Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van herpesvirus en Mycoplasma sp. infecties

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013 – 2014

Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van herpesvirus en Mycoplasma sp. infecties. door Stephan GÖBEL

Promotoren:

Prof. Dr. An Martel

Onderzoek in het kader

Prof. Dr. Frank Pasmans

van de masterproef © 2014 Stephan Göbel

Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef.

UNIVERSITEIT GENT

FACULTEIT DIERGENEESKUNDE

Academiejaar 2013 – 2014

Ademhalingsstoornissen bij postduiven: het belang van herpesvirus en Mycoplasma sp. infecties. door Stephan GÖBEL

Promotoren:

Prof. Dr. An Martel

Onderzoek in het kader

Prof. Dr. Frank Pasmans

van de masterproef © 2014 Stephan Göbel

VOORWOORD

Graag zou ik mijn promotor Prof. Dr. A. Martel willen bedanken voor de begeleiding tijdens het schrijven van deze masterproef. Ondanks haar lange afwezigheid van afgelopen winter verliep de communicatie via e-mail prima. Ook zou ik graag Connie Adriaensen hartelijk willen bedanken voor al het werk dat zij in de analyse van de stalen heeft gestoken. Zoveel stalen analyseren is een hele klus! Verder wil ik Drs. J. van der Sluis en zijn assistent Rob van der Bijl bedanken voor het nemen van een groot aantal stalen. Ook gaat mijn dank uit naar co-promotor Prof. Dr. F. Pasmans voor het nalezen van deze masterproef. Dan als laatste wil ik Sandra Göbel bedanken voor de laatste keer nalezen van mijn masterproef. Zonder al deze mensen was het uitvoeren van een dergelijk onderzoek in het afstudeerjaar van de opleiding diergeneeskunde niet mogelijk. Verder wens ik U veel leesplezier in deze masterproef toe.

INHOUDSOPGAVE

SAMENVATTING………………………………………………………………………….……….. p. 1 INLEIDING………………………………………………………………………………...………... p. 2 LITERATUURSTUDIE……………………………………………………………………………... p. 2 1. 1.1.

Herpesvirose bij duiven…………………………………………………………………. p. 2 Etiologie………………………………………………………………………………… p. 2

1.1.1. Oorzakelijk agens…………………………………………………………............... p. 2 1.1.2. Eigenschappen van het PHV-1……………..………………………………………. p. 3 1.1.3. Gastheerspecificiteit………………………………………………………..………... p. 4 1.2. Epidemiologie…………………………………………………………………………… p. 5 1.3. Pathogenese…………………………………………………………………..………... p. 6 1.4. Symptomen…………………………………………………………………....………... p. 8 1.5. Letsels………………………………………………………………………….………... p. 10 1.6. Diagnose………………………………………………………………………………… p. 11 1.7. Differentiaaldiagnose…………………………………………………………………… p. 13 1.8. Therapie…………………………………………………………………………………. p. 13 1.9. Prognose………………………………………………………………………………… p. 15 1.10. Preventie……………………………………………………………………..………... p. 15 2. Mycoplasmose bij duiven………………………………………………………………… p. 16 2.1. Etiologie………………………………………………………………………..………... p. 16 2.1.1. Oorzakelijk agens…………………………………………………………..………... p. 16 2.1.2. Eigenschappen van Mycoplasma sp……………………………………..………... p. 16 2.1.3. Gastheerspecificiteit………………………………………………………..………... p. 17 2.2. Epidemiologie…………………………………………………………………………… p. 18 2.3. Pathogenese…………………………………………………………………..………... p. 19 2.4. Symptomen……………………………………………………………………………… p. 20 2.5. Letsels………………………………………………………………………….………... p. 21 2.6. Diagnose………………………………………………………………………....……… p. 21 2.7. Differentiaaldiagnose………………………………………………………................ p. 23 2.8. Therapie…………………………………………………………………………………. p. 23 2.9. Preventie en controle…………………………………………………………………... p. 24 ONDERZOEK……………………………………………………………………………..………... p. 25 1.

Materialen en methoden………………………………………………………………… p. 25

1.1. Staalname………………………..……………………………………………………….. p. 25 1.2. DNA-bereiding……………………………………………………………………………. p. 25 1.3. PCR-techniek…………………………………………………………………………….. p. 27 1.4. Gelelektroforese…………………………………………………………………………. p. 29 1.5. Sequenering……………………………………………………………………………… p. 31 2.

Resultaten………………………………………………………………………………… p. 32

3.

Discussie…………………………………………………………………………………. p. 38

4.

Conclusie…………………………………………………………………………………. p. 41

REFERENTIELIJST………………………………………………………………………………... p. 43 BIJLAGE I: Tabellering van de stalen……………………………………………………………. p. 46

SAMENVATTING

In deze masterproef wordt verslag gedaan van een onderzoek naar de prevalentie van herpes en mycoplasma’s in drie provincies van Nederland. Het doel van dit onderzoek is om een beter inzicht te krijgen in het voorkomen van het duivenherpesvirus en de verschillende soorten mycoplasma’s in Nederland. Een ander doel van dit onderzoek is om na te gaan of het gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s een rol speelt bij het ontstaan van ademhalingsproblemen bij duiven. Na een literatuurstudie over beide organismen worden in deze masterproef de onderzoeksresultaten gepubliceerd. Uit het onderzoek blijkt dat de prevalentie van zowel herpes als mycoplasma’s bij duiven in de drie deelnemende provincies van het onderzoek veel lager zijn dan de prevalenties die voor beide organismen in de literatuur beschreven zijn. Ook is er een vermoeden van een seizoensgebonden uitscheiding van zowel het PHV-1 als van Mycoplasma sp. en blijkt uit het onderzoek dat de verhoudingen in voorkomen van de verschillende soorten mycoplasma’s in de drie deelnemende provincies sterk afwijken van de percentages die in de literatuur beschreven worden. Verder kan er uit de gegevens, die voorvloeien uit dit onderzoek, niet opgemaakt worden dat het gezamenlijk voorkomen

van

PHV-1

en

mycoplasma’s

invloed

heeft

op

het

ontstaan

van

ademhalingsstoornissen bij duiven en bijgevolg schadelijk kan voor de gezondheid van de duif.

Keywords: duiven-herpes-mycoplasma’s-prevalentie-ademhalingsstoornissen

1

INLEIDING

Het herpesvirus en mycoplasma’s zijn twee veel voorkomende agentia bij duiven. De laatste jaren zijn uitbraken van herpesvirose bij postduiven een vaak gezien verschijnsel in België en Nederland. Vooral jonge duiven zijn het slachtoffer van deze ziekte. Dit kan zijn doordat zij sterven als gevolg van een klinische herpesvirose, maar ook door een verminderde gezondheid van de jongen die ze een achterstand geeft in hun ontwikkeling en oriëntatie in de omgeving van het hok. Het gevolg hiervan is dat er veel meer duiven wegblijven bij het opleren en op de eerste wedvluchten, omdat zij simpelweg ervaring te kort komen. Ook sluimerende infecties van herpesvirose zijn de laatste jaren meer en meer de oorzaak geworden van minder goede prestaties op bepaalde hokken.

In het verleden is nog maar weinig onderzoek gedaan naar de rol van mycoplasma’s in de duivensport. Het is bekend dat klinische mycoplasmose bij duiven zelden of nooit voorkomt. Maar over de vraag of mycoplasma’s een rol van betekenis kunnen spelen in bijvoorbeeld het voorkomen van klinische herpesvirose is weinig tot niets bekend.

Dit onderzoek heeft als doel meer te weten te komen over de prevalentie van zowel het herpesvirus als mycoplasma’s in de provincies Zuid-Holland, Noord-Holland en Utrecht van Nederland. Daarnaast is het doel om een relatie te vinden tussen het herpesvirus en Mycoplasma sp., door na te gaan welke duiven met ademhalingsstoornissen drager zijn van het herpesvirus, welke duiven met ademhalingsstoornissen drager zijn van mycoplasma’s en welke duiven drager zijn van beide agentia.

LITERATUURSTUDIE

1. HERPESVIROSE BIJ DUIVEN

Vroeger kende deze ziekte een groot aantal synoniemen. Zo werd herpesvirose bij duiven kort na de ontdekking door Smadel et. al. in 1945 ook wel de ziekte van ‘Smadel’ genoemd. Maar ook benamingen als ‘Infectieuze Coryza’, ‘Intranucleair Inclusion Disease’ en ‘Inclusion 3

Body Disease’ werden in het verleden aan herpesvirusinfecties bij duiven toegekend . 1.1. ETIOLOGIE 1.1.1. Oorzakelijk agens Het oorzakelijk agens van de ziekte ‘herpesvirose’ bij duiven is een virus dat behoort tot de familie van de Herpesviridae. Het virus wordt tegenwoordig in de literatuur vaak beschreven 1,2

als ‘pigeon herpesvirus 1’, oftewel PHV-1 . Het PHV-1 is verwant aan de herpesvirussen

2

van valken, uilen, oehoe’s en papegaaien en het behoort samen met het herpesvirus van de 1,3

aalscholver tot groep A van de aviare herpesvirussen .

Figuur 1: Vereenvoudige fylogenetische stamboom met onderverdeling van de herpesvirussen die bij gewervelde dieren voorkomen. De stippenlijn geeft een hogere onzekerheid in de evolutie aan (uit Davison A.J., 2002)

Figuur 2: Verdere fylogenetische onderverdeling van de α-herpesvirinae tot aan de aviare herpesvirussen (uit Mc Geoch et al., 2006)

1.1.2. Eigenschappen van PHV-1 PHV-1 is morfologisch gelijkwaardig aan alle andere herpesvirussen. Ook de voornaamste physico-chemische eigenschappen van het PHV-1 zijn in overeenstemming met de physico1

chemische eigenschappen van andere herpesvirussen . De diameter van het virus en zijn envelop varieert van 120-200 nanometer. Het virion heeft een icosahedraal nucleokapsied dat bestaat uit 162 holle langwerpige kapsomeren. De diameter van dit icosahedrale nucleokapsied varieert van 90 tot 100 nanometer

2,3,4

. De envelop die om het virion heen zit is

een lipoproteïne-omhulsel en bevat antigeen materiaal van het virus maar ook van de cel die 3

2,3

het virus geïnfecteerd heeft . Saik et al. (1985) stelde bij het bestuderen van het duiven herpesvirus in zijn gastheer vast dat, net als bij sommige humane herpesvirussen, er bij een 2

infectie met PHV-1 af en toe virions zonder envelop terug te vinden zijn .

Serologisch gezien verschilt PHV-1 van herpesvirussen van papegaaiachtigen en van andere diersoorten. Als men de antigenische eigenschappen van de verschillende isolaten, die men in de loop der tijd bij duiven heeft gevonden met elkaar vergelijkt, komt men tot de conclusie dat alle isolaten tot hetzelfde antigenische type van het herpesvirus behoren, namelijk het 5,6

PHV-1 . Volgens sommige auteurs is het PHV-1 niet in staat tot het agglutineren van rode 2,3

bloedcellen .

Er zijn een aantal omstandigheden waarbij het PHV-1 niet stabiel blijft. Zo blijkt PHV-1 3,4

gevoelig te zijn aan ether en chloroform . Ook is het PHV-1 labiel bij een pH van 4 of lager en wordt de replicatie van het virus geinhibeerd door de aanwezigheid van gehalogeneerde deoxyuridines. De infectiviteit van het PHV-1 wordt totaal vernietigd als het virus gedurende 30 minuten aan een temperatuur van 56ºC blootgesteld wordt. Bij lagere temperaturen blijkt het virus stabieler te zijn dan de andere virussen van groep A van de aviaire herpesvirussen. 2,4

Zo zou de halfwaardetijd van PHV-1 in een celcultuur bij 37ºC ongeveer 15 uur bedragen . 3

Over de stabiliteit van PHV-1 in de buitenwereld is tot op heden nog weinig bekend .

Het in vitro kweken van PHV-1 kan men het beste doen in geëmbryoneerde eieren. PHV-1 groeit het best in de fibroblasten van een kippenembryo, maar ook in niercellen van het kippenembryo en in niercellen van een volwassen duif kan het PHV-1 opgekweekt 2,4,6

worden

. Het virus groeit het best op de chorio-allantoïdale membraan waar dan ook de 3,4

fijnste haarden van virusreplicatie terug te vinden zijn . 1.1.3. Gastheerspecificiteit PHV-1-infecties worden veruit het meest bij duiven vastgesteld. Duiven zijn dan ook de 1

natuurlijke gastheer voor dit virus , maar duiven zijn zeker niet de enige gastheer waarvoor PHV-1 pathogeen is. Zo stelde Vindevogel et al. in 1977 al vast. Zij bedachten een proef waarbij de pathogeniciteit van het PHV-1 op celculturen van verschillende soorten vogels en van een aantal zoogdieren werd getest. Met deze werd proef dus enkel de gevoeligheid van bepaalde celculturen voor PHV-1 nagegaan en niet de gevoeligheid van de desbetreffende 7

diersoort voor het PHV-1 .

Uit de proef bleek dat PHV-1 cytopathogeen is voor de meeste celculturen die afkomstig zijn van vogels. Verder bleek ook dat de meeste celculturen afkomstig van zoogdieren niet gevoelig zijn aan PHV-1. Dit is met uitzondering van de BHK (‘baby hamster kidney’) cellijn. De gevoeligheid van deze cellijn werd aangetoond door de morfologische veranderingen van de celcultuur en ook het verschijnen van PHV-1-specifiek antigeen materiaal in de celcultuur. 7

Ook werden er bij deze cellijn verhoogde virustiters vastgesteld . 4

Eerder in 1970 voerde Cornwell et al. ook al een experiment uit waarbij de infectiviteit van PHV-1 voor duiven en voor kuikens werd getest. Uit dit experiment bleek dat gebruikte stammen van het PHV-1 pathogeen waren voor voornamelijk jonge duiven en niet voor 8

kuikens .

Voor wat betreft de gastheerspecificiteit van het PHV-1 neemt de grasparkiet (Nymphicus hollandicus) een bijzondere status in. Zo bleek uit onderzoek dat, ondanks dat de grasparkiet niet de natuurlijke gastheer van PHV-1 is, hij door nauw kontakt met geïnfecteerde duiven 1,3

toch herpesvirose kan ontwikkelen . Daarnaast zijn grasparkieten ook gevoelig voor het papegaaien-herpesvirus. Grasparkieten op hun beurt kunnen het papegaaien-herpesvirus 3

niet op duiven overbrengen .

Evenals de grasparkiet zijn ook roofvogels gevoelig aan het ontwikkelen van klinische herpesvirose door nauw kontakt met duiven. Dit nauw kontakt komt vooral tot stand door de predatie van roofvogels ten opzichte van duiven. Uit verschillende onderzoeken in het verleden is gebleken, dat het herpesvirus wat roofvogels vaak bij zich dragen gelijkwaardig is aan het PHV-1. Bij deze vergelijkende onderzoeken werd gebruik gemaakt van een restrictie endonuclease analyse, die het vergelijken van verschillende isolaten van het herpesvirus afkomstig van duiven, uilen en valken mogelijk maakte

9,10

.

1.2. EPIDEMIOLOGIE Het duiven herpesvirus werd ruim 65 jaar geleden, in 1945, voor het eerst gerapporteerd door Smadel et al. In New York trof hij bij een kolonie duiven die toebehoorde aan het Amerikaanse leger, de zogenaamde ‘army pigeons’, duiven aan waarbij hij na autopsie multipele necrosehaardjes in de lever, de pancreas en de milt te zien waren. Hij noemde de ziekte destijds ‘Inclusion Body Disease’, omdat de cellen in de necrosehaardjes intranucleaire 2,3,4

inclusies bevatten korte tijd ontdekt

. Later werd het duiven herpesvirus over de gehele wereld in een relatief

2,3,4,11

.

Tegenwoordig draagt het duiven herpesvirus over de hele wereld de naam ‘PHV-1’ en het virus komt anno 2014 nog steeds wereldwijd voor. Er wordt algemeen aangenomen dat 1,2,3,5,6,11,12

minstens 50 tot zelfs 80% van alle duiven latent besmet is met PHV-1

.

Voor wat betreft het voorkomen van PHV-1 wordt er vaak een link gelegd tussen acute coryza en PHV-1. Zo kon men in België bij 82% van de duiven met acute coryza uit de farynx het PHV-1 isoleren. Ook kon men in 60% van de duivenbestanden, waarin permanent acute coryza heerste tegelijkertijd, PHV-1 aantonen

1,3,4

. Een significant onderscheid voor wat betreft

de gevoeligheid voor PHV-1 tussen postduiven en sierduiven kon niet gemaakt worden. Bij een onderzoek testte 58% van de postduiven en 56% van de sierduiven positief op PHV-1. 5

Leeftijd daarentegen is daarentegen wel een significante factor gebleken in het voorkomen 3,4

van PHV-1 bij duiven . Zo bleek uit een onderzoek waarbij in totaal 524 duiven (383 jongen en 141 oude duiven) werden getest op PHV-1 dat 47,4% van de jongen en maarliefst 71,6% 3

van de oude duiven antistoffen tegen PHV-1 bezaten .

De klinische vorm van herpesvirose bij duiven is echter eerder zeldzaam te noemen. Zo bleek uit een onderzoek van de Universiteit Gent dat herpesvirussen slechts in 0,2% van de duiven 5,6

die ter autopsie aangeboden worden verantwoordelijk is voor de klinische ziekte . De klinische ziekte kan in elk seizoen voorkomen, maar in de zomer lijkt de prevalentie hoger te liggen. Verder blijken geslacht en het ras waartoe de duiven behoren geen invloed te hebben 2

op het ontwikkelen van klinische ziekte na infectie met PHV-1 .

Voor wat betreft de morbiditeit en mortaliteit van klinische herpesvirose bij duiven is deze anders dan de latente vorm. In enzoötisch aangetaste hokken varieert de morbiditeit van 5 tot 3

50%. Op deze hokken sterft 10-15% van de dieren aan klinische herpesvirose . In de kweekperiode kunnen deze waarden nog hoger liggen, omdat er dan veel jongen aanwezig zijn op de hokken die meer gevoelig zijn aan het ontstaan van de klinische vorm van de 2,3

ziekte . De morbiditeit en mortaliteit liggen het hoogst bij duivenbestanden die voor het eerst in aanraking komen met het virus en wanneer het duivenbestand te maken heeft met ongunstige milieufactoren. Ongunstige milieufactoren zijn bijvoorbeeld slechte verzorging, slechte voeding, zware belasting door deelname aan wedvluchten of algemene verzwakking door een primaire aantasting van een ander pathogeen agens, bijvoorbeeld een 3

worminfestatie . Afhankelijk van de stam van PHV-1 waarmee een duivenbestand 2

geïnfecteerd wordt kan de mortaliteit oplopen tot wel 90% .

1.3. PATHOGENESE Het PHV-1 kan uitgescheiden worden door klinisch zieke of subklinisch geïnfecteerde 3

duiven . Evenwel is de belangrijkste factor in de verspreiding en pathogenese van PHV-1 in een duivenpopulatie de latent geïnfecteerde fractie van de desbetreffende duivenpopulatie. Deze zogenaamde dragers kunnen het virus intermitterend uitscheiden onder invloed van bepaalde factoren

1,2,3,5,6,11,12,13,14,15

.

Een eerste factor die een verhoogde uitscheiding van het virus tot gevolg heeft is stress. Dit is natuurlijk een heel breed begrip en kan verschillende oorzaken hebben. Zo is stress door het transport van duiven bij een verhoogde temperatuur een zeer belangrijke triggerende factor voor een verhoogde virusuitscheiding. Ook de kweekperiode kan een extra hoeveelheid stress geven, evenals een te dichte bezettingsgraad of luchtvochtigheid in het 5,6

hok .

6

De

tweede

factor

die

een

verhoogde

virusexcretie

tot

gevolg

kan

hebben

is

immunosuppressie. Duiven die een minder goed werkend immuunsysteem bezitten hebben een grotere

kans

2,5,6,11,12,15,16

ziekte

op verhoogde virusexcretie

en het ontwikkelen van klinische

. Zo zijn er in het verleden experimenten uitgevoerd waarbij duiven werden

behandeld met het chemotherapeuticum cyclophosphamide. Men stelde tijdens deze experimenten vast dat wanneer een duif met dit chemotherapeuticum behandeld werd, zijn bursa van Fabricius en thymus atrofiëerden en zelfs tekenen van degeneratie vertoonden. Om precies te zijn ontstaat er na behandeling met cyclophosphamide een deficiëntie aan Ben T-cellen. Na het stopzetten van deze therapie regeneren beide lymfoïede organen weer. Het valt hierbij op dat in deze lymfoïede organen het T-cel producerend weefsel sneller regenereert dan het B-cel producerend weefsel

11,15,16,17

. Overigens is het mechanisme

waarmee het cyclophosphamide de immunosuppressie veroorzaakt tot op heden nog niet 16

gekend .

De besmetting van een duif met PHV-1 gebeurt uitsluitend horizontaal. Zo wordt het virus onder andere uitgescheiden via de mest en kunnen duiven door kontakt met besmet 2,3

materiaal of aerosolen in het hok zelf geïnfecteerd worden . Een veel belangrijkere besmettingsroute is de overdracht van het virus van de ouders op hun jongen. De besmetting van de jongen gebeurt tijdens het azen en vaak al in de eerste paar dagen na het 1,2,3,5,11,14,18

uitkomen

.

Verticale transmissie lijkt in de overdracht van een PHV-1 infectie geen enkele rol te spelen. De overdracht van het virus vanuit de ouderdieren via het ei naar de jongen heeft men tot op heden nog niet aan kunnen tonen

1,2,11,14,15

. Ook is men er nog niet in geslaagd om het duiven

herpesvirus uit de genitale tractus van een duif te isoleren. Dit is dus een ondersteunend 15

argument om aan te nemen dat verticale transmissie van PHV-1 niet bestaat .

Wanneer het virus is opgenomen door de duif gaat het zich vestigen in de kern van de geïnfecteerde cel. Hier vindt de replicatie van het virus plaats. Vervolgens worden de 2

viruspartikels geassembleerd in de kern en het cytoplasma van de geïnfecteerde cel . De verspreiding doorheen het lichaam van de duif gebeurt door middel van cel-cel kontakt dat begint op de plaats waar het virus terecht komt als het wordt opgenomen. Meestal is dit de pharynx. Hiervandaan gaat het virus zich verspreiden naar de mucosae van het ademhalingsstelsel of het spijsverteringsstelsel

2,3,15

.

Wanneer het virus zich in het lichaam van de duif verspreidt via cel-cel kontakt, is het niet gevoelig aan eventuele hoge antistoftiters buiten de cel. Dit is zowel in vitro als in vivo aangetoond. Dit geeft tegelijkertijd een verklaring voor het feit dat hoge titers van antistoffen tegenover PHV-1 niet kunnen voorkomen dat een latent geïnfecteerde duif milde episodes van re-excretie van het virus vertoont en dat de frequentie van voorkomen van deze episodes

7

van re-excretie gelijk is aan de frequentie van diezelfde episodes van re-excretie bij duiven die geen antistoffen bezitten tegen PHV-1. Hieruit kan men concluderen dat de humorale immuniteit geen hoofdrol speelt in de controle van een PHV-1 infectie bij de duif

1,15

. Als het

virus gelokaliseerd is in het spijsverteringsstelsel is er een grote kans dat zich van hieruit een algemene viremie gaat ontwikkelen. Dit verklaart ook vaak de aantasting van de lever, de milt 15

en soms ook de hersenen .

Bij met PHV-1 geïnfecteerde duiven kan 24 uur na infectie de virusuitscheiding al beginnen. Deze virusuitscheiding kan 7 tot 10 dagen aanhouden. De incubatietijd van klinische herpesvirose varieert van 3 tot 7 dagen

1,2,3,16

.

Jonge duiven van 2 tot 10 weken zijn het gevoeligst voor het ontwikkelen van systemische en daardoor vaak ook klinische herpesvirose. Bij oudere duiven beperkt een infectie met PHV-1 zich vaak tot het ademhalingsstelsel, tenzij zij onder erge stress lijden of immunodeficient zijn 2,3,5,6,11,12

. Met name de jongen van ouderdieren die zelf geen latente drager zijn van PHV-1

hebben een grote kans op het ontwikkelen van klinische herpesvirose

2,5,6,11

. Volgens

sommige bronnen zou de gevoeligheid voor het ontwikkelen van klinische herpesvirose ook 3

gedeeltelijk erfelijk bepaald zijn . Jonge duiven van ouderdieren die latent besmet zijn met PHV-1 krijgen volgens verschillende bronnen antistoffen binnen via de ouderdieren. Dit gebeurt niet zoals aanvankelijk gedacht werd via de kropmelk, maar via de eidooier. De aanwezigheid van de antistoffen ten tijde van het uitkippen behoedt de jongen voor het ontwikkelen van klinische herpesvirose. Deze antistoffen beschermen de jongen de eerste 2 weken na het uitkomen en verdwijnen dan uit de duif. Dit wordt ook wel passieve immuniteit genoemd. De antistoffen voorkomen echter niet dat de jongen evenals hun ouders latente 1,2,11

dragers worden

.

1.4. SYMPTOMEN De acute vorm van herpesvirose bij duiven wordt gekenmerkt door een aantal symptomen. Een eerste symptoom is dat de oorspronkelijk krijtwitte neusdoppen van de duif verkleuren 1,3

naar een grijze tot soms zelfs grijsbruine kleur . Op deze neusdoppen kan zich in een verder stadium van de ziekte 1 tot 2 mm dik beleg vormen dat de neusdoppen geheel of gedeeltelijk 3

1

bedekt . Ook overmatig veel niezen kan duiden op een PHV-1 infectie .

Vaak is er bij een klinische manifestatie van herpesvirose ook een conjunctivitis aan 1 of beide ogen van de duif waar te nemen

1,2,3,4,11

. Dit kan gepaard gaan met het verstoppen van

de neusgaten met mucus of er kan eventueel een sereuze uitvloei vanuit de neusgaten te zien zijn

1,2,3

.

8

Figuur 3: Grijs-geel verkleuring van de neusdoppen bij een jonge duif met klinische herpesvirose (uit Marlier D. & Vindevogel H., 2006)

Wanneer er een secundaire bacteriële infectie in combinatie met een primaire infestatie van het herpesvirus plaatsvindt, kan de gehele respiratoire tractus bij het ziektebeeld betrokken raken. De oorspronkelijke PHV-1 infectie wordt dan voornamelijk gekenmerkt door typische ademhalingssymptomen

1,2,4,16,19

.

Zoals eerder in deze studie beschreven zijn jongen van ouderdieren die niet latent besmet zijn met PHV-1 het meest gevoelig aan het ontwikkelen van klinische herpesvirose. Vooral bij een leeftijd van 2-10 weken. Bij deze jongen die geen maternale antistoffen bezitten zal de infectie in zeer korte tijd ontwikkelen tot veralgemeende infectie met ernstige hepatitis met vaak acute sterfte binnen enkele dagen

1,2,5,6

.

De veralgemeende symptomen van klinische herpesvirose bestaat onder andere uit apathie, depressie, anorexie, dehydratatie en vaak is er door de algemene verzwakking een 2,3

onmogelijkheid tot vliegen bij de aangetaste duiven . Veelal is er bij een veralgemeende 3,12

herpesvirose ook uitscheiding van vieze donkergroene en slijmerige mest waar te nemen

.

Afhankelijk van de stam van het PHV-1 waarmee de duiven geïnfecteerd worden kan het virus zich gaan lokaliseren in de hersenen van een duif, welke op zijn beurt neurologische symptomen kan gaan veroorzaken zoals torticollis of instabliteit

12,15,19

.

Bij oudere duiven met een normale immuniteitsstatus gaat een herpesvirusinfectie vaak gepaard met coryza of ornithose. Dit is een veelvuldig voorkomend en typisch verschijnsel

4,5,6

.

9

1.5. LETSELS Klinische herpesvirose bij duiven kent een groot aantal letsels, waarvan sommige zeer specifiek zijn voor een infectie met PHV-1. Soms zijn er slechts milde letsels waar te nemen 1

zoals enkel laryngeale congestie . Ook is er soms algemene stuwing van het gehele 2

orgaanpakket met uitzetting van de galblaas .

In acute gevallen zijn er vaak focale necrose en kleine ulceraties te zien ter hoogte van de bek, de pharynx en de larynx. Soms zijn deze ook te zien op de mucosa van de kliermaag en in de trachea liggen

4,5,6,11,19

1,2,3

. Over deze letsels kan eventueel een geelachtig difteroïd beleg heen

. In sommige gevallen ontwikkelt de duif ook sinusitis, pericarditis of 1,2

aerosacculitis .

Figuur 4: Difteroïde faryngitis met necrose bij een duif met klinische herpesvirose (uit Marlier D. & Vindevogel H., 2006)

Typische letsels bij een uitbraak van klinische herpesvirose bij duiven zijn de focale necrosehaardjes in de lever, de milt, de pancreas en de nieren

2,3,4,5,6,8,12,19

. Deze focale

necrosehaardjes kunnen volgens sommige bronnen ook voorkomen ter hoogte van de luchtzakken, de speekselklieren en de longen

3,6,8

. In de focale necrosehaardjes in de lever,

de nieren, de pharynx en de larynx zijn intracellulaire en intranucleaire eosinofiele inclusielichaampjes te zien

2,3,4,5,8,12,19

. De inclusielichaampjes die te zien zijn bij klinische 6

herpesvirose zijn kleiner dan de inclusielichaampjes die men ziet bij een adenovirusinfectie . Verder is er aan de randen van de focale necrosehaardjes vaak een vergrote leucocytische 2,3

activiteit waar te nemen .

10

Figuur 5: Intranucleaire inclusielichaampjes in de lever van een duif met herpesvirose (uit Cornwell H.J.C. & Wright N.G.,1970).

Ook kunnen er hersenletsels ontstaan wanneer men te maken heeft met bepaalde stammen van PHV-1. Er is een mononucleaire infiltratie en perivasculaire cuffing, maar ook een verlies van Purkinje-cellen en een stapeling van mononucleaire cellen in het cerebellum komen voor

2,3,15,19

19

. De letsels kunnen zelfs uitbreiden tot een erge meningo-encephalitis .

1.6. DIAGNOSE Herpesvirose bij duiven kan op verschillende manieren gediagnosticeerd worden. Een eerste methode om herpesvirose te diagnosticeren is, na autopsie, aan de hand van de 1,2,3,4,6,20

verschillende letsels die door het herpesvirus veroorzaakt worden

. Ook typische

histologische letsels zoals intranucleaire inclusielichaampjes in de cellen, behorende tot de letsels die herpesvirose veroorzaakt, kunnen meehelpen de diagnose van herpesvirose te 1,2,5,6

bevestigen

. Voor wat betreft het stellen van de diagnose ‘herpesvirose’ aan de hand van

alleen de symptomen is dat niet betrouwbaar, omdat de meeste symptomen die waarneembaar zijn tijdens klinisch herpesvirose niet pathognomisch zijn. Wel kunnen de symptomen in combinatie met een andere diagnostische methode gebruikt worden om de 1,2

diagnose te stellen . Een van de meest gebruikte methodes voor het stellen van de diagnose ‘herpesvirose’ bij duiven is de inoculatie weefselsuspensies of swabs van mogelijk geïnfecteerde duiven in geëmbryoneerde SPF kippeneieren. Deze inoculatie gebeurt meer specifiek op de chorioallantoïdale membraan van het embryo

1,3,4,5,21

. Wanneer deze test positief is ontstaan er al na

een paar dagen plaques op de chorio-allantoïdale membraan van het geïnoculeerde ei

5,21

.

11

Figuur 6: Intranuclaire inclusielichaampjes op de chorio-allantoïdale membraan van een kippenembryo na inoculatie van PHV-1 in een SPF-kippenei (uit Cornwell H.J.C. & Wright N.G., 1970).

Tegenwoordig wordt voor het aantonen van PHV-1 in swabs of andere stalen ook PCR gebruikt. Dit kan echter alleen in gespecialiseerde laboratoria gebeuren. Daarbij komt dat deze techniek totaal geen onderscheid kan maken tussen klinische en subklinische 1

herpesvirose .

Volgens sommige bronnen kan serologisch onderzoek naar de aanwezigheid van antistoffen 3

in het bloed van de duiven tegen het PHV-1 ook een diagnostische methode zijn . Andere bronnen spreken dit echter tegen met de beargumentering dat de aanwezigheid van antistoffen tegenover PHV-1 in het bloed van een duif niet bevestigt dat deze duif lijdt aan klinische herpesvirose. Daarbij komt ook nog dat uit onderzoek is gebleken dat ruim 50% van 5

alle duiven serologisch positief test op de aanwezigheid van antistoffen tegenover PHV-1 .

Bij het vaststellen van de uiteindelijke diagnose van herpesvirose bij duiven zou men de duiven best ook parasitologisch op Trichomonas columbae testen, maar ook een bacteriologisch onderzoek naar de aanwezigheid van

Staphylococcus intermedius,

Pasteurella multocida en Escherichia coli is aangewezen bij het stellen van de diagnose. Deze bijkomende onderzoeken voert men uit, omdat duivenbestanden die primair lijden aan klinische herpesvirose vaak ook secundair aangetast zijn met bovengenoemde agentia. Het is dan van belang om het duivenbestand niet alleen te behandelen tegen de klinische herpesvirose maar ook zeker een behandeling in te stellen tegen de secundair pathogene 1

agentia indien deze uit de duiven geïsoleerd kunnen worden .

12

1.7. DIFFERENTIAALDIAGNOSE Om een goed overzicht van de verschillende differentiaaldiagnoses te bekomen zullen in dit hoofdstuk de differentiaaldiagnoses per hoofdstuk besproken worden:

Tijdens de kweekperiode kan een uitbraak van herpesvirose in een duivenbestand acute sterfte

van

nestjongen

met

zich

meebrengen.

Dit

moet

differentiaaldiagnostisch

onderscheiden worden van een uitbraak van paramyxovirose, salmonellose, S. gallolyticus, 5,6

E. coli, trichomoniasis en hexamitiasis .

De difteroïde letsels in de bek moeten differentiaaldiagnostisch onderscheiden worden van een infectie met het poxvirus

1,3,5,6

. Ook trichomoniasis en een infestatie met Candida albicans 5,6

behoren tot de differentiaaldiagnose van de difteroïde letsels . De difteroïde letsels die men bij een klinische PHV-1 ziet, zijn eerder pseudomembraneus en minder invasief dan de 1

difteroïde letsels die het poxvirus doorgaans in de bek van de duif veroorzaakt . Ook mag men de difteroïde letsels die te zien zijn bij klinische herpesvirose niet verwarren met sialolieten die te zien zijn als kleine witte stipjes achter in de bek van de duif. Hun etiologie is tot op heden ongekend. Zij worden vaak geassocieerd met verminderde vliegprestaties van 6

duiven .

De neurologische verschijnselen en dan met name de meningo-encephalitis die soms te zien is bij duiven, die lijden aan klinische herpesvirose, moeten differentiaaldiagnostisch onderscheiden worden van de neurologische verschijnselen die zich voor kunnen doen bij 2

een besmetting met het paramyxovirus of Salmonella spp .

Het gehele klinische beeld dat soms te zien is wanneer een duif lijdt aan klinische 3

herpesvirose wordt soms verward met ornithose .

1.8. THERAPIE Er bestaat nog geen doeltreffende therapie om duiven die geïnfecteerd zijn met PHV-1 van dit virus te ontdoen

2,5,6,22

. In het verleden zijn er een aantal hoopgevende experimenten met

onder andere trisodium phosphonoformate uitgevoerd. Deze stof zou een belangrijk antiviraal effect bezitten, omdat trisodium phosphonoformate het door PHV-1 geïnduceerde DNA22

polymerase zou inhiberen en zo de replicatie van PHV-1 stil zou leggen .

Er werd onder andere een experiment uitgevoerd waarbij vijf verschillende stammen van het PHV-1 in vitro werden onderworpen aan een behandeling met trisodium phosphonoformate in verschillende dosissen. De gevoeligheid van iedere stam van PHV-1, aan een behandeling met trisodium phosphonoformate, werd gemeten door de grootte van de plaques die het PHV-1 in vitro vormde in de aanwezigheid van trisodium phosphonoformate. Uit de resultaten bleek duidelijk dat alle vijf de stammen van PHV-1 die gebruikt werden in dit experiment 13

gevoelig waren aan een behandeling met trisodium phosphonoformate. De gevoeligheid voor deze stof verschilde wel significant per stam van PHV-1, maar natuurlijke resistentie van het virus tegenover trisodium phosphonoformate werd niet vastgesteld. Het minst gevoelig aan een behandeling met trisodium phosphonoformate bleken de stammen van PHV-1 afkomstig 23

van verschillende psitacciformes .

Toen men het gebruik van trisodium phosphonoformate verder ging testen op levende dieren werd al snel duidelijk dat deze stof niet aangewezen is voor de bestrijding van PHV-1 bij duiven

1,22

. Zo bleek uit een experiment van Vindevogel et al. (1982) dat, wanneer trisodium

phosphonoformate intramusculair werd ingespoten bij klinisch gezonde duiven, men het ontstaan van een klassieke klinische herpesvirose niet kon voorkomen. Ook kon men met deze behandeling de excretie van het virus niet verminderen of het ontstaan van dragers voorkomen. Men veronderstelde na dit experiment dat de geringe distributie van het product doorheen het lichaam van de duif aan de basis lag van de verminderde werkzaamheid van trisodium phosphonoformate in vivo ten opzichte van de werkzaamheid van dezelfde stof in 22

vitro .

Een ander middel wat in het verleden getest werd op zijn activiteit tegenover PHV-1 is acyclovir. In vitro werden onder andere plaques van PHV-1 blootgesteld aan verschillende concentraties van acyclovir. Uit de resultaten van deze tests bleek dat acyclovir een duidelijke vermindering van de grootte van de plaques tot gevolg had wanneer deze werden blootgesteld aan acyclovir. De resultaten van de tests in vivo waren minder bevredigend. Voor de in vivo tests gebruikte men duiven en grasparkieten die men experimenteel infecteerde met PHV-1. Intramusculaire injecties met acyclovir aan een dosis van 100 mg/kg/dag konden bij beide soorten het optreden van klinische ziekte niet voorkomen. Ook de virusexcretie van de geïnfecteerde vogels werd niet verminderd door de behandeling met 24

acyclovir .

Ondanks dat er geen werkzame stof tegen PHV-1 op de markt is, kan men wel een aantal maatregelen treffen om de kans op een veralgemeende uitbraak van klinische herpesvirose in een duivenbestand tegen te gaan. Ten eerste isoleert men de zieke duiven best, zodat zij als zeer voorname kiemuitscheiders minder snel de andere duiven zullen belasten met een hogere infectiedruk. Indien de reeds aangetaste duiven niet van grote waarde zijn of een zeer slechte prognose van overleven hebben ruimt men deze duiven beter op. Men kan daarnaast ook proberen de natuurlijke weerstand van de duiven te verhogen. Dit kan men doen door middel van het verstrekken van een uitgebalanceerd voeder en het toedienen van multivitaminepreparaten. Ook is het belangrijk om de natuurlijke weerstand van de duiven niet te onderdrukken. Dit gebeurt vaak wanneer er bepaalde stressoren zoals vervoer, tentoonstellingen of wedvluchten plaatsvinden. Het is dan ook beter wanneer er een uitbraak

14

van klinische herpesvirose in een duivenbestand heeft plaatsgevonden dit bestand tijdelijk 3

niet deel te laten nemen aan tentoonstellingen en wedvluchten .

1.9. PROGNOSE De prognose van een klinische herpesvirusinfectie is afhankelijk van de stam van PHV-1 waarmee de duif geïnfecteerd is. De mortaliteit na infectie met bepaalde stammen van PHV-1 kan oplopen tot wel 90%, voornamelijk bij stammen die de hersenen aantasten kan de mortaliteit erg hoog oplopen. Duiven, die een klinische herpesvirose overleven, herstellen vaak langzaam en kunnen levenslang nadelen ondervinden van hun ziekte. Zo is er vaak een permanent verminderde vruchtbaarheid en zullen ook de vluchtprestaties veelal van minder 3

niveau zijn na het doormaken van een klinische herpesvirose .

1.10. PREVENTIE Het is voorwat betreft herpesvirose zo dat er op dit moment geen commercieel vaccin op de 1,13

markt beschikbaar is welke de duif kan behoeden voor een infectie met PHV-1

. In het

verleden zijn er verschillende vaccins tegen herpesvirose ontwikkeld. Zo is er een experiment uitgevoerd waarin zowel een geattenueerd als een geïnactiveerd vaccin werden uitgetest. Beide vaccins waren in staat om de primaire virusexcretie na ‘challenge’ te onderdrukken. Ook waren de klinische symptomen bij de gevaccineerde duiven minder uitgesproken dan bij een controlegroep na dezelfde ‘challenge’

1,13

.

Nadeel van het geattenueerde vaccin was dat het mild pathogeen bleek te zijn voor duiven. PHV-1 vrije duiven die na vaccinatie met het geattenueerd vaccin een immunosuppressieve behandeling met cyclofosphosphamide ondergingen vertoonden na enige tijd uitscheiding van het virus. Een ander nadeel van deze twee geteste vaccins was dat zij beiden niet konden voorkomen dat gevaccineerde duiven na infectie met PHV-1 toch nog drager van het virus werden

1,13

.

Ondanks dat het vaccineren tegen het PHV-1 geen bescherming geeft tegen de infectie met PHV-1 en het ontstaan van dragers van PHV-1 is het geïnactiveerde vaccin wel goed te gebruiken bij de preventie van het ontstaan van klinische herpesvirose. Zo kan men best de duiven waarmee gefokt gaat worden voor aanvang van de kweek hyperimmuniseren door ze te vaccineren met het geïnactiveerd vaccin. Men gebruikt een geïnactiveerd vaccin omdat deze geen excretie van het virus geeft en omdat een duif na vaccinatie met het dit vaccin een betere seroconversie vertoont in vergelijking met een geattenueerd vaccin. Door deze hyperimmunisatie zullen de jongen op het moment dat zijn geïnfecteerd worden met het PHV1, meestal enkele dagen na het uitkippen, optimaal beschermd zijn tegen dit virus. Op deze 13

manier verkleint men de kans op een uitbraak van klinische herpesvirose .

15

Een andere maatregel die men kan nemen is het uitselecteren van duiven of koppels die een verhoogde gevoeligheid vertonen voor PHV-1. Het is beter niet met deze duiven te fokken om een zo hoog mogelijke natuurlijke weerstand van het duivenbestand tegen klinische herpesvirose op te bouwen. Ook is het van groot belang om de duiven in een hygiënische omgeving te houden en een volwaardig voeder te verstrekken. Ook het beperken van stresserende factoren die de natuurlijke weerstand kunnen onderdrukken behoort tot de 3

preventie van klinische herpesvirose .

2. MYCOPLASMA BIJ DUIVEN 2.1. ETIOLOGIE 2.1.1. Oorzakelijk agens Mycoplasmose wordt veroorzaakt door kleine pleomorfe bacteriën, ook wel mycoplasma’s genoemd

25,26

. Ze groeien evenals andere bacteriën ook goed op een artificiële 25

voedingsbodem . Het grote verschil tussen een Mycoplasma en andere bacteriën is dat bacteriën een celwand hebben en hierdoor als het ware altijd een zelfde uiterlijke vorm hebben, maar mycoplasma’s hebben daarentegen geen celwand. Door het ontbreken van de celwand bij mycoplasma’s kan dit organisme een wisselende vorm aannemen. Het is dus een pleomorf organisme

25,26

.

Mycoplasma’s behoren tot de klasse van de Schizomyceten, de orde van de Eubacteriales, de familie van de Mycoplasmataceae, welke op hun beurt onderverdeeld zijn in de genera Mycoplasma, Acheloplasma en Ureoplasma

25,26

. Er zijn in de loop der tijd wereldwijd meer

dan zeventig verschillende soorten mycoplasma’s ontdekt, waarvan er ongeveer twintig bij 26

vogels kunnen voorkomen . 2.1.2. Eigenschappen van een Mycoplasma Zoals eerder vermeld hebben mycoplasma’s geen vaste celwand. Ze hebben enkel een lipoproteinemembraan drie voor een pleomorf uitzicht zorgt

25,26

. Zo kunnen mycoplasma’s

waargenomen worden als kok-achtige vormen, maar ook als nesten van staafjes of met 24

flagellen . Het zijn de kleinste vrijlevende organismen op aarde. Uit onderzoek is gebleken 25

dat mycoplasma’s zelfs filters met een diameter van 150 micrometer kunnen passeren . De grootte van deze organismen is zeer moeilijk te meten door hun grote vervormbaarheid, maar wordt geschat op 0,3 – 1,0 micrometer

25,26

.

Mycoplasma’s groeien op speciaal daarvoor samengestelde vaste media. Zij vormen hierop kleine translucente kolonies die niet zelden alleen met een vergrootglas waargenomen kunnen worden. De kolonies van Mycoplasma columbinum hebben microscopisch een zeer kenmerkend ‘spiegelei-uitzicht’ waarbij er centraal een verdikte zone waar te nemen is door

16

de hogere intensiteit van vermenigvuldiging op deze plaats. Wanneer men mycoplasma’s kweekt op een voedingsbodem die 20% paardenserum bevat vormen de kolonies het 25

typische beeld van ‘film and spots’ .

Figuur 7: Het typische 'spielgelei-uitzicht' dat men verkrijgt wanneer men Mycoplasma columborale opkweekt in een medium verrijkt met 20% paardenserum (uit Shimizu et al., 1978)

Ook op het vlak van de reproductie verschillen mycoplasma’s van andere bacteriën die wel een celwand hebben. Het lijkt erop dat bepaalde delen van een moedercel, die DNAcomponenten bevatten, afgesnoerd worden en in staat zijn te overleven en tot een nieuwe 25

Mycoplasma uit te groeien . 2.1.3. Gastheerspecificiteit Zoals eerder beschreven zijn er bij vogels reeds meer dan 20, volgens sommige auteurs zelfs meer dan 40, verschillende soorten mycoplasma’s beschreven. Er zijn in de literatuur 3 soorten mycoplasma’s beschreven die tot op heden ook alleen bij duiven waargenomen zijn, namelijk Mycoplasma columbinum, M. columborale en M. columbinasale. M. columbinasale werd vroeger ook wel aangeduid als het ‘L-serotype’. Deze drie species zijn zeer gastheerspecifiek. Ze komen dan ook niet bij een andere diersoort dan de duif voor

25,26,27,28,29,30,31,32

.

Verder zouden duiven, volgens sommige bronnen, symptoomloze dragers kunnen zijn van 26

Mycoplasma meleagridis die vooral bij kalkoenen voor problemen kan zorgen . Andere 30

bronnen beweren dat M.meleagridis enkel bij de kalkoen voorkomt . Hoewel een duif bij besmetting met deze species van Mycoplasma geen symptomen zou ontwikkelen wordt mycoplasmose

bij

kalkoenen,

veroorzaakt

door

M.meleagridis,

gekenmerkt

door

26

conjunctivitis, rhinitis, tracheïtis en fibrineuze aerosacculitis .

17

2.2. EPIDEMIOLOGIE

Mycoplasma’s bij duiven werden voor het eerst aangetoond in Amerika in 1953 door Winterfield. Hij toonde de mycoplasma’s aan door inoculatie van een suspensie van geïnfecteerd materiaal op kippenembryo’s. In Europa waren het Schrag et al. die in 1974 in 25

West-Duitsland voor het eerst duifspecifieke mycoplasma’s rapporteerden . Heden ten dage zijn

mycoplasma’s

onderzoekers

over

25,26,27,28,29,30,31,32

de

gehele

wereld

vastgesteld

door

tal

van

.

De prevalentie van mycoplasma’s bij duiven is hoog. Zelfs zo hoog dat bijna elk duivenbestand ter wereld wel eens geïnfecteerd is geweest met mycoplasma’s. Shimuzu stelde, in een onderzoek waarbij 262 duiven onderzocht werden op de aanwezigheid van mycoplasma’s, vast dat bij 68,7% van de onderzochte duiven mycoplasma’s aanwezig 24

waren . In een ander onderzoek dat Shimizu uitvoerde, waarbij hij in totaal meer dan 850 vogels onderzocht op de aanwezigheid van mycoplasma’s, vond hij meer dan 40 verschillende soorten mycoplasma’s. Voor wat betreft de 3 soorten die bij duiven voorkomen stelde hij vast dat 43% van de gevonden mycoplasma’s behoorde tot de species M.columbinum, 55% tot M. columborale en 2% behoorde tot een toen nog onbekende species van Mycoplasma

25,26

. Later werd dit onbekende species, vroeger aangeduid als het

‘L-serotype’, M. columbinasale genoemd

28,31

. De hiervoor genoemde Mycoplasma sp. komen

alleen bij duiven voor. Een enkele keer werden 2 verschillende soorten mycoplasma’s in één duif geïsoleerd. Het betrof in deze gevallen een infectie met M. columbinum en M. 25

columborale .

Mycoplasma’s komen op een aantal specifieke plaatsen in de duif voor. Zo zijn er bij duiven reeds mycoplasma’s geïsoleerd uit de oropharynx, de turbinale sinussen en het tracheaal exsudaat

25,26,27,30

. Maar ook uit de longen, hersenen en de luchtzakken zijn in het verleden al

mycoplasma’s geïsoleerd. Men heeft in het verleden ook dikwijls geprobeerd mycoplasma’s uit cloacale swabs te isoleren, maar men heeft hierin nog nooit mycoplasma’s weten aan te tonen. Ook uit de genitale tractus heeft men getracht mycoplasma’s te isoleren maar ook hieruit is dit nog nooit gelukt

25,30

.

Een infectie met mycoplasma’s is niet seizoensgebonden. Evenals het jaargetijde hebben de leeftijd en het geslacht van de duif geen enkele invloed op de gevoeligheid van de duif voor een infectie met mycoplasma’s. Ook het ras heeft geen invloed op de gevoeligheid van de 25

duif voor Mycoplasma-infecties . De incubatieperiode voor een infectie met mycoplasma’s is moeilijk vast te stellen. Dit komt 25

door het feit dat er zelden klinische ziekte optreedt na een infectie met Mycoplasma sp. .

18

Volgens sommige bronnen zouden mycoplasma’s zelfs volledig apathogeen zijn voor duiven. Mycoplasma-infecties bij duiven zijn dan ook vaak latent aanwezig in een duivenbestand

25,26

.

Uit de huidige documentatie is niet op te maken of duiven klinische mycoplasmose kunnen ontwikkelen wanneer zij enkel geïnfecteerd worden met Mycoplasma columbinum, M. 25

columborale of M. columbinasale . Wel is bekend dat mycoplasma’s vaak als secundaire pathogenen aanwezig zijn bij infecties met PHV-1 en infecties met Chlamydophila 25,26

psitacci

.

Klinische ziekte wordt volgens sommige auteurs ook in de hand gewerkt door de invloed die bepaalde stressoren op de duif hebben. In de literatuur worden stressoren zoals Eschericha coli-infecties, infecties met Haemoproteus spp., overbevolking, slechte hygiene, hoge concentraties aan ammonia, koud of nat weer en uitputting door lange races genoemd. Ondanks deze grote hoeveelheid mogelijke stressoren wordt klinische ziekte niet vaak 25

gezien .

Voor wat betreft de morbiditeit van mycoplasma-infecties variëren de percentages volgens de verschillende bronnen in de literatuur van 10% to 100%. Tevens is de mortaliteit net als de morbiditeit van een infectie met Mycoplasma sp. moeilijk na te gaan. Het is namelijk moeilijk vast te stellen of dode duiven die mycoplasma’s bij zich dragen daadwerkelijk gestorven zijn aan mycoplasmose daar er altijd nog andere infectieuze agentia aanwezig zijn

25,26

.

Voor wat betreft de opbouw van immuniteit bij een Mycoplasma-infectie is vrij weinig bekend. De verschillende auteurs zijn het op dit vlak niet geheel met elkaar eens. Keymer et al. (1984) beweerden dat er seroconversie optreedt na infectie

25,27

. Maar Gerlach (1978) stelde vast dat

seroconversie na een infectie met Mycoplasma’s lang niet altijd plaatsvindt en dus helemaal 25

niet zo vanzelfsprekend is . In hun onderzoeken observeerden zij duiven die 5 maanden na 26

een experimentele infectie met mycoplasma’s nog steeds geen seroconversie vertoonden .

2.3. PATHOGENESE

De pathogenese van een Mycoplasma-infectie bij duiven start met het opnemen van het infectieus agens door de duif. Mycoplasma’s kunnen het lichaam van de duif binnentreden via 25

de bek, de neusopeningen en de ogen . Opname door inademing van mycoplasma’s is mogelijk, omdat ze zich kunnen bevinden op de kleinste stofdeeltjes en op deze manier met de lucht mee naar binnen gezogen worden. Hierdoor is er tevens een aerogene spreiding van 26

mycoplasma’s mogelijk . Ook ander indirect kontakt zoals gecontamineerde hokken en 25

materiaal kunnen de transmissie van een Mycoplasma-infectie tot stand brengen .

19

Een andere manier van overdracht is via direct kontakt tussen twee duiven. Direct kontakt tussen twee duiven kan ten eerste plaatsvinden wanneer de duiven elkaar liefkozen. Een ander voorbeeld van direct kontakt tussen twee duiven is de ouder die zijn of haar jong voedert. Mycoplasma’s kunnen via de kropmelk van de ouderduiven, bij het azen, 26

overgedragen worden op de jongen . Tevens is verticale transmissie van mycoplasma’s via het ei mogelijk. Verschillende auteurs hebben dit door middel van onderzoek bevestigd

25,26

. De incubatietijd van een Mycoplasma26

infectie is, ondanks dat deze moeilijk te bepalen is, volgens sommige auteurs zeer lang .

2.4. SYMPTOMEN

Een klinische vorm van mycoplasmose zoals die bij kippen en kalkoenen voorkomt, waarbij mycoplasma’s als primaire pathogenen worden bestempeld, komt volgens sommige bronnen niet voor bij duiven

26,29

. De situatie bij duiven is vaak complexer. Zo zijn er vaak primaire

pathogenen die de duiven aantasten, waarbij mycoplasma’s in dit geval vaak secundaire pathogenen

zijn. Zo

zouden

mycoplasma’s

vaak

synergistisch

zijn met primaire

ziekteverwekkers zoals Chlamydia psitacci en het duivenherpesvirus (PHV-1). Het is in deze gevallen moeilijk te bepalen of de aanwezige symptomen veroorzaakt worden door de 26

mycoplasma’s of door de primaire pathogenen .

Figuur 8: Foto van een duif met erge conjunctivitis waarbij uit de letsels ook Mycoplasma columborale werd geïsoleerd (uit Loria G.R. et al., 2005)

Zo werden tijdens een uitbraak van ziekte bij nestjongen in een duivenbestand in Hongarije zowel circovirus, Salmonella Typhimurium en Mycoplasma columbinasale teruggevonden. Deze jongen vertoonden een vertraagde groei, diarree en zenuwsymptomen. De morbiditeit 20

bij deze uitbraak bedroeg 60% van de jongen waarvan uiteindelijk 80% stierf. Ook het 31

percentage onbevruchte eieren, dat normaal rond de 5% ligt, was verhoogd tot 20% .

Volgens Gerlach (1977,1978) kunnen door Mycoplasma beschadigde weefsels makkelijker gekoloniseerd worden door andere pathogenen, welke deze weefsel nog verder aan zullen 26

tasten . Volgens sommige auteurs kunnen duiven wel lijden aan klinische ‘mycoplasmose’. De symptomen van een klinische ‘mycoplasmose’ bij duiven zouden ademhalingsproblemen, conjunctivitis, rhinitis en donker verkleurde neusdoppen zijn

25,26,27,28,29,33

symptomen zoals rochelen, hoesten en niezen veroorzaken

. Dit kan weer andere

25,33

. Ook een gestuwde en meer

rode mucosa van de trachea en de choanespleet zouden veroorzaakt kunnen worden door een infectie met mycoplasma’s. Tevens zou een meer dan normale hoeveelheid seromuceus slijm ter hoogte van de choanespleet ook kunnen duiden op de aanwezigheid van 26

mycoplasma’s in de duif . Wanneer een duif wel met mycoplasma’s geïnfecteerd is, maar verder geen symptomen vertoont, wordt hij een asymptomatische drager genoemd. Duiven kunnen levenslang drager blijven van mycoplasma’s maar vertonen verder geen klinische ziekte

25,26

.

2.5. LETSELS Bij autopsie kan men bij duiven, die geïnfecteerd zijn geweest met mycoplasma’s, onder 25

andere variërende hoeveelheden slijm in de respiratoire tractus terug vinden . Vaak zijn er kleinschalige weefselreacties met infiltratie van mononucleaire cellen en oedeem van het 27

subepitheliaal weefsel te zien . Ook kan er een enkele keer vertroebeling van de luchtzakken waargenomen worden met eventueel een geelachtig beleg. Tevens kunnen de drainerende 26

lymfeknopen van het ademhalingsstelsel ook sterk vergroot zijn . Verder zijn er bij 25

seropositieve dieren vrijwel nooit andere letsels terug te vinden .

2.6. DIAGNOSE Aangezien mycoplasma’s niet altijd duidelijke letsels veroorzaken bij duiven is het bij het stellen van de diagnose van belang dat men het organisme aan kan tonen. Het aantonen van de aanwezigheid van mycoplasma’s kan door middel van het nemen van een swab uit de choanespleet, de trachea, de longen of de luchtzakken

25,27,31

. Het materiaal van de swab

brengt men vervolgens over op een speciaal Mycoplasma-groeimedium. Dit zijn speciaal voor de groei van Mycoplasma aangerijkte media om mycoplasma’s te kunnen cultiveren

25,31

.

Deze aanrijking gebeurt vaak met gistcomponenten en serum, bijvoorbeeld 20%

21

paardenserum. Swab-culturen worden vaak van een bouillon naar een agar-medium 25

overgeënt na een incubatieperiode van 1-3 dagen bij 37ºC .

Ook het remmen van andere organismen tijdens het cultiveren is nodig om overgroei van het medium tegen te gaan. Om bacteriële overgroei tijdens het incuberen tegen te gaan, worden 25

vaak penicilline en thalliumacetaat gebruikt .

Wanneer een cultuur positief test op Mycoplasma zijn er kleine translucente kolonies gevormd die enkel met een vergrootglas waar te nemen zijn. M. columborale-kolonies hebben een karakteristiek ‘spiegelei-uitzicht’ waarbij centraal een verdikte zone van vermeerdering te zien is. Wanneer men 20%-paardenserum gebruikt vormen kolonies van M. 25

columbinum het karakteristieke uitzicht van ‘film and spots’ .

Figuur 9: Typisch beeld van 'film and spots' dat men verkrijgt na het opkweken van Mycoplasma columbinum op een medium dat verrijkt is met 20% paardenserum (uit Shimizu et al., 1978)

Een tweede methode om mycoplasma’s te cultiveren is door middel van inoculatie van embryo’s of vogels. Bij deze methode wordt tracheaal exsudaat in bouillon behandeld met penicilline (10.000 units/ml), omdat men dan de mogelijke bacteriële overgroei onder controle kan houden. Dit is nodig omdat het exsudaat bij kamertemperatuur bewaard dient te worden vooraleer het geïnoculeerd wordt in de dooierzak van 7 dagen geïncubeerde SPF-eieren. Na een verdere incubatie van 5 of 6 dagen kan men de mycoplasma’s uit de respiratoire tractus van het embryo isoleren. Bij deze methode kan men ook kuikens of in het geval van 25

duifspecifieke mycoplasma’s ook jonge duiven inoculeren .

22

Tegenwoordig wordt ook vaak de PCR-techniek gebruikt om het DNA van mycoplasma’s in swabs te detecteren. Door middel van het aantonen van het DNA van de duifspecifieke 31

mycoplasma’s kan men bepalen of het organisme wel of niet aanwezig is in de duif .

Serologisch onderzoek kan bij het stellen van de diagnose van mycoplasmose niet gebruikt worden omdat vele geïnfecteerde duiven geen seroconversie tegenover de antigenen van mycoplasma’s vertonen. Tevens kan men de antigenen die gebruikt worden voor het aantonen van mycoplasma’s bij kippen en kalkoenen niet gebruiken voor de diagnose van mycoplasmose bij duiven omwille van het verschil in diersoortspecificiteit tussen de 26

verschillende mycoplasma’s .

2.7. DIFFERENTIAALDIAGNOSE Tot de differentiaaldiagnose van ‘mycoplasmose’ bij duiven kan men alle ziekten rekenen die met luchtwegklachten verbonden zijn. Zo worden de klinische verschijnselen die optreden bij een infectie met herpesvirose vaak geassocieerd met mycoplasmose ook infecties met C. psitacci tot deze differentiaaldiagnose

25,26,27

26,27

. Verder behoren

. Evenals Bordetella spp. en

Haemophilus spp.. Als laatste kan men ook nog de mucosale vorm van duivenpokken en eventueel ook aspergillose tot deze differentiaaldiagnose rekenen

26,27

.

Volgens andere auteurs behoren ook vitamine A. deficiëntie, E-coli infecties en paramyxovirus-infecties tot de differentiaaldiagnose van een infectie met mycoplasma’s

26,27

.

2.8. THERAPIE Er is tot op heden nog geen middel gevonden dat effectief mycoplasma’s uit het lichaam van de duif kan eradiceren. In de loop der jaren zijn er veel middelen uitgetest met als doel mycoplasma’s geheel uit de duiven te doen verdwijnen. Ondanks dat dit doel heden ten dage nog niet bereikt is, heeft men inmiddels wel een aantal middelen gevonden om mycoplasma’s 25

te onderdrukken en de uitscheiding ervan enigszins te verminderen . Een eerste product die men gebruikt om mycoplasma’s te onderdrukken is lincomycine

25,27

.

Deze stof werd door Keymer et al. (1984) gebruikt op een hok waar Mycoplasma-achtige verschijnselen

voor

kwamen. De duiven reageerden

op

de behandeling en de

27

ademhalingsproblemen bleven voor langere tijd onder controle .

Een tweede product die in het verleden al mycoplasma’s is tiamuline-OH-fumaraat

ingezet werd voor de bestrijding van

25,27

. Overigens wordt de werkzaamheid van dit 27

product door sommige bronnen in twijfel getrokken .

23

Een ander product dat vaak wordt aangewend voor de behandeling van ‘mycoplasmose’ bij duiven is spiramycine

25,27

. Spiramycine werd door Keymer et al. (1984) op twee verschillende

hokken ingezet om Mycoplasma-infecties te onderdrukken. In een eerste hok waar in eerste instantie tiamuline-OH-fumaraat niet werkzaam was, bleek de behandeling met spiramycine wel effectief want na deze tweede behandeling was men gedurende de navolgende anderhalf jaar niet meer in staat om mycoplasma’s te isoleren uit swabs genomen bij de in eerste instantie met Mycoplasma geïnfecteerde duiven. In een tweede hok dat meteen na het vaststellen van de aanwezigheid van mycoplasma’s behandeld werd met spiramycine werd wel een lichte verbetering van de aanwezige ademhalingssymptomen gezien, maar kon men 27

ook na de behandeling met spiramycine nog steeds mycoplasma’s aantonen .

Tevens wordt tegenwoordig ook spectinomycine gebruikt ter bestrijding van Mycoplasma25

infecties van duiven .

In het verleden zijn ook duiven bij wijze van experiment behandeld met tetracyclines. Zo behandelden Loria et. al duiven, die ademhalingsstoornissen en ontstoken ogen hadden waaruit mycoplasma’s geisoleerd werden, met oxy-tetracyclines. De resultaten waren allerminst bevredigend en men kwam tot de conclusie dat oxy-tetracycline niet aangewend dient te worden ter bestrijding van mycoplasma’s bij duiven.

2.9. PREVENTIE EN CONTROLE

Ter preventie van Mycoplasma-infestaties van een duivenbestand moet men met een aantal zaken rekening houden. Zo is het van belang om voor voldoende frisse lucht in de behuizing van de duiven te zorgen. Wanneer er teveel ammoniagassen in het hok aanwezig zijn kan dit 25

een triggerende werking uitoefenen op het ontstaan van ‘mycoplasmose’ bij duiven .

Wanneer men Mycoplasma-vrije dieren wil kweken uit duiven die geïnfecteerd zijn met mycoplasma’s is het volgens onderzoek uit de USA effectief om de eieren van de 25

geïnfecteerde duiven te inoculeren met of te dippen in lincomycine en/of spectinomycine .

Serologisch onderzoek en het medicineren van Mycoplasma-positieve duivenbestanden kan nuttig zijn in het kader van de reductie van infectiedruk en de remissie van de uitscheiding 25

van mycoplasma’s door de geïnfecteerde duiven .

24

ONDERZOEK

1. MATERIALEN EN METHODEN 1.1. STAALNAME

Om uit dit onderzoek een helder beeld te vormen over het voorkomen van herpes- en Mycoplasma-infecties bij duiven in de drie Nederlandse provincies Zuid-Holland, NoordHolland en Utrecht is er voor gekozen om 440 stalen te verzamelen van in totaal 225 postduivenhouders woonachtig in deze drie provincies. Aangezien in deze drie provincies naar schatting een kleine 2000 postduivenhouders wonen is er een bemonstering gerealiseerd van ongeveer 11% van alle aanwezige liefhebbers in deze streek (voor de tabellering van de stalen zie bijlage I). Het verzamelen van de stalen gebeurde op 2 manieren. Ten eerste werden er in de praktijk waar ik mijn stage gevolgd heb van elke postduivenhouder die op consultatie kwam en woonachtig is in één van de drie aangegeven provincies, na zijn goedkeuring, 2 duiven bemonsterd. Ook werd er door elke meewerkende liefhebber een standaard formulier ingevuld waarop naar de provincie, de woonplaats en het voorkomen van ademhalingsstoornissen bij zijn of haar duiven gevraagd werd. Om aan het grote aantal stalen te geraken is er ook op een aantal tentoonstellingen, die in het winterseizoen plaatshebben, afname van stalen gebeurd. De stalen werden telkens bij het inzetten van de duiven voor de tentoonstelling genomen zodat kruisbesmetting van duiven van de verschillende postduivenhouders op dat moment niet mogelijk was.

Elke staalname vond plaats door met een swab de keel en de choanespleet van de duif te bemonsteren. Na de staalname werden de stalen steriel verpakt en ingevroren bij -20°C. Na het verzamelen van de stalen werden deze ontdooid en naar het PCR-labo van de kliniek ‘Vogels en Bijzondere dieren’ in Gent overgebracht waar ze uiteindelijk verder verwerkt werden.

1.2. DNA-BEREIDING

Om PCR op de stalen uit te kunnen voeren dient er eerst een speciale DNA-bereiding plaats te vinden. Deze DNA-bereiding gaat als volgt:

Eerst werden de stalen per serie gesorteerd. Van bijna elke postduivenhouder werden een aen

een

b-staal

van

twee

verschillende

duiven

genomen

en

genummerd

als

‘serienummer.staalnummer+a of b’, bijvoorbeeld ‘6.24a’. De swabs werden uit hun steriele verpakking genomen en één voor één in een epje geplaatst. Door middel van een microliter pipet werd er aan elk epje 100 µL lyserende buffer toegevoegd. Deze buffer is commercieel verkrijgbaar en heet ‘PrepMan Ultra’. Deze buffer werd direct door de swab opgenomen. Voor 25

het toevoegen van de buffer werd voor elk epje een nieuwe tip gebuikt om contaminatie van de stalen te voorkomen. Vervolgens werd elke swab in zijn eigen tip uitgedrukt. Hierna werden de swabs afgeknipt, zodat alleen het uiteinde van de swab in de tip bleef. De tip

Figuur 10: A) Staal in steriele verpakking; B) Swabs worden uitgedrukt in de tips waarmee de buffer aan TM de epjes werd toegevoegd; C) De lyserende buffer: PrepMan Ultra; D) De stalen worden gedurende 1 minuut aan een snelheid van 13000 RPM gecentrifugeerd; E) Vervolgens wordt de gecentrifugeerde fractie 10 minuten verhit tot 100°C; F) De stalen worden 1:10 verdund ,aangebracht op een microtiterplaat en vervolgens ingevroren

bevond zich nog steeds in het epje. Vervolgens werden de epjes met daarin de tips en de uiteinden van de swabs gedurende 1 minuut gecentrifugeerd aan de maximale snelheid van 13.000 RPM. Na het centrifugeren werden de tips met daarin de swab verwijderd en bleven enkel de epjes met daarin het gecentrifugeerde materiaal over. De volgende stap in de DNAbereiding was het verhitten van de epjes en hun inhoud tot 100ºC voor een tijdsduur van 10 minuten. Door verhitting van het materiaal gaan de cellen lyseren en komt de inhoud van de cellen met daarin ook het DNA vrij. Na 10 minuten tot 100ºC verhit te zijn geweest werden de stalen afgekoeld tot kamertemperatuur. Vervolgens werden de stalen 1 op 10 verdund overgebracht naar een speciale PCR-plaat waarna de PCR procedure kan starten. Bewaring van dergelijke platen gebeurt het best in de vriezer bij een temperatuur van -20ºC.

26

1.3. PCR-TECHNIEK

Zoals eerder vermeld hebben we voor de analyse van de stalen gebruik gemaakt van de PCR-techniek. De PCR-techniek berust zowel voor de controle op de aanwezigheid van Mycoplasma als voor de controle op de aanwezigheid van herpes op hetzelfde principe, maar er zijn wel een aantal verschillen in de methodiek voor de analyse van de genomen stalen op herpes en op Mycoplasma. Daarom worden naast het algemeen principe van de PCRtechniek ook de beide protocols, voor zowel de PCR op Mycoplasma, als voor de PCR op herpes nog eens apart en meer in detail besproken.

De PCR-techniek zelf bestaat uit een combinatie van een drietal fasen. In de eerste fase worden de stalen, die daarvoor gemengd zijn met een speciale mix waarover later meer, verhit tot een temperatuur van ongeveer 95°C. Door deze verhitting worden de dubbelstrengige DNA-moleculen ontdubbeld en ontstaan er enkelvoudige DNA-moleculen. Vervolgens begint de fase van het eigenlijke kopiëren van het DNA dat aanwezig is in het staal. Hierbij wordt, afhankelijk van het soort organisme waarvan men het DNA kopieert, een speciaal programma van verhitting en afkoeling gevolgd, waarover hierna meer verteld zal worden. Na het afwerken van het programma worden de stalen nog enkele minuten op een temperatuur van 72°C gehouden om de vorming van de nieuwe DNA-strengen te completeren. Vervolgens worden de stalen afgekoeld tot een temperatuur van ongeveer 15°C om het verkregen DNA-materiaal voor langere tijd te kunnen bewaren.

Het protocol van zowel het PCR onderzoek naar herpes als dat van het PCR onderzoek naar de aanwezigheid van mycoplasma’s begint met het samenbrengen van 1 µL van elk staal met 24 µL van een zogenaamde ‘biomix’. De 1 µL van het staal bevat voldoende DNA-materiaal om de PCR mee uit te voeren. De biomix is afkomstig van de firma ‘Bioline’ en bevat verschillende bestanddelen die nodig zijn bij het uitvoeren van het PCR onderzoek. Zo bevat de ‘biomix’ het enzym DNA-polymerase dat tijdens de PCR de enkelvoudige DNA-strengen aanvult met nucleotiden totdat zich dubbelstrengige DNA-moleculen hebben gevormd. De ‘biomix’ bevat ook de nucleotiden welke ook wel dNTP’s (deoxyribonucleotide triphosphate) genoemd worden. Een ander onmisbaar bestanddeel dat nodig is om het DNA-polymerase zijn werk te laten doen is het magnesiumchloride (MgCl 2). De ‘biomix’ is commercieel verkrijgbaar in een geconcentreerde vorm. Voor gebruik dient men eerst de ‘biomix’ 1:1 te verdunnen, vooraleer ze gebruikt kan worden voor de PCR.

Tot op dit moment in het proces verlopen de protocollen voor de PCR op herpes en de PCR op Mycoplasma identiek. De volgende stap in het proces is het toevoegen van de primers die nodig zijn om het DNA van de organismen waar onze interesse naar uit gaat te kunnen repliceren.

27

Voor de PCR op herpes worden 2 soorten primers gebruikt. Het eerste soort primers dient voor de eigenlijke PCR. Bij dit onderzoek werden de primers DFA (sequentie: GAYTTYGCNAGYYTNTAYCC), ILK (sequentie: TCCTGGACAAGCAGCARNYSGCNMTNA) en KG-1 (sequentie: GTCTTGCTCACCAGNTCNACNCCYTT) gebruikt. Tevens wordt er een zogenaamde

‘nested-PCR’

uitgevoerd

met

TGTAACTGCGTGTAYGGNTTYACNGGNGT) CACAGAGTCCGTRTCNCCRTADAT).

Een

de

primers

en

TGV

IYG

nested-PCR

is

een

(sequentie: (sequentie:

modificatie

van

de

conventionele PCR met het doel om niet-specifieke bindingen, die ontstaan door de amplificatie van niet gewenste regio’s in het DNA waarmee de primers complementair zijn, tegen te gaan.

Voor de PCR op Mycoplasma werden bij mijn onderzoek 2 primers gebruikt, namelijk GPO-1 (sequentie:

ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT)

en

MGSO

(sequentie:

TGCACCATCTGTCACTCTGTT). Na het toevoegen van de primers wordt het geheel van het DNA uit het staal, de ‘biomix’ en de primers gecentrifugeerd met als doel een goede vermenging van de verschillende componenten te bekomen.

Om achteraf te kunnen controleren of de PCR op de juiste manier uitgevoerd is werden er naast de te testen stalen van het onderzoek ook positieve stalen aan de PCR toegevoegd. Dit noemt men de ‘positieve controle’. Voor de PCR op Mycoplasma was dit Mycoplasma columbinum en voor herpes waren dit de stam AG 770 en de stam 1473.

Na de voorgaande stappen werden de te onderzoeken stalen in de PCR-machine geplaatst en werd het PCR-programma gestart. Voor de PCR op herpes ziet het programma van de PCR-machine er als volgt uit: 

3 minuten verhitten tot 95°C



40x herhalen: 30 seconden verhitten tot 94°C waarna 60 seconden afkoelen tot 43°C waarna 60 seconden verhitten tot 72°C



7 minuten verhitten tot 72°C



Koelen tot 15°C

Het programma van de PCR voor de detectie van Mycoplasma sp. ziet er als volgt uit: 

5 minuten verhitten tot 95°C



35x herhalen: 1 minuut verhitten tot 94°C waarna 30 seconden afkoelen tot 58°C waarna 1,5 minuten verhitten tot 72°C



5 minuten verhitten tot 72°C



Koelen tot 15°C

28

De PCR-techniek werkt als het ware als een enorme kopieermachine. Omdat de drie fasen van het programma een groot aantal keren herhaald werden zijn er miljoenen kopieën van de oorspronkelijke DNA-molecule uit het staal gevormd.

1.4. GELELEKTROFORESE

Nadat het DNA-materiaal van Mycoplasma of herpes, wat mogelijks aanwezig was in de stalen, gekopieerd was tot een meetbare hoeveelheid DNA-fragmenten werd er een gelelektroforese uitgevoerd in het speciale Gelred-labo van de ‘Kliniek Bijzondere Huisdieren’ van de ‘Faculteit Diergeneeskunde’ in Merelbeke. De gelelektroforese start met het aanmaken van de gelplaat waardoorheen de uiteindelijke gelelektroforese plaats zal vinden.

Figuur 11: Electroforese van nested herpes PCR: L1: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp (Plus DNA Ladder ready-to-use), L2-13 stalen: 4.8b, 4.9a, 4.9b, 4.10a, 4.10b, 4.11a, 4.11b, 4.12a, 4.12b, 4;13a, 4.13b,4.14a, L14-15: positieve controles (+/- 200 bp), L16: negatieve controle.

Om de gel aan te maken lost men agarose op in een speciale buffer, genaamd TBE. Voor dit onderzoek werd 3 gram agarose vermengd met 200 ml buffer, zodat men een mengsel verkreeg met daarin 1,5% agarose. Vervolgens werd het mengsel gedurende 3 minuten gekookt in de microgolfoven op volle sterkte. Na het koken werd de agarose-gel uit de microgolfoven genomen en werd er GelRed aan het nog vloeibare mengsel toegevoegd aan de verhouding 1:20, dus 400 µL voor 200 ml agarose-gel. GelRed is een intercalerende nucleïnezuurkleuring, die in de moleculaire biologie vaak gebruikt wordt voor onder andere agarose gelelektroforese. De voornaamste eigenschap van deze stof is dat het fluorescerend is. Bij blootstelling aan UV-licht, zal de stof oplichten met een oranje kleur. Het fluorescerend vermogen van de stof neemt sterk toe na binding met DNA. Op deze manier kan DNA in de gel met UV-belichting zichtbaar gemaakt worden. Na het toevoegen van de GelRed werd het mengsel uitgegoten over 4 platen en werden de platen 15 tot 20 minuten met rust gelaten om te stollen waarbij het van belang is dat er geen luchtbellen in de gel ontstaan. 29

Om de stalen voor te bereiden om ze deel te laten nemen aan de gelelektroforese, neemt men een plaat met 96 welletjes, waarin men in elk welletje 3 µL van een gele ladingsbuffer aanbrengt. Daarna voegt men 5 µL van het staal per welletje toe aan de ladingsbuffer.

Als laatste voorbereiding voordat de werkelijke gelelektroforese kon starten werd een zogenaamde DNA-ladder toegevoegd (Gene Ruler). Een DNA-ladder is een oplossing van DNA-moleculen, waarbij de lengte van deze DNA-moleculen bekend is. De lengte van DNAmoleculen wordt uitgedrukt in baseparen (bp). De DNA-ladder wordt toegevoegd aan de agarose-gel als een referentie waar de onbekende DNA-moleculen uit de stalen die in de gelelektroforese getest worden mee vergeleken kunnen worden. Op deze manier kan men een schatting maken van de lengte van het onbekende DNA. De lengte van de DNA-ladder die voor de gelelektroforese van mijn onderzoek gebruikt werd bedraagt 100 bp.

Na de bereiding van de stalen werden deze op de platen geplaatst voor de eigenlijke gelelektroforese. Bij een gelelektroforese als deze wordt er een stroom van 175 Volt gebruikt om het DNA-materiaal doorheen de gelplaat te laten voortbewegen. De totale duur van de gelelektroforese bedroeg telkens 75 minuten.

Figuur 12: Electroforese van Mycoplasma genus PCR: L1: Thermo Scientific GeneRuler 100 bp (Plus DNA-ladder ready-to-use), L2-13 stalen: 4.8b, 4.9a, 4.11a, 4.10a,4.9b, 4.11b, 4.12a, 4.14a, 4.13a, 4.13b, 4.12b, L14: positieve controle (+/- 717 bp), L15: negatieve controle

Om de resultaten van de gelelektroforese te bekijken werden de gelplaten na afloop op een speciale UV-lichtbak geplaatst, waarbij het aan DNA-gebonden GelRed oplicht en zo de bandjes van het aanwezige DNA in de gelplaat laat oplichten. Op deze manier kan men aan de hand van de bandjes van de positieve controle bepalen of het DNA-materiaal in een bepaald staal afkomstig is van het organisme waarop getest wordt (zie figuren 11 en 12). 30

Soms komt het voor dat er zeer brede bandjes gevormd worden of bandjes op een andere plek in de agarose-gel gevormd worden. Dit wijst op contaminatie van het DNA-materiaal. Indien men hierdoor geen duidelijke conclusie kan trekken uit het patroon van de fluorescerende bandjes kan men de PCR het best herhalen.

1.5. SEQUENERING

Nadat de PCR voor de detectie van Mycoplasma werd afgerond was het onderzoek nog niet ten einde. Omdat er bij dit onderzoek naar het voorkomen van Mycoplasma bij duiven ook voor gekozen is om, indien een staal positief is voor de aanwezigheid van Mycoplasma, ook de specifieke soort Mycoplasma vast te stellen, werd er op de stalen die positief testten op Mycoplasma een sequenering uitgevoerd, de zogenaamde ‘Sanger sequencing’. De ‘Sanger sequencing’ is een methode voor DNA-sequenering welke gebaseerd is op de selectieve opname van ketenbeëindigende dideoxynucleotiden door DNA-polymerase tijdens in vitro DNA-replicatie. ‘Sanger sequencing’ wordt tegenwoordig alleen nog gebruikt voor kleinschalige projecten en voor het bepalen van zeer lange DNA-sequenties van meer dan 500 nucleotiden lang. De DNA-sequenties in dit onderzoek zijn 700 nucleotiden lang en dus is de ‘Sanger sequencing’ een geschikte methode om toe te passen voor dit onderzoek. De sequenering gebeurde in een extern laboratorium in Duitsland waar de stalen per post naartoe werden gestuurd. Alleen de DNA-strengen die gevormd werden aan de MGSOprimers, welke een lengte van ongeveer 700 bp hebben, werden opgestuurd. Wat men na enkele dagen terug gestuurd kreeg was per opgestuurd staal een digitaal bestand met daarin de sequentie van het DNA-materiaal dat in dat specifieke staal aanwezig was. Met speciaal hiervoor ontwikkelde software zoals ‘Chromas’ of ‘Nucleotide BLAST’ (Basic Local Alignment Search Tool) kan men de computer de DNA-sequentie die men verkregen heeft met de ‘Sanger sequencing’ laten vergelijken met de specifieke DNA-sequenties in een database die uniek zijn voor een bepaald soort organisme. In dit geval werden de sequenties dus vergeleken met de sequentie van de verschillende soorten mycoplasma’s. Nadat de computer klaar is met het vergelijken van de DNA-sequenties krijgt men een overzicht te zien met de gerelateerde Mycoplasma-species en de graad van zekerheid dat die bepaalde sequentie ook daadwerkelijk overeenkomt met een bepaalde soort Mycoplasma. Indien de zekerheid voor verschillende Mycoplasma-species gelijk is kan op het niveau van de nucleotiden nagegaan worden waar en hoeveel verschillen precies tussen de sequenties aanwezig zijn. Zo kan men ook bij een gelijke zekerheid voor 2 verschillende Mycoplasmaspecies nagaan welke soort Mycoplasma in de duif aanwezig was op het moment van de staalname.

31

2. RESULTATEN

Het doel van dit onderzoek is om een inzicht te krijgen in het voorkomen van herpes (PHV-1) en Mycoplasma sp. bij reisduiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland. Het onderzoek is niet zozeer gebaseerd op het voorkomen van de klinische symptomen van herpesvirose en/of mycoplasmose maar meer op het voorkomen van deze organismen en een eventueel verband tussen het voorkomen van de twee organismen en de eventuele gevolgen voor de gezondheid van de duif.

Voor het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 bij reisduiven werden in totaal 438 stalen genomen bij 221 verschillende duivenliefhebbers. Van de meeste liefhebbers werden 2 duiven bemonsterd. Van 4 liefhebbers werd slechts 1 duif bemonsterd omdat zij op het moment van de staalname maar slechts 1 duif bij zich hadden. Uit de resultaten van het PCR-onderzoek bleek dat in totaal 134 stalen positief testten op de aanwezigheid van DNA van PHV-1 (zie tabel 1). Als we de drie provincies waar de stalen genomen zijn met elkaar vergelijken valt het op dat vooral de provincie Utrecht eruit springt met 42,5% van de stalen die positief testen op de aanwezigheid van PHV-1. De provincies Zuid-Holland en NoordHolland bleven steken op percentages van respectievelijk 29,0% en 26,2%.

Provincie:

Utrecht

Aantal

Herpes-

Herpes-

% Herpes-

stalen

positief

Negatief

positief

80

34

46

42,5%

Zuid-Holland

217

63

154

29,0%

Noord-Holland

141

37

104

26,2%

Totaal

438

134

304

30,6%

Tabel 1: Het voorkomen van PHV-1 bij duiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland

Een tweede vraag bij aanvang van dit onderzoek was de relatie tussen herpes en klinische respiratoire problemen. Bij de staalname is de liefhebber, bij wijze van een in te vullen formulier, gevraagd of zijn duiven op het moment van staalname of minder dan 6 maanden voor

de

staalname

last

hebben

gehad

van

ademhalingsstoornissen.

Met

ademhalingsstoornissen werden dan vooral ornithose, kortademigheid, een ontstoken keel, ronkende ademhalingsgeluiden of ontstoken ogen met eventueel ‘het vliesje’ erop bedoeld. Van ‘het vliesje’ wordt heden ten dage vaak gesproken wanneer de duif een lichte ontsteking van de bovenste luchtwegen heeft waarbij ook het oog betrokken is, maar dan in een dusdanig milde vorm dat enkel het derde ooglid iets achterblijft wanneer de duif met zijn oog knippert. 32

Uit het PCR-onderzoek bleek dat de percentages voor wat betreft het voorkomen van zowel PHV-1 als respiratoire problemen bij de duif niet echt een duidelijke trend volgt (zie tabel 2). Bij de liefhebbers, die op het moment van het nemen van de stalen, geen respiratoire problemen voor een periode van meer dan 6 maanden bij hun duiven hadden waargenomen testten procentueel gezien ongeveer evenveel duiven positief als bij de liefhebbers die zeiden op

het

moment

van

staalname

duiven

op

het

hok

te

hebben

met

duidelijke

ademhalingsstoornissen (28,9% tegenover 29,7%). Bij de categorie van liefhebbers die aangaven dat zij in de periode van minder dan 6 maanden voor het moment van de staalname nog ademhalingsstoornissen bij hun duiven te hebben gehad, bleek 34,1% van de stalen positief op de aanwezigheid van DNA-materiaal van PHV-1 te testen.

Ademhalings-

Aantal

Herpes-

Herpes-

% Herpes-

stoornissen:

stalen

positief

Negatief

positief

Nee

266

77

189

28,9%

Ja, < 6 maanden geleden

135

46

89

34,1%

37

11

26

29,7%

438

134

304

30,6%

Ja, op moment van staalname aanwezig Totaal

Tabel 2: Het voorkomen van PHV-1 bij duiven in Nederland gerelateerd aan de zichtbaarheid van respiratoire problemen voor de liefhebber

Voor het onderzoek is ook het voorkomen van PHV-1 bij duiven tijdens twee verschillende seizoenen gevolgd. In het onderzoek zijn alleen de herfst en de winter opgenomen. Dit komt omdat het onderzoek van eind juli 2013 tot half maart 2014 liep. Bijgevolg werden er dus geen duiven bemonsterd in het voorjaar en zeer weinig in de zomer. Omdat het aantal verkregen stalen in de zomer niet relevant was voor het totaal aantal stalen is de zomer ook niet meegenomen in de beschouwing van de seizoensverschillen in het voorkomen van PHV1 bij duiven. Van alle stalen die genomen werden tijdens de herfst, die loopt van 21 september tot 20 december testten slechts 50 duiven positief op de aanwezigheid van PHV-1 (zie tabel 3). Dit komt neer op 23,8% positieve stalen. Van de stalen die in de winter werden genomen testte maarliefst 35,2% van de stalen positief op de aanwezigheid van PHV-1. Het totaal aantal stalen die voor de parameter ‘jaargetijde’ in beschouwing zijn genomen licht lager dan het totaal aantal verzamelde stalen omdat er een klein aantal in de zomer van 2013 genomen is.

33

Jaargetijde

Herfst

Aantal

Herpes-

Herpes-

% Herpes-

stalen

positief

Negatief

positief

210

50

160

23,8%

193

68

125

35,2%

403

118

285

29,3%

(21-9-2013 t/m 20-12-2013)

Winter (21-12-2013 t/m 20-3-2014) Totaal

Tabel 3: Het voorkomen van PHV-1 in 3 provincies in Nederland tijdens de winter

herfst en de

Voor het onderzoek naar de prevalentie van Mycoplasma sp. bij reisduiven werden dezelfde 438 stalen gebruikt die ook voor het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 gebruikt werden. Uit de PCR-analyse van deze 438 stalen bleek dat 174 stalen positief testten op de aanwezigheid van DNA-materiaal afkomstig van een bepaalde soort Mycoplasma. Als we het algemeen voorkomen van Mycoplasma sp. in de drie provincies met elkaar gaan vergelijken dan valt op dat de provincies Utrecht en Zuid-Holland, met respectievelijk 41,3% en 44,7% positief geteste stalen, een hogere prevalentie van Mycoplasma sp. kennen dan de provincie Noord-Holland, waar slechts 31,2% van de genomen stalen positief testte op de aanwezigheid van DNA-materiaal afkomstig van Mycoplasma sp. (zie tabel 4).

Provincie:

Utrecht

Aantal

M.-

M.-

% M.-

stalen

positief

negatief

positief

80

33

47

41,3%

Zuid-Holland

217

97

114

44,7%

Noord-Holland

141

44

97

31,2%

Totaal

438

174

264

39,7%

Tabel 4: Het voorkomen van Mycoplasma sp. bij duiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland

Als men dan het voorkomen van Mycoplasma sp. in relatie met het voorkomen van ademhalingstoornissen bij duiven in beschouwing neemt, ziet men dat het voorkomen van Mycoplasma sp. niet direct in verband gebracht kan worden met ademhalingsstoornissen. Zo kan men uit de onderstaande tabel (zie tabel 5) opmaken dat het percentage positief testende stalen in de groep duiven afkomstig van hokken waar nooit ademhalingsproblemen gezien 34

worden gelijk is aan het percentage positief testende stalen in de groep duiven afkomstig van hokken waar in de 6 maanden voor de staalname nog ademhalingsstoornissen waargenomen zijn, namelijk 40,2% tegenover 40,7%. In de groep stalen afkomstig van duiven, die gehuisvest zijn op een hok

waar op het moment van staalname

ademhalingsstoornissen bij de duiven voorkwamen, testte zelfs maar 32,4% van de stalen positief op Mycoplasma sp..

Ademhalings-

Aantal

M.-

M.-

% M.-

stoornissen:

stalen

positief

Negatief

positief

Nee

266

107

159

40,2%

Ja, < 6 maanden geleden

135

55

80

40,7%

37

12

25

32,4%

438

174

264

39,7%

Ja, op moment van staalname aanwezig Totaal

Tabel 5: Het voorkomen van Mycoplasma sp. bij duiven in Nederland gerelateerd aan de zichtbaarheid van respiratoire problemen voor de liefhebber

Bij de analyse van het voorkomen van Mycoplasma sp. in de herfst en de winter valt meteen op dat Mycoplasma sp. in de winter meer voorkomt bij duiven dan in de herfst. Zo bleek uit de PCR-analyse dat slechts 27,1% van de stalen die in de herfst genomen werden positief testten op Mycoplasma sp., terwijl van de stalen die in de winter genomen werden meer dan het dubbele percentage positief testten, namelijk 56%.

Jaargetijde

Herfst

Aantal

M.-

M.-

% M.-

stalen

positief

negatief

positief

210

57

153

27,1%

193

108

85

56,0%

403

165

238

40,9%

(21-9-2013 t/m 20-12-2013)

Winter (21-12-2013 t/m 20-3-2014) Totaal

Tabel 6: Het voorkomen van Mycoplasma sp. in 3 provincies in Nederland

tijdens de herfst en de winter

Een volgende stap in de analyse van het voorkomen van Mycoplasma sp. bij duiven was het bepalen van welke soorten van Mycoplasma waar voorkomen en in welke mate zij voorkomen in de drie provincies waar het onderzoek gehouden is. Uit onderstaande tabel (zie 35

tabel 7) valt op te maken dat in elke provincie die deelneemt aan het onderzoek M. columbinum het meest voorkomt. M. columbinasale kent ook een hoge prevalentie en M. columborale komt in alle drie de provincies het minst voor. Categorie 4 in de tabel omvat de stalen die wel positief testten op de aanwezigheid van DNA-materiaal van Mycoplasma sp., maar waarvan na sequenering niet duidelijk was tot welke soort van Mycoplasma ze behoorden

Provincie:

Aantal

Positief

1

2

3

4

stalen

Utrecht

80

33

23

6

3

1

Zuid-Holland

217

97

43

35

10

9

Noord-Holland

141

44

25

8

6

4

Totaal

438

174

91

49

19

14

Tabel 7: De prevalentie van de verschillende species van Mycoplasma’s in absolute aantallen in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland (1= M. columbinum, 2= M. columbinasale, 3= M. columborale, 4= ondefinieerbaar type)

Het probleem van de tabel met daarin de absolute aantallen positieve stalen is dat men uit deze tabel moeilijk of niet kan opmaken hoe de verhouding tussen de verschillende soorten mycoplasma’s in de drie verschillende provincies is. Daarom is er een staafdiagram opgesteld welke de variatie in voorkomen van de verschillende soorten mycoplasma’s

Figuur 12: Staafdiagram over de prevalentie van de verschillende species van Mycoplasma’s in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland in Nederland (1= M. columbinum, 2= M. columbinasale, 3= M. columborale, 4= ondefinieerbaar type)

36

weergeeft (zie figuur 13). Uit het staafdiagram valt duidelijk op te maken dat in de provincie Utrecht het verschil in prevalentie tussen Mycoplasma columbinum (69,7%) en Mycoplasma columbinasale (13,1%) veel groter is dan het verschil tussen dezelfde soorten mycoplasma’s in de provincie Zuid-Holland (respectievelijk 44,3% en 36,1%). Verder valt uit de staafdiagram ook op te maken dat de prevalenties van Mycoplasma columborale in de drie provincies die aan het onderzoek deelnemen laag zijn en elkaar niet veel ontlopen. De laatste en misschien wel belangrijkste parameter die voor het onderzoek belicht werd is het al dan niet gezamenlijk voorkomen van PHV-1 en Mycoplasma sp. bij duiven. En dan meer specifiek hoe groot de prevalenties van de verschillende combinaties van deze twee organismen gerelateerd aan een bepaalde categorie van ademhalingsstoornissen zijn (zie tabel 8). De analyse van de stalen kende voor deze parameter van het onderzoek vier verschillende uitkomsten, namelijk herpes-positief / Mycoplasma sp.-negatief, herpes-negatief / Mycoplasma sp.-positief, herpes-positief / Mycoplasma sp.-positief en herpes-negatief / Mycoplasma sp.-negatief. Ademhalings-

Aantal

H+/M-

H-/M+

H+/M+

H-/M-

stoornissen:

stalen

(%)

(%)

(%)

(%)

Nee

266

13,2%

24,4%

15,8%

46,6%

Ja, <6 maand geleden

135

17,7%

24,4%

16,3%

41,5%

37

16,2%

18,9%

13,5%

51,4%

438

14,8%

24,0%

15,8%

45,4%

Ja, op moment van staalname aanwezig Totaal

Tabel 8: Het gezamenlijk voorkomen van PHV-1 en Mycoplasma sp. en de invloed hiervan op het optreden van ademhalingsstoornissen bij duiven

Bij beschouwing van de drie verschillende categorieën ziet men dat in de categorie ‘Nee’, welke

266

stalen

bevat

afkomstig

van

de

duiven

van

liefhebbers

die

nooit

ademhalingstoornissen bij hun duiven opmerken, slechts 46,6% van de stalen negatief testten op de aanwezigheid van herpes én mycoplasma’s. Opvallend in deze categorie is dat toch 15,8% positief test op zowel herpes als mycoplasma’s terwijl er bij deze duiven nooit ademhalingsstoornissen zijn opgemerkt. Verder testte 13,2% van de stalen enkel positief voor de aanwezigheid van herpes en testte 24,4% alleen positief voor de aanwezigheid van mycoplasma’s.

De stalen afkomstig van de tweede categorie zijn afkomstig van liefhebbers die recent nog (< 6 maanden geleden) ademhalingsstoornissen bij hun duiven hebben opgemerkt. Van de

37

stalen in deze categorie testte ook nog 41,5% van de stalen negatief op zowel de aanwezigheid van herpes als de aanwezigheid van mycoplasma’s. 16,3% van alle stalen in deze categorie testte positief op de aanwezigheid van beide organismen. Bij 17,75% van de stalen werd enkel de aanwezigheid van herpes vastgesteld en bij 24,4% van de stalen in deze tweede categorie werd enkel positief getest op de aanwezigheid van mycoplasma’s.

De laatste categorie van het onderzoek, die de hokken omvat waarop zich op het moment van de staalname duiven bevonden met ademhalingsstoornissen, bevatte 37 stalen. Van deze 37 stalen testten er slechts 5 positief op zowel herpes als mycoplasma’s. Dit komt neer op een percentage van 13,5%. Bij 19% van de stalen was er geen enkel spoor van de aanwezigheid van herpes en mycoplasma’s terug te vinden. 18,9% van de stalen testte enkel positief op de aanwezigheid van Mycoplasma sp. en 16,2% van de stalen bevatte alleen DNA-materiaal van herpes.

3. DISCUSSIE

Uit de verschillende bronnen, die voor de literatuurstudie over herpesvirose bij duiven zijn geraadpleegd, komt naar voren dat heden ten dage 50% tot zelfs 80% latent besmet zou zijn 1,2,3,5,6,11,12

met PHV-1

. Uit dit onderzoek daarentegen bleek dat slechts 30,6% van alle stalen

die genomen werden positief testten op PHV-1. Wat zou hier nu precies een verklaring voor kunnen zijn?

Een verklaring voor het feit dat PHV-1 in de drie provincies van het onderzoek minder voorkomt dan in de literatuur wordt beweerd is dat de prevalentie van PHV-1 per land of gebied sterk kan verschillen. Zo zal de prevalentie van PHV-1 in een gebied met veel duivenliefhebbers die aan een groot aantal wedvluchten per jaar deelnemen hoger zijn dan de prevalentie van PHV-1 in een gebied met weinig duivenliefhebbers die aan slechts enkele of helemaal geen wedvluchten deelnemen. Ook het klimaat van de gebieden die in alle verschillende onderzoeken genoemd worden zou een rol kunnen spelen. Een andere verklaring voor de verschillen in prevalentie kan zijn dat voor andere onderzoeken andere methoden werden gebruikt om het virus aan te tonen. Zo zijn er ook een aantal onderzoekers die naar antistoffen tegenover het PHV-1 in het serum van de duiven zochten

2,3,5,6

. Voor deze

methode is, in tegenstelling tot de PCR-techniek die in dit onderzoek gebruikt is, geen actieve virusuitscheiding nodig om de aanwezigheid van het virus in de duif aan te tonen. Verder is voor dit onderzoek ook maar één tijdsopname gebruikt om de aanwezigheid van het virus aan te tonen, terwijl voor andere onderzoeken misschien een aantal stalen per duif, met een bepaald tijdsbestek ertussen, zijn genomen.

38

Een volgend punt van discussie is de uitkomst van het onderzoek naar het voorkomen van PHV-1 in combinatie met ademhalingsstoornissen. Uit de resultaten van het onderzoek bleek dat de prevalentie van PHV-1 bij de verschillende categorieën nagenoeg gelijkwaardig aan elkaar zijn. Een verklaring hiervoor zou kunnen liggen bij de liefhebber zelf. In de duivensport heerst een zogenaamde ‘machocultuur’ wat betekent dat duivenmelkers onderling elkaar niet graag vertellen over wat hun duiven allemaal mankeren of gemankeerd hebben. Het is dan ook maar de vraag of de liefhebbers het vragenformulier, dat bij de staalname is ingevuld, naar waarheid is beantwoord. Een tweede mogelijke verklaring voor het feit dat de resultaten in de verschillende categorieën nagenoeg gelijk aan elkaar zijn is dat de duivenliefhebber het vaak simpelweg niet ziet of zijn duiven iets mankeren, waarbij het ook vaak voorkomt dat duiven subklinisch geïnfecteerd zijn met PHV-1 en zij geen klinische symptomen van herpesvirose vertonen. Een derde en laatste verklaring kan natuurlijk zijn dat het grootste gedeelte van de ademhalingsstoornissen bij duiven niet enkel en alleen gerelateerd is aan het voorkomen van PHV-1, maar dat het optreden van klinische herpesvirose en multifactoriele oorzaak kent. Zo kan het zijn dat een infectie met PHV-1 alleen tot klinische herpesvirose leidt indien er tegelijkertijd ook management- of huisvestingsproblemen aanwezig zijn.

Wat ook uit het onderzoek naar voren kwam was dat de uitscheiding en daarmee de prevalentie van PHV-1 bij duiven in de herfst veel lager is dan in de winter. Met respectievelijk percentages van 23,8% en 35,2% is er een aannemelijk verschil tussen deze twee seizoenen aanwezig. Een mogelijke verklaring is de toestand van de duiven in de herfst in vergelijking met de toestand van de duiven in de winter. De herfst is in de duivensport het zogenaamde rustseizoen. De duiven zijn dan in de rui en komen op de meeste hokken niet meer los. De wedstrijden liggen stil en de geslachten worden vaak gescheiden. In de winter daarentegen begint men in de duivensport vaak al vroeg met de kweek voor het nieuwe seizoen, wat eigenlijk onfysiologisch is. Ook zijn er veel tentoonstellingen en worden de duiven blootgesteld aan vaccinaties. Al deze handelingen en gebeurtenissen zorgen ervoor dat er meer stress heerst onder de duiven en stress zou wel eens de aanleiding kunnen zijn voor de verhoogde uitscheiding van PHV-1 in de winter. Eigenlijk zou het onderzoek een langere looptijd moeten hebben waarbij ook het voorjaar en de zomer in de resultaten verwerkt kunnen worden om zo de verschillende factoren voor een verhoogde aanwezigheid van PHV1 bij duiven vast te kunnen stellen.

Het tweede deel van dit onderzoek gaat over de prevalentie van Mycoplasma sp. bij duiven in de provincies Utrecht, Zuid-Holland en Noord-Holland. Volgens de literatuur is de prevalentie van mycoplasma’s bij duiven hoog. Zelfs zo hoog dat bijna elk duivenbestand ter wereld wel eens geïnfecteerd is geweest met mycoplasma’s. Shimuzu stelde, in een onderzoek waarbij 262 duiven onderzocht werden op de aanwezigheid van mycoplasma’s, vast dat bij 68,7% 24

van de onderzochte duiven mycoplasma’s aanwezig waren .

39

Uit het onderzoek dat nu plaats heeft gevonden bleek dat slechts 39,7% van alle stalen positief testte op de aanwezigheid van mycoplasma’s. Een verklaring hiervoor zou het verschil in geografische ligging van de bemonsterde gebieden kunnen zijn. Het onderzoek van Shimizu werd niet in dezelfde streek en zelfde periode uitgevoerd als dit onderzoek. Klimaat, geografische ligging en tijd kunnen een belangrijke rol spelen in de uitkomsten van een prevalentieonderzoek. Voor wat betreft de 3 soorten mycoplasma’s die bij duiven voorkomen stelde Shimizu vast dat 43% van de gevonden mycoplasma’s behoorde tot de species Mycoplasma columbinum, 55% tot M. columborale en 2% tot de species M. columbinasale behoorde

28,31

. De hiervoor

25

genoemde mycoplasma’s komen alleen bij duiven voor .

Uit het onderzoek dat nu heeft plaatsgevonden bleek dat de cijfers van nu toch wel enorm verschillen met de cijfers die Shimizu in zijn onderzoeksverslag toonde. Zo bleek uit het onderzoek van nu dat 52,3% van de gevonden mycoplasma’s behoorde tot de species Mycoplasma columbinum, 28,2% behoorde tot de species Mycoplasma columbinasale en slechts 10,9% behoorde tot de species Mycoplasma columborale. Nu is er in het onderzoek van nu ook nog een bescheiden groep van stalen (8%) die wel positief testte op mycoplasma’s maar waarvan na sequenering de species waartoe zij behoorden niet vastgesteld kon worden. Desalniettemin kan men uit deze gegevens wel concluderen dat net als vroeger Mycoplasma columbinum nog steeds veelvuldig voorkomt, maar dat Mycoplasma columborale veelal minder voorkomt dan vroeger.

Voor wat betreft de onderlinge verschillen tussen de drie provincies die deelnamen aan het onderzoek valt het op dat de verdeling van de verschillende soorten van mycoplasma’s in alle drie de provincies anders is. Een verklaring hiervoor kan zijn dat er door het wedvluchtensysteem, waarbij Nederland opgedeeld is in twaalf verschillende afdelingen, duiven uit de ene provincie niet meer in contact komen met duiven uit de andere provincie. Omdat in Nederland vóór het in werking treden van dit wedvluchtensysteem geen onderzoek is gedaan naar de prevalentie van mycoplasma’s bij duiven kan men niet met zekerheid zeggen dat dit ook daadwerkelijk van invloed is geweest op het ontstaan van dergelijke verschillen in prevalentie.

Een ander punt van discussie is de uitkomst van het onderzoek naar het voorkomen van mycoplasma’s in combinatie met ademhalingsstoornissen. Uit de resultaten van het onderzoek bleek dat de prevalentie van mycoplasma’s in de verschillende categorieën nagenoeg gelijkwaardig aan elkaar zijn. Een verklaring hiervoor zou, net als bij het onderzoek naar de prevalentie van herpes bij duiven, kunnen liggen bij de liefhebber zelf. De liefhebber kan

het

formulier

niet

naar

waarheid

ingevuld

hebben,

hij

kan

eventuele

40

ademhalingsstoornissen bij zijn duiven simpelweg niet gezien hebben omdat het bijvoorbeeld subklinisch

heerst

bij

zijn

duiven

of

het

kan

zo

zijn

dat

het

optreden

van

ademhalingsstoornissen niet gerelateerd is aan de aanwezigheid van mycoplasma’s bij duiven.

Wat net als bij het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 bij duiven naar voren kwam, was het grote verschil in uitscheiding en dus ook in prevalentie van Mycoplasma sp. tussen de 2 verschillende seizoenen waarin het onderzoek uitgevoerd is, namelijk de herfst en de winter. Van de stalen die in de herfst werden genomen testte slechts 27,1% positief voor de aanwezigheid van mycoplasma’s, terwijl van de stalen die in de winter genomen werden 56% positief testte op de aanwezigheid van mycoplasma’s. De verklaring die voor dit verschil kan worden gegeven werd eerder in de tekst ook al aangehaald en zou kunnen berusten op verhoogde stress die de duiven in de winter ondergaan omwille van het begin van het kweekseizoen en de vele tentoonstellingen en vaccinaties. Net als bij het onderzoek naar de prevalentie van PHV-1 zou het onderzoek eigenlijk een langere looptijd moeten hebben waarbij ook het voorjaar en de zomer in de resultaten verwerkt kunnen worden om zo de verschillende factoren voor een verhoogde aanwezigheid van mycoplasma’s bij duiven vast te kunnen stellen.

Het derde deel van het onderzoek ging over het gezamenlijk voorkomen van PHV-1 en mycoplasma’s bij duiven en een eventuele invloed die er zou zijn op het optreden van ademhalingsstoornissen bij de duif. In de literatuur was er geen informatie te vinden over het gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s bij duiven. Uit de gegevens die bij het onderzoek van nu verkregen werden kan opgemaakt worden dat het gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s (herpes-positief / Mycoplasma sp.-positief) in de drie verschillende categorieën van ademhalingsstoornissen (nee / ja,<6 maanden geleden / ja, op moment van staalname aanwezig) schommelt rond het gemiddelde percentage van 15,8%. Ook voor de andere combinaties van het voorkomen van de twee organismen (herpespositief / Mycoplasma sp.-negatief, herpes-negatief / Mycoplasma sp.-positief, en herpesnegatief / Mycoplasma sp.-negatief) schommelen alle percentage van de verschillende categorieën steeds rond het gemiddelde percentage (zie tabel 8). Met andere woorden volgens dit onderzoek heeft het gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s geen invloed op het optreden van ademhalingsstoornissen bij duiven. Het is in ieder geval niet zo dat enkel de aanwezigheid van mycoplasma’s en PHV-1 klinische ademhalingsstoornissen bij duiven veroorzaken.

4. CONCLUSIE

Uit dit onderzoek zijn vooralsnog een aantal interessante gegevens naar voren gekomen. Een eerste interessant gegeven, dat zowel geldt voor de prevalentie van PHV-1 als voor de 41

prevalentie van Mycoplasma sp. bij duiven in de drie deelnemende provincies, is dat de prevalentie van zowel PHV-1 als van Mycoplasma sp. in het huidige onderzoek lager is dan in de literatuur beschreven wordt. Verder kan uit dit onderzoek geconcludeerd worden dat zowel herpes als mycoplasma’s seizoensgebonden in meer of mindere mate uit de duiven te isoleren zijn. Dit vraagt echter wel om verder en meer uitgebreid onderzoek om een zekere bevestiging te krijgen.

Voor wat betreft het belang van herpes en Mycoplasma sp.-infecties bij het optreden van ademhalingsstoornissen bij duiven kan er uit de gegevens die in dit onderzoek verzameld zijn een duidelijke conclusie getrokken worden. Het gezamenlijk voorkomen van herpes en Mycoplasma sp. heeft geen invloed op het voorkomen van ademhalingsstoornissen bij duiven. Het percentage van gezamenlijk voorkomen van herpes en mycoplasma’s verschilde niet tussen de verschillende categorieën van duiven, die ingedeeld waren naar het voorkomen van ademhalingsstoornissen op het hok vanwaar deze duiven afkomstig waren.

42

REFERENTIELIJST

1. Marlier D., Vindevogel H. (2006). Viral infections in pigeons. The Veterinary Journal 172, p. 40-51. 2. Tudor D.C. (1991). Pigeon Health and Disease. Iowa State University Press, Ames, Iowa 50010, p. 34-38. 3. Vogel K. (1983). Taubenkrankheiten. Schober Verlags GmbH, Hengersberg, p. 7481. 4. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1970). Herpesvirus infection of pigeons. I. Pathology and virus isolation. Journal of Comparative Pathology 80, p. 221-227. 5. Martel A., Pasmans F., De Herdt P. (2007). Duivenziekten. Diergeneeskundig memorandum 2, p. 35. 6. De Herdt P., Devriese L.(2000). Pigeons. In: Tully TN, Lawton M.P.C., Dorrestein G.M. et al., editors. Avian Medicine. Oxford: Butterworth Heinemann, p. 312-338. 7. Vindevogel H., Duchatel J.P., Gouffeaux M., Pastoret P.P.(1977).

Pigeon

herpesvirus: Susceptibility of avian and mammalian cell cultures to infection with pigeon herpesvirus. Journal of Comparative Pathology 87, p. 605-610. 8. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1970). Herpesvirus infection of pigeons. II. Experimental Infection of Pigeons and Chicks. Journal of Comparative Pathology 80, p. 229-232. 9. Gailbreath K.L., Oaks J.L. (2008). Herpesviral Inclusion Body Disease in Owls and Falcons is caused by the Pigeon Herpesvirus (Columbid Herpesvirus 1). Journal of wildlife diseases 44.2, p. 427-433. 10. Aini, I., et al. (1993). Comparison of herpesvirus isolates from falcons, pigeons and psittacines by restriction endonuclease analysis. Journal of wildlife diseases 29.2, p. 196-202. 11. Vindevogel H., Debruyne H. (1985). Observation of Pigeon Herpesvirus 1: Reexcretion during the Reproduction period in conventionally reared Homing Pigeons. Journal of Comparative Pathology 95, p. 105-112. 12. Harlin R., Wade L. (2009). Bacterial and parasitic diseases of columbiformes. Veterinary Clinics of North America Exotic Animal Practice 12, 453-473. 13. Vindevogel H., Pastoret P.P., Leroy P. (1982). Vaccination Trials against Pigeon Herpesvirus Infection (Pigeon Herpesvirus 1). Journal of Comparative Pathology 92, p. 483-494. 14. Vindevogel H., Pastoret P.P. (1980). Pigeon Herpes Infection: Natural Transmission of the Disease. Journal of Comparative Pathology 90, p. 409-413. 15. Vindevogel H., Pastoret P.P. (1981). Pathogenesis of Pigeon Herpesvirus Infection. Journal of Comparative Pathology 91, p. 415-426.

43

16. Vindevogel H., Pastoret P.P., Burtonboy G. (1980). Pigeon Herpes Infection: Excretion and Re-excretion of Virus after experimental Infection. Journal of Comparative Pathology 90, p. 401-408. 17. Coignoul F., Vindevogel H. (1980). Cellulair changes in the Bursa of Fabricius and thymus of cyclophosphamide-treated pigeons. Journal of Comparative Pathology 90, p. 395-400. 18. Messana M., Kösters J., Grund C. (1997). Studies on reactivation and transmission of pigeon herpes virus (PHV) for raising PHV-free pigeons (Columba livia dom.), Avian Pathology 26:4, p. 859-864. 19. Mohammed M.A., Sokker S.M., Tantawi H.H. (1978). Contagious paralysis of pigeons. Avian Pathology 7, p. 637-643. 20. Gough R.E. et al. (1988). Routine virus isolation or detection in the diagnosis of diseases in birds, Avian Pathology 17:4, p. 893-907. 21. Cornwell H.J.C., Wright N.G. (1970). Herpesvirus infection of pigeons. III. Use of Embryonated Eggs for the Growth and Characterization of the Virus. Journal of Comparative Pathology 80, p. 509-515. 22. Vindevogel

H.,

Pastoret

P.P.,

Aguilar-Setien

A.

(1982).

Assessment

of

phosphonoformate-treatment of pigeon herpesvirus infections in pigeons and budgerigars and Aujeszky disease in rabbits. Journal of Comparative Pathology 92, p. 177-180. 23. Schwers A., Vindevogel H., Leroy P. & Pastoret P.P. (1981). Susceptability of different strains of pigeon herpesvirus to trisodium phosphonoformate, Avian Pathology 10:1, p. 23-29. 24. Thiry E. et al. (1983) In vivo and in vitro effect of acyclovir on pseudorabies virus, infectious bovine rhinotracheïtis virus and pigeon herpesvirus, Annales de recherches vétérinaires. Annals of veterinary research 14.3 : 239 25. Tudor D.C. (1991). Pigeon Health and Disease. Iowa State University Press, Ames, Iowa 50010, p. 94-98. 26. Vogel K. (1983). Taubenkrankheiten. Schober Verlags GmbH, Hengersberg, p. 131137. 27. Keymer I.F. et al. (1984). Isolation of Mycoplasma spp. from racing pigeons (Columbia Livia). Avian pathology 13:1, p. 65-74. 28. Nagatomo H., Kato H., Shimizu T. & Katayama B. (1997). Isolation of mycoplasmas from fantail pigeons. Journal of Veterinay Medical Science 59, p. 461-462. 29. Loria G.R. et al.(2005). Isolation of mycoplasmas from pigeons suffering eye lesions and respiratory disease. Veterinary Record 2005 157, p. 664-665. 30. Beneina D., Dorrer D. & Tadina T. (1987). Mycoplasma species isolated from six avian species. Avian Pathology 16:4, p. 653-663. 31. Turcsányi I. et al. (2005). Isolation of Mycoplasma columbinasale from pigeons in Hungary. Veterinary Record 2005 157, p. 235-236.

44

32. Shimizu T. et al. (1978). Isolation and characterisation of Mycoplasma columbinum and Mycoplasma columborale, two new species from pigeons. International Journal of Systematic Bacteriology 28, p. 538-546. 33. Guo Z. et al. (2013). Genome sequence of Mycoplasma columbinum Strain SF7. Genome Announc. 1(2):e00157-13. 34. Davison A.J. (2002) Evolution of the herpesviruses. Veterinary microbiology 86.1: p. 69-88 35. Mc Geoch, Duncan J., Rixon

F.J & Davison A.J. (2006). Topics in herpesvirus

genomics and evolution. Virus research 117.1: p. 90-104.

45

BIJLAGE

SERIE 1 Staalnr

Datum

Provincie

Plaats

AH-

Herpes

Mycoplasma

probleem

1= -inum

(1=Ja)

2=-inasale

(2=Ja,<6

3=-orale

mnd.)

4= ondef.

(3=Nee)

1.1a

26-7-2013

Noord-Holland

Marken

1

+

1

1.1b

26-7-2013

Noord-Holland

Marken

1

-

-

1.2a

26-7-2013

Utrecht

Bilthoven

1

+

-

1.2b

26-7-2013

Utrecht

Bilthoven

1

-

-

1.3

30-7-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

-

1

1.4a

30-7-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

1

-

1

1.4b

30-7-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

1

-

-

1.5a

30-7-2013

Utrecht

De Bilt

1

-

-

1.5b

30-7-2013

Utrecht

De Bilt

1

+

-

1.6

16-8-2013

Utrecht

Vreeland

1

+

-

1.7

16-8-2013

Utrecht

Hilversum

2

+

1

1.8a

27-8-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

+

-

1.8b

27-8-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

1

1.9a

2-9-2013

Utrecht

De Bilt

3

+

-

1.9b

2-9-2013

Utrecht

De Bilt

3

+

-

1.10a

2-9-2013

Utrecht

Driebergen

3

+

-

1.10b

2-9-2013

Utrecht

Driebergen

3

+

1

1.11a

2-9-2013

Utrecht

De Bilt

2

-

-

1.11b

2-9-2013

Utrecht

De Bilt

2

-

1

1.12a

9-9-2013

Noord-Holland

Uitgeest

2

-

-

1.12b

9-9-2013

Noord-Holland

Uitgeest

2

+

-

1.13a

9-9-2013

Noord-Holland

Heemskerk

3

+

-

1.13b

9-9-2013

Noord-Holland

Heemskerk

3

+

-

1.14a

10-9-2013

Utrecht

Kamerik

3

-

-

1.14b

10-9-2013

Utrecht

Kamerik

3

+

2

1.15a

10-9-2013

Utrecht

Utrecht

1

-

2

1.15b

10-9-2013

Utrecht

Utrecht

1

+

-

1.16a

13-9-2013

Noord-Holland

Den Helder

2

+

-

1.16b

13-9-2013

Noord-Holland

Den Helder

2

-

-

1.17a

13-9-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

1.17b

13-9-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

46

1.18a

4-10-2013

Zuid-Holland

Gouderak

2

-

-

1.18b

4-10-2013

Zuid-Holland

Gouderak

2

+

-

1.19a

4-10-2013

Noord-Holland

Uithoorn

3

+

-

1.19b

4-10-2013

Noord-Holland

Uithoorn

3

-

-

1.20a

5-10-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

2

-

-

1.20b

5-10-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

2

-

-

1.21a

1-9-2013

Zuid-Holland

Boskoop

2

-

-

1.21b

1-9-2013

Zuid-Holland

Boskoop

2

-

-

1.22a

31-8-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

1.22b

31-8-2013

Zuid Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

AH-

Herpes

Mycoplasma

SERIE 2 Staalnr

Datum

Provincie

Plaats

probleem

1= -inum

(1=Ja)

2=-inasale

(2=Ja,<6

3=-orale

mnd.)

4= ondef.

(3=Nee)

2.1a

19-10-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

-

-

2.1b

19-10-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

-

-

2.2a

26-10-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

2.2b

26-10-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

+

3

2.3a

26-10-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

2.3b

26-10-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

1

2.4a

27-10-2013

Zuid-Holland

Nieuwerkerk

2

-

2

2.4b

27-10-2013

Zuid-Holland

Nieuwerkerk

2

-

2

2.5a

8-11-2013

Zuid-Holland

Dordrecht

2

+

3

2.5b

8-11-2013

Zuid-Holland

Dordrecht

2

-

3

2.6a

8-11-2013

Zuid-Holland

Dordrecht

3

-

3

2.6b

8-11-2013

Zuid-Holland

Dordrecht

3

-

-

2.7a

9-11-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

2.7b

9-11-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

-

2.8a

9-11-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

-

2.8b

9-11-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

-

2.9a

11-11-2013

Zuid-Holland

Gouderak

3

-

-

2.9b

11-11-2013

Zuid-Holland

Gouderak

3

-

-

2.10a

11-11-2013

Zuid-Holland

Rotterdam

2

-

-

2.10b

11-11-2013

Zuid-Holland

Rotterdam

2

-

-

2.11a

11-11-2013

Noord-Holland

Landsmeer

3

-

-

2.11b

11-11-2013

Noord-Holland

Landsmeer

3

+

47

2.12a

11-11-2013

Noord-Holland

Groot-Ammers

2

-

-

2.12b

11-11-2013

Noord-Holland

Groot-Ammers

2

-

-

2.13a

11-11-2013

Utrecht

De Meern

1

-

2

2.13b

11-11-2013

Utrecht

De Meern

1

-

-

2.14a

11-11-2013

Noord-Holland

Haarlem

3

+

-

2.14b

11-11-2013

Noord-Holland

Haarlem

3

-

-

2.15a

12-11-2013

Noord-Holland

Oostzaan

3

-

4

2.15b

12-11-2013

Noord-Holland

Oostzaan

3

-

-

2.16a

12-11-2013

Zuid-Holland

Berkel en R.

2

-

-

2.16b

12-11-2013

Zuid-Holland

Berkel en R.

2

-

-

2.17a

13-11-2013

Noord-Holland

Nieuw Vennep

3

-

-

2.17b

13-11-2013

Noord-Holland

Nieuw Vennep

3

+

-

2.18a

13-11-2013

Utrecht

Nieuwegein

2

-

-

2.18b

13-11-2013

Utrecht

Nieuwegein

2

-

-

2.19a

13-11-2013

Zuid-Holland

Krimpen a/d Ij.

3

-

-

2.19b

13-11-2013

Zuid-Holland

Krimpen a/d Ij.

3

-

-

2.20a

13-11-2013

Zuid-Holland

Vlaardingen

3

-

-

2.20b

13-11-2013

Zuid-Holland

Vlaardingen

3

+

2

2.21a

13-11-2013

Zuid-Holland

Vlaardingen

3

-

-

2.21b

13-11-2013

Zuid-Holland

Vlaardingen

3

-

-

2.22a

13-11-2013

Zuid-Holland

Leidschendam

1

-

-

2.22b

13-11-2013

Zuid-Holland

Leidschendam

1

-

-

2.23a

15-11-2013

Noord-Holland

Amsterdam

1

-

-

2.23b

15-11-2013

Noord-Holland

Amsterdam

1

-

-

2.24a

15-11-2013

Noord-Holland

Amsterdam

3

-

-

2.24b

15-11-2013

Noord-Holland

Amsterdam

3

-

-

2.25a

13-11-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

2

-

1

2.25b

13-11-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

2

+

-

2.26a

15-11-2013

Utrecht

Kockengen

2

-

-

2.26b

15-11-2013

Utrecht

Kockengen

2

-

-

2.27a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.27b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.28a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.28b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.29a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

2

-

-

2.29b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

2

-

-

2.30a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

+

-

2.30b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.31a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

48

2.31b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.32a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

1

-

-

2.32b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

1

-

-

2.33a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.33b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

+

-

2.34a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

+

1

2.34b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.35a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.35b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.36a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.36b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.37a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.37b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.38a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.38b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.39a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

1

2.39b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.40a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.40b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

1

2.41a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.41b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.42b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.43a

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

-

2.43b

17-11-2013

Noord-Holland

Marken

3

-

1

2.44a

17-11-2013

Noord-Holland

Driehuis

3

-

-

2.44b

17-11-2013

Noord-Holland

Driehuis

3

-

-

2.45a

17-11-2013

Noord-Holland

Bloemendaal

3

-

-

2.45b

17-11-2013

Noord-Holland

Bloemendaal

3

-

-

2.46a

17-11-2013

Noord-Holland

Haarlem

2

-

1

2.46b

17-11-2013

Noord-Holland

Haarlem

2

-

-

2.47a

17-11-2013

Noord-Holland

Ijmuiden

3

-

-

2.47b

17-11-2013

Noord-Holland

Ijmuiden

3

-

-

2.48a

18-11-2013

Utrecht

Amerongen

1

-

-

2.48b

18-11-2013

Utrecht

Amerongen

1

-

-

2.49a

24-11-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

-

3

2.49b

24-11-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

-

1

2.50a

24-11-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

-

4

2.51a

16-12-2013

Noord-Holland

Aalsmeer

3

-

-

2.51b

16-12-2013

Noord-Holland

Aalsmeer

3

-

-

49

2.52a

16-12-2013

Noord-Holland

Loosdrecht

3

-

-

2.52b

16-12-2013

Noord-Holland

Loosdrecht

3

-

1

AH-

Herpes

Mycoplasma

SERIE 3 Staalnr

Datum

Provincie

Plaats

probleem

1= -inum

(1=Ja)

2=-inasale

(2=Ja,<6

3=-orale

mnd.)

4= ondef.

(3=Nee)

3.1a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

1

3.1b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

-

-

3.2a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

-

3.2b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

-

3.3a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

-

-

3.3b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

3

3.4a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

-

1

3.4b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

-

1

3.5a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

3.5b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

1

3.6a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

-

3.6b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

1

3.7a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

3.7b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

1

3.8a

13-12-2013

Zuid-Holland

Koudekerk

2

-

3

3.8b

13-12-2013

Zuid-Holland

Koudekerk

2

+

-

3.9a

13-12-2013

Zuid-Holland

Koudekerk

2

+

-

3.9b

13-12-2013

Zuid-Holland

Koudekerk

2

-

-

3.10a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

4

3.10b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

1

3.11a

13-12-2013

Zuid-Holland

Aarlanderveen

2

-

3

3.11b

13-12-2013

Zuid-Holland

Aarlanderveen

2

+

1

3.12a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

2

3.12b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

-

-

3.13a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

+

1

3.13b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

3.14a

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

2

3.14b

13-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

3

+

-

3.15a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

3.15b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

50

3.16a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.16b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.17a

14-12-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

-

-

3.17b

14-12-2013

Zuid-Holland

De Meije

3

+

-

3.18a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.18b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.19a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.19b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

2

3.20a

14-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

-

-

3.20b

14-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

-

-

3.21a

14-12-2013

Utrecht

Hekendorp

2

-

1

3.21b

14-12-2013

Utrecht

Hekendorp

2

-

1

3.22a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

3.22b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

3.23a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

3.23b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

3.24a

14-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

-

-

3.24b

14-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

-

-

3.25a

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.25b

14-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.26a

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

1

3.26b

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

+

3

3.27a

13-12-2013

Zuid-Holland

Vrouwenakker

3

-

-

3.27b

13-12-2013

Zuid-Holland

Vrouwenakker

3

-

-

3.28a

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.28b

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.29a

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.29b

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.30a

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

-

3.30b

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

3

3.31a

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

-

3.31b

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

-

3.32a

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

+

-

3.32b

13-12-2013

Zuid-Holland

Ter Aar

3

+

2

3.33a

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

2

-

1

3.33b

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

2

+

1

3.34a

13-12-2013

Noord-Holland

De Kwakel

3

-

2

3.34b

13-12-2013

Noord-Holland

De Kwakel

3

-

4

3.35a

13-12-2013

Zuid-Holland

Zevenhoven

3

+

-

51

3.35b

13-12-2013

Zuid-Holland

Zevenhoven

3

+

1

3.36a

13-12-2013

Zuid-Holland

Aarlanderveen

3

+

4

3.36b

13-12-2013

Zuid-Holland

Aarlanderveen

3

-

-

3.37a

13-12-2013

Zuid-Holland

Zevenhoven

3

+

4

3.37b

13-12-2013

Zuid-Holland

Zevenhoven

3

-

4

3.38a

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.38b

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.39a

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

+

1

3.39b

13-12-2013

Zuid-Holland

Nieuwveen

3

-

-

3.40a

20-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

+

-

3.40b

20-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

-

1

3.41a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

3

-

-

3.41b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

3

-

1

3.42a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

+

-

3.42b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

-

1

3.43a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

+

-

3.43b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

+

-

3.44a

20-12-2013

Utrecht

Hekendorp

2

+

-

3.44b

20-12-2013

Utrecht

Hekendorp

2

+

-

3.45a

20-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.45b

20-12-2013

Zuid-Holland

Bodegraven

2

-

-

3.46a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

-

1

3.46b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

+

-

3.47a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

-

-

3.47b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

+

-

3.48a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

-

-

3.48b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

2

-

-

3.49a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

3

-

-

3.49b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

3

-

-

3.50a

20-12-2013

Utrecht

Woerden

3

-

-

3.50b

20-12-2013

Utrecht

Woerden

3

-

-

SERIE 4 Staalnr

Datum

Provincie

Plaats

AH-

Herpes

Mycoplasma

probleem

1= -inum

(1=Ja)

2=-inasale

(2=Ja,<6

3=-orale

mnd.)

4= ondef.

(3=Nee)

4.1a

16-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

+

4 52

4.1b

16-12-2013

Zuid-Holland

Reeuwijk

3

-

2

4.2

30-12-2013

Zuid-Holland

Leerdam

3

-

-

4.3a

30-12-2013

Utrecht

Benschop

3

-

1

4.3b

30-12-2013

Utrecht

Benschop

3

+

-

4.4a

30-12-2013

Utrecht

Benschop

3

-

1

4.4b

30-12-2013

Utrecht

Benschop

3

-

2

4.5a

5-1-2014

Noord-Holland

Santpoort

3

-

-

4.5b

5-1-2014

Noord-Holland

Santpoort

3

-

-

4.6a

6-1-2014

Utrecht

Maarssen

3

-

-

4.6b

6-1-2014

Utrecht

Maarssen

3

+

2

4.7a

6-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

-

-

4.7b

6-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

-

-

4.8a

6-1-2014

Utrecht

Driebergen

2

-

1

4.8b

6-1-2014

Utrecht

Driebergen

2

-

1

4.9a

6-1-2014

Utrecht

Driebergen

3

+

-

4.9b

6-1-2014

Utrecht

Driebergen

3

+

-

4.10a

7-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

-

4

4.10b

7-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

-

1

4.11a

7-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

+

3

4.11b

7-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

+

1

4.12a

7-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

+

1

4.12b

7-1-2014

Utrecht

Utrecht

3

+

1

4.13a

7-1-2014

Zuid-Holland

Ameide

3

-

1

4.13b

7-1-2014

Zuid-Holland

Ameide

3

+

-

4.14a

7-1-2014

Zuid-Holland

Leidschendam

1

+

-

4.14b

7-1-2014

Zuid-Holland

Leidschendam

1

+

2

4.15a

8-1-2014

Utrecht

Veenendaal

3

+

1

4.15b

8-1-2014

Utrecht

Veenendaal

3

+

1

4.16a

13-1-2014

Zuid-Holland

Leerdam

1

+

2

4.16b

13-1-2014

Zuid-Holland

Leerdam

1

+

-

4.17a

13-1-2014

Noord-Holland

Amsterdam

2

+

-

4.17b

13-1-2014

Noord-Holland

Amsterdam

2

-

-

4.18a

20-1-2014

Noord-Holland

Badhoevedorp

3

-

-

4.18b

20-1-2014

Noord-Holland

Badhoevedorp

3

-

3

4.19a

20-1-2014

Noord-Holland

Uithoorn

2

+

1

4.19b

20-1-2014

Noord-Holland

Uithoorn

2

+

4

4.20a

20-1-2014

Noord-Holland

Loosdrecht

3

-

1

4.20b

20-1-2014

Noord-Holland

Loosdrecht

3

+

-

4.21a

20-1-2014

Noord-Holland

Hilversum

3

+

2

53

4.21b

20-1-2014

Noord-Holland

Hilversum

3

+

1

4.22a

21-1-2014

Noord-Holland

Huizen

2

+

2

4.22b

21-1-2014

Noord-Holland

Huizen

2

-

-

4.23a

21-1-2014

Noord-Holland

Huizen

1

-

3

4.23b

21-1-2014

Noord-Holland

Huizen

1

-

1

4.24a

21-1-2014

Noord-Holland

Nrd-Beemster

2

-

3

4.24b

21-1-2014

Noord-Holland

Nrd-Beemster

2

+

-

4.25a

27-1-2014

Noord-Holland

Uitgeest

3

-

3

4.25b

27-1-2014

Noord-Holland

Uitgeest

3

-

-

4.26a

27-1-2014

Zuid-Holland

Gouda

1

-

-

4.26b

27-1-2014

Zuid-Holland

Gouda

1

-

-

4.27a

28-1-2014

Noord-Holland

Nieuw-Vennep

3

-

4

4.27b

28-1-2014

Noord-Holland

Nieuw-Vennep

3

-

1

4.28a

29-1-2014

Noord-Holland

Mijdrecht

1

+

1

4.28b

29-1-2014

Noord-Holland

Mijdrecht

1

-

1

4.29a

3-2-2014

Utrecht

Veenendaal

2

-

3

4.29b

3-2-2014

Utrecht

Veenendaal

2

+

-

4.30a

6-2-2014

Noord-Holland

Zaandam

3

-

1

4.30b

6-2-2014

Noord-Holland

Zaandam

3

+

1

4.31a

7-2-2014

Utrecht

Vinkeveen

3

+

1

4.31b

7-2-2014

Utrecht

Vinkeveen

3

+

1

4.32a

7-2-2014

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

4.32b

7-2-2014

Noord-Holland

Zaandam

3

-

2

4.33a

9-2-2014

Zuid-Holland

Sassenheim

2

-

-

4.33b

9-2-2014

Zuid-Holland

Sassenheim

2

-

-

4.34a

10-2-2014

Zuid-Holland

Sassenheim

3

-

1

4.34b

10-2-2014

Zuid-Holland

Sassenheim

3

+

1

4.35a

10-2-2014

Noord-Holland

Driehuis

3

+

-

4.35b

10-2-2014

Noord-Holland

Driehuis

3

-

2

4.36a

11-2-2014

Utrecht

Utrecht

3

-

-

4.36b

11-2-2014

Utrecht

Utrecht

3

+

-

4.37a

17-2-2014

Utrecht

Utrecht

1

-

-

4.37b

17-2-2014

Utrecht

Utrecht

1

-

-

4.38a

18-2-2014

Noord-Holland

Amsterdam

3

+

4

4.38b

18-2-2014

Noord-Holland

Amsterdam

3

-

1

4.39a

18-2-2014

Zuid-Holland

Krimpen a/d Ij.

3

-

-

4.39b

18-2-2014

Zuid-Holland

Krimpen a/d Ij.

3

+

1

4.40a

18-2-2014

Noord-Holland

Amstelveen

2

+

2

4.40b

18-2-2014

Noord-Holland

Amstelveen

2

+

1

54

4.41a

20-2-2014

Utrecht

De Hoef

3

+

-

4.41b

20-2-2014

Utrecht

De Hoef

3

-

1

4.42a

25-2-2014

Noord-Holland

Zaandam

2

+

3

4.42b

25-2-2014

Noord-Holland

Zaandam

2

+

3

4.43a

25-2-2014

Noord-Holland

Amsterdam

3

-

-

4.43b

25-2-2014

Noord-Holland

Amsterdam

3

+

1

4.44a

25-2-2014

Utrecht

Maarssen

2

+

1

4.44b

25-2-2014

Utrecht

Maarssen

2

-

3

4.45a

25-2-2014

Noord-Holland

Kortenhoef

3

-

-

4.45b

25-2-2014

Noord-Holland

Kortenhoef

3

+

1

4.46a

3-3-2014

Zuid-Holland

Gouda

3

-

-

4.46b

3-3-2014

Zuid-Holland

Gouda

3

-

-

4.47a

4-3-2014

Noord-Holland

Zaandam

1

+

2

4.47b

4-3-2014

Noord-Holland

Zaandam

1

-

1

4.48a

5-3-2014

Zuid-Holland

Moerkapelle

3

+

2

4.48b

5-3-2014

Zuid-Holland

Moerkapelle

3

+

-

4.49a

7-3-2014

Noord-Holland

Krommenie

3

-

-

4.49b

7-3-2014

Noord-Holland

Krommenie

3

+

1

4.50a

7-3-2014

Noord-Holland

Krommenie

3

-

-

4.50b

7-3-2014

Noord-Holland

Krommenie

3

-

-

4.51a

7-3-2014

Utrecht

Amersfoort

3

-

-

4.51b

7-3-2014

Utrecht

Amersfoort

3

+

-

4.52a

10-3-2014

Noord-Holland

Heemskerk

2

+

-

4.52b

10-3-2014

Noord-Holland

Heemskerk

2

+

-

4.53a

10-3-2014

Noord-Holland

Uitgeest

3

+

-

4.53b

10-3-2014

Noord-Holland

Uitgeest

3

+

-

AH-

Herpes

Mycoplasma

SERIE 5 Staalnr

Datum

Provincie

Plaats

probleem

1= -inum

(1=Ja)

2=-inasale

(2=Ja,<6

3=-orale

mnd.)

4= ondef.

(3=Nee)

5.1a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

1

5.1b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

1

5.2a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.2b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.3a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.3b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

55

5.4a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.4b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.5a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.5b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.6a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

-

5.6b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

3

-

2

5.7a

27-12-2013

Noord-Holland

Koog a/d Zaan

3

-

-

5.7b

27-12-2013

Noord-Holland

Koog a/d Zaan

3

-

-

5.8a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandijk

2

-

-

5.8b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandijk

2

-

-

5.9a

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.9b

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

+

-

5.10a

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

1

-

-

5.10b

27-12-2013

Noord-Holland

Zaandam

1

-

-

5.11a

28-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

5.11b

28-12-2013

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

-

5.12a

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.12b

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.13a

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

1

5.13b

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

2

5.14a

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

+

1

5.14b

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

1

5.15a

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.15b

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.16a

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.16b

29-12-2013

Zuid-Holland

Wassenaar

3

-

-

5.17a

29-12-2013

Zuid-Holland

Leiden

3

-

2

5.17b

29-12-2013

Zuid-Holland

Leiden

3

-

2

AH-

Herpes

Mycoplasma

SERIE 6 Staalnr

Datum

Provincie

Plaats

probleem

1= -inum

(1=Ja)

2=-inasale

(2=Ja,<6

3=-orale

mnd.)

4= ondef.

(3=Nee)

6.1a

24-1-2014

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

6.1b

24-1-2014

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

-

6.2a

6-2-2014

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

2

6.2b

6-2-2014

Zuid-Holland

Bodegraven

3

-

2 56

6.3a

6-2-2014

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

1

6.3b

6-2-2014

Zuid-Holland

Alphen a/d Rijn

2

-

4

6.4a

8-2-2014

Zuid-Holland

Rijswijk

2

-

1

6.4b

8-2-2014

Zuid-Holland

Rijswijk

2

-

1

6.5a

8-2-2014

Zuid-Holland

Voorburg

3

+

-

6.5b

8-2-2014

Zuid-Holland

Voorburg

3

-

-

6.6a

8-2-2014

Zuid-Holland

Nootdorp

3

+

2

6.6b

8-2-2014

Zuid-Holland

Nootdorp

3

+

1

6.7a

8-2-2014

Zuid-Holland

Delft

3

-

2

6.7b

8-2-2014

Zuid-Holland

Delft

3

+

2

6.8a

8-2-2014

Zuid-Holland

Nootdorp

3

-

2

6.8b

8-2-2014

Zuid-Holland

Nootdorp

3

-

4

6.9a

14-2-2014

Zuid-Holland

Dordrecht

2

-

-

6.9b

14-2-2014

Zuid-Holland

Dordrecht

2

-

1

6.10a

15-2-2014

Zuid-Holland

Noorden

3

-

2

6.10b

15-2-2014

Zuid-Holland

Noorden

3

-

2

6.11a

16-2-2014

Utrecht

Breukelen

3

-

2

6.11b

16-2-2014

Utrecht

Breukelen

3

-

1

6.12a

22-2-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

3

+

1

6.12b

22-2-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

3

-

2

6.13a

22-2-2014

Zuid-Holland

Gouda

3

+

1

6.13b

22-2-2014

Zuid-Holland

Gouda

3

-

2

6.14a

22-2-2014

Zuid-Holland

Gouda

3

-

2

6.14b

22-2-2014

Zuid-Holland

Gouda

3

-

2

6.15a

22-2-2014

Zuid-Holland

Stolwijk

2

+

-

6.15b

22-2-2014

Zuid-Holland

Stolwijk

2

-

2

6.16a

2-3-2014

Zuid-Holland

Ammerstol

2

-

1

6.16b

2-3-2014

Zuid-Holland

Ammerstol

2

+

1

6.17a

3-3-2014

Zuid-Holland

Nieuwkoop

2

-

-

6.17b

3-3-2014

Zuid-Holland

Nieuwkoop

2

-

4

6.18a

15-3-2014

Zuid-Holland

Waddinxveen

2

+

2

6.18b

15-3-2014

Zuid-Holland

Waddinxveen

2

+

1

6.19a

15-3-2014

Zuid-Holland

Moerkapelle

3

-

2

6.19b

15-3-2014

Zuid-Holland

Moerkapelle

3

-

2

6.20a

15-3-2014

Zuid-Holland

Moerkapelle

3

-

-

6.20b

15-3-2014

Zuid-Holland

Moerkapelle

3

+

-

6.21a

15-3-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

2

-

-

6.21b

15-3-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

2

-

1

6.22a

15-3-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

2

-

-

57

6.22b

15-3-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

2

+

-

6.23a

15-3-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

3

-

1

6.23b

15-3-2014

Zuid-Holland

Zevenhuizen

3

+

1

6.24a

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

3

+

-

6.24b

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

2

6.25a

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

2

6.25b

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

-

6.26a

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

3

-

1

6.26b

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

3

+

2

6.27a

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

2

-

2

6.27b

16-3-2014

Zuid-Holland

Ter Aar

2

+

2

6.28a

16-3-2014

Zuid-Holland

Zwammerdam

2

-

1

6.28b

16-3-2014

Zuid-Holland

Zwammerdam

2

-

1

58