Studi Terapi Vitamin E pada Tikus (Rattus norvegicus) Fibrosis Ginjal terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) dan Histopatologi Glomerulus Ginjal The Study of Vitamin E Therapy on Renal Fibrosis Rats (Rattus norvegicus) toward Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) Expression and Renal Glomerulus Histopathology Very Iqbal Mathlubi, Aulanni’am, Dyah Kinasih Wuragil Program Studi Kedokteran Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
[email protected] ABSTRAK Fibrosis ginjal merupakan akumulasi abnormal extracellular matrix (ECM) pada jaringan ginjal yang dapat merubah struktur ginjal normal. Fibrosis ginjal adalah manifestasi akhir dari Chronic Kidney Disease (CKD). Vitamin E merupakan antioksidan yang berperan merusak rantai radikal bebas yang merupakan inisiator terjadinya fibrosis ginjal sehingga berpotensi untuk dijadikan bahan terapi. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi vitamin E sebagai terapi fibrosis ginjal pada hewan model tikus berdasarkan ekspresi iNOS dan gambaran histopatologi ginjal. Tikus model fibrosis ginjal disiapkan dengan injeksi Streptokinase secara intravena pada vena coccygea dengan dosis 6000IU/ekor tikus, streptokinase diinduksikan sebanyak tiga kali dengan rentang waktu lima hari. Hewan coba dibagi menjadi 5 kelompok perlakuan, yaitu kelompok kontrol, kelompok fibrosis ginjal, kelompok fibrosis ginjal yang telah diterapi vitamin E dosis 200 mg/Kg BB, 300 mg/Kg BB, dan 400 mg/Kg BB. Ekspresi iNOS dihitung menggunakan software Axiovision dan dianalisis dengan ANOVA. Pengamatan gambaran histopatologi glomerulus ginjal menggunakan mikroskop dan dianalisis deskriptif. Hasil penelitian menunjukan pemberian vitamin E mampu menurunkan ekspresi iNOS secara signifikan (P<0,05) dan memperbaiki gambaran histopatologi glomerulus ginjal yang ditandai dengan perbaikan capsula bowman, dan tidak adanya hemorraghi pada glomerulus dan glumerulosclerosis. Dosis 400 mg/Kg BB adalah dosis vitamin E terbaik untuk terapi fibrosis ginjal. Kesimpulan dari penelitian ini adalah pemberian vitamin E dapat digunakan sebagai terapi pada tikus model fibrosis ginjal berdasarkan ekspresi iNOS dan gambaran histopatologi glomerulus ginjal.
Kata kunci : Vitamin E, Fibrosis ginjal, INOS dan Glomerulus
ABSTRACT Renal fibrosis is characterized by the abnormal accumulation of extracellular matrix (ECM) that affected normal kidney structures. Vitamin E is an antioxidant that plays role to damage free radical chain which the initiator of renal fibrosis. The purpose of this research was to study the potential of vitamin E affect to iNOS expression and renal glomerulus histopathology appearance on renal fibrosis rats. Renal fibrosis rats were prepared by intravenously injection of streptokinase with dose of 6000 IU, it was induced three times with five days interval. Animal models were divided into Five groups was control group, renal 1
fibrosis group, and three groups with therapy of vitamin E dose of 200 mg/Kg BW, 300 mg/Kg BW, and 400 mg/Kg BW. INOS expressions were determined by axiovision software and were analyzed by ANOVA. Histophatological observations of renal glomerulus were observed microscopicaly and were analyzed descriptively. The result showed that vitamin E therapy significantly (P<0.05) could decrease iNOS expressions. Moreover it also repaired renal glomerulus damage in renal fibrosis rats were marked by repairing of capsula bowman and absence of glumerulosclerosis and hemorrahagi on tubulus. The dose of 400 mg/Kg BW was the effective vitamin E dose for renal fibrosis therapy. It can be concluded that vitamin E have possibility as therapy on renal fibrosis rats models based on iNOS expressions and renal glomerulus histopathology. Keywords : Vitamin E, Renal fibrosis, INOS and Glomerulus
PENDAHULUAN Fibrosis ginjal merupakan akumulasi abnormal extracellular matrix (ECM) pada jaringan ginjal yang dapat mengubah struktur ginjal normal (Chatziantoniou and Dussaule, 2005). Fibrosis ginjal adalah manifestasi akhir dari Chronic kidney Disease (CKD) dan menandakan proses terjadinya gagal ginjal. Berdasarkan penelitian yang dilakukan Banfield Pet Hospital AS kematian akibat CKD cukup tingi, lebih dari 600 kucing dewasa mati atau dieuthanasi karena CKD selama periode 22 tahun terakhir (Lefebvre, 2011). Streptokinase merupakan agen trombolitik yang bekerja sebagai aktivator ginjal. Sel-sel yang teraktivasi karena proses inflamasi akan menyebabkan terbentuknya reactive oxygen species (ROS) dan reactive nitrogen species (RNS) yang merupakan respon terhadap berbagai rangsangan (Caramori and Papi, 2004). Terbentuknya ROS dan RNS dipengaruhi oleh aktifitas fagositosis dari makrofag. Nitric oxide (NO) merupakan salah satu produk ROS yang pembentukannya dikatalis oleh inducible nitric oxide synthase (iNOS), INOS akan mengalami peningkatan produksi dan regulasi saat terjadi inflamasi. Vitamin E (α-tokoferol) merupakan antioksidan yang dapat menurunkan daya rusak radikal bebas. Vitamin E telah banyak digunakan dalam industri makanan baik dalam bentuk alami maupun sintetis. Selain sebagai antioksidan vitamin E juga dapat berfungsi sebagai
plasminogen dan dapat menginduksi terjadinya fibrinolysis. Mekanisme tersebut menyebabkan deposisi protein ECM yang menginduksi keberadaan fibroblas dan myofibroblas pada selsel ginjal, sehingga terbentuk jaringan fibrosa pada ginjal (Pardede, 2009). Fibrosis ginjal akan mengakibatkan penebalan lumen glomerulus yang menyebabkan terjadinya glumerulosklerosis (Cho, 2010). Hal tersebut diikuti proses terjadinya cedera jaringan parenkim ginjal dan hilangnya fungsi tubulus dan glomerulus ginjal (Fogo, 2012). Inflamasi memainkan peran penting dalam proses inisiasi fibrosis antiinflamasi. Vitamin E berperan melindungi struktur sel yang penting terutama membran sel dari kerusakan akibat oksidasi radikal bebas (ROS), dimana dalam membran sel terdapat polyunsaturated fatty acid (PUFA) (Youngson, 2005). Menurut penelitian yang telah dilakukan, pemberian vitamin E mampu menurunkan stress oksidatif dan tingkat sirkulasi Asymmetric dimethylarginine (ADMA) pada penderita CKD (Saran, 2002). Berdasarkan hal tersebut dimungkinkan vitamin E dapat digunakan sebagai terapi fibrosis ginjal. Pada Penelitian ini dilakukan pengamatan terhadap Pengaruh vitamin E sebagai terapi fibrosis ginjal pada hewan model Tikus yang diinduksi Streptokinase berdasarkan ekspresi inducible nitric oxide
2
Vitamin E yang digunakan adalah αtokoferol (Sigma), pemberian dilakukan dengan cara disonde dengan dosis terapi I 200 mg/Kg BB, terapi II 300 mg/Kg BB, terapi III 400 mg/Kg BB ( Herawati et al., 2012). Terapi vitamin E dilakukan pada hari ke-12 dan diberikan selama 11 kali dengan rentang waktu 1 hari dengan sonde lambung ( Herawati, 2012).
synthase (iNOS) dan gambaran histopatologi glomerulus ginjal. MATERI DAN METODE Persiapan Hewan Coba Tikus dilakukan adaptasi terhadap lingkungan laboratorium selama tujuh hari dengan pemberian makanan berupa ransum basal. Komposisi ransum basal disusun berdasarkan standar Association of Analytical Communities (AOAC) (2005) yaitu mengandung karbohidrat, protein 10%, lemak 3%, mineral, vitamin, dan air 12%.
Pengambilan Organ Ginjal Pembedahan pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus) dilakukan pada hari ke - 33 setelah seluruh terapi dilakukan. Langkah awal adalah mendislokasi hewan coba pada bagian leher kemudian dilakukan pembedahan. Tikus diletakkan pada posisi rebah ventral. Pembedahan dilakukan dengan membuka bagian abdomen (Linea alba), kemudian dilakukan pengambilan dan isolasi pada semua organ terutama ginjal. Organ ginjal pertama-tama dibilas dengan NaCl-fisiologis 0,9%. Kemudian ginjal dimasukkan dalam larutan formaldehyde (PFA) 10% untuk pembuatan preparat.
Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) Universitas Gadjah Mada Yogyakarta dengan umur 10 minggu dan berat badan antara 120 - 170 gram. Penggunaan hewan coba dalam penelitian ini telah mendapatkan sertifikat laik etik dari komisi etik penelitian Universitas Brawijaya No: 254-KEP-UB.
Pengamatan Ekspresi iNOS dengan metode Imunohistokimia
Preparasi Injeksi Streptokinase Streptokinase yang dipergunakan dalam penelitian ini berupa streptase dengan sediaan 1.500.000 IU yang dilarutkan dengan ringer laktat sebanyak 2 ml lalu dihomogenkan. Setelah itu ditempatkan pada tabung stock I. Selanjutnya, diambil 1ml pada Stock I dan dilarutkan pada ringer laktat 5 ml dengan kandungan 750.000 IU dan diletakkan pada tabung Stock II. Selanjutnya dari tabung stock II diambil 1ml untuk dijadikan stock III dengan kandungan 150.000 IU. Dosis Injeksi setiap tikus adalah 6000 IU, larutan sebanyak 40 μL diambil dari stok 3 dan dilarutkan kembali dengan ringer laktat sehingga menjadi 100 μL. Hewan cba pada kelompok perlakuan B,C,D,E diinduksi streptokinase dengan dosis 6000 IU sebanyak 100 μL pada hari pertama , keenam dan kesebelas secara intravena pada vena coccygea.
Preparat ginjal direndam kedalam xylol I, xylol II, etanol bertingkat (100%, 90%, 80%, 70%), dan aquadest secara berurutan dimana masing-masing direndam selama 5 menit, kemudian dicuci dalam PBS selama 3x 5 menit selanjutnya Ditetesi H2O2 3% selama 20 menit, dicuci dengan PBS selama 3x 5 menit dan direndam dalam 5% BSA dalam PBS selama 30 menit dan dicuci dalam PBS selama 3x 5 menit. Preparat kemudian direaksikan dengan antibodi primer (Anti rat iNOS) selama 24 jam dengan suhu 4°C dan dilakukan pencucian kembali dengan PBS pH 7,4 selama 3x 5 menit. Berikutnya direaksikan dengan antibodi sekunder berlabel biotin (Anti Rabbit IgG biotin labeled) selama 1 jam dengan suhu ruang. Dicuci kembali dengan PBS selama 3x 5 menit. Ditambahkan SA-HRP selama 40 menit dan dicuci dengan PBS 3x 5menit. Substrat DAB
Preparasi dan Terapi Vitamin E 3
ditambahkan dan inkubasi selama 10 menit lalu dicuci dengan PBS 3x 5menit. Counterstain dilakukan dengan Hematoxylen selama 5 menit pada suhu ruang, lalu dicuci dengan air, dikering anginkan dan terakhir mounting dengan entellan dan pengamatan dilakukan dengan mikroskop perbesaran 400x. Hasil pengamatan kemudian difoto pada 5 lapang pandang. Hasil foto dari mikroskop kemudian diproses menggunakan sotware axiovision untuk mengamati perubahan ekspresi iNOS yang ditandai dengan perubahan persentasi luas daerah yang terwarnai ( Duerr, 2006). Pengamatan Gambaran Histopatologi Glomerulus Ginjal Pengamatan gambaran histopatologi glomerulus ginjal dilakukan dengan pewarnaan hematoksilin eosin (HE) dan diamati secara
kualitatif menggunakan mikroskop Olympus BX51 perbesaran 400x . HASIL DAN PEMBAHASAN Pengaruh Vitamin E Terhadap Ekspresi Inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) pada Glomerulus Tikus (Rattus norvegicus) Model Fibrosis Ginjal Hasil Induksi Streptokinase Ekspresi iNOS pada hewan model tikus (Rattus norvegicus) model fibrosis ginjal pada penelitian ini ditunjukan pada Gambar 1.
C
B
A
E
D
Gambar 1. Ekspresi iNOS pada glomerulus hewan model tikus fibrosis ginjal dan telah diterapi vitamin E (perbesaran 400x) Keterangan: gambar panah ( ) menunjukan ekspresi iNOS. A= tikus kontrol (sehat), B= tikus fibrosis ginjal (induksi streptokinase), C= tikus terapi 200 mg/kg BB ,D= tikus terapi 300 mg/kg BB, E= tikus terapi 400 mg/kg BB.
Ekspresi iNOS pada glomerulus ginjal (Gambar 1) diamati menggunakan metode imunohistokimia (IHK) yang ditunjukan dengan
area berwarna kecoklatan pada irisan jaringan. Menurut Duerr (2006) antibodi primer berikatan dengan antigen pada jaringan dan antibodi 4
sekunder berlabel biotin. Pemberian antibodi sekunder diikuti penambahan StreptavidinHorseradish Peroxidase (SA-HRP) dan substratnya berupa Diaminobenzidine (DAB). Diaminobenzidine (DAB) merupakan substrat dari peroksidase yang menghasilkan warna kecoklatan pada jaringan.
terapi 200 mg/Kg BB (C) menunjukan ekspresi iNOS yang lebih sedikit daripada kelompok tikus fibrosis ginjal. Kelompok tikus fibrosis yang diterapi vitamin E dosis 300 mg/Kg BB (D) menunjukan ekspresi iNOS yang lebih sedikit daripada kelompok tikus terapi 200 mg/Kg BB. Kelompok tikus fibrosis yang diterapi vitamin E dosis 400 mg/Kg BB (E) menunjukan ekspresi iNOS yang lebih sedikit daripada kelompok tikus 300 mg/Kg BB. Ekspresi iNOS pada kelompok tikus fibrosis yang diterapi vitamin E dosis 400 mg/Kg BB mendekati kelompok tikus kontrol. Hal ini didukung dengan analisis menggunakan program Axiovision yang ditunjukkan pada Tabel 1.
Ekspresi iNOS (Gambar 1) diamati pada bagian glomerulus dan ditunjukan dengan tanda panah berwarna merah ( ). Kelompok tikus Kontrol (A) menunjukan ekspresi iNOS yang sedikit. Kelompok tikus fibrosis ginjal (B) menunjukan ekspresi iNOS yang paling banyak diantara kelompok perlakuan. Kelompok tikus
Tabel 1. Rata-rata ekspresi iNOS pada glomerulus tikus kontrol, tikus yang diinduksi streptokinase dan tikus yang diterapi menggunakan vitamin E. Perlakuan
Rata-rata Ekspresi INOS
Ekspresi INOS (%) Peningkatan
Penurunan
(A)
Kontrol (Sehat)
0,77 ± 0,05a
-
-
(B)
Fibrosis ginjal (Sakit)
3,24 ± 0,17d
320,77
-
(C)
Terapi 1 (200 mg/kg)
2,40 ± 0,13c
-
25,92
(D)
Terapi 2 (300 mg/kg)
1,84 ± 0,10b
-
43,20
(E)
Terapi 3 (400 mg/kg)
1,01 ± 0,11a
-
68,82
Keterangan : perbedaan notasi a,b,c,d menunujukan adanya perbedaaan yang signifikan (p<0,05) antara kelompok perlakuan.
Hasil analisis statistika menunjukan bahwa terdapat perbedaan yang signifikan (P<0,05) antar perlakuan, yang ditunjukan dengan notasi yang berbeda. Kelompok tikus terapi vitamin E 400 mg/Kg BB tidak menunjukan perbedaan yang nyata dengan kelompok Tikus kontrol, hal tersebut menunjukan bahwa dosis terapi vitmin E 400 mg/Kg BB adalah dosis efektif untuk terapi fibrosis ginjal.
Nilai rata-rata ekspresi iNOS pada kelompok kontrol digunakan sebagai standar untuk mengetahui adanya peningkatan atau penurunan yang terjadi karena pengaruh perlakuan. Menurut Ferrini et al., (2003) pada kondisi normal iNOS yang diaktifkan oleh interferon-gamma (IFN-γ) berperan dalam fagositosis. iNOS mengkatalis pembentukan nitric oxide (NO). Nitric oxide (NO) berperan untuk homeostasis pembuluh dengan 5
menghambat kontraksi otot polos pembuluh darah, agregasi platelet, dan adesi leukosit pada endotel. Nitric oxide (NO) juga dihasilkan oleh fagosit (monosit, makrofag, dan neutrofil) sebagai respon kekebalan tubuh. Ekspresi iNOS kelompok tikus fibrosis ginjal mengalami peningkatan sebesar 320,77 % dan menunjukan perbedaan yang signifikan (P<0,05) terhadap kelompok tikus kontrol. Ekspresi iNOS pada kelompok tikus fibrosis ginjal paling banyak dan merata hampir diseluruh bagian glomerulus. Peningkatan ekspresi iNOS dikarenakan induksi streptokinase pada hewan coba, sehingga menyebabkan kompleks aktivator mengkatalis perubahan plasminogen bebas menjadi plasmin, kemudian plasmin akan mengaktivasi komplemen. Aktivasi komplemen mengakibatkan pengendapan kompleks antigen-antibodi dalam glomerulus. Hal tersebut menyebabkan inflamasi dan kerusakan sel epitel pada glomerulus sehingga produksi makrofag akan mengalami peningkatan (Pardede, 2009). Aktivasi makrofag akan menginduksi radikal bebas seperti peningkatan NO (Velkeen et al.,2000). Menurut Forbes et al., (2008) Makrofag mengaktifkan iNOS untuk mengkatalis produksi Nitric oxide (NO) untuk meningkatkan fagositosis terhadap patogen intrasel melalui jalur reactife nitrogen intermediet (RNI). Peningkatan jumlah NO berbanding lurus dengan peningkatan ekspresi iNOS. NO merupakan radikal bebas, peningkatan jumlah NO yang berlebihan akan menyebabkan sres oksidatif yang mengakibatkan terjadinya peroksidasi lipid (Hancock et al., 2003). Peroksidasi lipid menyebabkan respon inflamasi pada jaringan ginjal dan mengakibatkan penumpukan ECM yang merupakan ciri-ciri terjadinya fibrosis ginjal (Liu, 2006). Kelompok tikus yang mendapat terapi vitamin E dosis 200 mg/Kg BB, 300 mg/Kg BB dan 400 mg/Kg BB secara signifikan (P<0,05) menunjukan penurunan ekspresi iNOS secara berturut-turut sebesar 25,92 %, 43,20 % dan 68,82 %. Ekspresi iNOS pada kelompok tikus
terapi 400 mg/Kg BB menunjukan perbedaan yang tidak signifikan (P>0,05) terhadap kelompok tikus kontrol, hal ini menunjukan bahwa dosis terapi 400 mg/Kg BB adalah dosis optimum dan efektif untuk terapi fibrosis ginjal. Hal tersebut menunjukan bahwa pemberian vitamin E sebagai antioksidan eksogen dapat menurunkan ekspresi iNOS (mendekati kelompok tikus kontrol) pada tikus (Rattus norvegicus) model fibrosis ginjal. Inducible nitric oxide synthase (INOS) merupakan katalisator produksi NO oleh makrofag yang membantu proses fagosistosis, jumlah NO yang meningkat menyebabkan terjadinya sres oksidatif pada jaringan (Forbes et al., 2008). Pemberian antioksidan yaitu vitamin E terbukti mampu menurunkan ekspresi iNOS. Vitamin E sebagai antioksidan berperan dalam tubuh untuk menetralisir radikal bebas dalam tubuh dengan cara memberikan satu elektronnya sehingga terbentuk molekul yang stabil dan mengakhiri reaksi radikal bebas ( Bucioli et al., 2011). Antioksidan tidak hanya penting untuk menghalangi terjadinya stres oksidatif dan kerusakan jaringan, tetapi juga penting dalam mencegah peningkatan produksi sitokin proinflamasi. Hal tersebut akan menyeimbangkan jumlah radikal bebas (NO) dan antioksidan sehingga sres oksidatif akan terhenti sehingga respon inflamasi pada jaringan yang diakibatkan peroksidasi lipid tidak akan terjadi (Youngson, 2005). Penurunan jumlah NO akan berbanding lurus dengan ekspresi iNOS (Velkeen et al., 2000). Pengaruh Vitamin E terhadap Gambaran Histopatologi Glomerulus Ginjal pada Hewan Tikus (Rattus norvegicus) Model Fibrosis Ginjal Hasil Induksi Streptokinase Gambaran histopatologi menunjukan tingkat keberhasilan suatu terapi. Glomerulus bersama kapsula bowman berada pada korpus malpighi. Sel epitel selapis merupakan salah satu penyusun dari glomerulus dan lapisan parietal kapsula bowman. Keadaan normal sel epitel intinya akan terlihat jelas dan kompak. 6
Gambaran Histopatologi glomerulus ginjal yang diinduksi streptokinase dan telah diterapi vitamin E, dan diamati menggunakan teknik pewarnaan
hematoxylen eosin (HE) dapat dilihat pada Gambar 2 berikut :
B
A
C
E
D
Gambar 2. Gambaran histopatologi pada glomerulus hewan model tikus fibrosis ginjal dan telah diterapi vitamin E (perbesaran 400x, pewarnaan HE). Keterangan: Kelompok A= tikus kontrol (sehat), B= tikus sakit ,C= terapi 200 mg/kg,D= terapi 300 mg/kg, D= terapi 400 mg/kg. ( ) menunjukan glomerulus, ( ) menandakan kerusakan capsula bowman, ( ) menunjukan adanya hemorraghi, ( ) menandakan adanya glumerulosclerosis.
Gambar 2 menunjukan adanya perbedaan Gambaran Histopatologi glomerulus ginjal pada setiap kelompok perlakuan. Kelompok tikus sehat (A) menunjukan gambaran normal. Menurut Dellman and Eurel (2006) sel epitel selapis merupakan salah satu penyusun glomerulus dan lapisan parietal kapsula bowman. Menurut Noer (2010) berdasarkan histologi glomerulus (bersama capsula bowman) terletak di korpus malpighi, glomerulus pada keadaan normal merupakan kapiler-kapiler khusus yang berfungsi sebagai penyaring. Kapiler glomerulus dibatasi oleh sel-sel endotel, mempunyai sitoplasma yang sangat tipis, yang mengandung banyak lubang disebut fenestra. Membran basal glomerulus membentuk suatu lapisan yang berkesinambungan, antara sel endotel dengan
mesangial pada satu sisi dan sel epitel disisi lain. Membran tersebut mempunyai 3 lapisan yaitu Lamina densa yang padat (ditengah), Lamina rara interna yang terletak diantara lamina densa dan sel endotel, Lamina rara eksterna yang terletak diantara lamina densa dan sel epitel. Selsel epitel kapsula bowman viseral menutupi kapiler dan membentuk tonjolan sitoplasma foot process yang berhubungan dengan lamina rara eksterna, diantara tonjolan-tonjolan tersebut adalah celah-celah filtrasi yang disebut silt pore. Mesangium (sel-sel mesangial dan matrik) terletak diantara kapiler-kapiler glomerulus dan membentuk bagian medial dinding kapiler. Kelompok tikus sakit (B) menunjukan adanya perubahan patologis yang signifikan apabila dibandingkan kelompok tikus kontrol 7
(A), capsula bowman yang menyelubungi glomerulus mengalami dilatasi, hemorraghi pada glomerulus dan penebalan lumen glomerulus yang disebabkan oleh pembentukan jaringan parut (Glomerulosclerosis). Proses patologis tersebut menunjukan adanya fibrosis ginjal, menurut Eddy (2000) Fibrosis ginjal ditandai dengan adanya Epithelial to Mesenchymal (EMT) sehingga secara histopatologis pada jaringan ginjal sel epitel akan tergantikan dengan sel yang berbentuk pipih dan runcing. Menurut Cho (2010) pada glomerulus akan terjadi infiltrasi sel polimorfonuklear (PMN) dan monosit (makrofag) serta akumulasi ECM sehingga menyebabkan focal sclerosis dan segmental sclerosis, hal tersebut akan menyebabkan terjadi glomerulosclerosis. Hemorraghi disebabkan oleh inflamasi pada glomerulus sehingga membran filtrasi mengalami kerusakan, permeabilitas kapiler akan meningkat dan molekul-molekul besar seperti sel darah merah dapat melewati dinding vaskuler. Permeabilitas kapiler glomerulus yang meningkat akan menyebabkan capsula bowman mengalami dilatasi. Kelompok tikus C (terapi vitamin E 200 mg/kg BB) menunjukan perbaikan gambaran dilatasi capsula bowman berkurang, tetapi masih ditemukan adanya hemorraghi pada glomerulus. Kelompok tikus D (terapi vitamin E 300 mg/Kg BB) hanya ditemukan adanya hemorraghi pada glomerulus, sedangkan kelompok tikus E (terapi vitamin E 400 mg/Kg BB) glomerulus normal dan menunjukan perbaikan gambaran histopatologi yang terbaik dan mendekati kelompok tikus A (kontrol). Hal tersebut menunjukan bahwa peningkatan dosis terapi vitamin E menunjukan adanya perbaikan gambaran histopatologis glomerulus ginjal yang bertingkat. Terapi vitamin E dengan dosis 400 mg/Kg BB (E) memberikan perbaikan gambaran histopatologi yang signifikan dan mendekati kelompok tikus kontrol (A). Streptokinase yang digunakan untuk induksi hewan model yang dikenal juga sebagai fibrinolisin adalah spreading factor, berperan
dalam penyebaran kuman pada jaringan yang mengubah plasminogen menjadi plasmin, dimana plasmin akan mengaktivasi komplemen, Aktivasi komplemen mengakibatkan pengendapan kompleks antigen-antibodi dalam glomerulus (Pardede, 2009). Makrofag distimuli oleh sitokin proinflamasi untuk memproduksi nitric oxide (NO). NO adalah suatu modulator endogen dalam proses inflamasi yang menghasilkan inducible nitric oxide synthase (iNOS). Semakin banyak NO yang diproduksi, maka semakin meningkat pula ekspresi iNOS dalam mengkatalis produksi NO. NO bereaksi membentuk peroksinitrit (ONOO-) yang merupakan suatu oksidan yang dapat merusak lipid pada membran (Widiastuti, 2010). NO merupakan radikal bebas, jumlah produksi radikal bebas yang tidak seimbang dengan antioksidan akan menyebabkan stres oksidatif pada jaringan dan memicu terjadinya peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid akan megakibatkan respon inflamasi pada jaringan (Sharma et al.,2003). Wei hua et al., (2008) menyatakan bahwa hasil peroksidasi lipid membran berefek langsung terhadap kerusakan makromolekul penting seperti lipid, protein dan DNA. Klahr and Morrissey (2002) menambahkan bahwa perubahan struktur menyebabkan perubahan fungsi membran jaringan ginjal sehingga terjadi penumpukan ECM yang menandakan terjadinya fibrosis ginjal. Perbaikan jaringan pada glomerulus terkait dengan vitamin E (α-tokoferol) yang terbukti mempunyai aktifitas antioksidan yaitu scavenger dari peroxyl radical yang secara khusus melindungi PUFA didalam membran phospholipid dan plasma lipoprotein. Bentuk paling aktif dari vitamin E yaitu α-tokoferol berperan menghambat aktifitas protein kinase C yang terlibat dalam proses poliferasi dan differensiasi sel (sel otot polos, human platelets, monosit) (Bucioli et al., 2011). Hal tersebut dikarenakan vitamin E akan memutus rantai peroksidasi lipid dengan mendonorkan ion hidrogen dalam reaksi, sehinga peroksidasi lipid dapat diturunkan. Menurut Kathryn dan Robaire 8
(2004) mekanisme tersebut diawali dengan perubahan α-tokoferol radikal menjadi αtokoferol peroksida, dua α-tokoferol radikal berubah menjadi dua α-tokoferol dimmer yang pada akhirnya akan berubah menjadi αtokoquinon, selanjutnya α-tokoquinon akan diregenerasi oleh vitamin C menjadi bentuk yang semula yaitu α-tokoferol. Proses tersebut akan menyeimbangkan jumlah radikal bebas dalam jaringan sehingga stres oksidatif akan terhenti dan aktifitas makrofag akan turun, sehingga penumpukan ECM yang menginisiasi fibrosis ginjal akan terhenti. Vitamin E sebagai anti infamasi menurunkan produksi prostaglandin E2 dan meningkatkan produksi IL-2 dan aktivitas imunostimulator yang berefek menstabilkan biosintesis kolagen untuk proses perbaikan jaringan (Bauman, 2002).
Bucioli, S.A., L.C. De Abreu, V.E. Valenti, C. Leone and H. Vannuchi. 2011. Effect of Vitamin E Supplementation on Renal Nonenzymatic Antioxidant in Young Rats Submitted to Exhaustive Exercise Stress. Journal BMC Complementary Medicine,11:133-138. Caramori, G. and A. Papi. 2004. Oxidants and Asthma. Thorax Vol 59 (2): 170-173. Chatzantinou, C. and J.C. Dussaule. 2005. Insight into Mechanism of Renal Fibrosis : is it Possible to Achieve Agression. American Journal Phisiology,289: F227F234. Cho, M. H. 2010. Renal Fibrosis. Korean Journal of Pediatr. Kyungpok National University School of Medicine Daegu. p.735-740.
KESIMPULAN Pemberian vitamin E dapat menurunkan ekspresi inducible nitric oxide synthase (iNOS) dan memperbaiki histopatologi glomerulus ginjal. Dosis vitamin E terbaik adalah 400 mg/Kg BB.
Duerr, J.S. 2006. Immunohistochemistry. Department of Biological Sciences Ohio University. USA. Eddy, E.A. 2000. A Molecular Basis of Renal Fibrosis. Pediatr Nephro Journal,15:290301.
UCAPAN TERIMAKASIH Terima kasih kepada analis staff laboratorium biokimia dan asisten di jurusan kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Brawijaya Malang yang telah memfasilitasi pelaksanaan penelitian ini.
Ferrini, M.G., E.G. Valente, D. Vernet, A. Qian, J. Rajfer and G. Cadavid. 2003. PDE Larginine and PDE Inhibitors counteract fibrosis in Pyeronie’s Fibrotic Plaque and Related Fibroblast culture. Nitric Oxide. 9: 229-244.
DAFTAR PUSTAKA Fogo, A.B. 2012. Inflamation and Fibrosis: Interaction and Impact on the kidney. Department of Pathology, Microbiology and Immunology Vanderbilt University Medical Center. Nashville.
Alderton, W.K., C.E. Cooper and R.G. Knowles. 2001. Nitric Oxide Synthases: Structure, Fuction and Inhibition. Biochem J,357: 593-615. Bauman, L. and E. Weisberg. 2002. Antioxidants. Mc Graw Hill. New York
Forbes, J. M., M. T. Coughlan and M. E. Cooper. 2008. Oxidative Stress as a Major Culprit in Kidney Disease in Diabetes. 9
diabetesjournals.org vol. 57 no. 6 14461454 doi: 10.2337/db08-0057
Hyperfiltration in Early Diabetic Nephropaty. J Am Soc Nephrol 11: 71-79.
Hancock, J.T., R. Desikin, and S.J. Neil. 2001. Biochemical Transaction. Biochem. Soc. Trans 29:345-350.
Vega, F.N., P. Majano, E. Larranaga, B.J.Miguel, R.R. Rodriguez, R.A. Gonzales, and M. Marazuela. 2008. Inducible Nitric Oxide Synthaze (iNOS) Exspression in Autoimmune Thyroid Disorders (AITD). Journal Endocrinology Rev.I.
Herawati, A., Aulanni’am, S. Prasetyawan. 2012. Peran Terapi d-α tokoferol terhadap kadar glukosa darah dan kadar MDA (Malondialdehid) pada Tikus Diabetes Melitus Tipe 1 Hasil induksi MLD-STZ. Veterinaria Medika, 5: 195-200.
Widiastuti. 2010. Perbedaan Kadar Nitric Oxide dan Derajat Stenosis pada Penderita Penyakit Jantung Koroner dengan dan tanpa Diabetes Melitus. Program Pascasarjana Magister Ilmu Biomedik dan Program Pendidikan Dokter Spesialis Patologi Klinik Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro. Semarang.
Kathryne, M.J. and B. Robaire. 2004. The Effect of Long-term Vitamin E Treatment on Gene Expressions and Oxidative Stress Damage in The Aging Brown Norway Rat Epydidimis. Journal Biology of Reproduction 71: 1088-1095.
Wei-hua, L., H. Zi-qing, N. Hong., T. Fu-tian., H. He-qing., L. Xue-juan., D. Yan-hui., C. Shao-rui., G. Fen-fen., H. Wen-ge., C. Feng-ying and L. Pei-qing. 2008. Berberine ameliorates renal injury in streptozotocin-induced diabetic rats by suppression of both oxidative stress and aldose reductase. Chin Med J 2008;121(8):706-712
Klahr. S., and J. Morrissey. 2002. Obstructive nephropathy and renal fibrosis. American Journal of Physiology Vol. 283 no. F861F87. Lefebvre, S. 2011. Literature Review – Epidemiology of Feline Chronic Kidney Disease. Banfield Applied Research and Knowledge (BARK) Team
Youngson, Robert. 2005. Antioksidan: Manfaat Vitamin E dan C bagi Kesehatan. Arcan. Jakarta.
Pardede, S. O. 2009. Struktur Sel Streptokokus dan Patogenesis Glomerulonefritis Akut Pascastreptokokus. Divisi Nefrologi Departemen Ilmu Kesehatan Anak, Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia. Jakarta. Sharma, A., S. Bansal, and R.K. Nagpal. 2003. Lipid Peroxidation in Bronchial Asthma. Indian Joumal of Pediatrics 70(9) : 715717 Veelken, R., K.F. Hilgers, A. Hartner, A. Hass, K.P. Bohmer and R.B. Sterzel. 2000. Nitric Oxide Synthase Isoform and Glomerular 10
