeksi dengan para tuberkulosis. Penelitian lain menunjukkan bahwa interaksi antara sel mast dengan Mycobacterium tuberculosis melalui CD48. Interaksi ini memicu pelepasan mediator seperti histamin dan β-heksoamidase dan liberasi dari sitokin sintesis de Novo seperti IL-6 dan TNF-α yang terlibat aktif dalam aktivasi neutrofil dan pemeliharaan integritas dari granuloma (Pando et al., 2007).

Disertasi



23 Protein dari Mycobacterium tuberculosis yaitu Mycobacterium tuberculosis secreted antigen (MTSA-10) dan protein 6kDa early secretory antigenic target (ESAT-6) mempunyai kontribusi untuk mengaktifkan makrofag, sel dendritik dan juga sel mast untuk melepaskan mediator pro inflamasi (Pando et al., 2007). Makrofag dianggap sebagai sel utama pada terjadinya infeksi tuberkulosis. Makrofag alveolar mempunyai peranan esensial untuk mengeliminasi organisme yang masuk ke dalam saluran napas. Makrofag merupakan sel yang pertama yang berinteraksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Interaksi awal antara bakteri dengan makrofag adalah melalui reseptor yang disebut Fc, komplemen, manose, protein surfaktan, dan CD43. Meskipun belum diketahui secara pasti jika bakteri berinteraksi dengan salah satu atau lebih reseptor tersebut tetapi secara invitro diketahui bahwa respons makrofag tergantung pada interaksi antara makrofag dengan salah satu reseptor. Interaksinya dengan Fc reseptor meningkatkan produksi reactive oxygen species (ROS) dan menyebabkan fusi antara fagosom yang mengandung bakteri dan lisosom. Di sisi lain interaksi antara bakteri dengan reseptor C3 mencegah respiratory brust dan memblokir maturasi antara fagosom yang mengandung bakteri dengan mencegah fusi antara fagosom dengan lisosom. Interaksi Mycobacterium tuberculosis dengan TLR-2 dan TLR-4 akan mengaktifkan berbagai komponen Mycobacterium tuberculosis seperti 19-kDa lipoprotein dan lipoarabinomannan (LAM) yang akan mengaktifkan makrofag melalui TLR-2 dan menginduksi IL-12 dan sintesis iNOS (Pando et al., 2007).

Disertasi



24 Tanpa memperhatikan reseptor yang berinteraksi dengan bakteri telah diteliti bahwa keberadaan kolesterol di membran sel merupakan molekul esensial untuk proses internalisasi bakteri. Dipercaya bahwa kolesterol seluler bekerja sebagai titik berlabuh dari bakteri dan sebagai stabilisator untuk berikatan dengan membran makrofag kemudian bakteri akan mudah ditelan. Ketika bakteri masuk ke dalam makrofag secara umum masuk ke dalam fagosom. Struktur ini diperoleh dari membran plasma dan kehadiran berbagai reseptor permukaan. Mycobacterium tuberculosis

mampu menghalangi

proses ini. Hambatan ini tergantung pada sebuah proses aktif yang diinduksi oleh Mycobacterium tuberculosis

yang hidup karena bakteri mati dapat

mudah ditemukan di lisosom. Vakuol di mana didalamnya terdapat bakteri, memiliki

morfologi

yang

berbeda

yang

disebut

early

endosomal

compartemen marker diganti menjadi karakter late endosom. Fagosom Mycobacterium tuberculosis

mempunyai petanda awal seperti Rab5 dan

Rab14 GTPase dan tidak ada molekul Rab7. Sebuah penemuan yang konsisten dengan blokade proses maturasi dari early menjadi late endosom (Pando et al., 2007).

a

b

Gambar 2.4 Proses fagositosis pada infeksi Mycobacterium tuberculosis (a) Proses maturasi fagosom, (b) Blokade fagolisosom oleh Mycobacaterium tuberkulosis (Kaufmann, 2001).

Disertasi



25 Karakteristik lain dari fagosom Mycobacterium tuberculosis adalah terbatasnya asidifikasi. Secara normal transport berbagai bahan menuju endosom membutuhkan medium asam untuk mengaktifkan kerja dari vesicular proton-pump adenosine triphosphatase (V-ATPase) pada late endosom. Jadi penurunan asidifikasi akan menghasilkan konsentrasi VATPase rendah atau nol di dalam fagosom yang mengandung mikobakterium. Lebih jauh lagi bahwa fagosom tersebut tidak dapat berhubungan dengan iNOS. Ketidakmampuan fagosom menjadi matur karena adanya protein tryptophan aspartate coat protein (TACO) pada fagosom. Pada sebuah penelitian telah dibuktikan bahwa sel dengan defisiensi TACO yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis mampu membentuk fagosom yang matur dan dapat melakukan fusi dengan lisosom membentuk fagolisosom, sehingga sel mampu mengeliminasi bakteri. Hal ini membuktikan bahwa molekul tersebut

sangat

mikobakterium.

penting Hambatan

pada

mekanisme

maturasi

pertahanan

fagososom

oleh

hidup

dari

Mycobacterium

tuberculosis mungkin juga dikendalikan oleh sitokin seperti IFN-γ dan TNFα, karena kedua sitokin tersebut merangsang mekanisme mikrobisidal termasuk produksi oksigen reaktif dan nitrogen intermediate. Peran proteksi dari nitrogen intermediate telah didemonstrasikan pada berbagai model tikus yang berbeda. Tetapi peranan oksigen reaktif dan hidrogen peroksida masih belum sepenuhnya diketahui (Chan, 1992). Sel lain yang penting pada respons imun alami tubuh terhadap Mycobacterium tuberculosis adalah sel dendritik. Sel dendritik jelas terlibat dalam pertahanan respons imun terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis. Ketika bakteri tersebut masuk secara inhalasi dan difagositosis oleh alveolar

Disertasi



26 makrofag, mereka tinggal dan replikasi di fagosom. Sel dendritik baik di darah maupun di jaringan paru ditemukan dalam jumlah besar (Sturgill-Koszyki, 1994; Pedroza et al., 2004) Sel dendritik mengenali, menangkap, memproses antigen dan dipresentasikan oleh molekul MHC melalui CD1. Sel dendritik mengikat antigen melalui reseptor C-type Lectin dan reseptor Fcγ/Fcε dan ditelan melalui endositosis. Endositosis Mycobacterium tuberculosis dibawa keluar melalui reseptor C-type Lectin yang disebut dendritic cell specific interceluller adhesion molecule grabing non integrin (DC-SIGN) (Geijtenbeek, 2003; Tailleux, 2003). Molekul ini akan berinteraksi dengan mannose capped LAM, sebuah komponen dinding sel bakteri. Sel dendritik yang ditemukan dari pembuluh

darah

perifer

dan

sel

dendritik imatur

dari

monosit

mengekspresikan TLR-2 dan TLR-4, 2 macam toll receptor yang nampaknya berinteraksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Diasumsikan bahwa respons imun pertahanan mungkin diinduksi melalui sinyal ini. Interaksi antara mannose-LAM dengan DC-SIGN menginduksi IL-10. 19-kDa Mycobacterium tuberculosis lipoprotein dan TLR-2 menginduksi IL-12, TNF-α, IL-6. Ketika suatu antigen ditangkap dan ditelan, sel dendritik menjadi matur (ditandai dengan perubahan fungsi dan fenotip) dan secara efisien migrasi ke pembuluh limfe perifer atau kelenjar getah bening. Ada bukti secara in vitro Mycobacterium tuberculosis dan BCG dari jaringan paru ke kelenjar getah bening melalui sel dendritik yang terinfeksi. Migrasi sel dendritik yang terinfeksi Mycobacterium tuberculosis membutuhkan ekspresi dari kemokin reseptor 7 (CCR7) pada permukaannya. Ekspresi reseptor membuat mereka sensitif terhadap kemokin (CC) CCL-19 dan CCL-21. Hal ini penting untuk

Disertasi



27 menyebutkan bahwa maturasi sel dendritik tidak hanya dengan peningkatan sintesis MHC I dan II, tetapi juga melalui ekspresi dari molekul ko stimulasi seperti CD80 dan CD86 dan produksi IL-12 (Pando et al., 2007). Dilaporkan bahwa ketika sel dendritik yang berasal dari monosit diinfeksi

dengan

Mycobacterium

tuberculosis,

kemampuan

mereka

menghadirkan antigen lipid gagal dan ekspresi CD 1 turun. Komponen dinding sel Mycobacterium tuberculosis

yang menghambat maturasi sel

dendritik adalah lipopolisakarida. Peningkatan virulensi bakteri berhubungan dengan ketidakmampuan maturasi dari sel dendritik. Pada respons pertahanan imun, sel dendritik menginduksi maturasi sel Th1 yang mensekresi sitokin IL12, IL-8, IL-23 dan mungkin IFN α dan β bukan IFNγ. Sel Th1 memperluas responsnya terhadap antigen BCG yang dipresentasikan oleh sel dendritik di kelenjar getah bening dan migrasi menuju tempat infeksi dimana mereka melepaskan IFNγ yang akan mengaktifkan makrofag lokal yang mengontrol replikasi bakteri (Kadowaki, 2001; Wozniak, 2006). Sel natural killer (NK) bermain dalam peran penting dalam perkembangan respons imun alami. Fungsi utamanya berhubungan dengan sitotoksisitas pada sel target dan merupakan sel pertama yang memproduksi IFNγ selama respons imun. Sel NK terlibat dalam infeksi virus, bakteri maupun kanker. Jumlah sel NK bertambah pada paru tikus C57BL/6 yang diinfeksi secara aerosol dengan Mycobacterium tuberculosis setelah 21 hari. Penyebaran sel ini dihubungkan dengan meningkatnya ekspresi petanda aktivasi dan maturasi dan produksi IFN-γ. Bagaimanapun juga kehilangan sel NK tidak mempengaruhi jumlah bakteri paru, mengindikasikan bahwa meskipun sel ini diaktifkan selama respons awal pada tuberkulosis paru,

Disertasi



28 mereka tidak punya peran esensial untuk pertahanan tubuh inang (JunqueiraKipnis, 2003). Sel NK pada manusia telah ditunjukkan mempunyai kemampuan meningkatkan sitotoksisitas makrofag yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Mereka juga mengoptimalkan kemampuan sel CD8+ untuk memproduksi IFN-γ

dan melisis sel

yang terinfeksi

Mycobacterium tuberculosis kemudian menggabungkan respons imun alami menuju adaptif (Vankalayapati et al., 2002; Vankalayapati et al., 2004). Defensin adalah peptida antimikroba endogen. Terdiri dari 30-50 asam amino pada mieloid dan sel epitel semua spesies hewan. Mereka menunjukkan fungsi antibakteri, antifungi dan antiviral. Molekul diklasifikasikan pada α, β, θ defensin berdasarkan posisi residu sistein dan jumlah ikatan disulfur. Pada sel fagosit, defensin menunjukkan destruksi komponen mikroorganisme tergantung metabolisme O 2 . Diduga peptida ini memecah membran berbagai mikroorganisme dan beberapa mampu menembus membran sitoplasma dan masuk ke dalam sel yang terinfeksi. Pada makrofag manusia sampai sekarang belum diketahui apakah memiliki defensin tetapi pada neutrofil terdapat human neutrofil defensin peptides (HNP 1 , HNP 2 , HNP 3 ) ditemukan aktif melawan M.avium intraseluler dan Mycobacterium tuberculosis. Secara invitro, α-defensin dari neutrofil manusia secara langsung menarik sel T CD4+/CD45RA+, CD8+ dan sel dendritik. Ekspresi β-defensin 2 dan 3 diinduksi oleh IL-1, TNF-α, TLR mengenali bakteri dan fungi. β-defensin manusia merupakan kemoaktran untuk CD β-defensin4+/CD45RA+ melalui CCR6 (Pando et al., 2007). Tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis mengekspresikan βdefensin yaitu mBD3 dan mBD4. Pada tahap awal infeksi, sel epitel dari

Disertasi



29 traktus

respiratorius mengekspresikan kedua

defensin tersebut

yang

berhubungan dengan mengontrol proliferasi bakteri. Bagaimanapun juga ekspresi menurun ketika penyakit berlanjut. Pada model infeksi laten, mBD3 dan mBD4 tetap terekspresi tetapi ekspresi menurun ketika terjadi reaktivasi. Ekspresi genetik HBD-2 didentifikasi di sel epitel di kulit, paru, trakea dan sistem urogenital. Defensin juga terdeteksi pada sel bronkial hasil lavase dari penderita terinfeksi M. avium. Monosit dari pembuluh darah perifer yang diberi HBD2 lebih baik mengontrol pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis daripada monosit tanpa HBD2. Sel alveolar epitel manusia yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

juga mengekspresikan HBD2. Tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

yang diterapi dengan HNP-7

menurunkan jumlah bakteri di paru, liver dan limpa. Hal ini menunjukkan bahwa defensin dapat digunakan sebagai terapi baru (Pando et al., 2007). Berbeda dengan respons imun alami, respons imun adaptif membutuhkan pengenalan spesifik dari antigen asing. Sistem imun alami sangat besar pengaruhnya pada tipe mekanisme imun didapat yang dikembangkan dan respons imun spesifik menjalankan berbagai fungsi efektor melalui aktivasi dari berbagai komponen dari imunitas alami. Respons imun spesifik dapat dibagi menjadi respons imun seluler dan respons imun humoral. Kedua mekanisme tersebut tidak eksklusif. Sel Th dibutuhkan untuk maturasi antibodi, perubahan isotipe dan memori, sedangkan sel B juga berfungsi sebagai sel penyaji dengan mengaktifasi sel T secara spesifik (Pando et al., 2007). Mycobacterium tuberculosis merupakan contoh paling menonjol dari bakteri intraseluler yang tetap di dalam host untuk waktu yang lama

Disertasi



30 menyebabkan infeksi laten. Suatu infeksi kronik asimtomatik tanpa menyebabkan kerusakan jaringan. Pada infeksi intraseluler respons imun protektif lebih pada respons imun seluler daripada antibodi. Mycobacterium tuberculosis

tinggal di dalam makrofag dan relatif resisten terhadap

mekanisme mikrobisidal yang secara efisien mengeliminasi bakteri lain yang difagositosis. Hal ini merupakan bagian dari kemampuan bakteri tersebut untuk menghindari aktivasi makrofag oleh IFN-γ dan IL-12. Berbagai studi menunjukkan bahwa sitokin tersebut memegang peranan kritis pada infeksi Mycobacterium tuberculosis

baik pada manusia maupun pada hewan.

Defisiensi dari IFN-γ dan IL-12 atau reseptornya menyebabkan individu lebih rentan terhadap infeksi tersebut. Lebih dari 20 tahun diasumsikan bahwa induksi sel Th1 menghasilkan respons imun yang protektif terhadap infeksi tuberkulosis. Walaupun kenyataannya masih ada kehilangan informasi penting seperti peranan sel penyaji secara invivo selama tuberkulosis paru. Informasi ini penting untuk mengetahui induksi respons imun terhadap bakteri tuberkulosis dan dapat digunakan untuk mengontrol penyakit menjadi lebih efektif (Pando et al., 2007).

2.4.

Apoptosis Apoptosis disebut juga dengan kematian sel terprogram, yaitu suatu proses penyelesaian secara bertingkat untuk menghilangkan sel yang tidak diperlukan tanpa menggunakan respons inflamasi. Bila melibatkan respons inflamasi yang terjadi adalah nekrosis sel. Apoptosis adalah suatu proses fisiologis yang dikendalikan dengan kontrol genetik yang ketat, berlangsung melalui proteolisis, kondensasi dan fragmentasi DNA disusul dengan

Disertasi



31 pengerutan sel. Secara biokimiawi terjadi aktivasi berbagai endonuklease dan protease, DNA dipecah menjadi fragmen-fragmen dengan panjang berbeda dan terbentuk badan apoptotik. Badan apoptotik ini akan difagositosis oleh makrofag (Geweis, 2003). Apoptosis merupakan proses abnormal yang menjaga perkembangan jaringan normal maupun homeostasis tubuh dan merupakan bagian integral dari fungsi sistem imun. Proses apoptosis akan menyingkirkan sel T autoreaktif untuk mencegah terjadinya penyakit imun demikian pada sel-sel yang terinfeksi mikroorganisme misalnya sel CD4 dengan HIV sehingga infeksi tidak berkembang (Elmore, 2007)

Gambar 2.5 Mekanisme apoptosis melalui jalur instrinsik dan ekstrinsik (Faherty et al., 2008). 2.4.1 Perbedaan apoptosis dan nekrosis Seperti diferensiasi dan proliferasi, apoptosis merupakan metode kontrol seluler yang tidak kalah penting dalam pengendalian sel. Gangguan pada sistem ini dapat menyebabkan gangguan dalam pengendalian sel menjadi abnormal. Proses kematian sel terjadi melalui apoptosis atau nekrosis. Kedua

Disertasi



32 proses kematian sel tersebut memberikan gambaran yang berbeda. Nekrosis selalu patologis, tetapi apoptosis dapat patologis maupun fisiologis. Apoptosis fisiologis merupakan proses kematian sel yang terjadi secara alami. Apoptosis dipicu oleh sekelompok enzim yang disebut caspase. Dalam kondisi normal enzim tersebut dalam keadaan inaktif yaitu sebagai pro-enzim. Aktivasi caspase segera disusul gambaran morfologis spesifik apoptosis, yaitu badan apoptotik. Apoptosis dipicu oleh berbagai molekul sinyal dari dalam sel, misalnya protein p53 (p53 dependent mediated pathway) dan dari luar sel, misalnya TNF-α (p53 independent mediated pathway). Apoptosis di modulasi oleh molekul yang proapoptotik dan molekul yang anti apoptotik. Keseimbangan antara kedua kondisi tersebut menentukan sensitifitas atau resistensi terhadap apoptosis (Buchman, 2000). Terdapat perbedaan gambaran morfologis dari nekrosis dan apoptosis. Sel yang nekrotik menunjukkan pembengkakan, lisis, diisi oleh komponenkomponen ekstraseluler, disertai proses inflamasi, menarik serta berkumpulnya sel-sel fagosit, terjadi perubahan berupa sel-sel nekrotik. Sel yang mengalami apoptosis tidak disertai pembengkakan sel, terjadi perubahan struktur seperti penyusutan volume, pengkerutan membran, sitoplasma mengalami konsentrasi, kondensasi kromatin, tidak ada proses lisis tetapi terjadi degradasi DNA menjadi oligonukleosomal fragmen. Terbentuk fragmen kecil disebut badan apoptotic dari 600-750 kb menjadi sekitar 50-300 kb serta kehilangan kemampuan berkomunikasi dengan sekitarnya (Winter, 1988; Rasola,1999; Buchman, 2000). Badan apoptotik yang terbentuk tidak bertahan lama oleh karena segera difagositer makrofag tanpa disertai proses inflamasi (Buchman, 2000). Berbagai faktor dapat mendorong terjadi apoptosis, menginduksi

Disertasi



33 munculnya perubahan mitokondria sebagai proses awal kematian sel. Awalnya terbentuk megaspore pada permukaan mitokondria, pembengkakan matrik, hilangnya mekanisme elektrokimia pada permukaan membran dalam, menyebabkan terlepasnya sitokrom-C di dalam sitosol akan memprovokasi komplek multiprotein yang kemudian mengaktifkan caspase-9 dan berikutnya caspase-3. Caspase merupakan protease suatu enzim proteolitik yang mengubah zimogen inaktif menjadi enzim heterodimerik aktif disebut juga interleukin-1β converting enzyme (Rasola, 1999). Apoptosis fisiologis terjadi pada masa embrional atau terjadi pada usia dewasa, misalnya penggantian sel kulit dan mukosa saluran cerna (Buchman, 2000). Apoptosis patologis terjadi bila terdapat fragmentasi DNA yang diinduksi oleh peningkatan aktivitas protein p53, maupun reseptor TNF-α. Keadaan normal sinyal kematian melalui apoptosis berada dalam keadaan inaktif menjadi aktif bila terdapat sinyal kematian sel dan program kematian yang dipandu gen nef, dengan demikian disebut kematian sel terprogram. Apoptosis merupakan proses kematian sel terprogram berakibat matinya sel yang tidak dikehendaki. Apoptosis jelas berbeda dengan nekrosis, karena apoptosis merupakan suatu kematian sel yang terprogram dan bukan secara kebetulan seperti kerusakan sel yang mengalami nekrosis. Selain itu, sel apoptotik dikenali dan dimusnahkan oleh fagosit sebelum mengalami disintegrasi sehingga sel yang mengalami apoptosis tidak didapatkan kerusakan jaringan sekitarnya, tidak terjadi induksi respons peradangan seperti pada nekrosis (Geweis, 2003; Elmore, 2007). Apoptosis merupakan bentuk kematian sel secara fisiologis, terjadi pada semua sel dan jaringan. Merupakan bagian penting dari keseimbangan sel dan

Disertasi



34 jaringan normal. Pada akhir masa hidupnya, sel normal terjadi kondensasi inti heterokromatik, pengerutan sel dan teracaknya letak berbagai organela di dalam sitoplasma. Gambaran karakteristik seperti pola anak tangga di dapatkan pada elektroforesis

DNA

sel

apoptotik

yang

dihasilkan

oleh

fragmen

oligonukleosom karena adanya kromatin internukleosom oleh endonuklease endogen (Elmore, 2007). 2.4.2 Protein Caspase Mekanisme apoptosis dipicu oleh beberapa produk gen. terdapat 3 gen utama yang berperan dalam proses apoptosis yaitu : CED-3, CED-4 dan CED-9. CED-3 dan CED-4 mendorong terjadi apoptosis, sedangkan CED -9 berfungi menghambat apoptosis. CED-3 adalah caspase yaitu suatu protease sistein yang dapat memecah protein pada posisi spesifik setelah residu asam aspartat pada rangkaian asam amino yang menyusun protein. Proses apoptosis dimulai dari CED-4 yang mengikat CED-3. Ikatan CED-4 pada CED-3 akan menyebabkan CED-3 teraktivasi sehingga proses apoptosis dimulai. CED-9 dapat mencegah apoptosis karena CED-9 dapat membentuk komplek dengan CED-4 dan CED-3, sehingga CED-4 tidak dapat mengaktivasi CED-3. Akibatnya apoptosis dapat dihambat (Geweis, 2003). Pada manusia dan mencit terdapat 14 caspase yang telah berhasil diidentifikasi yang dikelompokkan menurut sekuen asam amino yang sama atau spesifikasi proteasenya. Berdasarkan fungsinya caspase dibagi dua, yaitu caspase inisiator (upstream atau inisiator caspase) dan caspase efektor (downstream atau effector caspase) (Elmore, 2007). Peran caspase pada apoptosis belum sepenuhnya diketahui karena banyak sekali ditemukan substrat caspase dan beberapa substrat tersebut

Disertasi



35 diantaranya mengalami pemrosesan selama apoptosis. Substrat dari caspase efektor merupakan protein kinase. Sebagian besar caspase diperkirakan terlibat dalam apoptosis. Caspase yang terlibat dalam apoptosis antara lain casapase 2, 8, 9, 10 yang tergolong caspase inisiator. Caspase 3,6,7 yang tergolong caspase eksekutor. Sedangam caspase 1, 4, 5 merupakan caspase yang terlibat dalam proses inflamasi (Cullen et al., 2009). Caspase 3 merupakan efektor utama dengan berat molekul 32 kD yang teraktivasi hampir pada seluruh proses apoptosis. Aktivasi caspase 3 secara langsung maupun tidak langsung bertanggung jawab pada pemecahan substrat protein target, menuju pemecahan DNA yang spesifik dan perubahan morfologi yang spesifik pula dari sel apoptotik. Pada saat caspase 3 di dalamsel sudah aktif, sel tersebut benar commited to death dan apoptosis sudah dapat dikatakan menuju kondisi yang tidak dapat kembali lagi (Cullen et al., 2009). 2.4.3 Protein Bax dan Bcl-2 Protein Burkitt’s Cell Lymphoma (Bcl)-2 adalah anggota dari keluarga protein Bcl. Keluarga protein bcl dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan domain Bcl homolog (BH) yang dimilikinya. Kelompok pertama adalah kelompok yang mempunyai domain BH1, BH2, BH3 dan BH4. Protein tersebut yaitu Bcl-2, Bcl-XL dan Mcl-1. Kelompok protein tersebut berfungsi untuk menghambat apoptosis dan disebut sebagai antiapoptosis. Kelompok kedua adalah kelompok yang mempunyai domain BH1, BH2 dan BH3, yaitu Bax dan Bak. Protein tersebut mempunyai fungsi untuk menginduksi apoptosis sehingga disebut proapoptosis. Kelompok ketiga adalah kelompok yang hanya mempunyai domain BH3, yaitu protein tBid, Bim dan Puma. Protein tersebut

Disertasi



36 berfungsi menginduksi apoptosis dan disebut sebagai proapoptosis (Shore et al., 2008; Yao et al., 2009). Salah satu mekanisme respons suatu sel terhadap sinyal apoptosis adalah melalui keseimbangan antara protein antiapoptosis dan protein proapoptosis dari keluarga Bcl tersebut. Pada suatu kondisi dimana protein proapaoptosis pada sel berlebihan, maka sel tersebut menjadi lebih sensitif terhadap proses apoptosis. Demikian juga sebaliknya, apabila suatu sel memilki protein antiapoptosis yang berlimpah maka sel tersebut menjadi lebih resisten terhadap proses apoptosis. Peningkatan ekspresi protein pro apoptosis pada permukaan mitokondria merupakan kondisi y ang penting pada pembentukan permeability transition pore (Adams et al., 2007; Dash, 2009; Brenner et al., 2009). Interaksi antara protein proapoptotik dan protein antiapoptotik mengakibatkan gangguan pada fungsi protein antiapoptotik Bcl-2 sehingga mengakibatkan terbentuknya pori pada mitokondria. Pori pada mitokindria yang terbuka menyebabkan lepasnya sitokrom-c dan protein proapoptosis yang lainnya. Sitokrom-c yang keluar dari mitokondria berinteraksi dengan molekul Apaf-1. Interaksi kedua protein tersebut akan menarik protein caspase 9 untuk membentuk komplek yang disebut dengan apotosome. Formasi apoptosome tersebut menyebabkan aktivasi protein caspase 9 dan akhirnya protein tersebut menginduksi proses apoptosis (Dash, 2009; Brenner et al., 2009). 2.4.4 Apoptosis pada tuberkulosis Makrofag merupakan pertahanan lini pertama untuk melawan infeksi Mycobacterium tuberculosis dan memicu terjadinya respons imun seluler dari penderita.

Meskipun

makrofag

mampu

memfagositosis

bakteri

dan

membunuhnya di dalam sel, tetapi Mycobacterium tuberculosis mempunyai

Disertasi



37 mekanisme tersendiri sehingga terhindar dari proses terebut. Hasilnya adalah interaksi yang tetap antara makrofag dan Mycobacterium tuberculosis. Makrofag mungkin membangun sarana untuk melindungi host dari bakteri tuberkulosis namun bakteri tersebut mungkin menganggu fungsi makrofag sehingga membuat bakteri mampu proliferasi dan melepaskan diri dari sel. Berbagai bukti menunjukkan bahwa proses apoptosis makrofag pada infeksi tuberkulosis memegang peranan penting pada interaksi antara host dan patogen. Diduga apoptosis pada makrofag yang terinfeksi bakteri tuberkulosis menguntungkan host dan merupakan mekanisme pertahanan yang sangat berguna (Kornfeld et al.,1999). Beberapa peneliti membuktikan bahwa interaksi antara bakteri tuberkulosis dengan host juga tergantung dari virulensi bakteri. Bila infeksi oleh bakteri yang virulen maka akan menginduksi terjadinya nekrosis sedangkan infeksi oleh bakteri yang tidak virulen menginduksi terjadinya apoptosis (Behar et al., 2010; Kumawat et al., 2010; Maziar et al., 2010; Miller et al,. 2010; Rudel et al.,2010; Shin et al., 2010).

Gambar 2.6 Infeksi bakteri Mycobacterium tuberculosis virulen pada sel makrofag (Behar et al., 2010).

Disertasi



38 Pada penelitian oleh Zhang et al menunjukkan bahwa terdapat perbedaan ekspresi caspase-3 antara bakteri H37Ra yang tidak virulen dibandingkan dengan H37Rv yang virulent. Makrofag yang diinfeksi oleh H37Rv terjadi penurunan apoptosis. Pada bakteri tuberkulosis virulen yang menginfeksi makrofag menyebabkan makrofag terhindar dari apoptosis. Fenomena ini menyebabkan bakteri berkembang biak di dalam makrofag dan akhirnya terjadi nekrosis. Mekanisme nekrosis ini diduga merupakan upaya bakteri untuk melepaskan diri dari sel dan masuk ke dalam medium ekstraseluler (Zhang et al., 2005; Chen et al., 2006). Hubungan antara virulensi M. tuberkulosis dan hambatan terhadap apoptosis juga telah dibuktikan pada penelitian dengan menggunakan tikus. Suatu gen tertentu pada M. tuberkulosis mampu menghambat apoptosis pada makrofag (Velmurugan et al., 2007). Fas (APO-1/CD95) anggota dari reseptor TNF yaitu tipe-I protein membran dan FasL sebuah anggota dari keluarga TNF yaitu tipe-II protein membran. Ikatan antara Fas dan FasL menghasilkan sinyal transduksi yang menyebabkan sel mengalami apoptosis. Pada penelitian tersebut menunjukkan bahwa M. tuberculosis mengatur sinyal Fas/FasL, diduga penurunan regulasi Fas bisa mencegah makrofag terinfeksi bakteri mengalami apoptosis dan terjadi prolong intraseluler survival. Penelitian lain menunjukkan bahwa terjadi peningkatan ekspresi FasL pada pada makrofag yang terdapat di granuloma tuberkulosis (Mustafa et al., 2001; Zhang et al., 2005). Bcl-2

adalah

molekul

pengatur

antiapoptosis

utama

yang

menyelamatkan sel dari apoptosis. Pada penelitian diatas menunjukkan bahwa terjadi peningkatan ekspresi mRNA Bcl-2 pada makrofag terinfeksi H37Rv.

Disertasi



39 Peningkatan regulasi ekspresi Bcl-2 pada makrofag terinfeksi tuberkulosis mengijinkan M. tuberkulosis untuk terus berkembang intraseluler pad awal fase dan pada fase lanjut akan menyebabkan nekrosis makrofag sehingga bakteri akan menginfeksi jaringan sekitarnya (Zhang et al., 2005; Rodrigues et al., 2009). Penelitian ini menguatkan penelitian sebelumnya bahwa terjadi peningkatan regulasi Bcl-2 pada tikus yang diinfeksi dengan M. tuberkulosis. Interaksi antara makrofag dan bakteri menyebabkan peningkatan ekspresi proapoptosis dan antiapoptosis terhadap makrofag tergantung juga pada virulensi bakteri. Pada bakteri yang virulen terjadi peningkatan ekspresi Bcl-2. Penelitian ini juga membuktikan bahwa terjadi penurunan ekspresi Bax, yaitu protein proapoptosis dengan mekanisme kerja menghambat kerja Bcl-2 (Mogga et al., 2002). Hambatan apoptosis makrofag oleh Mycobacterium tuberculosis merupakan strategi dari bakteri tersebut untuk mempertahankan diri dan merupakan faktor virulensi. Proses ini juga akan menghindari bakteri tersebut dari mekanisme respons imun alami dan menghambat respons imun adaptif. Melalui mekanisme anti apoptosis ini, Mycobacterium tuberculosis akan berkembang biak dan menyebar ke berbagai sel sekitarnya melalui proses nekrosis. Beberapa penelitian membuktikan bahwa bakteri yang virulen akan berkembang biak di dalam makrofag dan menginduksi nekrosis sel tersebut. Dampak negatif dari proses nekrosis adalah bakteri tetap hidup dan menginfeksi sel sekitarnya. Proses nekrosis ini juga akan menyebabkan reaksi inflamasi yang berlebihan sehingga menimbulkan kerusakan sel sekitarnya (Behar et al.,2010; Samali et al., 2010; Peter et al., 2010).

Disertasi



40 Mycobacterium tuberculosis yang virulen juga mempunyai mekanisme lain untuk menghindari apoptosis yaitu melalui hambatan terhadap perbaikan membrane plasma yang diperlukan oleh sel untuk mencegah terjadinya nekrosis dan menginduksi apoptosis dan meningkatkan sekresi dari TNFR2 yang akan menetralisasi fungsi dari sitokin TNF-α (Balcewihcz-Sablinska, 1998; Divanghi et al., 2009; Fairbain, 2009). Keuntungan dari mekanisme apoptosis adalah

Mycobacterium

tuberculosis akan mati pada proses apoptosis. Mekanisme kematian Mycobacterium tuberculosis pada proses apoptosis kemungkinan disebabkan karena dua proses yaitu: melalui peningkatan Nitrik Oksida atau melalui proses fusi fagosom menjadi fagolisosom (Molloy et al.,1994;Herbs et al.,2011). Nitrik oksida (NO) diketahui mempunyai kemampuan untuk menginduksi apoptosis pada makrofag dan produksi NO diinduksi oleh IFN-γ melalui peningkatan ekspresi Nitric oxide synthetase (NOS2) (Brune et al., 1997). NO dapat membunuh Mycobacterium tuberculosis intrase melalui berbagai

mekanisme

yaitu

: secara

langsung pada

DNA bakteri,

mempengaruhi metabolisme tembaga, target virulensi dari mikobakterial atau berfungsi sebagai pembawa pesan kedua (Shiloh et al., 2000; Nathan, 2003; Axelrod et al., 2008; Yang et al., 2009). Pada penelitian yang dilakukan oleh Herbs, 2011, menunjukkan bahwa NO yang diinduksi oleh IFN-γ meningkatkan apoptosis makrofag yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis dan membunuh bakteri tersebut. Apoptosis diduga mempunyai hubungan dengan perubahan aristektur dari sistem vesikular host sehingga menyebabkan fusi dari fagosom dan

Disertasi



41 lisosom yang sebelumnya dihambat oleh Mycobacterium tuberculosis (Molloy et al., 1994; Grassme et al., 2001; Labbe et al., 2008).

2.5. Sel Alveolar Makrofag Alveolar makrofag adalah salah satu populasi makrofag pada jaringan yang dengan mudah sapat dipelajari baik pada manusia maupun pada hewan coba.

Pada tahun 1961, sel

tersebut dapat dipanen dengan menggunakan

metode bronchoalveolar lavage dan sejak saat itu sel alveolar makrofag mulai diteliti. Sel alveolar makrofag merupakan tipe sel yang predominan di dalam alveolus (Fels et al., 1986; Lohmann-Matthes et al., 1994). Alveolar makrofag adalah sel yang berfungsi

sebagai sel pertahanan

seluler lini pertama untuk melawan pathogen yang masuk melalui saluran respirasi. Alveolar makrofag merupakan sel fagosit utama dari sistem imun alami pada paru. Sel tersebut bertugas untuk membersihkan ruang udara dari agen infeksi, toksik atau partikel alergen yang dapat lolos dari mekanisme pertahanan mekanik saluran respirasi seperti : mukosa nasal, glottis dan sistem transport mukosilia (Rubins, 2003; Peter-Golden, 2004). Alveolar makrofag mempunyai kemampuan untuk mengeliminasi patogen yang kita hisap setiap harinya pada manusia sehat melalui mekanisme fagositosis dan intracellular killing, sekresi dari metabolit oksigen, sekresi peptide dan protease anti mikroba.

Ketika

alveolar makrofag bertemu dengan patogen dalam jumlah besar atau patogen yang virulen, sel tersebut akan mensintesis dan mensekresi berbagai macam sitokin seperti

interleukin-1, interleukin-6 dan tumor necrosis factor-α,

interleukin-8, TGF-β, kemokin dan metabolit arakidonat. Kemokin yang disekresi antara lain : macrophage inflammatory proteins 1 & 2, leukotrien B 4. Beberapa

Disertasi



42 sitokin yang diproduksi oleh alveolar makrofag juga menginduksi proliferasi fibroblas. Alveolar makroafag juga menginduksi berbagai sel seperti neutrofil, granulosit untuk menjadi aktif. Alveolar makrofag juga memegang peranan penting sebagai sel pengatur dari pertahanan alveolar. (Rubins, 2004; Kirby et al., 2009).

2.6. Kerusakan Jaringan Paru Pada level yang fundamental, sebagian besar respons inflamasi terhadap infeksi Mycobacterium tuberculosis pada binatang dan manusia memiliki kemiripan. Perbedaan yang penting diantara manusia dan binatang adalah progresifitas perjalanan penyakit dan susunan tipe lesi. Pada binatang perjalanan penyakit lebih cepat sehingga binatang sangat menguntungkan untuk dijadikan hewan coba pada infeksi tuberculosis (Basaraba, 2008). Lesi tuberkulosis pada jaringan paru pada semua spesies adalah spesifik campuran antara makrofag, limfosit, sel plasma dan granulosit yang melampaui batas pada jaringan paru. Tanda khas infeksi Mycobacterium tuberculosis terdapat dominasi dari makrofag baik dalam bentuk mononuclear maupun multinucleated giant cells (Basaraba, 2008). Gambaran patologi kerusakan jaringan paru pada hewan coba dipengaruhi oleh cara infeksi bakteri, jenis dan strain hewan coba, dosis dan strain Mycobacterium tuberculosis. Perbedaan lesi morfologi pada hewan coba pada umumnya disebabkan karena resistensi genetik, stadium penyakit dan respons imun adaptif (Basaraba, 2008). Derajad kerusakan jaringan paru dapat digunakan untuk menilai efektivitas obat yang diuji pada hewan coba, selain itu juga dapat digunakan untuk menilai

Disertasi



43 virulensi kuman (Dormans et al., 2004; Reviono, 2011). Ker

usakan jaringan

paru pada infeksi Mycobacterium tuberculosis mulai berupa lesi morfologi yang terdiri dari infiltrasi sel radang sampai granuloma. Granuloma merupakan tanda stadium kronik infeksi Mycobacterium tuberculosis sebagai usaha dari sistem imun pejamu untuk melokalisir multiplikasi dan penyebaran lebih lanjut ke organ lain (Ordway et al., 2005). Respons pertama yang tampak setelah dilakukan pemberian infesi kuman adalah terkumpulnya sel mononuklear baik makrofag, limfosit maupun sel plasma dan neutrofil, baik berupa kelainan alveolitis, perivaskulitis maupun peribronkiolitis (Dormans et al., 2004). Pembentukan granuloma terjadi beberapa waktu kemudian, paling sering tampak pada hari ke-20 (Flynn et al., 2005; Cardona et al., 2000).

G

B

C

Gambar 2.7. Histopatologi jaringan paru mencit yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis setelah 23 hari. Pribronkiolitis (B), Perivaskulitis (C) dan granuloma (G) (Dormans et al., 2004). Perjalanan awal infeksi Mycobacterium tuberculosis sangat bervariasi, tergantung pada faktor imunitas, sensitivitas dari penjamu serta virulensi ataupun agresivitas dari kuman tersebut (Dormans et al., 2004). Lesi tuberkulosis pada awal perjalanan penyakit adalah proliferasi dan eksudatif. Pada individu yang resisten atau mempunyai daya tahan, reaksi fagositosis akan memulai dengan

Disertasi



44 pembentukan batas dinding fibroplastik dan skar. Pada individu yang rentan, lesi eksudatif akan lebih luas dengan melibatkan banyak sel inflamasi dan ditandai kemampuan melokalisir yang buruk (Basaraba et al., 2008). Respons terhadap kuman selanjutnya berkembang sampai timbul kekebalan imun yang didapat dengan pembentukan granuloma. Kekebalan imun yang didapat

pada

tuberkulosis ada 2 yaitu cell mediated immunity (CMI) dan delayed type hypersentitivity (DTH). CMI menunjukkan proses yang menyebabkan akumulasi sejumlah makrofag teraktivasi yang bersifat mikrobisid, sedangkan DTH menunjukkan proses imun sitotoksik yang membunuh makrofag imatur dan tidak teraktivasi sehingga menyebabkan multiplikasi bakteri tuberkulosis (Saunders et al., 2007). Pembentukan granuloma diawali dari pengenalan CD4+sel Th1 yang mengenali antigen fragmen peptida terbentuk melalui

reseptor

major

histocompatibility (MHC) kelas II. Antigen fragmen peptida terbentuk oleh enzim digesti proteolitik yang dibangkitkan oleh antigen presenting cell misalnya makrofag dan sel dendritik. Beberapa sitokin diproduksi oleh CD4+ sel Th1 yaitu IFN-γ, GMCSF ke makrofag terinfeksi Mycobacterium tuberculosis untuk meningkatkan fungsi efektor pada makrofag tersebut. Sitokin lain yaitu IL-2 juga diproduksi oleh CD4+sel Th1 untuk merangsang CD8+ sel T sitotoksik, selanjutnya berperan menghancurkan makrofag imatur terinfeksi secara apoptosis. Makrofag yang teraktivasi mengelilingi lesi yang terinfeksi Mycobacterium tuberculosis dengan mengeluarkan sitokin kemotaktik antara lain IFN-γ, monosit chemoactractant protein 1(MCP 1) dan Interleukin-8 (IL-8). Setelah terjadi agregasi pada lesi tersebut, monosit berpindah dari sirkulasi menuju lesi tersebut. Sejumlah monosit tersebut menjadi alveolar makrofag,

Disertasi



45 selanjutnya berubah menjadi histiosit palisade atau epitel. Beberapa sel tersebut berfusi untuk membentuk giant cells Laghans yang merupakan khas granuloma (Saunders et al., 2007). Granuloma pada tikus berbeda dengan granuloma pada manusia. Granuloma pada tikus tersusun oleh neutrofil, makrofag dan limfosit dengan struktur makrofag teraktivasi dan limfosit yang mengelilingi kumpulan makrofag terinfeksi. Pada granuloma ini tidak terdapat nekrosis. Meskipun strukturnya berbeda tetapi fungsinya sama yaitu mengendalikan infeksi dan mencegah penyebaran infeksi (Flyn et al., 2005). Kerusakan jaringan paru pada infeksi tuberkulosis juga disebabkan karena Mycobacterium

tuberculosis

menginduksi

ekspresi

enzim

matrix

metalloproteinase-1 (MMP-1). MMP-1 merupakan anggota keluarga matrix metalloproteinase (MMPs) yang mempunyai fungsi untuk memecah matrik dan mengubah bentuk jaringan. MMPs merupakan anggota dari keluarga protease yang tergantung Zinc yang secara kolektif mampu mendegradasi semua komponen matriks ekstraseluler. Aktivitas MMPs secara ketat diatur pada tingkat transkripsi dan aktivasinya dilakukan oleh pemecahan proteolitik. MMPs secara spesifik dihambat oleh enzim tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs). Peningkatan yang berlebihan dari aktivitas enzin MMPs menyebabkan gambaran patologi yang luas pada jaringan paru yang ditandai dengan kerusakan matriks ekstraseluler (Elkington et al., 2011). Berbagai enzim dari keluarga tersebut juga mempunyai peranan penting pada proses angiogenesis, motilitas sel, apoptosis, regulasi imunitas, inflamasi dan pertahanan tubuh (Salgame, 2011). MMP-1 secara spesifik telah ditunjukkan mempunyai kemampuan melakukan degradasi terhadap kolagen tipe I yang menyebabkan kerusakan jaringan paru. Penelitian yang dilakukan pada pasien tuberkulosis menunjukkan

Disertasi



46 adanya peningkatan enzim MMP-1 dan penurunan enzim tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs). Penelitian ini juga diperkuat pada penelitian mencit yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis, menunjukkan adanya peningkatan enzin MMP-1 yang mempunyai korelasi yang kuat dengan peningkatan kerusakan jaringan alveoli dan secara signifikan terjadi peningkatan pemecahan kolagen. Pada penelitian tersebut juga menunjukkan bahwa mekanisme patogenesis terjadinya kerusakan jaringan paru akibat aktivitas MMP-1 berbeda dengan kerusakan jaringan paru karena proses nekrosis dan granuloma (Elkington et al., 2011).

Disertasi



47 BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL 3.1. Kerangka konseptual Ekstrak etanol herba Centella asiatica

IFNγ

IL 10 TNFα TNFR1

BH3 ONLY M.tuberculosis Bcl-2

Bax

Caspase-8

Caspase-3

Mitokondria

Apoptosome C-9

Makrofag Apoptosis Badan apoptotik

M.tuberculosis

Kerusakan jaringan

Gambar 3.1 Skema kerangka konseptual. Meningkatkan Menghambat Variabel yang diteliti

Disertasi



48 Keterangan Mycobacterium tuberculosis yang masuk kedalam tubuh melalui saluran napas akan difagositosis oleh sel alveolar makrofag pada jaringan paru. Mycobacterium tuberculosis merupakan

bakteri intraseluler di dalam makrofag dan mempunyai

kemampuan untuk mempengaruhi respons makrofag. Bakteri tersebut menginduksi peningkatan ekspresi protein anti apoptosis yaitu Bcl-2 dan menghambat ekspresi protein pro apoptosis yaitu Bax. Mycobacterium tuberculosis juga menghambat ekspresi reseptor membran seperti TNFR1 dan meningkatkan sekresi TNFR2. Mekanisme tersebut bertujuan untuk menghambat apoptosis sel makrofag. Hambatan mekanisme apoptosis sel makrofag, menyebabkan Mycobacterium tuberculosis tetap hidup dan berkembang biak di dalam sel makrofag. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica akan meningkatkan respons sel makrofag yang terinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis sehingga sel makrofag dapat meningkatkan kemampuannya untuk melakukan eliminasi bakteri melalui proses apoptosis. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein pro apoptosis yaitu Bax dan menghambat ekspresi protein Bcl2. Kedua protein tersebut adalah protein yang menginduksi proses apoptosis melalui jalur instrinsik. Ekstrak etanol herba Centella asiatica juga meningkatkan apoptosis melalui jalur ekstrinsik dengan cara meningkatkan sekresi TNF-α dan menghambat sekresi TNFR2. Interaksi antara TNF-α/TNFR1 akan membentuk suatu komplek yang memicu aktivitas protein caspase 8. Selain menginduksi jalur ekstrinsik, Aktivasi protein Caspase 8 juga mempengaruhi jalur instrinsik dengan memperkuat aktivitas protein Bax. Induksi apoptosis sel makrofag baik melalui jalur ekstrinsik maupun intrinsik akan memicu aktivitas protein eksekutor yaitu caspase 3 sehingga terjadi apoptosis sel makrofag.

Disertasi



49 Sel makrofag yang mengalami apoptosis akan membentuk badan apoptotik. Selanjutnya, badan apoptotik akan difagositois oleh sel makrofag melalui proses yang disebut efferositosis. Hasil akhir dari mekanisme apoptosis sel

makrofag adalah

menurunnya jumlah bakteri Mycobacterium tuberculosis dan menurunkan kerusakan jaringan paru. 3.2.Hipotesis Berdasarkan kerangka konseptual diatas maka disusunlah hipotesis sebagai berikut : 1. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 2. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 3. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 4. Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 5. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

Disertasi



50 6. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. 7. Ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis.

Disertasi



51 BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1. Jenis dan Rancangan penelitian Jenis penelitian ini adalah penelitian eksperimental laboratoris pada hewan coba. Rancangan penelitian adalah rancangan acak lengkap. Penelitian ini membuktikan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel

alveolar makrofag

jaringan paru tikus dengan infeksi

Mycobacterium tuberculosis. Tikus diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis secara intratrakea dan dibagi secara acak menjadi 5 kelompok. Pada hari ke-29 setelah infeksi tikus pada kelompok 5 dieuthanasia untuk mengetahui adanya infeksi tuberkulosis pada jaringan paru tikus. Kelompok 1, 2, dan 3 adalah kelompok perlakuan, yaitu kelompok tikus yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica dengan dosis

375mg/KgBB, 750mg/KgBB, 1500mg/KgBB,

sekali

sehari secara peroral selama 14 hari. Kelompok 4 adalah kelompok kontrol, yaitu kelompok tikus yang tidak memperoleh ekstrak etanol Centella asiatica.

Unit Eksperimen

Randomisasi P1

P2

P3

P4

P5

O1

O2

O3

O4

O5

Gambar 4.1 Bagan rancangan penelitian.

Disertasi



52

Keterangan: Kelompok P1=adalah kelompok tikus

yang diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis dan mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica sebesar 375mg/kgBB/ peroral sehari sekali Kelompok P2=adalah kelompok tikus yang

diinfeksi Mycobacterium

tuberculosis dan mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica sebesar 750mg/kgBB/ peroral sehari sekali Kelompok P3=adalah kelompok tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis dan mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica sebesar 1500mg/kgBB/ peroral sehari sekali Kelompok P4= adalah kelompok tikus kontrol, yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis dan tidak mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica Kelompok P5= adalah kelompok tikus praperlakuan yaitu kelompok tikus yang dieuthanasia pada hari ke-29 setelah infeksi untuk menentukan keberhasilan infeksi

4.2. Unit Eksperimen dan Replikasi 4.2.1 Unit Eksperimen Unit eksperimen pada penelitian ini adalah tikus jantan berumur 2 -3 bulan dengan berat badan sekitar 150 gram. Tikus dipilih sebagai unit eksperimen dalam penelitian ini karena memiliki banyak kesamaan proses patogenesis penyakit tuberkulosis dengan manusia, kemiripan respons imunologis dengan manusia, kemudahan pemeliharaan dan ketersediaan reagen (Orme, 2003; Gupta et al., 2005).

Disertasi



53 4.2.2 Replikasi Jumlah replikasi yang dipergunakan pada penelitian ini ditentukan dengan memakai rumus, sebagai berikut :

r≥ Keterangan r Z1-α Z1-β σ d f

2σ 2 ( Z1-α + Z1-β ) 2 d2

= besarnya masing-masing kelompok eksperimen = nilai standar normal yang besarnya tergantung α α = 0,05 jadi Z = 1,645 = power test (90%) = nilai yang diperoleh dari tabel yang telah ditentukan = 1,28 = standard deviasi = 6,3 = selisih rerata antara kelompok kontrol dan perlakuan yang diharapkan= 11 = faktor koreksi (10%)

Diperoleh nilai r adalah 5, 6 dibulatkan menjadi 6. Jadi replikasi minimal pada penelitian ini adalah 6. Setelah dilakukan koreksi

1/1- f, maka jumlah

replikasi adalah 7.

4.3. Variabel penelitian 4.3.1 Variabel bebas Variabel bebas pada penelitian ini adalah dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica. 4.3.2 Variabel tergantung Variabel tergantung pada penelitian ini adalah kerusakan jaringan paru tikus. 4.3.3 Variabel Antara

Disertasi

1.

Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag

2.

Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag



54 3.

Ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag

4.

Apoptosis sel alveolar makrofag

5.

Jumlah Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru tikus

6.

Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag

4.3.4 Variabel terkendali 1.

Strain , jenis kelamin, umur dan berat badan tikus

2.

Asal herba Centella asiatica

3.

Kandang hewan coba, makanan dan minuman

4.

Strain bakteri H37Rv

5.

Cara menginfeksi tikus

4.3.4 Definisi operasional variabel 4.3.4.1 Dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica Dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica adalah jumlah ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan pada tikus sesuai dengan berat badan secara peroral satu kali sehari selama 14 hari. Dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica adalah 375mg/KgBB, 750mg/KgBB dan 1500mg/kgBB. Penetapan dosis ekstrak berdasarkan penelitian pendahuluan. Sedangkan, Dosis ekstrak pada penelitian pendahuluan tersebut ditentukan berdasarkan penelitian sebelumnya pada hewan coba mencit dan dilakukan konversi dosis dari mencit ke tikus (Fatmawati et al., 2007). Ekstrak diberikan secara peroral dalam bentuk suspensi satu kali sehari selama 14 hari sesuai dengan berat badan tikus (Granapragrasam,

2004; Gitawati, 2005; Shamaseker,

2006; George et al., 2009; Wahjo, 2009).

Disertasi



55 4.3.4.2 Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus, diperiksa dengan menggunakan pemeriksaan imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5 lapang pandang dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x (Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2007). 4.3.4.3 Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus, diperiksa dengan menggunakan pemeriksaan imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5 lapang pandang dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x (Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2007). 4.3.4.4 Ekspresi protein Caspase 8 sel alveolar makrofag Ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi protein Caspase 8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus, diperiksa dengan menggunakan pemeriksaan imunohistokimia. Dihitung sebanyak 5 lapang pandang dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x (Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2007). 4.3.4.5 Apoptosis sel alveolar makrofag Apoptosis sel alveolar makrofag adalah sejumlah sel alveolar makrofag di jaringan paru tikus yang mengalami apoptosis diperiksa dengan pewarnaan TUNNEL assay (Apoptag Detection Kit), dihitung sebanyak 5 lapang pandang dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x (Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2007).

Disertasi



56 4.3.4.6 Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag adalah jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel makrofag pada jaringan

paru

imunohistokimia.

tikus,

diperiksa

Dihitung

dengan

sebanyak

5

menggunakan lapang

pemeriksaan

pandang

dengan

menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x (Mustafa et al., 2001; Mustafa et al., 2007). 4.3.4.7 Jumlah Mycobacterium tuberculosis dari jaringan paru tikus Jumlah

Mycobacterium

tuberculosis

adalah

jumlah

koloni

bakteri

Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru tikus dengan menghitung colony forming unit (CFU)/ml/gram jaringan yang dikultur pada media Midllebrook 7H10 (Forbes et al., 2007). 4.3.4.8 Kerusakan Jaringan Paru Tikus Kerusakan jaringan paru tikus adalah kerusakan jaringan paru tikus yang dinilai dengan menggunakan skor dari Dormans. Penilaian kerusakan berdasarkan parameter histopatologi : peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan pembentukan granuloma. Secara semikuantitatif tiap parameter dinilai dengan tidak ada (0), minimal, apabila hanya terdapat infilttrasi sel inflamasi dominan polimorfonuklear (1), ringan, apabila terdapat sel inflamasi dominan mononuklear dengan ketebalan < 5um (2), sedang, apabila terdapat sel inflamasi dominan mononuklear dengan ketebalan 5-10 um (3), jelas apabila terdapat sel inflamasi dominan mononuklear dengan ketebalan >10 um (4), dan berat, apabila terdapat kerusakan endotel dan sel inflamasi (5) (Dormans, 2004).

Disertasi



57 4.4. Bahan dan Alat Penelitian 4.4.1 Bahan 4.4.1.1 Bahan tumbuhan Tumbuhan yang digunakan adalah Centella asiatica (pegagan) yang diambil dari Balai Materia Medika, Batu, Malang dan telah dilakukan determinasi di Kebun Raya Purwodadi Pasuruan. Bagian tumbuhan yang diambil adalah keseluruhan tanaman diatas tanah dan disebut dengan herba Centella asiatica Tumbuhan tersebut ditanam pada daerah dataran tinggi dengan ketinggian 800 meter diatas permukaan laut dan dipanen pada usia antara 2-3 bulan. 4.4.1.2 Hewan coba Hewan coba yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus strain Wistar) jantan yang diperoleh dari unit hewan coba Universitas Gadjah Mada. Tikus yang dipilih berumur 2-3 bulan dengan berat badan antara 125 – 200 gram. Pakan tikus adalah pellet par G diproduksi oleh PT. Comfeed Indonesia. Air minum adalah air PDAM yang dimasak terlebih dahulu. 4.4.1.3 Bakteri Mycobacterium tuberculosis yang digunakan adalah strain H 37 RV (ATCC27294) yang diperoleh dari laboratorium tuberkulosis Lembaga Penyakit Tropik Universitas Airlangga. Bakteri yang diambil dari stock bakteri Mycobacterium tuberculosis ditanam pada Media LJ selama 2-3 minggu. Suspensi kuman dibuat dengan mengambil koloni bakteri masukkan didalam tabung kaca yang berisi 0,05% tween 80 2 tetes, glas bit yang telah diterra terlebih dahulu. Tambahkan aquadest ± 6 ml kemudian divortex dan suspensi dibandingkan dengan standard Mc Farland, 1 Mc Farland sebanding

Disertasi



58 dengan 10 8 /ml Mycobacterium tuberculosis (Saunders et al.,1996; Sato K et al.,1998). 4.4.1.4 Bahan Kimia Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah ketamin HCl injeksi (Hameln Pharmaceutical), ether (EMS No katalog 1180), alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80%, alkohol 70% (Brataco), aquadestilata (Brataco), carboxy methyl cellulosa natrium (Brataco), kiesel gel 60F 254 (Merk, no katalog 0345629), xylol, n-hexana, etilasetat, anisaldehide asam sulfat, pewarna Hematoxylin Eosin (EMS No katalog 14653), phosphate buffer saline (PBS) (Brataco), formaldehyde (Brataco), pewarna ZiehlNeelsen (EMS No katalog 484k), media Middlebrook 7H9 dan 7H10 (BD Biosciens No katalog 295964 ), fungizone (Sigma, katalog no A2942), Apoptag detection Kit (Milipore corporation, katalog no S1701), antibodi primer untuk Bcl-2 yaitu anti mouse monoclonal antibody Bcl-2 (Bioworld Technology Inc, No catalog BS1511), antibodi primer untuk antigen Mycobacterium

tuberculosis

(antibodies-online

GmbH,

katalog

no.

ABIN112959), antibodi primer untuk Bax yaitu rabbit Ig G Bax antibody (species reactivity to rat and mouse)

(Novus Biologicals, katalog no.

NB120-7977), antibodi primer untuk Caspase-8 yaitu rabbit IgG caspase 8 antibody

(Novus

Biologicals,

katalog

no.

NB120-15552),

Immunohistochemistry Kit (antibodi sekunder, streptavidim-HRP, DAB dari Daco LSAB no catalog K0673). 4.4.2

Alat Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah: tabung erlenmeyer 2L, corong Buchner, vakum ekstraktor dan rotavapour , chamber, timbangan,

Disertasi



59 sendok pengaduk, mortar, stamper, sonde pediatrik no 8, spuit 1 cc dan 5 cc, alat bedah minor, sarung tangan, masker, laminar flow, tabung sentrifus, incubator CO2, plate, glass bit, ose, vortek, bunsen, pipet mikro dan pinset. 4.5. Lokasi dan Waktu Penelitian 4.5.1

Lokasi Penelitian Penelitian dilakukan di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Airlangga, Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Laboratorium Farmasi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga, Laboratorium Tuberkulosis Lembaga Penyakit Tropik Universitas Airlangga, dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

4.5.2 Waktu Penelitian Penelitian dilakukan selama 9 bulan pada bulan Maret 2011 sampai dengan Nopember 2011. 4.6. Prosedur Penelitian 4.6.1 Ekstraksi dan Identifikasi herba Centella asiatica Ekstraksi herba Centella asiatica dilakukan dengan cara maserasi. Herba Centella asiatica adalah keseluruhan tanaman diatas tanah yang diambil dari Balai Materia Medica, Batu, Malang. Sebanyak 20 kg tanaman basah dikeringkan pada suhu kamar dan tidak terkena sinar matahari langsung. Bahan yang sudah kering dihaluskan dengan mesin penggiling dan diayak dengan pengayak. Serbuk yang dihasilkan ditampung dan dilakukan ekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi yaitu dengan merendam serbuk herba Centella asiatica dalam pelarut etanol 70%. Serbuk direndam di

Disertasi



60 dalam benjana tertutup selama 24 jam pada suhu kamar sambil sering diaduk. Rendaman disaring dengan menggunakan penyaring buchner dan vakum ekstraktor. Filtrat dikumpulkan dan residu direndam kembali dengan pelarut etanol 70% yang baru. Proses ekstraksi dilakukan sampai senyawa terpenoid yang terkandung didalam ekstrak herba Centella asiatica tidak terdeteksi lagi dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT). Filtrat hasil maserasi kemudian diuapkan dengan menggunakan rotavapour

sampai

didapatkan ekstrak kental. Sisa pelarut dalam ekstrak kental diuapkan dalam lemari asam. Hasilnya disebut dengan ekstrak etanol herba Centella asiatica. Identifikasi kandungan terpenoid dari ekstrak etanol herba Centella asiatica dilakukan dengan metode KLT. Ekstrak herba etanol Centella asiatica diambil secukupnya dan ditetesi dengan etanol, diaduk sampai larut. Larutan tersebut ditotolkan dengan menggunakan pipet kapiler pada fase diam yaitu kiesel gel GF 254. Fase diam dikeringkan dan setelah kering, direndam pada fase gerak (eluen) yaitu kombinasi antara n-hexana - etil asetat (4:1). Keberadaan senyawa terpenoid ditunjukkan adanya noda warna merah keunguan dengan penampak noda anisaldehida asam sulfat. Senyawa terpenoid juga dideteksi dengan menggunakan sinar uv vis (λ=365 nm). 4.6.2 Model infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus Tikus dipelihara dalam kabinet BSL di FKH Unair dan diberi makanan dan minuman ad libitum. Tikus diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis melalui trakea. Tikus dibius terlebih dahulu sebelum diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Obat anestesi yang digunakan adalah ketamin HCl dan obat anestesi yang digunakan untuk pemeliharaan selama tindakan pembedahan adalah ether. Ketamin HCl diberikan kepada tikus secara injeksi

Disertasi



61 intramuskular. Dosis ketamin adalah 50 mg/KgBb dan pada dosis tersebut tidak menimbulkan efek toksik (Kusumawati, 2004). Tikus difiksasi terlentang dan dibuat insisi pada leher sepanjang 0,5-1 cm, setelah terlihat trakea, suspensi bakteri diinjeksikan ke dalam trakea. Dosis Mycobacterium tuberculosis adalah 10 8 /ml, diinjeksikan ke trakea sebanyak 50μl. Luka insisi dijahit dan diberi betadin (Panduro et al., 1998; Adolfo et al., 2006; Rodrigues et al., 2009). Tikus dibiarkan pada posisi kepala lebih tinggi dan diamati sampai sadar kembali. Pada hari ke-29 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, tikus pada kelompok 5 dibunuh untuk membuktikan adanya infeksi tuberkulosis pada jaringan paru tikus. Jaringan paru kiri diambil secara aseptik dan dikultur pada media Middlebrook 7H10, sedangkan paru bagian kanan dimasukkan ke dalam formalin buffer 10% untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dengan menggunakan pewarnaan HE (Dormans et al., 2004).

4.6.3 Perlakuan Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica pada kelompok perlakuan dimulai pada hari ke-29 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Tikus pada kelompok 1 memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, kelompok 2 memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 750 mg/KgBB, kelompok 3 memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 1500 mg/KgBB. Ekstrak diberikan secara peroral dengan menggunakan sonde, satu kali sehari, selama 14 hari. Tikus pada kelompok 4 yaitu kelompok kontrol memperoleh suspensi CMC Na 1%

Disertasi



62 dalam aquadestilata yang diberikan secara peroral dengan menggunakan sonde, satu kali sehari, selama 14 hari. Pada hari ke-15 setelah perlakuan, baik tikus pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol dibunuh dan diambil organ paru untuk dilakukan pemeriksaan. Jaringan paru kiri diambil secara aseptik dan dikultur pada media Middlebrook 7H10, sedangkan paru bagian kanan dimasukkan ke dalam formalin buffer 10% untuk dilakukan pemeriksaan histopatologi dan imunohistokimia.

4.6.4 Pemeriksaan 4.6.4.1 Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Pemeriksaan

dilakukan

dengan

menggunakan

metode

imunohistokimia. Sediaan ditempatkan pada rak pengecatan, dilakukan deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit. Hidrasi preparat dengan alkohol absolut selama 5 menit, alkohol 96% selama 5 menit dan alkohol 80% selama 5 menit. Sediaan dicuci dengan PBS 3 kali selama 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi primer yaitu anti mouse monoclonal antibody Bcl-2 selama 1-2 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan kromogen diamino benzidine tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit. Dicuci

Disertasi



63 dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan Meyer’s Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau aquadest selama 10 menit. Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan dan kaca penutup.

4.6.4.2 Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Pemeriksaan

dilakukan

dengan

menggunakan

metode

imunohistokimia. Sediaan ditempatkan pada rak pengecatan, dilakukan deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit. Dilakukan hidrasi dengan alkohol absolut selama 5 menit, alkohol 96% selama 5 menit dan alkohol 80% selama 5 menit. Sediaan dicuci dengan PBS 3 kali selama 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi primer rabbit Ig G Bax antibody (species reactivity to rat and mouse) selama 1-2 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan kromogen Diamino Benzidine Tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan Meyer’s Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau aquadest selama 10 menit. Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan dan kaca penutup.

Disertasi



64 4.6.4.3

Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Caspase 8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Pemeriksaan

dilakukan

dengan

menggunakan

metode

imunohistokimia. Sediaan ditempatkan pada rak pengecatan, dilakukan deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit. Dilakukan hidrasi dengan alkohol absolut selama 5 menit, alkohol 96% selama 5 menit dan alkohol 80% selama 5 menit. Sediaan dicuci dengan PBS 3 kali selama 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi primer rabbit IgG caspase 8 antibody selama 1-2 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan kromogen Diamino Benzidine Tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan Meyer’s Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau aquadest selama 10 menit. Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan dan kaca penutup.

4.6.4.4 Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap apoptosis sel alveolar makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Preparat yang akan diperiksa dilakukan deparafinisasi dengan menggunakan xylol 1, xylol 2, xylol 3 masing selama 5 menit. Proses dilanjutkan dengan pencucian dengan menggunakan alkohol absolute

Disertasi



65 sebanyak 2 kali selama 5 menit, alkohol 96% selama 3 menit, alcohol 70% selama 3 menit. Selanjutnya cuci dengan aquadest dan phosphate buffer saline (PBS). Setelah proses deparafinisasi selesai, dilanjutkan dengan praperlakuan dengan tujuan untuk menghilangkan protein. Preparat ditambah dengan enzim trypsin 0,025% selama 5 menit, kemudian dicuci dengan PBS, tambahkan H2O2 3% selama 10 menit dan dicuci lagi dengan PBS. Inkubasi dengan antibodi spesifik (antibodi primer) dan dicuci dalam PBS. Lakukan prosedur sesuai dengan sistem deteksi yang digunakan. Dilakukan pewarnaan dan analisis secara mikroskopis.

4.6.4.5 Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi

antigen Mycobacterium tuberculosis pada

sel alveolar

makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Pemeriksaan

dilakukan

dengan

menggunakan

metode

imunohistokimia. Sediaan ditempatkan pada rak pengecatan, dilakukan deparafinisasi dengan xylol sebanyak 3 kali masing-masing selama 5 menit. Dilakukan hidrasi dengan alkohol absolut selama 5 menit, alkohol 96% selama 5 menit dan alkohol 80% selama 5 menit. Sediaan dicuci dengan PBS 3 kali selama 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi primer polyclonal antibody to Mycobacterium tuberculosis selama 1-2 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan antibodi sekunder selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan inkubasi dengan strepatavidin selama 1 jam dalam suhu kamar. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Ditetesi dengan

Disertasi



66 kromogen Diamino Benzidine Tetrahydrochlorida (DAB) selama 15 menit. Dicuci dengan PBS 3 kali 2-3 menit. Dilakukan counterstain dengan Meyer’s Hematoxylin selama 5 menit. Dicuci dengan air mengalir atau aquadest selama 10 menit. Preparat dikeringkan, mounting dengan entelan dan kaca penutup.

4.6.4.6 Pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap jumlah Mycobacterium tuberculosis H37Rv dari jaringan

paru tikus yang

diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Tikus yang sudah dieuthanasia, diambil jaringan paru secara aseptik dan ditimbang. Bagian paru kiri dihaluskan dan dilakukan pengenceran dengan penambahan larutan normal salin steril.

Seratus mikroliter dari

larutan tersebut diambil dan ditanam di media Midllebrook 7H10 selama 3 minggu. Setelah 3 minngu, dihitung jumlah bakteri CFU/ml/gram jaringan (Forbes et al., 2007). 4.6.4.7 Pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Paru bagian kanan akan dibuat histopatologi dengan pengecatan HE untuk mengetahui kerusakan jaringan (Sheshagiri et al., 2010). Paru kanan difiksasi dalam larutan formaldehyde 10% dalam PBS selama 2 hari kemudian direndam dalam paraffin dan pemotongan dilakukan sepanjang daerah terluas dari tiap lobus, hal ini dilakukan terhadap semua jaringan paru yang diperiksa sehingga semua jaringan paru mencit diperiksa pada daerah yang sama. Potongan setebal 5µm terpisah setiap 100 µm. Untuk pemeriksaan skor jaringan sediaan diwarnai dengan pengecatan HE.

Disertasi



67 Skor yang digunakan untuk menilai kerusakan jaringan paru tikus pada penelitian ini berdasarkan skor dari Dormans. Penilaian kerusakan berdasarkan parameter histopatologi : peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan pembentukan granuloma. Peribronkiolitis adalah keradangan pada bronkioli. Perivaskulitis adalah keradangan pada pembuluh darah. Alveolitis adalah keradangan pada jaringan alveoli. Granuloma adalah agregat seluler yang merupakan tanda khas dari infeksi tuberkulosis. Secara semikuantitatif tiap parameter dinilai dengan tidak ada (0), minimal, apabila infiltrasi sel radang berupa sel polimorfonuklear(1), ringan, apabila infiltrasi sel radang didominasi oleh sel mononuklear dengan ketebalan < 5 µm (2), sedang, apabila infiltrasi sel radang didominasi oleh sel mononuclear dengan ketebalan 5-10 µm (3), kuat, apabila apabila infiltrasi sel radang didominasi oleh sel mononuclear dengan >10 µm (4) dan berat, apabila infiltrasi sel radang didominasi oleh sel mononuklear dan terdapat kerusakan struktur (5) (Dormans, 2004).

Tabel 4.1 Skala Dormans (Dormans et al., 2004) Peribronkiolitis Skor Identifikasi 0

Tidak terdapat sel inflamasi pada dinding bronkiolus

1

Terdapat sel inflamasi dominan polimorfonuklear pada dinding bronkiolus Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding bronkiolus, ketebalan < 5 µm Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding bronkiolus, ketebalan 5 - 10 µm Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding bronkiolus, ketebalan >10 µm Terdapat sel inflamasi dan kerusakan epitel bronkiolus

2 3 4 5

Disertasi



68 Perivaskulitis Skor

Identifikasi

0

Tidak terdapat sel inflamasi pada dinding kapiler

1

Terdapat sel inflamasi dominan polimorfonuklear pada dinding kapiler Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding kapiler, ketebalan < 5 µm Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding kapiler, ketebalan 5 - 10 µm Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding kapiler, ketebalan >10 µm Terdapat sel inflamasi dan kerusakan endotel kapiler

2 3 4 5

Alveolitis Skor

Identifikasi

0

Tidak terdapat sel inflamasi pada dinding alveoli

1

4

Terdapat sel inflamasi dominan polimorfonuklear pada dinding alveoli Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding alveoli, luas,10% Terdapat sel inflamasi dominan mononuklear pada dinding alveoli, luas >10% Terdapat sel inflamasi peradangan intraalveoli <10%

5

Terdapat sel inflamasi peradangan intraalveoli >10%

2 3

Granuloma Skor Identifikasi 0 Tidak terdapat Granuloma

Disertasi

1

terdapat Granuloma diameter < 100 µm

2

terdapat Granuloma diameter 100 – 200 µm, jumlah < 2 buah

3

terdapat Granuloma diameter 100 – 200 µm, jumlah ≥ 2 buah

4

terdapat Granuloma diameter > 200 µm, jumlah < 2 buah

5

terdapat Granuloma diameter > 200 µm, jumlah ≥ 2 buah



69 4.6.5 Alur Penelitian 35 ekor tikus diaklimatisasi selama 1 mgg

Tikus dikelompokkan secara acak ke dalam 5 kelompok

Tikus diinfeksi dg M.tuberculosis H37Rv




Setelah 4 minggu

Perlakuan Ekstrak diberikan satu kali sehari selama 14 hari


Tikus dibunuh untuk pemeriksaan model infeksi tuberkulosis

EECA 375mg/Kg BB

EECA 750mg/Kg BB

EECA 1500mg/K g BB

Suspensi CMC Na 1%

Tikus dieuthanasia diambil paru kiri untuk dilakukan pemeriksaan jumlah M.tbc CFU/ml dan jaringan paru kanan dilakukan preparai PA untuk dilakukan pengecatan HE untuk pemeriksaan kerusakan jaringan dan pemeriksaan imunohistokimia yaitu: apoptosis, caspase-8,protein Bax dan BCl-2

Gambar 4.2. Skema alur penelitian. Keterangan : EECA = ekstrak etanol herba Centella asiatica CMC Na = carboxy methyl cellulosa natrium

4.7. Analisis Data Data yang dihasilkan dilakukan uji normalitas dan homogenitas varians. Untuk komparasi dilakukan uji ANAVA. Data kerusakan jaringan dilakukan uji Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan Mann-Whitney U. Untuk tujuan korelasi dilakukan analisis jalur dan korelasi dari Spearman. 4.8. Kelaikan Etik Penelitian ini telah dinyatakan laik etik oleh Komisi Etik penelitian Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Airlangga.

Disertasi



70

BAB 5 HASIL DAN ANALISIS

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental pada hewan coba tikus tentang efek dan mekanisme ekstrak etanol herba Centella asiatica pada apoptosis sel makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis terhadap ekspresi protein Bcl-2, protein Bax, Caspase-8, antigen Mycobacterium tuberculosis, jumlah Mycobacterium tuberculosis dan kerusakan jaringan paru tikus. Data yang diperoleh dari penelitian dilakukan analisis dan ditampilkan dalam bentuk tabel, grafik dan gambar.

5.1. Hasil Ekstraksi dan identifikasi herba Centella asiatica Telah dilakukan ekstraksi secara maserasi terhadap 2 kg serbuk kering Centella asiatica yang menghasilkan 551 gram ekstrak kental. Berdasarkan identifikasi menggunakan KLT menunjukkan bahwa pada ekstrak alkohol herba Centella asiatica nampak noda berwarna merah keunguan dengan penampak noda anisaldehide-asam sulfat. Eluen yang digunakan pada KLT adalah kombinasi antara n- hexana dan etil asetat dengan perbandingan nhexane 4 : etil asetat 1. Noda yang tampak pada kiesel gel apabila dilihat dengan sinar uv vis dengan panjang gelombang 365 nm menunjukkan warna biru terang dan oranye terang dan oranye gelap (gambar 5.1). Warna noda tersebut menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica mengandung senyawa terpenoid.

Disertasi



71

Senyawa terpenoid

(a)

Senyawa terpenoid

(b)

Gambar 5.1 Hasil KLT ekstrak etanol Centella asiatica. (a) Noda bewarna merah keunguan dengan penampak noda anisaldehide-asam sulfat menunjukkan senyawa terpenoid (b) Noda berwarna biru terang, oranye terang dan oranye gelap dengan sinar uv vis dengan panjang gelombang 365 nm menunjukkan senyawa terpenoid.

5.2. Hasil Model Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada tikus. Hasil model infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus setelah minggu ke-4 menunjukkan adanya

kerusakan jaringan paru tikus. Hasil pemeriksaan

histopatologi kerusakan jaringan paru tikus dinilai berdasarkan skor Dorman yaitu peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan granuloma menunjukkan tingkat kerusakan ringan sampai sedang. Peribronkiolitis yaitu infiltrasi sel radang campuran antara polimorfonuklear (PMN) dan makrofag pada dinding bronkiolus dengan ketebalan

> 10 um yang didominasi sel makrofag, tanpa disertai

kerusakan epitel bronkiolus menunjukkan skor 4 (gambar 5.2 a). Pada perivaskulitis menunjukkan adanya infiltrasi sel radang pada pembuluh darah merupakan campuran antara PMN dan makrofag dimana PMN lebih dominan. Gambaran tersebut menunjukkan perivaskulitis dengan skor 1 (gambar 5.2 a).

Disertasi



72 Alveolitis adalah keradangan pada jaringan alveoli yang ditandai dengan adanya infiltrasi sel radang tanpa

kerusakan dinding alveoli atau struktur alveoli.

Gambaran tersebut menunjukkan alveolitis dengan skor 3 (gambar 5.2 c). Granuloma yang ditunjukkan pada gambar 5.2.(d) merupakan ciri khas infeksi tuberkulosis dan penilaian berdasarkan skor Dorman adalah 1.

a

b

c

d

Gambar 5.2 Histopatologi kerusakan jaringan paru tikus pada minggu ke-4 setelah infeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Gambar diatas menunjukkan kerusakan jaringan paru dengan parameter: peribronkiolitis dengan skor 4 (a), perivaskulitis dengan skor 1 (b), alveolitis dengan skor 3 (c), dan granuloma dengan skor 1. Pengecatan Hematoxylin Eosin. Pembesaran 200x untuk (a), 400x untuk (b,c,d).

Disertasi



73 5.3. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag ada pada kelompok kontrol yaitu 79,06 (gambar 5.3).

79.06 Rerata ekspresi protein Bcl2

80 70 60 50 40

27.83

30.47

Dosis 1

Dosis 2

33.83

30 20

10 0 Dosis 3

Kontrol

Gambar 5.3 Rerata ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Ekspresi protein Bcl2 dikatakan positif jika

Disertasi



74 sitoplasma sel alveolar makrofag yang berwarna coklat, sedangkan ekspresi protein Bcl-2 negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar 5.4). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok kontrol, menunjukkan jumlah sel alveolar makrofag dengan ekspresi protein Bcl-2 positif yang tinggi.

a

c

b

d

Gambar 5.4. Ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), dan kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi Bcl-2. Diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi protein Bcl2 positip (panah kuning) sedangkan yang tidak berwarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Jumlah ekspresi protein Bcl-2 tertinggi ada pada kelompok kontrol. Pembesaran 400x.

Disertasi



75

Tabel 5.1 Perhitungan statistik ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 9,7 12,2 38,8 29,7 a 750mg/Kgbb 11,9 20,4 55,2 30 a 1500mg/Kgbb 25,7 10 81,4 33,8 b Kontrol 47,2 27,6 168,2 79,2 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas one sample Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan homogen. Setelah dilakukan analisis varian dan dilanjutkan dengan comparasion (α=0,05)

multiple

didapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan yang

bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok kontrol (p=0,016), antara kelompok dosis 750 mg mg/KgBB dengan kontrol (p=0,008) dan dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,037).

5.4. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 750mg/Kgbb yaitu 98,3 (gambar 5.5).

Disertasi



76

98.03 100 Rerata ekspresi protein Bax

90 80 70 60

52.97

51.51

53.03

50 40 30 20 10 0

Dosis 1

Dosis 2

Dosis 3

Kontrol

Gambar 5.5 Rerata ekspresi protein Bax sel alvelolar makrofag pada jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

Ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Ekspresi protein Bax dikatakan positif jika sitoplasma sel alveolar makrofag berwarna coklat, sedangkan ekspresi protein Bax negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar 5.6). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/KgBB menunjukkan jumlah sel alveolar makrofag dengan ekspresi protein Bax positif yang tinggi.

Disertasi



77

Gambar 5.6 Ekspresi protein Bax dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), dan kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi Bax. Diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi protein Bax positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Jumlah ekspresi protein Bax tertinggi ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/KgBB. Pembesaran 400x.

Tabel 5.2 Perhitungan statistik ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 19,6 26 77 51,3 b 750mg/Kgbb 7,8 86,8 109,2 98,1 a 1500mg/Kgbb 34,1 30,6 120,8 53

Disertasi



78 Kontrol 23,6 30,4 90,6 53 a Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna. Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas One SampleKolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan homogen. Setelah dilakukan analisis varian dan dilanjutkan dengan comparasion (α=0,05)

multiple


bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok dosis 750 mg/KgBB (p=0,004), antara kelompok dosis 750 mg/KgBB dengan dosis 1500 mg/KgBB (p=0,008) dan antara dosis 750 mg/KgBb dengan kelompok kontrol (p=0,008).

5.5. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica

terhadap

ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi protein caspase 8 pada sel alveolar makrofag ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica

dosis 750mg/Kgbb yaitu 109,43

(gambar 5.7). Ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Ekspresi protein caspase 8 dikatakan positif jika sitoplasma sel alveolar makrofag berwarna coklat, sedangkan ekspresi protein

Disertasi



79 caspase 8 negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar 5.8). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/KgBB menunjukkan jumlah sel alveolar makrofag dengan ekspresi protein caspase 8 positif yang tinggi.

120

109.43

Rerata ekspresi protein caspase8

100.3 100 80

57.06 60 37.1 40 20 0 Dosis 1

Dosis 2

Dosis 3

Kontrol

Gambar 5.7 Rerata ekspresi enzim Caspase-8 positif dari sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

Disertasi



80

Gambar 5.8 Ekspresi protein caspase-8 dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi caspase 8. Diperiksa dengan menggunakan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi protein Caspase positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah).Ekspresi caspase 8 tertinggi ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/Kgbb. Pembesaran 400x. Tabel 5.3 Perhitungan statistik ekspresi protein caspase 8 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 18,3 38,6 87,6 57 b 750mg/Kgbb 16,3 87,4 121,8 107,2 b 1500mg/Kgbb 38,4 42,4 153,4 100,3 a Kontrol 15,3 20 64,6 36,1 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Disertasi



81

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan homogen. Setelah dilakukan analisis varian dan dilanjutkan dengan

multiple comparasion (α=0,05)

didapatkan hasil bahwa terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok dosis 750 mg/KgBB (p=0,003), antara dosis 750 mg/kgBB dengan kelompok kontrol (p=0,000) dan antara dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,001).

5.6. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica apoptosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium

dengan

tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok

perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi apoptosis sel alveolar makrofag ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 750mg/Kgbb, yaitu 105,94 ( gambar 5.9). Apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus diperiksa dengan menggunakan pengecatan Tunnel assay. Pada pengecatan tersebut suatu sel dikatakan mengalami apoptosis apabila sel tersebut mengalami fragmentasi DNA. Sel alveolar makrofag yang menunjukkan apoptosis positif adalah sel alveolar makrofag yang inti selnya berwarna kecoklatan (gambar 5.10). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba

Disertasi



82 Centella asiatica 750mg/KgBB menunjukkan jumlah apoptosis sel alveolar

Rerata apoptosis sel alveoalr makrofag

makrofag yang tinggi.

120

105.94

100 74.1

80 57.8 60 40

19.1 20 0 Dosis 1

Dosis 2

Dosis 3

Kontrol

Gambar 5.9 Rerata apoptosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

Disertasi



83

Gambar 5.10 Apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), kelompok kontrol (d) terhadap apoptosis sel alveolar makrofag. Diperiksa dengan menggunakan Tunnel assay (Apoptag detection kit). Inti sel yang berwarna coklat menunjukkan hasil positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Jumlah apoptosis tertinggi ada pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/KgBB Pembesaran 400x. Tabel 5.4

Perhitungan statistik ekspresi protein apoptosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum b 375mg/Kgbb 15,4 37,6 77,2 57,8 c 750mg/Kgbb 21,2 68,8 134 105,9 b 1500mg/Kgbb 17,1 52,8 97,4 74,1 a Kontrol 18,6 4 44,6 19,1 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Disertasi



84

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas one sample Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan homogen. Setelah dilakukan analisis varian dan dilanjutkan dengan multiple comparasion (α=0,05) bermakna antara


kelompok dosis

375 mg/KgBB dengan dosis 750

mg/KgBB (p=0,000), kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,005), dosis 750 mg/KgBB dengan dosis 1500 mg/KgBB (p=0,023), dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000).

5.7. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap jumlah ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap

ekspresi antigen Mycobacterium

makrofag dari jaringan paru

tuberculosis sel alveolar

tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis menunjukkan perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Rerata tertinggi ekspresi

antigen Mycobacterium

tuberculosis sel alveolar makrofag ada pada kelompok kontrol, yaitu 109 (gambar 5.11). Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol diperiksa

Disertasi

dengan

menggunakan

imunohistokimia.

Ekspresi

antigen



85 Mycobacterium tuberculosis dikatakan positif jika sitoplasma sel alveolar makrofag berwarna coklat, sedangkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis negatif apabila sitoplasma sel alveolar tidak berwarna (gambar 5.12). Pada gambar tersebut terdapat perbedaan antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Pada kelompok kontrol menunjukkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis yang tinggi.

109

Jumlah ekspresi antigen M.tuberculosis

120 100

92.7

91.57

80 54.27

60 40 20 0 Dosis 1

Dosis 2

Dosis 3

Kontrol

Gambar 5.11. Rerata ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikusyang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

Disertasi



86

Gambar 5.12 Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis dari sel alveolar makrofag jaringan paru tikus. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica 375 mg/Kgbb(a), 750mg/Kgbb (b), 1500mg/Kgbb (c), dan kelompok kontrol (d) terhadap ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis. Diperiksa dengan imunohistokimia. Sitoplasma sel yang berwarna coklat menunjukkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis positip (panah kuning) sedangkan yang tidak bewarna menunjukkan hasil negatip (panah merah). Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis tinggi pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica 750mg/Kgbb. Pembesaran 400x.

Disertasi



87 Tabel 5.5 Perhitungan statistik ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum a b 375mg/Kgbb 25,1 67,4 139,8 91,5 b 750mg/Kgbb 42,9 14,6 144,8 52,5 a b 1500mg/Kgbb 92,7 33,5 62,4 141,4 a Kontrol 20,6 74,8 133,8 109 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas One Sample Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal dan homogen. Setelah dilakukan analisis varian dan dilanjutkan dengan multiple comparasion (α=0,05)


bermakna antara kelompok dosis 750 mg/KgBB dengan kelompok kontrol (p=0,021).

5.8. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/g) dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/g) jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis pada media 7H10

terdapat perbedaan

antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Rerata jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/g) terendah pada kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica pada dosis 750 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB, yaitu tidak terdapat pertumbuhan koloni (ganbar 5.13).

Disertasi



88 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis dari jaringan paru pada media Midllebrook 7H10 nampak bentukan bulat, kecil dan berwarna putih kekuningan. Koloni tersebut dilakukan pewarnaan dengan pewarna Ziehl Neelsen nampak bentukan batang soliter, berkelompok, dan bentuk huruf Y yang bewarna

merah.

Bentukan

tersebut

merupakan

bakteri

tahan

asam

Rerata jumlah M.tuberculosis CFU/ml

Mycobacterium tuberculosis (gambar 5.14). 326.4

350 300 250 200 150

110.4

100

50

0

0

0 Dosis 1

Dosis 2

Dosis 3

Kontrol

Gambar 5.13. Rerata jumlah Mycobacterium tuberculosis CFU/ml/gram dari jaringan paru tikus. Kelompok tikus yang diinfeksi dengan M. tuberculosis yang mendapat ekstrak herba Centella asiatica 375mg/KgBB (Dosis 1), 750mg/KgBB (Dosis 2), 1500 mg/KgBB (Dosis 3). Kontrol adalah kelompok tikus terinfeksi M. tuberculosis yang tidak memperoleh ekstrak.

a

b

Gambar 5.14 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis pada media MidlleBrook 7H10 (panah hitam)(a), Mycobacterium tuberculosis dari hasil kultur dilakukan pengecatan dengan Ziehl Neelsen. Mycobacterium tuberculosis ditunjukkan dengan panah hitam (b).

Disertasi



89

Perhitungan statistik jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml/gram) jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok x SD Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 35,7 76,2 181,8 110,4 b 750mg/Kgbb 0 0 0 0 b c 1500mg/Kgbb 0 0 0 0 d Kontrol 111,2 161,9 473,7 326 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna. Tabel

5.6

Sebelum dianalisis data diuji dengan uji normalitas one sample Kolmogorov Smirnov dan uji homogenitas. Data berdistribusi normal tetapi tidak homogen. Setelah dilakukan uji independent t-test, didapatkan hasil bahwa terdapat perbedann yang bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,000), dosis 375 mg/KgBB dengan dosis 750 mg/KgBB (p=0,000), dosis 375 mg/KgBB dengan dosis 1500 mg/KgBB (p=0,000). 5.9. Hasil Pemeriksaan Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Hasil pemeriksaan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap kerusakan jaringan paru tikus yang

diinfeksi Mycobacterium tuberculosis

berdasarkan 4 paramater histopatologi dari Dormans. Peribronkiolitis terjadi pada semua kelompok baik pada kelompok perlakuan maupun kelompok kontrol. Gambaran peribronkiolitis ringan (skor 1) yaitu terdapat infiltrasi sel

Disertasi



90 makrofag pada bronkiolus dengan ketebalan < 5 µm, terjadi pada kelompok perlakuan yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 750 mg/KgBB (gambar 5.15 b). Sedangkan, peribronkiolitis yang paling berat dengan skor 5 terjadi pada kelompok kontrol (gambar 5.15 d). Pada kelompok yang mendapat ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB, gambaran peribronkiolitis adalah sedang dengan skor 3 (gambar 5.15 a & c).

a

b

c

d

Gambar 5.15. Peribronkiolitis. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap terjadinya peribronkiolitis (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 3(a), 750mg/Kgbb dengan skor 1 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 3(c), dan kelompok kontrol dengan skor 5(d). Pengecatan Hematoxylin Eosin. Pembesaran 400x (a,b,c), 200x (d).

Disertasi



91 Tabel 5.7

Perhitungan statistik peribronkiolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Dosis Median Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 2 5 2 a 750mg/Kgbb 1 5 2 a 1500mg/Kgbb 2 5 3 a Kontrol 2 5 3 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan

Mann-WhitneyU ternyata tidak terdapat perbedaan yang bermakna

antara kelompok perlakuan dengan kelompok kontrol. Perivaskulitis yang terjadi pada kelompok

yang mendapat ekstrak

etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB adalah ringan (skor 2) yaitu terdapat infiltrasi sel makrofag di sekitar pembuluh darah. Pada kelompok dengan dosis ekstrak 750 mg/KgBB perivaskulitis yang terjadi adalah minimal (skor 1) yaitu hanya terdapat infiltrasi sel radang polimorfonuklear. Pada kelompok kontrol perivaskulitis yang terjadi adalah jelas yaitu infiltrasi sel makrofag pada pembuluh darah ketebalannya lebih dari 10 µm dan terjadi kerusakan dinding pembuluh darah (skor 5) (gambar 5.16).

Disertasi



92

a

b

c

d

Gambar 5.16 Perivaskulitis. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap perivaskulitis (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 2(a), 750mg/Kgbb dengan skor 1 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 2(c). Kelompok yang tidak memperoleh terapi adalah kelompok kontrol dengan skor 5(d). Pengecatan Hematoxylin eosin. Pembesaran 400x (a,b,c), 200x (d).

Tabel 5.8

Perhitungan statistik perivaskulitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Dosis Median Minimum Maksimum a b 375mg/Kgbb 1 2 2 a 750mg/Kgbb 1 2 1 b c 1500mg/Kgbb 2 3 2 c Kontrol 3 5 3,5 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Disertasi



93 Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan Mann-Whitney U ternyata terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,027) dan 750 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,012) Dosis 750 mg/KgBB juga berbeda bermakna dengan dosis 1500 mg/KgBB (p=0,025). Alveolitis yang terjadi pada jaringan paru tikus kelompok 1 pada dosis ekstrak 375 mg/KgBB, 750 mg/KgBB dan 1500 mg/KgBB adalah ringan (skor2) yaitu terdapat infiltrasi sel mononuklear pada dinding alveoli. Pada kelompok kontrol alveolitis yang terjadi adalah jelas yaitu infiltrasi sel makrofag pada alveoli, ketebalannya lebih dari 10 um (skor 4) (gambar 5.17).

Tabel 5.9 Perhitungan statistik alveolitis jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Dosis Median Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 2 4 2 a 750mg/Kgbb 2 5 3 a b 1500mg/Kgbb 2 5 3 b Kontrol 3 5 4 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna

Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan Mann-Whitney U ternyata terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kelompok kontrol (p=0,01), dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,033).

Disertasi



94

a

c

b

d

Gambar 5.17 Alveolitis. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap alveolitis (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 2(a), 750mg/Kgbb dengan skor 2 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 2(c). Kelompok yang tidak memperoleh terapi adalah kelompok kontrol dengan skor 4 (d). Pengecatan Hematoxylin eosin. Pembesaran 400x (a,c,d), 200x (b).

Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap pembentukan granuloma pada jaringan paru tikus menunjukkan perbedaan kelompok perlakuan dan kelompok kontrol. Pada pemberian ekstrak dengan dosis 375 mg/KgBB, 750 mg/KgBB, dan 1500 mg/KgBB menunjukkan skor 1, sedangkan pada kelompok kontrol skor 3 (gambar 5.20).

Disertasi



95

a

b

c

d

Gambar 5.18 Granuloma. Gambar diatas menunjukkan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap granuloma (panah hitam) pada dosis 375 mg/Kgbb dengan skor 1(a), 750mg/Kgbb dengan skor 1 (b), 1500mg/Kgbb dengan skor 1(c). Kelompok yang tidak memperoleh terapi adalah kelompok kontrol dengan skor 3(d). Pengecatan Hematoxylin eosin. Pembesaran 400x (c), 200x (a,b,d).

Tabel 5.10 Perhitungan statistik pembentukan granuloma jaringan paru tikus antara kelompok perlakuan dan kontrol (rerata (x), simpangan baku (SD) nilai minimum dan maksimum) Kelompok Median Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 0 1 0 a 750mg/Kgbb 0 1 0 a 1500mg/Kgbb 0 1 0 a Kontrol 0 3 2 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna.

Disertasi



96 Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan Mann-Whitney U ternyata tidak terdapat perbedaan yang bermakna. Jumlah total skor Dormans antara kelompok perlakuan dan kelompok kontrol ditampilkan dalam bentuk tabel 5.11.

Tabel 5.11

Perhitungan statistik jumlah total skor Dormans kerusakan jaringan paru tikus Kelompok Median Minimum Maksimum a 375mg/Kgbb 5 11 8 a 750mg/Kgbb 6 9 7 a 1500mg/Kgbb 7 12 8,5 b Kontrol 9 17 12,5 Keterangan : Notasi yang berbeda menunjukkan perbedaan yang bermakna Setelah dilakukan analisis dengan Kruskal Wallis dan dilanjutkan dengan Mann-Whitney U ternyata terdapat perbedaan yang bermakna antara kelompok dosis 375 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,006), dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,004), dosis 1500 mg/KgBB dengan kontrol (p=0,043). Untuk mengetahui adanya korelasi antara pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dengan ekspresi protein Bcl 2, Bax, caspase 8, apoptosis dan jumlah Mycobacterium tuberculosis maka dilakukan analisis statistik yaitu analisis jalur. Analisis tersebut juga bertujuan untuk mengetahui hubungan antar variabel. Berdasarkan analisis jalur, ekstrak etanol herba Centella asiatica secara signifikan menurunkan ekspresi protein Bcl2 sel alveolar makrofag (p=0,044), meningkatkan ekspresi protein Bax secara bermakna (p=0,001), dan meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 (p=0,000). Peningkatan ekspresi protein Caspase 8 secara signifikan mempengaruhi peningkatan ekspresi protein Bax (p=0,000) dan peningkatan apoptosis sel alveolar makrofag

Disertasi



97 (p=0,000). Ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag (p=0,000) sehingga menyebabkan penurunan jumlah Mycobacterium tuberculosis (p=0,000).

e2 BCL2 -.39

e1 DOSIS

-.22

e3 -.59

.66

BAX e41.00

e5

e6 -.70

-.03

APOP

CFU

.60

CAS8

Gambar 5.19. Skema analisis jalur

Hasil uji korelasi Spearmans antara jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/g) dengan kerusakan jaringan adalah bermakna (p=0,038). Hal ini menunjukkan bahwa terdapat hubungan yang kuat antara penurunan jumlah Mycobacterium tuberculosis dengan penurunan kerusakan jaringan paru tikus.

Disertasi



98 BAB 6 PEMBAHASAN

Karakteristik bakteri patogen di dalam tubuh manusia dan hewan adalah untuk menemukan tempat replikasi yang cocok di dalam tubuh inang, dimana bakteri tersebut dapat berkembang biak. Setiap bakteri mempunyai sifat yang spesifik yang berbeda antara satu bakteri dengan bakteri lainnya, sebagai usaha untuk mempertahankan hidup dan menimbulkan infeksi pada inang. Berbagai usaha tersebut adalah memanipulasi respons imun, menghindari sistem pengenalan dan menghambat proses apoptosis. Kemampuan bakteri patogen untuk menghambat apoptosis makrofag pada sel inang selama infeksi merupakan masalah utama pada studi patogenesis bakteri (Faherty et al., 2008). Apoptosis adalah suatu proses kematian sel terpogram yang terjadi secara teratur untuk menghilangkan berbagai sel yang tidak diperlukan tanpa respons inflamasi

(Geweis, 2003). Apoptosis

terjadi

secara

normal

selama

masa

perkembangan dan penuaan. Mekanisme tersebut merupakan mekanisme homeostasis untuk menjaga dan memelihara populasi sel di dalam jaringan. Apoptosis juga berfungsi sebagai mekanisme pertahanan seperti pada reaksi imun atau ketika sel rusak karena suatu penyakit atau agen toksik. Karakteristik apoptosis adalah terjadinya fragmentasi DNA, kondensasi kromatin, pengerutan sitoplasma dan sel akan mati tanpa lisis sehingga tidak merusak sel atau jaringan sekitarnya (Geweis, 2003; Elmore, 2007). Mycobacterium tuberculosis adalah bakteri penyebab tuberkulosis. Bakteri tersebut merupakan parasit fakultatif intraseluler di dalam makrofag yang mempunyai kemampuan untuk memanipulasi respons imun inang pada makrofag, sehingga

Disertasi



99 makrofag merupakan tempat yang sesuai untuk berkembang biak (Kornfeld et al., 1999). Studi terbaru menunjukkan bahwa kemampuan Mycobacterium tuberculosis menghambat apoptosis makrofag merupakan faktor yang mempengaruhi virulensi, karena hambatan pada proses apoptosis menyebabkan Mycobacterium tuberculosis dapat hidup dan berreplikasi di dalam makrofag (Faherty et al., 2009; Rudel et al., 2010; Behar et al., 2010). Hal ini merupakan dasar untuk menemukan bahan obat yang dapat digunakan sebagai imunoterapi untuk memperbaiki terapi tuberkulosis yang

sudah

ada.

Imunoterapi

tersebut

diharapkan

imunostimulasi yang sesuai sehingga menginduki membunuh Mycobacterium tuberculosis

mampu

menimbulkan

apoptosis sel makrofag dan

di dalam sel makrofag serta mencegah

kerusakan jaringan yang lebih luas.

6.1. Ekstraksi dan Identifikasi herba Centella asiatica Hasil

identifikasi

ekstrak

etanol

herba

Centella asiatica

yang

menggunakan metode kromatografi lapis tipis dengan penampak noda anisaldehide-asam sulfat dan eluen kombinasi dari n-hexana dengan etil asetat menunjukkan bahwa terdapat 3 noda berwarna merah ungu. Warna noda tersebut menunjukkan bahwa ekstrak etanol Centella asiatica mempunyai kandungan senyawa terpenoid. Apabila noda tersebut dilihat dibawah sinar uv dengan panjang gelombang 365 nm, ketiga noda warna ungu tersebut mempunyai tiga warna yang berbeda yaitu biru terang, oranye gelap dan oranye terang. Hasil ini mempunyai kesamaan dengan penelitian tentang profiling analisis dari ekstrak etanol Centella asiatica yang memperlihatkan adanya senyawa aktif golongan terpenoid yang ditunjukkan dengan adanya warna biru terang adalah senyawa

Disertasi



100 asiatic acid, oranye gelap adalah madecassoside dan oranye terang adalah asiaticoside (Zainol et al., 2008: James et al., 2011).

6.2. Model Infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada Tikus Pada penelitian ini tikus digunakan sebagai model untuk infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis. Tikus secara umum sering digunakan sebagai model untuk penelitian penyakit tuberkulosis, terutama untuk menemukan obat baru. Pemilihan ini disebabkan karena infeksi tuberkulosis pada tikus menghasilkan respons imun yang cepat dan spesifik yang mempunyai korelasi dengan respons imun pada manusia (Gupta et al., 2005; Singhal et al., 2011). Hewan coba tikus telah dibuktikan memiliki progresifitas perjalanan penyakit tuberkulosis yang menyerupai manusia dan mampu memberikan gambaran histopatologik akibat infeksi tuberkulosis yang mewakili infeksi pada manusia. Selain itu tikus memiliki kemiripin pada dasar fisiologis, metabolik, anatomi, respons imun dengan manusia (Gupta et al., 2005; Gaonkar et al., 2010). Terdapat berbagai macam cara untuk melakukan infeksi Mycobacterium tuberculosis pada hewan coba yaitu aerosol, intranasal, intraperitoneal dan intratrakeal. Aerosol adalah cara infeksi Mycobacterium tuberculosis pada hewan coba yang paling mendekati cara alami bakteri tersebut menginfeksi manusia (Gaonkar et al., 2010). Kelemahan pada cara tersebut terletak pada alat khusus yang digunakan serta standart laboratorium Biosafety level 3 (BSL3). Infeksi Mycobacterium tuberculosis pada hewan coba bisa dilakukan melalui intranasal, yaitu dengan cara larutan kuman diinokulasikan lewat nares eksternal dengan mikropipet. Hasil dari cara infeksi ini juga mampu menilai pertumbuhan bakteri dan sel inflamasi pada mencit (Saunders et al., 1996). Kelemahan cara intranasal

Disertasi



101 ini kurang efektif dibandingkan dengan cara intratrakea karena harus melalui saluran napas atas sehingga dimungkinkan bakteri akan bertempat di faring maupun laring. Selain itu penempatan bakteri pada mukosa nasal akan merangsang mukosa dan menimbulkan refleks bersin karena bakteri merupakan benda asing. Akibat refleks tersebut sebagian bakteri akan terbuang ke luar dan yang masuk ke dalam jaringan paru berkurang. Pada penelitian ini, menggunakan cara infeksi Mycobacteriun tuberculosis dengan menggunakan cara intratrakea karena cara tersebut paling aman digunakan baik bagi peneliti maupun bagi lingkungan. Cara intratrakeal ini juga sudah dibuktikan mampu menimbulkan infeksi dan kelainan histopatologik pada jaringan paru tikus dan dapat menilai pertumbuhan koloni kuman (Sugawara et al., 2004; Dormans et al., 2004; Rodrigues et al., 2009; Gil et al., 2010; Singhal et al., 2011). Hasil infeksi Mycobacteriun tuberculosis pada tikus menunjukkan adanya kerusakn jaringan paru berupa peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan pembentukan granuloma. Peribronkiolitis yang terjadi menunjukkan adanya infiltrasi sel radang yang didominasi oleh makrofag pada dinding bronkioli dengan ketebalan 5-10um. Perivaskulitis yang terjadi menunjukkan adanya infiltrasi sel radang terutama polimorfonuklear pada dinding vaskuler. Alveolitis pada penelitian ini menggambarkan infiltrasi sel radang polimorfonuklear dan makrofag pada dinding alveoli, sedangkan granula yang terbentuk masih sedikit. Pada fase ini banyak ditemukan sel radang polimorfonuklear yang menunjukkan bahwa tingkat kerusakan jaringan adalah minimal dan juga bisa menunjukkan bahwa ini merupakan fase awal infeksi tuberkulosis. Hasil penelitian ini sesuai dengan penelitian tentang

Disertasi

infeksi

tuberkulosis bahwa pada awal infeksi



102 morfologi lesi di jaringan paru tikus yang disebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis menunjukkan gambaran infiltrasi sel radang yang didominasi sel polimorfonulear (Sugawara et al., 2004; Dormans et al., 2004; Basaraba, 2008). Hasil kultur jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis pada kelompok ini menunjukkan adanya pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis pada jaringan paru tikus. Berdasarkan hasil tersebut menunjukkan bahwa pada minggu ke-4 setelah infeksi oleh Mycobacterium tuberculosis, tikus sudah mengalami infeksi tuberkulosis.

6.3. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Ekspresi Protein Bcl-2 Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Taru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Ekstrak etanol herba Centella asiatica tidak secara linier menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag jaringan paru tikus seiring dengan peningkatan dosis yang diberikan. Pemberian ekstrak etanol

herba Centella asiatica

dosis 375

mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500 mg/KgBb memberikan perbedaan yang signifikan pada penurunan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag bila dibandingkan dengan kontrol, tetapi diantara ketiga dosis tersebut tidak memberikan perbedaan yang bermakna. Pada kelompok kontrol dari penelitian ini, yaitu tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis tanpa diberi ekstrak etanol herba Centella asiatica, menunjukkan bahwa ekspresi protein Bcl-2 2,5 kali lebih tinggi bila

Disertasi



103 dibandingkan dengan kelompok yang memperoleh ekstrak. Hasil ekspresi bcl2 sel alveolar makrofag pada penelitian ini memang tidak dibandingkan dengan tikus normal. Pada penelitian ini menunjukkan adanya peningkatan ekspresi Bcl2 sel alveolar makrofag sebesar 65 % apabila dibandingkan antara rerata ekspresi Bcl2 sel alveolar makrofag pada infeksi tuberkulosis hari ke-28 dengan hari ke-42. Hasil ini sejalan dengan hasil penelitian yang dilakukan oleh Adolfo, 2006 tentang patogenesis infeksi tuberkulosis pada tikus, bahwa Mycobacterium tuberculosis mempunyai kemampuan untuk meningkatkan ekspresi protein Bcl2 pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus. Pada penelitian tersebut menunjukkan bahwa ekspresi protein Bcl2 pada sel alveolar makrofag meningkat dari 12,5% pada hari pertama setelah infeksi dengan H37Rv menjadi 32 % pada hari ke-28 setelah infeksi. Efek terapi dari suatu obat merupakan hasil interaksi antara obat tersebut dengan molekul di dalam tubuh. Sebagian besar obat akan bekerja melalui hubungan dengan makromolekul yang spesifik dan mempengaruhi aktivitas biokimia atau biofisik dari makromolekul tersebut. Makromolekul tersebut dikenal dengan istilah zat penerima atau reseptor. Definisi dari reseptor yaitu suatu komponen di dalam sel atau organisme yang berinteraksi dengan obat dan memulai reaksi biokimia yang berantai yang menghasilkan efek terapi (Bourne, 1998). Interaksi tersebut mengubah reseptor sehingga reseptor berfungsi untuk meneruskan sinyal ke dalam sel melalui perubahan permeabilitas membran, pembentukan second messenger atau mempengaruhi transkripsi gen (Ross et al., 1985). Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica ini kemungkinan disebabkan karena adanya interaksi antara bahan aktif yang ada di dalam ekstrak etanol

Disertasi



104 herba Centella asiatica dengan reseptornya tetapi hal ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut. Salah satu kandungan bahan aktif ekstrak etanol Centella asiatica adalah asiatic acid. Bahan tersebut diduga mempunyai peranan yang penting untuk menurunkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag di jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Pada penelitian yang telah dilakukan oleh Hsu et al., 2005, melaporkan bahwa asiatic acid yang diisolasi dari

Centella asiatica menurunkan ekspresi protein Bcl-2 yang

diidentifikasi dengan menggunakan Westren blotting pada apoptosis sel kanker. Pada penelitian ini menggunakan ekstrak etanol herba Centella asiatica yang didalamnya terdapat berbagai macam bahan aktif seperti asiaticoside, asiatic acid dan madecaside acid yang memungkinkan bahan aktif selain asiatic acid dapat menyebabkan penurunan ekspresi protein Bcl-2. Bcl-2 adalah sebuah onkogen anggota dari keluarga protein Bcl yang mempunyai fungsi untuk menghambat proses apoptosis dan peningkatan protein Bcl-2 mempunyai peranan yang sangat penting pada hambatan apoptosis sel makrofag oleh Mycobacterium tuberculosis (Mogga et al., 2002). Salah satu kemungkinan mekanisme Mycobacterium tuberculosis untuk meningkatkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag adalah melalui peningkatan sekresi sitokin interleukin-10 (Mustafa et al., 2000; Mogga et al., 2002). Pada infeksi Mycobacterium tuberculosis, bakteri tersebut mempunyai kemampuan untuk menghambat respons imun seluler dari makrofag dengan meningkatkan sekresi IL-10 yang dapat dihambat oleh sitokin IFN-γ (Kornfeld et al., 1999). Mustika dkk, 2009, melaporkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan sekresi sitokin IFN-γ pada sel kultur makrofag yang diinfeksi

Disertasi



105 dengan Mycobacterium tuberculosis. Hasil menunjukkan bahwa mekanisme kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica dalam menurunkan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag adalah dengan meningkatkan sekresi sitokin IFN-γ sehingga dapat menghambat sekresi IL-10. Protein Bcl-2 bekerja untuk menghambat proses apoptosis melalui hambatan kompetitif terhadap aktivasi protein Bax. Jumlah protein Bcl-2 yang berlebihan akan berikatan dengan protein dari keluarga Bcl yang hanya mempunyai domain BH3. Ikatan tersebut menyebabkan protein Bax tidak dapat berikatan dengan protein BH3, sehingga protein Bax tidak teraktivasi. Hal ini menyebabkan hambatan pada proses apoptosis sedangkan apabila jumlah protein Bcl-2 sedikit, maka protein pro apoptosis Bax mempunyai kesempatan lebih besar untuk berikatan dengan protein BH3 dan ikatan ini merupakan inisiasi awal dari proses apoptosis (Shore et al., 2008) Protein BH3-only adalah protein yang mempunyai fungsi untuk menerima rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat atau radiasi. Rangsangan tersebut menyebabkan protein BH3-only aktif dan bekerja secara langsung untuk membebaskan ikatan antara protein Bax dengan Bcl-2 dan menurunkan ekspresi Bcl-2 (Marzo et al., 2008). Kemampuan protein BH3-only ini mulai dimanfaatkan sebagai target kerja obat untuk meningkatkan apoptosis (Adams et al., 2007). Berdasarkan fakta tersebut, maka kemungkinan ekstrak etanol Centella asiatica mempunyai kemampuan untuk merangsang protein BH3-only sehingga menurunkan ekspresi protein Bcl-2.

Disertasi



106 6.4. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Ekspresi Protein Bax Sel Alveolar Makrofag

dari

Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi

dengan Mycobacterium tuberculosis. Efek ekstrak etanol

herba Centella asiatica pada penelitian ini

meningkatkan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis secara bermakna dibandingkan dengan kontrol. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb pada ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol, sedangkan dosis 750 mg/Kgbb ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag meningkat secara signifikan bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dari dosis 375 mg/KgBb ke 750 mg/KgBb menyebabkan peningkatan ekspresi protein Bax, tetapi pemberian ekstrak pada dosis 1500mg/KgBb menyebabkan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag menurun. Hal ini dapat dijelaskan bahwa pada pemberian ekstrak etanol

herba Centella asiatica dosis 375

mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapeutik yang dibutuhkan untuk meningkatkan ekspresi protein Bax sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan telah terjadi down regulation atau desensitisasi reseptor. Jadi dosis efektif ekstrak etanol

herba Centella asiatica untuk

meningkatkan ekspresi protein Bax adalah 750 mg/KgBb. Efek terapeutik suatu bahan obat selain ditentukan oleh afinitas, yaitu kemampuan obat untuk berikatan dengan reseptor juga ditentukan oleh efikasi, yaitu kemampuan obat yang terikat untuk mengubah konformasi reseptor sehingga reseptor menjadi aktif dan meneruskan sinyal transduksi ke dalam sel.

Disertasi



107 Pada dosis obat yang cukup tinggi, kemungkinan terjadi desensitisasi reseptor sehingga efikasi obat tersebut menurun (Ross et al., 1985). Sedangkan down regulation adalah suatu keadaan dimana jumlah total reseptor di permukaan sel menurun (Bourne, 1998). Salah satu kandungan ekstrak etanol herba Centella asiatica yaitu asiatic acid mempunyai peranan penting pada peningkatan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag. Hal ini berdasarkan pada penelitan tentang asiatic acid dapat

meningkatkan apoptosis sel kanker payudara melalui peningkatan

ekspresi protein Bax (Hsu et al., 2005). Demikian juga dengan penelitian yang dilakukan oleh Park et al., 2005, asiatic acid meningkatkan apoptosis sel melanoma melalui peningkatan ekspresi protein Bax. Hasil ini konsisten dengan efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada peningkatan ekspresi protein Bcl-2. Kedua protein tersebut adalah anggota dari keluarga protein Bcl yang mempunyai peranan penting pada proses apoptosis melalui jalur mitokondria. Hasil analisis jalur menunjukkan bahwa pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica mempunyai korelasi yang kuat dengan penurunan ekspresi protein Bcl-2 pada sel alveolar makrofag dan peningkatan ekspresi protein Bax pada sel alveolar makrofag. Analisis jalur pada Protein Bax dan Bcl-2 menunjukkan bahwa korelasi antara kedua protein tersebut dengan apoptosis lemah artinya kedua protein tersebut tidak secara langsung meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag tetapi melalui jalur yang lain yang tidak diteliti pada penelitian ini. Hasil ini dapat dijelaskan, bahwa interaksi yang terjadi diantara keluarga protein Bcl, yaitu antara protein proapoptotik (Bax) dan protein antiapoptotik (Bcl-2) memberikan kontribusi yang cukup besar pada induksi apoptosis, bukan sekedar jumlahnya yang meningkat atau menurun.

Disertasi



108 Hasil dari interaksi berbagai protein tersebut adalah untuk mengatur permeabilitas membran mitokondria yang hasil akhirnya adalah keputusan suatu sel untuk tetap hidup atau mengalami apoptosis (Yao et al., 2009). Pada keadaan normal, tanpa ada rangsangan, protein Bax berada di sitosol sel dalam keadaan inert. Stimulus yang sesuai menyebabkan perubahan struktur protein sehingga protein Bax tersebut melakukan insersi pada target membran, yaitu membran luar mitokondria dan retikulum endoplasmik. Pada membran mitokondria, protein Bax mengalami perubahan konformasi dan berinteraksi dengan protein proapoptosis lainnya yaitu protein tBid, Bim dan Puma. Interaksi antara protein Bax dengan salah satu dari protein tBid, Bim dan Puma terjadi pada domain BH3 dan memicu perubahan bertingkat dari protein Bax dan fase ini merupakan tahap awal dari proses apoptosis melalui jalur instrinsik (Shore et al., 2008; Marzo et al., 2008). Protein BH3-only adalah protein yang mempunyai fungsi untuk menerima rangsangan yang berasal dari luar sel seperti obat atau radiasi. Rangsangan tersebut menyebabkan protein BH3-only aktif dan bekerja secara langsung untuk membebaskan ikatan antara protein Bax dengan Bcl-2 dan menurunkan ekspresi Bcl-2 (Marzo et al., 2008). Stimulus dari luar yaitu bahan obat, iradiasi maupun stres mempunyai kemampuan untuk mempengaruhi interaksi antara protein proapoptosis dengan protein antiapoptosis (Geweis, 2003). Pada penelitian ini, peneliti memberikan stimulus dari luar, berupa ekstrak etanol herba Centella asiatica dan ekstrak tersebut mempunyai kemampuan untuk meningkatkan ekspresi protein Bax melalui aktivasi terhadap protein BH3 only.

Disertasi



109 6.5. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Ekspresi Protein Caspase-8 Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica secara bermakna meningkatkan ekspresi protein caspase-8 pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis.

Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dengan dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier meningkatkan ekspresi protein caspase 8 pada sel alveolar makrofag, karena hanya dosis 750 mg/KgBb yang dapat meningkatkan ekspresi caspase-8 secara bermakna. Hal ini dapat dijelaskan bahwa pada pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapi yang dibutuhkan untuk meningkatkan ekspresi protein caspase-8, sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan sudah terjadi down regulation atau desensitisasi reseptor (Ross et al., 1985: Bourne, 1998). Caspase-8 adalah enzim yang berada di dalam sel yang bentuknya tidak aktif yaitu procaspase-8. Aktivasi procaspase-8 menjadi caspase-8 terjadi melalui jalur ekstrinsik yang melibatkan sinyal transduksi death receptor. Death receptor tersebut akan berikatan dengan ligan yang sesuai untuk membentuk sebuah death domain, yang mempunyai peranan utama dalam meneruskan sinyal kematian dari permukaan sel ke intraseluler. Death domain yang berhasil diidentifikasi antara lain FasL/FasR, TNF-α/TNFR1, Apo3L/DR3, Apo2L/DR4 dan Apo2L/DR5 (Elmore, 2007; Karger, 2010). Aktivasi procaspase-8 menjadi caspase-8 pada penelitian ini, karena ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan interaksi antara ligan TNF-

Disertasi



110 α dengan reseptor transmembran TNFR1. Fakta ini juga didukung oleh sebuah penelitian tentang efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada kultur makrofag. Pada penelitian tersebut membuktikan bahwa pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan kadar TNF-α (Punturee et al., 2004; Mustika dkk, 2009). Peningkatan kadar TNF-α menyebabkan ikatan antara ligan TNF-α dengan reseptornya yaitu TNFR1 untuk membentuk death domain di dalam sitoplasma sel. Death domain bersama dengan death effector domains membentuk sebuah protein adaptor yaitu TNF receptor-associated death domain (TRADD). Bagian dari komplek tersebut, yaitu death effector domains akan berikatan dengan procaspase-8 membentuk suatu komplek yang disebut dengan death-inducing signaling complex (DISC). Komplek DISC menyebabkan aktivasi procaspase-8 secara autolitik menjadi caspase-8. Ketika caspase-8 diaktifkan, maka akan memicu terjadinya apoptosis sel alveolar makrofag (Geweis, 2003; Elmore, 2007). Mycobacterium

tuberculosis

mempunyai

kemampuan

untuk

meningkatkan sekresi protein TNFR2 yang dapat menyebabkan ikatan yang inaktif antara TNF-α dengan TNFR2, sehingga TNF-α tidak bisa berikatan dengan TNFR1 dan membentuk death domain (Balcewicz-Sablinka, 1998; Fratazzi et al., 1999; Fairbain, 2004). Peningkatan sekresi TNFR2 terjadi karena induksi dari sitokin IL-10, sehingga hambatan pada IL-10 akan menurunkan sekresi TNFR2 (Fratazzi et al., 1999; Mustafa et al., 2007). Centella asiatica meningkatkan sekresi sitokin IFN-γ pada sel kultur makrofag yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, yang menghambat sekresi IL-10 dan menurunkan sekresi TNFR2 sehingga meningkatkan aktivitas caspase

Disertasi



111 8 yang dapat menginduksi apoptosis melalui jalur ekstrinsik (Mustika dkk, 2009). Hasil analisis jalur menunjukkan bahwa mekanisme kerja caspase 8 selain meningkatkan apoptosis juga meningkatkan ekspresi protein Bax pada jalur instrinsik. Hal ini menunjukkan adanya komunikasi antara jalur ekstrinsik dan jalur instrinsik pada apoptosis.

6.6.

Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica

terhadap

Apoptosis sel

Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis secara bermakna bila dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan dosis ekstrak etanol


diberikan dengan dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier meningkatan apoptosis sel alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb memberikan peningkatan apoptosis yang tertinggi. Hal ini dapat dijelaskan bahwa pada pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapeutik yang dibutuhkan untuk meningkatkan

apoptosis sel alveolar makrofag

sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan sudah terjadi desensitisasi reseptor atau down regulation. Metode yang digunakan untuk pemeriksaan apoptosis makrofag pada penelitian ini adalah pengecatan imunohistokimia dengan menggunakan pewarnaan terminal dUTP nick end labeling (TUNEL) Assay. Metode ini dipilih karena mampu mendeteksi fragmentasi DNA sebagai

Disertasi



112 salah satu ciri apoptosis (Elmore, 2007). Prinsip kerja TUNEL assay adalah menyambung ujung 3-OH dari fragmen DNA dengan oligomer yang merupakan rangkaian nukleotida trifosfat yang diberi label secara acak dengan digoxigenin. Pemberian label secara acak tersebut bertujuan untuk memicu ikatan antara digoxygenin dan antidigoxygenin secara optimal. Reaksi ini memerlukan enzim katalisator yaitu

enzim terminal deoxynucleotidyl

transferase (TDT). Digoxygenin mengikat antidigoxygenin peroxydase conjugate yang mengikat diamino benzidine (DAB) substrat sehingga bewarna coklat. Metode ini menyebabkan sel yang mengalami apoptosis dapat ditemukan walau belum terjadi perubahan morfologis dan mudah dibedakan dengan sel yang tidak mengalami apoptosis (D’herde et al., 2003; Elmore, 2007). Setiap sel akan merespons semua stres atau stimulus yang diterimanya melalui berbagai macam cara baik melalui aktivasi sinyal kehidupan sampai inisiasi kematian sel. Tujuan dari proses tersebut adalah untuk menjaga homeostasis, sehingga sel yang tidak diperlukan akan dieliminasi. Mekanisme tersebut tergantung pada berbagai macam faktor eksogen dan kemampuan sel untuk mengatasi stres atau stimulus (Samali et al., 2010). Pada penelitian ini, stimulus yang diberikan berupa bahan alam yaitu ekstrak etanol herba Centella asiatica, bahan tersebut

menunjukkan peningkatan apoptosis sel alveolar

marofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis. Penelitian oleh Bunpo et al., 2004 dan Babbykutty, 2009 membuktikan bahwa ekstrak tumbuhan tersebut meningkatkan apoptosis sel kanker usus dan sel kanker payudara. Senyawa aktif dari ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diduga meningkatkan apoptosis adalah asiatic acid

Disertasi



113 karena asiatic acid yang diisolasi dari herba Centella asiatica juga terbukti meningkatkan apoptosis sel kanker payudara (Hsu et al, 2004). Hasil analisis menunjukkan bahwa terdapat korelasi yang kuat antara pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dengan peningkatan ekspresi protein caspase 8 dan terdapat korelasi yang kuat pula antara peningatan ekspresi caspase 8 dengan apoptosis sel alveolar makrofag. Hal ini membuktikan bahwa mekanisme peningkatan apoptosis oleh ekstrak etanol herba Centella asiatica melalui jalur ekstrinsik.

6.7. Efek Ekstrak Etanol Herba Centella asiatica terhadap Ekspresi Antigen Mycobacterium tuberculosis Sel Alveolar Makrofag dari Jaringan Paru Tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Hasil

dari penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol herba

Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis. Peningkatan dosis ekstrak etanol


diberikan dengan dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag, tetapi dosis 750 mg/KgBb menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis yang paling rendah. Hal ini dapat dijelaskan bahwa pada pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica dosis 375 mg/KgBB, efek yang ditimbulkannya belum mencapai dosis terapeutik yang dibutuhkan untuk menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag sedangkan pada dosis 1500mg/KgBB kemungkinan sudah terjadi down regulation.

Disertasi



114 Antibodi primer yang digunakan pada penelitian ini adalah antibodi terhadap antigen spesifik Mycobacterium tuberculosis, sehingga yang terdeteksi pada pengecatan imunohistokimia ini adalah antigen dari bakteri tersebut, baik bakteri tersebut hidup ataupun sudah mati. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi oleh

Mycobacterium tuberculosis, diduga melalui proses apoptosis

makrofag dan efek antibakteri terhadap Mycobacterium tuberculosis. Kedua mekanisme tersebut menyebabkan jumlah Mycobacterium tuberculosis di dalam jaringan paru menurun sehingga antigen yang dapat dideteksi juga menurun.

6.8. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan

jumlah

Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Penelitian

ini

menunjukkan

penurunan

jumlah

Mycobacterium

tuberculosis yang signifikan akibat pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica terutama pada dosis 750 mg/kgBB dan 1500mg/KgBB. Mekanisme ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap penurunan jumlah Mycobacterium tuberculosis yang hidup di jaringan paru tikus, kemungkinan disebabkan karena proses apoptosis makrofag dan efek antibakteri terhadap Mycobacterium tuberculosis. Pada proses apoptosis Mycobacterium tuberculosis yang mati akan didegradasi menjadi beberapa fragmen di dalam abadan apoptotik, selanjutnya akan melalui proses eferositosis. Eferositosis adalah suatu mekanisme dimana badan apoptotik akan difagositosis oleh sel fagosit terdekat (Behar et al, 2010). Proses eferositosis merupakan proses yang

Disertasi



115 melibatkan berbagai sinyal transduksi yang dikenal dengan eat me atau find me (Lee et al., 2009; Rudel et al., 2010). Mekanisme kematian Mycobacterium tuberculosis pada proses apoptosis dapat disebabkan karena dua proses yaitu: melalui peningkatan Nitrik Oksida atau melalui proses fusi fagosom menjadi fagolisosom (Molloy et al., 1994; Herbs et al., 2011). NO dapat membunuh Mycobacterium tuberculosis intrasel melalui berbagai mekanisme yaitu: secara langsung pada DNA bakteri, mempengaruhi metabolisme tembaga, target virulensi dari mikobakterial atau berfungsi sebagai pembawa pesan kedua (Shiloh et al., 2000; Nathan, 2003; Axelrod et al., 2008; Yang et al., 2009). Selain itu, Nitrik oksida (NO) diketahui mempunyai kemampuan untuk menginduksi apoptosis pada makrofag dan produksi NO diinduksi oleh IFN-γ melalui peningkatan ekspresi Nitric oxide synthetase 2 (NOS2) (Brune et al., 1997). Pada penelitian yang dilakukan oleh Herbs, 2011, menunjukkan bahwa NO yang diinduksi oleh IFN-γ meningkatkan apoptosis makrofag yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis dan membunuh bakteri tersebut. Pada penelitian terdahulu ditunjukkan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica meningkatkan produksi IFN-γ sehingga diduga mekanisme kematian Mycobacterium tuberculosis intrasel disebabkan ekstrak etanol herba Centella asiatica yang juga meningkatkan produksi NO (Mustika et al., 2009; Punturee et al., 2004). Pada proses apoptosis diduga mempunyai hubungan dengan perubahan aristektur dari sistem vesikular inang sehingga menyebabkan fusi antara fagosom dan lisosom yang sebelumnya dihambat oleh Mycobacterium tuberculosis (Molloy et al., 1994; Grassme et al., 2001; Labbe et al., 2008).

Disertasi



116 Ekstrak etanol herba Centella asiatica mempunyai efek antibakteri menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis H37Rv secara in vitro (Mustika, 2009). Penelitian oleh Gitawati dkk, juga membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menghambat pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis H 37 Rv multiresisten. Beberapa studi mengungkapkan, aktivitas antibakteri dari tanaman tersebut terutama disebabkan oleh kandungan glikosida triterpenoid yaitu asiaticoside (Dutta et al., 1967; Ramaswamy et al., 1970; Bisignano et al., 1999). Hal ini disebabkan karena senyawa tersebut berpengaruh pada permeabilitas membran sel. Peningkatan permeabilitas membran sel menyebabkan cairan elektrolit dari ekstraseluler masuk ke intraseluler, akibatnya sel akan terdegradasi menjadi beberapa fragmen (Zhang et al., 2005). Berdasarkan analisis jalur, terdapat korelasi yang kuat antara pemberian ekstrak herba Centella asiatica dengan apoptosis sel alveolar makrofag dan jumlah Mycobacterium tuberculosis di dalam jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak herba Centella asiatica menurunkan jumlah bakteri di dalam jaringan paru melalui mekanisme apoptosis sel alveolar makrofag. Jadi mekanisme kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica dalam menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis di jaringan paru tikus melalui peningkatan apoptosis sel alveolar makrofag dan anti bakteri.

Disertasi



117 6.9. Efek ekstrak etanol herba Centella asiatica terhadap kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis. Pemberian ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan paru tikus secara signifikan terutama pada perivaskulitis, alveolitis dan pembentukan granuloma. Pada kelompok kontrol dimana tikus tidak mendapat ekstrak, kerusakan jaringan berdasarkan skor dormans yaitu peribronkiolitis, perivaskulitis, alveolitis dan granuloma adalah sedang sampai berat.Parameter peribronkiolitis tidak menunjukkan perbedaan yang bermakna antara kelompok yang memperoleh ekstrak etanol herba Centella asiatica dengan kelompok yang tidak memperoleh ekstrak. Hal ini disebabkan karena cara infeksi tikus oleh Mycobacterium tuberculosis adalah melalui intratrakea. Hal ini berarti bakteri akan melalui bronkus terlebih dahulu sebelum melakukan invasi ke jaringan paru. Keberadaan Mycobacterium tuberculosis pada bronkus menyebabkan respons imun tubuh melakukan perlawanan dengan memobilisasi sel radang (reaksi inflamasi). Mobilisasi sel radang tersebut bertujuan untuk mencegah Mycobacterium tuberculosis invasi ke dalam jaringan paru. Proses inflamasi ini menyebabkan kerusakan pada bronkioli. Granuloma merupakan respons utama dari stadium kronik infeksi Mycobacterium tuberculosis yang memperlihatkan respons dari sistem imun untuk melokalisir multiplikasi dan penyebaran lanjut dari bakteri tersebut ke sel dan organ lain (Ordway et al., 2005). Pada kelompok yang tidak mendapat ekstrak, infiltrasi sel radang sudah didominasi oleh sel alveolar makrofag dan mulai merusak jaringan parenkim paru. Pada kelompok ini semua hewan coba menunjukkan bentukan granuloma dengan gambaran khas sel datia Laghans.

Disertasi



118 Gambaran ini menunjukkan adanya

infeksi kronis tuberkulosis pada tikus

(Pando et al., 1998). Gambaran histopatologis jaringan paru ini berbeda dengan kelompok praperlakuan, menujukkan lesi yang memiliki karakteristik infiltrasi sel radang mononuklear yang didominasi makrofag. Infiltrasi ini mulai dari daerah peribronkial, perivaskular, daerah interstitial alveoli. Pada kelompok ini sudah mulai ada gambaran sel alveolar makrofag yang berkelompok dan

hal ini

merupakan fase awal terbentuknya granuloma. Pada fase ini nampak banyak sel polimorfonuklear pada infiltrasi sel radang. Hal ini menunjukkan bahwa pada fase awal sel polimorfonuklear mempunyai peranan penting dalam mencegah perkembangan tuberkulosis (Sugawara et al., 2004). Penilaian hasil infeksi Mycobacterium tuberculosis pada tikus setelah 4 minggu, berdasarkan skor Dormans adalah kerusakan jaringan paru pada tikus termasuk sedang, dimana infiltrasi sel radang belum sepenuhnya didominasi oleh sel mononuklear dan belum ditemukan kerusakan pada epitel bronkus maupun endotel pembuluh darah. Struktur alveoli juga masih bagus, tidak ditemukan kerusakan pada septum alveoli. Perbedaan kerusakan jaringan paru tikus pada kelompok infeksi Mycobacterium tuberculosis setelah minggu ke-4 dan minggu ke-6 menunjukkan adanya progresifitas perjalanan penyakit tuberkulosis pada tikus yang tidak diberi terapi ekstrak etanol herba Centella asiatica. Mekanisme kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan kerusakan jaringan disebabkan karena ekstrak tersebut meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag dan mencegah terjadinya nekrosis. Proses apoptosis menyebabkan bahan intraseluler tidak keluar ke jaringan ekstraseluler sehingga enzim yang bersifat litik tidak dapat merusak jaringan sekitarnya. Disamping itu

Disertasi



119 apoptosis adalah suatu proses untuk melakukan eliminasi Mycobacterium tuberculosis dengan reaksi inflamasi yang minimal (Rudel et al., 2010). Kerusakan jaringan paru pada infeksi tuberkulosis juga disebabkan karena Mycobacterium

tuberculosis

menginduksi

ekspresi

enzim

matrix

metalloproteinase-1 (MMP-1) (Salgame, 2011). MMP-1 secara spesifik telah ditunjukkan mempunyai kemampuan melakukan degradasi terhadap kolagen tipe I yang menyebabkan kerusakan jaringan paru. Penelitian yang dilakukan pada pasien tuberkulosis menunjukkan adanya peningkatan enzim MMP-1 dan penurunan enzim tissue inhibitor of metalloproteinase (TIMPs). Penelitian ini juga diperkuat pada penelitian mencit yang diinfeksi oleh Mycobacterium tuberculosis, menunjukkan adanya peningkatan enzin MMP-1 yang mempunyai korelasi yang kuat dengan peningkatan kerusakan jaringan alveoli dan secara signifikan terjadi peningkatan pemecahan kolagen (Elkington et al., 2011). Berdasarkan hasil penelitian ini bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica menurunkan jumlah Mycobacterium tuberculosis di jaringan paru, maka kemungkinan mekanisme penurunan kerusakan jaringan paru disebabkan karena menurunnya sekresi MMP-1 sehingga tidak terjadi pemecahan kolagen. Resolusi jaringan paru bisa disebabkan karena ekstrak etanol herba Centella asiatica yang mengandung bahan aktif asiaticoside diduga mempunyai kemampuan untuk meningkatkan sintesis kolagen (Maquart et al., 1999; Coldren et al., 2003;Lee et al., 2006;Dyatmiko dkk, 2009; Hashim et al., 2011). Peningkatan dosis ekstrak etanol herba Centella asiatica yang diberikan dari dosis terkecil 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb dan 1500mg/KgBb tidak secara linier menurunkan kerusakan jaringan paru.

Disertasi



120 Berdasarkan hasil penelitian ini, dapat diperkirakan bahwa dosis optimum efek ekstrak etanol herba Centella asiatica pada mekanisme apoptosis sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis adalah dosis 750 mg/KgBB. Efek terapeutik suatu obat tergantung pada interaksi antara bahan aktif suatu obat dengan reseptor yang spesifik. Ikatan tersebut menyebabkan perubahan konformasi reseptor sehingga memicu respons sel. Respons sel ditentukan oleh afinitas dan efikasi antara bahan aktif dengan reseptornya. Afinitas adalah ukuran kemampuan obat untuk berikatan dengan reseptor, sedangkan afinitas adalah kemampuan obat terikat untuk mengubah reseptor sehingga memberikan efek. Suatu bahan aktif bisa mempunyai afinitas tetapi tidak menunjukkan efikasi. Bahan aktif yang dimiliki oleh ekstrak etanol herba Centella asiatica pada dosis 375 mg/kgBB kemungkinan mempunyai afinitas yang rendah sehingga belum bisa memberikan efek farmakologis yang maksimum. Pada dosis 1500 mg/Kg, bahan aktif dari ekstrak etanol herba Centella asiatica mengalami desensitisasi reseptor, yaitu mempunyai efikasi yang rendah sehingga efek terapeutik yang diberikannya juga belum optimum. Kemungkinan lain adalah terjadi down regulation yaitu jumlah reseptor pada permukaan sel menurun.

6.10. Temuan baru Pada penelitian ini membuktikan bahwa ekstrak etanol herba Centella asiatica memiliki bahan aktif yang meningkatkan kemampuan sel makrofag sebagai bagian dari sistem imunitas, melalui peningkatan apoptosis sel alveolar makrofag pada tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis.

Disertasi



121 Mekanisme kerja ekstrak etanol herba Centella asiatica dalam meningkatkan apoptosis adalah melalui jalur ekstrinsik dan instrinsik, dimana kedua jalur tersebut saling berkomunikasi melalui protein caspase 8 dengan protein Bax. Fungsi imunostimulan dari ekstrak etanol herba Centella asiatica merupakan reaksi berantai dalam berbagai tahap sampai terjadi kematian dari Mycobacterium tuberculosis dan perbaikan jaringan paru. Hasil penelitian ini juga membuktikan bahwa induksi pada mekanisme apoptosis merupakan faktor esensial untuk mengatasi masalah penyakit infeksi terutama infeksi oleh bakteri intraseluler.

Disertasi



122 BAB 7 PENUTUP

7.1. Kesimpulan Berdasarkan hasil penelitian, maka dapat disimpulkan sebagai berikut bahwa Ekstrak etanol Centella asiatica : 1. Menurunkan ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah 750 mg/KgBb. 2. Meningkatkan ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium

tuberculosis, dosis optimum

adalah 750 mg/KgBb. 3. Meningkatkan ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi dengan Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah 750 mg/KgBb. 4. Meningkatkan apoptosis sel alveolar makrofag pada jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah 750 mg/KgBb. 5.

Menurunkan ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis pada sel alveolar makrofag dari jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah 750 mg/KgBb.

6. Menurunkan

jumlah Mycobacterium tuberculosis(CFU/ml) pada jaringan

paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, dosis optimum adalah 750 mg/KgBb dan 1500 mg/KgBb. 7. Menurunkan kerusakan jaringan paru tikus yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis, pada dosis 375 mg/KgBb, 750 mg/KgBb, dan 1500 mg/KgBb.

Disertasi



123

7.2. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk 1. Uji ekstrak etanol herba Centella asiatica pada Mycobacterium tuberculosis yang resisten, wild type atau isolat klinik. 2. Uji klinik ekstrak etanol herba Centella asiatica sebagai terapi pendamping pada penderita infeksi tuberculosis. 3. Pengaruh ekstrak etanol herba Centella asiatica pada enzim matrix metalloproteinase-1, tissue inhibitor of metalloproteinase dan kolagen. 4. Senyawa aktif dalam Centella asiatica yang dapat digunakan sebagai senyawa marker antituberkulosis untuk menyaring bahan alam lain yang memiliki peluang sebagai anti tuberkulosis. 5. Pengaruh ekstrak etanol herba Centella asiatica pada apoptosis sel neutrofil, sel stroma dan limfosit.

Disertasi



124 DAFTAR PUSTAKA

Abebe M, Kim L, Rook G, Aseffa A, Wassie L, Zewdie M, Zumla A, Engers H, Andersen P, Doherty T M, 2011. Modulation of cell death by M. tuberculosis as a strategy for pathogen survival. Clin Develop Immunol: 1-11. Adams JM, Cory S, 2007. A Bcl-2 regulated apoptosis: mechanism and therapeutic potential. Curr Opin Immunol 19: 488-496. Adolfo Ro-BVc, Victoria C-Pa, Diana A-Ln, Ricardo LL, Antonio M-RoM, Jos M, Victor F-G, Rogelio Hn-P, 2006. Macrophage and T lymphocyte apoptosis during experimental pulmonary tuberculosis: their relationship to mycobacterial virulence. Eur J Immunol 36: 345-353. Aditama TY, 2006. Extreme drug resistane tuberuculosis (XDR-TB). J Tuberkulosis Indonesia 3 (2): 20-23. Anthony A, Santhakumari G, Merina B, Sheeba V, Mukkadan J, 2006. Hepatoprotektif effect of Centella asiatica (L) in carbon tetrahchlorideinduced liver injury in rats. Ind J Pharm Sci 68 (6): 772-776. Axelrod S, Oschkinat H, Enders J, Schlegel B, Brinkmann V, 2008. Delay of phagosome maturation by a mycobacterial lipid is reversed by nitric oxide. Cell Microbiol 10: 1530–1545. Babykutty S, Padikkala J, Sathiadevan PP, Vijayakurup V, Thasni Azis, KA Srinivas, P, Gopala S, 2009. Apoptosis induction of Centella asiatica on human breast. Afr J TCAM 6 (1): 9-16. Bailey LH, 1953. The standard cyclopedia of horticultura. Jilid 1.3. Balcewicz-Sablinska MK, Keane J, Kornfeld H, Remold HG, 1998. Phatogenic Mycobacterium tuberculosis evades apoptosis of host macrophages by release of TNF-R2, resulting in inactivation of TNF-α. J Immunol 161: 2636-2641. Barera L, 2007. The basics of clinical bacteriology. In Tuberculosis 2007. Editor Palomino. ebook. Barnes PF, 2003. Immunotherapy for tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med 168:142-143. Basaraba R J, 2008. Experimental tuberculosis: the role of comparative pathology in the discovery of improvement tuberculosis treatment strategies. Tuberculosis 88 (1): S35-47. Behar SM, Divangahi M, Remold HG, 2010. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy?. Nature 8: 668-74.

Disertasi



125 Bhatt K, Salgane P, 2007. Host innate immune response to Mycobacterium tuberculosis. J Clin Immunol 27 (4): 347-362. Bordbar A, Lewis N E, Schellenberger J, Ø Palsson B, Jamshidi N, 2011. Insight into human alveolar macrophage and M. tuberculosis interactions via metabolic reconstructions. Mol Sys Biol 6: 422. Bourne HR, 1998. Drug receptor and pharmacodynamics. In Basic and clinical pharmacology. Edisi 7th . editor Betram G Katzung. A Simon & Schuster company. 9-34. Brenner D, Mak TW, 2009. Mitochondrial cell death effectors. Curr Opin Cell Biol 21: 871-877. Brune B, Gotz C, Messmer UK, Sandau K, Hirvonen MR, 1997. Superoxide formation and macrophage resistance to nitric oxide-mediated apoptosis. J Biol Chem 272: 7253–7258. Bunpo K, Kataoka K, Arimochi H, Nakayama H, Uwahara T, Bando T, Vinetetkumnuen U, Ohnishi Y, 2004. Inhibitory effects of Centella asiatica on azoxymethane-induced aberrant crypt focus formation and carcinogenesis in the intestines of F344 rats. Food Chem Toxicol 42: 1987-97. Bunpo K, Kataoka K, Arimochi H, Nakayama H, Uwahara T, Bando T, Vinetetkumnuen U, Ohnishi Y, 2005. Inhibitory effects of Asiatic acid on CPT-cells on growth cells HT-29. J Med Invest 52: 65-73. Bunyaphrapatsara N, Padua LS, Lemmens RHMJ, 1999. Plant resources of south-east asia no 12(1). Bogor Indonesia: 190-194. Cardona PJ, Llatjós R, Gordillo S, Díaz J, Ojanguren I, Ariza A, 2000. Evolution of granulomas in lungs of mice infected aerogenically with Mycobacterium tuberculosis. Scand J Immunol 52: 156-163. Chan X, Xing Y, Magliozzo RS, Bloom BR, 1992. Killing of virulent Mycobacterium tuberculosis by reactive nitrogen intermediates produced by activated macrophages. J Exp Med 175: 1111-12. Chen Li, Shi W, Li H, Sun X, Fan X, LeSage G, Li H, Li Y, Zhang Y, Zhang X, Zhang Y, Yin D, 2010. Critical role of Toll-Like Receptor 9 in Morphine and Mycobacterium tuberculosis-Induced Apoptosis in Mice. Plos One 5(2): e9205. Chen M, Gan H, Remold H G, 2006. A mechanism of virulence: virulent Mycobacterium tuberculosis Strain H37Rv, but not attenuated H37Ra, causes mitochondrial Inner membrane disruption in macrophages leading to necrosis. J Immunol 176:3707-3716. Cho MK, Sung MA, Kim SD, Park HG, Jew SS, Kim SG, 2003. 2-Oxo-3,23isopropylidene-asiatate (AS2006A), a wound-healing asiatic derivative, exerts

Disertasi



126 anti-inflammatory effect by apoptosis of macrophages. Int Immunopharmacol 3(11):1429-1437. Coldren CD, Hashim P, Ali JM, Oh S, Sinskey AJ, Rha C, 2003. Gene expression Changes in the Human Fibroblast Induced by Centella asiatica Triterpenoids. Planta Med 69: 725-732. Cullen S, Martin SJ, 2009. Caspase activation pathways: some recent progress. Cell Death Differ 16: 935-38. Danelishvili L, Yamazaki Y, Selker J, Bermudez LE, 2010. Secreted Mycobacterium tuberculosis Rv3654c and Rv3655c Proteins Participate in the Suppression of Macrophage Apoptosis. PLoS ONE 5(5): e10474. Daniel TM, 2004. The history of tuberculosis. Respir Med 100: 1862-70. Dash P, 2009. Apoptosis. Basic Medical sciences, St.george’s, University of London. D’Herde K, Mussche S, Roberg K, 2003. Morphological changes in dying cell in cell proliferation & apoptosis. Hughes D and Mehmet H (Eds). Ed 1st.Trowbridge.The Cromwell pres.p: 202-231. Djatmiko W, 2009. Pengembangan dan Pemanfaatan tanaman Obat Indonesia menjadi produk fitofarmaka dengan tekhnologi fitosom untuk Terapi Tuberkulosis. Laporan akhir Program Hibah Kompetitif Penelitian Unggulan Strategis Nasional tahun anggran 2009. Dormans J, Burger M, Aguilar D, Hernandez-Pando R, Kremer K, Roholl P, S. M. Arend S M, Van Soolingen D, 2004. Correlation of virulence, lung pathology, bacterial load and delayed type hypersensitivity responses after infection with different Mycobacterium tuberculosis genotypes in a BALB/c mouse model. Clin Exp Immunol 137: 460–468. Edward, 2010. IL-32 Is a host protective cytokine against Mycobacterium tuberculosis in differentiated THP-1 human macrophages. J Immunol 184: 3810-40. Elkington P, Shiomi T, Breen R, Nuttal RK, Upgarte-Gill CA, Walke NF, Saraiva L, Pederson B, Mauri F, Lipman M, Edwards DR, Robertson BD, D”Armiento J, Friedland JS, 2011. MMP-1 drives immunopathology in human tuberculosis and transgenic mice. J Clin Immunol 121 (5): 1827-1833. Elmore S, 2007. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol Pathol 35: 495-516. Faherty CS, Maurelli AT, 2008. Staying alive: bacterial inhibition of apoptosis during infection. Trend in Microbiol 16(4): 173-179. Fairbain IP, 2004. Macrophage apoptosis in host immunity to mycobacterial infections. Biochem societ trans 32(4): 496-498.

Disertasi



127

Fatmasari AR, Immaculata I, 2007. Efek Imunostimulasi Ekstrak Air Herba Pegagan (Centella asiatica Urb) dan Daun Beluntas (Pluchea indica Less.) pada Mencit Swiss Webster Betina. Skripsi Sekolah farmasi ITB. http://bahanalam.fa.itb.ac.id. Diunduh pada tanggal 17 April 2008. Fels AO, Cohn ZA, 1986. The Alveolar macrophages. J App Phys 60(2). 353-369. Forbes B, Sahn D, Weissfield AS, 2007. Diagnostic Microbiology. St Louis, Missouri. Mosby Elsevier: 843-859. Fratazzi C, Arbeit R D, Carini C, Balcewicz-Sablinska M K, Keane J, Kornfeld H, Remold H G, 1999. Macrophage apoptosis in mycobacterial infection. J Leu Biol 66: 763-64. Fulton SA, Cross JV, Toossi ZT, Boom VH, 1998. Regulation of IL-12 by IL-10, TGF-β, TNF-α, and INF-γ in human monocytes infected with Mycobacterium tuberculosis H37Ra. J Infect Dis 178(4):1105-14. Ganthina, Elin Y, Tintin G, 2004. Uji Aktivitas Ekstrak Beberapa Tumbuhan terhadap Mycobacterium tuberculosis yang Sensitif dan Resisten terhadap Obat Antituberkulosis. Thesis Sekolah farmasi ITB. http://bahanalam.fa.itb.ac.id. Diunduh tanggal 17 April 2008. Gan H, Lee J, Ren F, Chen, Kornfeld H, Remold H, 2008. Mycobacterioum tuberculosis blocks crosslinking of annexin-1 and apoptotic envelope f ormation on infected macrohages to maintain virulence. Nat Immunol 9(10): 1189-1197. Gaonkar S, Balasubramanian V, Sowmya B, Radha KS, Naveen K 2010. Aerosol infection model of tuberculosis in Wistar Rats. Int J Microbiol: 1-6. Geijtenbeek TB, Van VSJ, Koppel EA, 2003. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendrintic cell function. J Exp Med 197: 7-17. Geweis Andreas, 2003. Introduction to apoptosis. Aporeview: 1-26. Gil O, Diaz I, Vilaplana C, Tapia G, Diaz J, Fort M, Caceres N, Pinto S, Cayla J, Corner L, Domingo M, Cardona P, 2010. Granuloma encapsulation is a key factor containing tuberculosis infection in minipigs. Plos one 5(4): e10030. Gitawati R, Astuti Y, Winarno W, 2005. Herba pegagan (Centella asiatica L): Studi pendahuluan efek anti mikobakterium secara invitro. Jurnal bahan Alam Indonesia 4(2): 286-291. Grassme H, jendrossek V, Gulbins E, 2001. Molecular mechanism of bacteriainduced apoptosis. Apoptosis 6: 441-445. Grimaldi R, De Ponti F, D’angelo L, Caravaggi M, Guidi G, Lechhini S, Frigo GM, Crema A, 1990. Pharmacokinetics of the total triterpenic fraction of Centella

Disertasi



128 asiatica after single and multiple administration to healthy volunteers. A New Assay for Asiatic acid. J Ethnopharmacol 28: 235-41. Gupta UD, Katoch VM, 2005. Animal models of tuberculosis. Tuberculosis 85: 27793. Hashim P, Sidek H, Helan MHM, Sabery A, Palanisamy UD, Ilham M, 2011. Triterpene composition and bioactivities of Centella asiatica. Mol 16: 13101322. Herbst S, Schaible UE, Schneider BE, 2011. Interferon Gamma activated macrophages kill mycobacterium by Nitric Oxide induced apoptosis. Plos One 6(5): e19105. Hirsch CS, Johnson JL, Okwera A, Kanost RA, Mianda WU, Peters P, Muhumuza , Kizza HM, Mugerwa RD, Mugyenyi P, Ellner J,Tossi Z, 2005. Mechanisms of apoptosis of Tcells in human tuberculosis. J Clin Immunol 25(4): 353-364. Hsu Ya-Ling,Kuo PL, Lin LT, Lin CC, 2005. Asiatic acid a triterpene induces apoptosis and cell cycle arrest through activation of extracellular signalregulated kinase and p38 mitogen-activated protein kinase pathways in human breast cancer cells. J Pharmacol Exp Ther 313 (1): 333-344. James J, Ian D, 2011. Identification and qualification of triterpenoid centelloids in Centella asiatica (L.) urban by densitometric TLC. J Planar Chrom 24 (1): 82-7. Junqueira-Kipnis AP, Kipnis A, Jamison A, 2003. NK cells respond to pulmonary infection with Mycobacterium tuberculosis, but play a minimal role in protection. J Immunol 171: 6039-45. Kadowaki N, Ho S, Antonenko S, 2001. Subsets of human dendritic cell precursor express different toll-like receptors and respond to different microbial antigens. J Exp Med 194; 863-9. Kaufmann SHE, 2001. How can immunology contribute to the control of tuberculosis? Nat Rev Immunol 1: 20-30. Kaufmann SHE, 2003. Immune response to tuberculosis: experimental animal models. Tuberculosis 83: 107-11. Karger AG, B. 2010. Apoptosis, cell death and inflammation. J Innate Immun 2: 201203. Keane J, Sablinska MK, Remold HG, Chupp GL, Meek BB, Fenton MJ, Kornfeld H, 1997. Infection by Mycobacterium tuberculosis promotes human alveolar macrophage apoptosis. Infect Immun 65(1): 298-304. Kornfeld H, Mancino G, Colizzi V, 1999. The role of macrophage cell death in tuberculosis. Cell Death Diff 6: 71-78.

Disertasi



129

Kritszki A, 2007. Tuberculosis in adult. In Tuberculosis 2007. e-book: 487-500. Kumawat K, Pathak SK, Spetz A-L, Kundu M, Basu J, 2010. Exogenous Nef Is an Inhibitor of Mycobacterium tuberculosis-induced Tumor Necrosis FactorProduction and Macrophage Apoptosis. J Biol Chem 285 (17): 12629–37. Kusumawati D, 2004. Tehnik eksperimentasi. In Bersahabat dengan hewan coba. Ed 1.Yogyakarta. Gadjah Mada University Press: 102-110. Labbe K, Saleh M, 2008. Cell death in the host response to infection. Cell Death Differ 15: 1339-1349. Lee YS, Jin D-Q, Kwon EJ, Park SH, Lee E-S, Jeong TC, Doo Hyun Nam, Huh K, Kim J-A, 2002. Asiatic acid, a triterpene, induces apoptosis through intracellular Ca21 release and enhanced expression of p53 in HepG2 human hepatoma cells. Canc Lett 186: 83–91. Lee J, Hartman M, Kornfeld H, 2009. Macrophage apoptosis in tuberculosis. Yonsei Med J 50(1):1-11. Lohmann-Matthes ML, Steinmuller G, Franke-Ullmann, Macrophages. Eur Respir J 7. 1678-1689.

1994.

Pulmonary

Lyu Su-Yun, Park WB, 2005. Production of cytokine and NO by Raw 264,7 macrophages and PBMC in vitro incubation with flavonoids. Arch Pharm Res 28 (5): 573-581. Mamtha B, Kavitha K, Srinivasan K K, Shivananda PG, 2004. An in vitro study of the effect of Centella asiatica on enteric phatogen. Ind J Pharmacol 36: 41-44. Maquart FX, Chastang F, Simeon A, Birembaut P, Gillery P, Wegrowski Y, 1999. Triterpenes from Centella asiatica stimulate extracellular matrix accumulation in rat experimental wounds. Eur J Dermatol 9 (4): 289- 96 Marriot HM, Bingle CD, Read RC, Braley KE, Kroemer G, Hellewell PG, Craig RW, Whyte MKB, Dockrell DH, 2005. Dynamic changes in Mcl-1 expression regulate macrophage viability or commitment to apoptosis during bacterial clearance. J Clin Invest 115(2): 359-368. Marzo I , Naval J, 2008. Bcl-2 family members as molecular targets in cancer therapy. Biochem pharm 76: 939-4 6. Maziar Divangahi, Danielle Desjardins, Cláudio Nunes-Alves HGR, Behar SM, 2010. Eicosanoid pathways regulate adaptive immunity to Mycobacterium tuberculosis. Nat Immunol 11(8): 751-760. Miller JL, Velmurugan K, Cowan MJ, Briken V, 2010. The Type I NADH dehydrogenase of Mycobacterium tuberculosis counters phagosomal NOX2

Disertasi



130 activity to inhibit TNF-α mediated host cell apoptosis. PLoS Pathog 6 (4): e100864. Ming LJ , Yin ZD, 2006. Therapeutic DNA vaccines against tuberculosis: a promising but arduous task. Chin Med J 119 (13): 1103-1107. Mustafa T, Phyu S, Bjune G, Jonsson R, Nilsen R, 2000. In situ expression of cytokines and cellular phenotypes in the lungs of mice slowly progressive primary murine Mycobacterium tuberculosis infection. Scand J Immunol 51: 548-56. Mustafa T, Bjune G, Jonsson R, Pando HR, Nilsen R, 2001. Increased expression of fas ligand in human tuberculosis and leprosy lesions: A potential novel mechanism of immune evasion in Mycobacterial infection. Scand J Immunol 54,630-639. Mustafa T, Wiker H G, Morkve O, Sviland L, 2007. Reduced apoptosis and increased inflammatory cytokines in granulomas caused by tuberculosis compared to non-tuberculous mycobacteria: Role of MPT64 antigen in apoptosis and immune response. Clin Exp Immunol 150: 105-113. Mustika A, Roostantia I, 2009. Efek ekstrak ethanol Centella asiatica L pada produksi Interferon γ, tumor necrosis factor α, transforming growth factor β dan macrophages intracelluler killing Mycobacterium tuberculosis. Laporan Penelitian RisbinIptekdok. Mogga SJ, Mustafa T, Sviland L, Nilsen R, 2002. Increased Bcl-2 and reduced Bax expression in infected macrophages in slowly progressive primary murine Mycobacterium tuberculosis infection. Scand J Immunol 54: 383-391. Molloy A, Laochumroonvorapong P, Kaplan G (1994). Apoptosis, but not necrosis, of infected monocytes is coupled with killing of intracellular bacillus CalmetteGuerin. J Exp Med 180: 1499–1509. Nathan C, 2003. Specificity of a third kind: reactive oxygen and nitrogen intermediates in cell signaling. J Clin Invest 111: 769–778. Ordway D, Henao-Tamayo M, Orme IM, Gonzalez-Juarrero M, 2005. Foamy macrophages within lung granulomas of mice infected with Mycobacterium tuberculosis express molecules characteristic of dendritic cells and antiapoptotic markers of the TNF Receptor-Associated Factor Family. J Immunol 175: 3873-81. Orme IM, 2003. The mouse as a useful model of tuberculosis. Tuberculosis 83: 112115. O’Sullivan MP, O’Leary S, Kelly DM, Keane J, 2007. A caspase-independent pathway mediates macrophage cell death in response to Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun 75(4):1984-1993.

Disertasi



131 Othieno C, Hirsch CS, Hamilton BD, Wilkinson K, Ellner JJ, Toossi ZT, 1999. Interaction of Mycobacterium tuberculosis-induced TGF-beta 1 and IL-10. Infect Immun 67(11): 5730-5. Pando Rogelio H,Salinos RC, Lopez JS, Estrada E, 2007. Immunology, phatogenesis, virulence. In Tuberculosis 2007. Editors Juan Palomo:157-193. Pando RH, Panduro CA, Madrid-Marina V, Larriva-Sahd J, Orozco EH, Arriaga AK 1998. The response of hepatic acute phase proteins during experimental pulmonary tuberculosis. Exp Mol Pathol 65 (1): 25-36. Park BC, Bosire K O, Lee E, Lee Y S, Kim J, 2005. Asiatic acid induces apoptosis in SK-MEL-2 human melanoma cells. Canc Lett 218: 81-90. Park JS, Tamayo MH, Gonzalez-Juarrero M, Orme IM, Ordway DJ, 2006. Virulent clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis grow rapidly and induce cellular necrosis but minimal apoptosis in murine macrophages. J Leu Biol 79: 80–86. Park SH, Bendelac A, 2000. Progress CD1-restrictid T-cell responses and microbial infection. Nature 409: 788-792. Pedroza-Gonzalez A, Garcia-Romo GS, Aguilar-Leon D, 2004. In situ analysis of lung antigen-presenting cells during murine pulmonary infection with virulent Mycobacterium tuberculosis. Int J Exp Pathol 85: 135-45. Peters-Golden M, 2004. The Alveolar Macrophage : The forgotten cell in asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 31. 3-7. Peter CSW, Herrmann M, Lauber K, 2010. Dangerous attraction: phagocyte recruitment and danger signals of apoptotic and necrotic cells. Apoptosis 15: 1007-28. Punturee K, Wild CP, Vinitketkumneun, 2004. Thai medicinal plants modulate nitrit oxide and tumor necrosis factor α in J 774, 2 mouse macrophages. J Ethnopharmacol 95.183-189. Reviono, 2011. Pengaruh penambahan Clofazimine terhadap aktivasi INH pada mencit yang diinfeksi Mycobacterium tuberculosis resisten INH Mutan KatG. Disertasi. Universitas Airlangga. Rodrigues MF, Barsante MM, Alves CCS, Souza MA, Ferreira AP, AmaranteMendes GP, Teixeira HC, 2009. Apoptosis of macrophages during pulmonary Mycobacterium bovis infection: correlation with intracellular bacillary load and cytokine levels. Immunol 128: e691-e69 Rojas RE, Balaji KN, Subramanian A, Boom WH, 1999. Regulation of human cd4+ alphabeta Tcell receptor + and gammadelta TCR+ responsses to Mycobacterium tuberculosis by IL-10 and TGF beta. Infect Immun 67(12): 6461-72.

Disertasi



132

Ross E M, Gilaman A G, 1985. Pharmacodynamic. In The pharmacological Basis of Therapeutics. Ed 7Th. Editor Goodman and Gilman. London. MacMilland Publishing company: 35-48. Rudel T, Kepp O, Kozjak-Pavlovic V, 2010. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev 8:693-705. Rubins JB, 2003. Alveolar Macrophages : Welding the double-edged sword of inflammation. Am J Respir Crit Care Med 167. 103-104. Salgame Padmini, 2011. MMPs in tuberculosis: granuloma creators and tissue destroyers. J Clin Invest 121(5): 1686-1688. Samali A, Fulda S, Adrienne MG, Osamu H, Srinivasula SM, 2010. Cell stress and cell death. Int J Cell Biol:11-2 Sato K, Akaki T, Tomioka, 1998. Differential potentiation of anti-mycobacterial activity and reactive nitrogen intermediate-producing ability of murine peritoneal macrophages activated by interferon-gamma (IFN-γ) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-α). Clin Exp Immunol 112(1): 63–68. Saunders BM, Cheers C, 1996. Intranasal infection of beige mice with Mycobacterium avium complex: Role of neutrophils and natural killer cells. Infect Immun 64; 4236-4241. Saunders BM, Britton WJ, 2007. Life and death in the granuloma: immunopathology of tuberculosis. Immun Cell Biol 85: 103-111. Schaible UE, Winau F, Sieling PA, Fischer K, Collins HL, 2003. Apoptosis facilitates antigen presentation to T lymphocytes through MHC-I and CD1 in tuberculosis. Nat Med 9: 1039–1046. Shiloh MU, Nathan CF, 2000. Reactive nitrogen intermediates and the pathogenesis of salmonella and mycobacteria. Curr Opin Microbiol 3: 35–42. Shin DM, Jo EK, Park JK, Hur GM, Choi HH, Kang G, Lee HM, Park JB, Song CH, Lim YJ, Kim KH, 2010. Endoplasmic reticulum stress response is involved in Mycobacterium tuberculosis protein ESAT-6-mediated apoptosis. FEBS LETTERS 584(11): 2445-54. Shore GC , Nguyen M , 2008. Bcl-2 Proteins and Apoptosis: Choose Your Partner. Cell 135: 1004-7 Singhal A, Aliouat EM, Herve M, Mathys V, Kiass M, Creusy C, Delaire B, Tsenova L, Fleurisse L, Bertout J, Camacho L, Foo D, Tay HC, Siew JY, Boukhouci W, Romano M, Mathema B, Dartois V, Kaplan G, Bifani P, 2011. Experimental tuberculosis in the Wistar Rat : A model for protective immunity and control of infection. Plos One 6(4):e18632.

Disertasi



133 Sly LM, Hingley-Wilson SM, Reiner NE, McMaster WR, 2003. Survival of Mycobacterium tuberculosis in host macrophages involves resistance to apoptosis dependent upon induction of antiapoptotic Bcl-2 family member Mcl-1. J Immunol 170: 430–437. Somashekar Shetty, S. L. Udupa, A. L. Udupa, S. N. Somayaji, 2006. Effect of Centella asiatica L (Umbelliferae) on normal and dexamethasone-suppressed wound healing in Wistar Albino Rats. Int J low Extrem Wounds 5:137. Sturgill-Koszycki S, Schlesinger PH, Chakraborty P, 1994. Lack of acidification in Mycobacterium tuberculosis phagosome produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Sci 263: 678-81. Sugawara I, Udagawa T, Yamada H, 2004. Rat neutrophils prevent the development of tuberculosis. Infect Immun 72 (3): 1804-6. Suratman, Sumiwi SA, Gozali D,1996. Pengaruh ekstrak antanan dalam bentuk salep, krim, jelly terhadap penyembuhan luka bakar.Cermin dunia kedokteran 108.31-36. Tailleux L, Schwartz O, Hermann JL, 2003. DC-SIGN is the major Mycobacterium tuberculosis receptor on human dendritic cells. J Exp Med 197: 121-7. Tang X-L, Yang X-Y, Jung H-J, Kim S-Y, Jung S-Y, Choi D-Y, Park W-C, Park H 2009. Asiatic Acid induces colon cancer cell growth inhibition and apoptosis through mitochondrial ceath Cascade. Biol Pharm Bull 32 (8): 1399-405. Taib Saleh WBM, 2000. Efek ekstrak methanol Centella asiatica sebagai imunomodulator ajuvan pada perubahan beberapa variabel respons imun tikus putih. Disertasi. Universitas Airlangga Surabaya. Toossi Z, Mincek M, Seeholtzer, Fulton SA, Hamilton BD, Hirsch Cs, 1997. Modulation of IL-12 by transforming growth factor beta in Mycobacterium tuberculosis-infected mononuclear phagocytes and in patient with active tuberculosis. J Clin Lab Immunol 49(2):59-75. Vankalayapati R, Wizel B, Weis SE, 2002. The NKp46 receptor contributes to NK cell lysis of mononuclear phagocytes infected with an intracellular bacterium. J Immunol 168: 3451-7. Vankalayapati R, Klucar P, Wizel B, 2004. NK cells regulate CD8+ T cell effector function in response to an intracellular pathogen. J Immunol 172: 130-7. Velmurugan K, Chen B, Miller JL, Azogue S ,Gurses S, Hsu Tsungda, Glickman m, Jacobs jr, Porcell SA, Briken V, 2007. Mycobacterium tuberculosis nuoG is a virulence gene that inhibits apoptosis of infected host cells. Plos Pathogens 3(7): 972-980. Wang XS, Duan JY, Fang JN, 2004. Structural features of polysaccharide from Centella asiatica. Chin chem let 15(2):187-190.

Disertasi



134

Worlh Health Organization, 2010. Who report 2010: global tuberculosis control. Wozniak TM, Ryan AA, Triccas JA, Britton WJ, 2006. Plasmid interleukin-23(IL23), but not plasmid IL-27, enhances the protective efficacy of a DNA vaccine against Mycobacterium tuberculosis infection. Infect Immun 74: 557-65. Yao Y , Marassi FM, 2009. BAX and BAK Caught in the Act. Mol Cell 36: 353-54. Yang CS, Yuk JM, Jo EK (2009) The role of nitric oxide in mycobacterial infections. Immune Netw 9: 46–52. Zainol NA, Voo SC, R SM, Aziz RA, 2008. Profiling of Centella asiatica (L) urban extract. Mal J Analyt Sci 12 (2): 322-7. Zhang J, Jiang R,Takayama H, Tanaka Y, 2005. Survival of virulent mycobacterium tuberculosis involves preventing apoptosis induced by Bcl-2 upregulation and resulting from necrosis in J774 macrophages. Microbiol Immunol 49(9): 845852. Zhang S, Won YK, Ong C N, Shen H M, 2005. Anti cancer potential of sesquiterpene lactones bioactivity and molecular mechanisms. Curr Med Chem Canc Agent 5(3):239-24.

Disertasi



Lampiran 1 Determinasi Centella

135

Disertasi



Lampiran 2 Ethical Clearance

136

Disertasi



137

Disertasi



138

Disertasi



139

Disertasi



Lampiran 5 Hasil uji statistik Uji Normalitas Uji normalitas untuk ekspresi protein Bcl2 One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test BclD1 N

BclD2

BclD3

BclK

7

7

6

6

Mean

29.7143

30.5286

33.8333

79.0667

Std. Deviation

9.71381

11.91396

25.70243

47.27158

Absolute

.278

.236

.300

.319

Positive

.175

.236

.300

.319

Negative

-.278

-.198

-.177

-.178

Kolmogorov-Smirnov Z

.736

.625

.734

.781

Asymp. Sig. (2-tailed)

.650

.830

.654

.576

Normal Parameters

a,,b

Most Extreme Differences

a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.

Uji normalitas untuk ekspresi protein Bax One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test Bax1 N

Bax2

Bax3

BaxK

7

7

6

6

51.3143

98.1429

52.9667

53.0333

19.59553

7.78521

34.11989

23.65432

Absolute

.188

.160

.333

.235

Positive

.188

.160

.333

.235

Negative

-.183

-.135

-.256

-.169


.498

.424

.816

.575


.965

.994

.519

.896

Normal Parameters

a,,b

Mean Std. Deviation



139 Disertasi



140

Uji Normalitas untuk ekspresi caspase 8 One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test CasD1 N

CasD2

CasD3

CasDK

7

7

6

6

57.0571

107.2000

100.2667

36.1333

18.31637

16.26366

38.37159

15.29950

Absolute

.250

.251

.162

.258

Positive

.250

.224

.147

.258

Negative

-.159

-.251

-.162

-.178


.662

.665

.396

.632


.773

.769

.998

.819

Normal Parameters

a,,b

Mean Std. Deviation



Uji normalitas untuk apoptosis One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test ApopD1 N

ApopD2

ApopD3

ApopDk

7

7

6

6

57.8286

105.9429

74.1333

19.1333

15.35901

21.23165

17.06818

18.59061

Absolute

.159

.225

.161

.284

Positive

.122

.167

.149

.284

Negative

-.159

-.225

-.161

-.211


.422

.596

.393

.695


.994

.869

.998

.720

Normal Parameters

a,,b

Mean Std. Deviation



Disertasi



141

Uji normalitas untuk ekspresi antigen M.tuberculosis One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test antigen1 N

antigen2

antigen3

antigenk

7

7

6

6

91.4571

52.5429

92.7333

109.0333

25.09335

42.90854

33.55894

20.63024

Absolute

.247

.331

.301

.182

Positive

.247

.331

.301

.118

Negative

-.169

-.188

-.183

-.182


.655

.875

.738

.445


.785

.429

.648

.989

Normal Parameters

a,,b

Mean Std. Deviation



Uji normalitas untuk jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml/gram) One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test CFUD1 N Normal Parameters

a,,b

Mean Std. Deviation


CFUD2

CFUD3

CFUDK

7

7

6

6

110.3571

.0000

.0000

326.3667

35.71320

c

c

111.21472

.00000

.00000

Absolute

.228

.113

Positive

.228

.112

Negative

-.169

-.113


.604

.277


.859

1.000

a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data. c. The distribution has no variance for this variable. One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test cannot be performed.

Disertasi



142

Analisis untuk Ekspresi protein Caspase-8 sel alveolar makrofag Test of Homogeneity of Variances CASPASE8 Levene Statistic

df1

2.989

df2 3

Sig. 22

.053

ANOVA CASPASE8 Sum of Squares

df

Mean Square

Between Groups

22392.896

3

7464.299

Within Groups

12132.244

22

551.466

Total

34525.140

25

F

Sig.

13.535

.000

Multiple Comparisons CASPASE8 Tukey HSD (I) DOSIS

(J) DOSIS

Mean Difference (IJ) Std. Error

.00

375.00

-20.92381 13.06490

.398

-57.2029

15.3553

750.00

-71.06667* 13.06490

.000

-107.3458

-34.7876

1500.00

-64.13333* 13.55809

.001

-101.7819

-26.4847

20.92381 13.06490

.398

-15.3553

57.2029

750.00

-50.14286* 12.55235

.003

-84.9987

-15.2870

1500.00

-43.20952* 13.06490

.016

-79.4886

-6.9304

.00

71.06667* 13.06490

.000

34.7876

107.3458

375.00

50.14286* 12.55235

.003

15.2870

84.9987

6.93333 13.06490

.951

-29.3458

43.2124

64.13333* 13.55809

.001

26.4847

101.7819

375.00

43.20952* 13.06490

.016

6.9304

79.4886

750.00

-6.93333 13.06490

.951

-43.2124

29.3458

375.00

750.00

.00

1500.00 1500.00 .00

95% Confidence Interval Sig.

Lower Bound Upper Bound

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

Disertasi



143

Analisis untuk ekspresi protein Bax sel alveolar makrofag Test of Homogeneity of Variances BAX Levene Statistic

df1

1.777

df2 3

Sig. 22

.181

ANOVA BAX Sum of Squares

Df

Mean Square

Between Groups

10725.908

3

3575.303

Within Groups

11286.032

22

513.001

Total

22011.940

25

F 6.969

Sig. .002

Multiple Comparisons BAX Tukey HSD (I) DOSIS

(J) DOSIS


.00

375.00

1.71905 12.60104

.999

-33.2720

36.7101

750.00

-45.10952* 12.60104

.008

-80.1005

-10.1185

.06667 13.07672

1.000

-36.2452

36.3786

-1.71905 12.60104

.999

-36.7101

33.2720

-46.82857* 12.10669

.004

-80.4469

-13.2103

-1.65238 12.60104

.999

-36.6434

33.3386

.00

45.10952* 12.60104

.008

10.1185

80.1005

375.00

46.82857* 12.10669

.004

13.2103

80.4469

1500.00

45.17619* 12.60104

.008

10.1852

80.1672

-.06667 13.07672

1.000

-36.3786

36.2452

375.00

1.65238 12.60104

.999

-33.3386

36.6434

750.00

-45.17619* 12.60104

.008

-80.1672

-10.1852

1500.00 375.00

.00 750.00 1500.00

750.00

1500.00 .00




Disertasi



144

Analisis untuk ekspresi protein Bcl-2 sel alveolar Test of Homogeneity of Variances BCL2 Levene Statistic

df1

1.958

df2 3

Sig. 22

.150

ANOVA BCL2 Sum of Squares

df

Mean Square

Between Groups

10619.582

3

3539.861

Within Groups

15893.890

22

722.450

Total

26513.471

25

F

Sig.

4.900

.009

Multiple Comparisons BCL2 Tukey HSD (I) DOSIS

(J) DOSIS


.00

375.00

49.35238* 14.95377

.016

7.8282

90.8766

750.00

48.53810* 14.95377

.018

7.0139

90.0623

1500.00

45.23333* 15.51826

.037

2.1417

88.3250

-49.35238* 14.95377

.016

-90.8766

-7.8282

750.00

-.81429 14.36712

1.000

-40.7094

39.0808

1500.00

-4.11905 14.95377

.992

-45.6432

37.4051

-48.53810* 14.95377

.018

-90.0623

-7.0139

.81429 14.36712

1.000

-39.0808

40.7094

-3.30476 14.95377

.996

-44.8289

38.2194

-45.23333* 15.51826

.037

-88.3250

-2.1417

375.00

4.11905 14.95377

.992

-37.4051

45.6432

750.00

3.30476 14.95377

.996

-38.2194

44.8289

375.00

750.00

.00

.00 375.00 1500.00

1500.00 .00




Disertasi



145

Analisis untuk apoptosis sel alveolar makrofag Test of Homogeneity of Variances APOPTOSIS Levene Statistic

df1

.263

df2 3

Sig. 22

.851

ANOVA APOPTOSIS Sum of Squares Between Groups Within Groups Total

df

Mean Square

25207.396

3

8402.465

7304.758

22

332.034

32512.154

25

F

Sig.

25.306

.000

Multiple Comparisons APOPTOSIS Tukey HSD (I) DOSIS

(J) DOSIS


.00

375.00

-38.69524* 10.13768

.005

-66.8459

-10.5446

750.00

-86.80952* 10.13768

.000

-114.9602

-58.6588

1500.00

-55.00000* 10.52037

.000

-84.2133

-25.7867

38.69524* 10.13768

.005

10.5446

66.8459

9.73997

.000

-75.1606

-21.0680

1500.00

-16.30476 10.13768

.395

-44.4554

11.8459

.00

86.80952* 10.13768

.000

58.6588

114.9602

375.00

48.11429*

9.73997

.000

21.0680

75.1606

1500.00

31.80952* 10.13768

.023

3.6588

59.9602

55.00000* 10.52037

.000

25.7867

84.2133

375.00

16.30476 10.13768

.395

-11.8459

44.4554

750.00

-31.80952* 10.13768

.023

-59.9602

-3.6588

375.00

.00 750.00

750.00

1500.00 .00

-48.11429*




Disertasi



146

Analisis untuk jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) Group Statistics DOSIS CFU

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

.00

6

326.3667

111.21472

45.40322

375.00

7

110.3571

35.71320

13.49832

Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances

t-test for Equality of Means 95% Confidence Interval of the Difference Sig. (2-

F CFU Equal

Sig.

t

7.055 .022 4.885

df

Mean

Std. Error

tailed) Difference Difference

Lower

Upper

11

.000 216.00952 44.22126 118.67918 313.33986

4.560 5.885

.004 216.00952 47.36726 99.55290 332.46615

variances assumed Equal variances not assumed

Disertasi



147

Group Statistics DOSIS CFU

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

.00

6

326.3667

111.21472

45.40322

750.00

7

.0000

.00000

.00000



F CFU Equal

Sig.

t

16.660 .002 7.824

df

Mean

Std. Error


Lower

Upper

11

.000 326.36667 41.71555 234.55136 418.18197

7.188 5.000

.001 326.36667 45.40322 209.65397 443.07936


Disertasi



148


N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

.00

6

326.3667

111.21472

45.40322

1500.00

6

.0000

.00000

.00000



F

CFU Equal

14.063

Sig.

t

df

Mean

Std. Error


Lower

Upper

10

.000 326.36667 45.40322 225.20199 427.53135

7.188 5.000

.001 326.36667 45.40322 209.65397 443.07936

.004 7.188


Disertasi



149

Group statistic DOSIS CFU

N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

375.00

7

110.3571

35.71320

13.49832

750.00

7

.0000

.00000

.00000



F CFU Equal

7.960

Sig.

t

.015 8.176

df

Mean

Std. Error


Lower

Upper

12

.000 110.35714 13.49832 80.94683 139.76746

8.176 6.000

.000 110.35714 13.49832 77.32794 143.38635


Disertasi



150


N

Mean

Std. Deviation

Std. Error Mean

375.00

7

110.3571

35.71320

13.49832

1500.00

6

.0000

.00000

.00000



F CFU Equal

6.736

Sig.

t

.025 7.520

df

Mean

Std. Error


Lower

Upper

11

.000 110.35714 14.67422 78.05940 142.65489

8.176 6.000

.000 110.35714 13.49832 77.32794 143.38635


Disertasi



151

Analisis untuk ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis Test of Homogeneity of Variances Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis Levene Statistic

df1

.626

df2 3

Sig. 22

.606

ANOVA Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis Sum of Squares

df

Mean Square

Between Groups

11487.714

3

3829.238

Within Groups

22583.961

22

1026.544

Total

34071.675

25

F

Sig.

3.730

.026

Multiple Comparisons Ekspresi antigen Mycobacterium tuberculosis (I) DOSIS

(J) DOSIS


.00

375.00

17.57619 17.82525

.759

-31.9216

67.0740

750.00

56.49048* 17.82525

.021

6.9927

105.9883

1500.00

16.30000 18.49814

.815

-35.0663

67.6663

-17.57619 17.82525

.759

-67.0740

31.9216

750.00

38.91429 17.12595

.135

-8.6417

86.4702

1500.00

-1.27619 17.82525

1.000

-50.7740

48.2216

-56.49048* 17.82525

.021

-105.9883

-6.9927

375.00

-38.91429 17.12595

.135

-86.4702

8.6417

1500.00

-40.19048 17.82525

.140

-89.6883

9.3073

-16.30000 18.49814

.815

-67.6663

35.0663

375.00

1.27619 17.82525

1.000

-48.2216

50.7740

750.00

40.19048 17.82525

.140

-9.3073

89.6883

375.00

750.00

.00

.00

1500.00 .00




Disertasi



152

Analisis untuk kerusakan jaringan Test Statisticsa,b Peribronkioliti Perivaskulitis s1 1 Alveolitis1 Granuloma1 Jumlah Chi-Square

1.731

11.252

8.342

6.749

12.644

3

3

3

3

3

.630

.010

.039

.080

.005

df Asymp. Sig. a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: DOSIS

Analisis Mann-Whitney untuk dosis 375mg/KgBB dengan kontrol Ranks DOSIS Peribronkiolitis .00 1 375.00 Total Perivaskulitis1 .00 375.00 Total Alveolitis1

7.83

47.00

7

6.29

44.00

6

9.25

55.50

7

5.07

35.50

13

13 9.92

59.50

375.00

7

4.50

31.50

13

.00

6

8.83

53.00

375.00

7

5.43

38.00

13

.00

6

10.17

61.00

375.00

7

4.29

30.00

Total

Disertasi

6

6

Total jumlah

Mean Rank Sum of Ranks

.00 Total

Granuloma1

N

13



153

Test Statisticsb Peribronkioliti Perivaskulitis s1 1 Alveolitis1 Granuloma1

jumlah

Mann-Whitney U

16.000

7.500

3.500

10.000

2.000

Wilcoxon W

44.000

35.500

31.500

38.000

30.000

-.761

-2.207

-2.591

-1.722

-2.737


.447

.027

.010

.085

.006

Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)]

.534a

.051a

.008a

.138a

.005a

Z

a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: DOSIS

Analisis Mann-Whitney U antara dosis 750 mg/KgBB dengan kontrol Ranks DOSIS Peribronkiolitis .00 1 750.00 Total Perivaskulitis1 .00 750.00 Total Alveolitis1

7.67

46.00

7

6.43

45.00

6

9.75

58.50

7

4.64

32.50

13

13 9.42

56.50

750.00

7

4.93

34.50

13

.00

6

9.08

54.50

750.00

7

5.21

36.50

13

.00

6

10.33

62.00

750.00

7

4.14

29.00

Total

Disertasi

6

6

Total jumlah


.00 Total

Granuloma1

N

13



154


jumlah

Mann-Whitney U

17.000

4.500

6.500

8.500

1.000

Wilcoxon W

45.000

32.500

34.500

36.500

29.000

-.614

-2.522

-2.137

-2.043

-2.885


.539

.012

.033

.041

.004


.628a

.014a

.035a

.073a

.002a

Z


Analisis Mann-Whitney U antara dosis 1500 mg/KgBB dengan control Ranks DOSIS Peribronkiolitis .00 1 1500.00 Total Perivaskulitis1 .00 1500.00 Total Alveolitis1

6.17

37.00

6

6.83

41.00

6

7.75

46.50

6

5.25

31.50

12

12 7.58

45.50

1500.00

6

5.42

32.50

12

.00

6

8.25

49.50

1500.00

6

4.75

28.50

12

.00

6

8.58

51.50

1500.00

6

4.42

26.50

Total

Disertasi

6

6

Total jumlah


.00 Total

Granuloma1

N

12



155


jumlah

Mann-Whitney U

16.000

10.500

11.500

7.500

5.500

Wilcoxon W

37.000

31.500

32.500

28.500

26.500

-.341

-1.433

-1.087

-1.883

-2.027


.733

.152

.277

.060

.043


.818a

.240a

.310a

.093a

.041a

Z


Analisis Mann- WhitneyU antara dosis 375 mg/KgBB dengan 750 mg/KgBB Ranks DOSIS Peribronkiolitis 375.00 1 750.00 Total

Mean Rank Sum of Ranks 7

7.36

51.50

7

7.64

53.50

14

Perivaskulitis1 375.00

7

8.50

59.50

750.00

7

6.50

45.50

Total Alveolitis1

Granuloma1

7

7.00

49.00

750.00

7

8.00

56.00

14

375.00

7

8.00

56.00

750.00

7

7.00

49.00

Total jumlah

14

375.00 Total

14

375.00

7

7.21

50.50

750.00

7

7.79

54.50

Total

Disertasi

N

14



156


jumlah

Mann-Whitney U

23.500

17.500

21.000

21.000

22.500

Wilcoxon W

51.500

45.500

49.000

49.000

50.500

-.142

-1.041

-.490

-.628

-.262


.887

.298

.624

.530

.793


.902a

.383a

.710a

.710a

.805a

Z

a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: DOSIS Analisis Mann-Whitney U antara dosis 375 mg/KgBB dengan 1500 mg/KgBB Ranks DOSIS Peribronkiolitis 375.00 1 1500.00 Total Perivaskulitis1 375.00 1500.00 Total Alveolitis1

5.93

41.50

6

8.25

49.50

7

5.79

40.50

6

8.42

50.50

13

13 5.57

39.00

1500.00

6

8.67

52.00

13

375.00

7

7.36

51.50

1500.00

6

6.58

39.50

13

375.00

7

5.43

38.00

1500.00

6

8.83

53.00

Total

Disertasi

7

7

Total jumlah


375.00 Total

Granuloma1

N

13



157


jumlah

Mann-Whitney U

13.500

12.500

11.000

18.500

10.000

Wilcoxon W

41.500

40.500

39.000

39.500

38.000

Z

-1.125

-1.646

-1.517

-.488

-1.621


.260

.100

.129

.626

.105


.295a

.234a

.181a

.731a

.138a

a. Not corrected for ties. b. Grouping Variable: DOSIS Analisis Mann-Whitney U antara dosis 750 mg/KgBB dengan 1500 mg/KgBb Ranks DOSIS Peribronkiolitis 750.00 1 1500.00 Total Perivaskulitis1 750.00 1500.00 Total Alveolitis1

6.07

42.50

6

8.08

48.50

7

5.07

35.50

6

9.25

55.50

13

13 6.00

42.00

1500.00

6

8.17

49.00

13

750.00

7

6.93

48.50

1500.00

6

7.08

42.50

13

750.00

7

5.43

38.00

1500.00

6

8.83

53.00

Total

Disertasi

7

7

Total Jumlah


750.00 Total

Granuloma1

N

13



158


jumlah

Mann-Whitney U

14.500

7.500

14.000

20.500

10.000

Wilcoxon W

42.500

35.500

42.000

48.500

38.000

-.984

-2.239

-1.075

-.114

-1.603


.325

.025

.282

.909

.109


a

a

a

a

.138a

Z

.366

.051

.366

.945


Analisis jalur Assessment of normality (Group number 1) Variable DOSIS CAS8 BCL2 BAX APOP CFU Multivariate

min 1.000 20.000 10.000 26.000 4.000 1.000

max 1500.000 153.400 168.200 120.800 134.000 473.700

skew .436 .252 2.260 .342 .028 1.187

c.r. .872 .503 4.520 .684 .056 2.375

kurtosis -1.154 -1.139 5.825 -1.262 -.737 .212 2.880

c.r. -1.154 -1.139 5.825 -1.262 -.737 .212 .720

Regression Weights: (Group number 1 - Default model)

Estimate S.E. C.R. P Label CAS8 <--- DOSIS .045 .011 4.222 *** par_3 BCL2 <--- DOSIS -.023 .011 -2.013 .044 par_1 BAX <--- DOSIS -.031 .010 -3.235 .001 par_2 BAX <--- CAS8 .784 .143 5.495 *** par_8 APOP <--- CAS8 .581 .196 2.963 .003 par_4 APOP <--- BAX -.037 .242 -.154 .878 par_5 APOP <--- BCL2 -.239 .176 -1.359 .174 par_7 CFU <--- APOP -2.786 .589 -4.732 *** par_6

Disertasi



159

Analisis korelasi antara jumlah Mycobacterium tuberculosis (CFU/ml) dengan kerusakan jaringan.

Correlations CFU Spearman's rho

CFU

Correlation Coefficient Sig. (1-tailed) N

jumlah

Jumlah *

1.000

.354

.

.038

26

26

Correlation Coefficient

.354

*

1.000

Sig. (1-tailed)

.038

.

26

26

N *. Correlation is significant at the 0.05 level (1-tailed).

Disertasi



Lampiran 6 Prosedur pemeriksan Apoptosis dengan Apoptag Detection Kit

1. Deparafisasi jaringan 1. Cuci spesimen tiga kali dengan xylene masing-masing selama lima menit. 2. Cuci spesomen dua kali dengan etanol absolut masing-masing selama lima menit 3. Cuci spesimen satu kali dengan etanol 95% dan satu kali dengan etanol 70% masing-masing selama tiga menit 4. Cuci spesimen dengan satu kali PBS selama lima menit 2. Persiapan pewarnaan: 1. Teteskan proteinase K (20ug/ml) langsung pada spesimen (60u/5 lima belas menit 2. Cuci spesimen dua kali dengan d

) selama

O copling jar masing- masing selama dua

menit 3. Menghilangkan endogenous peroxidase 1. Teteskan 3%

dalam PBS selama lima menit pada suhu kamar.

2. Cuci spesimen dua kali dengan PBS masing-masing selama dua menit dalam copling jar. 4. Gunakan equilibration buffer 1. Singkirkan cairan di sekitar potongan jaringan dengan kertas pengering. 2. Teteskan 75ul equilibration buffer langsung pada spesimen. 3. Inkubasi paling sedikit sepuluh menit pada suhu kamar 5. Gunakan working strength TdT enzyme 1. Singkirkan cairan di sekitar potongan jaringan dengan kertas pengering. 2. Segera teteskan working strength TdT enzyme pada potongan jaringan sebanyak 55ul/5 3. Inkubasi selama satu jam pada suhu 37°C dalam wadah yang lembab 160 Disertasi



161

6. Gunakan stop/wash buffer 1. Letakkan spesimen dalam copling jar yang berisi working strength stop/wash buffer, goncangkan selama limabelas detik kemudian diinkubasi selama sepuluh menit pada suhu kamar 2. Keluarkan anti-Digoxigenin Peroxidase-Conjugate dari tempat penyimapana dan hangatkan pada suhu kamar 7. Gunakan anti-Digoxigenin Peroxidase-Conjugate 1. Cuci spesimen tiga kali dengan PBS masing-masing selama satu menit. 2. Keringkan cairan diantara potongan jaringan dengan kertas pengering. 3. Teteskan anti-Digoxigenin Peroxidase-Conjugate pada sediaan gunakan kirakira 65ul/5

dari permukaan spesimen

4. Inkubasi dalam tempat yang lembab selama tigapuluh menit pada suhu kamar 8. Cuci dalam larutan PBS 1. Cuci spesimen sebanyak empat kali dengan PBS dalam copling jar masingmasing selama dua menit pada suhu kamar 2. Sementara mencuci sediaan, disiapkan working strength peroxidase substrate 9. Pemberian warna pada sediaan dengan peroxidase substrate 1. Hilangkan cairan diantara potongan jaringan secara hati-hati dengan kertas pengering 2. Teteskan peroxidase substrate secukupnya sampai menutupi seluruh permukaan jaringan (75ul/5 3. Biarkan sepuluh menit pada suhu kamar 4. Untuk memonitor timbulnya warna dapat dilihat dengan mikroskop cahaya 10.Cuci spesimen 1. Cuci spesimen tiga kali dengan dH2O dalam copling jar masing-masing selama satu menit 2. Slide diinkubasi dengan dH2O dalam copling jar selama lima menit pada suhu kamar 11.Pemberian counter stain specimen 1. Teteskan 0,5% ffast green pada slide selama sepuluh menit pada suhu kamar

Disertasi



162

2. Cuci spesimen 3 kali dengan dH2O masing-masing selama 5 menit 12.Mount specimen 1. Keringkan spesimen dengan cylene 2. Hilangkan cairan diantara sediaan dengan kertas pengering 3. Teteskan mounting medium seperti Permount kemudian tutup dengan cover glas 13.Amati dibawah mikroskop

Disertasi


ADLN - Perpustakaan Universitas Airlangga DISERTASI

Recommend Documents