ABSTRAKTA. XX. celostátní konference DNA diagnostiky Dolní Morava

Společnost lékařské genetiky a genomiky ČLS JEP, Ústav lékařské genetiky LF UP a FNOLa Fakultní nemocnice Olomouc

ABSTRAKTA XX. celostátní konference DNA diagnostiky 3. - 4. 11. 2016 Dolní Morava Pod záštitou:

prof. MUDr. Milan Kolář, Ph.D. – děkan LF UP doc. MUDr. Roman Havlík, Ph.D. – ředitel FNOL prof. MUDr. Martin Procházka, Ph.D. – přednosta Ústavu lékařské genetiky

Realizační tým

Odborní garanti: doc. RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D. doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D.

Hana Liberdová Michaela Mlčochová Bc. Renata Streitová Mgr. Hana Synková Mgr. Dita Vrbická, Ph.D. Mgr. Petr Vrtěl

RNDr. Kateřina Adamová, Ph.D. Mgr. Jana Böhmová Vladimíra Drgová Mgr. Hana Filipová, Ph.D. Mgr. Mária Janíková, Ph.D. Mgr. Romana Kratochvílová

Drahé kolegyně, drazí kolegové, v nacházejícím se hlubokém, temném, ponurém, bezútěšném, zamračeném, zamlženém, nechutném, vlhkém, studeném, větrném, deštivém, krutém, zavadlém, nepřátelském, psabynevyhánějícím, zahnilém, smrdutém, nepřitažlivém, nekonečném, skličujícím, odporném, dusivém, užírajícím, životberoucím, nesnesitelném a veskrze depresivním podzimu se neúprosně blíží čas na naše tradiční, vřelé, milé, pozitivně laděné, prospěšné, veselé, poučné, optimistické, kvalitní, mírumilovné, oduševnělé, županové, horské, saunové, odborné, pracovně-společenské, společensko-pracovní, romantické, neformální, otevřené, blahodárné, svěží, inspirativní a již a neuvěřitelně dvacáté setkání milovníků DNA. Bude nás kolem 250 a podle údajů z posledního sčítáni lidu v roce 2011 bychom klidně mohli vytvořit město např. Genopolis nebo České nebo Moravské Dnatice a krásně bychom se vmezeřili mezi 599. Boží Dar a 600. Rejštejn. A to už nemůže být náhoda. NGSmánie je v plném proudu, i když k potěšení všech „DNA duchniček“ se staré dobré třistadesítky a třijednatřicítky drží zubynehty a jsou vždy odhodlané a připravené k definitivní konfirmaci Majsíkem nebo Pídžíemkem nalezených variant (omlouvám se, ale na Juniora jsem již pozapomněl). Ale čím si můžeme být do budoucna téměř jisti je skutečnost, že se pomalu ale nezadržitelně blíží SMRT a první praktické zkušenosti s ní můžeme očekávat již za několik let. Celkem budeme mít možnost vyslechnout nebo prostudovat více než 70 odborných příspěvků, program a jednotlivá abstrakta budou vydané v elektronickém sborníku a dostupné na stránkách naší konference. Doufejme, že nám počasí umožní společný výlet lanovkou na „Cestu do oblak“, která je plánovaná v pátek po obědě. Dovolte nám popřát, aby se setkání podařilo a aby se každému účastníku vrylo jak do profesní, tak i citové paměťové oblasti mozku. Za organizátory můžeme slíbit, že budeme nápomocni při každém Vašem kroku a že upřímný úsměv z našich obličejů bude vymazán přesně v pátek 4. 11. v 16:00. Na brzkou shledanou na Dolní Moravě RV a RV a MP

www.dna2016.cz XX. celostátní konference DNA diagnostiky PROGRAM Určeno pro účastníky konference Editoři: doc. RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D., doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D. Výkonná redaktorka: Vladimíra Drgová Grafická úprava: STUDIO5 v.o.s.

Publikace ve vydavatelství neprošla redakční jazykovou úpravou. 1. vydání, Olomouc 2016, Neprodejná publikace ISBN 978-80-270-0744-8 Neoprávněné užití tohoto díla je porušením autorských práv a může zakládat občansko-právní, správněprávní, popř. trestněprávní odpovědnost.

PROGRAM XX. celostátní konference DNA diagnostiky | 3. - 4. 11. 2016 Dolní Morava | www.dna2016.cz

ODBORNÝ PROGRAM

3. 11:24 -11:36

StřeDA 2. liStOPADu 2016 08:30 - 17:00

Všední analýza next-generation sekvenačních dat - bioinformatický workshop SEQme - více na: (https://www.seqme.eu/cs/kurzy/dates/next-gen-sekvenovani-windows) 17:00-19:00 REGISTRACE 20:00 UVÍTACÍ SETKÁNÍ

Piherová L., Stránecký V., Hartmannová H., Hodaňová K., Trešlová H., Kubánek M., Krebsová A., Paleček T., Kmoch S.

4. 11:36-11:48

08:20-08:30

REGISTRACE ZAHÁJENÍ KONFERENCE

BlOk 1: PřÍMÁ A NePřÍMÁ DiAGNOStikA MONOGeNNÍCH NeBO OliGOGeNNÍCH ONeMOCNĚNÍ Předsedající: Macek M., Vrtěl R., Korábečná M.

1. 08:30-08:42

BlOk 3: ONkOGeNetikA

KORELACE FENOTYPU A GENOTYPU U PACIENTŮ S KOMPLEXEM TUBERÓZNÍ SKLERÓZY Filipová H., Vrtěl R., Vodička R., Procházka M.

3. 08:54-09:06

Předsedající: Foretová L., Janíková M.

1. 11:48-12:00

NEOBVYKLÝ MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝ NÁLEZ U PACIENTA S X-SCID

2. 12:00-12:12

3. 12:12-12:22

Předsedající: Scheinost O., Pospíšilová Š.

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA DEFICIENCE LIPOPROTEINOVÉ LIPÁSY (LPLD)

4. 13:30-13:42

INTERPRETACE VARIANT DNA ZÍSKANÝCH SEKVENOVÁNÍM NOVÉ GENERACE V DIAGNOSTICE KARDIOMYOPATIÍ: NUTNOST REKLASIFIKACE

5. 13:42-13:54

MUTACE GENU STRC JSOU ČASTOU PŘÍČINOU VROZENÉ PORUCHY SLUCHU V ČESKÉ REPUBLICE Paprskářová M., Plevová P., Tvrdá P., Turská P., Slavkovský R., Hladíková A., Mrázková E.

7. 09:42-09:54

DETEKCE PŘÍČIN VROZENÝCH KOSTNÍCH ONEMOCNĚNÍ POMOCÍ SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE Paprskářová M., Plevová P., Turská P., Baxová A., Košťálová L., Malíková M.

8. 9:54-10:06 9. 10:06-10:18

10. 10:18-10:30

6. 13:54-14:06

7. 14:06-14:18

9. 14:30-14:42

CO LZE ČEKAT OD DNA VYŠETŘENÍ U NEUROPATIE S POZDNÍM ZAČÁTKEM (PO 40. NEBO I 50. ROCE VĚKU)?

10. 14:42-14:54

POTENCIÁLNÍ ROLE METYLACE KADHERINU 13 JAKO BIOMARKERU U KARCINOMU VAJEČNÍKŮ

Chmelařová M., Bubancová I., Hrochová K., Laco J., Dvořák O., Palička V.

SEKVENOVANIE PANELOV GÉNOV V DIAGNOSTIKE HEREDITÁRNYCH ONKOLOGICKÝCH SYNDRÓMOV

Konečný M., Dolešová L., Hamidová O., Závodná K., Valachová A., Mlkvá I., Cisárik F., Kantárska D.

LIBRARY PREPARATION FOR NEXT GENERATION SEQUENCING USING NEBNEXT KITS

11. 14:54-15:04

NGS DIAGNOSTIKA V NOVÝCH ČASECH:

ČAS NA KAFE A NĚJAKOU TU DUSIVKU

12. 15:04-15:14

SEKVENOVÁ NOVÉ GENERACE V DIAGNOSTICE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ

Předsedající: Valášková I., Kuglík P., Seeman P.

VÝZNAM GENOME-WIDE SCREENINGOVÝCH TECHNIK U DĚTSKÝCH PACIENTŮ S MENTÁLNÍMI RETARDACEMI A VÝVOJOVÝMI VADAMI: PŘEHLED VYŠETŘENÍ BĚHEM LET 2007-2015 NA OLG FN BRNO Smetana J., Wayhelová M., Mikulášová A., Oppelt J., Vallová V., Kašíková K., Filková H., Blažková D., Gaillyová R., Kuglík P.

2. 11:12-11:24

VÝSKYT SOMATICKÝCH MUTACÍ V PROTOONKOGENECH A TUMOR SUPRESOROVÝCH GENECH U ČESKÝCH PACIENTŮ S RŮZNÝMI TYPY NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ Benešová L., Belšánová B., Hálková T., Minárik M.

Horák P., PentaGen s.r.o.

Bielik P., Elisabeth Pharmacon

BlOk 2: PřÍMÁ A NePřÍMÁ DiAGNOStikA POlYGeNNÍCH ONeMOCNĚNÍ 1. 11:00-11:12

VÝZNAM PANELOVÉHO TESTOVÁNÍ POMOCÍ NGS V ONKOLOGICKÉ PROBLEMATICE Foretová L., Navrátilová M., Házová J., Vašíčková P., Štahlová Hrabincová E., Macháčková E.

KOMPLEXNÍ MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ ANALÝZA GENU TRPS1 U PACIENTŮ S TRICHORHINOFALANGEÁLNÍM SYNDROMEM

Janoušek J., BioTech 10:40 - 11:00

PEUTZ-JEGHERSOV SYNDRÓM A DNA DIAGNOSTIKA GÉNU STK11 Dolešová L., Konečný M., Hamidová O., Cisárik F., Barošová J., Repiská V.

Seeman P., Laššuthová P., Brožková D., Neupauerová J., Krůtová M., Meszárosová A., Staněk D., Mazanec R.

11. 10:30-10:40

KLINICKO-GENETICKÁ A MOLEKULOVÁ ANALÝZA PACIENTOV S OJEDINELOU IMUNOHISTOCHEMICKOU STRATOU VŠETKÝCH ŠTYROCH „MISMATCH“ REPARAČNÝCH (MLH1/MSH2/MSH6/PMS2) PROTEÍNOV

Závodná K., Hamidová O., Kajo K., Slamka T., Alemayehu A., Lohajová Behulová R., Konečný M.

8. 14:18-14:30

Šolc R., Klugerová M., Včelák J., Baxová A., Kuklík M., Všetička J., Beharka R., Hirschfeldová K.

ANALÝZA NÍZKOFREKVENTNÍCH SOMATICKÝCH VARIANT POMOCÍ NGS Tichý B., Pospíšilová Š., Malčíková J., Pál K., Radová L.

MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA ALPORTOVA SYNDROMU A SYNDROMU TENKÉ BAZÁLNÍ MEMBRÁNY Plevová P., Turská P., Slavkovský R.

ČAS NA OBĚD

BlOk 3: ONkOGeNetikA (POkRAČOvÁNÍ)

Kadlecová J., Veverková A., Nikulenkov Grochová D., Hiemerová M., Matyášová M., Dobšáková Z., Skutková L., Grochová I.

6. 09:30-09:42

AKO SPRAVIŤ CESTU K PERSONALIZOVANEJ LIEČBE RAKOVINY LAHŠOU Guillén C., Thermo Fisher Scientific

12:30 - 13:30

Valášková I., Křížová J.

5. 09:18-09:30

GENETICKÁ PREDISPOZICE KE KARCINOMU PRSU A VAJEČNÍKŮ U NON-BRCA PACIENTEK

Orlíková A., Plevová P., Paprskářová M., Hladíková A., Slavkovský R., Turská P.

Grombiříková H., Ravčuková B., Dederová J., Cochino A., Freiberger T.

4. 09:06-09:18

STUDIUM HETEROGENITY MUTACÍ V PRŮBĚHU TERAPIE PACIENTŮ S AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIÍ Folta A., Ježíšková I., Dvořáková D., Tom N., Semerád L., Šustková Z., Čulen M., Kosařová Z., Žák P., Szotkowski T., Jindra P., Cetkovský P., Ráčil Z.

7 PŘÍPADŮ KLEIDOKRANIÁLNÍ DYSPLÁZIE S MUTACEMI GENU RUNX2

Liška F., Chylíková B., Němečková J., Štenglová D., Veselá K., Baxová A.

2. 08:42-08:54

VYHLEDÁVÁNÍ VZÁCNÝCH GENETICKÝCH VARIANT U TROMBOFILNÍCH STAVŮ - ZAVEDENÍ DO KLINICKÉ PRAXE

Vrtěl P., Vodička R., Procházka M., Vrtěl R., Slavík L., Procházková J.

ČtvRtek 3. liStOPADu 2016 08:00-08:20

NEXT GENERATION SEQUENCING FOR EARLY DIAGNOSIS AND INDIVIDUALIZED TREATMENT OF DILATED CARDIOMYOPATHY AND RELATED FORMS OF CARDIOMYOPATHY

15:14 - 15:40


BlOk 4: BiOiNFORMAtikA Předsedající: Brož P., Stočes Š.

1. 15:40-15:50

HLA GENOTYPIZACE U CENTRÁLNÍCH HYPERSOMNIÍ

NGS NÁHRADA MLPA® POUŽITÍM NÁSTROJE HROMADNÉ CNV ANALÝZY SOFTWARU NEXTGENE® (V2.4.2) Zástěra J., Carolina Biosystems s.r.o.

Šiffnerová V., Šonka K., Vraná M.

2. 15:50-16:02

INFRASTRUKTURA PRO BIOINFORMATIKU V SUPERPOČÍTAČOVÉM CENTRU IT4I (WWW.IT4I.CZ) Mokrejš M., Svatoň V., Hrbáč D., Stachoň M., Jansík B., Martinovič J.

PROGRAM XX. celostátní konference DNA diagnostiky | 3. - 4. 11. 2016 Dolní Morava | www.dna2016.cz 3. 16:02-16:12

PÁtek 4. liStOPADu 2016

SEQUENCHER; NÁSTROJ PRO ANALÝZU NEXT-GENERATION SEKVENAČNÍCH DAT VE WINDOWS Stočes Š., SEQme s.r.o.

4. 16:12-16-22

FINALISTDX - CÍLENÉ ŘEŠENÍ PRO DIAGNOSTICKÉ LABORATOŘE Jakoubek P., Brož P., Accela

BlOk 5: vYuŽitÍ NOvÝCH POStuPŮ v DNA DiAGNOStiCe

BlOk 7: OStAtNÍ tÉMAtikA Předsedající: Drábek J., Hořínek A.

1. 09:00-09:12

HISTORIE A SOUČASNOST URČOVÁNÍ OTCOVSTVÍ

2. 09:12-09:24

ČÍM SE ZABÝVÁ ČESKÝ NÁRODNÍ REGISTR DÁRCŮ DŘENĚ?

Předsedající: Scheinost O., Putzová M., Vodička R.

1. 16:22-16:34

VÝVOJ NGS PANELU PRO URČENÍ NOSIČSTVÍ GENETICKÝCH VARIANT AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍCH ONEMOCNĚNÍ Lhota F., Zembol F., Honysová B., Černá L., Koudová M., Bittóová M., Stejskal D.

2. 16:34-16:46

STANOVENÍ BRAF MUTOVANÉ VOLNÉ NÁDOROVÉ DNA JAKO NÁSTROJ PRO MONITORING PACIENTŮ LÉČENÝCH PRO METASTAZUJÍCÍ MELANOM Putzová M., Arenbergerová M., Šedivcová M., Vaněček T., Michal M.

3. 16:46-16:58

SPEKTRUM MUTACÍ ODHALENÝCH METODOU CELOEXOMOVÉHO SEKVENOVÁNÍ U PACIENTŮ S IMUNITNÍ CYTOPENIÍ

Svatoň M., Kanderová V., Smíšek P., Suková M., Šrámková L., Kayserová J., Stuchlý J., Žaliová M., Freiberger T., Dušátková L., Průhová Š., Zachová R., Pospíšilová D., Blatný J., Procházková D., Mejstříková E., Kalina T., Šedivá A., Starý J., Trka J., Froňková E.

4. 16:58-17:10

NÁZEV SDĚLENÍ: ANALÝZA REZISTENCÍ V GENECH NS3 A NS5A VIRU HEPATITIDY C PŘI LÉČBĚ PŘÍMOPŮSOBÍCÍMI ANTIVIROTIKY (DAA) Trubač P., Piskunova N., Scheinost O., Chmelík V.

5. 17:10-17:20

SMARTEXTRACTION - EXTRAKCE NK RYCHLEJI, EFEKTIVNĚJI, SNÁZE

Šantová D., Marckardt L., Fořtová M., Jindra P.

3. 09:24-09:36

09:36-10:15

Předsedající: Brdička R., Dobrovolná M.

1. 10:15-10:27

KONTROLA KVALITY - VAZBA HLA S CHOROBAMI 2016

2. 10:27-10:39

VÝSLEDKY EXTERNÍHO HODNOCENÍ KVALITY PRO VYŠETŘENÍ BUNĚČNÉHO CHIMERIZMU ZA ROK 2016

Ratajová E., Vraná M.

Pegová K., Hrabáková P., Leontovyčová M., Přerovská R., Staňková M., Březinová D., Čechová H.

3. 10:39-10:51

ZÁVĚRY HARMONIZAČNÍ SCHŮZKY ČIA S ODBORNÝMI POSUZOVATELI ODBORNOSTI 816 - LÉKAŘSKÁ GENETIKA - MODEROVANÁ DISKUSE Dobrovolná M.

10:51-11:30 11:30-12:30

6. 17:20-17:30

QIAGEN: KOMPLETNÍ ŘEŠENÍ PRO NGS APLIKACE

16:00

7. 17:30-17:40

NGS TARGET ENRICHMENT - SOLUTIONS AND APPLICATIONS BY IDT AND CLONTECH/TAKARA

ZÁVĚREČNÁ DISKUSE ČAS NA OBĚD CESTA DO OBLAK PŘEDPOKLÁDANÉ UKONČENÍ KONFERENCE

Mikešová M., DYNEX

Jurkovičová D., KRD obchodní společnost

BlOk 6: PReiMPlANtAČNÍ A PReNAtÁlNÍ DiAGNOStikA

PřeHleD POSteROvÝCH PReZeNtACÍ 1.

Předsedající: Šantavý J., Šantavá A., Procházka M.

AKTUÁLNÍ TRENDY V PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ DIAGNOSTICE Horák J, Horňák M., Kubíček D., Pešáková M., Veselá K.

2.

ANEUPLOIDIE U LIDSKÝCH IVF EMBRYÍ JSOU NEJČASTĚJI ZAPŘÍČINĚNY CHYBOU 1. MEIOTICKÉHO DĚLENÍ BĚHEM OOGENEZE

2. 18:00-18:12

NEINVAZIVNÍ PRENATÁLNÍ TEST - PANORAMA

3. 18:12-18:24

AUTOMATIZACE METODY CFDNA TEST - NIPT

4. 18:24-18:36

PRENATÁLNA ANALÝZA VRODENÝCH VÝVOJOVÝCH VÁD SRDCA A OBLIČIEK METÓDOU MLPA

Gomolčáková B., Putzová M., Hasch M., Michal M.

ACADIAN VARIANT OF FANCONI SYNDROME IS CAUSED BY MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CHAIN COMPLEX I DEFICIENCY DUE TO A NON-CODING MUTATION IN COMPLEX I ASSEMBLY FACTOR NDUFAF6 Hartmannová H., Piherová L., Hodaňová K., Stránecký V., Přistoupilová A., Barešová V., Jedličková I., Živná M., Trešlová H., Bleyer A., Kmoch S.

3.

Marešová I., Horáková K., Zembol F., Hynek M., Vávrová J., Stejskal D., Koudová M., Bittóová M.

Štefeková A., Čapková Z., Čapková P.

PACIENT S MENKESOVOU NEMOCÍ A ROZSÁHLOU DUPLIKACÍ V ATP7A GENU

Záhoráková D., Hansíková H., Honzík T., Puchmajerová A., Zeman J., Martásek P.

Horňák M., Horák J., Kubíček D., Tauwinklová G., Trávník P., Veselá K.

Od 19:30


BlOk 8: MeZilABORAtORNÍ kONtROlA kvAlitY

12:30-15:00

2. 17:50-18:00

KLINICKY RELEVANTNÍ NÁLEZY CELOGENOMOVÉHO SCREENINGU U „ZDRAVÝCH” OSOB

Trková M., Bečvářová V., Hlavová E., Krutílková V., Rašková D., Hejtmánková M., Stejskal D., Koudová M., Horáček J.

Šustová A., GeneTiCA s.r.o.

1. 17:40-17:50

Drábek J.

IDENTIFICATION OF A NOVEL DNAJC5 MUTATION MISSED BY SANGER SEQUENCING IN A FAMILIAL CASE OF ADULT-ONSET NEURONAL CEROID LIPOFUSCINOSIS(ANCL) Jedličková I., Přistoupilová A., Stránecký V., Hůlková H., Kmoch S., Cadieux-Dion M., Cossette P., Andermann E., Andermann F.

4.

MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA SPINÁLNÍ MUSKULÁRNÍ ATROFIE V LABORATOŘI DNA DIAGNOSTIKY OLG FN OSTRAVA Buržáková K., Fojtík J., Valečková J., Balcar A., Gřegořová A., Grečmalová D., Dvořáčková N., Plevová P., Hladíková A.

ČAS NA VEČEŘI A SPOLEČENSKÝ VEČER 5.

MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÁ DIAGNOSTIKA AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍ POLYCYSTICKÉ CHOROBY LEDVIN

Obeidová L., Hojný J., Včelák J., Elišáková V., Kavec M., Reiterová J., Seeman T., Štekrová J.

6.

DNM1L-RELATED MITOCHONDRIAL FISSION DEFECT PRESENTING AS SPASTIC PARAPARESIS AND OPTIC ATROPHY

Tesařová M., Daňhelovská T., Rodinová M., Stránecký V., Beránková K., Sládková J., Vondráčková A., Spáčilová J., Zámečník J., Honzík T., Hansíková H., Zeman J.,

7.

PROBLÉMY S DIAGNOSTIKOU LEHKÉ HEMOFILIE A

Šimoníková M., Radovská A., Provazníková D., Hrachovinová I.

PROGRAM XX. celostátní konference DNA diagnostiky | 3. - 4. 11. 2016 Dolní Morava | www.dna2016.cz 8.

MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÁ DIAGNOSTIKA X-VÁZANÉHO HYDROCEFALU 2010 - 2016

9.

MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÁ DIAGNOSTIKA MUKOPOLYSACHARIDÓZY IVA

26.

TELOMERIC SEQUENCES IN CELL-FREE DNA ARE MORE ABUNDANT IN PLASMA THAN IN SERUM SAMPLES IN HEALTHY VOLUNTEERS

27.

DNA ANALÝZA EXTRAHUMÁNNÍHO GENOMU - DERMATOMYKÓZY, PROBLÉM DNEŠKA

Walczysková S., Hilscherová Š., Uhlíková H.

Švecová Š., Trefilová E., Zajícová Dočekalová D., Magner M., Hrubá E., Poupětová H., Zeman J., Tesařová M.

10.

ZAVEDENÍ SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE PRO PACIENTY SE SUSPEKTNÍ HEREDITÁRNÍ AMYLOIDÓZOU - PRVNÍ ZKUŠENOST

Zinková A., Svačina A., Hořínek A., Pazourková E., Korabečná M.

Staněk L., Horák P., Mihlova R., Šprincová A., Mačák J., Čížek J., Hasch M.

28.

Kufová Z., Januška J., Ševčíková T., Filipová J., Jelínek T., Kryukov F., Hájek R.

11.

MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÁ A BIOCHEMICKÁ PODSTATA VROZENÉ PORUCHY GLYKOSYLACE U PACIENTA S DEFICITEM GENU ATP6AP1

Vondráčková A., Ondrušková N., Stránecký V., Horová E., Trefilová E., Dočekalová Zajícová D., Hansíková H., Honzík T., Zeman J., Tesařová M.

12.

NEXT GENERATION SEQUENCING DATA ANALYSIS EVALUATION IN PATIENS WITH PARKONSONISM FROM GENETICALLY ISOLATED POPULATION Kolaříková K., Vodička R., Vrtěl R., Menšíková K., Kaňovský P., Procházka M., Dolinová I.

13.

GÉN PRE CHECKPOINT KINÁZU 2 A JEHO PORUCHY ASOCIOVANÉ S MALÍGNYMI OCHORENIAMI

14.

PILOTNÍ STUDIE: NGS ANALÝZA VYBRANÝCH GENŮ U ČESKÝCH PACIENTEK S ENDOMETROIDNÍM KARCINOMEM ENDOMETRIA NEBO OVÁRIA

15.

ZMĚNY EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ V PRIMÁRNÍCH NÁDORECH JATER JSOU NEJVÝZNAMĚJŠÍ U HIGH-GRADE TUMORŮ

TRANSKRIPTOMICKÉ PROFILOVÁNÍ TRANSPLANTOVANÝCH JATERNÍCH ŠTĚPŮ VE VZTAHU K ROZVOJI NEALKOHOLICKÉ JATERNÍ STEATÓZY

Šedová L., Chylíková B., Hejlová I., Dezortová M., Hájek M., Cahová M., Šeda O., Trunečka P.

29.

SROVNÁNÍ VÝSKYTU RIZIKOVÝCH HAPLOTYPŮ PRO CELIAKII U ZDRAVÝCH JEDINCŮ A U PACIENTŮ S PŘÍZNAKY CELIAKIE V ČESKÉ POPULACI

Blašková M., Vlčková Z., Indráková V., Slepičková I., Šplíchalová P.

PARtNeři

Žideková D., Hamidová O., Dolešová L., Konečný M.

Tichá I., Hájková N., Hojný J., Němejcová K., Dundr P.

Nekvindová J., Mrkvicová A., Souček P., Anzenbacher P., Slabý O., Kiss I., Palička V.

16.

PILOTNÍ STUDIE VYUŽITÍ NGS TECHNOLOGIE, PRŮKAZ A SLEDOVÁNÍ MUTACÍ V GENU CEBPA U AML PACIENTŮ Hrochová K., Vrbacký F., Petrová L., Chmelařová M., Zavřelová A., Radocha J., Žák P.

17.

SLEDOVÁNÍ EXPRESE EVI1 (TRANSKRIPČNÍ FAKTOR) V RÁMCI MRN U PACIENTŮ S AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIÍ

18.

ZÁCHYT SOMATICKÝCH MUTACÍ VYBRANÝCH POLYMERÁZ U PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM

Petrová L., Hrochová K., Havlíková P., Víšek B., Lánská M., Žák P.

Urbanová M., Včelák J., Schneiderová M., Vodičková L., Vodička P.

19.

VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ VYŠETŘENÍ MUTACÍ V GENECH BRCA1 A BRCA2 U RIZIKOVÝCH PACIENTŮ

20.

GLASS: ASSISTOVANÉ A ŠTANDARDIZOVANÉ POSUDZOVANIE SEKVENČNÝCH VARIANT Z DÁT SANGEROVHO SEKVENOVANIA

Curtisová V., Mracká E., Kratochvílová R., Žídková M.

Pál K., Bystrý V., Reigl T., Krejčí A.,Tichý B.,Pospíšilová Š., Malčíková J., Darzentas N.

21.

RYCHLÁ DETEKCE SOMATICKÝCH MUTACÍ U NÁDORŮ TLUSTÉHO STŘEVA (CRC), PLIC (NSCLC) A MALIGNÍHO MELANOMU S VYUŽITÍM SYSTÉMU BIOCARTIS IDYLLA™ Hopenštoková A., Šimová J., Kubová B., Žebráková I., Schreibrová L., Uvírová M., Urbanovská I., Konvalinka D., Měch R., Mazurová J., Dvořáčková N., Dvořáčková J.

22.

VYUŽITÍ METODY NGS PRO DETEKCI MOZAICISMU MUTACE V GENU KCNH2 ZPŮSOBUJÍCÍ SYNDROM DLOUHÉHO QT INTERVALU

23.

KAZUISTIKA: UPD CHROMOZOMU 14 JAKO VÝSLEDEK TRISOMIC RESCUE

Synková I., Ošťádalová E.

Soldátová I., Koudová M., Vilímová Z., Trková M., Jenčíková N., Nedomová V., Březinová S., Horáček J., Hodačová J., Bittoóvá M., Stejskal D.

24.

DIFFERENTIALLY EXPRESSED MIRNAS IN TRISOMY-21 PLACENTA Svobodová I., Korabečná M., Calda P., Břešťák M., Pazourková E., Pospíšilová Š., Krkavcová M., Novotná M., Hořínek A.

25.

NON-INVASIVE PRENATAL TESTING FOR FETAL ANEUPLODIES : A REPORT OF THREE ATYPICAL CASES

Horáková K., Marešová I., Vávrová J., Zembol F., Krutílková V., Trková M., Hynek M., Stejskal D., Bittóová M., Koudová M.

SuBPARtNeři

PŘEDNÁŠKY

| XX. celostátní konference DNA diagnostiky | 3. - 4. 11. 2016 Dolní Morava | www.dna2016.cz

I. - Diagnostika monogenních onemocnění 7 PŘÍPADŮ KLEIDOKRANIÁLNÍ DYSPLÁZIE S MUTACEMI GENU RUNX2 7 cases of cleidocranial dysplasia with RUNX2 mutations František Liška (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN) Spoluautoři: Blanka Chylíková (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN), Jitka Němečková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno), Dagmar Štenglová (Genetika Plzeň, s r. o.), Kamila Veselá (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN), Alica Baxová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN)

Úvod: Kleidokraniální dysplázie (CCD) je vzácné autozomálně dominantní onemocnění způsobené haploinsuficiencí RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), která postihuje funkci osteoblastů v celém skeletu, s nejvýraznější poruchou endesmální osifikace. To vede k hypoplázii nebo aplázii klíčních kostí, k pozdnímu uzavírání lebečních švů (s deformacemi), neznámým mechanizmem k zvýšení počtu nepříliš funkčních zubů a k dalším potížím. Metody: Vyšetřili jsme 7 případů kleidokraniální dysplázie, z toho 3 familiární a 4 sporadické. Všech 9 exonů RUNX2 (první nekódující, podle nejdelší známé sestřihové varianty NM_001024630.3) jsme amplifikovali pomocí standardní PCR a podrobili Sangerovu sekvenování. V případech, kdy sekvenace neodhalila patogenní mutaci, jsme provedli analýzu delecí/duplikací pomocí qPCR s detekcí pomocí SYBR Green. V jednom případě jsme identifikovali potenciální sestřihovou mutaci na začátku intronu 5, jejíž funkci jsme ověřili pomocí RNA z periferní krve, jednak RTPCR s primery přemosťujícími exon 4-6, jednak měřením rozdílu mezi amplifikací exonu 4 a 5 pomocí qRT-PCR. Výsledky: U tří případů jsme nalezli již dříve popsané bodové substituční mutace vedoucí k záměně aminokyseliny v heterozygotním stavu. V jednom případě jsme nalezli substituci v poloze +5 intronu 5, in silico se středně velkým poklesem skóre sestřihového místa. Proto jsme testovali sestřih genu pomocí RT-PCR z periferní krve a skutečně jsme nalezli cca v 30 % přeskočení exonu 5, což by měl být podle dostupných literárních dat právě takový pokles, který již způsobí postižení skeletu. Zajímavé je, že přeskočení exonu 5 (105 bp) nezpůsobí posun čtecího rámce, ale výpadek části klíčové domény „Runt“, včetně jaderného lokalizačního signálu. V jednom případě jsme zjistili heterozygotní deleci celého genu RUNX2, v jednom případě pak heterozygotní deleci exonu 4 a 5.

5

Závěr: Ve všech 7 případech s klinickou diagnózou kleidokraniální dysplázie jsme nalezli patogenní mutaci RUNX2, z toho 3 missense, 1 sestřihovou a 2 rozsáhlejší delece. KORELACE FENOTYPU A GENOTYPU U PACIENTŮ S KOMPLEXEM TUBERÓZNÍ SKLERÓZY Genotype/phenotype correlation in patients with tuberous sclerosis komplex Hana Filipová (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc) Spoluautoři: doc. RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D. (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc), doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D. (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc), prof. MUDr. Martin Procházka, Ph.D. (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc)

Komplex tuberózní sklerózy je onemocnění s autozomálně dominantním typem dědičnosti, které se projevuje benigními tumory v mnoha tkáních a orgánech (především na kůži, mozku, ledvinách a srdci). Příčinou tuberózní sklerózy jsou mutace v TSC1 a TSC2 genu.Tato studie byla zaměřena na analýzu TSC genů u vybraného souboru pacientů a následnou fenotyp/genotypovou korelaci. Analyzovaný soubor tvořilo 118 pacientů (99 probandů a 19 případů reprezentovalo tuberózní sklerózou postižené rodinné příslušníky některých probandů). K analýze TSC genů byly využity následující metody: MLPA, DGGE v kombinaci se Sangerovou metodou sekvenování nebo přímé Sangerovo sekvenování obou TSC genů či NGS na platformě Ion Torrent. Ve skupině 99 probandů bylo nalezeno 75 mutací v TSC2 genu a 24 mutací v TSC1 genu. Poměr detekovaných TSC2 : TSC1 mutací v rámci celého souboru byl 87 : 31. Celkem 27 zachycených sekvenčních variant (mutací) nebylo dosud popsáno v LOVD TSC1/TSC2. Poměr sporadických/familiárních případů byl ve skupině probandů 40 : 17 a 40 : 36 v celém souboru. U 42 probandů nebylo možné stanovit formu výskytu onemocnění. Variabilita klinických projevů onemocnění mezi pacienty byla značná a to i v rámci rodin či mezi nepříbuznými jedinci se stejnou mutací. V souladu s výsledky zahraničních výzkumů bylo v této fenotyp/genotypové studii prokázáno, že TSC2 mutace jsou spjaty se závažnějším fenotypovým projevem než mutace genu TSC1. U jedinců s TSC1 mutacemi byly vzácně pozorovány AML a vícečetné renální cysty, fibrózní plaky čela a hamartomy sítnice.

PŘEDNÁŠKY


Žádná statisticky významná korelace nebyla zaznamenána mezi jednotlivými kategoriemi mutací (sestřihovými, záměnovými a mutacemi způsobujícími zkrácení délky proteinu) a konkrétním fenotypovým projevem ve skupině TSC2 pacientů. TSC1 pacienti měli téměř výlučně pouze mutace vedoucí ke zkrácení délky genového produktu. Nositelé mutací způsobujících zkrácení délky tuberinu měli závažnější charakter onemocnění než jedinci s mutacemi vedoucími ke zkrácení délky hamartinu. Dále byly odhaleny významné korelace mezi nálezem hypomelanotických skvrn a výskytem kortikálních tuberů, mezi postižením kůže faciálními angiofibromy a nálezem renálních AML, mezi hamartomy sítnice a srdečním rhabdomyomem či mezi epilepsií a mentální retardací ve skupině pacientů s TSC2 mutacemi. NEOBVYKLÝ MOLEKULÁRNĚ BIOLOGICKÝ NÁLEZ U PACIENTA S X-SCID Unusual molecular biological finding in patient with X-SCID Hana Grombiříková (Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno) Spoluautoři: Barbora Ravčuková (Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno), Jana Dederová (Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno), Alexis Cochino (Institutut National de Medicina Legala, Bukurešť), Tomáš Freiberger (Centrum kardiovaskulární a transplantační chirurgie Brno)

Těžké kombinované imunodeficience (SCID) jsou nejzávažnější z primárních imunodeficiencí. Představují skupinu heterogenních genetických onemocnění, která postihují buněčnou i protilátkovou složku imunitního systému. Těžké, chronické infekce jsou tak prvním a nejzávažnějším projevem těchto chorob, které bez adekvátní léčby často končí letálně do jednoho roku věku. Jedním z klíčových diagnostických vyšetřením SCID je stanovení množství DNA epizómů v cytoplasmě buněk, vznikajících při vývoji T- a B- lymfocytů, tzv. TRECs (T-cell receptor excision circles) a KRECs (Kappa-deleting recombination excision circles). Nejčastější formou SCID je X-vázaná porucha v genu IL2RG, která se typicky projevuje chybějícími T-lymfocyty a NK buňkami a sníženou funkcí B-lymfocytů. Gen IL2RG kóduje gamma podjednotku cytokinových receptorů zodpovědných za přenos signálů do buňky a buněčného jádra, které jsou klíčové pro diferenciaci buněk. Vyšetřovali jsme devítiměsíčního chlapce, u kterého nebyly detekovány v krvi T-lymfocyty a NK buňky. Stanovení TRECs/KRECs pomoci qPCR svědčilo pro chybějící differenciaci T-lymfocytů, zatímco rekombinace B-lymfocytů zůstala částečně zachována. V genu IL2RG byla nalezena sestřihová mutace v heterozygotním stavu u matky probanda. Mutace byla 6

detekována i v DNA izolované z krve probanda, překvapivě však taktéž vykazovala heterozygotní obraz. HLA typizace prokázala u pacienta přítomnost 3 typů lymfocytů – pravděpodobně šlo o buňky pacienta, matky a dárce krve. Byl proto proveden odběr vzorku bukálním stěrem a následná analýza DNA získané z tohoto odběru potvrdila přítomnost jediné alely nesoucí mutaci v genu IL2RG. MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA DEFICIENCE LIPOPROTEINOVÉ LIPÁSY (LPLD). Molecular diagnostics of lipoprotein lipase deficiency (LPLD) Iveta Valášková (Oddělení lékařské genetiky FN Brno) Spoluautoři: Jana Křížová (Mendelova univerzita, Brno)

Lipoproteinová lipáza (LPL) je klíčový enzym v metabolismu lipoproteinů. Je obsažený zejm. v kapilárách tukové tkáně a tkáních využívajících mastné kyseliny jako zdroj energie (především příčně pruhované svaly a myokard). Enzym katalyzuje hydrolýzu triglyceridů (TG), které jsou součástí chylomikronů a lipoproteinů o velmi nízké hustotě (VLDL). Deficience lipoproteinové lipásy (LPLD), která vede ke zvýšené hladině triglyceridů, je v současné době považována za jeden ze závažných zdravotních problémů. Přibližně 30 % LPLD jsou spojeny s rekurentní pankreatitis.V LPL genu bylo zjištěno více než 220 mutací kauzálních pro familiární LPD. Tyto mutace redukují nebo eliminují aktivitu lipoproteinové lipázy. V důsledku toho se triglyceridy spojené s lipoproteiny hromadí v krvi a tkáních, což vede k pankreatitidě, zvětšení jater a sleziny (hepatosplenomegalie), tukovým usazeninám v kůži (eruptivní xantomy) a dalším příznakům LPLD. Četnost jednotlivých LPL mutací se liší široce mezi populacemi. Nejběžnější mutace asociovaná s LPLD u lidí evropského původu je Gly188Glu. U 20 % kavkazské populace se nachází sekvenční varianta Ser447stop, S447X, která je asociována se zvýšenou aktivitou LPL. Tato varianta genu LPL byla využita pro genovou terapii Alipogene Tiparvovec (také známá jako Glybera), která je aplikována u LPLD pacientů s těžkými nebo mnohočetnými ataky pankreatitidy s možným letálním dopadem, a to navzdory dietnímu omezení tuků. Vektor je adenoasociovaný virus typu I (AAV1) a obsahuje hyper funkční variantu genu LPL S447X. Glybera se podává intramuskulárně v celkové anestezii v asociaci s imunosupresí. Výsledky klinických studií prokázaly snížení hladiny triglyceridů o 40% po 3 až 12 týdnů. Vyšetřovaný soubor tvořili pacienti s těžkými nebo mnohočetnými ataky pankreatitidy, u kterých nebyla identifikována jiná genetická příčina onemocnění. Ukázalo se, že zvolený vyšetřovací algoritmus zahrnující metody

PŘEDNÁŠKY


MLPA, QF PCR, LightSNiP assay na HRM a sekvenování je vhodný pro vyšetření genu LPL a vyhledávání pacientů pro genovou terapii. Podařilo se vytipovat pacienty s LPLD vhodné pro genovou terapii AAV1-LPL S447X potvrzením patologické mutace v genu LPL. Dosažené výsledky se shodují v literatuře popsanými studiemi, které naznačují, že v rámci poruch metabolismu lipidů je významná nejen familiární chylomikronemie, ale i kombinovaná, podložená heterozygotními mutacemi. INTERPRETACE VARIANT DNA ZÍSKANÝCH SEKVENOVÁNÍM NOVÉ GENERACE V DIAGNOSTICE KARDIOMYOPATIÍ: NUTNOST REKLASIFIKACE Interpretation of the DNA variants obtained by the next generation sequencing in the cardiomyopathy diagnostics: the necessity of original NGS data reanalysis Jitka Kadlecová (Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o.) Spoluautoři: Alena Veverková (Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Kotlářská 2, Brno), Diana Nikulenkov Grochová (Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o., Veveří 39, Brno), Markéta Hiemerová (Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o., Veveří 39, Brno), Monika Matyášová (Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o., Veveří 39, Brno), Zuzana Dobšáková (Cytogenetická laboratoř Brno, s.r.o., Veveří 39, Brno), Linda Skutková (Fakultní nemocnice u sv. Anny v Brně, Mezinárodní centrum klinického významu (ICRC)), Ilga Grochová (Centrum prenatální diagnostiky, s.r.o., Veveří 39, Brno)

Dědičná kardiologická onemocnění (arytmie, kardiomyopatie) jsou heterogenní skupina onemocnění, která jsou způsobená mechanickou či elektrickou dysfunkcí srdečního svalu. V současné době je nejvhodnější technologie pro osvětlení vzniku těchto onemocnění sekvenování nové generace (NGS). Tato technologie umožňuje analýzu většího počtu genů a řešení problematiky genetického a fenotypového překrytí, které v diagnostice geneticky podmíněných chorob komplikuje správné určení diagnózy. Paralelní analýzou genů asociovaných s onemocněním srdce lze osvětlit příčiny vzniku onemocnění a identifikovat presymptomatické jedince v rodinách za účelem prevence a léčby. V souboru klinicky diagnostikovaných pacientů s dědičným srdečním onemocněním byly aplikovány následující technologie: TrueSight Enrichment (46 genů asociovaných s kardiomyopatiemi, Illumina), PED Mast Plus technology (56 genů popsaných u arytmií, Multiplicom) a NimbleGen technology (vlastní panel 97 genů v asociaci s kardiomyopatií i s arytmií, Roche) s následným sekvenováním na přístroji MiSeq. Klasifikovaná NGS data byla ukládána v průběhu dvou let do interní databáze laboratoře. Na základě informací z různých databází (NCBI dbSNP, NCBI ClinVar, OMIM, Ensembl atd.) a výsledků segregačních analýz v rodinách je prováděna zpětná klasifikace nalezených variant. 7

Dosavadní zkušenosti s NGS technologií v diagnostice kardiomyopatií ukazují na nutnost zpětné klasifikace nalezených variant, neboť analýza velkého počtu genů s sebou přináší nejen obrovský nárůst dat, která přispívají k osvětlení příčin vzniku těchto onemocnění, ale také nárůst informací, jež jsou z hlediska interpretace nejednoznačné. Z tohoto důvodu je nezbytné tyto informace periodicky přehodnocovat dle aktuálních údajů v odborných databázích. Library PREPARATION FOR NEXT GENERATION SEQUENCING USING NEBNEXT KITS Library Preparation for Next Generation Sequencing using NEBNext kits Josef Janoušek (BioTech)

Library preparation for Next Generation Sequencing represents important step in NGS analyses of DNA and RNA samples. Library preparation has influence on quantity and quality of obtained reads and hence it can influence result interpretation. The Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina (developed by New England Biolabs) enables high yield preparation of high quality libraries from 500 picograms to 1 microgram of input DNA. This kits offers fast, streamlined, automatable workflow with fewer PCR cycles. It can be used also with challenging samples such as FFPE DNA. NEBNext Ultra II DNA Library Prep with Sample Purification Beads kit contains SPRIselect beads (Beckman Coulter) for flexible and reliable size selection and enzyme reaction cleanup. MUTACE GENU STRC JSOU ČASTOU PŘÍČINOU VROZENÉ PORUCHY SLUCHU V ČESKÉ REPUBLICE STRC gene mutations are a frequent cause of congenital hearing impairment in the Czech Republic Martina Paprskářová (Oddělení lékařské genetiky, FN Ostrava) Spoluautoři: Pavlína Plevová (Oddělení lékařské genetiky, FN Ostrava), Petra Tvrdá (Oddělení lékařské genetiky, FN Ostrava), Petra Turská (Oddělení lékařské genetiky, FN Ostrava), Rastislav Slavkovský (Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP, Olomouc), Andrea Hladíková (Oddělení lékařské genetiky, FN Ostrava), Eva Mrázková (Ústav epidemiologie a ochrany veřejného zdraví, LF OU, Ostrava)

Poruchy sluchu jsou heterogenní skupinou onemocnění, které jsou ze 70 – 80 % způsobeny z genetické příčiny. Nejčastěji je porucha sluchu asociována s mutací v genu GJB2. V evropské populaci mutace v tomto genu způsobuje 20 – 40 % poruch sluchu. Navrhli jsme panel dalších 69 genů, které se mohou podílet na vzniku syndromové i nesyndromového poruchy sluchu. Pomocí metody „sequence capture“ s následným sekvenováním nové generace jsme těchto 69 genů vyšetřili u pacientů s poruchou sluchu, kteří byli negativní na mutaci v genu GJB2.

PŘEDNÁŠKY


Celkově bylo vyšetřeno 51 pacientů. U 12 pacientů byly zjištěny patogenní mutace v genech s recesivní dědičností a potvrdila se u nich diagnóza autozomálně recesivně dědičné poruchy sluchu. Jednalo se o geny TMPRSS3, USH2A, PCDH15, LOXHD1 a MYO15A – vždy po 1 pacientovi s hlubokou nebo těžkou poruchou sluchu a o gen STRC, ve kterém byly zjištěny mutace/velké genomické přestavby u 7 pacientů. U 2 pacientů byla nalezena mutace v genech s autozomálně dominantní dědičností - MYO6A a SIX1. U jednoho pacienta s hlubokou poruchou sluchu byla nalezena mutace v X-vázaném genu POU3F4. Závěr: Mutace a velké genomické přestavby genu STRC jsou druhou nejčastější příčinou poruchy sluchu v české populaci po mutacích v genu GJB2. Jsou asociovány s mírnou nebo středně těžkou poruchou sluchu. Mutace v dalších genech byly zjištěny pouze v izolovaných rodinách. DETEKCE PŘÍČIN VROZENÝCH KOSTNÍCH ONEMOCNĚNÍ POMOCÍ SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE Detection of causes of congenital bone diseases using next-generation sequencing Martina Paprskářová (Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Ostrava) Spoluautoři: Pavlína Plevová (Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Ostrava), Petra Turská (Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Ostrava), Alice Baxová (Ústav biologie a lékařské genetiky VFN a 1. LF UK, Praha), Ľudmila Košťálová (Endokrinologická ambulance, II. Dětská klinika DFNsP Bratislava), Marcela Malíková (Ústav biologie a lékařské genetiky Fakultní nemocnice Motol, Praha)

Vrozené kostní anomálie patří mezi skupinu geneticky heterogenních onemocnění. Navrhli jsme panel 474 genů spojených s vrozenými kostními anomáliemi. Pomocí metody „sequence capture“ s následným sekvenováním nové generace jsme tyto geny vyšetřili u 8 pacientů s vrozenými kostními anomáliemi. U dvou pacientů byly nalezeny mutace v genu CUL7 v homozygotním stavu, což potvrzuje diagnózu syndromu 3M. U jedné pacientky byla nalezena patogenní mutace v genu EVC v homozygotním stavu, čímž byl potvrzen syndrom Ellis-van Creveld. Syndrom ShwachmanDiamond syndrom byl diagnostikován u pacientky, která měla dvě různé mutace v genu SBDS. U jednoho pacienta byla nalezena homozygotní mutace v genu BBS5 pro syndrom Bardet-Biedel 5. Výše uvedená onemocnění jsou spjata s autozomálně recesivní dědičností. Dále byla nalezena mutace v genu EXT2 v heterozygotním stavu u pacienta s exostózami. U pacienta s heterozygotní inzercí v genu FAM111A byl potvrzen syndrom Kenny-Caffey. Tato onemocnění se dědí 8

autozomálně dominantně. Pomocí této metody se nám tak podařilo objasnit genetickou příčinu onemocnění u 7 z 8 vyšetřených pacientů. Vyšetřování panelů genů pomocí sekvenace nové generace je velmi efektivní metodou při zjišťování genetické podstaty chorob. CO LZE ČEKAT OD DNA VYŠETŘENÍ U NEUROPATIE S POZDNÍM ZAČÁTKEM (PO 40. NEBO I 50. ROCE VĚKU)? Pavel Seeman (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie) Spoluautoři: Petra Laššuthová (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie), Dana Šafka Brožková (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie), Jana Neupauerová (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie), Marcela Krůtová (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie), Anna Meszárosová (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie), David Staněk (2. LF UK a FN v Motole, DNA laboratoř, Klinika dětské neurologie), Radim Mazanec (2. LF UK a FN v Motole, Neurologická klinika dospělých)

Úvod: Dědičné neuropatie (DěN) jsou nejčastější geneticky podmíněné neurologické onemocnění a postihují v ČR asi 4 000 osob. Jde o geneticky vysoce heterogenní skupinu se všemi typy dědičnosti. Věk při začátku obtíží je u DěN typicky ve školním věku a začátek po 20. roce věku je poměrně vzácný. DNA vyšetřením nelze DěN vyloučit, lze ji pouze spolehlivě prokázat a určit typ a upřesnit prognosu. Dlouhodobá úspěšnost DNA vyšetření v naší DNA laboratoři s nálezem kauzální mutace vysvětlující příčinu DěN je 57 %. Za 19 let byla v naší DNA laboratoři příčina DěN objasněna u celkem 1 839 pacientů a neobjasněna zůstala u 1 402 pacientů. Cíl: Z dlouhodobých dat za 19 let z naší DNA laboratoře zjistit přínos a smysluplnost DNA vyšetření u pacientů s pozdním začátkem neuropatie, po 40. nebo i po 50. roce života. Metodika: V období 1997 - 2016 bylo v naší laboratoři provedeno DNA vyšetření (různých genů) u 238 pacientů s udávaným věkem začátku neuropatie mezi 40. a 50. rokem a dále u 90 pacientů s udávaným věkem začátku neuropatie po 50. roce života. Věk začátku neuropatie byl zjištěn dle anamnestických údajů pacientů. Výsledky: Z celkem 328 vyšetřených pacientů se začátkem neuropatie po 40. roce DNA vyšetření potvrdilo a objasnilo DěN nálezem kauzální mutace pouze u 13 z nich, úspěšnost DNA vyšetření je tedy u těchto pacientů velmi nízká (cca 4%). Z 238 pacientů se začátkem mezi 40. a 50. rokem byla kauzální mutace objasňující příčinu neuropatie nalezena u 10 pacientů (4,2 %). Z nich měli 3 pacienti mutace

PŘEDNÁŠKY


v genu MPZ, po 2 pacientech mělo mutace v genu GJB1 (ženy) a HINT1 a po jednom pacientovi byly příčinou mutace v genech SPTLC1, PMP22 a SOD1. Z 90 vyšetřených pacientů se začátkem neuropatie po 50. roce byla kauzální mutace prokázána pouze u 3 pacientů (3,3 %). Šlo, vždy po jednom o mutace v genech MPZ, GJB1 (žena) a SOD1. Z dosud objasněných 1 839 pacientů tvoří pacienti s věkem začátku neuropatie po 40. roce (13 pac.) pouze 0,7 %. Závěr: Šance na objasnění příčiny neuropatie s pozdním začátkem, po 40. roce pomocí DNA vyšetření je velmi nízká (cca 4%) a pravděpodobně s vyšším věkem při začátku klesá. DNA vyšetření u 96 % těchto pacientů příčinu neuropatie s pozdním začátkem neobjasní. Neuropatie s pozdním začátkem tedy pravděpodobně většinou není geneticky podmíněná, jak se dříve předpokládalo. Tyto dlouhodobé zkušenosti a výsledky je třeba brát v úvahu při zvažování indikace k DNA vyšetření DěN u pacientů s pozdním začátkem neuropatie. AZV 16-30206A a 16-31173A MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA ALPORTOVA SYNDROMU A SYNDROMU TENKÉ BAZÁLNÍ MEMBRÁNY Molecular genetic diagnostics of Alport syndrome and thin basement membrane nephropathy Pavlína Plevová (Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Ostrava) Spoluautoři: Petra Turská (Oddělení lékařské genetiky Fakultní nemocnice Ostrava), Rastislav Slavkovský (Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP v Olomouci)

Alportův syndrom je charakterizován progresivním dědičným onemocněním ledvin, může být přítomna také porucha sluchu a oční anomálie. U většiny pacientů je onemocnění děděno X-vázaně (85 % případů; mutace v genu COL4A5), méně častá je autozomálně recesivní forma (10-15% případů; dvě patogenní mutace v genech COL4A3 nebo COL4A4) a vzácně autozomálně dominantní forma (jedna závažná mutace v genech COL4A3 nebo COL4A4). Syndrom tenké bazální membrány je dědičný autozomálně dominantně a je způsoben nosičstvím jedné patogenní mutace v genech COL4A3 nebo COL4A4; tito pacienti jsou tedy přenašeči vlohy pro recesivní formu Alportova syndromu. Pacienti a metody: V letech 2008-2016 bylo provedeno testování na Alportův syndrom u 303 pacientů. Testování genu COL4A5 bylo prováděno metodou sekvenace na přístroji ABI3130. Od roku 2015 bylo u 72 pacientů provedeno vyšetření genů COL4A3, COL4A4, COL4A5, CFHR5 a MYH9 pomocí metody „sequence capture“ 9

(NimbleGen) s následným sekvenováním nové generace na platformě Illumina. Výsledky: X-vázaný Alportův syndrom / u žen jeho přenašečství bylo potvrzeno u 177 pacientů nálezem mutace v genu COL4A5, z nich 63 (36 %) nese mutaci c.1871A>G (p.Gly624Asp). Autozomálně recesivně dědičný Alportův syndrom byl potvrzen u 26 pacientů nálezem bialelické mutace v genech COL4A3 nebo COL4A4; z nich 20 (77 %) je homozygotních pro mutaci c.1598G>A (p.Gly533 Asp) v genu COL4A4 – ve všech případech se jedná o pacienty romského etnika. U 45 pacientů byl potvrzen syndrom tenké bazální membrány nálezem jedné mutace v genech COL4A3 nebo COL4A4, z nich 28 pacientů (62 %) romského etnika bylo heterozygotních pro mutaci c.1598G>A (p.Gly533 Asp) v genu COL4A4 . Závěr: Alportův syndrom je relativně časté genetické onemocnění ledvin. V České populaci je nejčastější mutace c.1871A>G (p.Gly624Asp) v genu COL4A5, kterou detekujeme u přibližně třetiny pacientů s X-vázanou formou onemocnění. V romské populaci je prevalentní mutace c.1598G>A (p.Gly533 Asp) v genu COL4A4, která je v homozygotním stavu odpovědná za tři čtvrtiny případů autozomálně recesivně dědičného Alportova syndromu. V genech CFHR5 a MYH9 prozatím nebyla v české populaci detekována patogenní mutace. KOMPLEXNÍ MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ ANALÝZA GENU TRPS1 U PACIENTŮ S TRICHORHINOFALANGEÁLNÍM SYNDROMEM Complex molecular genetic analysis of TRPS1 gene in patients with trichorhinophalangeal syndrome Roman Šolc (Katedra antropologie a genetiky člověka, Přírodovědecká fakulta UK, Praha) Spoluautoři: Michaela Klugerová (Katedra antropologie a genetiky člověka, Přírodovědecká fakulta UK, Praha), Josef Včelák (Oddělení molekulární endokrinologie, Endokrinologický ústav, Praha), Alice Baxová (Ústav biologie a lékařské genetiky, 1. lékařská fakulta UK a VFN, Praha), Miroslav Kuklík (Oddělení molekulární endokrinologie, Endokrinologický ústav, Praha; Genetická ambulance, Poliklinika Olšanská, Praha), Jan Všetička (Genetika Ostrava, Ostrava), Rastislav Beharka (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice v Brně, Brno), Kateřina Hirschfeldová (Ústav biologie a lékařské genetiky, 1. lékařská fakulta UK a VFN, Praha)

Cílem studie bylo nalezení možných genetických patologií u skupiny pacientů s trichorhinofalangeálním syndromem (TRPS) pocházejících z české populace. DNA každého z 9 probandů (8 s formou TRPS I a 1 s formou TRPS II) byla vyšetřena metodou MLPA za použití kitu 228-B1 (MRC Holland), který pokrývá chromosomální region 8q24 a zvláště cílí na geny TRPS1

PŘEDNÁŠKY


a EXT1. Dále byla provedena mutační analýza genu TRPS1 s využitím metod sekvenování nové generace (NGS) a Sangerovy sekvenovací metody. U probanda s TRPS II byla objevena rozsáhlá delece (cca 10 Mb), která zahrnuje mimo jiné i geny TRPS1 a EXT1. U 6 z 8 probandů s TRPS I byly nalezeny různé mutace, jež mohou být považovány za kauzální. Jedná se o jednu velkou intragenovou deleci v genu TRPS1 (exony 2 – 5); dvě malé strukturní mutace (delece v exonu 5, indel mutace v exonu 4); dvě nonsense bodové substituce (v exonu 4 a v exonu 5); a jedna missense bodová substituce (v exonu 6). Z toho obě malé strukturní aberace a obě nonsense substituce nebyly dosud popsány. Navíc bylo objeveno 8 sekvenčních variant v 5’UTR a 3’UTR sekvencích. Jedna z těchto variant (objevená u probanda bez jiného nálezu) nebyla dosud popsána a její populační výskyt byl stanoven na 2 %. I tato varianta by potenciálně mohla mít kauzální vztah ke vzniku onemocnění. Výzkum byl podpořen Grantovou agenturou Univerzity Karlovy, projekt GAUK202615. Klíčová slova: delece; mutace; trichorhinofalangeální syndrom; TRPS1; EXT1; chromosomální aberace; 5’UTR a 3’UTR; MLPA; NGS

II. – Diagnostika polygenních onemocnění VÝZNAM GENOME-WIDE SCREENINGOVÝCH TECHNIK U DĚTSKÝCH PACIENTŮ S MENTÁLNÍMI RETARDACEMI A VÝVOJOVÝMI VADAMI: PŘEHLED VYŠETŘENÍ BĚHEM LET 2007-2015 NA OLG FN BRNO The utilization of genome-wide screening techniques in children patients with intellectual disability and development disorders: summary of results from OLG FN Brno during 2007-2015 Jan Smetana (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika, 2) Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika) Spoluautoři: Markéta Wayhelová (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika, (2) Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika), Aneta Mikulášová (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika, 2) Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika), Jan Oppelt (3) CEITEC – Středoevropský technologický institut, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika), Vladimíra Vallová (2) Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika), Kateřina Kašíková (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika), Hana Filková (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika), Dita Blažková (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika), Renata Gaillyová (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika), Petr Kuglík (1) Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Brno, Česká republika, (2) Ústav experimentální biologie, Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita, Brno, Česká republika)

Úvod: Mentální retardace (MR) představující postižení vývoje centrální nervové soustavy, jež se projevuje různou mírou omezení intelektuálních schopností a adaptivních funkcí v každodenním životě. I přes značný a dynamický pokrok v metodách molekulární diagnostiky a rozvoji mnoha analytických přístupů stále u přibližně 50 % pacientů dosud není možné určit příčinu jejich patologického fenotypu. Materiál a metody: V průběhu osmi let jsme na Oddělení lékařské genetiky FN Brno vyšetřili 275 dětských pacientů s MR a asociovanými vývojovými vadami pomocí tří různých oligonukleotidových DNA mikročipových platforem (Agilent Technologies, Oxford Gene Technology). V rámci pilotní studie jsme vyšetřili 16 dětských pacientů metodou cíleného NGS a panelu SureSelect Inherited Disease (Agilent Technologies). Výsledky: Z celkového počtu 275 dětských pacientů jsme u 111 z nich (40,4 %) nalezli 120 CNVs a v pěti případech jsme detekovali oblasti s UPD/LOH. Při následné detailní analýze s využitím databází OMIM, DECIPHER a Pubmed jsme 51 CNVs a UPD/LOH zhodnotili jako patogenní (18,5 %). U 15 CNVs zbývá ověřit jejich původ 10

PŘEDNÁŠKY


a stanovit jejich vliv na fenotyp pacientů. Celkově jsme detekovali 63 delecí a 57 duplikací (od 67 kb do 31 Mb) a 5 případů segmentální či celochromozomové UPD/ LOH. Ze zbývajícího počtu 224 pacientů, u nichž dosud nebyla stanovena kauzální příčina jejich fenotypu, jsme vybrali 16 pacientů se závažnou MR, autismem a asociovanými vadami pro účely cíleného NGS. V současnosti probíhá bioinformatické zpracování dat a jejich analýza. Závěr: Metoda array-CGH představuje efektivní nástroj v rámci vyšetřovacího algoritmu v naší laboratoři. V současnosti představuje klíčový krok v rámci zavedení technologie NGS, kdy pro účely této pilotní studie umožňuje selektovat pacienty se závažnou formou MR s dosud neobjasněnou příčinou. Na základě nejnovějších studií kombinace metod array-CGH a NGS vede k významnému zvýšení diagnostického záchytu u pacientů s idiopatickou MR a přispívá k objasnění její příčiny. Podpořeno granty CZ.1.07/2.3.00/20.0183, MZ ČR – DRO FN Brno, 65269705 a projekty IP FN Brno 2015 a IP FN Brno 2016 NEXT GENERATION SEQUENCING FOR EARLY DIAGNOSIS AND INDIVIDUALIZED TREATMENT OF DILATED CARDIOMYOPATHY AND RELATED FORMS OF CARDIOMYOPATHY Next generation sequencing for early diagnosis and individualized treatment of dilated cardiomyopathy and related forms of cardiomyopathy Lenka Piherová (UDMP, 1. LF UK) Spoluautoři: Viktor Stránecký (UDMP), Hana Hartmannová (UDMP), Kateřina Hodaňová (UDMP), Helena Trešlová (UDMP), Miloš Kubánek (IKEM), Alice Krebsová (IKEM), Tomáš Paleček (II. Interní klinika VFN), Stanislav Kmoch (UDMP)

Congestive heart failure (CHF) is a major cause of morbidity and mortality in developed countries. An important cause of CHF, especially in young individuals, represents cardiomyopathies. CHF predominates in the clinical picture of dilated cardiomyopathy (DCM), left-ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC) and idiopathic rectrictive cardiomyopathy (RCM). The greatest burden on health care systems represents DCM with a prevalence of 40-50 cases per 100 000 inhabitants. DCM often leads to advanced CHF and it is reported as the common indication to heart transplantation. In theory, molecular genetic testing should enable earlier and more accurate identification of individuals at risk of development of cardiomyopathy than clinical methods. 11

Genetic testing has been most successful in individuals with HCM because assessment of three genes could elucidate more than 50 % of cases. However, most cardiomyopathies, including DCM, LVCN and RCM, require sequencing of tens of genes with a low success rate (30-35 % in familial DCM). Invention of next generation sequencing (NGS) has enabled cost-effective analysis of thousands of genes. In our presentation we will show first results of this project. VYHLEDÁVÁNÍ VZÁCNÝCH GENETICKÝCH VARIANT U TROMBOFILNÍCH STAVŮ – ZAVEDENÍ DO KLINICKÉ PRAXE Petr Vrtěl (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc) Spoluautoři: doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D. (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc), prof. MUDr. Martin Procházka, Ph.D. (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc), doc. RNDr. Radek Vrtěl, Ph.D. (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc), Mgr. Luděk Slavík, Ph.D. (Hematoonkologická klinika, FN Olomouc), MUDr. Jana Procházková, Ph.D. (Hemato-onkologická klinika, FN Olomouc)

V žilním systému je příčinou trombózy zpomalení toku krve spolu s hyperkoagulací způsobenou dysbalancí koagulačních faktorů a selháním regulace homeostázy. Na vzniku žilních trombóz se rovněž podílí endotel resp. poruchy jeho funkce. Trombofilie jako vrozený či získaný hyperkoagulační stav predisponuje pacienta ke vzniku krevní sraženiny. Trombóza je tedy multifaktoriální onemocnění, jehož vrozená varianta je geneticky podmíněná mutacemi v genech začleněných do kaskády srážlivosti krve. Běžně jsou vyšetřovány pouze mutace FV Leiden a FII Prothrombin (G20210A). S využitím metodiky masivního paralelního sekvenování na platformě Ion Torrent PGM jsme rozšířili molekulárně genetické vyšetření o další geny, které se řadí do antikoagulační části kaskády srážení krve. Jedná se geny: PROS1, PROC, SERPINC1. Jejich genovým produktem jsou proteiny, které působí jako inhibitory koagulace (protein S, C, antithrombin). V uvedených genech bylo popsáno více než 800 mutací, jejichž klinickým projevem může být nedostatek či ztráta funkce jejich genového produktu, které se podílejí na inhibici koagulačních faktorů. Patogenní mutace těchto genů vykazují obdobné riziko vzniku trombózy jako běžně vyšetřované mutace FV Leiden a FII Prothrombin (G20210A). Z důvodu absence mutačních hot-spot oblastí ve sledovaných genech jsme zvolili metodu MPS. S pomocí Ampliseq Designer byly navrženy multiplexy se 100% pokrytím kódujících sekvencí a exon/intron hraničních oblastí. Získaná data byla zpracována programy Torrent Suite – Ion Reporter a Next Gene – dostupné databáze klinických variant (ClinVar, HGMD). V prvním běhu bylo

PŘEDNÁŠKY


vyšetřeno 10 pacientů. Odhalené změny budou uvedeny v prezentaci. HLA GENOTYPIZACE U CENTRÁLNÍCH HYPERSOMNIÍ HLA typing for central hypersomnias Věra Šiffnerová (Ústav hematologie a krevní transfuze) Spoluautoři: Karel Šonka (1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice), Milena Vraná (Ústav hematologie a krevní transfuze)

Centrální hypersomnie (CH) je skupina neurologických poruch spánku charakterizovaných nadměrnou denní spavostí, která nevzniká špatnou kvalitou nočního spánku. CH zahrnuje tři hlavní diagnostické skupiny: narkolepsii typu 1 (NT1, narkolepsie s kataplexií), narkolepsii typu 2 (NT2, narkolepsie bez kataplexie) a idiopatickou hypersomnii (IH). Asociace narkolepsie s HLA systémem je známa od 80. let 20. století. Alela DQB1*06:02 je u pacientů s diagnózou NT1 přítomna v téměř 100 %. Jako protektivní pro tuto diagnózu jsou popisovány některé jiné alely DQB1 lokusu, především DQB1*06:01 a DQB1*06:03. Bylo zjištěno, že pacienti s NT2 mají zvýšenou frekvenci DQB1*06:02 (40 - 60 %) ve srovnání s kontrolními skupinami (24 %). Žádná významná souvislost mezi IH a DQB1*06:02 či jinými DQB1 alelami potvrzena nebyla. Cílem naší studie bylo analyzovat distribuci HLA-DQB1 u českých pacientů s CH a zjistit, zda existují rozdíly mezi jednotlivými diagnostickými skupinami. Statistická analýza genotypizace lokusu DQB1 byla provedena pro soubor 716 pacientů, u kterých byla pozorována nadměrná denní spavost. Soubor byl rozdělen do čtyř diagnostických skupin (NT1, NT2, IH a non-CH, tedy pacienti bez diagnostikované centrální hypersomnie). Alela DQB1*06:02 byla přítomna u 94 % NT1 pacientů a byl potvrzen snížený výskyt alely DQB1*06:03. Žádné další odlišnosti v distribuci alel DQB1*06 či alelických skupin DQB1 nebyly v této skupině pozorovány. Ve skupině pacientů NT2 byla alela DQB1*06:02 přítomna ve 43 %. Kromě zvýšeného výskytu DQB1*06:02 byla u této diagnostické jednotky detekována alelická skupina DQB1*05 se signifikantně vyšší frekvencí než u kontrolního souboru. Žádné rozdíly v přítomnosti DQB1*05 alel nebyly u pacientů NT2 prozatím publikovány. Analýzou skupiny pacientů s idiopatickou hypersomnií 12

nebyl prokázán žádný rozdíl v distribuci alelických skupin ani jednotlivých alel DQB1 lokusu. Přítomnost alely DQB1*06:02 byla výrazně zvýšená i ve skupině pacientů bez centrální hypersomnie. Pro ostatní DQB1 alely ani alelické skupiny nebyl významný rozdíl v distribuci u pacientů v porovnání se zdravými kontrolami pozorován. V analyzovaných diagnostických skupinách byla detekována odlišná distribuce alely DQB1*06:02 i dalších alelických skupin. Tyto výsledky naznačují, že DQB1 přispívá ke genetické predispozici onemocnění u jednotlivých diagnostických skupin spánkových poruch rozdílným způsobem. Podpořeno MZ ČR - RVO (ÚHKT CZ00023736).

PŘEDNÁŠKY


III. - Onkogenetika STUDIUM HETEROGENITY MUTACÍ V PRŮBĚHU TERAPIE PACIENTŮ S AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIÍ Study of mutational heterogeneity during therapy of patients with acute myeloid leukemia Adam Folta (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno) Spoluautoři: Ježíšková Ivana (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno), Dana Dvořáková (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno; Lékařská fakulta Masarykovy Univerzity, Masarykova Univerzita, Brno), Nikola Tom (Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno), Lukáš Semerád (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno), Zuzana Šustková (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno), Martin Čulen (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno; Lékařská fakulta Masarykovy Univerzity, Masarykova Univerzita, Brno), Zdeňka Kosařová (Lékařská fakulta Masarykovy Univerzity, Masarykova Univerzita, Brno), Pavel Žák (IV. interní hematologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Tomáš Szotkowski (Hemato-onkologická klinika, Fakultní nemocnice Olomouc), Pavel Jindra (Hematologicko-onkologické oddělení, Fakultní nemocnice Plzeň), Petr Cetkovský (Ústav Hematologie a krevní transfúze, Praha), Zdeněk Ráčil (Interní hematologická a onkologická klinika, Fakultní nemocnice Brno; Lékařská fakulta Masarykovy Univerzity, Masarykova Univerzita, Brno; Středoevropský technologický institut (CEITEC), Masarykova univerzita, Brno)

Ačkoliv je indukční/konsolidační terapie u většiny pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML) efektivní a vede k remisi onemocnění, část nemocných relabuje a umírá na progresi nemoci. Příčina relapsů AML není zřejmá, pravděpodobně však vychází z buněk klonu, který byl přítomen už v době diagnózy onemocnění a nebyl dostatečně eradikován léčbou. Studium heterogenity klonů prostřednictvím analýzy změn genetických variant v průběhu onemocnění AML může přispět k pochopení klonální architektury AML a tím i celkové patogeneze nemoci. U vybrané skupiny 24 de novo AML pacientů s kurativní léčbou (průměrný věk 47 let, rozpětí 26-68) byl metodami sekvenování nové generace (NGS) vyšetřen mutační status 20 nejčastěji mutovaných genů u AML. Celkem bylo analyzováno 74 vzorků periferní krve z doby záchytu, remise a relapsu onemocnění. NGS knihovny byly připravovány pomocí panelu ClearSeq AML (Agilent Technologies) a sekvenovány na přístrojích MiSeq a NextSeq (Illumina). Pozitivně byly hodnoceny vzorky s minimální frekvencí variantních alel 2,0 %. NGS analýzy identifikovaly mutace ve 12/20 analyzovaných genů. V době diagnózy byla alespoň 1 mutace detekována u 22/24 pacientů (92 %, viz tab.). Celkem bylo v době diagnózy identifikováno 56 mutací (medián 2,5; rozpětí 1-5). Nejfrekventovaněji byly mutovány geny NPM1, DNMT3A (oba 10/24, 42%) a FLT3 – mutace FLT3-ITD (9/24, 38 %). 13

V době remise onemocnění perzistovaly mutace především v genech DNMT3A (7/10, 70 %) a IDH2 (2/4, 50 %). Přítomnost těchto mutací ukazuje na přežívání preleukemických buněk s minimální odpovědí na chemoterapii. V době relapsu bylo znovu identifikováno 43/56 na vstupu identifikovaných mutací. Jedna mutace v genu IDH2 a dvě mutace FLT3-ITD byly u 3/24 (13 %) pacientů v době relapsu identifikovány nově. Za stabilní v průběhu onemocnění lze považovat mutace v genu NPM1, které byly v době relapsu detekovány u všech při diagnóze pozitivně testovaných pacientů (10/10, 100 %). Naproti tomu byly detekovány mutace přítomné pouze v době diagnózy AML: bodové mutace v genu FLT3 (3/3), mutace v genu NRAS (7/8, 87 %). Ačkoliv byl analyzovaný soubor pacientů velikostně omezený, je v něm možné identifikovat velkou heterogenitu detekovaných mutací. Současně také lze u jednotlivých pacientů sledovat společný výskyt více klonů s různou citlivostí vůči chemoterapii. Podpořeno z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 15-25809A a projektu MUNI/A/1028/2015. Tabulka – Distribuce mutací u pozitivních pacientů.

http://dna2016.cz/pic/abstract/file/46.jpg GENETICKÁ PREDISPOZICE KE KARCINOMU PRSU A VAJEČNÍKŮ U NON-BRCA PACIENTEK Genetic predisposition to breast and ovarian cancer in non-BRCA patiens Aneta Orlíková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava) Spoluautoři: Pavlína Plevová (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Martina Paprskářová (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Andrea Hladíková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Rastislav Slavkovský (Ústav molekulární a translační medicíny, LF UP v Olomouci), Petra Turská (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava)

Nejčastější příčinou dědičné formy karcinomu prsu a vaječníků jsou mutace v genech BRCA1 a BRCA2. Cílem studie bylo zjistit, jaké geny mohou být příčinou predispozice ke karcinomu prsu a vaječníků u pacientek, u nichž nebyla mutace v BRCA genech prokázána.

PŘEDNÁŠKY


Pacienti a metody: Do studie bylo zařazeno 59 nepříbuzných pacientek, které splňovaly kritéria pro testování BRCA genů. Z nich ve 12 případech se jednalo o vybrané pacientky s velmi závažnou rodinnou anamnézou suspektní z genetické predispozice, u nichž byly BRCA geny testovány před rokem 2014. Ve 47 případech se jednalo o po sobě jdoucí pacientky indikované k testování BRCA genů v letech 2015 - 2016. Byl sestaven zákaznický panel 31 genů publikovaných v literatuře v souvislosti s dědičnou predispozicí ke karcinomu prsu/ vaječníků. Vyšetření bylo provedeno pomocí metody „sequence capture“ (NimbleGen) s následným sekvenováním nové generace na platformě Illumina. Výsledky: U 7 pacientek (11,9 %) byla nalezena patogenní mutace v genech FANCD2, ATM, PALB2, CHEK2 (2 pacientky), FANCI a RAD51D. U 4 pacientek (6,8 %) byly nalezeny pravděpodobně patogenní varianty v genech FANCD2, FANCG, MSH3 a MAD2L2. Závěr: Genetická predispozice ke karcinomu prsu nebo vaječníků byla zjištěna/ pravděpodobně zjištěna u 18,7 % pacientek v testovaném souboru. ANALÝZA NÍZKOFREKVENTNÍCH SOMATICKÝCH VARIANT POMOCÍ NGS NGS analysis of low-frequency somatic variants Boris Tichý (CEITEC MU) Spoluautoři: Šárka Pospíšilová (FN Brno), Jitka Malčíková (FN Brno), Karol Pál (CEITEC MU), Lenka Radová (CEITEC MU)

V průběhu nádorového onemocnění dochází ke vzniku nových somatických mutací, které mohou jednotlivé buňky a z nich vycházející klonální populace zvýhodňovat, ale i znevýhodňovat v boji o dostupné prostředky (klonální evoluce). Tyto nové mutace mohou například přinést zvýšenou rezistenci vůči protinádorové terapii nebo vyšší schopnost metastazování. Včasná detekce zvýhodňujících mutací dovolí upravit léčebné schema tak, aby nedocházelo k selekci agresivnějších klonů na úkor klonů benignějších. Masivně paralelní sekvenování (NGS) přineslo nové možnosti vysoce senzitivní detekce nízkofrekventních variant. V závislost na použité metodě je možné zjistit i varianty s alelickou frekvencí nižší než 1 %. Zásadním problémem tohoto typu analýz je odlišení od technického šumu (chyby PCR, chyby sekvenační technologie). Prvním předpokladem je minimalizace technických chyb při amplifikaci vzorku použitím DNA polymeráz s nízkou chybovostí. Dalším nutným postupem je zajištění dostatečného množství dat, tzv. pokrytí. Neméně důležitá je pak volba vhodných statistických metod pro analýzu dat. 14

Pomocí NGS sledujeme výskyt a dynamiku nízkofrekventních somatických mutací genu TP53 v buňkách chronické lymfocytární leukemie (CLL). Kombinací velmi vysokého pokrytí se statistickou analýzou (deepSNV) můžeme detekovat varianty s frekvencí od 0,25 %. Opakované vyšetřování vzorků jednotlivých pacientů umožňuje sledování evoluce jednotlivých klonů v čase a jejich reakci na terapii. Podpořeno Projektem na podporu velké infrastruktury Národní centrum lékařské genomiky LM2015091 a z programového projektu Ministerstva zdravotnictví ČR s reg. č. 15-30015A a 15-31834A. AKO SPRAVIŤ CESTU K PERSONALIZOVANEJ LIEČBE RAKOVINY LAHŠOU Simplifying the path to personalized cancer care Cristina Guillén (Thermo Fisher Scientific)

The evolution of the knowledge lead the oncologist to characterize cancer not only on the basis of its anatomy, but more and more importance has the molecular classification. The possibility of define and describe cancer on the basis of his molecular characteristics open new possibilities for clinical research and for targeted therapies. Today’s challenges are the limited sample volumes, the need to test multiple biomarkers for one disease and the growing list of biomarkers changing rapidly. Current methods to test samples against various biomarkers are slow and often require more tumor sample than available. Ion TorrentTM Next Generation Sequencing allows the detection of multiple biomarkers (Hotspots, SNPs, indels, CNVs and gene fusions) in one test from one sample (10 ng of DNA or RNA from FFPE tissue), in one streamlined workflow.

PŘEDNÁŠKY


KLINICKO-GENETICKÁ A MOLEKULOVÁ ANALÝZA PACIENTOV S OJEDINELOU IMUNOHISTOCHEMICKOU STRATOU VŠETKÝCH ŠTYROCH „MISMATCH“ REPARAČNÝCH (MLH1/MSH2/MSH6/ PMS2) PROTEÍNOV Katarína Závodná (1. Oddelenie lekárskej genetiky, Ústav laboratórnej medicíny, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, Bratislava, 812 50, Slovenská republika) Spoluautoři: Olívia Hamidová1 (1Oddelenie lekárskej genetiky, Ústav laboratórnej medicíny, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, Bratislava, 812 50, Slovenská republika), Karol Kajo2 (2Ústav patológie SZU a OÚSA, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, Bratislava, 812 50, Slovenská republika), Tomáš Slamka1 (1Oddelenie lekárskej genetiky, Ústav laboratórnej medicíny, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, Bratislava, 812 50, Slovenská republika), Aster Alemayehu1 (1Oddelenie lekárskej genetiky, Ústav laboratórnej medicíny, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, Bratislava, 812 50, Slovenská republika), Regína Lohajová Behulová3,4 (3Ústav genetiky a molekulovej medicíny Viliama Izakoviča, Lekárska fakulta, Slovenská zdravotnícka univerzita, Limbová 12, 833 03 Bratislava, Slovenská republika), Michal Konečný1 (1Oddelenie lekárskej genetiky, Ústav laboratórnej medicíny, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, Bratislava, 812 50, Slovenská republika)

Lynchov symdróm (Hereditárny nepolypózny karcinóm kolorekta, HNPCC) patrí medzi autozomálne dominantné dedičné ochorenie s predispozíciou na vznik kolorektálneho karcinómu (CRC) alebo ďalších extrakolonických nádorov (adenokarcinómy endometria, žalúdka, karcinómy vaječníkov, močového traktu, tenkého čreva, nádory mozgu a kože) a predstavuje približne 2-5% zo všetkých CRC. Diagnostika Lynchovho syndrómu je komplexná, viackroková a vyžaduje úzku spoluprácu klinického genetika, molekulárneho biológa a patológa. Prvým krokom je imunohistochemická analýza (IHC) MMR proteínov a analýza mikrosatelitovej instability (MSI). Uvedené testy predstavujú vysoko senzitívny skríningový test na Lynchov syndróm, asociovaný s defektom v MMR reparačnom systéme DNA. Vyše 90% HNPCC nádorov vykazuje MSI pozitivitu, v porovnání s cca 15% sporadických kolorektálnych nádorov. Vhodným markerom na odlíšenie sporadického MSI nádoru od HNPCC asociovaného nádoru je vyšetrenie mutácie p.V600E v géne BRAF a metylácie promotora MLH1 génu. U pacientov s pozitívnym MSI a/alebo IHC nálezom je vhodné vykonať genetickú konzultáciu zameranú na posúdenie osobnej a rodinnej anamnézy. Cieľom následného vyšetrenia je identifikovať kauzálnu mutáciu v MMR génoch vedúcu k vrodenej predispozícii na karcinóm kolorekta, príp. iných typov nádorov (najmä endometria). Cieľom tejto práce je prezentácia komplexného klinickogenetického, histo-patologického a molekulárneho pohľadu na pacientov vyznačujúcich sa atypickou stratou všetkých štyroch MMR proteínov, čo je v literatúre ojedinele popísaný stav. 15

PEUTZ-JEGHERSOV SYNDRÓM A DNA DIAGNOSTIKA GÉNU STK11 Peutz-Jeghers syndrome and DNA diagnostic of STK11 gene Lenka Dolešová (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, 812 50, Bratislava, Lekárska fakulta Univerzity Komenského v Bratislave, Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a UN Bratislava, Sasinkova 4, 811 08, Bratislava) Spoluautoři: RNDr. Michal Konečný, PhD. (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, 812 50, Bratislava), MUDr. Olívia Hamidová (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Heydukova 10, 812 50, Bratislava, Lekárska fakulta Univerzity Komenského v Bratislave, Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a UN Bratislava, Sasinkova 4, 811 08, Bratislava), MUDr. František Cisárik, CSc. (Oddelenie lekárskej genetiky FNsP, V. Spanyola 43, 012 07 Žilina), MUDr. Janka Barošová (Genet s.r.o., Ambulancia lekárskej genetiky, Rázusova 16, 950 01 Nitra), prof. RNDr. Vanda Repiská, PhD. (Lekárska fakulta Univerzity Komenského v Bratislave, Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky LF UK a UN Bratislava, Sasinkova 4, 811 08, Bratislava)

Peutz-Jeghersov (P-J) syndróm patrí medzi vzácne polypózy tráviaceho traktu s autozomálne dominantnou dedičnosťou. Charakteristický je výskytom hamartomatóznych polypov, mukokutánnych pigmentácií v oblastiach pier, bukálnej sliznice a podnebia, pričom vek nástupu klinických prejavov je značne variabilný. Hoci sú polypy zväčša benígne, pacienti s Peutz-Jeghersovým syndrómom majú až 15násobne zvýšené riziko výskytu intestinálnych aj extraintestinálnych neoplázií v porovnaní s bežnou populáciou. U pacientov sa zvýšuje riziko vývoja rôznych typov epiteliálnych nádorov ako napr. karcinómov kolorekta, pankreasu, prsníka a ovárií. Na stanovenie diagnózy spomínaného ochorenia boli vypracované rôzne diagnostické kritériá zahŕňajúce prítomnosť pigmentácií, polypov, pozitívnej rodinnej anamnézy a analýzy patologických variantov v géne STK11. Gén STK11 je tumorsupresorový gén, ktorý kóduje seríntreonín kinázu. Výskyt patologických variantov v géne STK11 sa zatiaľ považuje za jedinú genetickú príčinu P-J syndrómu a zahŕňa približne 94-96% diagnostikovaných prípadov, pričom až v 50 % sa jedná o de novo variant. V roku 2006 bolo v HGMD identifikovaných približne 145 rôznych typov STK11 mutácií, väčšinou nonsense, missense variantov, in frame delécií a splice site variantov. Približne 30-35 % patologických variantov identifikovaných v géne STK11 pripadá na veľké genómové prestavby. Peutz-Jeghersov syndróm u pacientov s negatívnym výsledkom, ale klinickými prejavmi môže byť dôsledkom prítomnosti patologického variantu v inom doposiaľ neznámom géne, čím sa nevylučuje diagnóza P-J a teda manažment pacienta sa nemení. V rámci príspevku budeme prezentovať vybrané prípady pozitívnych rodín s patologickým variantom v géne STK11.

PŘEDNÁŠKY


VÝZNAM PANELOVÉHO TESTOVÁNÍ POMOCÍ NGS V ONKOLOGICKÉ PROBLEMATICE The importance of panel testing by NGS in oncology Lenka Foretová (Masarykův onkologický ústav, Brno, Žlutý kopec 7, 656 53) Spoluautoři: Navrátilová Marie (Masarykův onkologický ústav), Házová Jana (Masarykův onkologický ústav), Vašíčková Petra (Masarykův onkologický ústav), Štahlová Hrabincová Eva (Masarykův onkologický ústav), Macháčková Eva (Masarykův onkologický ústav)

Sekvenování nové generace (masivní paralelní sekvenování) umožňuje vyšetření mnoha desítek genů v rámci jednoho vyšetření. V MOU jsou používány enrichment/hybridizační postupy panelového sekvenování: komerční TruSight Cancer Gene panel (Illumina) a SeqCap EZ Choise NimbleGene (Roche) s vlastním navoleným panelem 54 nádorových genů nebo CZECANCA panel (Kleibl a kol. VFN). Kromě vysoce penetrantních genů nacházíme geny středního rizika; patogenní mutace a mnohočetné varianty s neznámým klinickým účinkem. Orientační hodnocení variant s neznámým klinickým účinkem provádí molekulární biolog dle různých predikčních programů (predikce sestřihu a u SNP variant např.: Align-GVGD, Polyphen-2, SIFT, PredictSNP). Pro klinické hodnocení patogenních mutací vysoce penetrantních genů jsou známé preventivní guidelines (viz suppl. KO II-IV.), u genů středního rizika, nebo genů vzácných nejsou většinou doporučené guidelines a lékař musí vycházet jen z dosavadních publikací a rodinné anamnézy. Mutace v genech pro recesivní onemocnění (FA, XP, NBS, BS, aj.) jsou nacházeny heterozygotně u mnoha onkologických onemocnění, jejich klinický význam je sporný, nicméně prediktivní testování je důležité pro další generace plánující potomky. Panel CZECANCA (219 genů) používáme pro testování všech ca ovarií indikovaných v MOÚ. Panel generuje u pacientek výsledky patogenních mutací (kromě BRCA1/2) i v genech VHL, BRIP1, RAD51C, RAD51D, RAD52, BARD1, MSH2, MSH5, ERCC2, RECQL, MSR1, EXO1, NAT1, BUB1B, FANCD2. Varianty s neznámým klinickým účinkem v genech ATR, FANCA, BRIP1, PALB2, SMARCA4, KIT, NBN, OGG1, ATM, RAD52, BUB1B, BARD1, EXPHX1, APC, FLCN, CASP8, FH, BMPR1A, SDHB, MMP8, MSCR1, SUFU, RET, PTTG2. U některých genů etiologická souvislost není jasná. Vždy je nutné uvažovat, zda si můžeme nebo nemůžeme dovolit prediktivní testování. Panel můžeme použít pro diagnózu velké většiny nádorových syndromů. Patogenní mutace před použitím pro klinické účely potvrzujeme Sangerovým sekvenováním. Problém může být s analýzou některých genů s výskytem 16

pseudogenů, kde je nezbytné nálezy potvrdit jinou metodou s ověřením vyloučení přítomnosti sekvence pseudogenů. Velké přestavby zatím analyzujeme pomocí MLPA vybraných genů, které indikuje genetik, případně potvrzujeme záchyty CNV analýzy tam, kde je MLPA dostupná. Počítačové programy, které umožní ze sekvenčních dat získat údaje o možné velké deleci nebo duplikaci jsou potřebné. Práce podpořena granty AZV 15-27695A a 16-29959A VÝSKYT SOMATICKÝCH MUTACÍ V PROTOONKOGENECH A TUMOR SUPRESOROVÝCH GENECH U ČESKÝCH PACIENTŮ S RŮZNÝMI TYPY NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ Lucie Benešová (Genomac výzkumný ústav, s.r.o.) Spoluautoři: Barbora Belšánová (Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Genomac výzkumný ústav, s.r.o., Praha), Tereza Hálková (Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Genomac výzkumný ústav, s.r.o., Praha), Marek Minárik (Centrum aplikované genomiky solidních nádorů (CEGES), Genomac výzkumný ústav, s.r.o., Praha)

Karcinogeneze je komplexní proces, ve kterém má klíčovou roli postupné hromadění somatických mutací v protoonkogenech a tumor supresorových genech vedoucí k permanentní aktivaci buněčné proliferace a inhibici apoptózy. Každé nádorové onemocnění má typické zastoupení mutovaných genů a identifikace jednotlivých mutací v těchto genech nabývá stále většího významu při predikci či monitoringu odpovědi na léčbu, zpřesnění diagnostiky, odhadu prognózy či dlouhodobém pooperačním follow-upu. Výčet nejčastěji mutovaných genů u konkrétního nádorového onemocnění včetně frekvence výskytu jednotlivých mutací vycházející ze studií na velkých souborech pacientů lze získat z veřejně přístupných databází, jako například COSMIC (Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer). Takové údaje však vychází z různých populací a nemusí odpovídat té konkrétní, se kterou pracujeme. Příklad takové diskrepance je frekvence aktivačních mutací v genu EGFR, rozhodujících při indikaci cílené biologické terapie, kde rozdíl mezi asijskou a evropskou populací dosahuje až desítky procent. Tento fakt však bývá často opomíjen a tak cílem této přednášky je ukázat srovnání frekvencí somatických mutací klíčových tumor supresorů a protoonkogenů v naší populaci s údaji z databáze COSMIC a to na souboru více než 2 000 vzorků pacientů s nádorem kolorekta, plic, slinivky, žaludku, mozku nebo hlavy a krku. Podpořeno z programového projektu zdravotnictví ČR s reg. č. 15-27939A.

Ministerstva

PŘEDNÁŠKY


POTENCIÁLNÍ ROLE METYLACE KADHERINU 13 JAKO BIOMARKERU U KARCINOMU VAJEČNÍKŮ Cadherin 13 methylation and its potential role as ovarian cancer biomarker Marcela Chmelařová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové) Spoluautoři: Ivana Bubancová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Kateřina Hrochová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Jan Laco (Fingerlandův ústav patologie, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Ondřej Dvořák (Porodnická a gynekologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Vladimír Palička (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové)

V ČR je každoročně diagnostikováno přes 1 000 případů karcinomu vaječníku, který patří mezi nejčastější příčinu úmrtí na gynekologické zhoubné nádory. Většina pacientek je diagnostikována v pokročilých stádiích nemoci, kdy pětileté přežití je nižší než 25%. Karcinom vaječníků patří mezi onemocnění se širokou variabilitou klinické odpovědi, proto jsou intenzivně studovány především molekulárně-biologické parametry doprovázející toto onemocnění. Pouze genetické alterace nejsou ovšem dostatečným vysvětlením všech změn doprovázejících nádorovou transformaci buňky, proto je velké úsilí věnováno odhalování faktorů ležících mimo samotný sled nukleotidů. V naší práci jsme se zaměřili na sledování metylace kadherinu 13 pomocí sekvenování nové generace (NGS). NGS prescreening byl proveden u 10-ti nádorových a 10-ti nenádorových vzorků vaječníků. Pomocí NGS technologie (platforma Illumina) se nám podařilo prokázat několik významně metylovaných CpG míst u nádorové ovariální tkáně v porovnání se zdravou kontrolní tkání. Tato místa byla verifikována pomocí High resolution melting analýzy a metylačně specifické real-time PCR na širším souboru pacientek. Metylace CDH13 byla přítomna u 60 % vzorků nádorové tkáně a u žádného vzorku nenádorové tkáně. Vzhledem k tomu, že změny v metylaci DNA jsou jedním z prvních projevů v průběhu karcinogeneze, mohly by být nalezené změny, v případě jejich průkazu v plazmě pacientek, v budoucnu využity jako screeningové markery u rizikové populace. Potenciál lze vidět také ve využití nalezených alterací jako prognostických markerů či při predikci odpovědi na léčbu.

SEKVENOVANIE PANELOV GÉNOV V DIAGNOSTIKE HEREDITÁRNYCH ONKOLOGICKÝCH SYNDRÓMOV Panel gene sequencing in the field of hereditary oncological syndromes Michal Konečný (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava) Spoluautoři: Lenka Dolešová (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava, Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky, LF UK a UN, Bratislava), Olívia Hamidová (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava, Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky, LF UK a UN, Bratislava), Katarína Závodná (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety, Bratislava), Alica Valachová (Oddelenie lekárskej genetiky FN Trenčín), Iveta Mlkvá (Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky, LF UK a UN, Bratislava), František Cisárik (Oddelenie lekárskej genetiky FN Žilina), Dana Kantárska (Oddelenie lekárskej genetiky FN Banská Bystrica)

Hereditárne onkologické syndrómy predstavujú v rámci DNA diagnostiky zásadný problém, a to najmä vzhľadom na svoju komplexnosť a možnosť výskytu rôznych DNA variantov vo viacerých génoch. Všeobecne frekvencia týchto genetických syndrómov predstavuje 5-10% z výskytu príslušného onkologického ochorenia. Základnými klinickými znakmi sú familiárny výskyt špecifických nádorov v pokrvnej príbuzenskej línii, nižší vek diagnostiky ochorenia (zväčša 10-15 rokov skôr ako je priemerný vek), výskyt bilaterálnych a duplexných foriem nádorov, charakteristické histologické znaky (triple negativita pri ca prsníka, prítomnosť buniek pečatného prsteňa pri ca žalúdka). Typický je aj výskyt špecifických asociovaných typov nádorov, napr. ca prostaty a prsníka v rámci hereditárneho karcinómu prsník/ovárií, ca endometria a kolorekta pri Lynchovom syndróme, ca žalúdka a lobulárneho ca prsníka pri hereditárnom difúznom karcinóme žalúdka. Uvedené ochorenia sú zväčša asociované s poruchami tumorsupresorových génov, v menšom počte prípadov s poruchami onkogénov. V oboch prípadoch však ide o gény zahrnuté v opravných DNA procesoch, prípadne v kontrolných dráhach bunkového cyklu. Multiproteínové DNA reparačné komplexy tak zhlukujú obrovské množstvo navzájom úzko interagujúcich proteínov, pričom sa často jednotlivé syndrómy v rámci svojho fenotypového prejavu prekrývajú. Nechýbajú ani prípady identifikovania viacerých variantov v rôznych génoch, čo následne komplikuje klinickú interpretáciu. Práve z týchto dôvodov sa v rámci DNA diagnostiky do popredia posúva masívne paralelné sekvenovanie panelov génov asociovaných spolu v príslušných signálnych dráhach. V rámci uvedeného príspevku budeme prezentovať výsledky rôznych prístupov založených na princípoch masívneho paralelného sekvenovania a jednotlivých case reportov komplexných hereditárnych onkologických ochorení.

17

PŘEDNÁŠKY


NGS DIAGNOSTIKA V NOVÝCH ČASECH The new era of next generation sequencing Horák Pavel (PentaGen sro.)

Sekvenování nové generace (NGS) se již stalo pevnou součástí metodických přístupů v diagnostických laboratořích. Na uvedenou situaci zareagovali i výrobci in-vitro diagnostik, a tak se těžiště NGS metodik postupně přesouvá od homemade testů k certifikovaným in vitro diagnostickým kitům. Společnost PentaGen do českých laboratoří přináší výrobky dvou předních producentů NGS souprav: 4bases: produktové portofilum italsko-švýcarského výrobce zahrnuje kity pro sekvenaci onkomarkerů KRAS, NRAS, BRAF, EGFR, BRCA1/2. Letošní novinkou je pak panel Thyroid ID pro karcinom štítné žlázy. Devyser: v nabídce v současnosti naleznete certifikované kity pro sekvenování genů BRCA1/2 a CFTR, které přinášejí uživatelům vše, co od uvedené metodiky očekáváme v kombinaci s minimální pracností (1-tube system). Všechny kity se vyznačují diagnostickou přímočarostí, vysokou procesivitou a nízkou pracností. Jsou validovány (CE IVD) pro sekvenátory Ion PGM (ThermoFisher) a MiSeq (Illumina). SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE V DIAGNOSTICE NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNÍ Next-generation sequencing in cancer diagnostics Peter Bielik (Elisabeth Pharmacon)

V posledních letech lze pozorovat zvýšenou poptávku onkologů po usnadnění individualizované péče. Především u nádorových onemocnění je velmi důležité stanovit správný léčebný postup. Mutace v některých genech mohou způsobovat špatnou účinnost některých léků, což vede k prodlužování léčby a snižování komfortu pacientů a k neefektivním výdajům. V moderním světě expandujících technologií a poznatků genomiky se začíná stále více uplatňovat technologie sekvenování nové generace. Sekvenování specifických exonů pomáhá v identifikaci mutací, které ovlivňují účinnost léčby. Společnost Elisabeth Pharmacon vytvořila speciální EliGene® NGS soupravy, které jsou jako první na světě v této kategorii CE certifikovány jako zdravotnické prostředky in vitro. NGS soupravy jsou určeny pro diagnostiku většiny nádorových 18

onemocnění a dělí se na EliGene® Colorectum NGS kit pro geny KRAS, NRAS (exony 2,3,4) a BRAF (exon 15), EliGene® GIST NGS kit pro c-Kit (exony 9, 11, 13, 14, 15, 16, 17) a PDGFRalfa (exony 8, 10, 12, 14, 18) a konečně EliGene® Lung NGS kit pro gen EGFR (exony 18, 19, 20, 21). Všechny tři soupravy jsou založené na multiplexové PCR amplifikaci. Samozřejmostí je kompatibilita uvedených souprav s EliGene® Adaptor-IL NGS kitem pro začlenění molekulárních identifikátorů a specifických sekvenčních adaptorů. Všechny tři soupravy společně s EliGene® Adaptor-IL NGS kitem umožňují identifikaci polymorfizmů v cílových sekvencích s využitím přístroje MiSeq (Illumina, USA).

PŘEDNÁŠKY


IV. - Bioinformatika

FINALISTDX – CÍLENÉ ŘEŠENÍ PRO DIAGNOSTICKÉ LABORATOŘE

NGS NÁHRADA MLPA® POUŽITÍM NÁSTROJE HROMADNÉ CNV ANALÝZY SOFTWARU NEXTGENE® (V2.4.2)

FinalistDX – targeted solution for diagnostic laboratories

Using NextGENe® Software (v2.4.2) Batch CNV Tool as an NGS replacement for MLPA® and Similar Analysis Techniques Jan Zástěra (Carolina Biosystems, s.r.o.)

Detekce počtu kopií variant (CNV analýza), je často prováděna metodou MLPA. Ačkoliv se jedná o metodu velmi citlivou, může být zároveň pomalá a pracná. Masivní sekvenování za použití cílených panelů nabízí odlišný přístup, který je jednodušší, levnější a rychlejší. Pomocí jednoduché metody normalizace pokrytí kompatibilních dat, která je součástí nástroje pro hromadnou CNV analýzu softwaru NextGENe® je možné softwarově obejít použití metody MLPA a Sangerova sekvenování. INFRASTRUKTURA PRO BIOINFORMATIKU V SUPERPOČÍTAČOVÉM CENTRU IT4I (WWW.IT4I.CZ) Infrastructure for bioinformatics in the National Supercomputer Center at the technical University in Ostrava - IT4Innovations (www.it4i.cz) Martin Mokrejš (VŠB-TUO IT4Innovations) Spoluautoři: Václav Svatoň (VŠB-TUO IT4Innovations), David Hrbáč (VŠB-TUO IT4Innovations), Martin Stachoň (VŠB-TUO IT4Innovations), Branislav Jansík (VŠB-TUO IT4Innovations), Jan Martinovič (VŠB-TUO IT4Innovations)

Analýzy genomových sekvencí vyžadují nemalou výpočetní a diskovou kapacitu. Přednáška shrne možnosti, které nabízí Národní superpočítačové centrum IT4I svým uživatelům. Jedná se zejména o nástroje pro de novo sestavení genomů, transkriptomů, předpovídání genů, zarovnávání sekvenačních čtení vůči referenční sekvenci. Dále nástroje pro vyhledávání a anotaci SNP/MNP, InDel, CNV, SV, pro manipulaci s běžnými typy souborů typu SAM/BAM/VCF a v neposlední řadě programy pro zobrazení výsledků přímo ze serveru (IGV browser, Tablet). Pracoviště nabízí a dále vyvíjí i uživatelsky přívětivé rozhraní pro zpracování/analýzu NGS dat skrz www prohlížeč.

19

Petr Brož (Institute of Applied Biotechnologies a.s.)

Technologie NGS velkou rychlostí proniká do diagnostických laboratoří a produkuje stále větší množství sekvenačních dat. Důležitý důraz se musí klást ne jenom na přípravu sekvenační knihovny, ale i na celkovou analýzu dat s interpretací vhodných výsledků. FinalistDX je zaměřen na laboratoře využívající NGS technologie. V prezentaci bude představeno cílené bioinformatické řešení od zálohy dat, kontroly kvality, anotace a interpretace výsledků. SEQUENCHER; NÁSTROJ PRO ANALÝZU NEXTGENERATION SEKVENAČNÍCH DAT VE WINDOWS Štěpán Stočes (SEQme s.r.o.)

Sekvenační strategie nové generace (NGS) se stávají běžnou součástí lékařského výzkumu a diagnostiky. Přináší s sebou velké možnosti, ale také nové požadavky jak na vědecké a laboratorní pracovníky, tak i na počítačové vybavení laboratoří a praktické znalosti v informatice a statistice. Bioinformatika je velmi rychle se rozvíjející interdisciplinární obor, zaměřený na analýzu, zpracování a interpretaci dat získaných v biologii, biochemii, biomedicíně a dalších souvisejících oblastech. Bohužel v současné době ne každá laboratoř má možnost si dovolit někoho, kdo by se staral pouze o analýzu dat, zároveň byl vyškolen na konkrétní případy, které v lepším případě již laboratoř řeší, v horším řešit teprve bude. Také dost často není k dispozici dostatečné výpočetní zázemí a prostředky si ho pořídit. Takové instituce se obrací na odborná pracoviště nebo soukromé firmy. Přitom optimalizovaná standardní analýza NGS dat již nemusí být o mnoho složitější, nežli validace sekvencí pořízených Sangerovou metodou. Sequencher je interaktivní uživatelsky příjemný software umožňující analýzu NGS sekvenačních dat v prostředí operačního systému Windows a to pomocí profesionálních programů vyvinutých v Unixovém prostředí (Linux). Pomocí tohoto programu velmi jednoduše provedete úkony jako kontrola kvality sekvencí pomocí FASTQC, vytvoření de novo assembly pomocí programu Velvet, namapování svých sekvencí na referenci a identifikaci polymorfismů, analýzu RNAseq, metylační studia a mnohem více. Zároveň získáte profesionální grafické výstupy, které je možné během několika vteřin upravit a použít přímo ve vědeckých publikacích. Sequencher je dobrou volbou pro všechny, kteří chtějí rychle a jednoduše analyzovat svá NGS data, aniž by museli trávit dlouhé týdny studiem Unixového prostředí.

PŘEDNÁŠKY


V. - Nové diagnostické postupy SMARTEXTRACTION – EXTRAKCE NK RYCHLEJI, EFEKTIVNĚJI, SNÁZE SmartExtraction - the Extraction of NA faster, easier and more efficiently Alena Šustová (GeneTiCA)

Společnost Analytik Jena v posledních letech intenzivně vylepšuje technologie na poli extrakce nukleových kyselin. Patentovaná DC technologie umožňuje šetrnější izolaci nukleových kyselin za pomoci pufrů s optimalizovanou kombinací chaotropních a antichaotropních solí a citelně minimalizuje ztráty v kvalitě a výtěžku NK. Analytik Jena uvedla na trh úplně nový způsob, jakým izolovat nukleové kyseliny, a to bez potřeby fenolu/chloroformu, iontové výměny, silika materiálů, magnetických částic nebo rotačních kolon. Podstatou nové metody SmartExtraction je použití speciálně modifikovaného povrchu implantovaného do laboratorního plastu, kterým jsou obyčejné laboratorní špičky. Upravená špička na svůj povrch dokáže selektivně navázat NK a stačí k tomu pipetovat výchozí materiál po lýze. Pracovní protokol obsahuje běžný postup – lýzu výchozího materiálu, adsorpci nukleových kyselin, promytí a eluci, ale celý proces extrakce zahrnuje pouze pipetování, není třeba mít k dispozici další vybavení jako centrifugu nebo magnetické systémy. Metoda SmartExtraction šetří čas i spotřebu laboratorního materiálu, přesto mají takto extrahované nukleové kyseliny vysoký výtěžek a čistotu. Technologie SmartExtraction k dispozici pro použití v automatizovaných systémech Analytik Jena jako jsou InnuPure C16, InnuPure C96 a GeneTheatre, případně lze metodu adaptovat i pro použití na jiných automatických systémech. Dostupné kity umožňují extrahovat NK z širokého spektra výchozích materiálů.

discovering novel RNA variants and splice sites utilizing RNA sequencing, or precisely quantifying mRNAs for gene expression analysis. IDT brings xGen® target capture products for greater sensitivity and higher sample throughput for targeted next generation sequencing and offer gene panels focusing on relevant genomic regions or transcripts of interest. xGen Lockdown Probes - an individually synthesized oligonucleotides, xGen Lockdown Panels - functionally validated, stocked gene panels for targeted next generation and xGen Lockdown Reagents and Universal Blocking Oligos optimized to deliver deep, even coverage of targets captured are provided by IDT. The probes are available at different scales, and are assessed by mass spectrometry for quality control, enabling a seamless transition from discovery to clinical application. Clontech /TaKaRa introduce the unparalleled sensitivity of SMARTer technology into kits for next-generation sequencing offering exceptional sensitivity and reproducibility. SMART technology leverages the template-switching capability of a reverse transcriptase to capture full-length RNA transcripts and incorporate adapter sequences during first-strand cDNA synthesis, such that sequencing libraries can be generated seamlessly via subsequent rounds of PCR amplification. Although SMART technology has been positioned as a leading solution for ultra-low input RNAsequencing it can also provide highly sensitive approach to analyze targeted sequences on level of RNA or ChIP preselected DNA sequences of interest. VÝVOJ NGS PANELU PRO URČENÍ NOSIČSTVÍ GENETICKÝCH VARIANT AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍCH ONEMOCNĚNÍ Development of NGS panel for determination of genetic variant carriers of autosomal recessive disorders

Dana Jurkovičová (KRD obchodní společnost s r.o.)

Filip Lhota (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha) Spoluautoři: Filip Zembol (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha), Barbora Honysová (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha), Leona Černá (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha), Monika koudová (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha), Martina Bittóová (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha), David Stejskal (Gennet, Centrum lékařské genetiky a reprodukční medicíny, Praha)

Today‘s complex genomic research questions demand a depth of information beyond the capacity of traditional DNA sequencing technologies. Innovative NGS sample preparation and data analysis options enable a broad range of applications including rapid sequencing of whole genomes, zooming into deep sequencing of target regions,

S dostupností nových sekvenačních metod dochází v posledních letech i v klinické praxi k posunu od vyšetřování jednotlivých genů k multigenovým analýzám pomocí sekvenačních panelů. Krom onkogenetiky či patologie lze tento přístup využít v dalších oblastech

NGS TARGET ENRICHMENT – SOLUTIONS AND APPLICATIONS BY IDT AND CLONTECH/TaKaRa NGS Target Enrichment – solutions and applications by IDT and Clontech/TaKaRa

20

PŘEDNÁŠKY


včetně prekoncepční diagnostiky. Na trhu je v současnosti dostupná řada komerčních NGS-panelů, které ovšem nemusí vždy obsahovat požadované spektrum mutací relevantních pro danou populaci a požadavky pracoviště. Stejně tak bioinformatická analýza, která bývá k těmto produktům nabízena, je černou skříňkou s omezenou možností detailního nastavení a propojení s laboratorním systémem. Sestavili jsme proto custom-designed NGS panel, zahrnující 924 jasně patogenních variant v cílových genech zodpovědných za 63 autozomálně recesivních onemocnění, převážně poruch metabolizmu a fertility. Tento „CarrierTest“ panel umožní odhalení heterozygotních přenašečů mezi dárci gamet nebo prekoncepční testování genetické kompatibility páru. CarrierTest využívá amplikonové cílené sekvenování s vlastní bioinformatickou analýzou pro zpracování hrubých sekvenačních dat, jejich anotaci a databázovou implementaci do klinicko-laboratorního softwarového systému. Součástí výstupu je i komparativní analýza nalezených variant pro posouzení prekoncepční kompatibility páru a zvážení možnosti prenatální nebo preimplantační genetické diagnostiky. QIAGEN: KOMPLETNÍ ŘEŠENÍ PRO NGS APLIKACE Martina Mikešová (Dynex)

QIAGEN Vám poskytuje kompletní řešení pro Vaše NGS aplikace. Nejen nová sekvenační platforma GeneReader s podporou klinických aplikací pro molekulární patologii, ale i široké spektrum souprav pro DNA i RNA-seq pro platformy Illumina i PGM je k dispozici pro veškeré aplikace sekvenování nové generace. Výsledky ze všech existujících platforem je možné dále analyzovat pomocí uceleného bioinformatického softwaru Biomedical Genomic Workbench a interpretace dat je jednodušší pomocí Ingenuity Variant Analysis nebo Ingenuity Pathway Analysis. QIAGEN tak nabízí opravdu kompletní řešení od prvotního zpracování vzorku až po spolehlivou interpretaci klinických dat.

21

STANOVENÍ BRAF MUTOVANÉ VOLNÉ NÁDOROVÉ DNA JAKO NÁSTROJ PRO MONITORING PACIENTŮ LÉČENÝCH PRO METASTAZUJÍCÍ MELANOM Determination of BRAF mutated free tumor DNA as a tool for monitoring patients treated for metastatic melanoma Martina Putzová (Bioptická laboratoř s.r.o.) Spoluautoři: Monika Arenbergerová (Dermatovenerologická klinika, FN Královské Vinohrady), Monika Šedivcová (Biotická laboratoř s.r.o.), Tomáš Vaněček (Bioptická laboratoř s.r.o.), Michal Michal (Bioptická laboratoř s.r.o.)

Přes narůstající preventivní opatření a povědomí o maligním melanomu incidence tohoto onemocnění celosvětově stoupá. Raná stádia lze velice efektivně léčit chirurgicky, ale ve fázi generalizace se melanom řadí mezi nejobtížněji léčitelné diagnózy. Tento tradiční pohled se s přibývajícím znalostmi o patogenezi melanomu na molekulárně biologické úrovni začíná měnit příznivým směrem. Pacientům s BRAF mutací je nabízena cílená léčba pomocí BRAF inhibitorů, která prodlužuje jak bezpříznakové období, tak i celkové přežívání pacientů. BRAF mutace se stanovuje z nádorové tkáně, která je fixována formolem a zalita do parafinových bločků. Včasné vyšetření je základem pro úspěch léčby. I přesto se někdy nepodaří z technických důvodů obstarat archivovanou nádorovou tkáň nebo je nádorová DNA nekvalitní z důvodu degradace formolem a nebo jsou metastázy tumoru nepřístupné odběru. Dalším problémem je, že stav mutace v metastázách, které chceme primárně léčbou zasáhnout, se liší od stavu mutace ve vyšetřovaném primárním tumoru. Z tohoto důvodu se snažíme verifikovat metodu stanovení BRAF mutované volné nádorové DNA za použití plně automatického real-time PCR diagnostického systému Idylla (Biocartis). Tento přístup je dobře dostupný pro klinika, málo invazivní pro pacienta a výsledek analýzy odpovídá aktuálnímu genotypu pacienta. V pilotních studiích byla prokázána vysoká senzitivita i specifita u pacientů s pokročilým maligním melanomem. Cílem naší studie je ověřit využití analýzy BRAF mutované volné DNA jako biomarkeru léčebné odpovědi u BRAFpozitivních pacientů s melanomem léčených imunoterapií. Dále pak ověřit senzitivitu a specificitu metody plně automatického real-time PCR na přístroji Idylla (Biocartis). Posluchače seznámíme s našimi dosavadními výsledky monitoringu pacientů.

PŘEDNÁŠKY


V. - Nové diagnostické postupy SPEKTRUM MUTACÍ ODHALENÝCH METODOU CELOEXOMOVÉHO SEKVENOVÁNÍ U PACIENTŮ S IMUNITNÍ CYTOPENIÍ Michael Svatoň (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol) Spoluautoři: Veronika Kanderová (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Petr Smíšek (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Martina Suková (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Lucie Šrámková (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Jana Kayserová (Ústav imunologie 2. LF UK a FN Motol), Jan Stuchlý (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Markéta Žaliová (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Tomáš Freiberger (Ústav klinické imunologie a alergologie, Lékařská fakulta, Masarykova Univerzita Brno), Lenka Dušátková (Pediatrická klinika 2. LF UK a FN Motol), Štěpánka Průhová (Pediatrická klinika 2. LF UK a FN Motol), Radana Zachová (Ústav imunologie 2. LF UK a FN Motol), Dagmar Pospíšilová (Dětská klinika, FN Olomouc), Jan Blatný (Oddělení dětské hematologie, FN Brno), Daniela Procházková (Dětská klinika, Masarykova nemocnice v Ústí nad Labem, Krajská zdravotní a.s.), Ester Mejstříková (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Tomáš Kalina (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Anna Šedivá (Ústav imunologie 2. LF UK a FN Motol), Jan Starý (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Jan Trka (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol), Eva Froňková (Klinika dětské hematologie a onkologie 2. LF UK a FN Motol)

Nově dostupné metody masivně paralelního sekvenování umožňují objevování nových genů způsobujících dysregulaci imunitního systému. Pomocí celoexomové sekvenace (WES) jsme vyšetřili skupinu 19 pacientů ve věku 1-36 let s chronickými imunitními cytopeniemi s počátkem v dětství, převážně s Evansovým syndromem, tj. kombinací imunní trombocytopenické purpury, autoimunitní hemolytické anémie nebo imunitní neutropenie, většinou doprovázených dalšími příznaky imunitní dysregulace jako defekt tvorby protilátek, lymfoproliferativní syndrom, imunitní endokrinopatie (tyreoiditida, DM 1. typu), zánětlivé postižení střev nebo CNS. Bioinformatická analýza byla zaměřena na geny účastnící se procesu dozrávání a aktivace buněk lymfoidní řady. U části dosud nepopsaných variací byl následně sledován vliv na funkci proteinu pomocí průtokové cytometrie a detekce fosforylace proteinů signálních drah. U 13 (65 %) pacientů jsme nalezli patogenní variantu, která buď již byla popsána v souvislosti s podobným fenotypem, nebo variantu v genu, kde byly takové mutace popsány na jiném místě a u které funkční validace potvrdila její patogenitu. Jednalo se o inaktivační mutace v genech CTLA4 (5 pacientů, z toho 4 sourozenci), aktivační mutace v genech PIK3CD (3x) a STAT3 (1x), vzácné poškozující 22

polymorfismy v genech CASP10 (2x) a TACI (1x) a v jednom případě o mutaci v genu KMT2D způsobující tzv. syndrom Kabuki. U 3 pacientů jsme nalezli jednu nebo více potenciálně patogenních variant, jejichž funkční dopad dosud nebyl ověřen (IKBKG, tzv. NEMO syndrom, CD40L spolu s FOXP3, IL6ST) a u tří pacientů jsme nenalezli žádnou variantu, která by vysvětlovala příznaky onemocnění. U pacienta s mutací CTLA4 byla nasazena léčba specifickým agonistou (Abatacept), u pacientů s mutací PIK3CD je zvažována léčba specifickým inhibitorem této dráhy. Závěr: Celoexomová sekvenace je průlomovou metodou, která dokáže odhalit genetickou příčinu a může pomoci správně cílit léčbu u podstatné části pacientů. Podpora: NV15-30626A. ANALÝZA REZISTENCÍ V GENECH NS3 A NS5A VIRU HEPATITIDY C PŘI LÉČBĚ PŘÍMOPŮSOBÍCÍMI ANTIVIROTIKY (DAA) Pavel Trubač (Laboratoř molekulární biologie a genetiky, Nemocnice České Budějovice, a.s. ) Spoluautoři: Natalja Piskunova (Laboratoř molekulární biologie a genetiky, Nemocnice České Budějovice, a.s.), Ondřej Scheinost (Laboratoř molekulární biologie a genetiky, Nemocnice České Budějovice, a.s.), Václav Chmelík (Infekční oddělení, Nemocnice České Budějovice, a.s.)

Zavedení léčby přímo působícími antivirotiky (directly acting antivirals - DAA) do klinické praxe je zásadním průlomem v léčbě virové hepatitidy C (VHC). V současné době se stává legitimním požadavkem vyšší než 95% úspěšnost léčby napříč celým spektrem pacientů s VHC genotypu 1 (GT1). Varianty spojené s rezistencí (resistance associated variant – RAV) u viru hepatitidy C jsou spojeny s vyšší pravděpodobností selhání léčby, což má dopad jak na pacienta (progrese jaterního onemocnění, nutnost opakování léčby), tak i na zdravotnický systém (celkově menší počet vyléčených pacientů při využití daného objemu finančních prostředků v rámci rozpočtu na léčbu VHC). Proteázové inhibitory byly prvními léky ze skupiny DAA na trhu a jsou také velice zranitelná skupina vůči primární i během léčby vznikající rezistenci. V současné době je známa řada kauzálních mutací, ovlivňujících léčbu proteázovými inhibitory. Jedná se o varianty v oblasti NS3 (asi nejlépe je popsaná Q80K spojená s rezistencí na simeprevir). Další skupinou DAA jsou přípravky zacílené na virový protein NS5A, který se podílí na replikaci viru. Zde jsou asi nejznámější varianty na aminokyselinových pozicích 31 a 93.

PŘEDNÁŠKY


Vyšetření provádíme sekvenováním cílených oblastí virů s využitím PCR (polymerase chain reaction – polymerázové řetězové reakce). Procesem reverzní transkripce je přepsána virová RNA do komplementární DNA a za použití specifických primerů je amplifikován gen pro virovou proteázu NS3 a pro protein NS5A. PCR produkty jsou poté sekvenovány a hodnoceny na přítomnost jednotlivých variant. Celkem jsme vyšetřili několik desítek pacientů s VHC genotypem 1 v oblasti NS3 a NS5A. Naše nálezy RAV jsou porovnatelné s nálezy v Evropě a ve světě, nicméně zdá se, že frekvence výskytu jednotlivých variant jsou specifické pro daný region (stát). Sekvenace genu pro proteázu NS3 a proteinu NS5 viru hepatitidy C umožňuje identifikovat varianty spojené s rezistencí (sníženou účinností léčby) a individualizovat tak pacientovu terapii. Je podáván takový preparát, u kterého můžeme očekávat vysokou úspěšnost dosažení setrvalé virologické odpovědi (SVR). Zvyšuje se tím komfort a kvalita života pacientů s virovou hepatitidou C a vzhledem k vysoké finanční náročnosti léčby umožňuje toto vyšetření i maximalizovat nákladovou účinnost.

VI. - Preimplantační a prenatální diagnostika PRENATÁLNA ANALÝZA VRODENÝCH VÝVOJOVÝCH VÁD SRDCA A OBLIČIEK METÓDOU MLPA Andrea Štefeková (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc) Spoluautoři: Zuzana Čapková, Pavlína Čapková (Ústav lékařské genetiky, FN Olomouc)

Defekty srdca predstavujú najčastejšie vrodené vývojové poruchy u detí. Príčiny srdcových porúch môžu byť monogénne alebo polygénne. Môžu byť zdedené od jedného alebo oboch rodičov alebo je príčinou de novo mutácia. Vo väčšine prípadov spôsobených genetickými zmenami sa vyskytujú okrem srdcových porúch aj iné často veľmi variabilné klinické príznaky. Na skorú diagnostiku je veľmi dôležité použiť vhodnú metódu, aby po narodení mohla byť poskytnutá adekvátna starostlivosť takto postihnutému dieťaťu. Štúdia obsahuje súbor plodov 26 pacientiek, u ktorých boli ultrazvukom a fetálnym echokardiografickým vyšetrením indikované poruchy srdca a 1 plod s bilaterálnou agenézou obličiek. DNA plodov bola následne testovaná metódou MLPA na prítomnosť genetických zmien. Patológie sme zaznamenali celkovo u piatich plodov. V troch prípadoch sme zistili prítomnosť delécie v oblasti 22q11.2, u jedného plodu bola zistená delécia na 9q34.3 v géne EHMT1 a posledný plod mal deléciu na 8p23.1 v géne GATA4. NEINVAZIVNÍ PRENATÁLNÍ TEST – PANORAMA Non-invasive prenatal test – PANORAMA Barbora Gomolčáková (Bioptická laboratoř s.r.o.) Spoluautoři: Martina Putzová (Bioptická laboratoř s.r.o.), Marcel Hasch (Bioptická laboratoř s.r.o.), Michal Michal (Bioptická laboratoř s.r.o.)

Neinvazivní prenatální testování z krve matky (NIPT) přineslo do prenatální diagnostiky zásadní pokrok. Oproti tradičnímu screeningu (ultrazvuk, detekce biochemických markrů) má analýza volné DNA z krve těhotné ženy několik výhod. Mezi nejdůležitější patří zejména výrazně vyšší citlivost a nižší falešná pozitivita v detekci nejčastějších chromozomálních vad a tím omezení zbytečného množství invazivních výkonů. V současnosti je na trhu několik testů, které nabízejí detekci nejčastějších aneuploidií chromozomů pomocí analýzy volné DNA (cfDNA). Pro všechny přístupy je charakteristická amplifikace mateřské a fetální cfDNA izolované z plazmy matky a následná sekvenace. Většina testů využívá takzvanou „počítací“ techniku, založenou na masívně paralelním celogenomovém shotgun sekvenování. 23

PŘEDNÁŠKY


Princip spočívá v analýze miliónů náhodných amplifikovaných fragmentů DNA a jejich následném přirazení k sekvenci lidského genomu. Poté jsou porovnány poměry počtu čtení u jednotlivých analyzovaných chromozomů a určeny případné aneuploidie. Jedním z největších problémů „počítacích“ metod je zejména fakt, že nejsou, až na výjimky, schopné odlišit mateřskou od fetální části celkové cfDNA. PANORAMA test jako jediný využívá princip cíleného sekvenování k samotné analýze nejčastějších aneuploidií. Aneuploidie jsou identifikované analyzováním jednonukleotidových polymorfismů (SNP). Algoritmus bere v úvahu genotyp matky, frekvenci rekombinací a možný počet kopií v 13 392 polymorfních lokusech. Umožňuje určit procento fetální frakce ve vzorku a taky odhalit abnormality, které není možné zachytit „počítacími“ technikami, především triploidii, syndrom mizejícího dvojčete nebo chromozómální odchylky matky (maternální mozaicismus – nejčastější u pohlavních chromozomů). Analyzované je relativní zastoupení jednotlivých polymorfních alel v plazmě. Na rozdíl od „počítacích“ testů dokáže PANORAMA test identifikovat vzorky s parametry nevhodnými pro určení spolehlivého výsledku. Má proto méně falešně pozitivních i falešně negativních výsledků a to i při nízkých hodnotách fetální frakce. PANORAMA proto patří mezi nejspolehlivější dostupné neinvazivní prenatální screeningové testy. Bioptická laboratoř prošla verifikačním a validačním procesem pro technologický transfer a je proto jako jediná v České a Slovenské Republice oprávněna Panorama test provádět. Klíčová slova: neinvazivní prenatální testování, jednonukleotidový polymorfismus, chromozomální aneuploidie, volná DNA, sekvenování nové generaceSekce: Kategorie VI. - Preimplantační a prenatální diagnostika AUTOMATIZACE METODY CFDNA TEST – NIPT Automatization of method cfDNA test – NIPT Ivona Marešová (Gennet s.r.o.) Spoluautoři: Karolína Horáková, Filip Zembol, Martin Hynek, Jana Vávrová, David Stejskal, Monika Koudová, Martina Bittóová

Test cfDNA je od ledna 2015 součástí prenatálního screeningového programu na klinice Gennet s. r. o. Jedná se o neinvazivní prenatální test (NIPT) k detekci trizomie chromozomů 13, 18 a 21 s možností určení pohlaví. Metoda je založena na hodnocení relativní četnosti fragmentů volné DNA (cfDNA) v maternální plazmě pomocí celogenomového sekvenování s následnou bioinformatickou analýzou. Test cfDNA je indikován těhotným ženám s rizikem z 24

kombinovaného testu v rozmezí 1/100 – 1/500 bez ultrazvukového nálezu, ve věku nad 40 let po IVF, dále ženám s opakovanými potraty a s trizomií v předcházejícím těhotenství. Metoda zpracování maternální plazmy zahrnuje extrakci volné DNA, zarovnání DNA fragmentů a jejich následnou úpravu. Samotnému sekvenování předchází emulzní PCR. Sekvenace je založena na principu seminkonduktivity (Ion Proton, LifeTechnologies). Volné úseky DNA jsou po zpracování dat přiřazeny dle jejich sekvence k odpovídajícímu místu na daném chromozomu. Pokrytí zastoupených úseků je porovnáváno s referenčními hodnotami. Statistická metodika zpracování dat u cfDNA testu využívá k hodnocení Z-score a distribuci korigovaných počtů readů specifických chromozomů pomocí EWMA – exponenciálně váženého klouzavého průměru. Od února 2016 je k extrakci volné DNA z plasmy využíván izolátor QIAsymphony AS od firmy QIAGEN. Jedná se o plně automatický izolátor pro extrakci a přečištění volné DNA za použití QIAsymphonyCirculating DNA kitu (CE IVD). V dubnu 2016 byl do procesu automatizace zařazen také přístroj Sciclone G3 od firmy PerkinElmer. Jedná se o automatický pipetátor s 96-kanálovou pipetovací hlavicí a bezkontaktní technologií detekce hladiny kapaliny, pracující pod vysokým tlakem. Zavedení těchto dvou přístrojů do rutinní laboratorní praxe významně přispělo k zjednodušení a zrychlení celé analýzy s možností testování velkého množství vzorků při omezení rizika vzniku chyb a ke snížení ekonomické nákladnosti metodiky neinvazivního prenatálního screeningu. AKTUÁLNÍ TRENDY V PREIMPLANTAČNÍ GENETICKÉ DIAGNOSTICE Current trends in preimplantation genetic diagnosis Jakub Horák (Repromeda Biology Park) Spoluautoři: Miroslav Horňák (Repromeda Biology Park), David Kubíček (Repromeda Biology Park), Martina Pešáková (Repromeda Biology Park), Kateřina Veselá (Repromeda Biology Park)

Preimplantační genetická diagnostika (PGD) je oblast genetických vyšetření, která se provádí v rámci asistované reprodukce na biopsii embrya před jeho zavedením do dělohy matky. Provedení preimplantačního genetického screeningu (PGS) aneuploidií v rámci IVF je indikováno u pacientů, u kterých můžeme očekávat zvýšený podíl aneuploidních embryí. Nejvýznamnějším faktorem, který zvyšuje podíl aneuploidií u embryí, je věk matky. Průměrný věk pacientek podstupujících IVF se zvyšuje každým rokem a v současnosti

PŘEDNÁŠKY


se začíná blížit hranici 35 let, kde má již nárůst aneuploidií s věkem exponencionální průběh. Každoročně se nám tedy rozrůstá skupina žen, pro které PGS hraje nezastupitelnou roli v léčbě neplodnosti a její efektivitě. Screening aneuploidií se v posledních letech zároveň stal nedílnou součástí PGD strukturních aberací (především translokací) a PGD monogenních chorob. Pro PGS a PGD strukturních aberací se v současné době používá technologie sekvenování nové generace. Metoda VeriSeq PGS (Illumina) se vyznačuje především vysokým dynamickým rozsahem pro detekci odchylek v počtu kopií chromozomů, nebo jejich částí. Přechod na tuto metodu otevřel problematiku mozaicismu a postavil nás před otázku, jaký je klinický dopad mozaicismu u lidských embryí. Ačkoliv se z mozaicistních embryí mohou narodit zdravé děti, mozaicistní embrya mají oproti embryím euploidním poloviční implantační potenciál a zvýšené riziko potracení v následném průběhu těhotenství. V současnosti je tedy třeba používat pro PGS metody, které umožňují spolehlivě detekovat mozaicismus u biopsie embrya. Metoda VeriSeq PGS nám rovněž umožňuje provádět PGD strukturních aberací v rozlišení, která již překonává rozlišení dosažitelné u klasického vyšetření karyotypu. Otevírá se tedy otázka, zda s nástupem této nové technologie nepřehodnotit postavení vyšetření karyotypu v rámci léčebného postupu u neplodných párů. Zavedení karyomappingu využívajícího technologii SNP-array do PGD monogenních chorob nám poskytlo univerzální nástroj, kterým jsme schopni provést PGD prakticky okamžitě pro jakýkoliv pár se známou kauzální mutací. Ačkoliv z výhod karyomappingu těží všichni pacienti, naše data ukazují na to, že karyomapping zpřístupnil PGD zejména párům, které trpí vzácnou autozomálně dominantní chorobou s pozdním nástupem. Rostoucí zkušenosti s touto metodou nám umožňují pustit se do PGD i u složitých diagnóz bez rodinné historie, kde by provedení PGD bylo dříve nemyslitelné. ANEUPLOIDIE U LIDSKÝCH IVF EMBRYÍ JSOU NEJČASTĚJI ZAPŘÍČINĚNY CHYBOU 1. MEIOTICKÉHO DĚLENÍ BĚHEM OOGENEZE Miroslav Horňák (REPROMEDA) Spoluautoři: Jakub Horák (REPROMEDA), David Kubíček (REPROMEDA), Gabriela Tauwinklová (REPROMEDA), Pavel Trávník (REPROMEDA), Kateřina Veselá (REPROMEDA)

Od roku 2014 jsme provedli v našem IVF centru preimplantační genetickou diagnostiku monogenních onemocnění přibližně u 150 léčených párů. Rutinně používáme metodu karyomapping, která díky vysokému počtu vysoce polymorfních SNiPů napříč lidským genomem umožňuje nepřímou DNA diagnostiku jakéhokoliv monogenního 25

onemocnění, jelikož pro každou mutaci je stanovena těsná vazba s informativními SNiPy nacházejícími se uvnitř nebo v blízkém okolí postiženého genu. Karyomapping navíc detekuje aneuploidie všech chromozomů, které jsou identifikovány nepřítomností haplotypu nebo přítomností dvou haplotypů od jednoho rodiče. Lze tak sledovat původ aneuploidií, zdali pochází od otce nebo od matky. Navíc lze vysledovat, zdali je aneuploidie způsobena chybou v 1. nebo 2. meiotickém dělení. Na souboru 563 vyšetřených blastocyst metodou karyomapping jsme zjistili, že: a) u 31 % embryí se vyskytovaly aneuploidie b) 59 % aneuploidií byly chromozomové ztráty (monosomie) a 41% zisky (trisomie) c)

91 % aneuploidních chromozomů bylo způsobenou ziskem nebo ztrátou maternálního chromozomu a jen 9% aneuploidií bylo detekováno na paternálním chromozomu.

d)

meiotické trisomie byly zapříčiněny z 60% chybou 1. meiotického dělení a ze 40% chybou 2. meiotického dělení

Karyomapping představuje nejen efektivní nástroj pro PGD monogenních chorob, ale přináší nové poznatky ke genezi aneuploidií u lidských IVF embryí.

PŘEDNÁŠKY


VII. - Mezilaboratorní kontrola kvality

VÝSLEDKY EXTERNÍHO HODNOCENÍ KVALITY PRO VYŠETŘENÍ BUNĚČNÉHO CHIMERIZMU ZA ROK 2016

KONTROLA KVALITY – VAZBA HLA S CHOROBAMI 2016

Název sdělení anglicky: The results of proficiency testing for cell chimerism assessment in 2016

Quality Control - HLA alleles associated with diseases 2016 Eva Ratajová (Ústav hematologie a krevní transfuze ) Spoluautoři: Milena Vraná (Ústav hematologie a krevní transfuze)

V roce 2016 proběhly dvě zásadní změny v organizaci kontroly kvality: varianta celiakie byla rozdělena na dvě kola a došlo ke změně hodnocení výsledků. Se všemi změnami byli účastníci a zájemci seznámeni před zahájením MPZ v rámci pravidelného workshopu. Kontrola kvality nadále nabízí tři varianty: 1. B*27 (vazba s Morbus Bechtěrev a dalšími revmatoidními autoimunitními chorobami) 2. Alely DQ lokusů vázaných s celiakií (CD) - DQA1*02, *03, *05, DQB1*02,*03:02 3. DQB1*06:02 (vazba s narkolepsií) Účast a úspěšnost 2016: První kolo kontroly kvality proběhlo v termínu duben-srpen 2016, zúčastnilo se jej 29 laboratoří z ČR, SR a Rakouska. Druhé kolo probíhá, termín ukončení listopad 2016. B*27 - účast 14 laboratoří, 100% úspěšnost Alely DQ lokusů vázaných s celiakií I. kolo - účast 27 laboratoří, 4 laboratoře nesplnily kritérium úspěšné účasti II. kolo – účast 10 laboratoří DQB1*06:02 – účast 4 laboratoře, 100% úspěšnost Plán pro rok 2017: Únor: zahajovací workshop Březen: přihlášky k MPZ Duben-červenec: I kolo Září-listopad: II. kolo organizace obdobná jako v roce 2016. Informace: http://www.uhkt.cz/laboratore/kontroly-kvality/sub_article_1

Kontakty: [email protected]; [email protected]

26

Kristýna Pegová (Oddělení HLA) Spoluautoři: Pavla Hrabáková (Oddělení HLA), Monika Leontovyčová (Oddělení HLA), Renáta Přerovská (Oddělení HLA), Martina Staňková (Oddělení HLA), Dagmar Březinová (Oddělení HLA), Hana Čechová (Oddělení HLA)

Příjemce a jeho dárce, kvantitativní vyšetření potransplantačních vzorků a jejich slovní interpretace. Naše laboratoř je od roku 2014 zařazena do seznamu poskytovatelů zkoušení způsobilosti v rámci Externí hodnocení kvality pro vyšetření buněčného chimerizmu je Národní referenční laboratoří pro DNA diagnostiku organizováno již od roku 2005. Problematikou letošního kola bylo určení referenčních alel na základě vyšetření vzorků DNA příjemce a jeho dárce, kvantitativní vyšetření potransplantačních vzorků a jejich slovní interpretace. Naše laboratoř je od roku 2014 zařazena do seznamu poskytovatelů zkoušení způsobilosti v rámci Evropské společnosti pro imunogenetiku (EFI), a proto jsme se v letošním roce rozhodli rozšířit naši nabídku, zejména pro další zahraniční účastníky. Letošní kolo zkoušení způsobilosti pro oblast kvantitativního vyšetření buněčného chimerizmu po alogenní transplantaci (alo-HSCT) krvetvorných buněk jsme rozdělili do 2 variant – základní a rozšířenou. Varianty se od sebe liší počtem zaslaných vzorků. Rozšířená varianta je určená především pro laboratoře akreditované dle EFI, konkrétně pro splnění požadavku standardů v 6.3, bod C6.4.7, týkající se počtu analyzovaných vzorků v rámci zkoušení způsobilosti za 1 rok. Každý účastník obdržel vzorky DNA příjemce a jeho dárce a dále 5 kvantifikačních vzorků pro základní variantu a 10 pro variantu rozšířenou. DNA příjemce a dárce byly v naší laboratoři izolované z plné periferní krve a pro přípravu kvantifikačních vzorků smíchány v různém poměru. Jednotlivé vzorky pak byly označeny číslem, identifikačním písmenem a zaslány přihlášeným účastníkům. Do letošního kola se přihlásilo celkem 9 laboratoří - 3 tuzemské a 6 zahraničních (2x Slovensko, Polsko, Maďarsko a 2x Rusko), z nichž jedna laboratoř výsledky nezaslala. Ostatní účastníci provedli vyšetření metodami běžně používanými ve své laboratoři. Pro kvantifikaci buněčného chimerizmu použilo, včetně organizátora, 56 % účastníků pouze Short Tandem Repeats (STR) analýzu, 22 % analýzu Variable Number of Tandem Repeats polymorfizmů a 22 % kombinaci STR a inzerce/delece analýzy.

PŘEDNÁŠKY


Nejčastějším problémem byla falešná pozitivita (4/13 případů), která je dána především nevhodným výběrem informativního polymorfizmu pro kvantifikaci. Certifikát, společně s textovým a grafickým porovnáním, obdrželo všech 8 laboratoří, které zaslaly výsledky. Příští kolo externího hodnocení kvality pro oblast kvantitativního vyšetření buněčného chimerizmu po aloHSCT bude probíhat v první polovině roku 2017 podle obvyklého harmonogramu. Podpořeno projektem (Ministerstva zdravotnictví ČR) koncepčního rozvoje výzkumné organizace (00023736, ÚHKT). ZÁVĚRY HARMONIZAČNÍ SCHŮZKY ČIA S ODBORNÝMI POSUZOVATELI ODBORNOSTI 816 - LÉKAŘSKÁ GENETIKA Marie Dobrovolná (ÚHKT)

Český institut pro akreditaci, o.p.s. (ČIA) je neziskovou státní organizací a je formálně uznaným národním akreditačním orgánem oprávněným provádět akreditaci podle harmonizovaných norem a národních a evropských právních předpisů. Zdravotnických laboratoří se týká zejména ČSN EN ISO 15189 pro klinické laboratoře. Zákon o specifických zdravotních službách č. 373/2011 Sb. pro některé odbornosti požadavek na akreditaci legislativně zakotvil a plnění požadavků normy ČSN EN ISO 15189:2007 přestalo být nepovinnou iniciativou, ale požadavkem vedoucím k hlubší spolupráci mezi ČIA a odbornou veřejností sdruženou v ČLS JEP. Výsledkem se stala Dohoda o spolupráci v oblasti akreditace zdravotnických laboratoří podepsaná v únoru 2014. V této dohodě jsou definovány vzájemné závazky, mimo jiné ze strany ČLS JEP „navrhovat odborníky z jednotlivých odborných lékařských společností sdružených v ČLS JEP jako externí posuzovatele ČIA“ a ze strany ČIA na základě „návrhu odborných společností a po absolvování příslušného školení ČIA zařazovat odborníky způsobilé posuzovat plnění akreditačních kritérií v oblasti zdravotnictví do databáze externích posuzovatelů a využívat je při akreditaci subjektů posuzování shody působících v této oblasti“. Výše zmíněný zákon (Hl. II, díl 6, § 28-30) specifikuje podmínky pro poskytování genetických vyšetření a vzbudil nárůst poptávky po akreditaci genetických laboratoří. 27

To si vyžádalo nárůst počtu odborných posuzovatelů proškolených ČIA v auditních technikách a přístupu zaměřeném na „primární hledání shody“. Pokrok v molekulární biologii i požadavky nové normy ČSN ISO EN 15189:2013 však neustále staví odborné posuzovatele při jednáních v laboratořích do nových situací. Diskuze počínají při úvodních zasedání otázkou názvů akreditovaných postupů a předmětu vyšetření, pokračují během posuzování diskuzemi o metrologických lhůtách, požadavcích na zařízení, četnostech účasti v programech EHK nebo přiznání a uplatnění flexibilního rozsahu akreditace a končí u klasifikace neshod a formulací zpráv. Potřebu harmonizace v uvedených otázkách pociťovaly akreditované subjekty, vedoucí posuzovatelé ČIA i sami odborní posuzovatelé. Ti i přes snahu o objektivitu při posuzování mohou být ovlivněni vlastní zkušeností či názorem, což se pak může vést k ne zcela jednotnému nastavení plnění požadavků normy. Proto byla na začátek října 2016 svolána harmonizační schůzka ČIA s odbornými posuzovateli odbornosti 816, jejíž závěry budou předmětem tohoto sdělení.

PŘEDNÁŠKY


VIII. - Jiné

HISTORIE A SOUČASNOST URČOVÁNÍ OTCOVSTVÍ History of paternity testing until present day

ČÍM SE ZABÝVÁ ČESKÝ NÁRODNÍ REGISTR DÁRCŮ DŘENĚ? Daniela Šantová (Český národní registr dárců dřeně) Spoluautoři: Lucie Marckardt (Český národní registr dárců dřeně), Martina Fořtová (Český národní registr dárců dřeně), Pavel Jindra (Hematologicko-onkologické oddělení FN Plzeň)

Přes nástup moderních cílených léků zůstává pro řadu hematoonkologických onemocnění – především akutní leukémie – jedinou kurativní šancí alogenní transplantace krvetvorných buněk. S ohledem na dědičnost HLAS systému má pouze 20 - 30 % pacientů dárce v rodině a pro zbytek je třeba hledat v registrech nepříbuzných dárců. Nepříbuzenská transplantace krvetvorných buněk je medicínsky i organizačně složitým procesem, na němž se musí podílet celý (často mezinárodní) tým lidí z transplantačního centra, registru dárců a v neposlední řadě i z HLA laboratoře. Český národní registr dárců dřeně (ČNRDD) disponuje jedním z největších (>67 000 dárců) a nejkvalitnějších registrů ve střední a východní Evropě. Současně disponuje HLA laboratoří, která zajišťuje „high resolution“ (alelicjkou) HLA typizaci pacientů, příbuzných i nepříbuzných dárců pro transplantační centra v Plzni, Olomouci, Hradci Králové a Brně, případně i pro zahraniční centra. HLA laboratoř je od roku 2001 mezinárodně akreditována „EFI“ (European Federation For Immunogenetics). Kromě vyhledávání a vyšetřování dárců z vlastní databáze ČNRDD a jeho laboratoř zprostředkovává i vyhledávání, typizaci a import krvetvorných buněk pro tyto centra a export do celého světa. Koordinační centrum je aktivně napojeno na mezinárodní databáze „BMDW“ (Bone Marrow Donors worldwide“ a EMDIS (European Marrow Information Systém), které celosvětově propojují dárce a pacienty. Samotný registr je dále členem světové asociace registrů „WMDA“ (World Marrow Donor Association) a jako 4. registr na světě získal prestižní WMDA akreditaci, dokládající kvalitu všech jeho činností. Samotný odběr a zpracování krvetvorných buněk probíhá ve spolupráci s Hematoonkologickým oddělením FN Plzeň, které je jako jediné v ČR a postkomunistických zemích akreditováno „JACIE“ (Joint Accreditation Committee Isct Ebmt). Cílem mé přednášky bude seznámit posluchače s veškerou rozsáhlou činností Českého národního registru dárců dřeně při vyhledávání a vyšetřování (HLA typizace) optimálního nepříbuzného dárce krvetvorných buněk pro pacienty bez dárce v rodině. Tato práce byla podpořena Nadací pro transplantaci kostní dřeně. 28

Jiří Drábek (IMTM, LF UP a FN Olomouc )

Určování otcovství nezačalo testováním mikrosatelitů, ba ani ne krevní zkouškou na antigeny ABO systému. Historie paternit je dosledovatelná až do starého Říma a není bez zajímavostí. Tato prezentace se zabývá předělovými technickými a legálními aspekty, které nás dovedly až k dnešním kralujícím STRkám a věrohodnostnímu poměru (paternitnímu indexu) jako způsobu referování výsledku profilování DNA. Poděkování: Prezentace byla připravena za přispění grantů LO1304 a TE020000058.

Odkaz na přiložený obrázek: http://dna2016.cz/pic/abstract/file/73.png KLINICKY RELEVANTNÍ NÁLEZY CELOGENOMOVÉHO SCREENINGU U „ZDRAVÝCH” OSOB Clinically relevant CNVs in «healthy» individuals Marie Trková (Gennet s.r.o.) Spoluautoři: Věra Bečvářová (Gennet), Eva Hlavová (Gennet), Věra Krutílková (Gennet), Dagmar Rašková (Gennet), Michaela Hejtmánková (Gennet), David Stejskal (Gennet), Monika Koudová (Gennet), Jiří Horáček (Gennet)

Neočekávané nálezy (označované také jako incidental findings) jsou jedním z doprovodných problémů plošných genomických vyšetření. Jejich správná interpretace může

PŘEDNÁŠKY


být obtížná pro laboratoř i pro genetické poradenství. V letech 2010 až 2016 bylo v rámci prenatální i postnatální genetické diagnostiky vyšetřeno metodami array (SNP array a array CGH) celkem 4 200 vzorků (1 458 PRE a 2 742 POST). Asi jednu pětinu (578) postnatálních vzorků tvořili zdraví rodiče a další příbuzní, kteří byli testováni z důvodu ověření nálezu u dítěte/plodu. V této skupině zdravých osob jsme prokázali 82 klinicky relevantní CNV (Copy Number Variation). Většinu tvořily mikroduplikační a mikrodeleční syndromy s variabilní expresivitou a neúplnou penetrancí (např. oblasti 1q21.1, 15q11.2, 16p11.2, 16p13.11, 22q11.2). Další početnou skupinou byly X-vázané CNV odhalené u fenotypicky normálních nosiček (např. v genech STS1, DMD, MECP2, SHOX, OPHN1). Zachytili jsme CNV asociované s autosomálně dominantním onemocněním s úplnou i neúplnou penetrancí (např. geny NF1, RYR2, PMP22, CHEK2). U dvou párů jsme potvrdili nosičství identické heterozygotní CNV způsobující autosomálně recesivní onemocnění (geny ISPD, SMN1). Naše výsledky potvrzují nutnost genetické konzultace před samotným vyšetřením. Zdraví rodiče (a další příbuzní) musejí být informováni, že celogenomový screening může odhalit nečekané, například nosičství disposic pro onemocnění s pozdním nástupem či disposici k nádorovému onemocnění.

29

POSTERY


I. - Diagnostika monogenních onemocnění MOLEKULÁRNĚ-BIOLOGICKÁ A BIOCHEMICKÁ PODSTATA VROZENÉ PORUCHY GLYKOSYLACE U PACIENTA S DEFICITEM GENU ATP6AP1 Alžběta Vondráčková (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze) Spoluautoři: Nina Ondrušková (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Viktor Stránecký (ÚDMP VFN a 1. LF UK v Praze), Eva Horová (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Eva Trefilová (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Dagmar Dočekalová Zajícová (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Hana Hansíková (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Tomáš Honzík (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Jiří Zeman (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze), Markéta Tesařová (KDDL VFN a 1. LF UK v Praze)

Úvod: Dědičné poruchy glykosylace (Congenital Disorders of Glycosylation, CDG syndrom) jsou rychle se rozrůstající skupinou dědičných metabolických onemocnění (> 60 typů). Představují širokou, klinicky obzvláště heterogenní skupinu metabolických onemocnění, jejichž diagnostika je komplikovaná. Cílem studie bylo provést genetické a biochemické analýzy v rodině probanda a charakterizovat tak na buněčné úrovni patologické změny u tříměsíčního chlapce s hepatopatií a podezřením na vzácný typ CDG. Metody: Metodou celoexomového sekvenování nové generace byla na platformě HiSeq 2500 (Illumina) analyzována gDNA probanda a jeho rodičů. Biochemický screening CDG u pacienta zahrnoval analýzu krevního séra pomocí izoelektrické fokusace (IEF) a imunofixace transferinu (TRF), SDS-PAGE s Western blotem (WB) TRF a IEF s WB apolipoproteinu C-III (ApoC-III). Struktura a funkce buněčných organel na úrovni kultivovaných fibroblastů byla studována za použití imunofluorescence a imunocytochemie. Hladina vybraných proteinů ve fibroblastech byla analyzována pomocí SDS-PAGE/WB. Výsledky: U pacienta byla na chromozomu X identifikována doposud nepopsaná hemizygotní mutace c. 221T>C (p.Leu74Pro, ENST00000369762) v exonu 2 genu ATP6AP1. Gen ATP6AP1 kóduje přídavnou podjednotku komplexu V-ATPasy, který je nezbytný pro acidifikaci lumen sekretorických váčků. V séru pacienta byly nalezeny patologické profily TRF (CDG IIx) a ApoCIII (apoC-III0) definované zvýšeným zastoupením jejich hypoglykosylovaných forem, indikujících kombinovaný defekt N- a O-glykosylace. Imunofluorescenční metoda s PNA lektinem potvrdila snížený obsah sialovaných kyselin na O-glykanech mucinového typu „core1“. Alterovaná struktura Golgiho aparátu byla prokázána imunocytochemicky anti-giantinem, po inkubaci fibroblastů s brefeldinem A byl detekován opožděný retrográdní transport proteinů z Golgiho aparátu. Pomocí WB byla zjištěna snížená hladina COG7. 30

Závěr: Provedené genetické a biochemické analýzy u probanda prokázaly kombinovaný defekt N- a O-glykosylace spojený s narušenou funkcí Golgiho aparátu, jehož podstatou je mutace v genu ATP6AP1. Projekt byl podpořen granty RVO-VFN64165/2012, GAČR 14-36804G, AZV 16-31932A a AZV 15-28208A. PACIENT S MENKESOVOU NEMOCÍ A ROZSÁHLOU DUPLIKACÍ V ATP7A GENU Patient with Menkes disease and large duplication in ATP7A gene Daniela Záhoráková (Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1. LF UK ) Spoluautoři: Hana Hansíková (Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1. LF UK), Tomáš Honzík (Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1. LF UK), Alena Puchmajerová (Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1. LF UK), Jiří Zeman (Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1. LF UK), Pavel Martásek (Klinika dětského a dorostového lékařství VFN a 1. LF UK)

Menkesova nemoc je závažné X-vázané recesivní onemocnění způsobené mutacemi v ATP7A genu. Produktem genu je transmembránová ATPasa účastnící se přenosu mědi v buňce. V důsledku deficitu aktivity enzymů závislých na mědi trpí postižení od raného dětství vážnými neurodegenerativními poruchami a snížením pevnosti pojivových tkání. V genu ATP7A bylo dosud objeveno více než 300 mutací, z čehož velké duplikace představují asi 7%. Doposud bylo v ČR diagnostikováno pouze 5 pacientů s prokázaným defektem v ATP7A genu. Popisujeme první český případ Menkesovy nemoci způsobené rozsáhlou duplikací ATP7A v genu. U sedmiměsíčního (korigovaně 5měsíčního) hypotonického chlapce se ve věku 2 měsíců rozvinula farmakoresistentní epilepsie se zástavou psychomotorického vývoje. MRI/ MRA CNS prokázala kortikální atrofii, Leigh-like syndrom a nápadně vinuté cévy. Vlasy měl lámavé s obrazem pilli torti. Hypertrofická kardiomyopatie a atrofie zrakových nervů se objevila ve 4. měsíci věku. Hladina ceruloplazminu byla nízká (0,06 g/l, norma 0,2-0,6), přítomná byla laktátová acidóza (laktát v krvi 4 mmol/l, norma <2,3; laktát v likvoru 4,2 mmol/l, norma <2,1) se sníženým poměrem aktivity cytochrom c oxidázy a citrátsyntázy (0,22, norma 0,241,05). Tříměsíční terapie cupprum histidinátem byla bez efektu. Sekvenační analýza kódujících exonů genu ATP7A byla bez patologického nálezu. Analýza MLPA odhalila u probanda hemizygotní duplikaci exonů 5 až 10 a následná analýza cDNA duplikaci potvrdila. Výsledek molekulárně genetického

POSTERY


vyšetření potvrzující přenašečství matky byl k dispozici ve 13. týdnu gravidity a byla nabídnuta prenatální diagnostika. Mutační analýza genu ATP7A umožňuje definitivní potvrzení diagnózy u nemocných a je důležitá pro genetické poradenství a prenatální diagnostiku tohoto letálního onemocnění v postižených rodinách. Zavedení metody MLPA výrazně rozšířilo možnosti DNA diagnostiky Menkesovy nemoci v České republice. Práce byla podpořena granty Prvouk P24/LF1/3, MZCR RVO-VFN64165/2012 a UNCE 204011/2012. ACADIAN VARIANT OF FANCONI SYNDROME IS CAUSED BY MITOCHONDRIAL RESPIRATORY CHAIN COMPLEX I DEFICIENCY DUE TO A NON-CODING MUTATION IN COMPLEX I ASSEMBLY FACTOR NDUFAF6 Hana Hartmannová (UDMP, 1. LF UK) Spoluautoři: Lenka Piherová (UDMP), Kateřina Hodaňová (UDMP), Viktor Stránecký (UDMP), Anna Pristoupilova (UDMP), Veronika Baresova (UDMP), Ivana Jedlickova (UDMP), Martina Živná (UDMP), Helena Trešlová (UDMP), Anthony Bleyer (Section on Nephrology, Wake Forest School of Medicine, Medical Center Blvd, WinstonSalem, NC, USA), Stanislav Kmoch (UDMP)

The Acadian variant of Fanconi Syndrome refers to a specific condition characterized by generalized proximal tubular dysfunction from birth, slowly progressive chronic kidney disease and pulmonary interstitial fibrosis. This condition occurs only in Acadians, a founder population in Nova Scotia, Canada. The genetic and molecular basis of this disease is unknown. We carried out whole exome and genome sequencing and found that nine affected individuals were homozygous for the ultra-rare non-coding variant chr8:96046914 T>C; rs575462405, whereas 13 healthy siblings were either heterozygotes or lacked the mutant allele. This variant is located in intron 2 of NDUFAF6 (NM_152416.3; c.298-768 T>C), 37 base pairs upstream from an alternative splicing variant in NDUFAF6 chr8:96046951 A>G; rs74395342 (c.298-731 A>G). NDUFAF6 encodes NADH:ubiquinone oxidoreductase complex assembly factor 6, also known as C8ORF38. We found that rs575462405—either alone or in combination with rs74395342—affects splicing and synthesis of NDUFAF6 isoforms. Affected kidney and lung showed specific loss of the mitochondria-located NDUFAF6 isoform and ultrastructural characteristics of mitochondrial dysfunction. Accordingly, affected tissues had defects in mitochondrial respiration and complex I biogenesis that were corrected with NDUFAF6 cDNA transfection. Our results demonstrate that the Acadian variant of Fanconi Syndrome results from mitochondrial respiratory chain complex 31

I deficiency. This information may be used in the diagnosis and prevention of this disease in individuals and families of Acadian descent and broadens the spectrum of the clinical presentation of mitochondrial diseases, respiratory chain defects and defects of complex I specifically. IDENTIFICATION OF A NOVEL DNAJC5 MUTATION MISSED BY SANGER SEQUENCING IN A FAMILIAL CASE OF ADULT-ONSET NEURONAL CEROID LIPOFUSCINOSIS (ANCL) Ivana Jedličková (Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN v Praze) Spoluautoři: Anna Přistoupilová (Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN v Praze), Viktor Stránecký (Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN v Praze), Helena Hůlková (Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN v Praze), Stanislav Kmoch (Ústav dědičných metabolických poruch 1. LF UK a VFN v Praze), Maxime Cadieux-Dion (Centre Hospitalier de L´Universite de Montréal, Montréal, Canada), Patrick Cossette (Centre Hospitalier de L´Universite de Montréal, Montréal, Canada), Eva Andermann (Montréal Neurological Hospital & Institute, McGill University, Montreal, Québec, Canada), Frederick Andermann (Montreal Neurological Hospital & Institute, McGill University, Montreal, Québec, Canada), The Adult NCL Gene Discovery Consortium

The adult-onset forms of neuronal ceroid lipofuscinosis (ANCL, Kufs disease) are rare inherited neuropsychiatric disorders, which are characterized by intralysosomal accumulation of ceroid lipopigment in tissues. The ceroid accumulation affects primarily brain, leads to loss of neurons and progressive neurodegeneration. Genetically, homozygous or compound heterozygous mutations in genes CLN6, CTSF, GRN, CLN1, CLN5, ATP13A2, CLCN6, SGSH and heterozygous mutations in the DNAJC5 gene have been described as causative in ANCL cases. The list of the ANCL causal mutations/genes is not complete, as additional families are diagnosed with ANCL based on clinicopathological criteria with an unknown genetic background of the disease. To support the research on ANCL, the Adult NCL Gene Discovery Consortium (The Kufs Consortium) was established involving groups from Australia, UK, Europe, USA and Canada. The suspected ANCL families are evaluated based on clinical and histopathological criteria and further tested for candidate/causal genetic variations by next-generation sequencing based methods including targeted exome sequencing and whole-exome sequencing. Here we report a discovery of a 30 bp in-frame insertion in the DNAJC5 gene in one family with three affected individuals, a mother and two sons, with autosomal dominant (AD) Kufs disease. The 30 bp insertion is predicted

POSTERY


to result in a duplication of 10 amino acid residues, primarily cysteine residues, in a highly palmitoylated cysteine string motif and is predicted to affect the hydrophobicity and the palmitoylation of the mutated protein. This mutation is remarkable in view of the fact that it has been missed by whole exome sequencing with standard approach to data analysis. Moreover, Sanger sequencing of DNAJC5 in this family using a standard sequencing protocol led to a false-negative result. Considering that DNAJC5 is the prevalent gene for AD Kufs disease, it cannot be ruled out that this kind of mutation has been missed in other ANCL unsolved cases. This family exemplifies the limitations of next-generation and traditional Sanger sequencing approaches. MOLEKULÁRNÍ DIAGNOSTIKA SPINÁLNÍ MUSKULÁRNÍ ATROFIE V LABORATOŘI DNA DIAGNOSTIKY OLG FN OSTRAVA Molecular testing of spinal muscular atrophy in the Laboratory of DNA diagnostics of the Department of Medical Genetics, University Hospital of Ostrava Kateřina Buržáková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava ) Spoluautoři: Jakub Fojtík (Lékařská fakulta, Ostravská univerzita, Ostrava), Jarmila Valečková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Alfons Balcar (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Andrea Gřegořová (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Dagmar Grečmalová (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Nina Dvořáčková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Pavlína Plevová (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava), Andrea Hladíková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Ostrava)

Úvod: Spinální muskulární atrofie je těžké neuromuskulární onemocnění s autozomálně recesivním typem dědičnosti, které je charakterizováno degenerací buněk předních rohů míšních, což má za následek slabost a atrofii svalů. U 95 – 98 % pacientů s SMA je onemocnění způsobeno mutacemi telomerického genu SMN1 charakteru homozygotní bialelické kompletní nebo částečné delece, která zahrnuje exon 7. Přibližně 2% pacientů jsou složení heterozygoti s bodovou či jinou mutací jedné alely genu a delecí alely druhé. Pacienti s jednou kopií genu SMN1 jsou zdraví přenašeči, dvě a více kopií genu SMN1 lze považovat za normální stav bez fenotypového efektu. Pacienti a metody: Od června roku 2011 do srpna roku 2016 byla provedena detekce počtu kopií genu SMN1 u 1 556 pacientů. Testovaná skupina zahrnovala pacienty s podezřením na SMA (n = 60), rodinné příslušníky pacientů, u kterých bylo zjištěno SMA nebo přenašečství SMA (n 32

= 73), plody rodičů přenašečů pro SMA (n = 13), sterilní a infertilní páry, těhotné ženy s partnery (n = 1 410). Detekce počtu kopií genu SMN1 byla provedena metodou MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) pomocí soupravy SALSA MLPA P060-B2 SMA na genetickém analyzátoru ABI3130. Pro analýzu dat získaných metodou MLPA byl použit software Coffalyser. Paralelně byly nálezy ověřovány metodou relativní kvantifikace na přístroji LightCycler 480. Výsledky: U pacientů s podezřením na SMA byla diagnóza potvrzena nálezem delece v homozygotním stavu u 14 z 60 vyšetřených (23,3 %); nízký záchyt byl v podskupině dospělých (3/46, tj. 6,5 %), naopak vysoký záchyt byl v podskupině dětí (11/14, tj. 78,6 %). Ze 73 rodinných příslušníků pacientů, u kterých bylo zjištěno SMA nebo přenašečství SMA, bylo 55 přenašečů (75,3 %). Ze 13 vyšetřených plodů byla u 2 potvrzena diagnóza SMA (15,4 %) a 7 (53,8 %) bylo přenašečů. Ve skupině sterilních a infertilních párů a těhotných žen s partnery bylo detekováno 45 přenašečů z 1 410 vyšetřených (3,2 %). Co se týče počtu kopií genu SMN1, v celém souboru 1 556 pacientů, nebyla zjištěna žádná kopie v 16 případech (1 %), jedna kopie ve 107 případech (6,8 %), u 1 397 pacientů (89,9 %) byly zjištěny 2 kopie genu SMN1, u 35 pacientů (2,2 %) 3 kopie a u jednoho pacienta (0,1 %) 4 kopie genu SMN1. Závěr: Ve skupině sterilních a infertilních párů a těhotných žen s partnery bez rodinného výskytu SMA byla zjištěna frekvence přenašečů 3,2 %, tj. každý 31. je přenašečem vlohy ke spinomuskulární atrofii. MOLEKULÁRNĚ GENETICKÁ DIAGNOSTIKA AUTOZOMÁLNĚ RECESIVNÍ POLYCYSTICKÉ CHOROBY LEDVIN Molecular genetic diagnosis of autosomal recessive polycystic kidney disease Lena Obeidová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN ) Spoluautoři: Jan Hojný (Ústav biochemie a experimentální onkologie 1. LF UK), Josef Včelák (Endokrinologický ústav v Praze), Veronika Elišáková (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN), Miriam Kavec (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN), Jana Reiterová (Klinika nefrologie 1. LF UK a VFN v Praze), Tomáš Seeman (Pediatrická klinika 2. LF UK a FN Motol), Jitka Štekrová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN)

Autozomálně recesivní polycystická choroba ledvin (ARPKD) je závažné dědičné onemocnění ledvin, které je ve většině případů diagnostikováno již v prenatálním období, kdy jsou na ultrazvukovém nálezu typické zvětšené ledviny se zvýšenou echogenitou. Děti, které přežijí perinatální období, obvykle trpí arteriální a portální hypertenzí se souvisejícími

POSTERY


komorbiditami a postupným poklesem renálních funkcí. ARPKD je primárně způsobena mutacemi v genu PKHD1, ovšem fenotyp polycystických ledvin může být součástí i řady dalších syndromů, jako je například syndrom renálních cyst a diabetu (RCAD) způsobený mutacemi genu HNF1β, adultní forma polycystické choroby ledvin s mutacemi v genech PKD1 a PKD2, nefronoftíza (mutace v genech NPHP1 až NPHP16) a dalšími. Na našem pracovišti již byla v rámci grantového projektu zavedena mutační analýza genů PKHD1 a HNF1β pomocí amplikonového sekvenování na přístroji GS Junior (Roche). U řady pacientů však nebyla ani po doplnění genetické analýzy o MLPA obou genů odhalena kauzální mutace. Z tohoto důvodu naše pracoviště postupně rozšiřuje molekulární diagnostiku o mutační analýzu dalších genů pomocí sekvenování nové generace na přístroji MiSeq (Illumina). Z důvodu přítomnosti vysoce homologních pseudogenů je sekvenace genu PKD1 prováděna amplikonově pomocí Nextera XT kitu. Metodou cíleného obohacování je také postupně zaváděno sekvenování panelu pokrývajícího přibližně 70 genů, jejichž mutace způsobují syndromy projevující se (mimo jiné) i fenotypem polycystických ledvin. Komplexní molekulární analýza v budoucnu umožní upřesnění klinické diagnózy pacienta, což se odrazí nejen na lékařské péči samotného pacienta, ale také na plánování dalšího těhotenství v rodině. Podporováno výzkumnými projekty GAUK č. 1015, PRVOUKP25/LF1/2 a IGA MZ ČR NT/13090-4/2012 DNM1L-RELATED MITOCHONDRIAL FISSION DEFECT PRESENTING AS SPASTIC PARAPARESIS AND OPTIC ATROPHY DNM1L-related mitochondrial fission defect presenting as spastic paraparesis and optic atrophy Markéta Tesařová (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic) Spoluautoři: Tereza Daňhelovská (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Marie Rodinová (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Viktor Stránecký (Institute of Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Kamila Beránková (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Jana 33

Sládková (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Alžběta Vondráčková (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Jana Spáčilová (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Jan Zámečník (Institute of Pathology and Molecular Medicine, Second Faculty of Medicine, Charles University and Motol University Hospital, Prague, Czech Republic), Tomáš Honzík (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Hana Hansíková (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic), Jiří Zeman (Department of Pediatrics and Adolescent Medicine, First Faculty of Medicine, Charles University and General University Hospital in Prague, Prague, Czech Republic)

An increasing group of mitochondrial disorders is caused by mutations in nuclear genes affecting mitochondrial dynamics and function. DNM1L gene encodes the dynamin 1- like protein DNM1L (Drp1) which is crucial in the mitochondrial fusion process as well as fusion of peroxisomes. We describe a patient with novel heterozygous de novo DNM1L mutation c. 176C>T (p.Thr59Ile), which further expands the associated clinical spectrum. The patient exhibits axial hypotonia, spastic paraparesis, neo- and paleo-cerebellar syndrome and optic atrophy. Muscle biopsy revealed mild decrease in CI+III activity, increased SDH and decreased COX activity staining in 5% of muscle fibers. Furthermore, regular occurrence of “mega-mitochondria” along elongated mitochondrial network was found in cultured myoblasts which confirms impaired mitochondrial dynamic. Novel mutation c. 176C>T (p.Thr59Ile) in DNM1L gene was identified by exome sequencing and affects highly conserved Thr59 in the GTPase domain of the protein. Trp59 has been previously shown to be indispensable for GTPase reaction since it is involved in the positioning of the catalytic water molecule and Mg2+ coordination (Wenger et al 2013). All previously described missense mutations in 3 patients with varied phenotype were localized in the middle domain that is important for the self-assembly of the protein and its oligomerization. To conclude, our results further expand clinical phenotypes (including optic atrophy) associated with DNM1L mutations that is typical for mitochondrial disorders due to altered mitochondrial dynamics. Supported by research projects GAČR 14-36804G, RVOVFN64165/2012 and AZV 16-32341A.

POSTERY


PROBLÉMY S DIAGNOSTIKOU LEHKÉ HEMOFILIE A Martina Šimoníková (ÚHKT) Spoluautoři: Alena Radovská (ÚHKT), Dana Provazníková (ÚHKT),

Hemofilie A (HA) je jedna z nejčastějších vrozených poruch krevního srážení. Postihuje především muže, přibližně 1 z 10 000 obyvatel, ženy toto onemocnění pouze přenášejí na své potomky. HA je způsobena mutacemi v genu pro F8, které vedou k nedostatku nebo nefunkčnosti koagulačního faktoru VIII (FVIII). HA můžeme rozdělit dle množství FVIII na těžkou formu (FVIII pod 1 %), středně těžkou (1 – 5 %) a lehkou formu (5 – 40 %). Přibližně třetinu případů tvoří těžcí hemofilici. U lehkých a středně těžkých hemofiliků nedochází na rozdíl od těžké formy ke spontánnímu krvácení, ale krvácení může být velmi závažné např. po operačních výkonech. Lehká forma HA je způsobena různými záměnnými mutacemi v genu pro F8. Účelem našeho projektu bylo zhodnotit stanovení kauzality lehké formy hemofilie A. Vyšetřili jsme DNA 101 lehkých hemofiliků (indexových pacientů). Přímou sekvenací jsme zkontrolovali všech 26 kódujících oblastí (exonů) F8 včetně přilehlých intronových oblastí. Kauzální mutaci jsme nalezli u 92 % (93/101) z nich. U zbylých 8 jsme mutaci nenalezli, ačkoli klinicky splňovali kritéria lehké hemofilie - hladina FVIII snížená (FVIII:C 7 – 38 %, FVIII:Ag 9 – 15 %). Opakovaně byla vyloučena VWCH, s důrazem na diagnózu VWCCH, 2N. Pseudohemofilie spojená s mutacemi v genu ERGIC53 byla také vyloučena. Tento gen ovlivňuje sekreci koagulačních faktorů FV a FVIII a mutace by způsobila ztrátu aktivity obou faktorů. Hladina FV byla však u všech pacientů normální. Proto jsme přistoupili k sekvenování intronových oblastí, kde již byly popsány mutace spojené se vznikem lehké HA (databáze EAHAD). Nicméně ani toto sekvenování neodhalilo kauzální mutace. Závěrem můžeme shrnout, že jsme neobjasnili příčinu lehké formy hemofilie A u 8 % našich pacientů. Je zajímavé, že ačkoli je hemofilie A monogenní onemocnění, nemusí být nalezení kauzální mutace u lehkých hemofiliků jisté. Nelze vyloučit, že budou objevena další místa, hlouběji v intronových částech genu, spojená se vznikem lehké hemofilie A nebo jiné geny, které expresi FVIII ovlivňují. MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÁ DIAGNOSTIKA X-VÁZANÉHO HYDROCEFALU 2010 – 2016 Molecular diagnostics of X-linked hydrocephalus 2010 – 2016 Sylwia Walczysková (OLG, FN Ostrava) Spoluautoři: Šárka Hilscherová (Laboratoř DNA diagnostiky, Oddělení lékařské genetiky FN Ostrava), Hana Uhlíková (Laboratoř DNA diagnostiky, Oddělení lékařské genetiky FN Ostrava) 34

X-vázaný recesivní hydrocefalus je nejčastější formou dědičného hydrocefalu. Postihuje 1/ 30 tis. novorozenců mužského pohlaví. Onemocnění je spojeno s hydrocefalem, makrocefalií, mentální retardací, spasmy, flexními deformitami palců a spastickou paraplegií. Mutace v genu L1CAM (Xq28) způsobují několik onemocnění, jež byly sdruženy v L1 syndrom. Glykoprotein L1CAM hraje důležitou roli při vzniku nervového systému, podílí se na migraci neuronů, podporuje růst a myelinizaci axonů během embryonálního vývoje. Screening mutací přímým sekvenováním celé kódující oblasti genu L1CAM se v Laboratoři DNA diagnostiky OLG FN Ostrava provádí od roku 2010. Dosud bylo vyšetřeno 131 vzorků, z toho 53 těhotných pacientek, 36 vzorků plodových vod/ tkání plodů 42 narozených chlapců. Nejčastějším důvodem k vyšetření genu L1CAM byla UZ patologie ve smyslu rozsáhlého hydrocefalu po 20. týdnu těhotenství. Celkem bylo nalezeno 17 mutací, v jednom případě se jednalo o nonsense mutaci, jednou o sestřihovou mutaci, zbytek tvořily missense mutace. Mutace byly nalezeny u 8 nepříbuzných rodin. V literatuře se uvádí až 10% výskyt de novo mutací u matek, a/nebo výskyt mozaiky v zárodečných buňkách u prarodičů probandů. Asi pětina rodin s L1 syndromem nese privátní mutace. ZAVEDENÍ SEKVENOVÁNÍ NOVÉ GENERACE PRO PACIENTY SE SUSPEKTNÍ HEREDITÁRNÍ AMYLOIDÓZOU - PRVNÍ ZKUŠENOST Implementation of next generation sequencing (NGS) in samples with suspected hereditary amyloidosis – first experience Zuzana Kufová (Klinika hematoonkologie, Fakultní nemocnice Ostrava. Lékařská fakulta, Ostravská univerzita. Ústav experimentální biologie, Masarykova univerzita, Brno.) Spoluautoři: Jaroslav Januška (Komplexní kardiovaskulární centrum, Nemocnice Třinec Podlesí), Tereza Ševčíková (Lékařská fakulta, Ostravská univerzita. Klinika hematoonkologie, Fakultní nemocnice Ostrava), Jana Filipová (Lékařská fakulta, Ostravská univerzita. Klinika hematoonkologie, Fakultní nemocnice Ostrava. Katedra biologie a ekologie, Přírodovědecká fakulta, Ostravská univerzita.), Tomáš Jelínek (Klinika hematoonkologie, Fakultní nemocnice Ostrava.), Fedor Kryukov (Lékařská fakulta, Ostravská univerzita. Klinika hematoonkologie, Fakultní nemocnice Ostrava), Roman Hájek (Lékařská fakulta, Ostravská univerzita. Klinika hematoonkologie, Fakultní nemocnice Ostrava. Babákova myelomová skupina, Ústav patologické fyziologie, Masarykova univerzita, Brno)

Introduction: Hereditary amyloidosis is a disease caused by deposits of misfolded proteins (amyloids) in various tissues resulting in end organ damage. Formation of hereditary amyloidosis has been associated with germline mutations in 7 genes coding for amyloidogenic precursor proteins. At present, Sanger sequencing is routinely used for evaluation

POSTERY


of mutations in amyloidogenic genes, however the cost of this approach is relatively high. The more cost effective method that would cover broad range of target genes is still lacking, although employment of modern high throughput sequencing methods has potential to fill this gap. We designed a panel of 11 amyloidogenic genes including 7 common genes involved in hereditary amyloidosis along with 4 genes associated with other “amyloid diseases” (e.g. Alzheimer or prion diseases). By this approach, we are able to examine patients with suspected hereditary amyloidosis or “amyloid diseases” and confirm the diagnosis when positive results are obtained. Results: Altogether, 14 Gb data was generated for 43 patients. Four positive samples (identified by Sanger sequencing) were confirmed for the presence of mutation in genes involved in hereditary amyloidosis also by NextGen sequencing. Our preliminary data show repeated findings of various SNPs, predominantly in genes CST3, GSN and PRNP, which are associated with predisposition to amyloid formation. Moreover, in two samples, specific variant Ala25Thr in CST3 gene was detected. This variant is associated with higher risk of Alzheimer disease and age-related macular degeneration. This finding raises the intriguing possibility that all amyloid diseases, irrespective of the nature of the amyloid forming protein, share common genomic landscape. Detailed analysis and interpretation of sequencing results will be presented in poster. Discussion & conclusions: We designed and validated target sequencing for 11 genes associated with predisposition to amyloid formation. Enrichment of the set of commonly examined genes with genes linked with other types of amyloidoses improves the diagnostic potential for patients with suspected diagnoses. Acknowledgements: This work was supported by the Ministry of Health of the Czech Republic (15-29667A), MH CZ - DRO - FNOs/2015-2016, Institutional Development Plan of University of Ostrava (IRP201550), SGS10LF2016-17. MOLEKULÁRNĚ-GENETICKÁ DIAGNOSTIKA MUKOPOLYSA-CHARIDÓZY IVA Molecular-genetic diagnostics of mucopolysaccharidosis IVA Štěpánka Švecová (Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze ) Spoluautoři: Eva Trefilová (Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Dagmar Zajícová Dočekalová (Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Martin Magner (Klinika 35

dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Eva Hrubá (Ústav dědičných metabolických poruch, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Helena Poupětová (Ústav dědičných metabolických poruch, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Jiří Zeman (Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Markéta Tesařová (Klinika dětského a dorostového lékařství, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy v Praze a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze)

Mukopolysacharidóza typ IVA (MPS IVA, syndrom Morquio) (MIM 253000) je autozomálně recesivní onemocnění způsobené deficitem aktivity enzymu galaktosamin-6-sulfátsulfatázy (N-acetylgalaktosamin-sulfátsulfatáza), který je kódován genem GALNS (16q24.3). Tento enzym se účastní katabolismu mukopolysacharidů (glykosaminoglykanů) – především keratanu a chondroitinsulfátu v lysozomech. Mutace v genu GALNS vedou ke snížené (či nulové) aktivitě enzymu a tím i k hromadění těchto mukopolysacharidů v pojivové tkáni (chrupavky, klouby, atd.). Fenotypově se onemocnění manifestuje mezi 1. – 3. rokem života abnormálním vývojem kostry (malý vzrůst, kostní dysplazie), zákalem rohovky, nadměrnou hybností v kloubech; fragmenty glykosaminoglykanů jsou vylučovány močí. Incidence v České republice je přibližně 1 : 140 000. Diagnóza je stanovena na základě klinických příznaků kostních změn a měření aktivity enzymu v leukocytech a fibroblastech, případně biochemickým vyšetřením moči a krevní plazmy (často zvýšená sekrece keratansulfátu), a molekulárně-genetickým vyšetřením. Na enzymatické úrovni byla doposud diagnóza MPSIVA potvrzena u 13 pacientů z ČR (enzymatické vyšetření v leukocytech zajišťuje Ústav dědičných metabolických poruch od roku 1995). V naší laboratoři jsme zatím identifikovali kauzální mutace v genu genu GALNS u 9 z 10 vyšetřovaných pacientů, od kterých byla k dispozici DNA. U pacientů byly nalezeny pouze dosud dříve popsané mutace. Nejčastějším typem byla substituční záměna, zejména mutace c.1156C>T (p. Arg386Cys), nalezená u 4 pacientů (1x homozygotně), a mutace c.1219A>C (p. Asn407His), nalezená také u 4 pacientů. Prevalentní mutace se celosvětově liší dle jednotlivých populací, mutace c.1156C>T tvoří 8,9 % všech mutací nalezených v genu GALNS. Práce byla podpořena projektem RVO-VFN 64165/2012 a AZV 15-28208A.

POSTERY


II. - Diagnostika polygenních onemocnění

III. - Onkogenetika

NEXT GENERATION SEQUENCING DATA ANALYSIS EVALUATION IN PATIENTS WITH PARKINS ONISM FROM GENETICALLY ISOLATED POPULATION

GÉN PRE CHECKPOINT KINÁZU 2 A JEHO PORUCHY ASOCIOVANÉ S MALÍGNYMI OCHORENIAMI

Kristýna Kolaříková (University Hospital and Palacky University, Olomouc, Czech Republic) Spoluautoři: Radek Vodicka (University Hospital and Palacky University, Olomouc, Czech Republic), Radek Vrtel (University Hospital and Palacky University, Olomouc, Czech Republic), Katerina Mensikova (University Hospital and Palacky University, Olomouc, Czech Republic), Petr Kanovsky (University Hospital and Palacky University, Olomouc, Czech Republic), Martin Prochazka (University Hospital and Palacky University, Olomouc, Czech Republic), Iva Dolinová (Department of Nanomaterials in Natural Sciences, Technical University of Liberec, Czech Republic)

Parkinson‘s disease (PD) can be caused by genetic changes in a lot of genes. The effect of these changes is determined by the nature of the mutation and ranges from weak associations to pathogenic mutation which leads to loss of protein function. Our study is based on epidemiological data which show significantly increased prevalence of PD (2.9 %) in an isolated population of South-Eastern Moravia in the Czech RepublicWe compared two different Next Generation Sequencing (NGS) data analysis approaches in DNA from 28 PD patients in the genes responsible for Parkinsonism (ADH1C, ATP13A2, EIF4G1, FBXO7, GBA + GBAP1, GIGYF2, HTRA2, LRRK2, MAPT, PARK2, PARK7, PINK1, PLA2G6, SNCA, UCHL1 and VPS35) using: 1) Already described missense rare variants or pathogenic mutations 2) Twelve control DNA samples from the same isolated population. Ion Torrent NGS data processing and trimming from Fastaq through “bam” to “vcf” files was done parallely by Torrent Suite/Ion Reporter and NextGene software. Variants were than filtered using following parameters: AQ˃20; Read coverage ˃20; MAF˂0,01; SIFT: 0 - 0,05 and/or PolyPhen-2: 0,2 -1. After filtering out, three missense mutations were found in LRRK2 gene: rs33995883 in 6/0 patients/control (p/c), rs33958906 in 1/1p/c, rs781737269 in 3/0p/c, one missense mutation in MAPT gene rs63750072 in 6/1p/c and one mutation in HTRA2 gene rs72470545 in 3/1p/c. Both the results from NextGene with Ion Torrent adaptation and from Ion Reporter significantly correlated in variant calling. Our study may contribute to further explanation of genetic background of Parkinsonism. This study was supported by grant MZ- NV15-32715A 36

Název sdělení anglicky: Checkpoint kinase 2 gene and defects associated with malignant disease Daniela Žideková (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety v Bratislave) Spoluautoři: Olívia Hamidová (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety v Bratislave), Lenka Dolešová (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety v Bratislave, Ústav lekárskej biológie, genetiky a klinickej genetiky, LF UK a UN, Bratislava), Michal Konečný (Oddelenie lekárskej genetiky, Onkologický ústav sv. Alžbety v Bratislave)

Checkpoint kináza 2, proteínový produkt CHEK2 génu, je serín treonínová kináza aktivovaná ATM proteínom v odpovedi na DNA poškodenie. Zároveň je kandidátnym tumor supresorom, ktorého poruchy prispievajú k molekulárnej patogenéze rôznych typov malignít. Spolu s BRCA1, BRCA2, TP53 a ATM hrá dôležitú úlohu v DNA oprave, kontrole bunkového cyklu a apoptóze. CHEK2 gén je lokalizovaný na chromozóme 22q12.1, s veľkosťou 50 kb a genomickou DNA pozostávajúcou zo 14 exónov. V ľudskej DNA sa však celkovo vyskytuje až 16 pseudogénov uvedeného génu, čo výrazne technicky komplikuje DNA diagnostiku. Germinálne mutácie v CHEK2 géne sú asociované so zvýšeným výskytom karcinómu prsníka a prostaty. Ženy s dokázanou CHEK2 mutáciou majú riziko karcinómu prsníka až do 20 – 25 %, v porovnání s 8 – 12 % u všeobecnej populácie, riziko karcinómu prostaty u mužov s mutáciou je až do 27 % vs. 13 %. Nosiči mutácií môžu mať podľa literatúry taktiež zvýšené riziko kolorektálneho karcinómu, melanómu, osteosarkómu, karcinómov štítnej žľazy a obličiek. V rámci niektorých onkologických hereditárnych syndrómov sa preto zaraďuje k nízko, resp. stredne-penetrantným génom. Hlavným cieľom DNA diagnostiky je identifikovať u rizikových pacientov alebo zdravých probandov predispozíciu na nádorové ochorenie, pričom dôkaz závažnej mutácie má význam pre ďalší klinický manažment pacienta. Gén CHEK2 je primárne analyzovaný v rodinách s hereditárnym karcinómom prsníka a ovárií a zvýšeným výskytom asociovaných karcinómov prostaty, či osteosarkómov, v ktorých nebol nájdený kauzálny patologický variant v génoch BRCA1/2. Pomocou Sangerovho sekvenovania dokazujeme prítomnosť zmien vo všetkých 14 exónoch génu CHEK2, pričom exóny 10-14 sa preamplifikujú pomocou Long-Range

POSTERY


PCR. Najčastejšími patologickými variantmi tohto génu sú veľká delécia exónov 10-11 a bodový variant c.1100delC v exóne 10, ktoré vedú ku skráteniu a nefunkčnosti proteínu a zvýšeniu rizika nádorového ochorenia. Pomerne častým variantom je aj c.470T>C (p.I157T), ktorého interpretácia je však kontroverzná. Cieľom nášho príspevku je prezentácia výsledkov analýz v rodinách so zvýšeným výskytom nádorových ochorení a porovnanie so svetovou literatúrou. PILOTNÍ STUDIE: NGS ANALÝZA VYBRANÝCH GENŮ U ČESKÝCH PACIENTEK S ENDOMETROIDNÍM KARCINOMEM ENDOMETRIA NEBO OVÁRIA Pilot study of the NGS analysis of chosen genes in endometrioid endometrial or ovarian carcinomas in Czech patiens Ivana Tichá (Ústav patologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze ) Spoluautoři: Nikola Hájková (Ústav patologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Jan Hojný (Ústav patologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Kristýna Němejcová (Ústav patologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze), Pavel Dundr (Ústav patologie, 1. lékařská fakulta, Univerzita Karlova a Všeobecná fakultní nemocnice v Praze)

Background: Endometrioid endometrial carcinomas (EEC) represent majority of endometrial carcinoma (70-80%) and are usually associated with hyperestrinism. On the contrary, endometrioid ovarian carcinomas (EOC) are relatively rare (10% of ovarian carcinomas) and commonly arise in endometriosis. Endometrioid carcinomas probably arise from the same precursor cell and share many histological and molecular alterations. Frequency and spectrum of mutations in these carcinomas in the Czech population is unknown. Materials and methods: Genomic DNA was isolated from 17 fresh frozen EECs and 32 archived EOC tissues. Sequence capture NGS was performed on MiSeq (Illumina). Data were processed by NextGene software (Softgenetics). Pathogenic somatic variants were evaluated in genes KRAS, NRAS, BRAF, KIT, BRCA1, BRCA2, PIK3CA and PTEN. Results: Eighteen PTEN variants were found in 14/17 (82.4%) EECs, 3 patients carried two or three PTEN mutations. Twelve PTEN mutations were identified in 8/15 (53.3%) EOCs (only 15 cases of 32 EOCs were suitable for PTEN evaluation due to low coverage in exon 5). Only nonsense and frameshift BRCA1/2 variants were assessed. BRCA2 variants were relatively common in EECs (6/17; 35.3%) and EOCs (6/32; 18.8%), 3 tumors carried two 37

BRCA2 mutations. BRCA1 mutation was found in 5/32 (15.6%) EOCs. KRAS mutations were more frequent in EOCs (7/32; 21.9%) than in EECs (1/17; 5.9%). NRAS and BRAF were mutated only in EOCs (3/32; 9.4% and 1/32; 3.1%, respectively). Hotspot PIK3CA variants in exons 9 and 20 were evaluated only in EOC cases and 7/32 (21.9%) carried pathogenic mutation. In two EECs was detected possibly splicing variant in KIT (NM_000222.2:c.67+4G>S), one EOC carried possibly damaging variant c.2381C>T (p.A794V). Conclusion: The PTEN and BRCA2 mutations were frequent in EECs (82.4% and 35.3%) and EOCs (53.3% and 18.8%, respectively). Mutations in BRCA1 (15.6%) and NRAS (9.4%) were found only in EOCs, but small sample sets should be taken into consideration. EECs and EOCs carried similar mutations, however the frequency differed. Larger cohorts and extended panel of genes may reveal genetic divergence between EECs and EOCs. This work was supported by Ministry of Health, Czech Republic (conceptual development of research organization 64165); research project LM 2015089; OPPK (Research Laboratory of Tumor Diseases, CZ.2.16/3.1.00/24509). ZMĚNY EXPRESE BIOTRANSFORMAČNÍCH ENZYMŮ V PRIMÁRNÍCH NÁDORECH JATER JSOU NEJVÝZNAMNĚJŠÍ U HIGH-GRADE TUMORŮ Expression of biotransformation enzymes in primary liver cancer is significantly altered especially in high-grade tumours Jana Nekvindová (Fakultní nemocnice Hradec Králové ) Spoluautoři: Alena Mrkvicová (Fakultní nemocnice Hradec Králové), Pavel Souček (Státní zdravotní ústav, Praha), Pavel Anzenbacher (Lékařská fakulta Univerzity Palackého v Olomouci), Ondřej Slabý (Masarykův onkologický ústav, Brno), Igor Kiss (Masarykův onkologický ústav, Brno), Vladimír Palička (Fakultní nemocnice Hradec Králové)

Primární nádory jater, kam patří zejména hepatocelulární karcinom (HCC) a cholangiokarcinom (CC), se celosvětově řadí mezi nejvýznamnější nádory co do incidence i mortality. V procesu jaterní kancerogeneze se uplatňují především virové hepatitidy, cirhóza, nealkoholická steatotická hepatitida (NASH) nebo hemochromatóza. V České republice je incidence přibližně 10 případů na 100 000 obyvatel. Resekce nádoru je možná u cca 10 - 30 % případů, s tím souvisí i špatná prognóza onemocnění pouze 15 - 20 % pacientů dosahuje přežití 5 let.

POSTERY


V průběhu kancerogeneze dochází k deregulaci exprese mnoha genů, a jelikož jsou játra hlavním orgánem biotransformace, lze očekávat změny exprese také genů kódujících enzymy metabolismu xenobiotik. Významně snížená exprese metabolických enzymů v jaterních nádorech oproti nenádorové tkáni by u rozsáhlejších nádorů mohla způsobit nestandardní odpověď pacientů na farmakoterapii. Naše analýzy ukazují, že především nízce diferencované (histologický grade III-IV) nádory prakticky ztrácí schopnost metabolizovat významnou část léčiv, když je postižena I. i II. fáze metabolismu, tj. většina cytochromů P450 a rovněž nejvýznamnější jaterní enzymy II. fáze biotransformace léčiv z rodin UDP-glukuronyltransferáz (UGT), sulfotransferáz (SULT), N-acetyltransferáz (NAT) a glutathion-S-transferáz (GST), což by u pacientů s rozsáhlým postižením jater mělo být zvažováno při indikaci farmakoterapie a prevenci nežádoucích účinků či toxicity léčiv. Práce byla podpořena MZ ČR – RVO (FNHK, 00179906). PILOTNÍ STUDIE VYUŽITÍ NGS TECHNOLOGIE PRŮKAZ A SLEDOVÁNÍ MUTACÍ V GENU CEBPA U AML PACIENTŮ A pilot study of the use of NGS technology for detection and monitoring CEBPA mutations in AML patiens Kateřina Hrochová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové) Spoluautoři: Filip Vrbacký (IV. interní hematologická klinika, FN Hradec Králové), Lucie Petrová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, FN Hradec Králové), Marcela Chmelařová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, FN Hradec Králové), Alžběta Zavřelová (IV. interní hematologická klinika, FN Hradec Králové), Jakub Radocha (IV. interní hematologická klinika, FN Hradec Králové), Pavel Žák (IV. interní hematologická klinika, FN Hradec Králové)

Transkripční faktor CCAAT enhancer vazebný protein alpha (CEBPA) má důležitou roli pro normální vývoj granulocytů. Gen CEBPA obsahuje velké množství GC bází, nemá žádné introny, leží na chromozomu 19q13.1. Mutace genu CEBPA jsou příznivým prognostickým faktorem pro klinický výsledek u pacientů s AML s normálním karyotypem. V současné době se uvádí možný výskyt nejen jedné mutace, ale i vícečetných mutací v genu CEBPA. Cílem této pilotní studie bylo využít NGS (sekvenování nové generace) technologii pro průkaz a sledování mutací v genu CEBPA u vybraných pacientů s akutní myeloidní leukémií. Metoda: U 25 pacientů v době diagnózy byla provedena mutační analýza genu CEBPA metodou Sangerovo sekvenování. U 3 pacientů byla nalezena mutace (292 het_del C, 432_433het_insertion 4bp, 172-182 het_del 10 bp). Pro NGS jsme navrhli primery v programu PrimeBlast. Příprava a kvantifikace amplikonů musela být navržena pro GC bohaté oblasti DNA. 38

Sekvenace proběhla na přístroji MiSeq Illumina. Pro analýzu dat jsme použili několik různých bioinformatických přístupů. Citlivost záchytu mutací jsme si nastavili na 5 %. NGS metoda nám umožnila s větší citlivostí zachytit mutace ve vzorcích v době diagnózy, které jsme klasickým Sangerovým sekvenováním neprokázali. Tato metoda je vhodná i pro sledování účinnosti léčby u hematoonkologických pacientů. SLEDOVÁNÍ EXPRESE EVI1 (TRANSKRIPČNÍ FAKTOR) V RÁMCI MRN U PACIENTŮ S AKUTNÍ MYELOIDNÍ LEUKÉMIÍ The monitoring of the EVI1 expression within MRD in patients with acute myeloid leukemia Lucie Petrová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové) Spoluautoři: Kateřina Hrochová (Ústav klinické biochemie a diagnostiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Pavlína Havlíková (Oddělení lékařské genetiky, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Benjamin Víšek (IV. interní hematologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Miriam Lánská (IV. interní hematologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové), Pavel Žák (IV. interní hematologická klinika, Fakultní nemocnice Hradec Králové)

Onkogen EVI1 („ecotropic viral integration site 1“), jehož zvýšená exprese je negativním prognostickým faktorem u dospělých pacientů s akutní myeloidní leukémií (AML), je lokalizovaný na třetím chromozomu v oblasti q26.2. Zvýšená exprese transkriptu EVI1 bývá spojována se specifickými přestavbami chromozomů, např. t(3;3)(q21;q26), t(3;21) (q26;q22), či inv(3)(q21q26). Bylo popsáno, že tato zvýšená exprese blokuje diferenciaci granulocytů a erytroidních buněk, a zároveň podporuje růst některých typů buněk. Rutinní sledování exprese transkriptu EVI1 u pacientů na základě již zmíněných cytogeneticky diagnostikovaných chromozomálních přestaveb probíhá v naší laboratoři od počátku roku 2015. Doposud se nám podařilo zajistit sledování minimální reziduální nemoci (MRN) u celkem čtyř pacientů s diagnostikovanou výše popsanou translokací či inverzí. Sledování hladiny exprese tohoto genu je prováděno pomocí metody real time PCR využívající primery a sondu specifické pro sekvenci genu EVI1, tudíž jsme schopni sledovat MRN v rámci všech souvisejících chromozomálních přestaveb. Pro vyhodnocení relativního množství exprese transkriptu EVI1 jsme použili metodu ΔΔCt, vztaženou k expresi udržovacího genu Abl. Od počátku záchytu jsou tito pacienti sledováni v časovém intervalu po 3-4 měsících, kdy se sleduje vliv léčby (transplantace) na expresi transkriptu, případně možná hrozba rozvoje relapsu v čase. EVI1 se v naší laboratoři osvědčil jako vhodný marker pro sledování MRN u pacientů s AML.

POSTERY


ZÁCHYT SOMATICKÝCH MUTACÍ VYBRANÝCH POLYMERÁZ U PACIENTŮ S KOLOREKTÁLNÍM KARCINOMEM Somatic mutation screening of selected polymerases for patients with colorectal carcinoma Markéta Urbanová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF a VFN UK ) Spoluautoři: Josef Včelák (Endokrinologický ústav, Praha), Michaela Schneiderová (1. chirurgická klinika 1. LF a VFN UK, Praha), Ludmila Vodičková (Ústav experimentální medicíny, AV ČR, Praha), Pavel Vodička (Ústav experimentální medicíny, AV ČR, Praha)

Enzymy polymerázy, podílející se na replikaci, transkripci a reparaci nukleových kyselin, jsou z evolučního hlediska silně konzervované a jakákoliv DNA varianta v délce jejich kódující oblasti je pod silným selekčním tlakem. V nedávné době byly germinální varianty nacházející se v oblasti excizní domény genů polymerázy delta (PolD1) a polymerázy epsilon (PolE) spojeny s dominantně dědičným syndromem PAPP (Polymerase proofreading-associated polyposis). Polymeráza Beta (PolB je důležitým článkem DNA oprav typu BER (base-excision repair). Není sice spojována s dědičným onemocněním typu PAPP, ale v nádorech tlustého střeva se vyskytuje mnoho somatických mutací (až 30 % nádorů), které vykazují klonalitu a mohli by být zodpovědné za nádorový rozklad genové integrity. Na našem pracovišti byl vytvořen NGS panel cílící do oblastí vybraných polymeráz s cílem zachytit převážně somatické mutace v nádorové tkáni skupiny pacientů s kolorektálním karcinomem sporadického výskytu. Smyslem tohoto projektu bylo zavedení metody na detekci somatických mutací s maximálním využitím souboru DNA, která již je na pracovišti k dispozici. Získaná data byla vyhodnocena a rozšířen přehled charakteristik pacientů a samotných nádorů. Jedním z důležitých cílů této práce bylo získání zkušeností se zpracováním objemných NGS dat a příprava pilotní studie pro budoucí projekty. VYHODNOCENÍ VÝSLEDKŮ VYŠETŘENÍ MUTACÍ V GENECH BRCA1 A BRCA2 U RIZIKOVÝCH PACIENTŮ The results of BRCA1 and BRCA2 testing in a high risk category of patiens Václava Curtisová (Ústav lékařské genetiky FNOL) Spoluautoři: Enkhjargalan Mracká (Ústav lékařské genetiky FNOL), Romana Kratochvílová (Ústav lékařské genetiky FNOL), Michaela Žídková (Univerzita Palackého, Olomouc)

Úvod: Hereditární syndrom karcinomu prsu a ovaria (HBOC) je autozomálně dominantně dědičné onemocnění způsobené mutacemi v genech BRCA1 a BRCA2. HBOC je zodpovědné za 5 - 10 % karcinomů prsu a více než 39

10 % karcinomů ovaria. Testování germinálních mutací je indikováno při splnění indikačních kritérií po provedení genetického poradenství. Provádí se v kontextu onemocnění (diagnostické testování) nebo zvýšeného dědičného rizika (prediktivní testování). Cíle: Cílem práce bylo zodpovědět, zda byla u pacientů splněna indikační kritéria testování, u jakého procenta pacientů byla nalezena mutace, zda existuje souvislost jednotlivých indikačních kritérií a výsledků testování, jaké bylo zastoupení pohlaví při prediktivním testování, jaké bylo spektrum nalezených mutací a jaká je korelace spektra nalezených mutací a mutací zastoupených v komerčně nabízeném kitu. Metodika: Retrospektivní studie indikací a výsledků testování mutací v genech BRCA1 a BRCA2 v kohortě 146 pacientů vyšetřených laboratoří Ústavu lékařské genetiky FNOL v roce 2013. Výsledky: Základní indikační kritéria nesplňovalo 18 % pacientů (z toho 94 % splňovalo platná rozšířená indikační kritéria), u žádného z těchto pacientů nebyla nalezena mutace v BRCA1, BRCA2 genech. Ve skupině pacientů s karcinomem prsu/ovaria byla mutace nalezena u 18 % pacientů. Nejvyšší počet pozitivních výsledků byl u mužů s karcinomem prsu (67 %) a u žen s nádorovou duplicitou – prs a/nebo ovarium (40 %). Nebyla zjištěna souvislost mezi počtem splněných indikačních kritérií a pravděpodobností pozitivního výsledku. O prediktivní testování mělo zájem 68 % žen a 32 % mužů. Žádná mutace nebyla zachycena u více než jednoho pacienta. Komerčně nabízený kit by zachytil pouze 25 % mutací. Závěr: Výsledky potvrdily správnost indikací k vyšetření, dobrou senzitivitu indikačních kritérií a zvýšené riziko přítomnosti mutace u mužů s karcinomem prsu a u žen s nádorovou duplicitou. Odhalily zvýšený zájem o prediktivní testování u žen a nedostatečný záchyt mutací komerčním kitem. Výsledky jsou v souladu s publikovanými údaji.

POSTERY


IV. - Bioinformatika

V. - Nové diagnostické postupy

GLASS: ASSISTOVANÉ A ŠTANDARDIZOVANÉ POSUDZOVANIE SEKVENČNÝCH VARIANT Z DÁT SANGEROVHO SEKVENOVANIA

RYCHLÁ DETEKCE SOMATICKÝCH MUTACÍ U NÁDORŮ TLUSTÉHO STŘEVA (CRC), PLIC (NSCLC) A MALIGNÍHO MELANOMU S VYUŽITÍM SYSTÉMU BIOCARTIS IDYLLA™

GLASS: assisted and standardized assessment of gene variations from Sanger sequence trace data Pál Karol (CEITEC MU) Spoluautoři: Vojtěch Bystrý (CEITEC MU), Tomáš Reigl (CEITEC MU), Adam Krejčí (CEITEC MU), Boris Tichý (CEITEC MU), Šárka Pospíšilová (CEITEC MU, FN Brno), Jitka Malčíková (CEITEC MU, FN Brno), Nikos Darzentas (CEITEC MU)

Sangerovo sekvenovanie je stále základná metóda pre detekovanie sekvenčných variant. Interpretácia chromatogramov, ako kĺúčová časť analýzy dát zo Sangerovho sekvenovania, často vyžaduje vizuálnu kontrolu a nemalé množstvo skúseností. Ďalším kľúčovým aspektom je správne pomenovanie nájdených variant, pričom názvoslovie je často ponechané na samotných užívateľoch, čo môže viezť v tomto ohľade k nejasnostiam. Nástroj GLASS je vytvorený pre asistenciu pri pracovnom postupe „vizuálnej kontroly“ Sangerových dát a vyhodnocovanie sekvenčných variant. Program tiež ponúka štandardizované pomenovanie variant ako výstup analýzy podľa doporučení siete TP53 v rámci Európskej iniciatívy ERIC.

Rapid Detection of Somatic Mutations in CRC, NSCLC and Melanoma Using Biocartis Idylla™ Systém Andrea Hopenštoková (CGB laboratoř a.s.) Spoluautoři: Jarmila Šimová (CGB laboratoř a.s.), Barbora Kubová (CGB laboratoř a.s.), Iveta Žebráková (CGB laboratoř a.s.), Lenka Schreibrová (CGB laboratoř a.s.), Magdalena Uvírová (CGB laboratoř a.s., Lékařská fakulta, Ostravská Univerzita, Ostrava), Irena Urbanovská (CGB laboratoř a.s., Lékařská fakulta, Ostravská Univerzita, Ostrava), David Konvalinka (CGB laboratoř a.s.), Radek Měch (CGB laboratoř a.s.), Jana Mazurová (CGB laboratoř a.s.), Nina Dvořáčková (CGB laboratoř a.s., Lékařská fakulta, Ostravská Univerzita, Ostrava), Jana Dvořáčková (CGB laboratoř a.s., Lékařská fakulta, Ostravská Univerzita, Ostrava, Ústav patologie, Fakultní nemocnice Ostrava, Ostrava)

Úvod: Testování vybraných molekulárních markerů v případě použití cílené biologické léčby nádorů (status RAS genů u CRC, EGFR gen u NSCLC atd.) je, v éře personalizované medicíny, již standardem. Současně vzniká požadavek klinických onkologů na rychlou časovou dostupnost výsledku a to zejména u plicních nádorů. Jsou tedy vyvíjeny a testovány nové detekční systémy. Materiál a metody: Vstupním materiálem pro analýzu byly FFPE tkáňové řezy a cytologické nátěry pacientů s diagnózou NSCLC, CRC a maligním melanomem. Detekce biomarkerů probíhala na plně automatizovaném systému Biocartis Idylla™, který je založený na real-time PCR. Systém zahrnuje celý proces od izolace DNA až po výsledek (deparafinizace, zkapalnění vzorku, lýze buněk, extrakce DNA, amplifikace/ detekce v reálném čase). Použity byly testy Idylla™ KRAS Mutation Test (CE-IVD), NRAS-BRAF-EGFRS492R Mutation Assay (RUO), Idylla™ EGFR Mutation Assay (RUO), Biocartis, Bamed. Uváděná citlivost testů je pro většinu detekovaných mutací 1 - 5 %. Výsledky: V naší laboratoři bylo dosud (v průběhu 9 měsíců) vyšetřeno systémem Biocartis Idylla™ 37 vzorků parafinových bloků pacientů s diagnózou CRC, 3 vzorky pacientů s NSCLC a 1 vzorek pacienta s maligním melanomem. Výsledek mutačního statusu vyšetřovaných genů, včetně přípravy vzorku, byl dostupný do cca 2,5 hod. Závěr: Diagnostický systém Biocartis Idylla™ je uživatelsky velice jednoduchý a rychlý s minimálními časovými nároky na ruční práci personálu. V naší laboratoři byl tento systém využit zejména v případech požadavků onkologů pro rychlou statimovou analýzu biomarkerů a v případech analýz méně kvalitních, problematických vzorků, kdy jiné detekční metody selhaly.

40

POSTERY


VYUŽITÍ METODY NGS PRO DETEKCI MOZAICISMU MUTACE V GENU KCNH2 ZPŮSOBUJÍCÍ SYNDROM DLOUHÉHO QT INTERVALU

VI. - Preimplantační a prenatální diagnostika

The use of NGS method for the detection of mosaicism of mutation in KCNH2 gene causing Long QT Syndrome

KAZUISTIKA: UPD CHROMOZOMU 14 JAKO VÝSLEDEK TRISOMIC RESCUE

Iva Synková (OLG FN Brno) Spoluautoři: Edita Ošťádalová (OLG FN Brno)

Syndrom dlouhého QT intervalu (LQTS) je dědičné onemocnění manifestující se abnormální repolarizací srdeční tkáně, které pacienty predisponuje ke smrtelným arytmiím. Doposud bylo s tímto onemocněním asociováno 16 genů, přičemž až 70 % případů je způsobeno mutacemi v genech KCNQ1, KCNH2 a SCN5A (Schwartz et al., 2013). U probandky zemřelé na srdeční selhání a následně také u jejího bratra byla detekována mutace c.1919_1921delTCT v genu KCNH2 způsobující deleci fenylalaninu v pozici 640 proteinu Kv11.1 (Andršová et al., 2012). Protein Kv11.1 tvoří alfa podjednotku srdečního draslíkového kanálu IKr a jeho mutace způsobují LQTS typu 2. Metodou Sangerova sekvenování nebyla tato mutace detekována ani v DNA izolované z plné krve rodičů, ani v DNA izolované ze spermatu otce. Pro ověření hypotézy výskytu mutace v malém procentuálním zastoupení (v podobě somatického mozaicismu u jednoho z rodičů nebo gonadálního mozaicismu u otce obou sourozenců) byla využita metoda cíleného amplikonového sekvenování na přístroji GS Junior. I při dosažení vysokého pokrytí cílových sekvencí nebyla mutace u rodičů detekována. Vzhledem k negativnímu nálezu ve spermatu otce můžeme vyloučit paternální původ mutace. Maternální zárodečná linie testována nebyla, usuzujeme proto, že se v tomto případě mohlo jednat o maternální gonadální mozaicismus.

Inna Soldatova (GENNET) Spoluautoři: Monika Koudová (GENNET), Zuzana Vilímová (GENNET), Marie Trková (GENNET), Naďa Jenčíková (GENNET), Věra Nedomová (GENNET), Sabina Březinová (GENNET), Jiří Horáček (GENNET), Jana Hodačová (GENNET), Martina Bittoóvá (GENNET), David Steskal (GENNET)

Gravidní pacientka geneticky konzultována v 13. týdnu těhotenství pro riziko chromozomální aberace plodu pozitivní kombinovaný screening I. trimestru (risk T21 1/10, risk T13+T18 1/200, vyšší NT 3,2mm) a UZ zjištěná VVV plodu (drobná omfalokéla). Indikováno invazivní vyšetření - odběr choriových klků (CVS). QF-PCR vyšetření z CVS vyloučilo aneuploidii chromozomů 13,18,21. Metoda array CGH z nekultivované tkáně CVS prokázala trizomii chromozomu 14, ale nebylo možné vyloučit ev. mozaiku. V kultivovaném vzorku CVS byla zjištěna mozaiková forma trizomie chr.14 v kombinaci s Robertsonskou translokací chr. 13 a 14 (mos45,XX,der(13;14)(q10;q10)[22] / 46,XX,der(13;14)(q10;q10), +14[19]/46,XX[6]). Vyšetřením karyotypu páru byla u partnera prokázána balancovaná Robertsonská translokace chr.13 a 14, u pacientky byl normální karyotyp. Kontrolním UZ vyšetřením v 16. týdnu gravidity zjištěny mimo omfalokélu další anomálie plodu - přetrvávající zvýšené prosáknutí šíje, atypická facies (mikromandibula, vysoké čelo) a kratší dlouhé kosti končetin. Vzhledem k riziku uniparentální disomie chr.14, progredujícímu UZ nálezu a k posouzení chromozomální výbavy plodu byl indikován odběr plodové vody. DNA z CVS a DNA z plodové vody spolu s DNA obou rodičů byla vyšetřena metodou QF-PCR pomoci panelu STR markerů které jsou lokalizované na chr.14. DNA profil z CVS odpovídal trizomii chromozomu 14 paternálního původu a DNA profil z plodové vody v oblasti centromery 14q12 vykazoval UPD chromozomu 14 – heterodizomii a v oblasti 14q32 UPD – izodizomii paternálního původu. U plodu tedy došlo ke ztrátě maternálního genomu chromozomu 14, což je označováno jako trisomic rescue. Dva typy UPD a heterodizomie v pericentromerickém regionu chromozomu spolu s prokázanou mozaikou svědčí pro chybu v I. meiotickém dělení (publ. Yamazawa K et. all., 2010). Imprinting paternálního původu v oblasti 14q32 je popsán jako Kagami-Ogata syndrom, UPD(14)pat (OMIM608149), který je spojen se závažným postižením plodu, včetně vad odpovídajících UZ nálezům v našem případě. Karyotyp plodu byl na základě vyšetření kultivovaných buněk z AMC 45,XX,der(13;14)(q10;q10)pat.

41

POSTERY


Po závěrečné genetické konzultaci se partneři rozhodli pro ukončení gravidity. Vzhledem k riziku nebalancované chromozomální vady či UPD(14) pro další graviditu byla páru doporučena léčba metodami asistované reprodukce (IVF) s provedením preimplantační genetické diagnostiky, ev. invazivní prenatální diagnostika (CVS) při spontánní koncepci. Differentially expressed miRNAs in trisomy-21 placenta Differentially expressed miRNAs in trisomy-21 placenta Iveta Svobodová Spoluautoři: Iveta Svobodová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Marie Korabečná (Ústav biologie a lékařské genetiky Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Pavel Calda (Gynekologickoporodnická klinika 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Miroslav Břešťák (Gynekologickoporodnická klinika 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Eva Pazourková (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Šárka Pospíšilová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Miroslava Krkavcová (GENvia, Praha), Michaela Novotná (Gynekologicko-porodnická klinika 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze), Aleš Hořínek (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. lékařské fakulty Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze.

Background: The Down syndrome (DS) etiology is still unknown. However, all data suggest that the mechanism is more complex than previously supposed. Epigenetic mechanisms, including miRNAs gene expression regulation, are one of potential influencing factors. The aim of this study was to compare miRNAs expressions in placentas with normal and trisomic karyotype and to associate differentially expressed miRNAs with concrete biological pathways. Materials and Methods: In the pilot study, 754 miRNAs were profiled in 30 chorionic villi samples (CVS) - 14 normal and 16 DS, using real-time PCR technology and TaqMan Human miRNA Array Cards A and B. Twelve differently expressed miRNAs between compared groups of samples were validated on 50 independent samples (25 normal and 25 DS) using TaqMan miRNA Assays. The Mann-Whitney test with a cutoff p-value < 0.05 was used for results evaluation. Functional annotation and diseases association of selected miRNAs were performed using several webbased software tools (miRWalk, DAVID, WebGestalt). Results: Seven miRNAs were verified as upregulated in DS placentas; three of these miRNAs are located on chromosome 21 (miR-99a, miR-125b and let-7c). Many 42

essential biological processes, transcriptional regulation or apoptosis, were identified as being potentially influenced by altered miRNA levels. Moreover, miRNAs overexpressed in DS placenta potentially regulates genes involved in placenta development (GJA1, CDH11, EGF, ERVW-1, ERVFRD-1, LEP or INHA). Conclusion: These findings suggest the possible participation of miRNAs in Down syndrome impaired placentation and connected pregnancy pathologies. Supported by the Ministry of Health of the Czech Republic RVO VFN64165. NON-INVASIVE PRENATAL TESTING FOR FETAL ANEUPLODIES: A REPORT OF THREE ATYPICAL CASES Karolína Horáková (Gennet, s.r.o., Kostelní 9, Praha 7) Spoluautoři: Ivona Marešová, Jana Vávrová, Filip Zembol, Věra Krutílková, Marie Trková), Martin Hynek (), David Stejskal (), Martina Bittóová (), Monika Koudová ()

We are presenting three cases of false negative or inconclusive results s of non-invasive prenatal testing (NIPT). The first case was a mother with the negative first trimester screening result for trisomy 21 (1/1800) and low risk of trisomy 21, 18 and 13 assessed by NIPT. However, a fetus with Down syndrome was born. The mother’s karyotype showed 10% gonosomal mosaic of chromosome X. Her partner’s chromosome 21 specific FISH revealed an inclination to nondisjunction of chromosome 21 (21 monosomy /trisomy clones). False negative NIPT result was probably due to low fetal fraction or placental mosaicism. The second case was a mother with positive first trimester screening result for trisomy 21 (1/70). The NIPT result showed an increased risk of trisomy of chromosome X. Surprisingly, amniocentesis revealed trisomy of chromosome 18. The pregnancy was terminated and cytogenetic examination of the placenta detected various representations of cell lines with trisomies of chromosomes 18 and X, with a predominance of the line XXX. NIPT method did not reveal trisomy of chromosome 18, most likely due to placental mosaicism with a predominance of the line XXX. The third case was a mother with positive first trimester screening result for trisomy 21 (1/20). CVS proved de novo translocation of trisomy 21. Follow-up NIPT performed as a part of validation NIPT study showed a borderline risk of trisomy 21 most likely due to loss of part of 21 genome during translocation event.

POSTERY


The aim of these case study is to present biological limits of NIPT which should be taken into consideration. The most frequently occuring NIPT limits include low fetal fraction, higher body weight, placental mosaicism, and rare chromosomal aberrations.

VIII. - Jiné TELOMERIC SEQUENCES IN CELL-FREE DNA ARE MORE ABUNDANT IN PLASMA THAN IN SERUM SAMPLES IN HEALTHY VOLUNTEERS Telomeric sequences in cell-free DNA are more abundant in plasma than in serum samples in healthy volunteers Alžběta Zinková (1. LF UK v Praze) Spoluautoři: Alexander Svačina (1. LF UK v Praze), Aleš Hořínek (1. LF UK v Praze), Eva Pazourková (1. LF UK v Praze), Marie Korabečná (1. LF UK v Praze)

Introduction: Telomere lengths in leucocytes and plasma samples are analysed with regard to their correlations with various pathological states. Circulating cell-free DNA (cfDNA) represents a biomarker of growing interest in numerous fields of medicine, especially in prenatal diagnosis and oncology. We studied the variations in relative telomere lengths in plasma and serum in young healthy volunteers with regard to clinical utility of both types of samples. Materials and Methods: We performed quantitative realtime PCR (qPCR) to determine relative telomere lengths (telomere/single copy gene - T/S ratio) in plasma and serum of 36 healthy volunteers aged 20-25 years. The DNA was extracted by QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit. Results: We found significant differences in the relative T/S ratios between paired plasma and serum samples. These ratios were significantly higher in plasma samples (Wilcoxon test, p< 0.0001) than in serum samples. Each sample was rendered by relative telomere length of a control sample. The total amount of cfDNA measured using qPCR on single copy gene was significantly higher in serum in comparison with plasma (p< 0.0001). Conclusions: We detected higher abundance of telomeric sequences in plasma than in serum but higher levels of total cfDNA in serum samples. Our results suggest the existence of different mechanisms involved in cfDNA release and clearance in plasma and serum. Supported by the grants no. RVO-VFN 64165 of the Ministry of Health of the Czech Republic and by no. PRVOUK P25/ LF1/2 of the Ministry of Education, Youth and Sport of the Czech Republic.

43

POSTERY


DNA ANALÝZA EXTRAHUMÁNNÍHO GENOMU – DERMATOMYKÓZY, PROBLÉM DNEŠKA Libor Staněk (Laboratoř molekulární diagnostiky, synlab czech, Praha, CZ) Spoluautoři: Pavel Horák (PentaGen s.r.o.; Kladno), Radka Mihlova (Laboratoř molekulární diagnostiky, synlab czech, Praha, CZ), Adriana Šprincová (Laboratórium klinickej mikrobiológie; synlab slovakia; Košice, SK), Jozef Mačák (Laboratórium klinickej mikrobiológie; synlab slovakia; Košice, SK), Jiří Čížek (PentaGen s.r.o; Kladno), Marcel Hasch (Laboratoř molekulární diagnostiky, synlab czech, Praha, CZ)

Povrchové mykózy kůže (dermatomykózy) jsou obecně velmi rozšířené a s věkem se stupňující. Mnohdy bývají zanedbávané. Ve skutečnosti jde však o záležitost, které by měla být věnována pozornost a která potřebuje léčbu. Léčbě ovšem musí předcházet kvalitní diagnostika. Značným přínosem se jeví DNA diagnostika. Mezi nejčastější projevy patří zarudlá místa na kůži, svědění, šupinatá ložiska a odlupování epidermis, mokvání na nohách a kolem nehtů, lámání nehtů. V rámci našeho pracoviště synlab czech jsme ve spolupráci s firmou PentaGen zavedli nový test Mentype® MycoDermQS Lateral Flow, který je určen pro rychlou a spolehlivou diagnózu nejvýznamnějších dermatomykóz na bázi polymerázové řetězové reakce (PCR) s následnou hybridizací na stripech. Test umožňuje vícestupňovou skupinovou nebo druhovou detekci patogenů podle požadavků klinického pracoviště. Kohorta pacientů zahrnovala různé kožní projevy a analyzované vzorky, např. kožní stěry postiženého místa, seškraby postižené kůže, zrohovatělou kůži, části nehtů či nehtového lůžka. Celkem bylo testováno 10 pacientů, jednalo se o opakované analýzy pro zavedení metody a prokázání její robustnosti. Výsledky byly konfirmovány v laboratoři v Německu a u pozitivních vzorků pro ověření nálezu a metody bylo provedeno sekvenační dourčení (pandetekce hub). Analýzy prokázaly ve dvou případech infekci dermatophyty (TME band) a specificky T. rubrum. Tyto případy byly potvrzeny stejnou metodikou a se shodným výsledkem v laboratořích výrobce (Biotype, Drážďany, Německo). U jednoho z případů se pokračovalo v pandetekci a byl sekvenačním vyšetřením genu pro 18S rRNA identifikován majoritní mikroorganismus Trichophyton rubrum. Klinicky tito pozitivní pacienti vykazovali dlouhodobé potíže nereagující na léčbu. První pacient - muž, obtíže cca 6 měsíců, postižení lokální v oblasti nehtu palce pravé nohy. Druhý pacient – žena, infekce od roku 1993 na pánevních končetinách, obtíže - svědění, masivní olupování epidermis, 44

lámání nehtů léčena Canestenem (krém) - bez objektivního zlepšení, nyní krátce používá Exoderil mast - subjektivně mírné zlepšení. V obou případech bude díky DNA diagnostice možnost nasazení adekvátní léčby. Závěrem lze říci, že se tato metoda DNA diagnostiky jeví jako velice přínosná pro laboratorní praxi a hlavně pro následnou klinickou léčbu. Při řádném zavedení testu a důsledného dodržování uživatelské příručky je test dostatečně robustní pro běžné užití v diagnostických laboratořích. TRANSKRIPTOMICKÉ PROFILOVÁNÍ TRANSPLANTOVANÝCH JATERNÍCH ŠTĚPŮ VE VZTAHU K ROZVOJI NEALKOHOLICKÉ JATERNÍ STEATÓZY Transcriptomic profiling of transplanted liver grafts in relation to non-alcoholic fatty liver disease Lucie Šedová (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN) Spoluautoři: Blanka Chylíková (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN), Irena Hejlová (Institut klinické a experimentální medicíny), Monika Dezortová (Institut klinické a experimentální medicíny), Milan Hájek (Institut klinické a experimentální medicíny), Monika Cahová (Institut klinické a experimentální medicíny), Ondřej Šeda (Ústav biologie a lékařské genetiky 1. LF UK a VFN), Pavel Trunečka (Institut klinické a experimentální medicíny)

Nealkoholická jaterní steatóza (NAFLD) souvisí se zvýšeným rizikem kardiovaskulárních chorob a vyšší celkovou mortalitou. U pacientů po transplantaci jater je prevalence NAFLD/NASH (steatohepatitida) ve srovnání s běžnou populací významně vyšší. Naším cílem bylo porovnat transkriptomické profily ve štěpu u příjemců bez a s NAFLD. Celková RNA byla izolována z biopticky získané tkáně štěpu jater u 47 příjemců transplantátu, z toho 24 mužů a 23 žen. Kvalita a integrita vyizolované RNA byla ověřena pomocí Agilent 2100 Bioanalyzer system a následně zpracována pomocí technologie microarray na přístroji Affymetrix GeneAtlas s použitím čipů Affymetrix® HuGene2.1ST Array Strip. Data byla analyzována v programu Partek Genomic Suite 6.6 a následně IPA (Ingenuity Pathway Analysis) sadou standardizovaných metod včetně hierarchického shlukování, analýzy hlavních komponent, genové ontologie, analýzy „upstream“ regulátorů a analýzy mechanistických a kauzálních sítí. Po korekci na mnohonásobné porovnávání FDR 0,05 jsme identifikovali 583 transkripty signifikantně odlišně exprimovaných u steatotických vzorků, které byly dále použity pro analýzy IPA. Mezi kategorie onemocnění nejvíce obohacené transkripty patřila rakovina, z kategorie buněčných funkcí byl nejvíce obohacen buněčný růst a proliferace. Analýzou sítí jsme identifikovali moduly odlišující steatotické vzorky od kontrol. V těchto modulech prominovaly mj. tyto geny: telomerase reverse transcriptase

POSTERY


(TERT), angiotensin II associated protein (AGTRAP) acetylCoA acyltransferase 2 ( ACAA2), cytochrome P450 family 7 (CYP7B1).

uváděných 20 – 30 %. V populaci zdravých jedinců byly rizikové haplotypy zastoupeny v poměru: DQ2.5cis přítomen u 51,2 %, DQ8 u 41% a DQ2.5trans u 7,8 % vyšetřovaných.

Výsledky této iniciální analýzy budou průběžně doplňovány. Identifikace specifické transkriptomické signatury pro NAFLD/NASH může být relevantní pro další predikci rozvoje onemocnění nejenom u transplantovaných pacientů, ale i v běžné populaci.

Pacienti s příznaky typickými pro klasickou nebo subklinickou celiakii byli nejčastěji odesláni ke genetickému vyšetření lékaři z oboru gastroenterologie, hematologie, pediatrie a alergologie/ imunologie (celkem 90,6% pacientů). U těchto pacientů byl záchyt rizikových haplotypů u 50,3 % osob. Zastoupení jednotlivých rizikových haplotypů v této skupině pacientů bylo téměř totožné s populací zdravých jedinců: DQ2.5cis byl přítomen u 54,1 %, DQ8.1 u 37,9 % a DQ2.5trans u 8,0 % vyšetřovaných.

Podpořeno grantem AZV ČR 15-26906A. SROVNÁNÍ VÝSKYTU RIZIKOVÝCH HAPLOTYPŮ PRO CELIAKII U ZDRAVÝCH JEDINCŮ A U PACIENTŮ S PŘÍZNAKY CELIAKIE V ČESKÉ POPULACI Monika Blašková (GHC GENETICS) Spoluautoři: Vlčková Z., Indráková V., Slepičková I., Šplíchalová P.

Úvod: Celiakie (gluténová enteropatie) je autoimunitní zánětlivé postižení sliznice tenkého střeva, které vzniká na podkladě intolerance gliadinové frakce glutenu u geneticky disponovaných osob. Mezi hlavní genetické faktory asociované se vznikem celiakie patří molekuly HLA alel II. třídy: DQA1*0501-DQB1*0201 v pozici cis (haplotyp DQ2.5cis), DQA1*0505-DQB1*0301/ DQA1*0201DQB1*0202 v pozici trans (haplotyp DQ2.5trans) a DQA1*0301-DQB1*0302 v pozici cis (haplotyp DQ8.1). Cílem naší studie bylo zjistit výskyt těchto rizikových haplotypů u zdravých jedinců v české populaci a porovnat ho s výskytem rizikových haplotypů u pacientů, jejichž zdravotní obtíže spadají do obrazu klasické nebo subklinické celiakie. Metodika: Celkem bylo vyšetřeno 216 zdravých osob (101 mužů, 115 žen) české populace a 727 pacientů se suspektní celiakii odeslaných ze specializovaných pracovišť (261 mužů a 466 žen). Izolace DNA ze stěru sliznice dutiny ústní nebo odběru nesrážlivé žilní krve byla provedena přístrojem MagCore HF16. Vyšetření rizikových alel/ haplotypů bylo provedeno metodou reverzní hybridizace pomocí certifikované soupravy Celiastrip (f. Operon) dle originálního protokolu. Výsledky: Genetická dispozice pro celiakii – haplotypy DQ2.5cis, DQ2.5trans a DQ8.1 byla celkem prokázána u 36,1 % zdravých jedinců české populace. V populaci pacientů se zdravotními obtížemi byly rizikové haplotypy prokázány v 50,3 %. Závěr: Celkový výskyt rizikových haplotypů ve zdravé české populaci je trochu vyšší než v dostupné literatuře 45

ABSTRAKTA. XX. celostátní konference DNA diagnostiky Dolní Morava

Recommend Documents