Abstracts NVB-TRIP symposium 2016

Abstracts NVB-TRIP symposium 2016

1. Niet-polaire lipiden accumuleren tijdens opslag van transfusieproducten maar zijn niet verklarend voor transfusie gerelateerde acute longschade Anna-Linda Peters1, Martin A.T. Vervaart2, Robin van Bruggen3, Dirk de Korte3,4, Rienk Nieuwland5, Wim Kulik2, Alexander P.J. Vlaar1 1Laboratorium

van Experimentele Intensive Care en Anesthesie en Intensive Care Volwassenen, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam, 2Laboratorium van Genetische Metabole Ziekten, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam, 3Afdeling Bloedcel Research, Sanquin Research, Amsterdam; 4Afdeling Product en Proces Ontwikkeling, Sanquin Research, Amsterdam, 5Laboratorium van Experimentele Klinische Chemie, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam; Inleiding: Transfusie gerelateerde acute longschade (TRALI) is een syndroom waarbij patiënten binnen 6 uur na een transfusie ernstige kortademigheid ontwikkelen. Men veronderstelt dat TRALI in twee fases ontstaat. Tijdens de “eerste hit” zorgt een ernstige onderliggende aandoening (bijvoorbeeld sepsis, hematologische maligniteit, hartchirurgie) voor migratie van neutrofielen naar het longvaatbed. De “tweede hit” wordt door de transfusie gevormd en activeert de neutrofielen wat resulteert in longschade. Mogelijk speelt de opslagduur van transfusieproducten hier een rol in. De gedachte is dat het opstapelen van nietpolaire lipiden zoals arachidonzuur, 5-hydroxeicosatetranoic acid (HETE), 12-HETE en 15-HETE tijdens opslag van rode bloedcel producten in aanwezigheid van een “eerste hit” TRAL kan induceren. In deze studie hebben wij onderzocht of deze lipiden ophopen tijdens opslag van humane transfusieproducten en of infusie hiervan in proefpersonen in TRALI resulteert. Methoden: De concentratie arachidonzuur, 5-HETE, 12-HETE en 15 HETE werd met high-performance liquid chromotography – mass spectrometry gemeten in supernatant van opgeslagen producten. Het supernatant werd verkregen van tien standaard rode bloedcel (RBC) producten waarbij gedurende 42 dagen elke week gesampeld werd. Zes standaard plasmaproducten werden op dag 0, 5 en 7 na productie gesampeld. Om de invloed van temperatuur te onderzoeken werd de helft van het product bij 4°C en de andere helft bij 20°C opgeslagen. Zes standaard trombocytenconcentraten van 30 buffy coats werden op dag 0, dag 2, dag 5 en dat 7 na productie gesampeld. Daarnaast kregen 18 proefpersonen lipopolysacharide, de endotoxine van een gramnegatieve e. coli, als “first hit”. Dit werd gevolgd door een autologe RBC transfusie van 2 dagen oud, een autologe RBC transfusie van 35 dagen oud of als controle een infusie van NaCl 0.9%. Zes uur na transfusie werd de longfunctie gemeten en ondergingen de vrijwilligers een bronchoscopie met bronchoalveolaire lavage. Resultaten: Alle niet-polaire lipiden accumuleren in RBC en plasmaproducten gedurende opslag. Plasmaproducten die bij 20°C werden opgeslagen hadden een

nog sterkere toename in concentratie van niet-polaire lipiden dan producten die bij 4°C werden opgeslagen. De concentratie niet-polaire lipiden in trombocyten was direct na productie hoger dan in RBC en plasma. De concentratie hierin veranderde echter niet tijdens opslag. In de gezonde vrijwilligers gaf de lipopolysacharide infusie een systemisch inflammatoir syndroom respons (SIRS) met hypotensie, tachycardie en koorts (“eerste hit”). Transfusie van 35 dagen oude producten met een hoge concentratie niet-polaire lipiden (“tweede hit”) veroorzaakte echter geen TRALI of verslechtering van de longfunctie. Conclusie: Niet-polaire lipiden hopen op tijdens opslag van RBC transfusieproducten en plasmaproducten. De lipiden in RBC producten veroorzaken echter geen TRALI in proefpersonen die lipopolysacharide als “first hit” ontvangen.

2. Oorzaken van K-alloimmunisatie bij zwangeren met K-antistoffen Jessie Luken1,2, Henk Schonewille3, Peter Ligthart1, C. Ellen van der Schoot3, Anske van der Bom4 5, Rianne Koopman2, Masja de Haas1,4 1Sanquin

Diagnostiek, Immunohematologie Diagnostiek, 2Sanquin Bloedbank, Unit Transfusiegeneeskunde, 3Sanquin Research, Immunohematologie Experimenteel, Amsterdam, 4Center for Clinical Transfusion Research, Sanquin Research en Universiteit van Leiden, Leiden 5Leiden University Medical Center, Clinical Epidemiology, Leiden Inleiding/Doel: De aanwezigheid van antistoffen met de specificiteit anti-K (voorheen anti-Kell) kan ernstige hemolytische ziekte van foetus en pasgeborene (HZFP) veroorzaken. Om K-immunisatie door transfusie te voorkomen, wordt sinds 2004 de selectie van K-compatibele erytrocytenconcentraten voor vrouwen <45 jaar aanbevolen. Eerder toonden wij aan dat de prevalentie van zwangerschappen met Kantistoffen sindsdien is gedaald, maar het aantal zwangerschappen at risk (met Kpositieve partner) was niet duidelijk verminderd. Om het effect van K-compatibele transfusie op het aantal zwangerschappen at risk te beoordelen werd de oorzaak van K-immunisatie bij zwangeren met K-antistoffen na invoer van preventieve Kcompatibele transfusie onderzocht. Methode: Gegevens van zwangeren met K-antistoffen in het eerste trimester van de zwangerschap van 2013 en 2014 werden geanalyseerd. Nadat informed consent was verkregen, werd patiënten gevraagd naar mogelijke immunisatie-momenten in hun voorgeschiedenis, en werden transfusiegegevens opgevraagd bij zorgverleners. Resultaten: In totaal werden 39 zwangeren met K-antistoffen in 2013 en 2014 geïncludeerd. Partners van deze vrouwen waren in tien gevallen K-positief. Tot heden werden gegevens van 13 vrouwen geanalyseerd, waarvan zes vrouwen een K-positieve partner hadden. Zes van de 13 vrouwen hadden nooit een bloedtransfusie ontvangen. Partners van deze zes vrouwen waren in vier gevallen Kpositief, in een geval K-negatief en 1x was de K-typering onbekend. Zeven vrouwen

hadden in het verleden een transfusie ontvangen. Drie vrouwen werden voor 2004 getransfundeerd en vier vrouwen hierna. Van de vier transfusies na 2004 zijn de gegevens achterhaald en in drie gevallen was K-positief bloed getransfundeerd, waarvan 2x in een spoedsituatie bij massaal bloedverlies. Twee van de zeven vrouwen waren zwanger van een K-positief kind; een van hen had een K-positieve transfusie ontvangen na 2004. Bij een van deze zwangerschappen waren intrauteriene transfusies noodzakelijk, terwijl de andere zwangerschap intensief werd gecontroleerd in het LUMC en na de geboorte fototherapie gegeven werd. Conclusie/discussie: Immunisatie bij zwangeren met K-antistoffen in 2013 en 2014 vond in een deel van de gevallen plaats na transfusie. De K-positieve bloedproducten werden zowel voor als na invoer van het preventieve K-compatibele transfusiebeleid toegediend. Om zekerheid te krijgen over het immunisatiemoment wordt, bij ontvangers van een K-positieve transfusie die tevens een eerdere zwangerschap doormaakten, K-typering van het eerdere kind uit wangslijm verricht. Deze studie is onderdeel van een voortdurende monitoring naar het effect van een Kcompatibel transfusiebeleid.

3. Valideren van routinematig geregistreerde data ten behoeve van een transfusie-datawarehouse Loan R. van Hoeven1,2, Martine C. de Bruijne3, Mart P. Janssen1,2, Maria M.W. Koopman4, Peter Kemper1,2, Kit C.B. Roes2 1Transfusion

Technology Assessment Dept., Sanquin Research, Amsterdam, Center for Health Sciences and Primary Care, UMCU, Utrecht 3Dept. of Public and Occupational Health, EMGO Institute, VU Medisch Centrum, Amsterdam, 4Sanquin Blood Bank, Dept. of Transfusion Medicine, Amsterdam 2Julius

Inleiding: De hoeveelheid data uit electronic health records (EHR) neemt snel toe. Deze data, bedoeld voor administratieve en klinische doeleinden, worden steeds vaker gebruikt voor wetenschappelijk transfusieonderzoek. Toch worden EHR data niet standaard gevalideerd, onder andere omdat bestaande richtlijnen voor het vaststellen van de datakwaliteit erg theoretisch zijn. Daarom beschrijven we hier een praktische benadering voor het valideren van routinematig verzamelde data afkomstig uit verschillende bronnen ten behoeve van transfusieonderzoek. Methoden: Uit bestaande validatierichtlijnen zijn validiteitdimensies geselecteerd die relevant zijn voor gekoppelde transfusiedata. Vervolgens zijn vanuit deze dimensies meetbare validiteituitkomsten geformuleerd die zijn toegepast op een transfusiedataset met donor- en patiëntdata van meerdere ziekenhuizen. Resultaten: Er zijn voor onze toepassing zes relevante validiteitdimensies geïdentificeerd: identiteit, compleetheid, uniformiteit, tijdspatronen, plausibiliteit, en ‘event attributen’. Voor elke dimensie zijn kwantificeerbare uitkomsten

geoperationaliseerd (aantallen, percentages, ja/nee uitkomsten; zie Tabel 1). Er is een onderscheid gemaakt tussen validatie gebaseerd op externe informatiebronnen (externe validatie) en op verwachte associaties binnen de dataset zelf (interne validatie). Daarnaast kunnen uitkomsten op microniveau (binnen een variabele) en op macroniveau (tussen meerdere variabelen) berekend worden. Conclusie: Met de beschreven validiteituitkomsten is het haalbaar om de validiteit van gekoppelde routinematig geregistreerde transfusiedata te kwantificeren. Hoewel datavaliditeit ook afhangt van goede registratie aan de bron en contextuele factoren zoals het doel van de studie, is een gestructureerde validatiestap essentieel voor de transparantie en betrouwbaarheid van onderzoek op basis van routinematig verzamelde EHR data. Tabel 1. Voorbeelden van validiteitsuitkomsten voor bloedbank- en ziekenhuisdata Dimensie Extern, overeenkomst data met: Jaarrapport Koppeling Ziekenhuizen Literatuur Experts

Validiteitsuitkomst

Verschil aantal producten in dataset en jaarrapport bloedbank (%) % transfusies dat kan worden gekoppeld aan de donatie Vergelijk top5 gebruikers tussen verschillende ziekenhuizen van hetzelfde type (% afwijking) Vergelijk top5 gebruikers in dataset met de top-5 gebruikers verwacht vanuit literatuur (% afwijking) Vergelijk gemiddeld aantal transfusies per patiënt met verwachting van experts (zoals chirurgen) (% afwijking)

Intern: Identiteit Compleetheid Uniformiteit

Tijdspatronen

Plausibiliteit

% gedupliceerde donatiecode + productcode % missing voor belangrijkste variabelen als leeftijd van donor en patiënt Gebruiken ziekenhuizen en bloedbank hetzelfde coderingsysteem voor producten? (% productcodes dat kan worden gekoppeld aan de complete lijst ISBT productcodes) Vergelijk aantal donaties (/transfusies) van opeenvolgende jaren en check of er onverklaarbare sprongen in zitten % donors over het maximum aantal donaties per jaar (WB: 3-5x, plasma: 23x) % transfusies waarbij Hb stijgt na transfusie (accuraatheid Hb- en transfusiedatums)

Event attributen

% poolproducten dat aan het correcte aantal (5 of 6) donaties kan worden gekoppeld % transfusies dat aan de correcte diagnose kan worden gekoppeld

4. Hemostatische functie van trombocyten bewaard in “platelet additive solution C” in vergelijking met trombocyten bewaard in plasma Fabienne van Hout, Ido Bontekoe, Lara de Laleijne, Jean-Louis Kerkhoffs, Dirk de Korte, Johanna van der Bom, Pieter van der Meer Sanquin, Leiden en Amsterdam Inleiding: In Nederland worden trombocyten bewaard in plasma (plasmatrombocyten) of in platelet additive solution C (PAS-trombocyten). Eerdere studies leveren geen eenduidige resultaten op over de hemostatische functie van PAStrombocyten. Het doel van de studie was het ex vivo vergelijken van de hemostatische functie van PAS-trombocyten met plasma-trombocyten. Methoden: Deze studie bestond uit 2 experimenten waarbij volbloed werd samengesteld. In het eerste experiment bestond het samengestelde volbloed uit rode bloedcellen (RBC), Omniplasma en PAS-trombocyten (n=7) of plasma-trombocyten (n=7) in fysiologische verhouding. In het tweede experiment werd in plaats van Omniplasma, PAS-vloeistof of plasma gebruikt. Oftewel, naast RBCs bevatten de volbloed samples of PAS-trombocyten en PAS-vloeistof (n=7) afkomstig uit dezelfde eenheid of plasma-trombocyten en plasma (n=7) uit dezelfde eenheid. De aggregatiecapaciteit van de trombocyten werd bepaald met impedantie aggregometrie (Multiplate) geïnduceerd door 4 agonisten ADP, TRAP, COL en RISTO. De gehele stolselvorming werd gemeten met thrombelastografie (TEG). Alle metingen werden verricht op dag 2, 5, 8 en 13 na donatie. De invloed van de bewaarvloeistof van de trombocyten op de aggregatiecapaciteit en stolselvorming, onafhankelijk van bewaarduur, is geanalyseerd met een “linear model met correlated errors”. Resultaten: In het eerste experiment lieten de monsters met PAS-trombocyten significant lagere aggregatie (Multiplate) zien dan met plasma-trombocyten na activatie door ADP -5 U [95% confidence interval (CI) -6;-4] en TRAP -16 U (-22;-9). Wanneer de aggregatie geactiveerd werd met COL en RISTO was er geen verschil tussen de samples met PAS- of plasma-trombocyten. De aggregatie van alle samples nam af gedurende de bewaarduur. Het volbloed met PAS-trombocyten was vergelijkbaar met het volbloed met plasma-trombocyten wat betreft de met TEG gemeten maximale stolsel stevigheid (maximale amplitude), initiële fibrinevorming (Rtijd) en de snelheid van de stolselvorming (hoek). De TEG uitslagen bleven constant gedurende de bewaarduur.

In het tweede experiment waren alle TEG uitslagen van de samples met zowel PASvloeistof als PAS-trombocyten minder gunstig dan van de samples met plasma en plasma-trombocyten: maximale amplitude -11 mm (-16;-7), R-tijd +2.3 min (1.9;2.7) en hoek -17⁰ (-20;-14). Conclusie: PAS-trombocyten in volbloed lieten minder aggregatie zien na activatie door ADP en TRAP, maar de gehele stolselvorming werd niet beïnvloed door de verminderde trombocyten receptor functie. De stolselvorming van de monsters met zowel PAS-vloeistof als PAS-trombocyten was duidelijk slechter dan van de monsters met plasma en plasma-trombocyten.

5. Het genereren van gekweekte erythrocyten voor transfusie doeleinden Patrick Burger1,2, Elina Ovchynnikova1, Marijke Valkhof2, Esther Heideveld1, Erica Sellink2, Emile van den Akker1, Marieke von Lindern1 1Afd.Hematopoiesis, 2Laboratorium

Sanquin Research en Landsteiner Laboratory, Amsterdam, voor Celtherapie, Sanquin Research en Landsteiner Laboratorium,

Amsterdam Inleiding: Van een donor afkomstige rode bloedcellen (RBC) zijn de meest bekende vorm van cel therapie. Echter, allo-immunisatie, bloed overdraagbare ziektes en donor beschikbaarheid geven de nood aan van een in vitro gekweekte, aanpasbare RBC (cRBC) aan. Een transfusie eenheid bevat 1-2x10e12 rode bloedcellen, dus de huidige kleinschalige research grade expansie en differentiatie protocollen moeten worden aangepast aan good manufacturing practice grootschalige (bioreactor) procedures. Hier beschrijven we de optimalisatie van erytroïde expansie en differentiatie om good manufacturing practice gradatie cRBC te produceren voor transfusie doeleinden en het opschalen naar grootschalige kweken. Resultaten: Om de belangrijkste parameters die cruciaal zijn voor erytroïde expansie en differentiatie te kunnen controleren, maar ook om de kosten te verlagen, hebben we een eigen gehumaniseerd GMP-graad kweekmedium ontwikkeld. Initiële gehumaniseerde kweken met humaan plasma gaven goede cRBC, echter was de opbrengst laag door spontane differentiatie van de pro- erytroblast richting de reticulocyt. Door het plasma te vervangen met humaan serum albumine waren we in staat om een 125*106 keer expansie te krijgen van voorloper cellen aanwezig in buffy coats naar de gecommitteerde erytroïde cel, de erytroblast. Deze expansie is voldoende voor het genereren van genoeg cRBC voor een initiële fase I studie. Vervolgens hebben we de differentiatie van de erytroblasten naar reticulocyten geoptimaliseerd, hetgeen resulteerde in >85% geënucleërde cellen. Deze reticulocyten waren CD71laag/CD235+, tonen een vervormbaarheid die vergelijkbaar is met normale reticulocyten, bevatten volwassen hemoglobine en correcte antigen expressie. Op dit moment zijn we bezig om de protocollen geschikt te maken voor

specifieke bioreactoren om 150*109 reticulocyten te kweken voor een minitransfusie voor de fase I studie. Conclusie: Samenvattend, we hebben een compleet gehumaniseerd medium ontwikkeld en het protocol voor expansie en differentiatie van voorloper cellen naar grote hoeveelheden reticulocyten geoptimaliseerd.

6. Plaatjesrijk plasma voor de behandeling van acute en chronische wonden Ivo van der Bijl, Coert Margadant, Esther Middelkoop, Dirk de Korte Vereniging Samenwerkende brandwondencentra Nederland, Sanquin Amsterdam Inleiding/ doel: Autoloog plaatjesrijk plasma (PRP) wordt vaak gebruikt in behandeling van acute en chronische wonden. De groeifactoren uit bloedplaatjes en plasma kunnen het proces van wondgenezing versnellen. Autoloog PRP vertoont grote variatie in samenstelling door verschillende productiemethoden en de onderliggende aandoening. Om tot een verbeterde wondbehandeling te komen is er behoefte aan een gestandaardiseerde, allogene PRP formulering. Daarom is er behoefte aan preklinisch onderzoek naar de optimale samenstelling. De uitkomsten van deze testen worden vertaald naar in-vivo proefdiermodellen. Methode: Plasma, plaatjes in plasma en plaatjes in de bewaarvloeistof PAS III (Fresenius Kabi) werden gemaakt uit een trombocytenconcentraat. De concentratie plaatjes in plasma en plaatjes in PAS III was 1.0*10 9 plaatjes/ml. De plaatjes werden geactiveerd door 3 vries / dooi cycli en gecentrifugeerd. Het supernatant werd verdund in serum vrij medium. De verschillende composities werden vergeleken op de proliferatie en migratie van keratinocyten en fibroblasten. Migratie wordt onderzocht met een scratch assay. In een confluente laag keratinocyten of fibroblasten werd een kras aangebracht door middel van een gele pipetpunt. Vervolgens werd de migratie gevolgd door 45 uur iedere 20 minuten een foto te maken. Proliferatie werd gemeten gedurende 4 dagen. In het supernatant werden ook voor wondgenezing relevante factoren gemeten. Resultaten: Plasma, plaatjes in plasma en plaatjes in PAS III zijn in staat om de migratie en proliferatie van fibroblasten te induceren. De proliferatie wordt het sterkst gestimuleerd door plaatjes in plasma. Plasma en plaatjes in plasma zorgen voor remming van de migratie van keratinocyten, maar stimuleren de proliferatie. Plaatjes in PAS stimuleren de migratie van keratinocyten, maar remmen de proliferatie. Zie tabel 1. Plaatjes bevatten hoge concentraties van de groeifactoren platelet-derived growth factor AB/BB en transforming growth factor –beta, die een belangrijke rol spelen bij wondgenezing. Keratinocyt migratie

Keratinocyt proliferatie

Fibroblast migratie

Fibroblast proliferatie

Plaatjes in PAS +

-

+

+

Plaatjes in plasma Plasma

-

+

+

+++

-

+

+

+

Tabel 1 Conclusie/ discussie: De tegengestelde effecten van plasma en plaatjes op de migratie van keratinocyten hebben mogelijk invloed op de gewenste samenstelling van een product ter bevordering van wondgenezing. Dit zal worden getest in een 3D ex-vivo huidmodel, waarin na aanbrengen van een brandwond de effecten op genezing gemeten kunnen worden.

7. Agonisten-geïnduceerde plaatjes reactiviteit voorspelt bloeding in hematooncologische patiënten Birol Batman1, Esther R van Bladel1, Mariska van Hamersveld1, Pieternel C.M. Pasker1, Suzanne JA Korporaal2, Rolf T Urbanus2, Mark Roest2, Leonie A Boven1, Rob Fijnheer1,2 1 Meander Medical Center Amersfoort, the Netherlands, 2 Departments of Clinical Chemistry and Hematology, University Medical Center Utrecht Introductie; Prophylactic platelet transfusion strategies are based on platelet count. A large amount of patients with receive platelet transfusions, but will never bleed. On the other hand, bleeding still occurs, despite prophylactic platelet transfusions. In this study, we correlated the bleeding tendency in patients with hypoproliferative hematooncological disease with platelet function. Methods: In this observational study bleeding was graded according to the WHO bleeding scale, which ranges from 0 (no bleeding) to 4 (life threatening episode). Grades 2 and higher were regarded as significant. A novel platelet function test was developed, which provided results within the hour. Platelet reactivity to agonist stimulation of ADP, CRP, PAR-1 and PAR-4 was measured using flow cytometry on the same day bleeding scores were obtained. Results; A sum of 114 bleeding scores and platelet function tests were available of 21 patients. Of these patients, eighteen suffered from leukemia and lymphoma, two from multiple myeloma and one from myelodysplastic syndrome. All four studied agonists were correlated inversely with clinical bleeding. ADP odds ratio (OR) was 0.28, with a 95% confidence interval [CI] of 0.11-0.73 p=0.009, CRP OR 0.59 [0.400.87] p=0.007, PAR-1 OR 0.59 [0.37-0.94] p=0.026, PAR-4 OR 0.43 [0.23-0.79] p=0.007. The platelet count itself did not correlate with bleeding. Conclusion: We observed that agonist induced platelet reactivity in hypoproliferative hematology patients was inversely and significantly correlated to bleeding. This

correlation, if reproduced in a multi-center and multivariate analysis could have major implications in the field of prophylactic platelet transfusions.

8. Megakaryopoiesis vanuit geïnduceerde pluripotente stamcellen Marten Hansen1, Anne Marneth2, Carmen van der Zwaan3, Annemarie JM Koorneef3, Rinske van Oorschot2, Britta Laros-van Gorkom2, Tatjana Wust1, Marieke von Lindern1, Sander Meijer3, Bert van der Reijden2, Emile van den Akker*1 1Sanquin

Research, afdeling Hematopoiesis, Amsterdam, Nederland, en Landsteiner Laboratory, Academisch Medisch Centrum, Universiteit van Amsterdam, Amsterdam, 2Afdeling of Laboratory Medicine, Laboratory of Hematology, Radboud Universitair medisch centrum, Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Nijmegen, 3Sanquin Research, Afdeling Plasma Proteins, Amsterdam, en Landsteiner Laboratory, Academisch Medisch Centrum, Universiteit van Amsterdam, Amsterdam Introductie: De beperkte houdbaarheid van plaatjes limiteert de voorraad die nodig is om de continue vraag van transfusie plaatjes te beantwoorden. Ex vivo productie van plaatjes vanuit een herbruikbare bron zou deze situatie verbeteren. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (IPS) zijn een veelbelovende herbruikbare bron voor ex vivo plaatjes productie. Daarnaast zullen op maat gemaakte plaatjes allo-immunisatie voorkomen die veroorzaakt worden door plaatjes antigenen. Patiënt specifieke IPS lijnen zouden gebruikt kunnen worden om oorzakelijke mechanismes te ontdekken in ziekte modellen. Bij gray platelet syndrome (GPS) veroorzaakt door GFI1B mutaties, is megakaryopoiesis gekarakteriseerd door verhoogde megakaryoblast frequentie in beenmerg, een inhibitie van terminale differentiatie, afwezigheid/vermindering van alpha granule inhoud en een behoudt van CD34 expressie op plaatjes. Ons doel is om de expansie en differentiatie van IPS lijnen naar de megakaryocyten te optimaliseren door de moleculaire mechanismes te vergelijken tijdens normale en defecte megakaryopoiesis. Methode: Megakaryoblasten van gezonden donoren en GPS patiënten werden geherprogrammeerd met behulp van een polycistronische lentivirale vector die de herprogrameer factoren OCT4, SOX2, c-MYC en KLF4 bevat. Pluripotentie en het verlies van hematopoëtische kenmerken werd getest met flow cytometrie en PCR. IPS differentiatie naar megakaryocyten werd gedaan met de geïnduceerde kolonie differentiatie methode. Geproduceerde megakaryocyten werden beoordeeld als volgt: morfologie, flow cytometrie, confocale microscopie, CFU-MK en massaspectrometrie. Resultaten: Differentiatie van IPS naar megakaryocyten leidt tot een productie van megakaryocytaire cellen tussen dag 14-17. De cellen zijn meerkernig en positief voor megakaryocyt markers (CD41, CD42a/b, CD61), hebben kolonievormende potentie en kunnen pro-plaatjes maken. De productie is hoger (30x) in vergelijking met CD34+ cellen als start materiaal. De differentiatie van GPS-IPS lijnen leidt tot een constante

productie van megakaryoblasten voor 30 dagen. Dit zorgt voor een 10x verhoogde productie in vergelijking met gezonde IPS. Daarnaast zien we een lager aantal differentiërende megakaryocyten. Massaspectometrie op megakaryoblasten van GPS-IPS lijnen bevestigd de moleculaire eigenschappen van GPS. Verbazingwekkend genoeg zien we ook een 10x verhoogde expansie van endotheel voorloper cellen die fenotypisch lijken op vroege hemogenic endotheel. Dit samen suggereert dat GFI1B een rol heeft in endotheel specificatie en differentiatie. Conclusie: IPS kunnen gemaakt worden van megakaryoblasten en daarna gedifferentieerd worden naar megakaryocyten. GFI1B mutaties leiden tot een selectief groei voordeel van megakaryoblasten en hemogenic endotheel. Deze data laat het nut van patiënt specifieke IPS zien om ziektes te bestuderen. Het mechanisme achter dit groeivoordeel zou uitgebuit kunnen worden om de hematopoëtische uitgroei en in het specifiek plaatjes opbrengst te verhogen uit IPS.

9. Biotinylering van erytrocyten ten behoeve van klinisch wetenschappelijk onderzoek Djuna Z. de Back1, Richard Vlaar1, Boukje Beuger1, Brunette Daal1, Johan Lagerberg1, Dirk de Korte1, Marian van Kraaij1 en Robin van Bruggen1 1Afdeling

van bloedcel onderzoek, Sanquin Research en Landsteiner Laboratorium, Academisch Medisch Centrum, Universiteit van Amsterdam, Nederland. Inleiding: Binnen Sanquin zijn er diverse klinische studies waarbij men beter inzichtelijk wil maken wat de opbrengst is na transfusie van een bloedproduct. Er zijn momenteel vanuit Sanquin gesponsorde klinische transfusieprotocollen in ontwikkeling of al gerealiseerd, waarbij het doel is om de effectiviteit en veiligheid van erytrocytentransfusies bij bepaalde patiëntencategorieën (MDS patiënten, ICpatiënten) in kaart te brengen. Deze vraagstelling komt voort uit het feit dat tot 25% van de donorerytrocyten worden geklaard binnen 24 uur na een transfusie, een fenomeen dat meer en meer wordt gerelateerd aan bijwerkingen van transfusie bij de ontvanger. De mechanismen die er voor zorgen dat erytrocyten worden geklaard zijn in grote mate nog steeds onduidelijk. Identificatie van de routes die tot de klaring van erytrocyten leiden zijn vooral belangrijk voor de transfusiepraktijk. Het doel is dan ook een gestandaardiseerd gelabeld bloedproduct te ontwikkelen (GMP) dat kan worden gebruikt ten behoeve van klinisch wetenschappelijk onderzoek en voor evaluatie van nieuwe bloedproducten. Methoden: De opbrengst na transfusie is moeilijk te meten. Hoewel eigen rode bloedcellen van patiënten een andere genetische opmaak hebben dan de getransfundeerde producten, is het lastig om na transfusie op eenvoudige wijze “eigen” bloedcellen te onderscheiden van donorerytrocyten. Vroeger werd gebruik gemaakt van een labeling van donorerytrocyten met behulp van Chroom-51, een radioactief label. In Nederland mag chroom-51 echter niet meer worden toegepast ivm de radioactiviteit. Een andere optie is om onderscheid te maken op basis van bloedgroepverschillen. Dit is echter bewerkelijk en niet altijd mogelijk. Een derde mogelijkheid is het labelen van erytrocyten met biotine, ook wel vitamine B8

genaamd. Het voordeel van labelen met biotine is dat er met verschillende concentraties kan worden gelabeld, waardoor er verschillende RBC fracties kunnen worden vervolgd binnen 1 patiënt. Resultaten: Het labelen van rode bloedcellen met biotine is in eerdere studies veilig gebleken, ook bij herhaaldelijke blootstelling. De biologische activiteit van de RBC is na het labellen onveranderd waarbij het label zelf stabiel blijft ook als een erytrocytenconcentraat (EC) moet worden bestraald ter voorkoming van een Graft vs. Host reactie. Wel ontwikkelen 1:8 gezonde vrijwilligers antistoffen tegen biotine (zonder klinische consequenties), die na een jaar spontaan weer verdwijnen. Conclusie: Aan het einde gekomen van deze validatiestudie blijkt dat EC die onder GMP condities zijn gelabeld met biotine op gestandaardiseerde wijze kunnen worden geproduceerd. Hierbij kan biotine in verschillende concentraties worden bewaard in zakken die compatibel zijn met bloedzakken zonder kwaliteitsverlies en met behoud van eigenschappen.

10. Alloimmunisatie tegen rode bloedcel antigenen in patiënten met infecties Dorothea Evers1,2, Johanna G. van der Bom1,3, Janneke Tijmensen1,2, Rutger A. Middelburg1,3, Masja de Haas1,2,4, Saurabh Zalpuri1, Karen M.K. de Vooght5, Daan van de Kerkhof6, Otto Visser7, Nathalie C.V. Péquériaux8, Francisca Hudig9, Jaap Jan Zwaginga1,2 1Centrum

voor Klinisch Transfusiegeneeskundig Onderzoek, Sanquin Research, Leiden, 2Afdeling Immunohematologie en Bloedtransfusie, Leids Universitair Medisch Centrum, Leiden, 3Afdeling Klinische Epidemiologie, Leids Universitair Medisch Centrum, Leiden, 4Afdeling Immunohematologische Diagnostiek, Sanquin Research, Amsterdam, 5Afdeling Klinische Chemisch en Hematologisch Laboratorium, Universitair Medisch Centrum Utrecht, Utrecht, 6Afdeling Klinische Chemisch en Hematologisch Laboratorium, Catharina Ziekenhuis, Eindhoven, 6Afdeling Hematologie, VU Medisch Centrum, Amsterdam, 7, Afdeling Klinische Chemisch en Hematologisch Laboratorium, Jeroen Bosch Ziekenhuis, ’s Hertogenbosch, 8LabWest, Haga Ziekenhuis, Den Haag. Inleiding: Blootstelling aan rode bloedcel (RBC) antigenen middels bloedtransfusie kan leiden tot ernstige antistof gemedieerde morbiditeit en zelfs mortaliteit. De huidige preventieve matching strategieën gericht op hoogrisico patiënten kunnen geoptimaliseerd worden middels een gevalideerde ‘predictiescore’. In verschillende muizenmodellen bleek inflammatie een belangrijke modulator van de humorale immuunrespons tegen RBC antigenen. Wij kwantificeerden het alloimmunisatie risico in patiënten met infecties. Methode: Vanuit zes Nederlandse ziekenhuizen verrichtten wij een case-controle onderzoek binnen een cohort van alle niet-eerder geïmmuniseerde patiënten die tijdens een studieperiode van acht jaar hun eerste RBC transfusie ontvingen. Cases werden gedefinieerd als patiënten die een eerste transfusie-geïnduceerde RBC antistof ontwikkelden. Elke case werd vergeleken met twee controle patiënten. Deze controles betroffen random geselecteerde, niet-geïmmuniseerde patiënten

blootgesteld aan ten minste hetzelfde aantal RBC eenheden als de case. Middels logistische regressie analyse met stratificatie voor potentiële confounders beoordeelden wij de associatie tussen RBC alloimmunisatie en de aanwezigheid van verschillende typen infecties tijdens een ‘alloimmunisatie risicoperiode’ van vijf weken. Hiertoe werden weefselinvasie bacteriële infecties gedefinieerd als ‘ernstig’ of ‘niet-ernstig’ op basis van de verwachte systemische inflammatoire respons bij dit type infectie. Bacteremieën werden geclassificeerd als Gram-positief of Gramnegatief op basis van de verwekker. Alle viremieën en gedissemineerde varicella zoster infecties werden gedefinieerd als ‘gedissemineerde virale infecties’. Resultaten: Binnen een cohort van 24,063 niet-getransfundeerde patiënten ontvingen 505 cases en 1,010 gematchte controles mediaan acht (range 4-16) RBC eenheden. Gedurende de risicoperiode werden 159 cases (31.5%) en 314 controles (31.1%) gediagnosticeerd met ten minste één infectieuze episode. Alloimmunisatie incidenties waren verhoogd na RBC transfusies ontvangen tijdens een ernstige bacteriële infectieuze episode (gecorrigeerd relatief risico (RR) 1.34 met 95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 0.97-1.85). Wanneer deze infecties tevens samenvielen met een koortsende periode van meer dan zeven dagen, bleek het risico nog verder verhoogd (RR 3.06, CI 1.57-5.96). Gedissemineerde virale infecties waren geassocieerd met een RR van 2.41 (CI 0.89-6.53). Verrassenderwijs bleken Gram-negatieve bacteriëmien, in tegenstelling tot Gram-positieve bacteriëmien, geassocieerd met een bijna tweemaal verlaagd alloimmunisatie risico (RR 0.58, CI 0.13-1.14). Fungale infecties, verhoogde CRP waarden, en (mate van) leukocytose bleken geen voorspellers van alloimmunisatie. Conclusies: Ondersteund door data uit diermodellen tonen onze data aan dat het risico op alloimmunisatie verhoogd is wanneer een patiënt RBC transfusies ontvangt ten tijde van ernstige (weefsel-invasieve) bacteriële of virale infecties. Gramnegatieve bacteremieën daarentegen zijn geassocieerd met een risicoreductie. Infectieuze episoden aanwezig ten tijde van RBC bloedtransfusies dienen daarom een belangrijk onderdeel uit te maken van een predictieve alloimmunisatie predictiescore.

11. Antilichaam gemedieerde rode cel fagocytose door neutrofielen in de milt Sanne Meinderts1, Per-Arne Oldenborg2, Boukje Beuger1, Taco W. Kuijpers1,3, Timo K. van den Berg1* and Robin van Bruggen1* 1Afdeling

Blood Cell Research, Sanquin Research en Landsteiner Lab, Universiteit van Amsterdam, Amsterdam; Afdeling Integrative Medical Biology, Universiteit van Umeå, Zweden; 3Emma Kinderziekenhuis, Academisch Medisch Centrum, Universiteit van Amsterdam;* deze auteurs hebben een gelijke bijdrage geleverd Inleiding: Het klaren van rode bloed cellen (RBCs) door middel van fagocytose speelt zich voornamelijk af in de milt en het wordt algemeen aangenomen dat dit proces wordt uitgevoerd door rode pulp macrofagen. Fagocytose van RBCs vindt plaats onder homeostatische condities maar kan versterkt worden door antilichaam opsonisatie van de RBC tijden auto- of allo-immunisatie reacties. Allo-antilichamen

kunnen gevormd worden ten gevolge van bloedtransfusies en auto-antilichamen ontstaan in pathologische situaties zoals auto-immuun hemolytische anemie (AIHA). Methoden: Voor het in vitro meten van RBC fagocytose gebruiken wij een zeer specifieke methode waarbij we de RBC magnetisch labelen voordat we ze incuberen met de fagocyten van de milt. De fagocyten die deze magnetische RBCs hebben opgenomen kunnen geïsoleerd worden met behulp van een magnetische column. Deze fractie wordt vervolgens geanalyseerd door middel van flow cytometrie. Voor de in vivo analyse hebben we PKH-gelabelde, IgG-geopsoniseerde RBCs geïnjecteerd in C57BL/6 muizen en vervolgens fagocytose gemeten met behulp van flow cytometrie. Resultaten: Verrassend genoeg bleken naast macrofagen ook neutrofielen betrokken te zijn in het fagocyteren van IgG-geopsoniseerde RBCs. Fagocytose van RBCs door neutrofielen bleek afhankelijk te zijn van de mate van opsonisatie van de RBC. Het proces kan versterkt worden door het “don’t eat me signaal” CD47 te blokkeren. Dit eiwit bindt normaal gesproken aan SIRPα, een remmende immunoreceptor op fagocyten, en remt daarmee fagocytose. Daarnaast kan het activeren van neutrofielen door ontstekingsmediatoren ook leiden tot verhoogde fagocytose. Conclusie: Onze data laten zien dat naast macrofagen, neutrofielen belangrijke fagocyten zijn in het proces van RBC fagocytose in de milt. Hoewel macrofagen de primaire fagocyt zijn onder homeostatische condities, wijzen onze data erop dat neutrofielen de primaire fagocyt van IgG-geopsoniseerde RBCs in vitro en in vivo zijn. RBC fagocytose door neutrofielen kan versterkt worden door ontstekingsmediatoren en wordt geremd door de interactie tussen CD47 en SIRPα. Dit suggereert dat neutrofielen een aanzienlijke rol zouden kunnen spelen in pathologische condities zoals allo-immunisatie of AIHA.

12. Ontbreken van detecteerbare trombocyten auto-antistoffen voorspelt het niet responderen op rituximab behandeling in ITP patienten. Leendert Porcelijn1, Elly Huiskes1, Martin Schipperus2, Jaap Jan Zwaginga3,4, Masja de Haas1,3,4 1Immunohematology

Diagnostic Services, Sanquin Diagnostic Services, Amsterdam, Department of Internal Medicine, HagaZiekenhuis, Den Haag, 3 Department of Immuno-hematology and Blood Transfusion, Leiden University Medical Center, 4Centre for clinical transfusion research, Sanquin and Leiden University Medical Centre 2

Introduction: Rituximab (R), a chimeric anti-CD20 monoclonal antibody that causes depletion of circulating B cells, is known to have a treatment efficacy in approximately 50-60% of immune thrombocytopenia (ITP) patients. We tested if the response to R in these patients was associated with a decrease of detectable platelet-associated autoantibodies.

Methods: For ten weeks, weekly, starting before the first R dose was administered, EDTA-anticoagulated blood samples were drawn from 89 patients and send to our laboratory for platelet-associated autoantibody detection.in the direct platelet immunofluorescence test (PIFT) (n=89) and direct monoclonal antibody immobilization of platelet antigens assay (MAIPA) (n=27). Complete (CR), good/partial (PR) and moderate (MR) response were respectively defined as platelet counts on 2 consecutive occasions of ≥150x10e9/L, ≥50x10e9/L and ≥ 30x10e9/L provided to be at least twice the base-line count. Results: For 12 of 89 (13%) patients insufficient platelets could be isolated from preR treatment samples to perform the direct PIFT or direct MAIPA. No platelet-associated autoantibodies were detected in 15 of 77 (19%) patients, of which 11 of 37 (30%) non-response patients, 3 of 15 (20%) partial response patients, 1 of 9 (11%) moderate response patients and 0 of 15 (0%) complete response patients. The positive predictive values of platelet associated antibodies in d-MAIPA and d-PIFT for CR and response to R were 24.6 (95%CI 14-5-37.3) and 57.4 (95%CI 44.1-70.0). However, the negative predictive value of no detectable antibodies is 100% (95%CI 78.2-100%) for complete response, and 73.3% (95%CI 44.9-92.2%) for response to rituximab. Conclusion: A lack of detectable platelet-associated autoantibodies in ITP patients strongly predicts non-responsiveness for rituximab treatment.

13. Anti-D vorming bij patiënten met rhesus-D incompatibele niertransplantaties. Ron Straat, Thomas Habets, Joris Vanderlocht, Marcel Tilanus, Erik Beckers, Maarten Christiaans, Yvonne Henskens. Maastricht UMC Inleiding: Voor veel mensen met irreversibel nierfalen, is transplantatie de beste behandeling. Bij niertransplantatie wordt primair gestreefd naar een optimale matching van donor en ontvanger wat betreft de antigenen van het ‘human leucocyte antigen’(HLA)-systeem en het in kaart brengen van anti-HLA antistoffen. Niertransplantaties in het MUMC+ worden op dit moment uitgevoerd met ABO compatibele donoren. Echter voor de Rhesus-D bloedgroep (RhD) wordt niet gematched. Of RhD incompatibele niertransplantatie kan leiden tot anti-D vorming bij patiënten is vrijwel niet onderzocht. Anti-D profylaxe maakt nu geen deel uit van de behandeling van RhD negatieve patiënten die een nier van een RhD positieve donor krijgen. De bestaande richtlijnen bevatten weinig tot geen informatie over dit onderwerp. Doel: Onderzoeken of Rhesus-D incompatibele transplantaties aanleiding geven tot anti-D vorming in de ontvanger. Materialen & Methoden: Analyzers: IH-1000 (BioRad, Zwitserland). Screeningscellen: ID-DiaCell I-II-III (BioRad, Zwitserland). Tijdens de validatie werd

in alle analyzers dezelfde batch screeningscellen gebruikt. Patiënten: Sera van RhD incompatibele niertransplantaties in de periode 1993-2015 werden geïncludeerd in de studie indien zowel serum van voor als na niertransplantatie aanwezig was in de serumbank. Procedure: Stap 1: Van alle sera na niertransplantatie werd een screening op irregulaire antistoffen uitgevoerd. Bij een positieve screening werd de specificiteit van de antistoffen vastgesteld. Stap 2: Bij een positieve screening posttransplantatie werd eveneens het betrokken pre-transplantatie sera screening en identificatie uitgevoerd. Stap 3: Indien de antistof voor transplantatie niet aantoonbaar was werden andere bronnen van immunisatie uitgesloten. Resultaten: In oktober 2015 werden de sera van 156 geïncludeerde patiënten getest op irregulaire antistoffen. Bij 7 monsters (4,5%) werd een positieve screening posttransplantatie gevonden Bij 4 patiënten werd een anti-D gevonden, Bij 1 patiënt een anti-D en een anti-Jk(a), bij 1 patiënt een anti-K en bij 1 patiënt kon de specificiteit niet worden vastgesteld. Van de 5 patiënten met anti-D, was slechts bij één patiënt (0,6%) deze niet aantoonbaar vóór transplantatie. De overige antistoffen waren ook vóór transplantatie aantoonbaar. Conclusie: Rhesus-D positieve niertransplantatie geeft zelden aanleiding tot anti-D vorming.

14. De rol van HLA klasse I antistoffen in foetale/neonatale alloimmuun thrombocytopenie L. Porcelijn1, D. Winkelhorst2, J.M.E van de Weerd1, E. Huiskes1, E. Muizelaar1, N.M. Lardy1, M. de Haas1,3 1Sanquin

Diagnostic Services, Amsterdam, The Netherlands, 2Department of Obstetrics and Gynaecology, Leiden University Medical Centre, Leiden, The Netherlands, 3Centre for clinical transfusion research, Sanquin and Leiden University Medical Centre Introduction: To date no structural survey on the role of HLA class I antibodies in FNAIT has been conducted. Here, we evaluated within our case series whether HLA class I antibodies could be determined as single cause of FNAIT. Materials and Methods: Plasma samples of 72 thrombocytopenic newborns, whose mothers showed strong reactive (O.D.>1.5) HLA-class I antibodies in the MAIPA, were screened for antibodies (Lifescreen de luxe). In case of a positive HLA antibody screening, maternal, paternal and neonatal genotyping (PCR-SSP and sequence based typing) and maternal and neonatal antibody identification was performed in the Luminex single antigen assay (Lifecodes LSA I assay, cut-off MFI>2000). In four cases, we determined by titration the maximal binding (max MFI) and ratio max MFI newborn/max MFI mother. Results: 216 different HLA-class I antibodies were detected in the plasma’s of 21/72 (29%) thrombocytopenic neonates. The detected antibodies were incompatible (i.e. fitting, n=35), strong cross reactive (n=35) or compatible (n=146) with the neonatal HLA-class I typing in respectively, 11 (52%), 11 (52%) and 19 (90%) neonates.

Incompatible and/or cross-reactive antibodies were detected in the plasma of 13/21 (62%) neonates. The titration studies mean max MFI ratio’s for four neonates, i.e. nine compatible and 35 incompatible antibodies were respectively, 0.22 (95%CI 0.13–0.32) and 0.68 (95%CI 0.54-0.81), hence pointing to consumption of the fitting antibodies. The mean platelet and leucocyte counts for 11 neonates with detectable incompatible antibodies were respectively, 25.8 x 10 9/L (Std 17.7, range 2-68) and 10.7 x 109/L (Std 4.9, range 3.9-21.5). Other causes for thrombocytopenia were present in 5 of those neonates, i.e. anti-HPA-5b (n=2), severe asphyxia (n=1), congenital viral infection (n=1), Trisomy 21 also suffering from hemophagocytic lymphohystiocytosis (n=1). Additionally, two neonates had high thrombopoietin levels, indicating a temporary decreased platelet production. Finally, four cases remain with an unexplained thrombocytopenia in presence of fitting HLA class I antibodies. Conclusion: In a substantial number of cord blood samples, free circulating compatible and incompatible HLA antibodies can be detected, of which we could not yet confirm a clear correlation with neonatal thrombocytopenia.

15. Identificatie van nieuwe KLF1 mutaties in In (Lu); de pleiotrope functie van KLF1 tijdens erythropoiese. Jesse Eernstman1, Barbara Veldhuisen2, Marieke von Lindern1, Ellen van der Schoot 2, Emile van den Akker1 1Sanquin,

Haematopoiese, Amsterdam, 2Sanquin, Immunohematologie, Experimenteel, Amsterdam Introductie: Beta- Hemoglobinopathieën worden prominent na de geboorte als gevolg van een overgang van foetaal-hemoglobine (HbF) naar volwassenhemoglobine (HbA). Een belangrijke regulator in deze omschakeling is de erytroïde specifieke, transcriptiefactor Krueppel-like-factor 1 (KLF1). KLF1 reguleert ook de expressie van eiwitten die cruciaal zijn voor de functionaliteit van erytrocyten, zoals Lutheran (BCAM, Lu), Band3 en CD44. Mutaties in KLF1 kunnen resulteren in verschillende pathologieën, zoals Hoge Persistentie van Foetale Hemoglobine (HPFH). Om te begrijpen waarom KLF1 mutaties uiteenlopende fenotypes veroorzaken, genexpressie regulatie door KLF1 begrepen worden. Instrumentaal hierin is het ontdekken van nieuwe mutaties in KLF1 en hun effect op de erytrocyten/erytroïde functionaliteit. In dit onderzoek werd de expressie van Lu op erythrocyten gebruikt als een uitlees mechanisme om nieuwe KLF1 mutaties vinden. Methoden: Lu expressie werd gemeten met behulp van serologie en flowcytometrie, op bloed van 31 Lu (a-b-) en 24 zwakke Lua en Lub donoren. In deze donoren werd het KLF1 gen gesequenced (3 exons en promotor). Flowcytometrie werd uitgevoerd op specifieke erytrocyten-membraaneiwitten en γ- en β-hemoglobine expressie niveaus zijn gemeten met HPLC. KLF1 mutanten werden tot expressie gebracht in pro-erytroblasten met behulp van lentivirale transducties. Endogene KLF1 werd omlaag gereguleerd met short hairpins gericht op KLF1 5'UTR. Het effect van KLF1

mutanten op erytroïde membraaneiwitten en hemoglobine omschakeling werd bestudeerd met Flowcytometrie, HPLC en Western blotting. Resultaten: Een flowcytometrie test is opgezet om Lutheran polymorfismes te detecteren. De Lu (a-b-) donor groep toonde verminderde CD44 en P1 expressie en verhoogde HbF en HbA2 niveaus, met uitschieters tot > 9% HbF expressie. Een inverse correlatie (R = 0,309) tussen CD44 en γHb expressie werd waargenomen. Sequencing van het KLF1 gen onthulde nieuwe mutaties, naast de bekende single nucleotide polymorphisms (zoals C304T). Het uitschakelen van endogeen KLF1 in primaire erytroblasten, resulteerde in verlaagde CD44 expressie. Transductie met wild-type KLF1 resulteerde in herstelde CD44 niveaus. De KLF1 mutanten tonen verschillende effecten op de CD44 expressie en de HbF/HbA hemoglobine expressie. Conclusie: Lu (a-b-) is geassocieerd met KLF1 genmutaties. Bestaande en nieuwe mutaties zijn geïdentificeerd. Donoren met Lutheran negativiteit en een KLF1 mutatie laten ook een lager CD44, P1 en hoge HbF niveaus zien. Expressie van KLF1 mutanten in pro-erytroblasten bevestigen dit. De studie suggereert dat KLF1 functioneert in diverse verschillende transcriptie complexen. Dit zou kunnen worden benut in patiënten met Beta- Hemoglobinopathieën om HbF te verhogen met behoud van membraaneiwitten en bloedgroepen die essentieel zijn voor erytrocyten structurele integriteit.

16. Constantere buffy coat samenstelling na aanpassing gevoeligheid detectoren compomat g5 Brunette B. Daal, Lara A.E. de Laleijne, Pieter F. van der Meer, Johan W. Lagerberg, Dirk de Korte Sanquin Inleiding: Sinds 2010 maakt Sanquin gebruik van de Compomat G5 voor het scheiden van gecentrifugeerd volbloed in plasma, buffy coat (BC) en RBC. In de praktijk bleek dat BCs gemaakt met de G5 een grote spreiding gaven in hematocriet (Ht) en dat deze regelmatig te hoog was (>0.5L/L). Bij nauwkeurige bestudering van scheidingsproces werd gezien dat de grenslaag van BC laat werd gedetecteerd, mogelijk als gevolg van te ongevoelige instelling van de betrokken detectoren A1– A8. In een kleine studie werd aangetoond dat aanpassing van de gevoeligheid van de detectoren leidde tot BCs met een lagere en constantere Ht. Het doel van deze studie was om vast te stellen of met gevoeliger instelling van detectoren van de CompoMat G5 ook in de dagelijkse praktijk BCs met een lagere en constantere hematocriet gemaakt konden worden. Hierbij werd gestreefd naar BCs met een volume van 50 ml en een gemiddelde Ht van 0.42 L/L. Methoden: 30 gecentrifugeerde VB eenheden zijn bewerkt op 5 verschillende CompoMat G5s van Bewerking Amsterdam. Voor het afpersen van VB is de software

van het standaard VB programma aangepast naar de gevoeliger instelling van detector A1 – A8. Er zijn 15 VB eenheden bewerkt met de gevoeliger instelling en 15 met de standaard instelling. Geproduceerde BCs werden gewogen en hematologisch geanalyseerd. Resultaten: Zie tabel. Aanpassing van de gevoeligheid van de detectoren van de verschillende CompoMat G5s resulteerde in BCs met een lagere Ht, dicht bij de streefwaarde van 0.42 L/L. Ook spreiding in Ht (SD) is lager na aanpassing van de gevoeligheid. Met beide instellingen voldeden de BCs aan de eisen voor volume. Het aantal trombocyten was bij de BCs met standaard instelling iets hoger dan bij de gevoeligere instellingen (niet significant). Conclusie/ Discussie: Deze studie heeft aangetoond dat aanpassing van de gevoeligheid van detector A1-A8 van de CompoMat G5 resulteert in een meer constante samenstelling van BCs. De variatie van de hematocriet van BCs is met meer dan de helft omlaag gebracht, zonder verlies van BC volume. Het aantal trombocyten was iets lager bij BCs geproduceerd met de gevoeliger instelling. Vermoedelijk is dit een gevolg van spreiding in trombocytenaantallen in het volbloed, omdat met kleine aantallen werd gewerkt. Bij de komende validatie van de nieuwe software instellingen zal dit aspect meegenomen worden en zullen ook trombocytenconcentraten (TC) gemaakt worden uit de aangepaste BCs om er zeker van te zijn dat de gemiddelde hoeveelheid trombocyten in TCs hetzelfde blijft. Tabel Parameter

Eis (streefwaarde)

44 – 56 (50) Ht (L/L) 0.34 - 0.50 (0.42) 9 Trombocyten (10 ) >60 (>75) #; p<0.05 (Student’s t-test) Volume (mL)

Gemiddelde ± SD, n=15 (min-max) Standaard Gevoeliger 50 ± 3 49 ± 3 (44-55) (44-52) 0.45 ± 0.07 0.40 ± 0.02# (0.34- 0.59) (0.36-0.44) 125 ± 33 106 ± 26 (80-194) (63-157)

17. Voorspellen van het aantal initiële behandelingen bij hemochromatose patiënten behandelt met erytrocytaferese of aderlating. Eva Rombout-Sestrienkova1,2, Bjorn Winkens3, Marian van Kraaij1, Cees Th.B.M van Deursen4, Mirian C.H. Janssen5,6, Alexander M.J. Rennings5, Dorothea Evers7,8, Jean-Louis Kerkhoffs8,9, Ad Masclee 2, Ger H Koek2 1Sanquin

Bloedbank , Unit Transfusiegeneeskunde, Amsterdam, 2 Maastricht University Medical Center, Department of Gastroenterology and Hepatology,

Maastricht, 3 Maastricht University, School for Public Health and Primary Care (CAPHRI), Department of Methodology and statistics, Maastricht, 4 Zuyderland M C, Heerlen, 5 Radboud University Nijmegen Medical Center, Department of General Internal Medicine, Nijmegen, 6 Radboud University Nijmegen Medical Center, Department of Pediatrics, Nijmegen, 7 Leiden University Medical Center, Department of Immuno- hematology and Blood Transfusion, Leiden, 8Center for Clinical Transfusion Research, Sanquin Research, Leiden, the Netherlands, 9 HAGA ziekenhuis, Department of Hematology, Den Haag Inleiding/ doel: De standaard behandeling voor patiënten met nieuw gediagnosticeerde hereditaire hemochromatose (HH) en ijzerstapeling is aderlating of erytrocytaferese. Erytrocytaferese is efficiënter maar minder vaak gebruikt wegens de kosten en de noodzaak van gespecialiseerde afname apparatuur. Het belangrijkste doel van onze studie was het ontwikkelen van een mathematisch model, dat het aantal behandel procedures, die nodig zijn als initiële behandeling bij het toepassen van klassieke aderlating of meer individuele erytrocytaferese methode, voorspellen kan. Methoden: In onze studie hebben we retrospectief data van 97 nieuw gediagnosticeerde patiënten met HH (allemaal C282Y homozygoot) geanalyseerd. De patiënten waren behandeld met aderlating (n=54) of met erytrocytaferese (n=43), tot het serum ferritine (SF) beneden de grens van 100 μg/L was. 38 van deze patiënten (19 behandeld met aderlating en 19 met erytrocytaferese) waren deelnemers van een eerder gepubliceerde gerandomiseerde klinische trial (NCT00202436) en de resterende 59 patiënten (35 behandeld met aderlating en 24 met erytrocytaferese) waren behandeld in vier verschillende ziekenhuizen (Zuyderland MC Heerlen, HAGA ziekenhuis Den Haag, Radboud UMC Nijmegen, LUMC Leiden). Alle patiënten waren behandeld conform de Nederlandse richtlijnen. In de aderlating groep was de behandeling een maal per week toegepast door afname van 500 ml volbloed. In de erytrocytaferese groep was de behandeling eenmaal in 2-4 weken toegepast en de hoeveelheid afgenomen erytrocyten was individueel bepaald op basis van totale bloedvolume van de patiënt en de initiële waarde van hematocriet en bedroeg 300-800 ml erytrocyten per afname. Om te bepalen welke voorspellers significant gerelateerd waren aan het aantal verrichte behandelprocedures werd een multipele lineaire regressie analyse voor elke behandelmethode afzonderlijk toegepast. Resultaten: Met betrekking tot de erytrocytaferese waren parameters met de beste en het meest praktische voorspelende waarde: het initiële gehalte van SF, het initiële gehalte van hemoglobine (Hb) en het gewicht van de patiënt. Met betrekking tot de aderlating waren dit het initiële gehalte van SF en het gewicht van de patiënt. De gevestigde formules voor het aantal behandelprocedures waren: Voor erytrocytaferese: X = 28,6 + (0,004 x initiaal SF ) – (1,82 x initieel Hb) – (0,08 x gewicht) met R2 =0,70 en √MSPE =3,7. Voor aderlating: X = 21,4 + (0,011 x initieel SF) – (0,17 x gewicht) met R2 = 0,69 en √MSPE= 7,9.

Conclusie: Dit model kan behandelaren helpen bij het kiezen van de meest efficiënte en kost effectieve behandeling voor elke individuele patiënt. Verdere prospectieve studies zijn nodig om de voorspellende waarde van het model te valideren en te verbeteren.

18. Validatie ih-1000 voor geautomatiseerde antistof identificatie. Ron Straat1, Thomas Habets2, Joris Vanderlocht2, Marcel Tilanus2, Erik Beckers3, Maarten Christiaans4, Yvonne Henskens1. 1Maastricht

UMC+, Centraal Diagnostisch Laboratorium, 2Maastricht UMC+, Laboratorium weefseltypering, 3Maastricht UMC+, Interne geneeskunde, 4Maastricht UMC+, Afdeling nefrologie. Inleiding: Na een uitgebreide validatie werd de IH-1000 in het MUMC+ in gebruik genomen als vervanger voor de WA-Diana voor de bloedgroep bepaling en de irregulaire antistof screening (IRS). Met de nieuwe generatie analyzers wordt door de fabrikant de mogelijk geboden om na een positieve IRS, de identificatie van de antistof met behulp van uitgebreide cel panels geautomatiseerd in te zetten en af te lezen. Identificeren van antistoffen met behulp van een panel is technisch identiek aan de procedure voor de IRS. Voorheen werd in het MUMC+ geen gebruik gemaakt van een geautomatiseerd systeem om panels in te zetten en af te lezen omdat uit eerdere validaties was gebleken dat de camera’s van de apparatuur te ongevoelig waren om zwakke reacties te detecteren. Het manueel aflezen van de reactiesterktes werd destijds als gouden standaard methode gekozen. Doel: Onderzoeken of het mogelijk is de IH-1000 te gebruiken voor het identificeren van antistoffen. Materialen & Methoden: Analyzers: IH-1000 (BioRad, Zwitserland). Panelcellen: IDDiaPanel (BioRad, Zwitserland). Patiënten: In de periode 20-2-2015 tot 28-4-2015 werden 21 patiënten, die zich presenteerden met reacties zwakker of gelijk aan 2+ in het 11-cel panel, geïncludeerd. Aangevuld met 7 sera uit ons archief konden we een breed scala antistoffen testen (D, C, c, E, e, K, Fya, Fyb, Jka, Jkb, M, N, S, s, Cw, Kpa, IH, aspecifieke warmte auto antistoffen). Alle bepalingen werden met hetzelfde materiaal zowel manueel als met de IH-1000, bepaald binnen een tijdsinterval van 4 uur. De reactiesterktes werden als volgt gescoord: negatief, (+),1+,2+,3+,4+. De reactiesterktes per cel werden per patiënt vergeleken met de manuele methode. Resultaten: Bij 28 panels werden 308 (28*11) reacties vergeleken. Bij 10 reacties (3%) gaf de IH-1000 aan dat manuele interpretatie nodig was, 6 werden door de analist zwak positief beoordeeld en 4 negatief. Bij 12 reacties (4%) werd manueel een sterker resultaat gevonden, bij 29 reacties (9%) werd een sterker resultaat door de IH-1000 gevonden. Alle positieve reacties die manueel gevonden werden werden ook door de IH-1000 gevonden. Tevens werd in de

geautomatiseerde methode een extra antistof (anti-K) gevonden die met de manuele methode niet aantoonbaar was. Conclusie: Op de IH-1000 kan een antistof identificatie geautomatiseerd ingezet en afgelezen worden die ten minste even gevoelig is als manueel bepaalde panels.

19. Tromboelastografie analyse van het fibrinolytische effect van solvent/detergent pooled plasma (sdp) Nicholas H. Saadah1,2 ,Pieter F. van der Meer1,3 ,Dirk de Korte3 ,Ido J. Bontekoe3 , Herm-Jan M. Brinkman4 ,Herbert H. Korsten3 ,Johanna G. van der Bom1,2 ,Martin Schipperus5,6 1Center

for Clinical Transfusion Research Sanquin Blood Supply Leiden, 2Dept. of Clinical Epidemiology Leiden University Medical Center Leiden, 3Product and Process Development/4Dept of Plasma Proteins Sanquin Blood Supply Amsterdam, , 5Haga Teaching Hospital Department of Hematology The Hague, 6 TRIP National Hemovigilance Foundation Hemovigilance and Biovigilance Office Leiden Achtergrond :Transfusies met SDP kunnen gecompliceerd worden door hyperfibrinolyse, met name in patiënten die blootgesteld worden aan hoge plasma volumina. De solvent/detergent behandeling en de daaraan gerelateerde verlaagde concentratie van het coagulatie eiwit α2-antiplasmine, ligt daar waarschijnlijk aan ten grondslag. Het doel van onze studie was derhalve om het fibrinolytisch effect van SDP in volbloed te vergelijken met dat in vers bevroren plasma (FFP). Methodes: Volbloed monsters werden gereconstitueerd uit erytrocyten concentraten (ECs) en plaatjes concentraten (PCs) met daarnaast toevoeging van vers bevroren plasma (Q-FFP), SDP of een mengsel van beiden. Doel hiervan vormde simulering van een geleidelijke vervanging van fysiologisch plasma door SDP. Tissue plasminogeen activator (tPA) en tissue factor (TF) werden toegevoegd in fysiologische concentraties en tromboelastografie (TEG) analyse werd gebruikt om de fibrinolytische activiteit van de monsters te meten. Stolsel lyse tijden (CLTs) werden gecorreleerd aan SDP verdunningsconcentraties. De primaire uitkomst betrof de benodigde tijd om 50% van het stolsel af te breken (ΔCLT50%) in de SDP bevattende monsters ten opzichte van deze tijd gemeten in monsters gereconstitueerd met puur Q-FFP. Resultaten: De gemiddelde verkorting van ΔCLT50% ten opzichte van metingen voor Q-FFP monsters betrof 12% bij een 50% concentratie SDP [95% betrouwbaarheidsinterval (CI) 7–17%], 28% bij een 75% concentratie SDP (CI 21– 35%] en 44% bij een 100% concentratie SDP [CI 37–51%]. Conclusies: SDP verkort de stolsel lyse tijd in volbloed. Hoewel de hier gepresenteerde data vooralsnog niet direct toepasbaar zijn in de praktijk, dienen artsen op de hoogte te zijn van een mogelijk fibrinolytisch effect van SDP transfusies. Verder klinisch onderzoek hiernaar lijkt essentieel.

20. Multi Componenten Collectie door Sanquin Marian Klijn Velderman, A. van de Griendt Sanquin Introductie: De afgelopen jaren was er een verminderde vraag naar erytrocytenconcentraten door de ziekenhuizen. Dit heeft geleid tot een verminderde afname van volbloed bij donors waardoor ook het aantal beschikbare buffy-coats voor de productie van gepoolde trombocytenconcentraten verminderde. Op dit moment is er geen tekort aan beschikbare buffy-coats voor de productie van gepoolde trombocytenconcentraten, maar bij aanhoudende dalende vraag naar erytrocytenconcentraten kan er een moment komen dat er op een andere wijze trombocytenconcentraten geproduceerd moeten worden. Multi Componenten Collectie (MCC), waarbij trombocytenconcentraten door aferesetechniek worden verkregen, kan dan een oplossing zijn. Door een Pilot studie uit te voeren waarbij minimaal 500 MCC-procedures werden uitgevoerd waarbij twee eenheden trombocytenconcentraten en een eenheid erytrocytenconcentraat werden afgenomen, is informatie verkregen over: a. Donorwerving en –bereidheid voor MCC. b. De financiële effecten wanneer MCC wordt toegepast. Methoden: 1. Flyers voor het werven van MCC-donors zijn verstuurd naar mannelijke donors. 2. Directe werving van MCC-donors op afnamelocaties. 3. Selectie van 184 donors door op basis van bloedvolume en trombocytenaantal te voorspellen of de donor binnen 90 minuten twee trombocytenconcentraten en een erytrocytenconcentraat kan doneren. 4. Uitvoeren van 551 MCC-procedures met de Trima Accel® (Terumo BCT). 5. Donor enquête. 6. Kwaliteitscontrole. 7. Post Marketing Surveillance (PMS). 8. Evaluatie van de financiële effecten Resultaten 1. 551 MCC-procedures uitgevoerd bij 184 donors waarbij 1601 componenten zijn verkregen. 2. 296 enquêteformulieren ontvangen waaruit blijkt dat 97,6% van de donors MCC-donor wil blijven.3. Kwaliteitscontrole van 1601 producten: producten voldoen aan de specificaties. 4. 740 PMS-resultaten uit 900 uitgegeven producten verkregen waaruit geen bijwerking zijn gebleken. 5. De financiële berekeningen van de huidige methode en de MCC-methode laat hogere kosten zien voor MCC. Conclusie/ discussie 1. Het is mogelijk om minimaal 4% van de mannelijke donors te werven voor MCC. 2. 97.6% van de multicomponentendonors vindt MCC-donatie acceptabel. 3. De producten blijken veilig voor de patiënt. 4. In deze situatie is MCC niet voordeliger dan de huidige methode, maar mogelijkheden om MCC voordeliger uit te kunnen voeren zijn inzichtelijk gemaakt.

21. Kwaliteit van trombocytenconcentraten wordt bepaald door donoreigenschappen Ido Bontekoe1, Davina Sijbrands1, Pieter van der Meer1, Johan Lagerberg1, Arthur Verhoeven2, Dirk de Korte1 1Sanquin

Bloedbank, Product- en Procesontwikkeling, Amsterdam, Medisch Centrum, Medische Biochemie, Amsterdam

2

Academisch

Inleiding / doel; Uit retrospectief onderzoek is gebleken dat verschillen in pH en functionele eigenschappen tijdens bewaren van de aferese trombocytenconcentraten (TCs) voor een deel aan de donor kunnen worden toegeschreven. Om dit uitgebreider en prospectief te onderzoeken, zijn in deze studie donors geselecteerd van wie de TCs naar verwachting, op grond van historische gegevens, ‘goede’ of ‘slechte’ bewaareigenschappen zouden vertonen. Methoden: Uit de QC files van ‘outdated’ aferese TCs (sept.2011-aug.2014) werden 6 donors geselecteerd met minimaal 1 TC met pH>7.0 (‘goed’) en 6 donors met minimaal 1 TC met pH<6.7 (‘slecht’) op dag 8. Deze donors (allen man) werd gevraagd om, naast een TC (Trima Accel, Terumo) en een buisje volbloed, een tiental vragen te beantwoorden over gezondheid en levensstijl. De TCs werden 12 dagen schuddend bewaard bij 22±2°C en regelmatig bemonsterd voor bepaling van de in vitro kwaliteit. Resultaten: De donorkarakteristieken waren vergelijkbaar qua leeftijd en body mass index (BMI). Van de ‘goede’ donors was 1/6 een roker, van de ‘slechte’ donors meldden 4/6 gezondheidsissues (hoge bloeddruk en/of hoog cholesterol/vet en/of gebruik medicijnen). De ‘goede’ TCs bevatten significant meer trombocyten (zie tabel), hetgeen niet te herleiden was tot de concentratie in het volbloed. De lactaatproductie (0.09±0.03 vs. 0.13±0.04 mmol/dag/1011 PLT) was in deze TCs ca.45% lager waardoor de pH vanaf dag 5 significant hoger was. De ‘goede’ TCs vertoonden minder activatie (CD62P-expressie), minder PS expositie (Annexine A5 binding) en een hogere mitochondriële membraan potentiaal (JC-1) aan het eind van de bewaartermijn. Zowel op dag 1 als 8 was het ATP gehalte vergelijkbaar in beide groepen. Functioneel waren er geen (trombo-elastografie R-tijd en Maximale Amplitude) verschillen (hypotonic shock response, HSR). Alle TCs voldeden gedurende 7 dagen bewaren aan de Richtlijn Bloedproducten. Conclusie / discussie: De ‘goede’ TCs waren significant verschillend ten opzichte van de ‘slechte’ TCs. Dit verschil wordt allereerst bepaald door de donor (genetische eigenschappen en/of gezondheidsissues). Het is niet duidelijk waarom de ‘goede’ donors een hogere trombocytenopbrengst gaven in de afereseprocedure, dit is onderwerp van verdere studie. Het lijkt er op dat de ‘goede’ trombocyten betere mitochondriën hadden en daarom een lagere glycolysesnelheid. Een beperkende factor is dat niet onderzocht is of het plasma van de donor een rol speelt. Onder standaard bewaarcondities voldeden alle TCs gedurende de reguliere bewaartermijn aan de Richtlijn Bloedproducten. De vraag dringt zich op of de bloedbank informatie over de kwaliteit van de gedoneerde producten moet uitwisselen met donors.

22. Hoge trombocyten aantallen in concentraten bewaard in PASIII: wat is het maximum? Ido Bontekoe, Davina Sijbrands, Pieter van der Meer, Johan Lagerberg, Dirk de Korte Sanquin Bloedbank, Product- en Procesontwikkeling, Amsterdam

Inleiding / doel: Voor trombocyten is glucose de belangrijkste energiebron en in trombocytenconcentraten (TCs) bereid uit 5 buffy coats en bewaarvloeistof PAS III (Fresenius) wordt de [glucose] bepaald door de CPD-plasma uit de buffy coats. Bij hoge trombocyten (PLT) aantallen is echter gebleken dat de glucose aan het eind van de bewaartermijn opraakt. In de beperkte validatie was de [glucose] op dag 8 vaak <1 mM bij PLT 3.8-4.0x1011 terwijl bij PLT 4.0-4.2x1011 de [glucose] meestal 0 mM was. TCs met 3.8-4.0 x1011 worden daarom in de routine goedgekeurd maar gelabeld als “zo spoedig mogelijk uitgeven”. De wens is om op basis van data uit routine productie de bovengrens te verhogen tot 4.0x10 11 PLT. Methoden: Om de afkeurgrens verantwoord te verhogen werd gesteld dat TCs met PLT 3.8-4.0x1011 (groep A) superieur dienen te zijn in [glucose] op dag 8 ten opzichte van TCs met PLT 4.0-4.2x1011 (groep B). Gedurende 6 maanden werden alle geproduceerde TCs in PASIII met PLT>384x10 9 (ook met >424x109 = groep C) bewaard gedurende 9 dagen en regelmatig bemonsterd voor bepaling van de in vitro kwaliteit. Resultaten: Zie tabel. In alle TCs was t/m dag 9 goede swirl aanwezig. De pH vertoonde tijdens bewaren een lichte daling (tot >6.75) maar steeg na dag 7 of 8. Deze parameters voldeden aan de Richtlijn Bloedproducten. Op dag 8 was het percentage TCs met [glucose] >0 mM in alle groepen vergelijkbaar. Opvallend waren verschillen in activatie (CD62P expressie) en apoptose (Annexine A5 binding) die in groep A het hoogst was. Conclusie / discussie: Het maximale aantal trombocyten in TCs in PASIII kan op basis van dit onderzoek niet worden verhoogd omdat in minder dan 55% van de eenheden met meer dan 3.8x1011 PLT trombocyten nog glucose aanwezig is op dag 8. De stijging van de pH na dag 7 of 8 heeft mogelijk te maken met bicarbonaat vorming: Glucose wordt verbrand via de glycolyse waarbij lactaat wordt gevormd en de pH daalt; na opraken van de glucose wordt mogelijk meer acetaat uit PASIII, middels de citroenzuur cyclus als energiebron gebruikt; hierbij ontstaat bicarbonaat waardoor de pH stijgt. Omdat de in vitro kwaliteit in alle TCs goed was, ongeacht het aantal trombocyten, zal een vervolg onderzoek worden gedaan waarin ook de acetaatconsumptie zal worden gemeten. TCs

A

B

C

384-404

405-424

>424

26

15

12

Volume, mL

273±16

275±18

273±14

PLT, x109

394±6

415±6

444±20

6.90±0.0

6.90±0.0

6.91±0.02

% TCs met [glucose] >0

4

4

39

mM

46

54

30.6±9.2**

37.3±5.3

31.4±8.5*

18.2±2.6**

PLT range, x109 n Dag 1

Dag 8 pH (37°C)

CD62P expressie, %

Annexine A5 binding, %

23.3±5.7

20.4±3.7

t-toets t.o.v. A: *p<0.05; **p<0.01

23. Vergelijking van 5 verschillende rode cel bewaarvloeistoffen Herbert Korsten, Dirk de Korte, Johan W Lagerberg, Pieter F van der Meer Sanquin Bloedbank, Afdeling Product en Proces Ontwikkeling, Amsterdam Inleiding: Erytrocytenconcentraten (RBC) worden standaard bewaard in SAGM (saline, adenine, glucose, mannitol). Tijdens bewaren gaat de kwaliteit van RBC achteruit, wat o.a. terug te zien is in cel lysis, verminderde vervormbaarheid en verlaagd energieniveau. Recent zijn er bewaarvloeistoffen ontwikkeld die deze achteruitgang in in vitro kwaliteit tijdens bewaren verminderen waardoor RBC langer bewaard kunnen worden. In een gepaarde studie werd de in vitro kwaliteit van RBCs in SAGM (controle) vergeleken met die van RBCs in PAGGS-M (Fresenius Kabi), PAG3M (Sanquin Research), Erythrosol-4 (Fenwal) en SOLX (AS-7, Haemonetics). Deze nieuwe vloeistoffen zijn met name ontwikkeld om het 2,3-difosfoglyceraat (2,3DPG) en het energieniveau (ATP-gehalte) van RBC tijdens bewaren beter te handhaven. Behoud van een hoog 2,3-DPG-gehalte vergemakkelijkt de zuurstofafgifte terwijl een hoog ATP-gehalte noodzakelijk is voor het functioneren en overleven van RBC in vivo. Doel: Het vergelijken van de in vitro kwaliteit van erytrocyten gedurende 56 dagen bewaren bij 2-6°C in SAGM, PAGGS-M, PAG3M, Erythrosol-4 en SOLX. Methode: Per experiment werden 5 overnacht bewaarde volbloed eenheden gepoold en gesplitst in 5 gelijke volumes. Van 4 afnamesystemen werd de inhoud van de SAGM zak vervangen door 110 ml PAGGSM, PAG3M, Erytrosol-4 of SOLX. De volbloed eenheden werden op de standaard manier bewerkt tot gefiltreerde RCCs in bewaarvloeistof. De RCCs werden gedurende 8 weken bewaard bij 2-6°C en regelmatig bemonsterd voor analyse van in vitro kwaliteitsparameters. Resultaten: De resultaten staan samengevat in de tabel. De filtratietijd was aanmerkelijk langer bij de alternatieve vloeistoffen, met name bij SOLX. RCCs in PAG3M, E-SOL en SOLX hadden een significant hogere ATP en 2,3-DPG concentratie ten opzichte van RCCs in SAGM. In RCCs met PAG3M bleef de 2,3DPG waarde hoog tot en met dag 56. De vervormbaarheid van de RCCs in PAG3M en in mindere mate bij Erythrosol en SOL X was lager dan bij de RCCs in SAGM. De onvervormbare fractie van de RCCs in PAG3M was veruit het grootst. Conclusie: SAGM en PAGGSM zijn prima bewaarvloeistoffen voor erytrocyten met een houdbaarheid van 35 dagen, behalve als waarde gehecht wordt aan aanwezigheid van 2,3-DPG. Nieuwe bewaarvloeistoffen zijn een goed alternatief voor erytrocyten vanwege de lage hemolyse (PAG3M), zorgen voor beter behoud van energiestatus (PAG3M en Erytrosol) en hoge 2,3-DPG concentratie (PAG3M en SOL X). Punt van aandacht bij de nieuwe bewaarvloeistoffen is de lagere

vervormbaarheid en hogere onvervormbare fractie. De betekenis van deze laboratoriumtesten voor een klinische situatie zijn onbekend. Punt van aandacht bij SOL X is de relatief lange filtratietijd.

Gemiddelde ± SD Filtratietijd RCC (min)

SAGM

PAGGSM 4

35

±

PAG3M 4

33

±

E-SOL 4

41

SOL X

25

±

±

6

72

±

26

pH dag 1

6,92

±

0,03 6,73

±

0,03 6,77

±

0,01 6,68

±

0,01 6,87

±

0,03

pH intern dag 1

6,85

±

0,04 6,80

±

0,02 7,00

±

0,03 6,97

±

0,02 7,01

±

0,03

ATP (µmol/g Hb) dag 35

3,78

±

0,25 4,31

±

0,09 5,18

±

0,42 4,33

±

0,54 4,60

±

0,42

2,3-DPG (µmol/g Hb) dag 21

0,51

±

0,24 0,64

±

0,26

16,5 8

±

6,95 1,97

±

0,62 2,92

±

1,57

Lactaatproductie* dag 1-35

0,09 2

±

0,00 0,08 8 3

±

0,00 0,12 9 5

±

0,01 0,09 5 2

±

0,00 0,10 5 1

±

0,00 9

Arca (Deformability)** dag 1

3,04

2%

2,88

8%

2,79

12% 3,13

15% 3,04

9%

dag 21

3,04

6%

2,79

17% 2,71

45% 2,79

29% 3,04

28%

dag 35

2,8 8

4%

2,7 9

37 2,5 % 4

48 2,7 % 1

40 2,8 % 8

34 %

* in mmol/1012 RBC/dag ** 1e getal is de deformability; 2e getal is de onvervormbare fractie (%)

24. In vitro evaluatie van rode bloedcelconcentraten na verwarming met een bloedverwarmer Johan Lagerberg1, Richard Vlaar1, Berry Teunissen2, Ron van Oudenallen2, Dirk de Korte1 1Afdeling Bloedcelresearch,

Sanquin Research, Amsterdam, 2The 37Company,

Amersfoort Inleiding. Een bloedverwarmer is in ziekenhuizen een hulpmiddel in de strijd tegen het afkoelen (hypothermie) van patiënten die bloedplasma, infuusvloeistof of bloedproducten toegediend krijgen. Door onderkoeling bij een operatie te voorkomen, is er minder kans op complicaties en wordt het herstel bevorderd. De The 37Company heeft een bloedverwarmer ontwikkeld met lage flow, Fluido®Compact, die geschikt is voor het verwarmen van rode bloedcelconcentraten (RCC). De Fluido®Compact, bestaat uit een controle-eenheid, verwarmingsmodule

en disposable set. De disposable set bestaat een verwarmingscassette waar de te verwarmen vloeistof doorheen loopt. Doel: Evalueren van de in vitro kwaliteit van RCC na verwarming met de Fluido®Compact. Methoden: Om de slechts mogelijke condities te simuleren, werden zowel leukocyt verwijderde (LD) als niet-leukocyt verwijderde (non-LD) RCC in SAGM gebruikt, die gedurende 35-50 dagen waren bewaard bij 2-6°C. Om de capaciteit van de verwarmer te testen werden, waar aangegeven, pools van 3 RCC gebruikt. Vlak voor verwarming werden de RCC uit de koelkast gehaald. De disposable set werd geprimed met 0.9% NaCl-oplossing. De Fluido®Compact werd ingesteld op 39°C en de RCC werden met verschillende stroomsnelheden door het verwarmingsapparaat geleid. Zowel direct voor als na de verwarming werden de RCC geanalyseerd op cellulaire samenstelling en hemolyse. Resultaten: De resultaten zijn samengevat in de tabel. Na verwarming was de temperatuur van de RCC 30-37°C. De resultaten van RBC telling en hematocriet geven aan dat er, door de priming vloeistof, enige verdunning van het RCC optreedt tijdens de verwarmingsprocedure (waarden zijn ca. 20% lager). RBC parameters zoals MCV en MCHC werden niet beïnvloed door de verwarmingsprocedure. Na verwarming nam het aantal bloedplaatjes iets toe, vooral in condities 1 en 2, maar de absolute waarden zijn erg laag. De toename in plaatjes moet toegeschreven worden aan vesicles afkomstig van RBC, omdat erg geen plaatjes gevormd worden tijdens verwarmen. Toename in vesicles werd niet gezien bij uitgeschakelde verwarming. Het 64 dagen bewaarde RCC (1a) en de pool van 35 dagen oude non-LD-RCC (8), toonden geringe (0.1%) toename in hemolyse door verwarmen, in alle andere RCC was er geen sprake van toename in hemolyse. RCC die voor verwarmen voldeden aan de eis voor hemolyse (<0.8%) voldeden hier ook na verwarming aan. Discussie: Verwarmen van 35-50 dagen bewaarde LD-RCC of 35 dagen bewaarde non-LD RCC met de Fluido®Compact met een temperatuur van 39°C en verschillende stroomsnelheden, resulteerde slechts in minimale schade aan de RCC. De verwarmde RCC voldeden aan de eis voor maximale hemolyse (0.8%).

Test conditi e

1

2

3 4* 5# 6#

a* b c a b c

LD

Fluido®Compact instelling Temperatuu Flow r Maximum 39°C

LD

spontaan

RCC

39°C

LD LD LD LD

Maximum uit spontaan uit 65 mL/min 39°C spontaan 39°C 50 mL/min, onderbroke 7# LD n 39°C 50 mL/min, Non- onderbroke 8# LD n 39°C *: 60 dagen bewaard voor verwarming #: pool van 3 RCCs

Hct (L/L)

Trombocyte n (x10^9/L)

Hemolyse (%)

V 0.538 0.572 0.567 0.554 0.572 0.565 0.597 0.568 0.529 0.677

N 0.460 0.464 0.465 0.469 0.455 0.420 0.515 0.479 0.525 0.597

V 2 1 0 2 4 2 2 3 1 2

N 9 4 6 10 13 12 1 2 3 1

V 1.15 0.74 0.19 0.39 0.35 0.30 0.19 1.21 0.32 0.26

N 1.25 0.72 0.17 0.34 0.36 0.28 0.14 1.21 0.30 0.29

0.663

0.616

1

3

0.15

0.18

0.769

0.722

4

3

0.33

0.44

25. Validatie van de nieuwe CPA-PPD cryolijm disposable Lara de Laleijne-Liefting, Roland van der Velden, Gwen Mast, Dirk de Korte. Sanquin Bloedbank, Amsterdam Inleiding/ doel: Cryolijm is een humaan bloedproduct dat uit twee componenten bestaat: cryoprecipitaat en trombine. Cryoprecipitaat bevat een geconcentreerde hoeveelheid stollingsfactoren. Trombine is een katalysator voor de omzetting van fibrinogeen in fibrine. Als beide componenten samen worden gevoegd ontstaat er een netwerk van fibrine onafhankelijk van het stollingsproces van de patiënt. Cryolijm wordt geproduceerd met de CS-1, een compact apparaat dat in een disposable automatisch cryoprecipitaat en trombine uit 1 eenheid plasma bereidt. De productie van de vorige disposable is gestopt wegens overstroming in de fabriek. Recuperate Medical B.V. heeft in overleg met Sanquin een nieuwe disposable (CPA-PPD) ontworpen en geproduceerd, waarbij ook een aantal verbeteringen werden doorgevoerd. De validatie van de productie van cryolijm met behulp van deze nieuwe disposable wordt in dit abstract beschreven. Methode: Er werden 12 cryolijm producten met behulp van de CPA-PPD disposable geproduceerd. Van deze producten werd de hoeveelheid stollingsfactoren en trombine bepaald en vergeleken met de resultaten van de vorige disposable. De producten dienen te voldoen aan de eisen van Richtlijn Bloedproducten en vergelijkbaar of beter te zijn dan de producten van de vorige disposable.

Resultaten: De resultaten staan samengevat in de tabel. Bij 1 van de 12 procedures was de stoltijd 10,7 sec en voldeed daarmee net niet aan de eis van <10 sec. Bij deze eenheid was de trombine concentratie het laagst (7.8 IU/ml). Eén eenheid voldeed aan alle eisen uit Richtlijn Bloedproducten, maar viel niet binnen de range voor Fibrinogeen en factor VIII. De oorzaak hiervoor was dat het cryoarm plasma machinaal niet helemaal werd verwijderd, waardoor het cryoprecipitaat teveel verdund was, zodat dit product uitgesloten mag worden. De validatie valt dan binnen de gestelde eisen (zie tabel bij n=11). Het gemiddelde voor fibrinogeen komt overeen met de resultaten uit de validatie van de vorige disposable. De concentratie trombine en factor VIII was bij deze validatie lager dan de resultaten van de validatie van de vorige disposable, maar er was een stijgende lijn waarneembaar bij ervaren operators. Conclusie/ discussie: De validatie van de nieuwe disposable CPA-PPD voor de CS-1 device voldoet aan de gestelde eisen, op basis waarvan de disposable in gebruik kan worden genomen voor de productie van cryolijm-SQ. Na ingebruikname van de nieuwe disposable CPA-PPD zal de eerste periode (minimaal 50 procedures) in 100% van de producten de concentratie fibrinogeen en trombine activiteit worden bepaald om de bandbreedte in de praktijk te bepalen. Daarna kan een frequentie worden vastgesteld om deze parameters regelmatig te meten als procescontrole. Tabel Resultaten uit de validatie (n=12) Product

Parameter

Eis Range

Gem ± SD

% voldoet

Stoltijd

< 10 seconden

2.3 – 10.7

4.7 ± 2.9

92%

Opbrengst

5-20 mL

8 – 18

13.8 ± 2.9

100%

Stolsel aanwezig na 24 uur

Nvt

ja

100%

Cryolijm

Cryoprecipitaat Factor XIII

Streefwaarde Product

Parameter

(oude disposable)

Range

Gem ± SD

% voldoet

Trombine

Trombine (IU/mL)

≥ 5.0

7.8 – 20.6

14.7 ± 3.8 #

100%

3.9 – 13.0 (n=12)

9.5 ± 2.5 (n=12)#

92% (n=12)

7.7 – 13.0 (n=11)

10.0 ± 1.8 (n=11)#

8.5 – 24.2(n=12)

19.3 ± 4.1 (n=12)

16.3 – 24.2

20.3 ± 2.4

Factor VIII (IU/mL)

≥ 6.0

Cryoprecipitaat Fibrinogeen (mg/ml)

≥ 10.0

100% (n=11) 92% (n=12) 100% (n=11)

(n=11)

(n=11)

# p<0,01

26. Vergelijking zure elutiemethoden van DiaCidel (BioRad) en PeliStrip (Sanquin) met de ether elutiemethode in het aantonen van antistoffen tegen c, e, en K in PEG/buisjes en LISS/kolom methode Wendy PJ den Elzen, Karin JM Prinsen-Zander, Jaap Jan Zwaginga, Christa M Cobbaert, Arjan Albersen Leids Universitair Medisch Centrum Inleiding/ doel; Elutie is een onmisbare laboratoriumtechniek voor het verwijderen van antistoffen van gesensibiliseerde erytrocyten om o.a. de specificiteit te bepalen van gebonden antistoffen. De in ons laboratorium gebruikte ether elutiemethode heeft in dit opzicht nadelen: 1) ether is zeer licht ontvlambaar waardoor in een zuurkast gewerkt moet worden, 2) een groot volume cellen is nodig (4mL), 3) de methode kent een lange incubatie en veelvuldige wasstappen en 4) het eluaat kan vanwege de kleur alleen gebruikt worden in de PEG/buisjes methode wat een tweede beoordeling onmogelijk maakt. De zure elutiemethode is, in tegenstelling, eenvoudig, snel, veilig, toepasbaar op kleine volumina (1 ml) en mogelijk toepasbaar in de LISS/kolom methode. Voor een gevalideerde overgang vergeleken wij de ethermethode met twee zure elutiemethoden (DiaCidel/BioRad en PeliStrip/Sanquin). Het aantonen van anti-c, anti-e en anti-K alsmede de bruikbaarheid van de eluaten in zowel de PEG/buisjes als LISS/kolom methode werd hiertoe onderzocht. Methoden: Erytrocyten positief voor antigenen c, e, of K (Sanquin) werden gesensibiliseerd met antistoffen tegen de desbetreffende antigenen (monoclonaal, Sanquin). Monsters werden geschikt bevonden wanneer de DAT positief was met een IgG antistoftiter <1:32 (i.e. de laatste positieve reactie in een 2-staps verdunningsreeks). De drie elutiemethoden werden uitgevoerd volgens vigerende protocollen/gebruiksaanwijzingen. De eluaten werden getest in de IAT in zowel de PEG/buisjes als in de LISS/kolom methode met twee testcellen die positief (1 cel homozygoot, 1 cel heterozygoot) en twee cellen die negatief waren voor het betreffende antigeen. Als negatieve controles werden 3-cel screeningspanels uitgevoerd op de laatste waswaters en op eluaten van patiëntenerytrocyten die negatief waren voor de desbetreffende antigenen waaraan een pool van monoclonale antistoffen was toegevoegd. Resultaten: Reactiesterktes in de IAT in de PEG/buisjes methode waren vergelijkbaar (anti-c/anti-e) of hoger (anti-K) voor de zure elutiemethoden dan voor de ether elutiemethode (Tabel). Voor de zure elutiemethoden werden vergelijkbare of hogere reactiesterktes gevonden voor de LISS/kolommethode dan de PEG/buisjes methode. Er waren geen vals positieve reacties en alle negatieve controles waren negatief. Het eluaat van de zure ‘Pelistrip’ methode bleek ook bruikbaar in de LISS/kolom techniek.

Conclusie/ discussie: Dit onderzoek toont aan dat de zure elutiemethoden anti-K effectiever en anti-c/anti-e gelijkwaardig van erytrocyten elueren in vergelijking met de ether techniek. Tevens zijn beide zure elutiemethoden in de LISS/kolom te gebruiken. Deze resultaten in combinatie met het kleinere monstervolume en de analytische- en arbotechnische voordelen maken de zure elutiemethode een geschikt alternatief voor ether in ons laboratorium. Tabel. Reactiesterktes in IAT voor anti-c, anti-e en anti-K in PEG/buisjes en LISS/kolom methode voor de drie elutiemethoden. Methode DAT Identificatie antistof in eluaat pos / neg titer buisjes (PEG) kolom (LISS) negatieve negatieve positieve testcellen testcellen positieve testcellen testcellen cel cel cel 1 cel 2 3 cel 4 cel 1 cel 2 3 cel 4 homozygoot heterozygoot homozygoot heterozygoot anti-c Ether elutie pos 1:4 3+ 2+ n x x x x Zure elutie DiaCidel pos 1:4 3+ 3+ 3+ 3+ Zure elutie PeliStrip pos 1:4 3+ 3+ 3+ 3+ anti-e Ether elutie pos 1:16 4+ 3+ x x x x Zure elutie DiaCidel pos 1:16 4+ 3+ 4+ 4+ Zure elutie PeliStrip pos 1:16 4+ 3+ 4+ 4+ anti-K Ether elutie pos 1:4 1+ +/x x x x Zure elutie DiaCidel pos 1:4 3+ 2+ 3+ 3+ Zure elutie PeliStrip pos 1:4 3+ 2+ 3+ 3+ n = niet voldoende materiaal x = reactiesterkte niet af te lezen

27. Werken met de kleurenkaart voor het beoordelen van ongewenst rood van trombocytenconcentraten in plasma en in PASIII Willy Karssing, Lara de Laleijne-Liefting, Johan W Lagerberg, Pieter F van der Meer, Dirk de Korte Product- en procesontwikkeling, Sanquin Bloedbank, Amsterdam Inleiding doel: Visueel beoordeelde Trombocytenconcentraten (TC) in plasma en in PASIII mogen volgens Richtlijn Bloedproducten ‘Geen rode kleur’ (>6x10 9/L erytrocyten (RBC)) hebben. Onderzoek heeft uitgewezen dat visuele beoordeling subjectief uitpakt. Er is behoefte aan standaardisering. PPO ontwikkelde de Kleurenkaart, met foto’s van TC’s met verschillende hoeveelheden RBC. Onderzocht werd of de Kleurenkaart, als proefdruk met een gekalibreerde afdrukmethode gemaakt, werkbaar is voor afdeling Bewerking in dagelijkse routine bij de visuele beoordeling van visueel rode TC’s.

Methoden: Bewerking Amsterdam en Nijmegen beoordeelden met de proefdruk Kleurenkaart visueel rode plasma-TC en PASIII-TC. Ter controle telde PPO RBC met de Bürker telkamer. Resultaten: Resultaten samengevat in Tabel. Categorie 1: <0.5x109/L. RBC werd onderschat in de kleurbeoordeling, feitelijke RBC verontreiniging was >0.5x109/L. Onderscheid tussen categorie 1 en 2 is lastig, vooral bij PASIII-TC. PASIII-TC bevatten gemiddeld meer erytrocyten dan plasma-TC. Categorie 2: 2-4x109/L. Beoordeling komt overeen met Kleurenkaart. TCs werden niet onterecht ingedeeld in deze categorie. Categorie 3: 4-6x109/L. Beoordeling komt overeen met Kleurenkaart, maar spreiding is vrij groot. 3/10 plasma-TC werden ten onrechte goedgekeurd (RBC>6x109/L). Categorie 4: >6x109/L. Beoordeling komt overeen met de kleurenkaart. 3/10 TC in plasma werden ten onrechte afgekeurd. Conclusie / Discussie: Gebruik van de Kleurenkaart maakt het voor de afdeling Bewerking mogelijk rode PASIII-TC in te delen in categorie 1-2, categorie 3 of af te keuren op >6x109/L RBC (categorie 4). Met plasma-TC is het lastig om onderscheid te maken tussen categorie 3 (goedkeur) en categorie 4 (afkeur). Het lijkt daarom noodzakelijk om plasma-TCs uit zowel categorie 3 als 4 te herbewerken (of af te keuren)). Besloten werd om de huidige afdrukkwaliteit te handhaven, waarna de Kleurenkaart, met instructie en training in gebruik kan worden genomen door Bewerking. Ter controle bij leveringen van TC die, ondanks de controle bij Bewerking, volgens de ontvanger (intern is dat Uitgifte, extern zijn dat de ziekenhuizen) toch ‘te rood’ lijken te zijn zal de Kleurenkaart ook beschikbaar zijn op de uitgiftepunten. Tevens wordt er een praktijkproef ingezet met de Kleurenkaart in twee ziekenhuizen, het MUMC in Maastricht en het Franciscus Gasthuis in Rotterdam. Bij klachten van Uitgifte of ziekenhuizen over eenheden die als ‘te rood’ worden ervaren zullen de producten retour worden genomen en zal onderzocht worden of de klacht terecht is door het uitvoeren van een RBC telling. Tabel. Resultaten Bürker tellingen (gemiddelde ± SD) RBCx109/L Categorieën TC in plasma 1 <0.5 0.93 ± 1.03 2 ±3 (2-4) 3.14 ± 0.88 3 ±5 (4-6) 5.21 ± 1.65 4 ±8x (>6) 8.31 ± 2.68

TC in PASlll 1.96 ± 0.53 2.71 ± 0.98 4.01 ± 0.88 9.89 ± 2.36

28. Trombocytenconcentraten in bewaarvloeistof bereid uit zogenoemde ’droge’ buffy coats Jos Lorinser, Ido Bontekoe, Pieter van der Meer, Johan Lagerberg, Dirk de Korte Sanquin Bloedbank, afdeling Product- en Proces Ontwikkeling, Amsterdam Inleiding / doel: Door een aangepast programma voor de Compomat G5 te gebruiken kan ongeveer 20 ml meer plasma uit volbloed eenheden worden verkregen. Als gevolg van deze aanpassing hebben de buffycoats (BCs) een kleiner volume (ca. 25 ml) en een hogere hematocriet (ca.76%). Deze zogenoemde ‘droge’ BCs zijn niet geschikt voor de huidige procedure van trombocytenbereiding, omdat ze niet voldoen aan de hiervoor benodigde samenstelling qua volume en

hematocriet. Plasma’s en rode cel concentraten (RCCs) bereid met het aangepaste programma voldoen aan de eisen van de Richtlijn Bloedproducten. Omdat de ‘droge’ BC weinig plasma bevat is dit mogelijk een geschikt halfproduct om trombocytenconcentraten (TCs) te bereiden in bewaarvloeistof met minder plasma carry-over dan de huidige 35-40%. Het doel was om een centrifugeerprogramma te vinden waarmee een goede opbrengst wordt verkregen wanneer een TC in bewaarvloeistof wordt gemaakt m.b.v. ‘droge’ BCs. Methoden: Per experiment werden telkens 2x5 volbloed met het aangepaste Compomat G5 programma verwerkt. De RCCs en plasma’s werden vrijgegeven na controle op alle relevante parameters. De ‘droge’ BCs werden gebruikt om 2 TCs te maken met 300 of 400 mL bewaarvloeistof SSP+ (MacoPharma) waarbij gestart werd met het standaard centrifugeerprogramma voor TC in bewaarvloeistof (700g, 4 min 15 sec). Hierbij werd o.a. gebruik gemaakt van poolsystemen waaruit het filter was verwijderd zodat hetzelfde materiaal herhaaldelijk gecentrifugeerd kon worden. Resultaten: Met het standaard centrifugeerprogramma en aanvulling van de BCs met 300 ml SSP+ werd zonder filter een lage absolute opbrengst (gemiddeld < 250x109 trombocyten) gevonden met een relatief laag volume. Als het TC wel gefiltreerd werd was het verlies aan trombocyten in het filter veel groter dan in het huidige proces. Met een aangepast centrifugeerprogramma (700 g, 3 min 15 sec) en aanvulling met 400 ml SSP+ werd zonder filter een redelijke opbrengst (recovery 70%) verkregen (zie tabel). Echter, bij bereiding met een poolsysteem met filter werd opnieuw een veel lagere recovery gevonden, met een verlies van 20-30% van de trombocyten in het filter. Conclusie / discussie: Trombocytenconcentraten gemaakt uit vijf ‘droge’ BCs en 400 ml SSP+ als bewaarvloeistof geven met een aangepast centrifugeerprogramma een goede trombocyten recovery. Tijdens het filtreren treedt echter een onverklaarbaar hoog verlies aan trombocyten op. Nader onderzoek naar de oorzaak van dit hoge verlies is nodig om een TC met minder plasma te kunnen maken. Mogelijk is door gebruik van een ander leukocytenverwijderingsfilter de trombocyten recovery te verbeteren. Tabel: Resultaten TCs (per 2) met of zonder filter in bereidingssysteem BC-pool

TC

Restant

volume, mL

570-564

343-335

149-149

trombocyten, x109

434-506

303-353

83-75

n.v.t.

70-70

19-15

509-509

330-340

146-139

435-478

218-258

52-60

400 mL SSP+; 3’15’’ Zonder filter

Met filter

trombocytenrecovery, % volume, mL

trombocyten, x109

n.v.t.

50-54

12-13

trombocytenrecovery, %

29. Het effect van rejuveneren voor invriezen op de houdbaarheid van ontdooide rode bloedcellen Charles Lelkens, Vlaar, Gouwerok, Go, De Korte, Lagerberg Bloedcelresearch, Sanquin Research, Amsterdam Inleiding: Cryopreservatie is een goede manier om de houdbaarheid van bloedproducten te verlengen. Zowel de Militaire Bloedbank (O-pos/neg) als Sanquin (zeldzame bloedgroepen) heeft een voorraad ingevroren rode bloedcelconcentraten (RCC) beschikbaar om aan de transfusiebehoefte te kunnen voldoen. De ACP215 (Haemonetics®) maakt het mogelijk RCC in een gesloten systeem te (de)glyceroliseren. Hierdoor is de houdbaarheid na ontdooien verlengd van 24 uur naar 2 weken (in bewaarvloeistof AS-3). Verdere verlenging van de houdbaarheid zou de logistiek van het gebruik van ontdooide RCC nog verder vereenvoudigen. Eén mogelijkheid om de houdbaarheid na ontdooien te verlengen is vóór invriezen de energiestatus van de RBC te verhogen d.m.v. rejuvenatie. Doel: Onderzoeken of rejuveneren van 7 dagen oude RCC met PIPA-oplossing (Rejuvesol®, Citra Labs, Braintree, MA) vóór invriezen de houdbaarheid na ontdooien kan verlengen. Methoden: Leukocytengereduceerde RCC in SAGM werden 7 dagen bewaard bij 26°C, waarna vier RCC werden samengevoegd (n=4) en gesplitst. Van iedere pool werden 2 RCC geïncubeerd met Rejuvesol (1h, 37°C). Vervolgens werden alle RCC, m.b.v. een ACP215, geglyceroliseerd tot een eindconcentratie van 40% (w/v) glycerol en ingevroren. Na 14 dagen bewaren bij -80°C, werden de RCC ontdooid, gedeglyceroliseerd en geresuspendeerd in SAGM of AS-3 (van elke pool één gerejuveneerde en één niet gerejuveneerde). Tijdens bewaren bij 2-6°C werden de stabiliteit en de in vitro kwaliteitsparameters van de ontdooide cellen bepaald. Resultaten: Rejuveneren resulteerde in een toename van totaal adenylaat van 6.5 naar 8.2 µmol/g Hb (127% van waarde dag 1), 2,3-DPG steeg van 1.9 naar 30 µmol/g Hb. Rejuveneren had geen negatief effect op de hemolyse na ontdooien: hemolyse bleef onder 0.8% gedurende 7 dagen (in SAGM) of 35 dagen (in AS-3). Tijdens bewaren in AS-3 daalde het totaal adenylaatgehalte in niet-gerejuveneerde RCC naar 4.9 µmol/g Hb (72% van dag 1) en naar 6.5 µmol/g Hb (96% van dag 1) in gerejuveneerde RCC. Discussie: Rejuveneren resulteerde in een toename van 27% voor het totaal adenylaatgehalte. Högman et al. (Vox Sang 1985;48:257-68) hebben een goede correlatie aangetoond tussen totaal adenylaat en in vivo overleving, waarbij een totaal adenylaat gehalte van 82% een 24 h overleving van > 75% garandeert. Gebaseerd op een maximaal toelaatbare hemolyse van 0.8% en een totaal adenylaat van > 82% kunnen ontdooide RCC 7 dagen bij 2-6°C bewaard worden in

SAGM, terwijl gerejuveneerde, ontdooide RCC in AS-3 gedurende 35 dagen bij 26°C bewaard kunnen worden.

30. Evaluatie van 3 machines voor Multi Component Collecties Willy Karssing, Ido Bontekoe, Johan W Lagerberg, Pieter F van der Meer, Dirk de Korte Product- en procesontwikkeling, Sanquin Bloedbank, Amsterdam Inleiding / doel: De Trima Accel (Terumo BCT), MCS+ (Haemonetics) en Amicus (Fresenius Kabi) aferesemachine zijn geschikt voor multi-component-collecties (MCC). Hierbij kan in één procedure een dubbele hoeveelheid geconcentreerdetrombocyten, een eenheid erytrocyten (RCC) en een eenheid plasma afgenomen worden. Na MCC wordt PASIII aan de geconcentreerde-trombocyten toegevoegd en gesplitst in 2 trombocytenconcentraten (TC). Onderzocht werd de samenstelling en in vitro kwaliteit tijdens bewaren van MCCplasma, TC en RCC. Methoden: Er werden per aferesemachine 24 MCCs uitgevoerd. Plasma (uitsluitend MCS+ en Amicus) werd geanalyseerd kort na afname. TCs werden gedurende 8 dagen schuddend bewaard bij 20-24°C, RCCs werden 42 dagen bewaard bij 2-6°C. Gedurende de bewaarduur werden monsters genomen voor kwaliteitscontrole. Verschillen tussen de groepen werden geanalyseerd middels Student’s t-test, pwaarden <0.05 werden beschouwd als significant verschillend. Resultaten: De resultaten zijn samengevat in de tabel. Plasma. Alle plasmaproducten voldeden aan P-plasma eis voor volume. Amicus-plasma voldeed tevens aan de Q-plasma voor plaatjescontaminatie. TC. Alle TCs voldeden aan eis voor volume. MCS+-TC hadden een lager trombocytenaantal dan Trima-TC en Amicus-TCs. 3 MCS+-TC voldeden niet aan de eis voor trombocytenaantal. AmicusTCs hadden zichtbare aggregaten, ook nog na 24 uur bewaren. Na 8 dagen voldeden alle TCs aan eisen voor swirl en pH. MCS+-TC hadden hogere activatie (CD62P expressie) dan Trima en Amicus-TCs RCC. Alle Amicus-RCC voldeden aan eis voor volume, Trima- (2x) en MCS+-RCC (1x) voldeden niet altijd. Hb-gehalte van MCS+-RCC was significant lager dan dat van Trima-, Amicus en standaardproduct. Op dag 35 voldeden alle RCCs aan de eis voor ATP-gehalte en hemolyse. Conclusie / Discussie: Alle TCs, afgenomen met de Trima of Amicus, voldeden aan de in de Richtlijn Bloedproducten vermelde eisen qua samenstelling. Met de huidige instellingen, voldeed niet alle MCS+-TCs aan de eis voor minimum trombocyten aantal. Trombocyten afgenomen met de MCS+ waren significant meer geactiveerd. Voor de Amicus zijn de aggregaten mogelijk een gevolg van de wat lagere citraat concentratie in de producten in vergelijking met de andere apparatuur. Niet alle Trima- en MCS+-RCCs voldeden aan de eisen voor volume. MCS+-RCCs bevatten significant minder Hb dan de andere producten. Op dag 35 voldeden alle RCCs aan de eis voor ATP-gehalte en hemolyse. Verdere optimalisatie van MCC instellingen is nodig om TCs en RCCs te maken die volledig voldoen aan de eisen gesteld aan volume en samenstelling. Tabel. Kwaliteitsparameters van MCC bloedproducten Parameter (gem±SD) Eis Trima MCS+

Amicus

TC (n=12)_ Dag 1 Volume (mL) PLT (x1011) Dag 8 CD62P+ (%) Plasma (n=24) Volume (mL)

150-400 2.5-4.6

304±17 3.2±0.3 27±6

271±61 2.6±0.4 # 41±11#

240±5 § 3.4±0.5 § ◊ 28.4±7.4 ◊

P 100-650; Q 225-325 P<50; Q<50

-

205±25

220±9 ◊

PLT conc (x109/mL) 41±33 2±2 ◊ RBC (n=24) Standaard Dag 1 Volume (mL) >245 280±20 258±15* 314±19* 285±24 Hb (g/E) >40 53±2* 45±3* 55±2 55 ±2 Dag 35 Hemolyse <0.8 0.26±0.08 0.17±0.06* 0.22±0.15 0.27±0.09 (%) ATP (µmol/g Hb) >2.7 3.0±1.0 3.4±0.6 3.5±0.7 3.3±0.4 p<0.05: # MCS+ ↔ Trima; § Amicus ↔ Trima; ◊Amicus ↔ MCS+, * tov standaard

31. Determinanten voor orgaandonatie registratie van Nederlandse bloeddonors Eva-Maria Merz1, Katja van den Hurk1, Wim de Kort 1,2 1Sanquin

Research, Afd. Donor Studies, Amsterdam, 2Landsteiner Laboratorium, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam Inleiding/doel. In Nederland heerst een constant tekort aan organen voor transplantatie. Dit tekort leidt tot lange wachtlijsten en verminderde levenskwaliteit bij patiënten die op een donororgaan wachten. Het besluit van individuen om zich als orgaandonor te registreren hangt samen met verschillende demografische, culturele en persoonlijke factoren. Onderzoek naar motieven voor en attitude ten opzichte van bloed- of orgaandonatie laat vergelijkbare resultaten zien. Altruïsme en sociale verantwoordelijkheid zijn kernbegrippen bij het verklaren van iemands status als bloed- of orgaandonor. Onze studie kijkt daarom of vergelijkbare factoren ook de orgaandonor status van huidige bloeddonors kunnen verklaren. Methoden. We gebruikten data van Donor InZicht-II (2012; n = 20.063) om de samenhang van demografische, culturele en persoonlijke kenmerken met orgaandonor registratie te onderzoeken. Met behulp van regressie analyses is onder andere de voorspellende waarde van geslacht, leeftijd, opleiding, religie, politieke voorkeur, attitude en altruïsme voor het wel of niet als orgaandonor geregistreerd zijn in kaart gebracht. Resultaten. Over het algemeen zijn er in de huidige bloeddonor populatie meer geregistreerde orgaandonors dan in de algemene bevolking. Vrouwelijk geslacht en hogere opleiding liet een positieve samenhang met orgaandonatie registratie zien binnen bloeddonors. Bloeddonors met hogere altruïstische waarden, meer sociaal verantwoordelijkheidsgevoel en met een links-liberale politieke voorkeur hadden een hogere waarschijnlijkheid om als orgaandonor geregistreerd te zijn dan minder altruïstische, verantwoordelijke en politiek conservatievere bloeddonors. Verder hadden bloeddonors die zichzelf rekenden tot een bepaalde religie (katholiek,

gereformeerd, hervormd, protestant, anders) een kleinere waarschijnlijkheid om als orgaandonor geregistreerd te zijn dan niet religieuze bloeddonors. Conclusie/discussie. Onze resultaten laten zien dat demografische, culturele en persoonlijke kenmerken orgaandonatie ook binnen de specifieke groep van bloeddonors kunnen voorspellen. Samen met het feit dat orgaandonors oververtegenwoordigd zijn in de bloeddonor populatie bevestigt dit onderzoek eerdere hypotheses over het belang van bepaalde sociale kenmerken en pro-sociale waarden in hun voorspellende kracht voor donorstatus. Donors van ‘één soort’ (bv bloed) zijn wellicht eerder geneigd om ook donor van een ‘ander soort’ (bv organen) te worden.

32. Negatieve ervaringen en pre-donatie bloeddruk: de invloed van attitude en angst Maurits D. Hoogerwerf1,2, Anne van Dongen3, Rutger Middelburg4,5, Eva-Maria Merz3,6, Wim L.A.M. de Kort1,7, Monique H.W. Frings-Dresen2, Judith K. Sluiter2, Ingrid J.T. Veldhuizen8 1Sanquin

Research, Afdeling Donor Studies, Amsterdam, en Landsteiner Laboratorium, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam, 2Coronel Instituut voor Arbeid en Gezondheid, Academisch Medisch Centrum, Amsterdam, 3Sanquin Research, Afdeling Donor Studies, Amsterdam, 4Sanquin Research, Afdeling Klinisch Transfusie Onderzoek, Leiden,, 5Leids Universitair Medisch Centrum, Afdeling Klinische Epidemiologie, Leiden, 6Vrije Universiteit, Afdeling Sociologie, Amsterdam, 7Academisch Medisch Centrum, Afdeling Sociale Geneeskunde, Amsterdam, 8RadboudUMC, Afdeling Fysiologie, Nijmegen Inleiding/doel: Negatieve ervaringen bij bloeddonatie, zoals een vasovagale reactie of tijdelijke afkeuring, kunnen leiden tot een verhoogde stressreactie bij een volgende donatie. Deze reactie zou kunnen worden beïnvloed door de donors angst voor, en attitude ten opzichte van de donatie. Wij onderzochten het effect van attitude en angst op de invloed die negatieve ervaringen hebben op pre-donatie bloeddruk, als indicator van anticipatoire stress, bij de eerstvolgende donatie. Methode: Pre-donatie bloeddruk bij het derde bezoek aan de bloedbank werd vergeleken tussen twee groepen nieuwe volbloeddonors: donors zonder een negatieve ervaring in hun eerste twee bezoeken versus donors met een negatieve ervaring bij hun tweede bezoek. Het effect van attitude en angst (gemeten een maand voor het eerste bezoek) op de bloeddruk werd onderzocht met behulp van lineaire regressie en interactie analyse. Er werden onderscheid gemaakt tussen vier soorten negatieve ervaringen: vasovagale reacties, naald reacties, vermoeidheid en afkeur. Analyses werden gestratificeerd voor geslacht, en gecorrigeerd voor leeftijd en pre-donatie bloeddruk op baseline (bezoek één). Resultaten: In een groep van 1,106 nieuwe bloeddonors (70% vrouwen), rapporteerden 632 donors (57% van totaal) een negatieve ervaring tijdens of na het tweede bezoek. Na correctie voor confounders werden er geen significante associaties gevonden tussen eerdere negatieve ervaringen en de pre-donatie

bloeddruk bij het derde bezoek. Enkele significante interactie-effecten (p<0.05) werden gevonden, maar effecten waren niet eenduidig van richting en verschilden tussen mannen en vrouwen (zie Tabel 1). Conclusie/discussie: Deze studie vond in een groep nieuwe volbloeddonors geen aanwijzingen voor een invloed van attitude en/of angst op een mogelijke stressreactie na een negatieve ervaring. Daarnaast resulteerden negatieve ervaringen bij de nieuwe donors niet in anticipatoire stress bij de eerstvolgende donatie, er werd geen verhoogde bloeddruk gevonden na een negatieve ervaring. Tabel 1 - Significante interactie-effecten van negatieve ervaringen en attitude of angst op pre-donatie bloeddruk bij het tweede bezoek Hoofdeffect*

Interactie-effect*

Affectieve attitude en afkeur bij mannen

-19,5 (-39,0 tot 0,0)

4,0 (0,0 tot 7,9)

Diastole

Affectieve attitude en vermoeidheid bij vrouwen

18,5 (2,3 tot 34,8)

-3,9 (-7,1 tot -0,6)

Systole

Cognitieve attitude en naald reacties bij vrouwen

-33,8 (-62,4 tot -5,3)

4,9 (0,6 tot 9,2)

Systole

9,5 (0,3 tot 18,7)

-3,2 (-6,0 tot -0,4)

Diastole

Angst en afkeur bij mannen

Bloeddru k

* Data gerapporteerd als regressiecoëfficiënt met 95% betrouwbaarheidsinterval

33. Effecten van bloeddonatie op cardiovasculair risico: een literatuurstudie Karlijn Peffer; Anique D. ter Braake; Wim L.A.M. de Kort; Katja van den Hurk Sanquin, Divisie Research, Afdeling Donorstudies, Amsterdam Inleiding: Al in 1981 werd de hypothese geformuleerd dat bloeddonatie mogelijk tot een vermindering van het cardiovasculaire risico zou leiden. Bloeddonatie zou via het verlagen van de ijzervoorraad oxidatieve stress verminderen en daarmee het risico op onder meer atherosclerose. Tot op heden heerst er controverse over dit onderwerp, vanwege het ‘gezonde donor effect’. Dit ‘gezonde donor effect’ houdt in dat het niet of nauwelijks te onderscheiden is of een betere gezondheid van donors het gevolg is van bloeddonatie, of juist bloeddonatie mogelijk heeft gemaakt door selectie op gezondheidscriteria. Doel van dit onderzoek was om op systematische wijze de literatuur over effecten van bloeddonatie op cardiovasculaire ziekten en risicomarkers samen te vatten en de wetenschappelijke kwaliteit ervan te beoordelen.

Methoden: In Pubmed werd gezocht naar literatuur van studies onder groepen mensen die in principe voor bloeddonatie in aanmerking zouden komen (geen patiëntpopulaties). Er werd gezocht met een combinatie van zoektermen (MeSH termen en vrije tekst) synoniem aan ‘bloeddonatie’ en ‘cardiovasculair risico´ of ´cardiovasculaire ziekten´. Dit resulteerde in 182 artikelen, waarvan er na selectie op titel 33 overbleven en na selectie op abstract 14. De studies zijn stuk voor stuk, onafhankelijk door 3 personen (AtB, KP en KvdH) beoordeeld op interne en externe validiteit met behulp van ´Evidence-Based Richtlijn Ontwikkeling’ (EBRO) formulieren. Deze formulieren zijn op Cochrane standaarden gebaseerd en naar het Nederlands vertaald door de Dutch Cochrane Center. Interbeoordelaars verschillen in de resultaten zijn besproken totdat consensus werd bereikt. Resultaten: Negen van de 14 studies rapporteerden gunstige effecten van bloeddonatie. Dit betrof zes van de 11 observationele studies en alle drie de experimentele studies. De studies waren echter geen van allen van voldoende methodologische kwaliteit om de resultaten als hard wetenschappelijk bewijs te kunnen beschouwen (zie Tabel). Vijf studies die donors met niet-donors vergeleken hadden het meest last van het ‘gezonde donor effect’, maar ook andere studies vergeleken groepen die niet zomaar vergeleken kunnen worden. De experimentele studies hadden geen (geschikte) controlegroep en/of analyseerden alleen veranderingen binnen donors. Conclusie: Er is relatief weinig onderzoek gedaan naar cardiovasculaire effecten van bloeddonatie en de studies die gedaan zijn, zijn er tot op heden niet in geslaagd voldoende rekening te houden met het ‘gezonde donor effect’. Een gerandomiseerde trial is aan te bevelen om de methodologische problematiek van observationele studies te omzeilen en aan te kunnen tonen of bloeddonatie al dan niet gunstige effecten heeft op het cardiovasculaire risico. Tabel. Overzicht van studies met bijbehorende belangrijkste bevindingen en validiteit Studie

Design/ opzet Salonen, J Int Med 1995 Cross-over trial Meyers, Heart 1997 Cohort

Salonen, Am J Epidemiol 1998 Ascherio, Circulation 2001 Meyers, Transfusion 2002

Cohort Cohort Cohort

Belangrijkste bevinding Verminderde lipiden oxidatie Minder cardiovasculaire events Minder hartinfarcten Niet minder hartinfarcten Minder cardiovasculaire events

Vergeleken groepen Donors vs nietdonors Donors vs nietdonors

Validiteit (1-5)* 3

Donors vs nietdonors Donors vs nietdonors Frequente vs minder frequente donors

2

2

3 4

Van Jaarsveld, Atherosclerosis 2002

Trial

Verhoogd HDL cholesterol

Donors vs niet2 donors (niet random) Hoydonck, CrossGeen effect op LDL Donors vs niet3 Atherosclerosis 2004 sectioneel oxidatie donors Fernández-Real, Clin CrossVerbeterde Frequente vs 2 Chem 2005 sectioneel insulinegevoeligheid minder frequente donors Zheng, Arterioscler CrossBetere ‘flow-mediated Frequente vs 2 Thromb Vasc Biol 2005 sectioneel dilation’ minder frequente donors Zheng, Diab Care 2007 CrossGeen verhoogde Frequente vs 2 sectioneel insulinesensitiviteit minder frequente donors Engberink, Cohort Verminderde intimaDonors vs ex4 Atherosclerosis 2008 media dikte donors Houschyar, BMC Med Trial Verbetering Donors vs niet3 2012 risicomarkers donors Germain, Transfusion Cohort Niet minder Donors vs ex4 2013 hartinfarcten donors Peffer, Transfusion CrossNiet minder Frequente vs 4 2013 sectioneel atherosclerose minder frequente donors *De validiteit is weergegeven als 1: slecht, 2: zeer twijfelachtig, 3: twijfelachtig, 4: redelijk of 5: goed.

35. Een generieke methode om de overerving van antigenen te modeleren Joost van Sambeeck1,2, Peter Ligthart1, Wim de Kort1, Nico van Dijk2, Mart Janssen1 1Sanquin,

Amsterdam, 2Universiteit van Twente, Enschede

Inleiding: In het ‘BloodMatch’-project wordt gezocht naar een optimale matchingsstrategie van bloedproducten, waarbij rekening gehouden wordt met de beschikbaarheid van donors, kosten van typering, de beschikbaarheid van bloedproducten, logistieke kosten, maar vooral ook het risico op alloimmunisatie in verschillende patiëntengroepen. Omdat een optimale matchingsstrategie ook afhangt van de kosten die worden gemaakt voor het werven van donors met zeldzamere bloedgroepprofielen is het van belang om na te kunnen gaan welke inspanningen er precies geleverd moeten worden om dergelijke donors te vinden. In het verleden heeft Sanquin al succesvol familieleden van O-negatieve donors geworven, aangezien de kans dat zij ook het universele bloedprofiel hebben groter is dan bij een willekeurig individu. De exacte kans om een O-negatief familielid te vinden is echter onbekend. Daarom is een generieke methode ontwikkeld waarmee de kans

kan worden berekend dat bij een willekeurig gegeven bloedgroepprofiel van de donor, een bepaald specifieke bloedgroep bij een familielid wordt gevonden. Methoden: Voor het modelleren van de kans op overerving is gebruik gemaakt van de stelling van Bayes en van kwadratische stochastische operators. Met behulp van de ontwikkelde generieke methode is het mogelijk om ook de kans op zeldzame antigen combinaties bij familieleden te schatten. Resultaten: De kans op het vinden van een O-negatieve broer of zus bij O-negatieve donor is vijf keer zo groot als de kans om dit bloedgroepprofiel bij een willekeurig persoon in de Kaukasische populatie te vinden. Voor ouders van O-negatieve donors is deze kans bijna vier keer zo groot. Conclusie: De resultaten laten zien dat het werven van donors bij naaste bloedverwanten zeer effectief is, in het bijzonder voor broers en zussen. Dit geldt niet alleen voor ABO-D bloedgroepprofielen, maar ook voor andere complexere bloedgroepprofielen. Op basis van de resultaten kan een inschatting gemaakt worden van de inspanning die nodig is en de haalbaarheid om donors met specifieke bloedgroepprofielen te werven.

36. Gebruik van internationale productcodering voor bloed- en weefselproducten P.C. van Krimpen, J. Vonk Sanquin / ICCBBA Inleiding/ doel: In Nederland wordt ISBT128 gebruikt voor de identificatie van bloedproducten en een deel van de weefselproducten. JACIE en NetCordFACT hebben het gebruik van ISBT128 opgenomen in de richtlijn. Sanquin hanteert voor de bloedproducten de zogenaamde nationale productcodes, dat zijn productcodes die alleen in Nederland gebruikt worden. Deze productcodes zijn herkenbaar aan de letter “N” in de oog leesbare code en de data-identifier “&<” in de barcode. Producten worden in de ISBT128 systematiek uniek geïdentificeerd door de combinatie van het donatie identificatienummer (DIN) en de product code. Om de identificatie en uitwisselbaarheid van bloed- en weefselproducten te vergroten en te voldoen aan de eisen van JACIE, NetCordFACT en de nieuwe wetgeving rondom bloedstamcellen en andere weefselproducten (de Single European Code, per uiterlijk april 2017) zal de internationale ISBT128 productcode gebruikt moeten worden. Om dit te kunnen registreren moeten afnemers de registratiesystemen aanpassen. Om dit tijdig te kunnen realiseren is een gestructureerde aanpak noodzakelijk. Methoden: Op een gestructureerde wijze worden schema’s gemaakt waarin de totstandkoming van producten wordt weergegeven (productbomen). Ook wordt gebruik gemaakt van de Nederlandse ICCBBA database1 en de internationale

ICCBBA database2. In de schema’s worden de van toepassing zijnde vragen en omstandigheden benoemd. Resultaten: Met de schema’s en tabellen is het mogelijk om de impact van de aanpassing van productcodering van bloed- en weefselproducten te overzien. Met behulp van een risicoanalyse kunnen de noodzakelijke maatregelen geïdentificeerd worden. De maatregelen zijn afhankelijk van de gebruikte systemen bij de afnemers (zoals klinisch chemische / hematologische afdelingen, stamcellaboratoria, operatiekamers). Met behulp van kruistabellen kunnen de systemen van de afnemers ingericht worden, waarbij de voorkeur uitgaat naar een leesmethode die meerdere coderingssystemen herkent. Conclusie / discussie :Door de invoering van de internationale productcodes conform ISBT128 zullen ziekenhuizen, Sanquin en weefselbanken voldoen aan de internationale eisen, waaronder JACIE en NetCordFACT. De schema’s ondersteunen afnemers van bloed- en/of weefselproducten om de wijzigingen in de productcodes in hun systemen mogelijk te maken.

37. Selectie van K-compatibele bloedproducten voor vrouwen <45 jaar in Nederlandse ziekenhuizen Jessie Luken1,2, Henk Schonewille3, Bas Romeijn4, C. Ellen van der Schoot3, Anske van der Bom4 6, Rianne Koopman2, Masja de Haas1,5 1Sanquin

Diagnostiek, Immunohematologie Diagnostiek, 2Sanquin Bloedbank, Unit Transfusiegeneeskunde, 3Sanquin Research, Immunohematologie Experimenteel, Amsterdam, 4Sanquin Research, Donorstudies, 5Center for Clinical Transfusion Research, Sanquin Research en Universiteit van Leiden, Leiden 6Leiden University Medical Center, Clinical Epidemiology, Leiden Inleiding/Doel: De aanwezigheid van antistoffen met de specificiteit anti-K (voorheen anti-Kell) kan ernstige hemolytische ziekte van foetus en pasgeborene (HZFP) veroorzaken. Om K-immunisatie door transfusie te voorkomen, wordt sinds 2004 de selectie van K-compatibele erytrocytenconcentraten voor vrouwen <45 jaar aanbevolen in de richtlijn bloedtransfusie. In verschillende ziekenhuizen werd dit al voor 2004 gedaan. Om het effect van dit transfusiebeleid op het aantal zwangerschappen met K-antistoffen te beoordelen, zijn gegevens noodzakelijk over het moment waarop hiermee werd gestart in de diverse Nederlandse ziekenhuizen. Methode: Een elektronische enquête werd verstuurd naar 85 ziekenhuizen, gericht aan de klinisch chemicus die participeert in de bloedtransfusiecommissie. Deze enquête ‘Preventieve matching bij transfusie’ had betrekking op de verschillende patiëntencategorieën waarvoor een preventief compatibel transfusiebeleid is opgenomen in de richtlijn bloedtransfusie. De respons op de vragen over selectie van bloedproducten voor vrouwen <45 jaar werd geanalyseerd.

Resultaten: Van 53 (62%) ziekenhuizen ontvingen wij gegevens. De gegevensset representeert 66% procent van het gebruikte aantal erytrocyten concentraten in Nederland. In 24 (45%) ziekenhuizen werden al voor 2004 K-compatibele bloedproducten geselecteerd voor vrouwen <45 jaar, waarvan in 20 (38%) al voor 2000. In 2004 werd dit transfusiebeleid opgenomen in de richtlijn bloedtransfusie, en in dat jaar werd het ingevoerd in 11 (21%) ziekenhuizen. In 18 (34%) van de ziekenhuizen werd het transfusiebeleid in 2005 of later ingevoerd, waarbij dit in 9 (17%) ziekenhuizen na 2010 plaatsvond (zie tabel). Voor 2004

2004

Na 2004

Academische ziekenhuizen (7)

3

2

2

Topklinische ziekenhuizen (18)

8

5

5

Algemene ziekenhuizen (28)

13

4

11

Regio Noordwest (13)

6

2

5

Regio Noordoost (8)

1

4

3

Regio Zuidwest (15)

9

3

3

Regio Zuidoost (17)

8

2

7

Totaal ziekenhuizen (53)

24 (45%)

11 (21%)

18 (34%)

Conclusie/discussie; In 24 (45%) ziekenhuizen werden al voor 2004 K-compatibele bloedproducten geselecteerd voor vrouwen <45 jaar. Een effect op het aantal zwangerschappen met anti-K is daarom al mogelijk voor 2004. Omdat in 18 (34%) ziekenhuizen dit beleid pas na 2004 plaatsvond, kunnen transfusie-gerelateerde Kantistoffen nog steeds de oorzaak van HZFP zijn. Nauwkeurig uitvragen van de oorzaak van immunisatie tegen K is noodzakelijk om het effect van een K-compatibel transfusiebeleid op de prevalentie van K-antistoffen in de zwangerschap te kunnen vaststellen.

38. TRIP en TRIX: potentieel vermijdbare incidenten en transfusiereacties P.Y. Zijlker, J.C. Wiersum, A.J.W. van Tilborgh, A.G. Bokhorst TRIP Nationaal bureau voor hemo- en biovigilantie Inleiding: Met ingang van 2007 is de landelijke database TRIX (Transfusie Register Irregulaire antistoffen en kruis(X)proefproblemen) geleidelijk geïmplementeerd in de Nederlandse ziekenhuizen. Per februari 2016 heeft > 85% van de Nederlandse ziekenhuizen een operationele TRIX aansluiting. Geregistreerde informatie in TRIX betreft irregulaire antistoffen, IgA deficiëntie, kruisproefproblemen en allogene

stamceltransplantaties (SCT). Informatie die door het eigen ziekenhuis is ingevoerd wordt hierbij volgens de standaard TRIX-instellingen niet getoond. Methode: Retrospectief zijn in de TRIP database hemovigilantie-meldingen van 2005 tot en met 2014 in de categorieën acute hemolytische transfusiereactie (AHTR), vertraagde hemolytische transfusiereactie (VHTR), verkeerd bloedproduct toegediend (VBT) en overig incident (OI) beoordeeld op de vermijdbaarheid door TRIX informatie, indien TRIX volledig operationeel geweest zou zijn. Meldingen zijn als zeker vermijdbaar geclassificeerd indien irregulaire antistoffen of andere in TRIX opgenomen informatie elders al bekend waren, maar niet in het transfunderende ziekenhuis. Meldingen over een SCT-patiënt uit een ziekenhuis dat stamceltransplantaties uitvoert, of met betrekking tot irregulaire antistoffen die in het transfunderende ziekenhuis bekend zijn, zijn beoordeeld als mogelijk vermijdbaar, omdat deze informatie in TRIX staat en als deze getoond zou worden, een extra trigger kan geven waardoor de fout vermeden wordt. Tevens zijn incidenten betreffende onjuist gebruik van de TRIX database geïnventariseerd. Resultaten; In totaal zijn 62 meldingen aan TRIP gedaan die potentieel vermijdbaar zouden zijn geweest bij volledige implementatie van TRIX (61x VBT, 1x overig incident). Van het totaal waren 30 ‘zeker’ vermijdbaar. Hieruit was er in 21 gevallen sprake van een antistof die al geconstateerd was in een ander ziekenhuis en 9 gevallen van een stamceltransplantatie in een ander ziekenhuis, waarbij geen rekening werd gehouden met het specifieke transfusie-advies. Er zijn 10 meldingen geweest, waarbij voor een stamceltransplantatiepatiënt in het transplanterende ziekenhuis geen rekening werd gehouden met het specifieke transfusie-advies. In totaal is in 20 gevallen een nevencategorie gerapporteerd: 4x nieuwe antistofvorming, 1x AHTR, 9x VHTR, 1x milde niet-hemolytische koortsreactie, 5x overige reactie. Er waren geen meldingen betreffende IgA deficiëntie. Er zijn zeven meldingen, waarbij TRIX onjuist werd gebruikt: 5x VBT ten gevolge van ten onrechte niet raadplegen of wegklikken van een TRIX-hit, 1x bijna ongeluk en 1x overig incident, waarbij (vermoedelijk) een identificatiefout is gemaakt bij raadplegen resp. invoer van informatie in TRIX. Conclusie/ discussie: De meldingen aan TRIP tonen de potentie van TRIX om transfusiefouten te vermijden. TRIX zou een ondersteunende functie kunnen hebben bij de selectie van het bloedproduct als gekozen wordt om de informatie uit het eigen ziekenhuis te laten tonen. Er worden ook fouten betreffende de toepassing van de TRIX database aan TRIP gemeld. Transfusiefoute n vermijdbaar

Totaa 200 l 5

200 6

200 7

200 8

200 9

201 0

201 1

201 2

201 3

201 4

door TRIX Zeker

30

4

4

2

5

3

4

3

4

0

1

Mogelijk

32

5

5

5

3

4

3

0

2

0

5

Totaal

62

9

9

7

8

7

7

3

6

0

6

1

4

2

TRIX incident

7

39. Invloed van ABO-mismatch op behandelingsuitkomsten en transfusiebehoefte na niet-myeloablatieve, allogene perifere bloed stamceltransplantaties Nicole van Yperen, Inge Geelen, Con Jöbses, Yvonne Henskens, Harry Schouten 1, Erik Beckers1 1MUMC+

afdeling interne geneeskunde-hematologie, 2ASZ Dordrecht, onderzoeker, 3MUMC+ CDL laboratorium voor hemostase en transfusie

arts-

Inleiding: Geschikte stamceldonoren worden geselecteerd op basis van HLAtypering, CMV status, geslacht en leeftijd, maar niet op het ABO compatibiliteit. Weinig studies hebben de effecten op transfusiebehoeftes posttransplantatie vergeleken tussen ABO identieke en ABO mismatched (MM) patiënten. Doel: Evaluatie van ABO-MM op de behoefte aan erytrocytenconcentraten (ECs) gedurende de eerste 90 dagen posttransplantatie. Materiaal: Alle patiënten behandeld met een eerste allogene stamceltransplantatie na een niet-myeloablatieve conditionering tussen 2004 en 2014. Resultaten: 223 (124 ABO-identiek, 31 ABO major MM en 68 minor MM) patiënten konden worden geanalyseerd voor klinische uitkomsten. Multivariate analyse toonde geen invloed van ABO-MM op overall survival, acute GvHD incidentie, non-relapse mortaliteit (NRM) en GvHD mortaliteit. 195 (111 ABO-identiek, 27 ABO major MM en 57 minor MM ) patiënten konden worden geanalyseerd voor transfusie behoefte. Gedurende de eerste 30 dagen bleek hierin geen verschil te bestaan. Tussen de 3060 dagen posttransplantatie kreeg de ABO major MM groep meer transfusies. 14 patiënten (52%) gemiddeld 2,17 ECs vergeleken met 24 patiënten (22%) gemiddeld 0,68ECs in de ABO-identieke groep (p=0,001)en 16 patiënten (28%) gemiddeld 1,04 ECs in de ABO minor MM groep (p=0,028). Meer dan 5 eenheden werden toegediend aan 15% van de ABO major MM; 3% aan ABO-identieke (RR 5,0 95%CI 1,2 – 21,0 , p=0,028); en 5% aan ABO minor MM (RR 2,8 95%CI 0,7 – 11,7 , p=0,155). Tussen 60-90 dagen posttransplantatie was de ABO major MM groep nog steeds meer transfusieafhankelijk. 13 patiënten (48%) gemiddeld 2,22 ECs vergeleken met 23 patiënten (21%) gemiddeld 1,04ECs in de ABO-identieke groep (p=0,002)en 9 patiënten (16%) gemiddeld 0,58 ECs in de ABO minor MM groep (p=0,002). Gedurende deze periode ontvingen 19% van de ABO major MM patiënten meer dan 5 ECs, vergeleken met 6% in de ABO identieke (RR 2,9 95%CI 1,0 – 8,5 , p=0,048) en 2% in de ABO minor MM groep (RR 10,6 95%CI 1,3 – 86,0 , p=0,028). De verschillen in transfusiebehoefte bleken significant onafhankelijk van pretransplantatie Hb waardes. Pure red cell aplasia (PRCA) gedefinieerd als transfusie

afhankelijkheid vanaf dag 30 tot na dag 90 posttransplantatie werd gezien in 10 (37%) van ABO major MM patiënten. Conclusie: ABO major MM patiënten bleven langer en vaker transfusieafhankelijk (tot en met 90 dagen posttransplantatie) . Klinische uitkomstparameters verschilden niet tussen de groepen. Onze resultaten ondersteunen de procedure, waarbij ABO matching niet noodzakelijk is bij de selectie van stamceldonoren. Niettemin, indien mogelijk, zou ABO major MM moeten worden vermeden om noodzaak voor EC transfusies te verminderen.

40. Fatale sepsis na een trombocytentransfusie: de donor als mogelijke bron Judith G.H. Lie , Lieke B. van Alphen, Erik A.M. Beckers, Yvonne M.C. Henskens, Paul H.M. Savelkoul Maastricht UMC+ Inleiding: Posttransfusie bacteriemie/sepsis (Transfusion-Transmitted Bacterial Infection, TTBI) werd in Nederland in de periode 2002-2013 twintig keer gerapporteerd, meestal na een trombocytentransfusie. Eénmaal was een Staphylococcus aureus betrokken. Alle bloedproducten waren negatief in bacteriële screening met kweek. Doel: Deze analyse beschrijft de zoektocht naar de oorsprong van de bacteriële infectie na een trombocyten transfusie. Casus: Een man, 60 jaar, gediagnosticeerd met Multiple Myeloom, waarvoor hij in 2006 een autologe stamceltransplantatie onderging. Acht jaar later werd de behandeling gewijzigd in palliatieve zorg. In november 2014 meldde de patiënt zich bij de Spoedeisende Hulp, vanwege recidiverende en persisterende epistaxis ten gevolge van lage trombocyten (11 x 109/L), en werd in het ziekenhuis opgenomen voor een trombocyten en een erytrocyten (Hb 4,4 mmol/L) transfusie. De week voorafgaand aan deze opname onderging de patiënt met goed gevolg en zonder complicaties een poliklinisch toegediende transfusie met trombocytenconcentraat voor dezelfde klacht. De patiënt had geen koorts of tekenen van een infectie (WBC 5,5 x 109/L). Na de trombocyten transfusie (standaard 5 donor concentraat) trad een acute transfusiereactie op: koude rilling, pijn op de borst, maar zonder temperatuur stijging. Binnen 1 uur posttranfusie daalde het leukocytenaantal naar 0,5 x 10 9/L. De patiënt en het restant van het toegediende trombocytenconcentraat werden bacteriologisch gekweekt. Beide kweken waren binnen een dag positief met S. aureus. Twee dagen na opname overleed de patiënt op de verpleegafdeling aan een aanhoudende sepsis en optreden van orgaan falen onder adequate antibiotische behandeling. Bacteriologische analyse patiënt, product en donoren: Moleculaire stam typering met 2 verschillende technieken (Spa en Multiple-locus variable number of tandem repeat analysis (MLVA) typering) liet identieke S. aureus stammen zien in patiënt en trombocyten concentraat: Spa type t3164/MLVA type MT5077. Daaropvolgende neuskweken van de 5 trombocytendonoren toonden S. aureus dragerschap aan bij 4 van de 5 donoren. Stamtypering toonde aan, dat een van de 4 donoren drager was van S. aureus Spa type t3164, MLVA type MT5077.

Conclusie: Dit bron onderzoek wijst in de richting van een van de donoren als oorsprong van de besmetting. Hiermee is dit een van de weinig gemelde casussen waar S. aureus dragerschap in een donor gerelateerd is met een fatale acute sepsis bij een immuun gecompromitteerde patiënt na een gecontamineerde trombocyten transfusie. Aanvullend (epidemiologisch) onderzoek naar het vóórkomen van dit type S. aureus is noodzakelijk om dit verband te bevestigen.

41. Resultaten van een prospectieve, actieve hemovigilantie studie van thrombocytenconcentraten bereid met amotosalen-UVA fotochemische behandeling, in routine therapeutisch gebruik Rico S1, Ernst C1, Leitner G2, Gudmundsson S3, Buser A4, Gaponova T5, MartinRecio A6, Guerra L7, Parotti C1, Corash L1, Benjamin RJ1 1Cerus

Corp., Concord, CA, 2Medizinische Universität Wien, Bereich Transfusionsmedizin Vienna, Austria, 3 The Blood Bank Landspítali University Hospital Reykjavík, Iceland, 4 Blutspendezentrum SRK beider Basel Basel, Switzerland, 5 Federal Research Hematology Center Moscow, Russia, 6 Instituto Canario de Hematología y Hemoterapia, Islas Canarias, Spain, 7 Hospital Universitario de Gran Canaria Doctor Negrín, Islas Canarias, Spain Inleiding: Het fotochemisch behandelingsproces (PCT) gebruik makend van amotosalen en UVA-licht heeft een klasse III licentie voor het inactiveren van virussen, bacteriën, parasieten en leukocyten die thrombocytenconcentraten (TC) besmetten. Dit proces (INTERCEPT Blood System, Cerus Corp., Concord, USA) wordt gebruikt in > 100 centra in 20 landen, waaronder de VS (goedgekeurd december 2014). Doelstelling: Het veiligheidsprofiel van PCT-TC te beschrijven in routinematig gebruik. Methoden: Open label, observationeel, multicenter en actief hemovigilantie programma van PCT-TC transfusies tijdens routinematig gebruik. PCT-TC werden bereid door bloedbanken in 5 landen (Oostenrijk, IJsland, Rusland, Spanje en Zwitserland). Demografie, TC bereiding, transfusie- en veiligheidsdata werden verzameld. Alle bijwerkingen die optraden binnen 24 uur na transfusie, ernstige bijwerkingen (SAE's) en transfusiereacties (TR) tot zeven dagen na transfusie werden gedocumenteerd. Resultaten: Een totaal van 680 patiënten (58% mannelijk) ontvingen 2316 PCT-TC transfusies. De gemiddelde leeftijd was 50,3 (spreiding <1-93 jaar, waaronder 14 zuigelingen, 57 kinderen en 194 geriatrische patiënten). De meeste patiënten kregen PCT-TC’s voor hematologie-oncologie ziekten (60,4%) of chirurgie (17,4%). De TC’s waren aferese (Trima 55,3% of Amicus 39,6%) of volbloed/buffy-coat afgeleid (5,1%). De meeste PCT-TC’s waren ≤ 5 dagen oud (82,3%), in PAS-3 bewaaroplossingen (78,3% versus 21,7% in 100% plasma), niet gamma bestraald (99,9%) of CMV getest (78,3%). Het mediane aantal PCT-TC’s toegediend per patiënt was 2 (bereik 1-59). Twaalf AE's werden waargenomen (0,5% per transfusie) bij 9 patiënten (1,3%). Twee bijwerkingen waren mogelijk / waarschijnlijk gerelateerd (lichte allergische

transfusiereactie en niet-hemolytische febriele transfusiereacties), terwijl de rest mogelijk of niet waarschijnlijk gerelateerd waren. Drie mogelijke SAE’s werden gemeld (anafylactische transfusiereactie [mogelijk gerelateerd], koorts en hypotensie [waarschijnlijk gerelateerd]). Geen TRALI, TA-GVHD of transfusie gerelateerde sepsis (TRS) werden gemeld. Conclusies: Dit hemovigilantieprogramma van PCT-TC’s toonde een laag aantal acute transfusiereacties en een veiligheidsprofiel consistent met eerder gerapporteerde profielen voor conventionele TC’s en PCT-TC’s (Knutson 2015).

42. De 72 uur geldigheid van de irregulaire antistoffenscreen en kruisproeven, is niet voor alle patiënten een veilige keuze. Karlijn van Keulen, Ellen van der Zwan, Fokke Lindeboom, Lenneke Prinzen Franciscus Gasthuis, Rotterdam Inleiding: Patiënten met irregulaire erytrocyt-antistoffen hebben 20-25% kans op vorming van additionele antistoffen en daarom mag voor deze patiënten donorbloed niet geselecteerd worden via de type- en screen-methode. Ter preventie van nieuwe antistoffenvorming wordt Rhesus- en Kell-compatibel bloed gekruist. Antistofvorming na transfusie of zwangerschap vindt binnen drie maanden plaats. Bij secundaire immunisatie is de antistofvorming veel sneller, waardoor de periode tussen bloedafname voor antistofscreening en transfusie maximaal 72 uur mag zijn, volgens de CBO richtlijn. Bij een massale bloeding en geen tijd voor verdere analyses, kan ongekruist (O neg) bloed worden uitgegeven. Er is dan geen of een onvolledige antistoffencontrole en geen preventieve selectie van donorbloed. Dit geeft een groter risico op transfusiereacties en antistofvorming, zeker bij patiënten die al eerder een antistof hebben gevormd. Resultaten: Een 75-jarige vrouw presenteert zich op de SEH met beeld van hemorragische shock. Zij is bekend met anti-D antistoffen. Op CT wordt een rectushematoom gezien. Vanwege massaal bloedverlies, ontvangt mevrouw ongekruist 5 erytrocytenconcentraten, 2 omniplasma en 1 trombocytenconcentraat. Na transfusie worden alle andere klinisch belangrijke antistoffen uitgesloten en de kruisproeven met de reeds gegeven erytrocytenconcentraten zijn negatief. Zes dagen later ontstaat opnieuw een beeld van hemorragische shock waarbij de patiënte gereanimeerd wordt. Mevrouw ontvangt opnieuw ongekruist bloed; 4 erytrocytenconcentraten, 3 omniplasma en 2 trombocytenconcentraten. Na transfusie zijn de kruisproeven negatief, maar de antistoffenscreening positief. De patiënt heeft een anti-E gevormd, als gevolg van de eerste ongekruiste transfusie, waarvan slechts één erytrocytenconcentraat E-positief was. Bij reservering van nieuwe erytrocytenconcentraten wordt één kruisproef positief. Vervolgonderzoek in een nieuw bloedsample, acht uur later afgenomen dan het vorige kruisbloed, toont nu ook een anti-S. Haar antistofproductie draait op volle toeren! Vanwege het sterk toegenomen risico op een hemolytische transfusiereactie stemmen de klinisch

chemicus en intensivist af, dat toediening van ongekruist bloed voorkomen moet worden. Daarom zal altijd gekruist bloed klaarliggen, waarvoor minstens iedere 72 uur nieuw kruisbloed nodig is. Klinisch gaat de patiënte steeds verder achteruit, een dag later overlijdt zij aan multi-orgaan falen. Conclusie: In de meeste situaties is de geldigheid van 72 uur voor de antistoffenscreening en kruisproeven een veilig tijdsinterval, zoals beschreven in de CBO richtlijn transfusie. Deze casus illustreert dat mensen met irregulaire antistoffen makkelijk additionele antistoffen kunnen vormen en de 72 uur geldigheid van de screen en kruisproeven te lang kan zijn voor een veilige bloedtransfusie.

43. Spoedsectio bij zwangere met anti-Jr(a) antistof vanwege verdenking op foetale nood Alma Mingels1, Manon Dello1, Sandra Rouwette1, Jessie Luken2, Yvonne Henskens1, Erik Beckers3 1Centraal

Diagnostisch Laboratorium, Maastricht Universitair Medisch Centrum, 2 Unit Transfusiegeneeskunde, Sanquin Bloedbank, Sanquin Diagnostiek, 3 Afdeling Interne Geneeskunde, Maastricht Universitair Medisch Centrum Inleiding: Het Jr(a) antigeen is een hoog frequent antigeen, waarbij het negatieve fenotype meestal wordt aangetroffen bij Aziatische personen. Anti-Jr(a) antistoffen zijn meestal van het type IgG maar ook zeer zeldzaam. Er is weinig bekend over de hemolytische ziekte van pasgeborenen, hoewel er één fatale casus is beschreven. Casus; Deze casus betreft een vrouwelijke patiënte (31 jaar) van Chinese afkomst bij een zwangerschapsduur (G1P0) van 27 weken. Haar bloedgroep was B CcDEe K- Fy(b)- en S-. Bij haar waren anti-Jr(a) antistoffen aangetoond, met drie weken voor de sectio een ADCC <10% en titer van 1:32. Haar partner had bloedgroep O CcDee K- Fy(b)+ en S-. Drie dagen voor de sectio had zij een Hb van 6.6 mmol/l. Er waren twee geschikte donoren, die nog niet waren opgeroepen vanwege de vroege fase in de zwangerschap, stabiele situatie, de eindige houdbaarheid van erytrocytenconcentraten en de reservering voor in eerste instantie een andere patiënt. Ten tijde van het besluit (14:30 uur) tot een spoedsectio (vanwege suboptimaal CTG, oligohydramnion en intra-uteriene groeiretardatie) werd een erytrocytenconcentraat besteld uit de Sanquin Bank of Frozen Blood. Door bewerking (ontdooien 4-6 uur) en transport was de verwachte aankomsttijd rond middernacht. Dit ontdooide product was bestraald en gesplitst (O ccdee K- en Jr(a)-), waardoor ook geschikt voor de neonaat (houdbaarheid max 24 uur) hoewel niet meer als wisselproduct. De sectio (+/-16:00 uur) verliep ongecompliceerd (met gebruik van Cellsaver). De zoon (876 gram, Apgarscore 5-6-10) had een Hb van 7.4 mmol/l, reticulocyten 233·109/l, trombocyten 35·109/l en hepatomegalie. Zijn bloedgroep was B CCDee K- en geen aantoonbare antistoffen (IRA, DAT en eluaat neg). Hij kreeg trombocyten toegediend. Zijn totaal bilirubine was bij geboorte 49 umol/l, daarna oplopend tot 79 umol/l (wisselgrens) maar zakte dankzij intensieve fototherapie. De

volgende middag werden twee prematuriteit, het krappe Hb en werd daarna O ccdee K-, maar later Jr(a)+, met in de volgende milde vorm van hypertonie.

van de Jr(a)- pedipacks toegediend gezien de de beperkte houdbaarheid. Het transfusieadvies zonder kruisproef met moeder. De neonaat bleek maanden een goed klinisch verloop behalve een

Leermomenten: De anti-Jr(a) antistoffen hebben bij deze zwangere niet geleid tot hemolytische ziekte van de pasgeborene. Bij zwangeren met antistoffen tegen hoogfrequente antigenen is nauw overleg tussen alle betrokkenen essentieel. Gezien de beperkingen van producten uit de Sanquin Bank of Frozen Blood hebben verse producten afkomstig van ‘walking donors’ de voorkeur.

44. Positieve screening voor irregulaire antistoffen bij een zeven maanden oude zuigeling: alloantistofvorming op basis van eerdere bloedtransfusie? Yvonne Visser, Kimball de Bruyn Ziekenhuis Tergooi, Blaricum/Hilversum Inleiding: In een monster van een zeven maanden oud meisje wordt een Hb gemeten van 4,1 mmol/L. Het laboratoriumonderzoek toont daarbij een verhoogd aantal reticulocyten van 150x109/L. Deze zuigeling blijkt bekend met congenitale sferocytose. Bij de poliklinische controle constateert de kinderarts dat het goed met haar gaat, hoewel ze wat bleek oogt. Er is sprake van een goede voedings- en hydratietoestand en er lijkt geen sprake te zijn van klachten. Aangezien het meisje zich voor het eerst in dit ziekenhuis presenteert, wordt er bloedgroepserologisch onderzoek uitgevoerd. Daarbij blijkt haar bloedgroep 0 Rhesus D positief te zijn. De screening voor de aanwezigheid van irregulaire bloedgroepantistoffen is verrassend genoeg positief. Er wordt vervolgonderzoek ingezet om de oorzaak van deze positieve screening te achterhalen. Methode: De antistofscreening en het antistofidentificatie-onderzoek werden uitgevoerd in de BioRad/Diamed LISS kolomtechniek. Resultaten: Serologisch vervolgonderzoek toonde de aanwezigheid van een antistof met specificiteit voor het M-antigeen. Bij navraag ten aanzien van het transfusieverleden bleek het meisje eerder opgenomen te zijn geweest in een ander ziekenhuis, waarbij zij in het kader van haar anemie ook tweemaal met een bloedtransfusie werd behandeld. Het eerste erytrocytenconcentraat ontving zij op de leeftijd van vier weken, gevolg door een tweede één week later. Uit de bij Sanquin opgevraagde fenotypering van deze twee erytrocytenconcentraten bleek de Mantigeen status van de eerste eenheid onbekend, terwijl de tweede eenheid positief was voor het M-antigeen. De erytrocyten van de zuigeling werden als M-negatief getypeerd. Conclusie/ discussie: Van neonaten jonger dan 3 maanden wordt verondersteld op basis van eerdere studies dat hun immuunsysteem niet reageert met de vorming van

alloantistoffen na transfusie van erytrocytenconcentraten. Hier wordt bij een zuigeling van zeven maanden oud bij bloedgroepserologisch onderzoek een antistof met specificiteit voor het M-antigeen aangetoond. Deze antistof zou mogelijk gevormd kunnen zijn op basis van een transfusie van een M-positief erytrocytenconcentraat op de leeftijd van vijf weken. Als alternatieve verklaring voor alloimmunisatie zou het echter ook om een natuurlijk voorkomende antistof met specificiteit voor het Mantigeen kunnen gaan. Indien deze antistof aantoonbaar blijft in bloed afgenomen bij een volgende poliklinische controle, dan zal vervolgonderzoek worden uitgevoerd met als doel deze antistof nader te karakteriseren. Een persisterende aanwezigheid van een bij 37 graden Celsius reagerende incomplete antistof zou de ontwikkeling van een alloantistof op een erytrocytentransfusie in de tweede levensmaand door deze zuigeling aannemelijk kunnen maken.

45. Nieuw ontdekte aminozuursubstitutie in pyruvaat kinase leidt tot hemolytische anemie T.R.L. Klei, S.K. Kia, M. Veldthuis, B.M. Beuger, E. Clifford, J. Berghuis, F. Ait Ichou, R. van Bruggen, R. van Zwieten. Sanquin Inleiding: Pyruvaatkinase (PK) is essentieel voor energievorming in rode bloedcellen die daarvoor volledig afhankelijk zijn van anaerobe afbraak van glucose via de glycolyse. Sterk verlaagde PK activiteit, PK deficiëntie, is zeldzaam (1: 20.000) maar het meest voorkomende erfelijke glycolytische defect dat leidt tot hemolytische anemie van wisselende klinische ernst. Wij rapporteren een 7 jarige bloedtransfusieafhankelijke Iraanse patiënt met ernstige hemolytische anemie met een nog niet beschreven homozygote mutatie in het PK-Lever/Rode bloed cel (PKLR) gen die leidt tot een aminozuursubstitutie. Er is in deze patiënt gekeken naar PKLR RNA en eiwitexpressie, enzymactiviteit en stabiliteit. Methode: PK uit rode bloedcellen wordt vrijgemaakt en gebruikt voor de omzetting van phosphoenolpyruvaat naar pyruvaat. Met behulp van NADH wordt het gevormde pyruvaat vervolgens omgezet in lactaat. De enzymatische activiteit van PK wordt gemeten door de afname van NADH spectrofotometrisch te volgen. De PK stabiliteit is gemeten door voorafgaand aan de enzymbepaling de monsters te incuberen bij 530C. PKLR eiwitexpressie is bepaald d.m.v. western blot in reticulocyten en gekweekte erytroblasten van de patiënt. Reticulocyten zijn op basis van CD71 expressie geïsoleerd. Door middel van Sanger Sequencing zijn mutaties in het PKLR gen bepaald. Resultaat: Omdat de patiënt chronisch wordt getransfundeerd is gekeken naar PKLR expressie in reticulocyten. Ondanks een nauwelijks aantoonbare eiwitexpressie in deze jonge rode bloedcellen is in de patiënt toch nog ca 20% PK activiteit aantoonbaar vergeleken met de reticulocyten van een gezonde donor. De discrepantie, afwezigheid van rode cel PK en wel beperkte PK activiteit, kan mogelijk verklaard worden door expressie van een isovorm van PK, PKM2 in zowel

reticulocyten als erytroblasten van de patiënt. De hitte-stabiliteit van de PK activiteit in patiënten reticulocyten is verlaagd. Conclusie: De aminozuursubstitutie (G164R) leidt tot bijna afwezigheid van PKLR eiwit in de reticulocyten van de patiënt. De resterende PK activiteit is mogelijk toe te schrijven aan expressie van PKM2. Expressie van PKM2 in reticulocyten is onderwerp van onderzoek. De sterk verminderde glycolytische activiteit in reticulocyten door een gebrek aan PKLR activiteit is een waarschijnlijke verklaring voor de ernstige hemolytische anemie bij de patiënt.

46. Een familie met een afwijkende B antigeen expressie door een frame-shift mutatie Peter C. Ligthart1, Annika K. Hult2, Åsa Hellberg2, Jill R Storry2, Claudia C. Folman1, Annegeet van de Bos3, Masja de Haas1,4 , Martin L. Olsson2 1Sanquin

Diagnostiek, Amsterdam, 2Division of Hematology and Transfusion Medicine, Lund, Sweden , 3Radboud Academisch Medisch Centrum, Nijmegen, 4Centrum voor klinisch transfusiegeneeskundig onderzoek, Sanquin en Universiteit van Leiden, Leiden Introductie: De antigenen van het ABO systeem worden gevormd door enzymen die specifieke suikermoleculen binden aan de voorloperstructuur H. Het A allel codeert voor een enzym dat resulteert in ontstaan van het A antigeen. Het B allel voor het B antigeen. O allelen bevatten mutaties waardoor geen functioneel enzym gevormd kan worden en er geen A en/of B antigeen ontstaat. In dit abstract wordt een nieuwe mutatie in het B allel gepresenteerd met verschillende serologische bevindingen. Materiaal en methode: Serologisch onderzoek werd routinematig verricht bij een vrouw (32 jaar) in de 12e week van de zwangerschap. Onafhankelijk hiervan werd een ABO bepaling verricht bij haar broer(33 jaar). De serologie is verricht met standaardmethodes volgens voorschrift van de fabrikant. Gebruik is gemaakt van zowel kolom (Biorad en Ortho) als buisjes technieken (Sanquin, Ortho, Biorad, Immucor). De absorptie/elutie en minor cell population test werden verricht met polyclonale reagentia (Sanquin). Het DNA is geïsoleerd uit volbloed en vervolgens is de genotypering verricht behulp van PCR-RFLP, PCR-ASP en DNA sequentie analyse. Resultaten: Bij mevrouw was bij de bepaling van de ABO bloedgroep geen agglutinatie te zien met anti-A en anti-B. Het serum was echter alleen reactief met de A1 testerytrocyten en niet met B testerytrocyten. Ook bij lage temperatuur was er geen anti-B aantoonbaar. Met behulp van absorptie/elutie onderzoek kon de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid B antigeen aangetoond worden. De minor cell population test toonde aan dat die expressie afkomstig was van een kleine hoeveelheid erytrocyten (circa 2%). Bij de broer van mevrouw was bij de ABO bloedgroep bepaling geen reactie met anti-A en een zeer zwakke reactie met anti-B. Het serum was sterk reactief met A1 testerytrocyten maar niet met B testerytrocyten, ook niet bij lagere temperatuur. Met verschillende mono- en polyclonale reagentia anti-B en anti-A,B waren zwakke reacties te zien met een mixed-field karakter. De

genotypering laat zien dat beide patiënten een O allel hebben (verschillende vormen) naast een mutant B allel. In dit B allel is bij zowel broer als zus dezelfde mutatie te zien, een insertie van 5 nucleotiden in het begin van exon 1 (1_5dupATGGC). Conclusie/discussie: Bij een broer en zus wordt een mutant B allel aangetoond. Dit allel lijkt bij de zus te leiden tot de expressie van een normaal B antigeen op een subpopulatie van erytrocyten, terwijl er bij broer een iets hogere expressie van het B antigeen is die eveneens een, weliswaar sterker, chimeer beeld laat zien. De aangetoonde frame-shift mutatie in het B allel leidt tot een vervroegd stop-codon waardoor er geen werkzaam enzym zal worden gevormd. Echter, in beide casussen wordt toch B antigeen aangetoond. Omdat de mutatie aan het begin van het gen zit wordt er mogelijk in zeldzame gevallen toch een werkzaam enzym gevormd. Hierdoor zullen slechts enkele erytrocyten expressie van B antigeen vertonen wat serologisch overeenkomst met een chimeer beeld.