GY N E C O LO GY
Új nanotechnológiai kezelési lehetőségek és genetikai prediszpozíció vizsgálata visszatérő vulvovaginális candidiasisban és bakteriális vaginózisban szenvedő, termékeny korú nők körében
Vanya Melinda dr1, Jakó Mária dr.1, Szabó Kornélia dr.2 , Nagy Nikoletta dr.3, Farkas Katalin dr.2 , Janovák László dr.4 , Bitó Tamás dr.1, Bártfai György dr.1, Kemény Lajos dr.2 , Dékány Imre dr. 4 , Goran Pjevac dr.5, Renata Grbović dr.5, Ksenija Kričković Pele dr.5, Dubravka Kljajić dr.5, Tihomir Vejnović dr.5, Aleksandra Novakov Mikić dr.5, Snežana Brkić dr.6 , Mirjana Bogavac dr.6 , Marija Kulauzov dr.6 Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Klinikai Központ, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Szeged (Igazgató: Pál Attila dr., egyetemi tanár) 2 MTA-SZTE Dermatológiai Kutatócsoport, Szeged (Vezető: Kemény Lajos dr., egyetemi tanár) 3 Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Klinikai Központ, Orvosi Genetikai Intézet, Szeged (Intézetvezető: Széll Márta dr., egyetemi tanár) 4 MTA-SZTE, Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoportja, Orvosi Kémiai Intézet, Szeged (Intézetvezető: Dékány Imre dr., egyetemi tanár) 5 Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Novi-Sad-i Egyetem, Novi Sad, Szerbia (Igazgató: Tihomir Vejnovic dr., egyetemi tanár) 6 Mikrobiológiai Intézet, Novi-Sad-I Egyetem, Novi Sad, Szerbia (Intézetvezető: Vesna Milošević dr., egyetemi tanár) 1
Összefoglaló: Célkitűzés: Vizsgálatunk célja az volt, hogy azonosítsuk és tanulmányozzuk a visszatérő vulvovaginalis candidiasis (RVVC) patogenezisében a genetikai tényezők szerepét és vizsgáljuk egy új kezelési mód kifejlesztésének lehetőségét. Anyag és módszer: A visszatérő vulvovaginalis candidiasis patogenezisében esetlegesen szerepet játszó gének single nukleotid polimorfizmusait (SNP-ket) elemeztük 336 nőbeteg perifériás vérmintáiból izolált genomikus DNS segítségével. Az eset csoport recurrens candidiasisban (n=266) szenvedő nőkből állt. A kontroll csoportot nem recurrens candidiasisban (n=70) szenvedő betegekből válogattuk össze. A dectin-1 (DECT -1) receptor és a CARD9 illesztő molekula SNP-it vizsgáltuk direkt szekvenálás során eset-kontroll tanulmányban. A DECT-1 a Candida-sejtek felismerésében játszik szerepet, a CARD9 pedig egy illesztő molekula, a sejten belüli jelátviteli mechanizmusok megindításában játszik szerepet az immunfolyamatok során. A résztvevőket arra is kértük, hogy válaszoljanak egy, a szocio-demográfiai és életmódbeli tényezőket felölelő kérdőívre, így vizsgálni kívántuk a különböző tényezők hatását az RVVC patogenezisében. A genetikai szekvenálással párhuzamosan különböző pH-érzékeny gombaellenes nanorészecskék in vitro vizsgálatát és különböző Candida-fajokra kifejtett hatását is tanulmányoztuk annak érdekében, hogy új kezelési módokat találjunk. Eredmények: A jelenleg a rendelkezésre álló SNP-adatbázisokban található adatok alapján tanulmányoztuk a DECT-1 gén esetén 16 potenciálisan polimorf nukleotid szekvenciáját és a CARD9 gén esetén 54 M AGYA R N Ő O R VO S O K L A PJA
19
77. ÉVFOLYAM 5. SZÁM | 2014. SZEPTEMBER
N Ő GYÓ GYÁ S Z AT
SNP-t. Előzetes eredményeink azt mutatják, hogy a magyar lakosság körében a legtöbb ilyen SNP ritka, vagy azok nem polimorfok. Kettő SNP-t azonosítottunk, amelyek esetében mindkét génnél (rs16910526, rs7959451 (DECT1) és rs4077515, rs10781499 (CARD9)) valóban polimorfizmus figyelhető meg. Következtetés: Eredményeink közelebb visznek, ezen krónikus betegség patomechanizmusának megértéséhez és reményeink szerint ezáltal lehetővé válik hatékonyabb és jól tolerálható célzott kezelési mód kialakítása, amely egyaránt hasznosítható a nőgyógyászati kezelésben csakúgy, mint a koraszülés megelőzésében. Az újonnan kifejlesztett nanokompozitok, és a pH-szenzitív gombaellenes szerek révén csökkenteni lehet a hatóanyag dózisát, és ezzel párhuzamosan a mellékhatások előfordulásának gyakoriságát is. Kulcsszavak: recurrens vulvovaginális candidiázis, dectin-1, CARD-9, ezüst nanorészecskék
Vanya M., Jakó M, Szabó K.,, Nagy N, Farkas K Janovák L, Bitó T, Bártfai Gy., Kemény L., Dékány I., Goran P., Renata G, Ksnija K. P., Dubravka K., Thomir V., Aleskandra N. M., Snezana B., Mirjana B., Mirja K.
Investigation of the possibility of new nanotechnological treatment modalities and genetical predisposition in women with recurrent vulvovaginal candidiasis and bacterial vaginosis
Summary: Objective: The aims of the study were to identify and examine the role of genetic factors in the pathogenesis of recurrent vulvovaginal candidasis (RVVC), and to develop new treatment modalities. Materials and methods: Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of candidate genes, that are important for the molecular pathogenesis of the disease, were analyzed from the genomic DNA obtained from the peripheral blood sample of 316 female patients. The case group consisted of women suffering from recurrent vulvovaginal candidiasis (n=266) and the control group consisted of patients with non-recurrent vulvovaginal candidiasis (n=70). SNPs of the dectin-1 (DECT-1) receptor that recognize the Candida cells, and CARD9, an important adaptor molecule that takes part in the intracellular signaling events leading to the initiation of immune events, were tested in case-control studies by direct sequencing. Participants were also invited to answer a questionnaire concerning their socio-economic background and lifestyle in order to evaluate the contribution of various factors to the pathogenesis of RVVC. Parallel with the genetic studies, in vitro testing of the pH sensitive release of different antifungal nanoparticles, and their effect on different Candida species were investigated in order to find new treatment modalities. Results: Sixteen potentially polymorphic nucleotides in case of the DECT-1 and 54 in CARD9 were studied, based on the available data found in various SNP databases. According to our preliminary results, the majority of these SNPs are either rare or they are not polymorphic in the Hungarian population. Two SNPs were identified in which both genes (rs16910526, rs7959451 (DECT1) and rs4077515, rs10781499 (CARD9)) showed polymorphism. Conclusion: Our results may enhance our current understanding of a chronic disease, furthermore, it may also suggest the design of more effective and well-tolerated, targeted treatment modalities that can be used in the gynecological practice and in the prevention of premature birth. The newly developed nanocomposites with a pH sensitive targeted release of antifungal drugs may help us to decrease the dose of the applied active components, and at the same time decrease the side effects. Keywords: recurrent vulvovaginal candidiazis, dectin-1, CARD-9, silver nanoparticles rő vulvovaginalis candidiasisról, akkor beszélhetünk, ha a fertőzés 3-szor, vagy annál többször fordul elő egy év leforgása alatt. Pontos prevalenciája és incidenciája nem ismert. Becslések szerint az RVCC előfordulása a reproduktív korú nőkben drasztikusan emelkedik, amely jelentősen
Bevezetés A Candida albicans (C. albicans) egy dimorph gomba, amely a hüvelyben megtelepedve tünetmentesen előfordul a termékeny életkorban lévő nők 30%-ában. VisszatéM AGYA R N Ő O R VO S O K L A PJA
20
77. ÉVFOLYAM 5. SZÁM | 2014. SZEPTEMBER
GY N E C O LO GY
befolyásolja a termékeny életszakaszban levő nők életminőségét, különösen azért, mert az esetek jelentős részében terápiarezisztens [1,2]. A nők többsége rendelkezik kimutatható, a Candidával szembeni humorális és sejtes immunitással, azonban a szülőcsatornán áthaladó magzat is fertőződhet [3,4,5]. Az elsődleges védővonalat a hüvely nyálkahártyáján a polymorphonucleáris leukocyták képezik kísérleti állatokban, ám ezek a sejtek jellemzően hiányoznak vaginalis candidiasisban szenvedő nőknél [6,7]. A C. albicans a kommenzális flórában megtalálható, kórokozóvá válásának hátterében álló pontos mechanizmust még nem azonosítottak [8]. A legújabb megközelítés szerint, az, hogy miért alakulnak ki bizonyos fertőzések és más kórképek egyes páciensekben, míg másokban nem, az eset és a kontroll csoport közötti genetikai különbségekre vezethető vissza. Ezek alapján azt feltételezzük, hogy különböző gének gyakori variánsai (single nucleotide polymorphisms = SNPs) fontos szerepet játszanak a gomba elleni védekezésben. Hasonló mechanizmus a bakteriális vaginózis esetén is valószínűsíthető.
1 ábra. Candida kapcsolódása a sejtmembrán felszíni receptorához és a kiváltott szignáltranszdukciós kaszkád sematikus modellje [9,10]
között megjelentek és felvilágosítást kaptak a programról. Amennyiben egyetértettek a vizsgálatban való részvétellel, időpontot kaptak felvételi vizsgálatra, ahol aláírták a beleegyező nyilatkozatot. Azok a betegek, akik vulvovaginitisre jellemző panaszokkal érkeztek a Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika Ambulanciáira, regisztrálásra kerültek az orvosi nyilvántartó-rendszerbe. A betegek a beleegyező nyilatkozat aláírásával hozzájárultak a genetikai szekvenálást is magába foglaló klinikai vizsgálatban való részvételhez. Ezek a páciensek részletes tájékoztatást kaptak a vizsgálat menetéről, mely rendelkezik a Tudományos Kutatás-etikai Bizottság (TUKEB) engedélyével (239-1/2012/EKU). A vizsgálatban résztvevők alkalmasságáról a kérdőív adatai és a hüvelyflóra mikrobiológiai mintavételi eredménye alapján döntöttünk. A 514 betegből 1 személy nem töltötte ki a kérdőívet, de a vérvétel és hüvely váladék levétel megtörtént. Súlyos nem kívánatos esemény a vizsgálati periódus alatt nem volt. A hüvelyváladék mikrobiológiai tenyésztésével határoztuk meg a tüneteket okozó kórokozókat. Az eredmények alapján a betegek recurrens vulvovaginalis candidiasis, és bacteriális vaginózis csoportba soroltuk. A vénás vérvétel során 5 ml alvadásában gátolt vért vettünk minden egyes résztvevőtől, amelyet a Szegedi Tudományegyetem, Bőrgyógyászati Klinikára küldtük genetikai elemzés céljából.
Anyag és módszer A vulvovaginitis tüneteinek csökkentése érdekében a szerb-magyar munkacsoport (Magyar munkacsoport: Szegedi Tudományegyetem, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika és Szegedi Tudományegyetem, Bőrgyógyászati és Allergológiai Klinika, Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoportja, Orvosi Kémiai Intézet; Szerb munkacsoport: Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika, Novi-Sad-i Egyetem, Mikrobiológiai Intézet, Novi-Sad-i Egyetem) fő célja volt olyan genetikai prediszponáló és protektív faktorok azonosítása, amelyek szerepet játszhatnak ennek a multifaktoriális kórképnek a kialakulásában. Vizsgálatunk a DECT1 és a CARD9 gének szerepére összpontosult, melyeket a szakirodalmi adatok alapján [9-10] választottuk ki. Ezek alapján mindkettő szerepet játszik abban a szignáltranszdukciós folyamatban, ami a hámsejtek C. albicansra adott válaszreakcióját elindítja. Ez a gomba áll a visszatérő krónikus vulvovaginalis candidiasis (RVVC) kialakulásának hátterében. A kiválasztott gének ritka mutációiról bebizonyosodott, hogy egy hasonló betegség, a recurrens mucocutan candidiasis kialakulásában is jelentős szerepük van (1.ábra).
Genetikai analízis
Betegbevonás és kérdőíves felmérés
Annak érdekében, hogy az eredeti hipotézist vizsgálhassuk molekuláris genetikai módszerekkel, olyan örökletes, egy nukleotidot térintő eltéréseket kerestünk a DECT1 és a CARD9 génekben, amelyek prediszponálnak RVVC-re,
A vizsgálatba 514 reproduktív korú nőt vontunk be, akik a szegedi illetve a novi sad-i Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika járóbeteg rendelésén 2012.07.01 és 2013.10.30 M AGYA R N Ő O R VO S O K L A PJA
21
77. ÉVFOLYAM 5. SZÁM | 2014. SZEPTEMBER
N Ő GYÓ GYÁ S Z AT
vagy megvédik a hordozójukat az RVVC-től. Ez az elemzés a következő lépésekből állt: a) a genom DNS izoláció Biorobot EZ2-vel, b) a DECT1 és a CARD9 gén kiválasztott kódoló régióinak PCR amplifikációja, c) a PCR termékeinek agarózgél-elektroforézise és detektálása spektrofotometriával, d) a PCR termékek megtisztítása szekvenálás előtt (Exosap digestion), e) szekvenálás f) statisztikai analízis
rendszer esetén alacsony hüvelyi pH-n a nanorészecskék leadása olyan minimális, mely a normál hüvelyflórát nem károsítja, viszont a hüvelyi pH emelkedése (>4.5) esetén a hatóanyag leadás fokozódik, ezáltal a kórokozót rövid idő alatt eliminálja.
Eredmények A projekt keretében 514 vérminta analízise történt meg, 336 minta a Szegedi Tudományegyetem, Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáról, 178 minta a Novi Sad-i Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáról érkezett a Szegedi Tudományegyetem, Bőrgyógyászati Klinika Genetikai Laboratóriumába. A 336 magyar mintából 266 esetben RVVC-ben szenvedő reproduktív korú nőtől vettük, míg 70 nonRVVC résztvevőtől származott. A nem rekurrens csoportot alábbi 3 csoportra osztottuk (II-V). A résztvevők csoportok szerinti megoszlása a 1. és 2. táblázatban található. I. csoport: visszatérő Candida-infekcióban szenvedő betegek (RVVC), II. csoport: Candida-fertőzés csak egyszer volt kimutatható (non-RVVC) III. csoport: Trichomonas vaginalis fertőzésben szenvedő nőbetegek IV. csoport: Bakteriális vaginózisban szenvedő nőbetegek
Nanokompozitok in vitro tesztelése
Az EU-s projektünk keretében az SZTE, Orvosi Kémiai Intézet, Szupramolekuláris és Nanoszerkezetű Anyagok Kutatócsoportja olyan nanotechnológiai eljárást dolgozott ki, amely a különböző bakteriális és gombafertőzések nanotechnológiával való megelőzését, illetve ha már a fertőzés kialakult, annak megszűnését teszi lehetővé. A módszer poli-akrilsav (PAAc) és poli-metakrilsav (PMAAc), valamint a biológiailag lebontható polimereket tartalmazó pH- érzékeny gélhálózatba történő ezüst nanorészecskék beépítésén, illetve in situ szintézisén alapul. Ezeket az antimikrobiális hatású, biológialag aktív nanokapszulák, a baktériumokat in vitro akár 30-60 perc alatt elpusztítják. RVCC és bakteriális vaginózis esetében a vizsgálat úgy történt, hogy 5-10 nanométeres részecskéket ágyaztunk be olyan ultravékony gél filmbe, amely fertőzés jelenléténél, azaz csak a hüvelyi pH emelkedés esetén fejti ki antimikrobiális, illetve antifungális hatását. A pH érzékeny hatóanyag leadási
RVVC
Csoportok
Vizsgált betegek száma
csoport
266
II. csoport
43
III. csoport
1
IV. csoport
27
1. táblázat. A vizsgált betegek megoszlása a kimutatott kórokozó alapján
Alcsoportok
Candida
Trichom.
Baktérium
Betegek száma
1.
kimutatható
-
-
210
2.
kimutatható
kimutatható
-
3
3.
kimutatható
-
kimutatható
41
4.
kimutatható
kimutatható
kimutatható
12
1.
kimutatható
-
-
25
I. csoport
II. csoport non-RVVC
Betegcsoportok
III. csoport IV. csoport
2.
kimutatható
kimutatható
-
1
3.
kimutatható
-
kimutatható
16
4.
kimutatható
kimutatható
kimutatható
1
1.
-
kimutatható
-
1
2.
-
-
kimutatható
23
1.
-
kimutatható
kimutatható
4
2. táblázat. A különböző csoportokban kimutatható egyéb kórokozók előfordulása a klinikai anamnézis szerint
A DECT 1 gén esetén 16, míg a CARD 9 gén esetén 54 SNP-t vizsgáltunk, mindezek közül 4 (rs16910526, rs7959451 (DECT1) és rs4077515, rs10781499 (CARD9) bizonyult polimorfnak a magyar populációban és M AGYA R N Ő O R VO S O K L A PJA
a rs16910526 esetén szignifikáns különbség mutatható ki a RVVC és non-RVVC csoportban (p=0.014 és p=0.017) (4. táblázat).
22
77. ÉVFOLYAM 5. SZÁM | 2014. SZEPTEMBER
GY N E C O LO GY
rs16910526
RVVC
Non-RVVC
n (%)
n (%)
Genotípus frekvencia
n=266
n=70
TT
241 (90.6)
56 (80.0)
TG
25 (9.4)
14 (20.0)
GG
0 (0.0)
0 (0.0)
Allél frekvencia
n=532
n=140
T
507 (95.3)
126 (90.0)
G
25 (4.7)
14 (10.0)
Genotípus frekvencia
n=266
n=70
GG
184 (69.2)
52 (74.3)
GA
77 (28.9)
17 (24.3)
AA
5 (1.9)
1 (1.4)
p érték
(a)0.014*
(b)0.017*
rs7959451
DECT1
Co-domináns
Domináns GG
184 (69.2)
52 (74.3)
GA+AA
82 (30.8)
18 (25.7)
261 (98.1)
69 (98.6) 1 (1.4)
b.
0.406 b
Recesszív GG+GA
a.
0.705 a
AA
5 (1.9)
Allél frekvencia
n=532
n=140
G
445 (83.6)
121 (86.4)
A
87 (16.4)
19 (13.6)
1.0 b
0.420 b
Chi2 test 2x3 tábla Chi2 test 2x2 tábla
4. táblázat. DECT1 SNP-k különböző genotípusainak és alléljainak (domináns, recesszív, co-domináns) előfordulási valószínűsége a RVVC és a non-RVVC csoportban a vizsgált Magyar cohortban
hat, szisztémás szerekkel szembeni előnye, hogy kikerüli a máj „first-pass” mechanizmusát, ennek következtében lényegesen kevesebb mellékhatással rendelkezik, és a forgalomban lévő kezelési lehetőségekhez képest költséghatékonyabb. Az in vivo tesztelés elindítása még nem történt meg, ez fogja képezni a jelen projekt ipari felhasználásának a megvalósulását, amely hasonlóan európai uniós forrásból valósulhat meg.
Összefoglalás Először azonosítottunk olyan SNP-ket a DECT1 és CARD9 géneken, amelyek polimorfak a vizsgált népességben rs16910526, rs7959451 (DECT1) és rs4077515, rs10781499 (CARD9),. Az rs16910526 esetén szignifikáns különbség mutatható ki a recurrens és nem recurrens vulvovaginalis candidiasis csoportokban, ezért alátámasztva a DECT-1 gén, mint szignál-transzdukciós molekulát kódoló gén alléljainak pathogenetikai szerepet a krónikus fertőzés kialakulásában. A vizsgálat másik célkitűzése a pH-érzékeny antimikrobiális hatású nanokompozitok kifejlesztése és laboratóriumi körülmények közötti tesztelése és alkalmazása a genetikailag érintett, illetve hüvelyi fertőzésekre érzékenyebb női populációban. Az eljárás kifejlesztésre került és tesztelése is megtörtén in vivo körülmények között, az előállítás menetét szabadalom védi. Az új módszer előnye az antibiotikus kezeléssel szemben, hogy jelentősen kevesebb a mellékhatás és az emésztőrendszeri flórát sem érinti kedvezőtlenül, bár a kolonizációt nem csökkenti. Ilyen gyógyszer a kereskedelmi forgalomban még sehol a világon nincs. Reményeink szerint a kifejlesztett eljárást használni lehet különböző hüvelytamponok felületén, amely közvetlenül a fertőzés helyén M AGYA R N Ő O R VO S O K L A PJA
Köszönetnyilvánítás Munkánk a DEVTEGEN HU-SRB/1002/214/078 és a TÁMOP-4.2.2.A-11/1/KONV-2012-0035 elnevezésű Európai Unió által finanszírozott projektek segítségével valósult meg.
23
77. ÉVFOLYAM 5. SZÁM | 2014. SZEPTEMBER
N Ő GYÓ GYÁ S Z AT
[7] Luigina Romani. Innate and adaptive immunity in Candida albicans infections and saprophytism Journal of Leukocyte Biology 2000;68 (2) 175-179 [8] Fidel PL Jr. History and new insights into host defense against vaginal candidiasis. Trends Microbiol. 2004; 12:220–7. [9] Maródi L, Erdös M. Dectin-1 deficiency and mucocutaneous fungal infections. N Engl J Med. 2010 28;362(4):367 [10] Glocker EO et al. A homozygous CARD9 mutation in a family with susceptibility tofungal infections. N Engl J Med. 2009 29; 361(18):1727-35.
Irodalom [1] Workowski KA et al. Sexually transmitted diseases treatment guidelines, MMWR Recomm Rep. 2010; 59:1. [2] Mardh PA et al. Facts and myths on recurrent vulvovaginal candidiasis: a review on epidemiology, clinical manifestations, diagnosis, pathogenesis, and therapy. Int J STD 2002; 13:522–39. [3] Bendel CM. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin Perinatol. 2003; 27:357–64. [4] Piccinni MP et al. Type 1 helper cells specific for Candida albicans antigens in peripheral blood and vaginal mucosal of women with recurrent vaginal candidiasis. J Infect Dis. 2002; 186:87–93. [5] Kozel TR et al. Biological activities of naturally occurring antibodies reactive with Candida albicans mannan. Infect Immun. 2004; 72:209–18. [6] Karen LW et al. Candida-Specific Antibodies during Experimental Vaginal Candidiasis in Mice Infect. Immun. 2002;70 (10) 5790-5799
M AGYA R N Ő O R VO S O K L A PJA
Levelezés:
Vanya Melinda dr. Szegedi Tudományegyetem, Szent-Györgyi Albert Klinikai Központ Szülészeti és Nőgyógyászati Klinika 6725 Semmelweis u.1. Email:
[email protected]
24
77. ÉVFOLYAM 5. SZÁM | 2014. SZEPTEMBER
