2017.09.28.
A vér élettana Karcsúné Dr. Kis Gyöngyi SZTE ÁOK Élettani Intézet, Szeged Összevont szeminárium 2017-09-26
TT-ok 8-13., vastagon szedett PIROS színnel #8 Nevezze meg a vérplazma fehérjefrakcióit, vázolja mérésük módszertani elvét (elektroforézis). Minden fehérjefrakciót illusztráljon egy-két példával. #9 Írja le a vérsüllyedés mechanizmusát, mérési módszereit, jelentőségét és normálértékét. #10 Reticulocyta fogalma, számolásának módja és jelentősége. #Az erythropoetin (keletkezés helye, trigger, funkció). #11 Definiálja az indirekt és a direkt bilirubint. #(UBG) keletkezése, vizeletbeli detektálásának jelentősége. #12 (Fehérvérsejtek) Ismertesse az immunglobulinok szerkezetét, típusait és működését. #13 Jellemezze a vércsoportok antigénjeit és a keringő antitesteket (Landsteiner-szabályok).
1
2017.09.28.
#Plazmafehérjék 60-80 g/l > 70 kDa Nem diffúzibilisek Leggyakrabban glikoproteinek (poliszacharid lánc, hexóz, frukóz), [kiv. albumin]! Funkciójuk: Kolloid ozmotikus nyomás fenntartása (albumin) Transzport Pufferelés (pH szabályozás) Proteolitikus enzimrendszerek komponensei (pl. véralvadás, komplement rendszer) Antiproteolitikus hatású fehérjék és proteáz inhibitorok Enzimek Immunglobulinok Modulátor- és akut fázis fehérjék Tumor markerek
Plazma/szérum fehérjék mennyiségi meghatározása Rutin laborgyakorlat: Biuret reakció Normál: 60-80 g/l, plazma esetén fibrinogén +2-6 g/l Hiperproteinaemia: oka lehet dehidratáció - renális folyadékvesztés; myeloma multiplex Hipoproteinaemia: fehérjevesztés - vérzés, égés; fehérjeszegény táplálkozás; malabszorpciós szindróma; májbetegség – csökkent fehérjetermelés; infekció – fokozott fehérje katabolizmus Diszproteinaemia: összetevők aránya változik Bizonyos betegségek jellemző változásokat idéznek elő a mennyiségi és/vagy minőségi összetételben
2
2017.09.28.
Vérplazma fehérjéi - elektroforézis Háttér: Fehérje lúgos közegben negatív (pH=8,6) Anód felé vándorolnak (Fehérjék mozgatása feszültségkülönbséggel) Sebesség a töltések számától, molekulatömegtől és mérettől függ Több savas As (glutaminsav, aszparaginsav), annál közelebb az anódhoz Különböző médiumok használhatók: papír, agaróz-gél, poliakrilamid gél – különböző felbontóképesség
Molekuláris szűrés is a gélszerkezetnek köszönhetően (20 frakció elkülöníthető) • Festés: • Ezüstözés (kis mennyiségek) • Oil-Red, Sudan-black (lipoprotein) • Perjódsav-Schiff (glikoprotein) • Specifikus szubsztrátok (enzimek) • Denzitometriás értékelés
Vérplazma fehérjéi - PAGE • Vizsgálat menete
SDS-PAGE
(www.bio-rad.com)
3
2017.09.28.
#Példák különböző fehérjefrakciókra Albumin 35-50 g/l Albumin/globulin diagnosztikus jelentőségű (1,5-2,5); csökkenés: májbetegségek, alultápláltság, égés, hasmenés
Antitripszin α1- globulin 2-4 g/l Gyulladásos folyamatokban véd a proteolízis káros hatásától és lokalizálja Hiánya májkárosodást okoz
Haptoglobin α2- globulin Szabad hemoglobin megkötése (RES kivonja) 0,5-2,2 g/l Akut fázis fehérjeként is viselkedik
Transferrin β-globulin Vaskötő fehérje 2-4 g/l Vashiányban növekedett szint
Egyéb módszerek 1. Radiális immundiffúzió (Mancini): Ag-At találkozás, specificitás, kvantitatív Agaróz lemez standard fehérje oldatok kalibrációs egyenes precipitációs gyűrű területe, illetve az átmérő négyzete és az antigén koncentráció között lineáris összefüggés van Immunelektroforézis: Agaróz Specificitás Semikvantitatív
Rakéta elektroforézis: Mennyiségi meghatározás
4
2017.09.28.
Egyéb módszerek 2. RIA ELISA Turbidimetria, nefelometria Biológiai aktivitás mérésével
Specifikus plazmafehérjék
CITOKINEK: -Kis molekulatömeg -Leukocyták kommunikációját segítik -Szolubilis, multifunkcionális mediátorok -Autokrin, parakrin, endokrin hatás -Pleiotropia, redundancia -Szinergista, gátló, moduláló jellegű 1. Interleukinok (IL) 2. Interferonok (INF) (antivirális, tumorok és autoimmun betegségek kezelése) 3. Tumor necrosis factor (TNF) 4. Transforming growth factor (TGF) (tumorok, szövetregeneráció) 5. Kolóniastimuláló faktorok (CSF) (csontvelő, sejtosztódás) 6. Adipokinek (zsírsejtek által szekretált!) AKUT FÁZIS FEHÉRJÉK CRP (C-reaktív protein) -Név: Pneumococcus sejtfalban levő C poliszacharidot megköti -Máj -1-8 mg/l (akár 50x) -Mediátorai: citokinek -A baktériumok sejtfalát duzzasztja -Segíti a nekrotikus sejttörmelék – kromatin, snRNP – felvételét -Aktiválja a komplementrendszert (klasszikus út) -Immunmodulátor Szérum-amyloid A (SAA) és P (SAP) -Több izotípusa ismert -Apolipoproteinként a lipidek szállítása Procalcitonin -Bakteriális gyulladás által indukált plazmaprotein
5
2017.09.28.
#Vérsejtek süllyedése Alvadásgátolt vérben a nehézségi erő hatására lesüllyednek 3 szakasz: Aggregációs: sebesség lassú, plazmafehérjék döntő szerepet játszanak az aggregátumok (rouleaux formation) kialakulásában (hidat képeznek) Precipitációs: aggregátumok kicsapódása a plazmában, sebesség nő Tömörülési: szorosan együtt süllyedő aggregátumok miatt csökken a sebesség
Normál értékek: Ffi: 2-6 mm/h Nő: 8-10 mm/h
Nem specifikus vizsgálat
Szedimentáció mérése (ERS) Westergren Na-citrát oldat, EDTA Gyorsabb süllyedés (>normál érték) Kor, anaemia, terhesség, makrocitózis, gyulladás, tumor Lassabb süllyedés (<normál érték) Hematokrit (ffi!), mikrocitózis, hipogammaglobulinaemia, spherocitózis
6
2017.09.28.
#Reticulocyta
Vvt prekurzor Tartalmaz: (bazofil anyagok) RNS, hemoglobin (34%), Golgi maradványok, mitokondrium, (esetleg s.mag maradvány) Csontvelőből véráramba (0,1-0,2 % vvt) (diapedesis) 1-2 nap érés után a maradék bazofil anyagok is eltűnnek érett erythrocyta
Retikulocyta számolása Jelentősége: a csontvelő erythropoietikus aktivitásáról ad információt Szükségessége: anémia differenciáldiagnosztika, terápiakövetés, csontvelő transzplantáció után, kemoterápia után regeneráció követése
7
2017.09.28.
Retikulocyta-számlálás módjai 1.
Brillantkrezilkék vagy új metilénkék festés után fénymikroszkópos számolás (gyakorlat!) (Hb, RNS kicsapódnak, jellegzetes golf labda alak) (időigényes és pontatlan)
2.
Automatizált metodikák: nagyobb a vizsgált sejtek száma Gyorsabb Reprodukálható eredmény kisebb a statisztikai hibalehetőség 1. az elektromos ellenállás (impedancia) mérésének elvén alapuló Coulter- számlálók egy sejt áthalad, megváltozik az elektromos ellenállás, hiszen az apoláris membránnal körülzárt sejtek sokkal rosszabb töltéshordozók, mint a körülöttük levő elektrolitoldat, tulajdonképpen nagy ellenállású szigetelőnek tekinthetők az ellenállás változása az áthaladó sejt méretével arányos, így az automaták az egyedi sejtméret meghatározásán keresztül a sejttípus azonosítására is alkalmasak 2. áramlási citométerek Optikai elven (fényszórás) működnek sejtnyalábra bocsátott adott hullámhosszú, monokromatikus, fókuszált lézerfényt a sejtek méretüktől és összetételüktől függően különböző törőszögekkel szórják jelölésére különböző fluoreszcens festékek alkalmasak, pl. auramin-O, tiazol narancs (TO), melynek molekulái 488 nm hullámhosszú lézerfénnyel gerjeszthetők
Retikulocyta számolás jelentősége > : fokozott vérképzés (oka lehet pl. vérvesztés, anémia vagy épp kezelése után) < : csökkent vérképzés (anémia (pernicious, aplasztikus, vashiány), sugárzás, fertőzés, csontvelő betegség) Az eredményt befolyásol(hat)ják: gyógyszerek Parkinson, rheumatoid arthritis, láz, malária, kemoterápia) Sugárterápia Antibiotikumok Terhesség Vérátömlesztés
8
2017.09.28.
#Erythropoetin Glikoprotein (citokin), 34 kDa 1977-ben izolálták Termelődés: vese (85-90 %, peritubuláris fibroblaszt-szerű interstitialis sejtek a kéregben és külső velőállományban – O2 fogyasztás!) máj (10-15 %) Hypoxia (vesében) szöveti HIF-2 transzkripciós faktor (hypoxia inducible factor2) EPO gén HRE (hypoxia response element) EPO Más stimulátorok: hipoxia nem-renális szenzorai, adrenalin, noradrenalin, prostaglandinok, spherocytosis Haase VH. Regulation of erythropoiesis by hypoxia-inducible factors, Blood Rev., 2013
HIF-EPO-VAS (hepcidin
ferroportin degradáció)
Renal EPO-producing cells
duodenal cytochrome b
Divalent metal transporter
HIF-regulált gének Hepcidin gátlása
ferroportin
Transferrin complex
Enterocyta, hepatocyta és RES ferroportin ↑
vas ↑
9
2017.09.28.
EPO receptor az erythroid progenitor sejten
EPO nem-erythroid hatásai
Wang et al., Erythropoietin, a Novel Versatile Player Regulating Energy Metabolism beyond the Erythroid System, Int J Biol Sci, 2014
10
2017.09.28.
EPO 2. leggyakoribb PED (performanceenhancing drug) Stroke, vérrög, infarktus
#Bilirubin
1-2 mg
Az orvosi élettan tankönyve, Digitális Tankönyvtár
11
2017.09.28.
Epefesték jellemzői Hemoglobinból (80 %), szöveti hemoproteinekből (mioglobin, citokrómok, enzimek) Antioxidáns hatás Nem konjugált bilirubin: van den Bergh-reagenssel alkohol jelenlétében ad lila elszíneződést indirekt reakció indirekt bilirubin Vesében nem filtrálódik, vizeletben nem jelenik meg (albumin) Fokozott vvt pusztulás, hemolízis, vérömlenyek felszívódása glukuronidképzés zavara Hiperbilirubinamia: > 40 µmol/l (sclera, bőr sárga, icterus, Kernicterus – véragy gát!) Perifériás vérben csak nem konjugált bilirubin (5-17 µmol/l)
Konjugált bilirubin: direkt bilirubin májsejt vagy epeszekréció zavar (sinusoidalis vérbe visszajut a direkt bilirubin) vízoldékony, hiperbilirubinaemia esetén vesében filtrálódik vizeletben megjelenik
Urobilinogén 80-90 % szterkobilinogénné oxidálódik, széklettel ürül 10-20 % keringéssel májba, vesébe Vesében: filtrálódik Különböző eredetű icterusok jellemző laboratóriumi leletei Típus
Prehepatikus
Hepatikus
Posthepatikus
Jellemző ok
Hemolízis ↑
Szövet károsodás
Obstrukció (epeút)
Szérum indirekt bilirubin (3-17 µmol/l)
++
+
Normál
Szérum direkt bilirubin
Nincs
+
++
Vizelet direkt bilirubin
Nincs
+
++
Vizelet urobilinogén (2(2-16 µmol/l)
++
++
Nincs
székletfesték
+, pleichrom széklet
halvány
Nincs, acholiás
Prehepatikus: hemolízis, hematoma, szerzett vagy öröklött hematolitikus betegségek Intrahepaticus: Gilbert-kór (transzportzavar), csökkent bilirubin felvétel vagy konjugáció, májsejtek szétesése, gyulladása Posthepaticus: epevezeték elzáródása (daganat, epekő, gyulladás)
12
2017.09.28.
A fehérvérsejtek (leukocyták) Szám: 5-8 000 sejt/µl Lymphohaematopoeticus őssejtből (haematopoetic stem cell, HSC) Vörös csontvelő, vérkeringés, nyirokrendszer, szervek Kvantitatív vérkép: leukocytosis(↑), leukopenia(↓)
Kvalitatív vérkép:a fehérvérsejtek százalékos eloszlása May-Grünwald-Giemsa festés Flow-cytometria (felszíni markerek)
A leukocyták típusai NEUTROPHIL - 50-70% átmérő: 10-12 μm mag: szegmentált (többlebenyű) granulum: kicsi, gyengén festődik élettartam: néhány óra (lépben, szövetekben napok) célpont: baktérium, gomba Phagocytosis (bekebelezés)
EOSINOPHIL - 2-4% átmérő: 10-12 μm mag: kétlebenyű granulum: nagyobb, hematoxilin-eosinos festéssel rózsaszín élettartam: 1-2 hét (néhány óráig van a keringésben) célpont: nagyobb paraziták, allergiás reakció
13
2017.09.28.
BASOPHIL - < 1% átmérő: 12-15 μm mag: kettő vagy háromlebenyű granulum: erős basophil festődés (kék) élettartam: néhány óra-nap Hisztamin felszabadulása gyulladás és allergia során – anaphylaxia
LYMPHOCYTA - 20-40% átmérő: 7-8 μm mag: nem lebenyezett, nagy, nem centrális élettartam: hetek-évek B sejt: antitestek termelése (plazmasejt) – humoralis immunitás T sejt: vírusokkal fertőzött és daganatos sejtek elpusztítása –cellularis immunitás NK (Natural Killer) sejt: nagy granularis lymphocyta, cellularis immunitás
MONOCYTA - 4-8% átmérő: 15-20 μm mag: bab alakú phagosoma a cytoplasmában élettartam: a keringésben néhány óra-nap, kilép a szövetekbe –macrophag (aktiváció nélkül a szövetekben hónapok-évek) phagocytosis (kórokozó, szöveti törmelék), antigének bemutatása Szöveti macrophag-vonal (reticuloendothelialis rendszer): Dendritikus sejtek(bőr, nyálkahártya) – fő antigénbemutató Kupffer-sejtek(máj): elöregedett vörösvértestek kivonása Microglia(agy) Histiocyta(többféle szerv) Mastocyta (hízósejt) - basophil granulocytához hasonló – allergiás reakció, gyulladás, sebgyógyulás [a szöveti hízósejt nem igazi macrophag vagy basophil] Osteoclast(csontlebontás)
14
2017.09.28.
Az immunválasz csoportosítása 1. Természetes immunitás • • •
első kontaktus a kórokozóval nincs memória mechanizmus: phagocytosis, komplementfehérjék (phagocytosis serkentése [opsonizáció], chemotaxis, cytolysis)
2. Szerzett (adaptív) immunitás • az antigén felismerésén alapul • sejtes (cytolysis) és humoralis immunitás (antitestektermelése) • memória (védőoltások) A fehérvérsejtek kommunikációja és szabályozása: CYTOKINEK A gyulladásos reakció kialakulása: Arachidonsav-származékok
Természetes immunitás Patogénhez asszociált molekuláris mintázatok (PAMP)(pl. baktériumok poliszacharid molekulái, vírus RNS): mikroorganizmus csoportokat, de nem specifikus kórokozókat jeleznek Mintázatfelismerő receptorok („Pattern recognition receptors [PRR]”): PAMP detekciója: Toll-like receptors NOD-receptor[sejt belsejében, vírusok] mannózkötő lektin [idegen poliszacharid felismerése]
Sejtek: MACROPHAGOK DENDRITIKUS SEJT GRANULOCYTÁK NK sejtek (vírus)
Kitapadás az endothelhez → „gördülés”, diapedesis (kilépés az endothel sejtek között a kapillárisban) → vándorlás a szövetekben
15
2017.09.28.
Természtes immunitás humorális tényezője – komplement rendszer Proteolitikus enzimkaszkád termelődés: máj- zymogén (=prekurzor) forma 3 úton aktiválódhat: Klasszikus út Lektin út Alternatív út Funkció: Cytolysis (pórusképzés a membránban – C5-9) Chemotaxis (C5a fragment) Opsonizáció (C3b, C4b) Kórokozók molekuláris szerkezetének megváltoztatása
Membrane attack complex (MAC)
16
2017.09.28.
Phagocytosis „Phago”=felfal-elpusztít, „cyto”=sejt, „sis”=folyamat Bekebelezése és megsemmisítése idegen anyagoknak Neutrofil granulocita, monocita
A szerzett immunitás Antigénbemutatás a membránban: MHC (major histocompatibility complex) az antigént kísérő bemutatófehérje (HLA –humán leukocyta antigén)
MHC-I minden sejten van nagy mértékű sokféleség, egyéni különbségek („az én sejtem”) része:TAP/tapasin antigénfeldolgozó molekula - cytotoxikus T-sejteknek prezentálnak antigént (vírusos sejt, daganatsejt)
MHC- II immunsejteken van (antigénbemutató sejtek) lysosomában feldolgozott antigénfragmentek (pl. baktérium) segítő T-sejteknek prezentál
17
2017.09.28.
Immunológiai „synapsis”: MHC/antigén – T-sejt receptora közötti kapcsolat A sejtek kommunikációját specifikus cytokinek segítik
A szerzett immunitás – T-sejtek Segítő T-sejt (T-helper, TH) CD4 membránmarkere van receptora MHC-II + antigén komplexet ismer fel 1-es típus: további phagocytosist serkent 2-es típus: B-sejtek serkentése specifikus antitesttermelés
Cytotoxikus T-sejt (T-killer, T-effektor) CD8 membránmarkere van MHC-I-et ismer fel - vírusos/daganatos sejt elpusztítása (apoptosis, membránperforáció) NK-sejt: hasonló cytotoxicitás, de nem feltétlen antigénspecifikus (természetes immunitás)
CD = Cluster of Differentiation (sejtfelszíni markerek)
18
2017.09.28.
Memória T-sejt CD8/CD4 pozitív is lehet hosszú ideig (évek) őrzik az antigén nyomát, új expozíciókor aktiválódás és osztódás
Regulátoros T-sejt (suppressor T-sejt) immuntolerancia: saját és bizonyos idegen antigének esetén gátlás centrális: thymusban autorekatív immunsejtek elpusztulása perifériás: elkülönülés (pl. agy, szemlencse, izületek), gátló cytokin (TGF), negatív kostimuláció (CD-fehérjék)
γδ T-sejt a sejt receptora a gyakori αβalegységek helyett γδ-ból áll nyálkahártya, intraepithelialis lymphocyta teljes fehérjéket ismer fel, nem MHC/antigénprezentáció függő
Szerzett immunitás – B-sejtek plazmasejtté alakulás és antitesttermelés antigénprezentáció B-sejt receptor = a sejt membránjában lévő antitest
19
2017.09.28.
#Immunglobulinok
IgG: leggyakoribb, phagocytáló sejtek Fc receptorához kötődik, placentán átjut IgM: ősi, kezdetben szintetizálódik IgA: nyálkahártya-secretumban IgE: cytophil antitest, basophil és hízósejt kapcsolódás IgD: B-sejt receptor antigénexpozíció előtt
Az immunválasz mediátoranyagai ARACHIDONSAV TERMÉKEK :
AKUT FÁZIS PROTEINEK CITOKINEK (lsd. 10. dia)
20
2017.09.28.
#Vércsoportok Kb. 35 vércsoport rendszer AB0 (és Rh): legjelentősebb Hazai elterjedés: A: 42%,B: 9%, 0: 46%, AB: 3% Antigének és antitestek (agglutininek) kialakulásának ideje: antigén - foetális élet 6. hetétől antitest - születés utáni 10. nap körül Az AB agglutininek kialakulásának oka: Baktériumfertőzés hatására (E. Coli - B; Strepptococcus - A)
#ABO vércsoport antigének
Bombay: H-antigénről hiányzik a fukóz további cukor nem tud kapcsolódni (genotípusstól függetlenül) vércsoport:0, de a genotípus más
21
2017.09.28.
Vércsoport meghatározása agglutináció
Csak apaság kizárására jó! Keresztreakció: Major teszt Minor teszt
Non-kompatibilis vér transzfúziója: Antitest-antigén reakció donor sejtek szétesése (hemolízis) hemoglobin felszabadulás, veseelégtelenség
#Landsteiner szabály (Karl Landsteiner, 1900)
22
2017.09.28.
Rh (Rhesus vércsoport) Protein antigének, 3 allél: c/C, d/D, e/E D-antigén Rh+ (85 %) Rh profilaxis: erythroblastosis fetalis elkerülése
2. terhesség!!!
23
