Pengaruh Induksi DMBA (Dimetylbenz (α) Antrasen) Multiple Low Dose (MLD) Pada Mamae Tikus (Rattus norvegicus) Terhadap Kadar VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) The Effect of DMBA (Dimetylbenz (α) Antrasen) Multiple Low Dose (MLD) Induction at Rat’s (Rattus norvegicus) Mammae on VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) Level Putri Astikasanti, Dyah Ayu Oktavianie A.P, Anna Roosdiana Program Studi Pendidikan Dokter Hewan Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
[email protected] ABSTRAK Kanker mammae merupakan kasus kanker yang banyak terjadi pada hewan betina. Kanker mammae dapat disebabkan karena mutasi gen yang disebabkan zat karsinogenetik. Pembuatan hewan model kanker mammae dapat menggunakan zat karsinogenik 7,12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), karena DMBA dapat menyebabkan kerusakan DNA yang ditandai dengan kesalahan pengkodean gen-gen pengatur pertumbuhan. Gen pengatur pertumbuhan yang rusak menyebabkan pertumbuhan yang tidak terkontrol pada sel-sel dalam tubuh termasuk sel endotel sebagai tempat produksi VEGF yang berperan pada proses angiogenesis. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA terhadap kadar VEGF tikus (Rattus norvegicus). Hewan model yang dipakai pada penelitian ini adalah tikus (Rattus norvegicus) galur Sprague dawley betina umur 10-12 minggu yang dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu kelompok kontrol negatif atau tidak diinduksi DMBA, dan kelompok tikus yang diinduksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan induksi estrogen dengan dosis 20000 IU/KgBB. Induksi DMBA dilakukan setiap 48 jam sekali selama 10x dan pemberian estrogen 2 kali dalam satu minggu. Pengukuran kadar VEGF dalam darah dilakukan sebelum dan sesudah tikus diinduksi DMBA dengan metode ELISA. Analisa data yang digunakan adalah uji T tidak berpasangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa induksi DMBA memberikan pengaruh terhadap peningkatan kadar VEGF sebesar 19x (276.589±16.434) dengan α=0,05. Kesimpulan dari penelitian ini adalah induksi DMBA dapat meningkatkan kadar VEGF tikus. Kata kunci : Kanker mamme, Rattus norvegicus, 7,12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), VEGF ABSTRACT Mammary cancer is cancer that occurs in female animal. Mammary cancer can be caused by gene mutations which caused by carcinogenic substance. Mammary cancer in animal model can made using carcinogenic substances dimetylbenz 7.12 (α) antrasen (DMBA) which can caused DNA damage that is characterized by error encoding regulating growth genes. Growth factor genes which demage can cause uncontrollable growth of cell in the body, including endothelial cells as production place of VEGF has a function on the angiogenesis process.This study was conducted to determine the effect of DMBA induction on the levels of VEGF on the rat (Rattus norvegicus). Animal models used 10-12 weeks old of female rat (Rattus norvegicus) Sprague Dawley strain which were divided into 2 groups: group 1 was a negative control or not induced by DMBA, and the second group was DMBA-induced rat at a dose of 10 mg / kg BW and estrogen induction of 20000 IU / Kg BW. DMBA induction was given 10x every 48 hours and estrogen was given 2 times a week. The levels of VEGF in the blood before and after DMBA induced was measured by ELISA method. Analysis of the data used unpaired t test. The results showed that the induction of DMBA could increased levels of VEGF at 19x (276.58± 16.43)) with α = 0.05. The conclusion of this study was DMBA induction can increase the levels of VEGF in rat. Keyword: 7.12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), Mammary Cancer, Rattus norvegicus, VEGF
PENDAHULUAN Kanker mammae merupakan kanker yang banyak terjadi pada wanita di seluruh dunia dengan angka kejadian yang terus meningkat. Kasus kanker mammae di Indonesia menempati urutan pertama sebesar 16,85% atau kejadian sebanyak 8.227 kasus (Ranasasmita, 2008; Retnani, 2011). Menurut Kelsey (1998), presentase kanker pada anjing sebesar 51%, dimana 97% terjadi pada anjing betina. Pada kucing kanker mammae merupakan kasus yang banyak terjadi setelah haemopoietic dan kanker kulit dengan frekuensi kejadian yaitu 158470/100.000 hewan, dan 86% dari kejadian kanker mammae adalah ganas (Todorova, 2006). Kanker mammae dapat dipengaruhi oleh usia, nutrisi, inbreeding, obesitas, vaksinasi dan obat-obatan yang diberikan pada hewan tersebut. Secara alami kanker mammae dapat disebabkan oleh faktor genetika, hormon, infeksi virus, sinar UV, karsinogenesis, faktor lingkungan dan gaya hidup (Polton, 2009). Penelitian dengan pembuatan hewan model kanker mammae telah banyak dilakukan menggunakan induksi bahan karsinogen. Bahan karsinogen yang digunakan seperti 7,12 dimetylbenz (α) antrasen (DMBA), benz[a]pyrene (BP), 4nitroquinoline-1-oxide, dan N-nitroso-Nmethylure. Hewan percobaan mengalami kanker mammae melalui diinisiasi zat-zat tersebut (Cordeiro and Kaliwal, 2011). Senyawa DMBA merupakan zat yang sering digunakan karena memiliki potensi yang lebih tinggi dan lebih stabil sebagai zat karsinogen untuk pembuatan hewan model kanker. Konsentrasi pemberian induksi DMBA dalam pembuatan hewan model kanker pada penelitian Adventus (2013), diberikan dengan dosis 10 mg/KgBB secara
oral setiap hari sekali selama 44 hari. Penelitian yang dilakukan Cordeiro dan Kaliwal (2011), induksi DMBA dilakukan secara intra-mammary subcutaneous dengan dosis 20 mg/KgBB satu minggu sekali selama 4 minggu. Pemberian DMBA secara oral untuk pembuatan hewan model kanker mammae memiliki kekurangan yaitu membutuhkan waktu yang lama untuk pembentukan kanker pada hewan model, oleh sebab itu penelitian ini menggunakan cara injeksi intra mammary subcutan dengan modifikasi dosis 10 mg/KgBB dengan pemberian selang waktu 48 jam sekali sebanyak 10 kali. Senyawa DMBA yang diinduksikan akan dimetabolisme di hati oleh sitokrom P450 CYP1A1 atau CYP1B1 dan microsomal epoxides hydrolase (mEH) menjadi DMBA 3,4 diol-1,2 epoxida (DMBA-DE) membentuk DNA adduct (Akrom, 2012). Metabolisme DMBA menyebabkan kerusakan DNA yang berpengaruh pada gengen pengatur pertumbuhan sehingga akan terjadi pertumbuhan yang tidak terkontrol. Pertumbuhan yang berlebihan terjadi di semua sel termasuk sel endotel dan berpengaruh pada peningkatan produksi VEGF dan terjadi angiogenesis. Angiogenesis adalah pembentukan pembuluh darah baru yang berguna mensuplai nutrisi dan oksigen ke sel kanker sehingga dapat berkembang terus menerus (Tammama, 2012). Berdasarkan latar belakang tersebut penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh induksi DMBA kadar Vaskular Endothelial Growth Factor (VEGF) tikus (Rattus norvegicus) model kanker mammae.
MATERI DAN METODE Alat dan Bahan Alat yang digunakan untuk penelitian ini antara lain: kandang tikus, spuit 1 ml dan 3 ml, timbangan hewan, mortar, sentrifuge, baker glass, object glass, cover glass, tabung ukur, mikrotube, Skapel blade, timbangan analitik, mikroskop. Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tikus putih (Rattus norvegicus) usia 10-12 minggu, dimetylbenz (α) antrasene (DMBA), minyak biji bunga matahari, NS (Normal saline), NaCl fisiologis, Xylol, Etanol 100%, PFA 4%, Akuades, PBS pH 4,4, Hydrogen Peroksida, SA-HRP, DAB, Mayer Hematoxyler, BSA 1%, entellan, kloroform,), VEGF kit Perlakuan Hewan Coba Hewan coba dibagi dalam dua kelompok yaitu kelompok kontrol dan kelompok perlakuan. Kelompok control adalah tikus sehat tanpa perlakuan sedangkan kelompok perlakuan adalah tikus yang diberi induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB dan estrogen 20.000 IU/kg BB. Penggunaan hewan coba telah mendapat sertifikat laik etik oleh Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya Nomor 189-KEP-UB. Perhitungan Dosis DMBA dan Estrogen Kelompok perlakuan diberikan DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB yang merupakan modifikasi dari Cordeiro dan Kaliwal (2011). Senyawa DMBA dilarutkan dalam minyak biji bunga matahari dan NaCl fisiologis dengan perbandingan 3:1 (Pugalendhi et al., 2011). Dosis estrogen yang diberikan yaitu 20.000 IU/kg BB yang merupakan modifikasi dari Naciff et al., (2002).
Pembuatan Hewan Model Kanker Mammae Pembuatan hewan model kanker mammae dengan memberikan induksi DMBA dan estrogen. Induksi DMBA dengan dosis 10 mg/kg BB diberikan secara subcutan pada organ target mammae. Induksi DMBA dilakukan setiap 48 jam sekali sebanyak 10 kali. Induksi estrogen diberikan secara intramuscular dengan dosis 20.000 IU/kg BB sebanyak dua kali dalam seminggu dengan interval waktu pemberian satu minggu dua kali dengan selang waktu satu hari sebelum induksi DMBA. Pengamatan Tikus Pasca Induksi DMBA Tikus yang sudah diinduksi DMBA dilakukan pemeriksaan fisik dan dilakukan penimbangan berat badan. Pemeriksaan fisik dilakukan dengan cara palpasi pada daerah mammae setiap satu minggu sekali sampai minggu terakhir induksi. Palpasi dilakukan untuk mengetahui perkembangan kanker dengan terbentuknya nodul pada mammae tikus. Pengabilan Sampel Darah Hewan Coba Tikus di restrain menggunakan kandang jepit, ekor dibersihkan dengan kapas alkohol, ujung ekor digunting sedikit, ekor diasukkan microtube dan ditekan-tekan sampai keluar darah, microtube dimiringkan dan setelah 3 jam disentrifuge. Ambil bagian serum menggunakan mikropipet dan dipindahkan ke mikrotube baru, diberi label dan disimpan pada leari pendingin. Pengukuran Kadar VEGF Dengan Uji ELISA Pengukuran kadar VEGF menggunakan uji ELISA dilakukan sesuai manual prosedur pada kit VEGF oleh Quantikine, R&D System Europe,Ltd.
Analisis Data Data yang diperoleh adalah data kuantitatif dari presentase area ekspresi Interleukin-12 dianalisis secara statistik. Hasil dan Pembahasan Pembuatan hewan model kanker mammae dengan menggunakan DMBA diketahui keberhasilannya dengan mengamati adanya nodul atau masa yang berbentuk melingkar atau tidak beraturan pada kelenjar mammae. Induksi DMBA dilakukan sebanyak 10 kali dengan selang waktu 48 jam. Pengamatan nodul dilakukan dengan palpasi pada daerah mammae setiap 1 minggu sekali. Nodul pertama kali muncul pada minggu ke 2, dengan adanya benjolan pada daerah mammae tikus kelompok perlakuan yang ditandai dengan bentukan padat, keras dan tidak dapat digerakan. Terbentuknya nodul pada penelitian ini digunakan sebagai penanda keberhasilan awal pebentukan kanker mammae setelah induksi DMBA. Nodul yang terbentuk kemudian dilakukan pemeriksaan histopatologi untuk memastikan bentukan nodul disebabkan oleh sel kanker. Hasil dari pemeriksaan histopatologi mammae pada kelompok perlakuan menunjukkan adanya proliferasi pada sel epitel pada duktus mammae sampai menutup lumen. Hasil penelitian pembuatan hewan model kanker mammae yang dilakukan Ranasmita (2008) dengan pemberian induksi DMBA sebanyak 11 kali secara oral dengan dosis 20mg/kg BB tikus sebanyak 2 kali seminggu menunjukkan terbentuknya nodul pertama kali setelah 24 hari dari induksi terakhir dan terus berkembang sampai hari ke 89 setelah induksi berakhir. Penelitian ini menunjukkan nodul pertama kali muncul pada minggu ke 2 induksi dan semakin mengeras dan membesar sampai induksi berakhir yaitu minggu ke 5. Hal tersebut membuktikan
bahwa induksi DMBA secara Multiple Low Dose (MLD) dengan dosis 10mg/kg BB setiap 48 jam sekali sebanyak 10 kali induksi mampu menginisisasi terbentuknya kanker pada mammae tikus dengan lebih cepat dibandingkan penelitian yang dilakukan oleh Ranasmita (2008). Induksi DMBA secara subkutan pada mammae tikus menyebabkan DMBA langsung menuju ke target organnya yaitu mammae. Pengaruh DMBA Terhadap Kadar VEGF Tikus Model Kanker Mamae Kadar VEGF pada serum tikus model kanker mammae dapat diketahui menggunakan metode ELISA. Nilai kadar VEGF pada hewan model kontrol dan perlakuan dapat diketahui dari pembacaan ELISA reader. Nilai kadar VEGF dari masing-masing pelakuan dihitung rataratanya untuk mengetahui besarnya peningkatan yang terjadi. Rata-rata kadar VEGF pada kelompok perlakuan lebih besar daripada kelompok kontrol dimana menunjukkan peningkatan sebesar 19x yang tercantum pada Tabel 1. Tabel 1 Tabel Peningkatan Kadar VEGF Kelompok
Rata-rata Kadar VEGF ± SD (%)
Kontrol
92.53 ± 7.48
Perlakuan
276.58 ± 16.43
Peningkatan Kadar VEGF dibandingka n kontrol negatif 19x
Nilai kadar VEGF yang diperoleh kemudian dilakukan analisa hasil
berdasarkan uji T tidak berpasangan menggunakan software SPSS. Faktor pertumbuhan VEGF kelompok kontrol pada Tabel 1 meiliki kadar yang rendah dikarenakan dalam keadaan normal VEGF diekspresikan dalam kadar yang bervariasi oleh berbagai jaringan. Saat kadar oksigen normal ekspresi VEGF akan menurun dan mengalami stabilisasi. Faktor pertumbuhan VEGF sangat penting dalam proses pertumbuhan dan perkembangan, seperti embriogenesis, penyembuhan luka, pembentukan jaringan vaskular dalam reproduksi betina yaitu pembentukan Corpus luteum dan regenerasi endometrium. Embriogenesis merupakan proses pembentukan embrio yang memerlukan asupan nutrisi dan oksigen yang dimediasi pembentukan pembuluh darah baru antara induk dan anak. Angiogenesis terjadi di tubuh yang sehat untuk penyembuhan luka berguna memulihkan aliran darah ke sel-sel setelah cidera (Frisca, 2009). Faktor pertumbuhan VEGF pada kelompok perlakuan memiliki kadar yang tinggi dibandingkan pada kelompok kontrol. Tingginya kadar VEGF pada tikus perlakuan disebabkan akibat induksi DMBA akan membuat kerusakan pada DNA yang mengkode pertumbuhan sehingga akan terjadi pertumbuhan yang tidak terkontrol pada sel termasuk sel endotel. Sel endotel merupakan tempat diproduksinya VEGF yang berperan pada proses angiogenesis. Mekanisme angiogenesis yang terjadi bertujuan untuk membantu pemberian nutrisi dan oksigen pada sel kanker sehingga sel kanker dapat berkembang. Pada penelitian ini terbukti adanya kemungkinan terjadinya kanker mammae oleh induksi DMBA dilihat
dari peningkatan kadar VEGF pada tikus kelompok perlakuan sebanyak 19 kali dibandingkan kelompok kontrol. Tang (2006) mengungkapkan bahwa regulasi dari VEGF dapat diekspresikan oleh Extracellular matrix metalloproteinase (MMP) inducer (EMMPRIN) melalui jalur sinyal P13K-Akt. Ekspresi yang berlebih EMMPRIN pada kanker mammae dapat merangsang fosforilasi pada Akt dan MAPk. Jalur P13K-Akt akan menginduksi sinyal angiogenic dan secara langsung menginduksi angiogenesis tumor dengan mengatur regulasi ekspresi VEGF pada sel endotel. KESIMPULAN Induksi 7,12 dimethylbenz [a] antrachen (DMBA) dengan dosis 10 mg/kg BB pada mammae tikus (Rattus norvegicus) dapat meningkatkan kadar Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) secara signifikan hingga 19x dibandingkan kondisi normal. SARAN Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pengaruh induksi DMBA dalam pembuatan hewan model kanker mammae pada organ-organ lain dan perlu dilakukan observasi lebih lanjut terkait dengan dampak induksi DMBA dalam pembuatan hewan model kanker pada hepar dapat menyebabkan inflmasi sistemik. DAFTAR PUSTAKA Adventus, B., Tiny, E.H. 2013. Ekstrak metanol Daun Kelor Menurunkan Ekspresi BCL-2, TRAIL-R1, dan Kadar Caspase-3 Jaringan Kolon Tikus yang Diinduksi DMBA. Jurnal Kedokteran Brawijaya, Vol.27, No.4.
Akrom. 2012. Mekanisme Kemopreventif Ekstrak Heksan Biji Jinten Hitam (Niggela sativa Lor) Pada Tikus Sprague Dawley Diinduksi 7,12 Dimethylbenz (a) antrasene Kajian Antioksidan dan Imunomodulator [Disertasi].Fakultas Kedokteran.Universitas Gajah Mada. Arifah, A.N. 2014. Efek Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanol Akar Pasak Bumi (Eurycoma longifa,Jack) Terhadap Aktivitas Fagositosis Makrofag Secara In Vitro. Pharmaciana, Vol.4,No. 1, 2014:9-14. Cordeiro M.C and Kaliwal B.B. 2011. Antioxidant Activity of Bark Extract of Bridelia Retusa Spreng on DMBA Induced Mammary Carcinogenesis in Female Sprague Dwley Rats. Journal of Pharmacognosy. Vol. Dampa2, Issue 1, 2011, pp-14-20. Frisca, C.T., Sardjono, dan Ferry, S. 2009. Angiogenesis : Patofisiologi dan Aplikasi Klinis. JKM. Vol.8 No.2:174187. Kelsey, JL., Antony S. Moore, and Lawrence T. Glickman. 1998. Epidemiologic Studies of Risk Factors for Cancer in Pet Dogs. Epidemiologic reviews/ vol. 20, No. 2. Printed in U.S.A.
Polton, G. 2009. Mammary Tumours in Dogs. Irish Veterinary Journal Vol. 62 No.1. Ranasasmita, R. 2008. Aktifitas Antikanker Ekstrak Etanol Daun Aglaia elliptica Blume Pada Tikus Betina Yang Diinduksi 7,12Dimetilbenz(@)Antrasena [SKRIPSI]. Program Studi Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Institut Pertanian Bogor. Retnani, V. 2011. Pengaruh Suplementasi Ekstrak Daun Annova Muricarata Terhadap Kejadian Displasia Epitel Kelenjar Payudara Tikus Sprague Dawley yang Diinduksi 7,12 Dimetilbenz(α)Antrasena. Fakultas Kedokteran. Universitas Diponegoro. Sigma-Aldrich. 2007. 7,12-Dimethylbenz[α] anthracene. http://www.sigmaaldrich.com. [26 April 2007]. Tammama, T. 2012. Angiogenesis dan Metastasis. Fakultas Kedokteran Gigi. Universitas Padjadjaran. Bandung. Tang, Y., Marian, T., Nakadaa,Patricia, R., Jenny, L., Francis, L.M.,Hillary, M., Mark, C., Linda, A.S., Peter, B., and Li Yan. 2006. Regulation of Vascular Endothelial Growth Factor Expression by EMMPRIN via the P13K-Akt signaling Pathway. American Association for Cancer Research
