Debreceni Egyetem Orvos-és Egészségtudományi Centrum, Biofizikai és Sejtbiológiai Intézet
A Kv1.3 ioncsatorna szerepe a T sejt aktivációban Hajdu Péter
Debrecen, 2011. november 14.
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben
2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
Az ioncsatorna egyszerűsített képe: A hidrofil pórus teszi lehetővé az ionok gyors membránon keresztüli áramlását (108 ion/s)
mozgás
szívműködés szekréció
immunitás
ioncsatornák kontrakció gondolkodás
memória
érzékelés
Hogyan szabályozzák az ioncsatornák a T sejtes immunválaszt? K+
K+
ER
IP3
Kv1.3
TCR/ CD3
Em~-50 mV
PLC
Ca2+ CRAC
CaM
proliferáció
[Ca2+] idő
T sejt CRAC:calcium release activated calcium channel (kalcium felszabadulás aktivált kalcium csatorna)
Miképpen tanulmányozhatók az ioncsatornák? Az ionáramok mérése a patch-clamp technikával Rf Vki
Ip +
műv. erősítő
Im
Em
áram (pA)
600
Vtartási
+30 mV
+30 mV -10 mV -50 mV -80 mV
400 200
-40 mV
0 0
200
400 idő (ms)
600
800
1000
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben
2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
A koleszterin hatása a Kv1.3 kapuzására
Hogyan befolyásolja a Kv1.3 csatorna funkcióját a humán T sejtmembrán koleszterintartalmának változása? az aktiváció és inaktiváció kinetikai
paraméterei
az egyensúlyi aktiváció és
inaktiváció feszültségfüggése
A membrán koleszterin tartalom növelése lassítja a Kv1.3 (in)aktivációs kinetikát Inaktivációs kinetika
= I(t) Imax e
1
−
t τi
Aktivációs kinetika
+C 1
0 1
1.425 mg/ml MβCD
áram
1.425 mg/ml MβCD 0
Kontroll
1.5 mg/ml MβCD/C
0
2
0
300
2
200
τa(ms)
τi(ms)
20
10
idő (ms)
idő (s) (s) Idő
100
0
4
+ C
+
Kontroll
normált K
+ normált K áram
1.5 mg/ml MβCD/C
t − τa I(t) = Im ax 1 − e
kontroll
0.5
1.0
1.5
MβCD/C koncentráció (mg/ml)
1
0
kontroll
1
1.5
MβCD/C koncentráció (mg/ml)
1 5
Kontroll
τa,f τa,s
τa(ms)
normált K+ áram
Az aktiváció kétfázisúvá válik a koleszterin bevitel hatására
1.5 mg/ml MβCD/C 0
0
00
25
50
Módosított Hodgkin-Huxley modell:
)
1.5
MβCD/C koncentráció (mg/ml)
idő (ms)
(
1
1
0 mV 50 mV
4
(
)
4
Ia,s 1 − exp − t / τ a,s + C R=
R
I (= t ) Ia,f 1 − exp − t / τ a,f +
Ia,f
Ia,f + Ia,s
0
1
1.5
MβCD/C koncentráció (mg/ml)
Összefoglalás I. • A T sejt membrán koleszterintartalmának növelése lassítja a Kv1.3 inaktivációt és aktivációt, megváltoztatja az aktiváció feszültség függését. • A membrán koleszterintartalmának csökkentése nincs biológiailag releváns hatással a Kv1.3 csatornák egyensúlyi és kinetikai paramétereire. • A koleszterinszint emelése az aktiváció kétfázisú viselkedését eredményezte. Modell Z0
Z1
Z2
Z3
Z4
NY K+
AZ
I
Immunológiai szinapszis T sejtek aktivációja az immunszinapszisban (IS) zajlik le, ahová számos intracelluláris és sejtmembrán fehérje szegregálódik
APC
T sejt
Kv1.3
LFA-1
CD4/CD8
TCR/CD3 TCR/ CD3
p56lck
elkülönülő piros és zöld jel a két molekula eltérő régióban lokalizálódik (c-SMAC és p-SMAC)
hDlg Kvβ2
ZIP-1/2
PKC Monks et al., Nature, 1998, 395:82-86
Az endogén Kv1.3 csatornák az IS-ba szegregálódnak PKC-θ-GFP
ext. anti-Kv1.3+ IgG-Cy3
tramszmissziós
T sejt APC
A Kv1.3 csatornák áramának kinetikája megváltozik az IS-ban Aktivációs kinetika
0.5 0.0
-0.5
norm. konduktancia
1.0
normált áram
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
-1.0 0
2
4
6
8 10 12 14 16 18
1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
időidő (ms) (ms)
-60 -40 -20 0 20 40 tesztfeszültség (mV)
idő idő(s)(s)
60
:T-sejt IS-ben :egyedülálló T-sejt *
2.5
400
*
τi(ms)
300
1.5 1.0
200
0.5
100
0.0
0
D10
D10 IS-ban
D10
D10 IS-ban
20
20
10
10
0
0
k(mV)
2.0
V1/2(mV)
normált áram
1.0
τa(ms)
Egyensúlyi aktiváció
Inaktivációs kinetika
-10
-10
-20
-20
-30
-30
A PK antagonisták gyorsítják a Kv1.3 csatornák inaktivációját Aktivációs kinetika
Inaktivációs kinetika
0.5 0.0
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
-0.5 10
20
30
0.0
0.5
1.0
0.6 0.4 0.2 0.0
-60 -40 -20
0
20
40
60
tesztfeszültség (mV)
: 0,1 µM H89 (PKA) : 0,5 µM GF109203X (PKC) : kontroll
2.5
400
2.0
*
τa(ms)
τi(ms)
1.5 1.0
*
200 100
0.5 H89
0
kontroll
GF
H89
10
10
0
0
-10
-10
-20
-20
-30
-30
-40
-40
k(mV)
300
GF
0.8
idő (s)
idő idő(ms) (ms)
kontroll
1.0
1.5
V1/2(mV)
0
0.0
norm. konduktancia
1.0
normált áram
normált áram
1.0
Egyensúlyi aktiváció
Összefoglalás II
• a T-sejt és az APC közötti IS-ban feldúsulnak az endogén Kv1.3 csatornák • az IS-ba rendeződés módosítja a Kv1.3 funkcióját • a PK antagonisták egyértelműen nem bizonyítják a Kv1.3 működés foszforiláció indukálta megváltozását (a Kv1.3 átrendeződik más membrándoménekbe??)
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben
2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
A Kv1.3 ioncsatorna interakciós partnereinek keresése Potenciális interakciós partnerek: MAGUK (membrane-associated guanylate kinases): PSD-95 (SAP-90) SAP97 (hDlg)
PCR totál Jurkat cDNS-ből PSD-95
Western blot
SAP97
1. 700 bp
2.
3. WB: PSD-95
95 kDa
130 kDa
1.
2.
3. WB: SAP97
1. Jurkat
A T sejtvonalak és Kv1.3 csatornák mGFP-vel jelölt vad típusú és ∆C mutáns Kv1.3 csatornát kifejező T sejtvonalak
PSD-95 és SAP97gén lecsendesítése shRNS-sel
A Kv1.3-feldúsulás mérése és kvantitatív jellemzése Jurkat-mGFP-Kv1.3-WT-B-sejt párok
APC mGFP-Kv1.3
CD3
T sejt
merge
APC mGFP-Kv1.3
CD3
merge
IIS, AREAIS: átlagos intenzitás az IS-ben illetve az IS területe Ioutside: átlagos intenzitás a sejten belül Iinside: átlagos intenzitás a citoszólban AREAmembrane= AREAoutside –AREAinside IBG: átlagos háttér intenzitás
( I IS − I BG ) ⋅ AREAIS AR =
( I outside − I BG ) ⋅ AREAoutside − ( I inside − I BG ) ⋅ AREAinside AREAIS AREAmembrane
Az előadás tematikája: 1. A Kv1.3 csatornák szerepe a T sejtekben
2. A Kv1.3 csatorna: a lipidkörnyezet és az immunológiai szinapszis hatása 3. A Kv1.3 csatornák útja az immunszinapszisba 4. Kv1.3 ioncsatorna jellemzői a Smith-Lemli-Opitz szindrómás betegek T sejtjeiben
Az SLO klinikai tünetei Rendkívül változatos tünetek: - súlyos és középsúlyos esetek: súlyos veleszületett rendellenességek (gyakran nem élik túl a perinatális periódust). enyhébb esetek: különböző viselkedészavarok, tanulási problémák.
fizikális
eltérések,
Kicsi, előrenéző orrlyukak, csüngő szemhéj, fejletlen állcsont. Abnormális genitáliák, pseudohermaphroditismus. A 2. és 3. lábujj összenövése (95%!). Hiperaktivitás, autoagresszivitás. Autista vonások. Alvási problémák. Visszamaradt növekedés. Késleltetett fejlődés.
Porter 2006, 2008
Az SLO kialakulásáért felelős enzim: 7-dehidrokoleszterin reduktáz (DHCR7) 7-dehidrokoleszterin (7-DHC)
koleszterin NADPH
NADP+
DHCR7
szteroid hormonok
neuroszteroidok oxiszterolok
epesavak
magzati membránok fejlődés, embrionális sejtdifferenciáció
Kv1.3 csatornák biofizikai karakterizálása CD4+ T sejt populáció szelekciója (panning)
Elektrofiziológia (patch-clamp, teljes sejt konfiguráció) Rf Ip
+
Kv1.3 T helper
CD4
1.0
+ C
0.5 0.0 -0.5 0
4
8
idõ(ms) (ms) idő
12
16
= I(t) Imax e
0.8
−
t τi
+C
norm. konduktancia
t − τa I(t) = Im ax 1 − e
1.5
Egyensúlyi aktiváció
Inaktivációs kinetika
1.2
4
teljes sejt áram (nA)
teljes sejt áram (nA)
Aktivációs kinetika
0.4
0.0 0.0
0.5
idő idő(s) (s)
1.0
Vtartási
IK+
Em
Vki
1.5
1.2 1.0 0.8
Gn =
1 1+e
−
V −V1 / 2 k
0.6 0.4
V1/2=-20.8 mV k=-10.7 mV
0.2 0.0 -80 -60 -40 -20
0
20
tesztfeszültség (mV)
40
60
Membránösszetétel és aktivációs útvonalak monitorozása CFSE (karboxifluoreszcein- szukcinimidilészter) hígítási esszé
sejtszám
Gáz kromatográfia (7DHC és koleszterin)
CFSE intenzitás
Köszönöm a figyelmet!
