A vesebiopszia standard laboratóriumi vizsgálata Daru Krisztián, Dr. Iványi Béla SZTE ÁOK Pathologiai Intézet Szeged
Mintavétel • • • •
Intézetek között előre egyeztetett időpontban Percutan biopszia, vese alsó pólusából 16 G-s tűvel, UH-vezérelt biopsziás pisztollyal Minta tűről történő kíméletes eltávolítása fiziológiás sóoldatos lemosással • Legalább két szövethenger vétele az elegendő glomerulusszám biztosítására • Asszisztens sztereomikroszkóp alatt ellenőrzi és osztja a mintát a mintavétel helyén
Glomerulus sztereomikroszkópos jellemzői • • • •
Halványabb kéregállomány, sötétebb velőállomány Glomerulusok kapillárisgomolyagból álló apró vörös foltok Egyes betegségekben sárgás foltok Anémiás glomerulusok színtelenek, nehezen észrevehetőek
Glomerulusok száma • Minimum 20 gl/biopszia a reprezentatív • Optimális a szövethenger felosztása, ha: • FM – legalább 12 gl • IF – 5 gl • EM – 3 gl Vesebiopszia - kéregállomány
Szövethengerek osztása I. • Fiziológiás sóoldattal átitatott szűrőpapíron • Éles, egyszer használatos pengével – kíméletes, határozott vágási felszínek • Perirenális zsírszövet, vesetok eltávolítása • Háromféle vizsgálatnak megfelelően
Szövethengerek osztása II.
Mintavételi hibák • Klimatizált szobában a minta kiszáradhat • Szükség szerint fiziológiás sóoldattal nedvesítsük meg a mintát a felosztási procedúra alatt • A minta mechanikailag sérülhet – csipesszel történő összenyomás miatt • Nedves csipeszen lévő vékony folyadékréteg segítségével vegyük fel a mintákat
Immunhisztokémiai vizsgálat • Rutinszerűen: IF technika – fagyasztott mintából • Speciális esetben: IPO technika – paraffinba ágyazott mintából • Kis mennyiségű biopsziás minta – fagyasztás nem készül • Nem áll rendelkezésre fagyasztott minta – paraffinos konzultációs blokk esetében
Immunfluoreszcens technika • Fixálás: fagyasztással folyékony nitrogénben • Metszés: kriosztátban, -20 C°-on, 4 µm vastag sorozatmetszetek; a minta teljes elfaragása • Metszetek tárgylemezen való rögzítése: szárítással, 37 C°-os termosztátban • Rehidrálás: 0.1 M, pH 7.2 sós foszfát pufferben • Inkubálás antitesttel • Mosás PBS-ben • Fedés zselatin glicerinnel
Minta fagyasztása • Kriosztát tárgyasztalára, annak felszíni síkjával párhuzamosan, beágyazó gél segítségével felrögzített parafa darabkára • Hiba: nincs párhuzamosítás → mintát a metszés során ferdén faragom be, értékes részletek veszhetnek el
• Fagyasztás előtt a minta felszínén lévő folyadékot itatós papír segítségével eltávolítjuk • Hiba: jelentős folyadékréteg marad a minta felszínén → kialakuló jégkristályok a minta szerkezetét roncsolják
IF - Natív vesebiopszia • Direkt IF technika: IgG, IgA, IgM, AHF, C3, C1q: glomerularis betegségek Kappa, lambda: amyloidosis, könnyűlánc betegség • Indirekt IF technika: Alport nephropathia gyanújakor – IV-es típusú kollagén molekula alfa-láncai ellenes savók
IF – szemcsés, ill. lineáris festődés
IgG
IgA
IgG
IF - Allograft vesebiopszia • Direkt IF vizsgálat: HLA-DR: akut T-sejtes kilökődésre C3, IgG, IgA, IgM: glomerularis betegség kórismézésére • Indirekt IF vizsgálat: C4d: antitest-közvetített kilökődésre
IF C4d+ Humoralis rejectio markere
C4d
Fénymikroszkópos vizsgálat • 3 µm vastagságú sorozatmetszetek • Rotációs mikrotóm használata – egyenletes metszetvastagság biztosítása • Metszetek hármasával felszedve • 26 tárgylemez / eset – teljes biopsziás mintába való betekintés (Focalis sclerosis)
Hematoxilin-eozin • Tájékozódásra: sejtdússág, lobsejtek, hialincsepp (vörös), cilinder • Magfestés: Gill-féle hematoxilinnal (kék) • Eozin: citoplazma, fehérjecilinder, egyéb szövetelemek rózsaszínűek
HE
Ciklosporin-indukálta TMA
PAS • A bazális membránok, kefeszegély feltüntetésére → rózsaszín-piros festődés • Perjódsav és Schiff-reagens ne legyen elhasználódott → halvány a festés (egyszerre cserélni)
PAS
Transzplantációs glomerulopathia
Crossmon - trikróm • A fibrin (piros), valamint a kollagénrostok, ill. bazális membrán (kék) elkülönítésére • Oranzs-fukszin (Oranzs G + savanyúfukszin) • Foszforvolfrámsav - kötőszövetből vörös színt kivonja; meggátolja, hogy az anilinkék a már vörösre festett elemeket megfesse • Anilinkék • Gyors differenciálás ecetsavval, pirosas színig (kék szín kioldódhat) • Öblítés deszt. vízben • Gyors dehidrálás - ne fakuljon a szín • Derítés, fedés
Crossmon
FSGS
AFOG - trikróm • A bazális membránok és a kollagén (kék), fehérjecseppek (piros), immundepozitumok (vörösek) elkülönítésére • Refixálás: Bouin oldat, 1 óra, 60 °C • Folyó csapvízben mosás – fehér színig • Magfestés: Gill-féle hematoxilin (5’) • Csapvízben kékítés (5 ‘) • Foszformolibdénsav (5 ‘) • AFOG oldat (7 ‘) – anilinkék, savanyúfukszin, Oranzs G vizes oldata, pH 1.0 • Öblítés röviden csapvízben, gyors dehidrálás • Derítés, fedés
AFOG
IgA nephropathia
Jones-féle ezüst • • • •
• • • • • • •
A bazális membránok feltüntetésére Perjódsav (30 ‘) Csapvíz, dv Ezüst methenamin oldat (30” mh.sütő, barnásfekete színig 60 °C) Hexametilén-tetramin oldat + ezüst-nitrát oldat + nátrium-tetraborát oldat (bórax) Arany-klorid → szürke színig (2 ‘) Na-tioszulfát → lilás színig (5 ‘) Bouin oldat (10” mh.sütő, 3’ szobahőn) Foszforvolfrámsav (1 ‘) Chromotrope 2 R (15 ‘) Csapvizes öblítés Gyors víztelenítés, derítés, fedés
Jones
Membranosus nephropathia
Elastica • Rugalmas rostok feltüntetésére (rozsdabarna) • Festés orceinnel – savas-alkoholos közegben (30’) • Differenciálás alkohollal – háttér csökkentése • Magfestés, kékítés Transzplantációs arteriopathia
Kongóvörös • Amyloid kimutatására (barnásvörös) • Gill-féle hematoxilin (3’) • Kékítés csapvízben (5’) • A-oldat (kongóvörös + nátriumkarbonát vizes oldata) B-oldat (50%-os alkohol) 1:1 arányú friss elegye (3’) • Gyors öblítés dv-ben, alkoholban • Gyors víztelenítés • Derítés, fedés
Immunperoxidáz technika • • • • • • • • • •
Paraffinos metszetek deparaffinálása, rehidrálása Endogén peroxidáz gátlás – 3 % H2O2 (10’) Antigén feltárás proteázzal, illetve hővel Nem specifikus kötőhely blokkolás - Ultra V Block (Lab Vision) (7’) Primer antitest Real EnVision jelölő rendszer (30’, DAKO) Jel előhívás DAB segítségével, mikroszkóp alatt, szemkontroll mellett Magfestés, kékítés Dehidrálás, derítés Fedés
Antigén feltárás • • • •
Enzimatikus: XIV. típusú proteáz / TRIS puffer 37 Cº-os termosztátban IgG (30’), IgA, IgM, C3, C1q, Kappa, Lambda (20’) Mosás: TRIS pufferben (0.05 M, pH 7.6)
• • • • •
Feltárás hővel: 0.1 M citrát puffer, pH 6,0 (25’) Kuktában, légköri nyomáson Hűtés szobahőn (15’) C4d Mosás: 0,2 M PBS, pH 7,4
IF / IPO
C4d IGA
C3
IPO - előnyök, hátrányok • • • • • •
Előnye: Minta osztása – két részre (EM, FM) Paraffinos metszeteken végezhető – speciális festésekkel összevethető Fénymikroszkópos értékelés A jel és a struktúra együtt tanulmányozható A jel stabil, a metszetek tárolhatók Lehetőséget ad konzultációs tevékenységre
Nehézsége: • Háttérfestődés kiküszöbölése • Antigén feltárás standardizálása
Elektronmikroszkópos vizsgálat Fixálás • 3 %-os glutáraldehid (PBS-ben, 2% dextrán) • Minta 0.5x1.5 mm-nél ne legyen nagyobb • Hiba: nagy méretű minta közepe nem rögzül
• Glutáraldehid penetrációja lassabb, mint a formaldehidé • Több keresztkötés, erőteljesebb fixálás • PBS: fiziológiás körülmények • Dextrán optimális ozmolaritást biztosítja – penetrációt elősegíti
EM – Beágyazás I. • Automatában (3.5 óra) • PBS: glutáraldehid kimosása • 0.5 % OsO4 (PBS): utófixálás, fekete festék, nagyon lassan penetrál (1 óra, 45 °C) • Mosás PBS-ben • 50 majd 70 %-os alkohol • Telített uranilacetát oldat – blokkfestésre (5’, 30 °C) (70 %-os alkoholban oldva) • Víztelenítés felszálló alkoholsorban (70 %, 96 %, abszolút), acetonban • Epon 812 gyanta : aceton = 1 : 1 elegye (1 óra, 30 °C)
EM – Beágyazás II. • EmBed-812 beágyazó kit – átitatás 1 óra, 60 °C-os termosztátban • Epoxigyanta monomer • Keményítő adalék – térhálósít, polimer létrehozása • Lágyító adalék – metszhetőség javítása, ridegség csökkentése • Gyorsító adalék (akcelerátor) – katalizátor, térhálósodás sebességét növeli (BDMA – benzildimetilamin) • Hiba: részleges átitatás → rosszul metszhető blokk
• Kapszulázás – formába öntés • Polimerizáltatás – friss gyantával 60 °C-on, másnapig
EM – Blokk befaragása • Blokk trimmelése – mintát felülről borító gyantaréteg levágása, trapéz alakú felület (csonka gúla) kifaragása szetereomikroszkóp alatt • Két szemközti párhuzamos oldal kialakítása – alsó él hosszabb a felső élnél, magasság fele az alsó él hosszának • Metszeten könnyebb tájékozódás • Szalagszerű sorozatmetszetek
EM – Félvékony metszet • Blokk háromszög alakú üvegkés éléhez történő párhuzamosítása, befaragása • Metszés ultramikrotómmal, gyémántkéssel • Hiba: kés élén szennyeződés, sérült él → metszet gyűrődik, csíkos a metszet
• Metszetvastagság 0.7-1.0 µm • Metszet színe: zöldes (vékony), kékeslila (vastagabb) • Metszet szempillával való felvétele, tárgylemezre cseppentett desztillált vízcseppre helyezése • Szárítás 90 °C-os forró lapon – metszet kiterül, megtapad
Toluidinkék festés • Zsírtalanított tárgylemez alkohollal • Megszárított metszet • Néhány csepp 1%-os toluidinkék • Forró lapon festés • Csapvíz, deszt. víz • Szárítás forró lapon • Fedés műgyantával • Betekintés fénymikroszkóppal
EM – Ultravékony metszet • Félvékony metszet alapján elváltozást tartalmazó blokkrészlet kifaragása • Metszetvastagság: 70 nm • Metszet színe: tejfehér-sárgás (aranysárga – vastag metszet) • Metszet felvétele rézből készült, egy lyukú gridre kifeszített Formvar-hordozóhártyára • Hiba: lyukas hártya, porszennyeződés
Kontrasztozás • • • • • • • •
Automatizált – kombinált festés Uranilacetát oldat (0.25 %, 30 perc, 40 °C) DV mosás Reynolds oldat (Ólom-nitrát oldat + Na-citrát + Na-hidroxid) DV mosás Metszet szárítása Tárolás metszettartó boxban Kiértékelés - elektronmikroszkóppal
Laboratóriumi vizsgálatok • Immunhisztokémiai vizsgálatok • Fénymikroszkópos vizsgálatok • Elektronmikroszkópos vizsgálatok
95 %-os diagnosztikai pontosság
Köszönöm a figyelmet !
