A TRPC6 ioncsatorna potenciális szerepe a szerzett proteinuriák kialakulásában

A TRPC6 ioncsatorna potenciális szerepe a szerzett proteinuriák kialakulásában Dr. Szabó Tamás Ph.D DE OEC Gyermekgyógyászati Intézet DE OEC Élettan Intézet

2011. 10. 24

Filtrációs Barrier GBM + Podocyta Signaling Network Citoszkeletális hálózat Podocin, nephrin, α-actinin, CD2AP

Ioncsatornák NSCC, Cl-, TRPs

Metabotróp receptorok AT-R1,2, PG-R, ET1-R, LTC4-R, LTB4-R, BK-R2, P2Y2, H1R, Adrenerg Rs, Thrombin-R, DRs, Chemokin-Rs

Intracelluláris jelátvitel [Ca2+]i, kináz rendszerek

Congenitalis NS – Struktúrális gén mutáció

Finn-típusú nephropathia (AR) NPHS1 – 19q13

Podocyta eredetű öröklődő vesebetegségek • Korai megjelenés Mutáció WT-1 Laminin β2 Nephrin Podocin

Szindróma Wilms tumor, FSGS (AR) Pierson ??? Finn-típusú NS Steroid-res. NS (AR)

• Késői megjelenés Mutáció α-actinin IV-es típusú collagen WT-1

Szindróma Familiaris FSGS (AD) Alport ??? Frasier ???, Steroid-res. NS

Valami új – Nem-citoszkeletális mutáció!!! • Korai megjelenés Mutáció WT-1 Laminin β2 Nephrin Podocin TRPC6

Szindróma Wilms tumor, FSGS (AR) Pierson ??? Finn-típusú NS Steroid-res. NS (AR) Steroid-res. NS (c. heterozyg)

• Késői megjelenés Mutáció α-actinin IV-es típusú collagen WT-1 TRPC6

Szindróma Familiaris FSGS (AD) Alport –sy. Frasier –sy., Steroid-res. NS Familiaris FSGS (AD)

A TRPC6-ról röviden • TRPC család 7 tagú, TRPC3, 6, 7 alcsaládban 75 %-os szekvencia-homológia látható • 6 TM helikális domén, tetramer, nem-szelektív kationcsatorna • N-és C terminál intracelluláris lokalizáció • TRPC6 nagy Ca-permeabilitású • TRPC6 aktiváció: GPCR/PLC útvonal és/vagy DAG-on keresztül, intracelluláris Ca-raktárak depléció TRP-csatornák szignál komplexekben működnek számos más fehérjével kapcsoltan („signaloplex”)

A TRPC6 „gain-of-function” mutációja familiaris FSGS kialakulásához vezet Chr. 11q, Pro-to-Gln (P112Q)

Winn, Science, 2005

A TRPC6 kolokalizációja a slit-diaphragma fehérjéivel

Reiser, Nat Genet, 2005

A TRPC6 in vivo overexpresszója a podocytákban proteinúriát okoz (egér)

Möller, JASN, 2007

A TRPC6 expresszója fokozódik a podocytákban NS model (patkány) I. Puromycin aminonucleoside (PAN) által kiváltott nephritis

Möller, JASN, 2007

A TRPC6 expresszója fokozódik a podocytákban NS model (patkány) II. Puromycin aminonucleoside (PAN) által kiváltott nephritis

Möller, JASN, 2007

A TRPC6 overexpresszója észlelhető humán vesebetegségekben

Betegségek: Minimal Change NS Membranosus GN Passive Heymann GN

Möller, JASN, 2007

Hypothesis A TRPC6 szerepet játszik szerzett proteinúriával járó vesebetegségek kialakulásában Módszer: vesebetegségek pathomechanizmusának modellezése in vitro sejtrendszerekben (podocyta és humán TRPC6 expresszáló heterológ sejtvonalak). Célkitűzés: A receptor intracelluláris szabályozásában (funkció, expresszió) fontos szignál útvonalak feltérképezése.

TRPC6 és egyéb podocyta markerek expressziója egér podocyta sejttenyészetben Immuncitokémia NC

Western blot NC NK

NK

TRPC6 TRPC6

TRPC6

106 kDa

TRPC6

200x 400x 33 C nem-differenciáltatott

33 C

600x 37 C differenciáltatott Immuncitokémia

Western blot

33 C

Differenciáltatott 37 C

33 C


TRPC6

+

+

+

+

podocin

+

+

+

+

α-actinin 4

+

+

+

+

synaptopodin

-

+

-

-

37 C

TRPC6 és egyéb podocyta markerek expressziója (podocin, α-actinin 4, synaptopodin) humán podocyták Immuncitokémia

Western blot

NK

NK

TRPC6

TRPC6

TRPC6

106 kDa

TRPC6

600x

33 C

600x 40x 37 C differenciáltatott

33 C nem-differenciáltatott

Immuncitokémia

Western blot

33 C


33 C


TRPC6

+

+

+

+

podocin

+

+

+

+

α-actinin 4

+

+

-

-

synaptopodin

-

+

-

-

37 C

Fluo 4

Elméleti háttér:

AM

 festék: Fluo-4 AM (hozzákapcsolt acetoximetilészter: AM)  a sejtben az AM-t nem-specifikus észterázok leemésztik a Fluo 4

festékmolekuláról  Fluo-4 szabaddá válik 

Ca2+-t

Ca Ca

köt

 megváltozik a fluoreszcencia intenzitása  kijutását megelőzendő ABC transzporter gátlószer: 2,5 mM

AM

észterázok AM

Ca

Fluo 4

probenecid

Probenecid

Ca

TRPC6 agonista hatása az intracelluláris Ca2+ koncentrációra - Ca2+-imaging, Fluo4-AM, FLIPR -

Kontroll 75 µM 100 µM 150 µM

8 000 7 000 6 000 5 000 4 000 3 000 2 000 1 000 0 -1 000 0

50

100

150

Idő (sec)

200

250

300

A TRPC6 ismert agonistája az OAG (1-oleoil-2-acetil-sn-glicerol) dózisfüggő módon növeli a podocyták [Ca2+]IC-ját.

A Ca2+ tranziensek amplitúdója (RFU, maximális válasz=100%)

Relatív fluoreszcencia (az alapvonalra normálva)

OAG 120 100 80 60 40 20 0

0

75

100

150

OAG koncentráció (μM)

Három független kísérlet eredményének átlaga.

A TRPC6 csatorna funkcionálisan aktív egér és humán podocytákban Ca2+-imaging (Fluo 4-AM) Humán podocyta

0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő (sec)

18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2

kontroll 400 µM DOG 400 µM DOG – alacsony [Ca2+]EC

0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő (sec)

Fluoreszcencia intenzitás

kontroll 200 µM OAG 200 µM OAG – alacsony [Ca2+]EC

16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2




Egér podocyta

kontroll 50 µM OAG 50 µM OAG – alacsony [Ca2+]EC

35 30 25 20 15 10 5 0 0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő (sec)

100

kontroll 75 µM DOG 75 µM DOG – alacsony [Ca2+]EC

80 60 40 20 0 0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő (sec)

A TRPC6 aktivációját módosító ágensek -Ca2+-imaging Fluo4-AM, FLIPR 200 µM OAG

200 µM OAG

20

250 nM inzulin

15 10 5

Kontroll

0 0

20

40

60

20

20

15

15

Kontroll

10 5

100 nM PMA

0 0

80 100 120 140 160 180

Idő(sec)

20

200 µM OAG

60

4 µM bradikinin

10 5

Kontroll

0

Relatív fluoreszcencia

15

Kontroll

0

80 100 120 140 160 180

0

Idő(sec)

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő(sec) 200 µM OAG 25

25

20

5

200 µM OAG

25


40

1 ng/ml PGE2

10


25


25



30

200 µM OAG 25

20

20 15

Kontroll

10

15

Kontroll

10

5

10 µM thapsigargin

0

5

180 µM ATP

0 0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő(sec)

-5 0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő(sec)

0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő(sec)

A podocytákat 30 percig kezeltük az egyes anyagok feltüntetett koncentrációjával, majd vizsgáltuk a TRPC6 aktiváció hatására kialakuló tranziens [Ca2+]IC változásokat. Egyes anyagok jellegzetes változásokat okoznak a TRPC6-hoz kapcsolódó Ca2+ szignalizációban. PMA – forbol-12-mirisztát-13-acetát AA – arachidonsav

BK – bradikinin HIS – hisztamin

INS – inzulin TG - thapsigargin

35 000

24 h - OAG

DilC1(5) - apoptózis Sytox - nekrózis Lysis: nekrózis pozitív kontrollja CCCP: apoptózis pozitív kontrollja

48 h - OAG

25 000 20 000 15 000 10 000 5 000

ct r LY l SI S CC CP 10 µM 50 µM 75 µM 10 0µ M 15 0µ M 30 0µ M

0

150 000 140 000

72 h - OAG

130 000 120 000 30 000 25 000 20 000 15 000 10 000 5 000 0


30 000




110 000 105 000 100 000 95 000 90 000 85 000 80 000 25 000 20 000 15 000 10 000 5 000 0


Különböző koncentrációjú OAG kezelés (24h, 48h, 72h) nem okoz apoptózist, sem nekrózist egér podocytákban

Különböző anyagok hatása a TRPC6 csatorna aktivációjára  Metabotróp receptor agonisták: arachidonsav, ATP, PGE2, bradikinin  Tirozin receptor agonista: inzulin  Intracelluláros kinázok modulátora: forbol észter (PMA) Egér podocyta OAG indukálta[Ca2+]IC emelkedése Arachidonsav ATP PGE2 Bradikinin Inzulin PMA

Humán podocyta OAG indukálta[Ca2+]IC emelkedése

A PMA-val történő 30 perces előkezelés lecsökkentette (megszüntette) az OAG által kiváltott [Ca2+]IC emelkedést Humán podocyta

Egér podocyta 200 µM OAG 200 µM OAG - előkezelve

75 µM OAG 75 µM OAG - előkezelve

20 15 10 5 0 0

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő (sec)

80 70 60 50 40 30

*

20 10 0

Előkezelés: 30 perc 1µM PMA 75 µM OAG 12 10 8 6 4 2 0 -2 0

Relatív fluoreszcencia intenzitás


25

Relatív fluoreszcencia intenzitás


Előkezelés: 30 perc 1µM PMA 200 µM OAG

20

40

60

80 100 120 140 160 180

Idő (sec)

25 20 15

*

10 5 0

OAG

1µM PMA OAG

OAG

1µM PMA OAG

* p < 0,05

A PKC rendszer  szerin/treonin kinázok  12 különböző PKC izoenzim  aktivációs mechanizmusaik alapján: 1.

„klasszikus” (cPKC): α, β1, β 2, γ → DAG és Ca2+

2.

kalcium-independens (nPKC): δ, ε, η, θ → csak DAG

3.

„atípusos” izoenzimek (aPKC): PKC ζ és λ/ι → sem DAG, sem Ca2+

4.

PKC µ

 gátlószerek: 1.

Gö6976 → cPKC,

2.

GF109203X → cPKC és nPKC,

3.

Rottlerin → PKC delta

Regulatórikus domén

Klasszikus (α, βI, βII, γ)

V1 N

V2 C1a C1b C2

pszeudoszubsztrát régió

Novel (δ, ε, η, θ) Atípusos (λ/ι, ζ) TM

PKCµ

Ca2+

Katalitikus domén

V3 V4 C3

V5 C4

ATP

szubsztrát-kötő hely

C

Al p Al ha p 60 Al ha P % ph C a 2 d Ga mm iff Ga a m Ga ma 60% mm PC a 2 d De iff l De ta 6 lt 0 De a P % lt C Ep a d 2 if s Ep zilo f s n Ep zilon 60% sz P ilo C n 2 di Ze ff t Ze a 60 ta % Ze PC ta 2 dif Et f a Et 60% a Et PC a 2 di Te ff t Te a 60 ta % Te PC ta 2 dif f

Relatív expresszió (GAPDH=1)

Az általunk vizsgált PKC izoformák (alpha, beta1, delta, gamma, epszilon, zeta, eta, teta) a β1 kivételével mRNS szinten expresszálódnak humán podocytákban 3,5x10-2

Q-PCR

3,0x10-2

2,5x10-2

2,0x10-2

1,5x10-2

1,0x10-2

5,0x10-3

0,0

PMA-val történő előkezelés kivédi az OAG által kiváltott [Ca2+]IC emelkedést Humán podocyta

CTRL 1 µM PMA - előkezelve 1 µM Gö6976 - előkezelve 1 µM GF109203X- előkezelve 1 µM Rottlerin - előkezelve

200 µM OAG

200 µM OAG

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1



Egér podocyta

0

20

40

60

Idő (sec)

80

100

35 30 25 20 15 10 5 0 0

20

40

60

Idő (sec)

80

100

120

 Az immortalizált egér és humán podocyták funkcionálisan aktív TRPC6 csatornával rendelkeznek  A TRPC6 csatorna aktivátor OAG nem befolyásolja a sejtek életképességét egér podocytákban  Humán podocyták esetében pedig az arachidonsav, az ATP és a bradikinin csökkenti a jel nagyságát  Az inzulin humán podocytákban csökkenti az aktivitás mértékét  A PKC aktivátor PMA konzekvensen csökkentette a csatorna aktivációra kialakuló [Ca2+]IC emelkedést mindkét sejttípusban  A PKC izoformák közül legnagyobb mennyiségben az α, a δ és a ζ van jelen humán podocytákban  A PKC rendszer gátlásával nagyobb mértékű lett az OAG-gal kiváltott [Ca2+]IC emelkedés, ezért feltételezhető, hogy a PKC rendszer a csatorna tónusos gátlását tartja fenn

PKC rendszer-TRPC6 akt/expr.- szerzett proteinuriák HG/PMA a TRPC6 expressziót csökkenti, következményesen az ANG II mediált hatások csökkentek Graham S et al. Am J Physiol Cell Phys. 2011

•Hyperglycemia diabetesben csökkenti a TRPC6 expressziót MC sejtekben és következményesen csökkent ANG II mediált hatások észlelhetők. •cPKC-inhibitorok a HG okozta TRPC6 expr. változásokat csökkentették •A TRPC6 mediált változások kizárólag a vesében (MC, podocyta) észlelhetők TRPC6-ANG II cross-talk? PKC aktiváció – protektív TRPC6 down-regulációt eredményezhet? ANG II módosítja a TRPC6 expresszióját mRNS és fehérje szinten podocytákban Nijenhuis T et al. Am J Pathol. 2011

•ANG II infúzió fokozza a glomeruláris TRPC6 expressziót •Állatkísérletekben a glomeruláris TRPC6 expr. ANG II dependens módon nőtt •Az ANG II fenti hatása függ mind a TRPC6-dependens Ca influxtól és a calcineurin aktivációtól (NFAT szignál útvonal) •A calcineurin gátlása (CsA) csökkenti a TRPC6 expressziót és proteinuriát

A TRPC6-kapcsolt szignalizáció szerepe a tenyésztett podocyták biológiai folyamatainak szabályozásában •Magas glükóz cc. RAS aktivációt indukál podocytákban, részben direkt renin aktiváción, másrészt non-ACE útvonalon növelve az ANG II szintjét. •Magas glükóz növeli az AT1R és a prorenin receptor expresszióját is.

LN, MPGN, MNP, (PKCα,β upreg.) HG ANG II

downregulatio

TRPC6

?

+ TRPC6 expr.

Calcineurin dependens (CNI gátolja)

Winn et al

1.

Metabotróp receptor: (arachidonsav, ATP, PGE2, bradikinin)

2.

Tirozin kináz receptor (inzulin) – TRPC6 és cPKC expresszió vizsgálata

3.

Forbol észter (PMA)

4.

Angiotenzin (ANG II mediált modulációja a TRPC6 ioncsatornának)

5.

mTOR inhibitorok (rapamycin)

6.

Calcineurin inhibitorok (cyclosporin, tacrolimus)

7.

Komplement rendszer

Humán vesebiopsziás minták vizsgálata (cPKC, TRPC6 expr.)

Köszönöm a figyelmet!

Köszönetnyilvánítás

Dr.Bíró Tamás Dr.Cziffra Gabriella Ambrus Lídia Zákány Nóra OTKA 76065

A TRPC6 ioncsatorna potenciális szerepe a szerzett proteinuriák kialakulásában

Recommend Documents