Adhese a růst lidských kostních buněk v kulturách na vrstvách fullerenů C60 Lucie Bačáková, Lubica Grausová Fyziologický ústav AVČR, Praha Jiří Vacík Ústav jaderné fyziky AVČR, Řež u Prahy Václav Švorčík Vysoká škola chemicko-technologická, Praha Alexander Kromka Fyzikální ústav AVČR
Fyziologický ústav Akademie věd ČR Odd. růstu a diferenciace buněčných populací
Vídeňská 1083 142 20 Praha 4 - Krč
Tel: +420 2 9644 2521, 2523, 2572 Fax: +420 2 4106 2488 E-mail:
[email protected]
Laboratoř buněčných kultur
Samostatná místnost pro přípravu buněčných kultur
Box s laminárním prouděním vzduchu a UV světlem
Nádobky na kultivaci buněk Kultivační médium Laminární box Cytosafe pro práci s nanočásticemi
Inkubátor (37oC, 5% CO2)
Laboratoř buněčných kultur
Horkovzdušný sterilizátor a autokláv
Inverzní mikroskop s fluorescencí, digitální kamerou a analýzou obrazu
Analyzátor počtu a životaschopnosti buněk
Metodika buněčných kultur • Založení explantační metodou
• Založení enzymatickou disociací 1. den po nasazení (obj. 10x)
2. den po nasazení (obj. 10x)
7. den po nasazení: monolayer i multilayer, tzv. „kopce a údolí“ (obj. 20x)
Hladké svalové buňky aorty potkana
7. den po nasazení: konfluentní monolayer, dlaždicovitá morfologie (obj. 20x)
Cévní endotelové buňky
Laboratoř imunocytochemie
Imunofluorescence talinu, proteinu fokálních adhesí, jádra dobarvena propidium iodidem
Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu, jádra dobarvena barvivem Hoechst 33342 Vinculin Absorbance (% of the value on PS)
Imunofluorescenční barvení & Enzymatická imunosorbentní esej (ELISA)
200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
*
PS
ELISA Reader „Victor“
TER
2S
4S
6S
8S
ELISA vinkulinu, proteinu fokálních adhesí, v kostních buňkách na kompozitech polymeruhlíkové nanotuby
Deposice vrstev fullerenů C60 Kulatá mikroskopická krycí skla, Menzel Glaser, Německo Průměr 12 mm
• Kontinuální vrstvy – Tenká: 505 ± 43 nm – Tlustá: 1090 ± 8 nm
• Mikrostrukturované vrstvy (deponované přes
Vakuový deposiční systém Univex 300 ÚJF AVČR, Řež u Prahy
kovovou mřížku) – Tloušťka pod oky mřížky: 484 ± 5 nm – Tloušťka pod kovovými přepážkami: 158 ± 5 nm (Měřeno pomocí AFM na VŠCHT)
Morfologie mikrostrukturovaných vrstev fullerenů
100 µm
Kovová mřížka a odpovídající měřítko, ÚJF AVČR
Optická mikroskopie, VŠCHT Praha
484±5 nm 158±5 nm
Cca 125 x 105 mikrometrů = 13 125 µm2
Světelná mikroskopie, FgÚ AVČR, analysa obrazu Tescan Atlas 16 000 ± 500 µm2, vzdálenost 50 µm
Morfologie lidských kostních buněk na fullerenových vrstvách
Kontinuální, 505±43 nm
Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm
Kontinuální, 1090 ± 8 nm Buněčná linie MG 63 Nativní kultury v médiu DMEM+10% FTS 5. den po nasazení Inversní mikroskop Olympus IX 50, obj. 20x
Polystyrenová kultivační miska
Mikroskopické krycí sklo
Digitální kamera DP 70
Kinetika růstu lidských kostních buněk na fullerenových vrstvách Growth curves of MG 63 cells Log cell number / cm
2
100000
10000
1000 0
1
2
3
4
5
6
Days after seeding Polystyrene
Glass
Full_thin
Full_domains
Full_thick
Lidské kostní buňky na mikrostrukturovaných fullerenových vrstvách % of domain area or cell number
Colonization of fullerene domains by MG 63 cells 70 60 50 40 30 20 10 0 Day 1
Day 3
Day 5
Imunofluorescence β1-integrinových adhesních receptorů Lidské kostní buňky linie MG 63 3. den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm
Kontinuální, 1090 ± 8 nm Inversní mikroskop Olympus IX 50 Obj. 20x Digitální kamera DP 70
Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm
Mikroskopické krycí sklo
Imunofluorescence cytoskeletárního proteinu β-aktinu v lidských kostních buňkách linie MG 63
Kontinuální, 505 ± 43 nm (obj. 20x)
Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158 ± 5 nm
Kontinuální, 1090 ± 8 nm
Mikrostrukturovaná vrstva, obj. 100x
Imunofluorescence osteopontinu, markeru osteogenní diferenciace Lidské kostní buňky linie MG 63 3. den po nasazení Fixace 70% etanolem Kontinuální, 505 ± 43 nm
Kontinuální, 1090 ± 8 nm Inversní mikroskop Olympus IX 50 Obj. 10x Digitální kamera DP 70
Mikrostrukturovaná, 484 ± 5 a 158±5 nm
Mikroskopické krycí sklo
Smáčivost fullerenových vrstev Kontaktní úhel vodní kapky: Kontinuální vrstva tenká (505 ± 43 nm): 100,6 ± 6,8° Kontinuální vrstva tlustá: (1090 ± 8 nm): 96,7 ± 1,7° Mikrostrukturovaná vrstva (484 ± 5 a 158 ± 5 nm): 95,3 ± 3,1° (Měřeno na Fyzikálním ústavu AVČR, dr. A. Kromka)
Surface Energy Evaluation System (SEE System), vyroben na Masarykově universitě, Brno, máme na FgÚ AVČR
Shrnutí Vrstvy fullerenů C60 podporovaly adhesi a růst lidských kostních buněk linie MG 63 v míře podobné jako na standardních kultivačních površích (sklo, polystyren) Bylo tomu tak i přes relativně vysokou hydrofobicitu povrchu Zřejmě se příznivě uplatnila nanostruktura povrchu i jeho určitá „pohyblivost“ způsobená migrací fullerenů
Postupné mizení mikrostruktury povrchu titititititiititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit ititititititititititititiitiitititititititititititittitii ttiittiitititittitiittitiiititititititititiiiitittiitititi iitiiitittitititititititititititititititititititititititi titititititititititititititititititititititititititititit it
The papers presented at NanoSMat07 will be selected to publish in a special issue of JOURNAL OF NANOSCIENCE AND NANOTECHNOLOGY (American Scientific Publishers). Impact factor 1.932
Dynamický průtokový kultivační systém Pumpa Reservoáry média
Firma Oligene GmbH (nyní Provitro GmbH), Berlin
Manipulace se systémem v laminárním boxu
„Tube chamber“ pro tubulární struktury (cévní náhrady)
Komora se vzorkem materiálu a buněk
Pumpa a „Flow chamber“ pro planární vzorky
Dynamický průtokový kultivační systém, Oligene, Německo pokračování „Perfusion chamber“ pro 3D porézní vzorky či vzorky ve formě prostorových sítí („scaffolds“)
Dynamický rotační kultivační systém, Synthecon, Lucembursko
Dynamická kultivace a konfokální mikroskopie Lidské kostní buňky linie MG 63 na:
PLGA „scaffold“ vláknitý
PLGA „scaffold“ porézní
PLGA „scaffold“ porézní
Cévní endotelové buňky
na klinicky užívaných cévních náhradách
Laserový konfokální mikroskop Leica
Tým Oddělení růstu a diferenciace buněčných populací Doc. MUDr. Vladislav Mareš, DrSc.
Mgr. Martin Pařízek
Doc. MUDr. Vladislav Mareš, DrSc.
Mgr. Věra Lisá, Elena prom. biol. MUDr. Filová Jaroslav Chlupáč
MUDr. Lucie Bačáková, CSc. Barbora Vagaská Ivana Zajanová MUDr. Jaroslav Ivana Chlupáč Zajanová
Mgr. Elena Filová
Mgr. Martin Pařízek
Věra Lisá, prom biol.
Ľubica Ľubica Grausová Grausová MUDr. Lucie Bačáková, CSc.
(Králík Šešulka, náš maskot)
