A tranziens ischaemiás attakot jellemzô vér-rns-profil

A tranziens ischaemiás attakot jellemzô vér-RNS-profil

X. Zhan, MD, PhD* G.C. Jickling, MD* Y. Tian, PhD B. Stamova, PhD H. Xu, MD, PhD B.P. Ander, PhD R.J. Turner, PhD M. Mesias, BS P. Verro, MD C. Bushnell, MD, MHS S.C. Johnston, MD, PhD F.R. Sharp, MD Levelezési cím: MIND Institute Research Wet Labs–Room 2415, University of California at Davis, 2805 50th Street, Sacramento, CA 95817, USA [email protected]

KIVONAT

Célkitűzés: A tranziens ischaemiás attak (TIA) gyakori megbetegedés. Bár a szisztémás gyulladás és thrombosis összefüggésbe hozható a tranziens ischaemiás attakkal, további vizsgálatok betekintést nyújthatnak a TIA patofiziológiájába és elôsegíthetik a tranziens ischaemiás attak célzott specifikus kezelését. Vizsgálatunkban azt próbáltuk meghatározni, hogy vajon a génexpressziós vérprofilok pontosan jellemezhetik-e a tranziens ischaemiás attakot elszenvedô betegek proinflammatorikus és prokoaguláns állapotát. Módszerek: Vizsgálatunkban az Affymetrix U133 Plus 2.0 microarray-rendszer segítségével hasonlítottuk a tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegek vérében (n=26) az RNS-expressziót olyan kontrollszemélyek génexpressziójával, akiknél vascularis kockázati tényezôk voltak jelen, anélkül, hogy cardiovascularis tüneteik jelentkeztek volna (n=26). A tranziens ischaemiás attakban megjelenô differenciált génexpressziót kovarianciaelemzéssel azonosítottuk, és keresztvalidálással, illetve funkcionális elemzések segítségével értékeltük.

Eredmények: A tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegek génexpressziós mintázata eltért a kontrolloknál talált mintázattól. Összesen 449 génnek megfelelô 480 próbakészlet esetében találtunk expressziós különbséget a TIA-betegek és a kontrollok között (hamis találati arány korrekció többszörös összehasonlítás esetében, p≤0,05, abszolút „fold change” [génexpressziós változási érték] ≥1,2). Ezek a gének szisztémás gyulladással, thrombocytaaktivációval és protrombinaktivációval hozhatók összefüggésbe. Az azonosított gének hierarchikus clusterelemzése kétféle RNS-expressziós minta jelenlétére utalt a tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegeknél. Predikciós analízissel egy olyan 34 tagból álló génkészletet azonosítottunk, amely 100%-os szenzitivitással és 100%-os specificitással különböztette meg a TIA-betegeket és a kontrollokat. Következtetések: A friss tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegek génexpressziós mintázata a vérben eltért a kontrolloknál talált mintázattól. A tranziens ischaemiás attakkal összefüggésbe hozható két génexpressziós profil a TIA-betegek heterogén válaszára utal, ami rávilágíthat a stroke okaira és kockázati tényezôire, valamint a tranziens ischaemiás attakhoz fûzôdô egyéb patofiziológiai tényezôkre. Eredeti megjelenés: Neurology® 2011;77:1718–1724 RÖVIDÍTÉSEK CRP=C-reaktív protein; FDR=(false discovery rate) hamis találati arány; LDA=lineáris diszkriminanciaanalízis; TIA=tranziens ischaemiás attak; vWF=von Willebrand-faktor.

Kiegészítô adatok a www.neurology.org honlapon találhatók

A tranziens ischaemiás attak (TIA) gyakori megbetegedés, amely évente több mint 300 000 embert érint csak az Amerikai Egyesült Államokban. Ugyan a TIA tünetei, a betegség definíciójából következôen, spontán rendezôdnek, ezt a történést mégsem igazán nevezhetjük jóindulatúnak, ugyanis tranziens ischaemiás attakot követôen a stroke, a szívizominfarktus és a halál 90 napon belüli kockázata 25%-os.1–3 A TIA patogenezisének jobb megértésére van szükség ahhoz, hogy megfelelôbben tudjuk kezelni a betegséget, és lehetôség szerint megelôzzük a stroke-ot. Korábban már kimutattuk, hogy a kísérleti tranziens ischaemiás attakot követôen kialakuló génexpressziós változások4 agyi microglia-aktivációval és macrophaginfiltrációval társulnak.5 Egy kísérleti TIA-patkánymodellen eltérô vérimmunsejt-aktivációt mutattunk ki teljesgenom-szintű expressziós analízis segítségével.4 Embereknél a TIA megemelkedett citokinszinttel és leukocytaszámmal jár,6,7 továbbá megnövekedett fibrinogén-,8 D-dimer-9 és thrombo-

*A szerzôk egyenlô mértékben járultak hozzá a közleményhez. Munkahelyi háttér: Department of Neurology (X.Z., G.C.J., Y.T., B.S., H.X., B.P.A., R.J.T., M.M., P.V., F.R.S.), MIND Institute, University of California at Davis, Sacramento, USA; Department of Neurology (C.B.), Wake Forest University Health Sciences, Winston-Salem, NC, USA; és Department of Neurology (S.C.J.), University of California at San Francisco, San Francisco, USA. A vizsgálat anyagi hátterét biztosította: NIH/NINDS grant N5056302, AHA Bugher Foundation (F.R.S., B.P.A., H.X. és Y.T.) és NIH/ NINDS K02 N5058760 (C.D.B.). Dr. Jickling a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) munkatársa. Dr. Xu, dr. Ander és dr. Tian az AHA Bugher munkatársai. Dr. Turnert az ausztráliai National Health and Medical Research Council Postdoctoral Fellowship támogatja. Dr. Bushnell a NIH/NINDS K02 N5058760-tól kap kutatási támogatást. Érdekeltségek: A szerzôk érdekeltségei a cikk végén olvashatók. 30

Copyright © 2011 by AAN Enterprises, Inc.

2. évfolyam, 1. szám, 2012. március

cyta-, kollagénreceptor- és glikoprotein-VI-szintekkel.10 Ezenkívül az ultraszenzitív C-reaktív protein (CRP) és az Lp-PLA2 (lipoproteinasszociált foszfolipáz) szintek recidív ischaemiás eseményekkel társulnak.11,12 Az átmeneti cerebrális ischaemiával kapcsolatos állatkísérletek, illetve humánvizsgálatok tehát gyulladásos és prothromboticus állapotok jelenlétét igazolják. A vérbôl nyert génexpressziós profilok el tudják különíteni az ischaemiás stroke eseteit a kontrolloktól, és azonosítani tudják a stroke patofiziológiája szempontjából fontos prokoaguláns és proinflammatorikus sajátosságokat.13–15 Az nem ismeretes, hogy akut tranziens ischaemiás betegeknél léteznek-e ilyen profilok. Ennek megfelelôen a jelen vizsgálatban azt szerettük volna kideríteni, hogy a vérben található génexpressziós profilok mennyire jellemzik az akut tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegek inflammatorikus és koaguláns állapotát. MÓDSZEREK Standard vizsgálati terv engedélyezése, regisztrációja és a betegek beleegyezô nyilatkozatai. Vizsgálatunkhoz a tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegeket és kontrollokat a University of California Davis Medical Center, a University of California San Francisco Medical Center, valamint a Wake Forest University Health Sciences intézményekben toboroztuk. Az intézményi felülvizsgáló testület minden egyes intézményben jóváhagyta a vizsgálatot. Minden betegtôl beszereztük a tájékoztatás utáni beleegyezô nyilatkozatot. A TIA diagnózisát neurológus szakorvosok állították fel. A tranziens ischaemiás attakot a következôképpen definiáltuk: kevesebb mint 24 órán át tartó, vascularis eredetű, akut fokális cerebralis vagy ocularis funkciókiesés. Minden tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegnél végeztünk neurológiai képalkotó vizsgálatot, amely az esetek 85%-ában MR-vizsgálat volt. A kontrollok olyan személyek voltak, akiknél a vascularis kockázat magas volt, de nem szenvedtek semmilyen szimptómás vascularis betegségben, például nem alakult ki náluk korábban stroke, TIA, myocardialis infarctus, angina- vagy perifériás artériás megbetegedés. A kontrollokat életkoruk és nemük alapján párosították a TIA-betegekkel. Vérmintagyűjtés és RNS-izolálás. A vért 9,5–68,6 órával (átlagban 35,1 órával) a TIA-tünetek kialakulása után vettük le.

1. táblázat

A tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegek és a kontrollszemélyek demográfiai és klinikai jellemzôia Kontrollok (n = 26)

TIA (n = 26)

P-érték

Életkor (évek±SE)

60,4±0,76

65,2±2,35

0,06

Nônem, n (%)

13 (50,0)

13 (50,0)

1,00

Kaukázusi rassz, n (%)

25 (96,2)

15 (57,7)

0,0007

Magasvérnyomás-betegség

17 (65,4)

19 (70,1)

0,55

Diabétesz (cukorbetegség)

6 (20,1)

9 (34,6)

0,36

Hyperlipidaemia

19 (70,1)

15 (57,7)

0,25

Dohányzás

10 (38,5)

13 (50,0)

0,48

20 (76,9)

23 (88,5)

0,28

Vascularis kockázati tényezô, n (%)

Gyógyszeres kezelés

a A csoportok között fennálló demográfiai eltéréseket szükség szerint Fisher-féle egzakt próba vagy t-próba segítségével elemeztük. A t-próba vagy a χ2-próba segítségével végzett elemzés nem talált szignifikáns különbséget a két csoport között az életkor, nem, vascularis kockázati tényezôk és a gyógyszeres kezelés tekintetében. A χ2próbával végzett elemzés szignifikáns rasszbéli eltérést talált a két csoport között. Ezért elvégeztünk egy második elemzést, amely csak a kaukázusi rasszhoz tartozó TIA-betegekre (n=25) és kaukázusi kontrollokra (n=15) korlátozódott. SE=(standard error) standard hiba; TIA=tranziens ischaemiás attak.

Minden vizsgálatban részt vevô személytôl a vénás vért (15 mlnyit) PAXgene Vacutainer (PreAnalytiX, Hilden, Németország) vérvételi csövekbe vettük le. A PAXgene Vacutainer vérvételi csövek azonnal stabilizálják a vér-RNS-t, ily módon csökkentve a vérvételt követô RNS-lebomlást és a génexpressziós változások kialakulását. A PAXgene Vacutainer csöveket két órán át tartottuk szobahômérsékleten, majd ezt követôen lefagyasztottuk –70 °C-ra, és így tároltuk a minták feldolgozásáig. A teljes RNS-t a gyártó protokollja (PreAnalytiX) szerint izoláltuk és együttesen dolgoztuk fel, egy idôben és egyazon vizsgálati helyszínen. A teljesvér-RNS a fehérvérsejtekbôl (neutrophil, basophil és eosinophil sejtekbôl, lymphocytákból és monocytákból), a fiatal thrombocytákból és az éretlen vörösvértestekbôl származik. Microarray-hibridizálás. Az RNS-t Agilent 2100 bioanalizátor készülékkel elemeztük minôségi szempontból, és NanoDrop spektrofotométerrel a koncentráció tekintetében. A biotinhez kötött cDNS-t 50 ng teljes RNS-bôl állítottuk elô Ovation teljesvéroldat-készlet (Nugen Technologies, San Carlos, CA) segítségével a protokollnak megfelelôen. Valamennyi RNS-mintát az Affymetrix Human Genome U133-Plus-2.0 microarrays (Affymetrix Santa Clara, CA) segítségével dolgoztuk fel.15 Statisztikai elemzés. A microarray-adatokat „Robust Multichip Average” módszerrel normalizáltuk, majd log2 transzformációt alkalmaztunk. Az egyes próbákat próbakészletekbe összesítettük az Affymetrix leírása szerint, és a próbakészletek, illetve a génszint elemzéséhez használtuk. A kovarianciaanalízist Partek Genomics Suite 6.5 (Partek Inc., St. Louis, MO) programmal végeztük. Így azonosítottuk azokat a próbakészleteket, amelyek jelentôs eltérést mutattak a TIA-betegek és a kontrollok között, elvégezve az életkor és microarray gyártási tétel szerinti kiigazítást is. A többszörös összehasonlítás korrekcióját a Benjamini– Hochberg-féle 5%-os hamis találati arány (FDR, false discovery rate) segítségével végeztük. A próbakészleteket akkor tekintettük szignifikánsnak, ha az abszolút „fold change” (génexpressziós változási érték) ≥1,2, a p-érték pedig ≤0,05 volt a többszörös összehasonlítás FDR-korrekcióját követôen. A csoportok között fennálló demográfiai és klinikai adatbeli eltéréseket Fisher-féle egzakt próba vagy t-próba segítségével elemeztük. A predikciós elemzést lineáris diszkriminanciaanalízis (LDA) segítségével végeztük. A keresztvalidáláshoz a vizsgálati alanyokat 10 egyenlô csoportba osztottuk randomszerűen, és a betegek 90%-ával kialakítottunk egy predikciós modellt, majd ezt a modellt a maradék 10%-on értékeltük. Ezt a folyamatot tízszer megismételtük a kifejlesztett modell általános prediktív képességének felmérése céljából. Funkció- és útvonalelemzést az Ingenuity Pathways Analysis szoftver segítségével készítettünk.

EREDMÉNYEK Betegek. Összesen 52 beteget vontunk be az elemzésbe: 26 tranziens ischaemiás attakban szenvedô és 26 vascularis kockázati tényezôvel rendelkezô beteget. Az átlagéletkor 62,9 év volt. Nem szerinti eloszlás: 26 férfi és 26 nô. A betegek különféle rasszokhoz és etnikumokhoz tartoztak (77%-uk a kaukázusi rasszhoz). A TIA-betegek és a kontrollszemélyek jellemzôit az 1. táblázatban foglaltuk össze. Mivel a TIA-betegek és kontrollok között szignifikáns eltérés volt a rasszbéli hovatartozás tekintetében, elvégeztünk egy második elemzést, amely csak a kaukázusi rasszhoz tartozó TIA-betegekre (n=25) és kaukázusi kontrollokra (n=15) korlátozódott. Genetikai profilok a TIA-betegek esetében. Öszszesen 449 génnek megfelelô 480 próbakészlet esetében találtunk expressziós különbséget a TIA-betegek és a kontrollok között (FDR ≤0,05, „fold change” ≥1,2) (e-1. táblázat a Neurology® weboldalán, a www.neurology.org cím alatt). A 480 próbakészlet közül 129 esetben alulre31

1. ábra

Tranziens ischaemiás attakban (TIA) azonosított gének hierarchikus clusterelemzése a vascularis kockázattal rendelkezô kontrollpárjaikkal szemben

Standardizált intenzitás

Diagnózis Kontrollok TIA Alany azonosító száma

TIA2

TIA1

IT-180 IT-003 IT-012 IT-101 IT-127 IT-033 IT-034 IT-175 IT-172 IT-166 IT-169 IT-050 IT-144 IT-096 IT-091 IT-103 IT-041 IT-137 IT-037 IT-119 IT-024 IT-017 IT-093 IT-135 IT-062 IT-179 IT-155 IT-177 IT-158 IT-046 IT-043 IT-095 IT-035 IT-094 IT-160 IT-154 IT-083 IT-120 IT-064 IT-076 IT-016 IT-142 IT-042 IT-104 IT-152 IT-174 IT-049 IT-036 IT-011 IT-098 IT-136 IT-008

Kontrollok

A TIA-betegekben és a kontrollszemélyekben eltérôen expresszálódó 480 génpróbakészlet hierarchikus clusterelemzése (hamis találati arány ≤0,05, abszolút „fold change” [génexpressziós változás] ≥1,2). Az x tengelyen minden egyes oszlop egy beteget képvisel (összesen 26, kékkel jelölt TIA-beteg és 26, narancssárgával jelölt kontroll). Az y tengelyen minden egyes sor az egyes próbakészleteket képviseli (rendszerint egyedi génekre vonatkozóan). A TIA-betegek esetében a clusterek a kontrolloktól különállóan alakulnak ki (lásd a zöld nyilat felül). A TIA-betegek esetében legalább két cluster kialakulása figyelhetô meg (piros nyíl). Ezt a két TIA-clustert TIA1-, illetve TIA2-ként jelöltük. Egy TIA-beteg (ID: IT-062) a kontrollokkal egy clusterbe tömörült. Két kontroll pedig (ID: IT-155 és IT-177) TIA-betegekkel került egy clusterbe. Diagnózis=kék (TIA) és narancssárga (kontrollok). Zöld=alulreguláció; ID=alany azonosító száma; piros=felülreguláció. TIA=tranziens ischaemiás attak.

gulációt (e-1.A táblázat), 351 próbakészlet esetében pedig felülregulációt (e-1.B táblázat) találtunk. Minden egyes gént egy–hat próbakészlet képviselt. A 480 próbakészlet hierarchikus clusterelemzését az 1. ábrán mutatjuk be. Az ábrán jól látható, amint a TIA-betegek génexpressziós mintázata elkülönül a kontrollok mintázatától. A kaukázusi rasszbéli TIA-betegekre és kontrollokra korlátozódó másodlagos elemzés hasonló eredményekhez vezetett. A kaukázusi rasszhoz tartozó alanyok összehasonlításakor a génexpressziós eltérések több mint 90%-a megegyezett azokkal, amelyeket a raszszok szerinti differenciálás nélkül végzett stratifikációs elemzés alapján kaptunk (480-ból 453 próbakészlet esetében; az adatokat nem tüntettük fel). A clusterdiagramon két TIA-csoportot azonosítottunk, amelyeket TIA1, illetve TIA2-ként jelöltünk meg (1. ábra). Annak meghatározása érdekében, hogy valamely klinikai jellemzô összefüggésbe hozható-e a két TIA-csoport valamelyikével az RNS-mintázat alapján, a TIA1- és a TIA2-csoport következô jellemzôit hasonlítottuk össze: 32

életkor, nem, rassz, a TIA óta eltelt idô, hypertonia, diabetes, hyperlipidaemia, dohányzás, stroke az anamnézisben, cardiovascularis betegség, pitvarfibrilláció, nagyérbetegség, ABCD2 skála szerinti pontérték, diffúziósúlyozott képalkotással (DWI, diffusion weighted imaging) kimutatható laesio, 90 napon belül visszatérô ischaemiás esemény és az alkalmazott gyógyszeres kezelés. A TIA1- és a TIA2csoportok között nem volt statisztikailag szignifikáns eltérés a felsorolt jellemzôk tekintetében. A különbségek detektálásának lehetôsége azonban a minta kis mérete miatt korlátozott volt. Nevezetesen a DWI-laesiót mutató három beteg a TIA1-csoporthoz tartozott, akárcsak az a beteg, akinél 90 napon belül kialakult egy újabb stroke (2. táblázat). Az ezekkel a TIA-altípusokkal összefüggésbe hozható géneket az e-1. C és D táblázatban tüntettük fel. TIA predikciós elemzés. A 480 próbakészleten alkalmazott lineáris diszkriminanciaanalízissel és elôre irányuló kiválasztással összesen 34 olyan próbakészletet azonosítottunk, amelyek optimális módon elkülönítik a TIA-betegeket a kontrolloktól (3. táblázat). Az említett

2. táblázat

A TIA1- és TIA2-alcsoportok demográfiai és klinikai jellemzôia TIA1 (n = 13)

TIA2 (n = 13)

P-érték

Életkor, év, átlag±SE

61,8±3,1

68,6±3,4

0,15

Nônem (%)

6 (46,2)

7 (53,8)

0,71

Kaukázusi rassz, n (%)

7 (53,8)

8 (61,5)

0,71

Hypertonia

10 (76,9)

9 (69,2)

0,67

Diabetes

5 (38,5)

4 (30,8)

0,69

Hyperlipidaemia

7 (53,8)

8 (61,5)

0,71

Dohányzás

7 (53,8)

6 (46,2)

0,71

TIA óta eltelt órák, átlag±SE

33,9±7,5

36,4±4,8

0,78

Stroke az anamnézisben, n (%)

4 (30,8)

4 (30,8)

1,00

CVD, n (%)

3 (23,1)

4 (30,8)

0,67

AF, n (%)

0 (0)

1 (7,7)

0,33

LVD, n (%)

0 (0)

1 (7,7)

0,33

ABCD2-pontérték, átlag±SE

5,23±0,4

4,77±0,4

0,42

DWI-laesio az MRI-n

3

0

0,07

90 napon belül recidiváló ischaemiás esemény

1

0

0,31

Antithromboticus

9 (69,2)

10 (76,9)

0,67

Vérnyomáscsökkentô

8 (61,5)

9 (69,2)

0,69

Lipidszintcsökkentô szer

8 (61,5)

11 (84,6)

0,20

Diabetes

3 (23,1)

1 (7,7)

0,30

Vascularis kockázati tényezô, n (%)

Gyógyszeres kezelés, n (%)

A t-próbával vagy χ2-próbával végzett elemzés nem talált szignifikáns eltérést a két csoport között. Rövidítések: AF=(atrial fibrillation) pitvarfibrilláció; CVD=(cardiovascular disease) cardiovascularis betegség; DWI=(diffusion-weighted imaging) diffúziósúlyozott képalkotás; LVD=(large vessel disease) nagyérbetegség; SE=(standard error) standard hiba; TIA=tranziens ischaemiás attak. a

34 próbakészlet felhasználásával kialakítottunk egy LDA predikciós modellt, majd a kiértékelést tízszeres „leaveone-out” (hagyj ki egyet!) keresztvalidálással végeztük. A TIA-betegeket 100%-os szenzitivitással (a 26 TIA-beteg közül 26 helyesen lett besorolva) és 100%-os specificitással (a 26 kontroll közül 26 helyesen lett besorolva) tudtuk elkülöníteni a kontrolloktól. A tranziens ischaemiás attakkal összefüggésbe hozható gének funkcióelemzése. A TIA-betegeket a kontrolloktól elkülönítô 480 próbakészlet funkcióelemzése azt igazolta, hogy ezek a próbák szignifikáns módon hozhatók összefüggésbe bizonyos immunfunkciókkal. A tranziens ischaemiás attakkal összefüggésbe hozható gének hasonló immunológiai mintázatot mutattak, mint azok, amelyeket korábban autoimmun betegségekben, például rheumatoid arthritisben és Crohn-betegségben írtak le. A TIA funkciós útvonalait ugyanakkor olyan immunológiai mintázatokkal is összefüggésbe tudtuk hozni, mint amilyeneket korábban atherosclerosisban és arteria coronaria betegségben írtak le (e-2.A táblázat). Az útvonalakat és a hozzájuk társuló génexpressziós eltéréseket az e-3.A táblázatban mutatjuk be. A TIA-altípusokkal összefüggésbe hozható gének funkcióelemzése. A TIA-betegek két csoportba tömörültek RNS-expressziós profiljuk alapján (1. ábra). Annak

érdekében, hogy még jobban jellemezhessük ennek a felfedezésnek a jelentôségét, elvégeztük a TIA1- és TIA2alcsoportok másodlagos funkcióelemzését. A TIA1 elnevezéssel jelölt alcsoportban statisztikai szempontból több atherosclerosishoz, stroke-hoz, arteria coronaria betegséghez, hypertoniához és diabetes mellitushoz kapcsolódó gént találtunk, mint a TIA2-alcsoportban (e-2.B táblázat). A TIA-RNS-altípusokkal összefüggésbe hozható útvonalakat és a hozzájuk társuló géneket az e-3. B és C táblázatban tüntettük fel. MEGBESZÉLÉS Tranziens ischaemiás attakot követôen gyulladással és alvadással összefüggésbe hozható specifikus gének expresszálódtak a vérben a kontrollokhoz viszonyítva. További vizsgálatokra van szükség annak eldöntésére, hogy vajon ezek a gének TIA-specifikus kezelés potenciális célpontjai lehetnek-e, illetve használhatók-e a TIA biomarkereiként. A tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegeknél két RNS-expressziós mintázatot találtunk. Az említett RNS-alcsoportok klinikai jelentôsége még nem tisztázott, bár ezek az adatok erôteljesen arra utalnak, hogy tranziens ischaemiás attakban különbözô immunaktivációs útvonalak állhatnak fenn. A tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegeknél egyedi gyulladásos mintázatok lehetnek jelen, amelyek a késôbbi ischaemiás vascularis történések kialakulásához vezethetnek. Korábbi vizsgálatok fokozott leukocytaaktivációt és szisztémás gyulladásos választ,6,7 valamint fertôzés,16–18 illetve más gyulladásos állapotok jelenlétét19–22 mutatták ki tranziens ischaemiás attakban. A TIAbetegeknél számos olyan gén eltérôen expresszálódott, amelyeket korábban gyulladásos bélbetegségekkel, rheumatoid arthritisszel és cardiovascularis betegségekkel hoztak összefüggésbe. Továbbra is tisztázatlan marad, hogy vajon ez a gyulladásos mintázat már a TIA kialakulása elôtt jelen volt-e, vagy az akut TIA következtében alakult ki. Amennyiben a tranziens ischaemiás attakhoz társuló gyulladás akut folyamat, arra számíthatunk, hogy ez idôvel megváltozik. Amikor összehasonlítottuk a génexpressziót a TIA-betegektôl 24 órán belül levett vérben (n=11) és a 24–72 óra múlva levett vérben (n=15), a 24 óra múlva expresszálódó gének 90%-a hasonló volt a 24–72 óra múlva expresszálódó génekhez (az adatokat nem mutatjuk be). Bár további génexpressziós vizsgálatok elvégzésére van szükség, ezek az adatok arra utalnak, hogy a TIA-betegeknél feltehetôen krónikus gyulladásos állapot áll fenn, amely hozzájárul a szimptomatikus cerebrovascularis betegségek kialakulásához. A TIA-betegeknél az alvadással összefüggésbe hozható gének fokozott expresszióját is kimutattuk. Mégpedig az elsôdleges haemostasishoz (többek között a thrombocytaaktivációhoz és -aggregációhoz) és a másodlagos haemostasishoz (az intrinsic és extrinsic útvonalakat is ideértve) kapcsolódó géneket is azonosítottunk. Érdekes módon a TIA-betegeknél a trombin és a Xa alvadási faktor egyik inhibitora, a szöveti faktor útvonalé, felülregulált volt, ami arra utal, hogy tranziens ischaemiás attakban feltehetôen a véralvadási kaszkád és a thrombusképzôdés eltérô regulációja áll fenn. A kollagént és a von Willebrand-faktort 33

3. táblázat

A lineáris diszkriminanciaanalízissel kimutatott 34 gén, amelyek 100%-os specificitással és 100%-os szenzitivitással különböztetik meg a TIA-betegeket és a kontrollokat

AFFY azonosító szám A gén szimbóluma

A gén megnevezése

„Fold change” (TIA vs kontroll)

206513_at

AIM2

Melanomában hiányzó 2

1,54

243365_s_at

AUTS2

Autizmusra hajlamosító 2

1,34

1560558_at

C9orf8O

9-es kromoszóma 80-as nyitott leolvasási kerete (open reading frame)

1,82

239871_at

CLTC

Clathrin, nehéz lánc (Hc), mRNS (cDNS klón IMAGE: 4812912)

–1,56

239309_at

DLX6

Distal-less homeobox 6

2,24

1553998_at

DMRTC1///DMRTC1B

DMRT típusú család Cl/// DMRT típusú család C1B

–1,57

1554333_at

DNAJA4

DnaJ (Hsp40) homológ, A-alcsalád, 4-es tag

–1,63

1557155a_at

FLJ30375

CDNA klón IMAGE:5301781

1,66

230047_at

FLJ32810

Hipotetikus fehérje FLJ32810

1,57

217487_x_at

FOLH1

Folát-hidroláz (prosztataspecifikus membránantigén) 1

2,04

1553613_s_at

FOXC1

Forkhead box C1

1,70

1553024_at

G30

LG30-szerû fehérje

1,64

1559520_at

GYPA

Glikoforin A

1,91

220085_at

HELLS

Lymphoid specifikus helikáz

–1,49

206858_s_at

HOXC4 ///HOXC6

Homeobox C4 /// homeobox C6

1,80

37566_at

KIAA1045

KIAA1045

–1,43

1558107_at

LOC283788

Hipotetikus fehérje LOC283788

–1,50

231434_at

LOC728460

A FLJ32921 fehérjéhez hasonló

1,73

219789_at

NPR3

Natriureticus peptid receptor C / guanilát-cikláz C (atrialis natriureticus peptid rec) 1,41

214111_at

OPCML

Opioidkötô fehérje / sejtadhéziós molekulaszerû

2,06

228825_at

PTGR1

Prosztaglandinreduktáz-1

1,83

235638_at

RASSF6

Ras-asszociáció (RaIGDSIAF-6) domén 6-os családtag

1,55

242385_at

RORB

RAR-hoz kapcsolódó árva (orphan) B-receptor

1,96

230730_at

SGCD

δ-szarkoglikán (35 kDa-os disztrofinasszociált glikoprotein)

1,46

206634_at

SIX3

SIX homeobox 3

1,86

232020_at

SMURF2

SMAD-specifikus E3 ubikvitin-proteinligáz-2

–1,38

1559545_at

SNRPN

Kis nukleáris ribonukleoprotein N-polipeptid

1,73

204913_s_at

SOX11

SRY (nemet meghatározó Y-régió) -box 11

2,22

202935_s_at

SOX9

SRY (nemet meghatározó Y-régió) -box 9

2,17

235342_at

SPOCK3

Sparc/oszteonektin, cwcv és kazal típusú domének proteoglikán- (tesztikán-) 3

1,60

1570035_at

TBC1D10A

CDNA klón IMAGE:4299416

–1,45

228121_at

TGFB2

β2-transzformáló növekedési faktor

1,76

222835_at

THSD4

I-es típusú tromboszpondin domént tartalmazó 4

2,13

226899_at

UNC5B

Unc-5 B-homológ B (C. elegans)

1,90

Rövidítések: TIA=tranziens ischaemiás attak.

(vWF)23 lebontó peptidázokat kódoló gének szintén túlzott mértékben expresszálódtak a tranziens ischaemiás attakos betegeknél a kontrollokhoz viszonyítva. Bár a von Willebrand-faktort lebontó peptidázokat már összefüggésbe hozták a stroke-kal24,25 és a thromboticus thrombocytopeniás purpurával,26 ez az elsô tranziens ischaemiás attakkal kapcsolatos beszámoló. Ezek az adatok arra utalnak, hogy tranziens ischaemiás attakban olyan prokoaguláns jellemzôk vannak jelen, amelyek kezelési célpontokká válhatnak. A hierarchikus clusterezés két TIA-csoport jelenlétére utalt, a TIA-betegeknél és a kontrolloknál eltérôen 34

expresszálódó génállomány alapján. Ennek ellenére nem tudtunk azonosítani egyetlen olyan klinikai tényezôt sem, amely szignifikáns eltérést mutatott volna a két csoport között. Mindemellett az MR-vizsgálatnál korlátozott diffúziót mutató mindhárom beteg a TIA1-csoporthoz tartozott. Az ilyen betegeknél köztudottan magasabb az utólagos stroke kialakulásának kockázata. Ezenkívül a TIA1-csoporthoz tartozó egyik betegnél stroke alakult ki a tranziens ischaemiás attakot követô három hónapon belül. Mindezek arra utalnak, hogy a TIA1-csoportban lévô betegeknél feltehetôen fokozott a rekurrens ischae-

2. ábra

A tranziens ischaemiás attak (TIA) vagy kontrolldiagnózis elôre vetített valószínûsége egy lineáris diszkriminanciaanalízis (LDA) modell alapján

Keresztvalidált valószínûség TIA

CV-valószínûség

Kontrollok

Kontroll TIA

Kontrollok

TIA

Alany Az LDA-modellt 34 olyan gén azonosítására használtuk, amelyek optimális módon elkülönítik a TIA-betegeket a kontrolloktól. A valószínûségszámítás alapja a tízszeres „leave-one-out” (hagyj ki egyet!) keresztvalidálási analízis volt. Az elôre vetített diagnózis valószínûségét az y tengelyen tüntettük fel, az alanyokat pedig az x tengelyen. A TIA-betegeket az x tengely jobb oldalán tüntettük fel, a kontrollokat pedig bal oldalon. A TIA elôre vetített valószínûségét piros színnel ábrázoltuk, a kontrollokét pedig kékkel. A TIA-betegeket 100%-os szenzitivitással és 100%-os specificitással tudtuk elkülöníteni a kontrolloktól. CV=(coefficient of variation) variációs koefficiens; LDA=(linear discriminant analysis) lineáris diszkriminanciaanalízis; TIA=tranziens ischaemiás attak.

miás események kialakulásának kockázata, bár a feltevés igazolására kiterjedtebb vizsgálatokra lesz szükség. A TIA1- és TIA2-csoportok eltérô génjei betekintést nyújtanak a két TIA-csoport közötti különbségekbe. A TIA2-csoport génexpressziós mintázata sokkal inkább hasonlított a kontrollok mintázatához, mint a TIA1-csoportban talált mintázathoz. Ez arra utalhat, hogy a TIA2-csoporthoz tartozhatnak a nem vascularis TIA-„utánzatok” is, ami megfelel a korábbi beszámolóknak, miszerint olykor igazi kihívást jelent a TIA-diagnózis felállítása.27 A TIA2-csoportban feltehetôen kevesebb gyulladás van jelen a TIA1-csoporthoz viszonyítva. A TIA1-csoportban túlzott mértékben expresszálódó gének leginkább gyulladással és extracelluláris mátrix újramodellezésével voltak kapcsolatosak. Bár ezek a TIA-alcsoportok fontosak, nagyobb mintákon végzett további vizsgálatokat kell elvégezni, mielôtt levonhatnánk a végleges következtetéseket. Jelen vizsgálatnak volt néhány korlátja. A minta az elemzett gének számához viszonyítva kisméretű volt. Bár elvégeztük a többszörös összehasonlítási korrekciót, ezt feltétlenül meg kell ismételni egy független, nagyobb méretű kohorszon. A polimeráz láncreakció (PCR, polymerase chain reaction) validálására is szükség van, mielôtt kijelentenénk, hogy ezek a gének TIA-specifikus markerek. Kontrollcsoportunkban több kaukázusi rasszhoz tartozó személy volt, mint a TIA-csoportban. Bár a kaukázusi rasszhoz tartozó személyekre korlátozott másodlagos elemzés nagyon hasonló eredményekhez vezetett, további vizsgálatok szükségesek annak meghatározására, hogy a rasszbéli különbségek mennyire befolyásolták a gének azonosítását. A releváns biológiai útvonalak azonosítása egyes TIA-betegek esetében potenciálisan hasznos lehet a kezelési mód személyre szabásához. Az akut tranziens ischaemiás attakban szenvedô betegek génexpressziós mintázata eltért a vascularis kockázati tényezôkkel rendelkezô, tünetmentes kontrolloknál talált mintázattól. A tranziens ischaemiás attakban expresszá-

lódó gének szisztémás gyulladásokkal, thrombocytaaktivációval és protrombinaktivációval hozhatók összefüggésbe. A tranziens ischaemiás attakos betegek kétféle RNS-expressziós mintázatának további vizsgálatára van szükség annak bizonyítására, hogy ezek a gének oki tényezôk lehetnek a TIA kialakulásában, illetve kockázati tényezôk az utólagos stroke kialakulásához. A SZERZÔK HOZZÁJÁRULÁSA Dr. Zhan: megtervezte a vizsgálatokat, begyűjtötte, elemezte és értelmezte az adatokat, statisztikai elemzést végzett, elkészítette a kézirat vázlatát, illetve átdolgozta. Dr. C. Jickling: begyűjtötte az adatokat, elemezte és értelmezte az adatokat, statisztikai elemzést végzett, és átdolgozta a kéziratot. Dr. Tian: begyűjtötte az adatokat, és átdolgozta a kéziratot. Dr. Stamova: átdolgozta a kéziratot. Dr. Xu: begyűjtötte az adatokat, és átdolgozta a kéziratot. Dr. Ander: begyűjtötte az adatokat, és átdolgozta a kéziratot. Dr. Turner: begyűjtötte az adatokat, és átdolgozta a kéziratot. M. Mesias: begyűjtötte az adatokat. Dr. Verro: begyűjtötte az adatokat, és átdolgozta a kéziratot. Dr. Bushnell: begyűjtötte az adatokat, és átdolgozta a kéziratot. Dr. Johnston: megtervezte a vizsgálatokat, és begyűjtötte az adatokat. Dr. Sharp: kigondolta és megtervezte a vizsgálatokat, begyűjtötte, elemezte és értelmezte az adatokat, szponzorokat talált, segített elkészíteni a kézirat vázlatát, illetve átdolgozta.

ÉRDEKELTSÉGEK Dr. Jickling a Canadian Institutes of Health Research (CIHR) munkatársa. Dr. Xu, dr. Ander és dr. Tian az AHA Bugher munkatársai. Dr. Turnert az ausztráliai National Health and Medical Research Council Postdoctoral Fellowship támogatja. Dr. Zhan a „The use of blood RNA in TIA” (A vér-RNS felhasználása tranziens ischaemiás attakban) című szabadalom társtulajdonosa. Dr. Jickling, dr. Tian és dr. Stamova nem számolnak be érdekeltségekrôl. Dr. Xu az American Heart Association Bugher Foundation alapítványtól kap kutatási támogatást. Dr. Ander az Ischemia Care tanácsadója és az American Heart Association társaságtól kap kutatási támogatást. Dr. Turner és M. Mesias nem számolnak be érdekeltségekrôl. Dr. Verro a Boehringer Ingelheim vállalattól kapott elôadói honoráriumot és az American Heart Association Bugher Foundationtôl kap kutatási támogatást. Dr. Bushnell a Boehringer Ingelheim vállalat tudományos tanácsadó testületében dolgozik, és kutatási támogatást kap a következôktôl: Bristol-Myers Squibb/Sanofi Pharmaceuticals Partnership, NIH/NINDS, American Heart Association Bugher Foundation, Hazel K Goddess Fund for Research on Stroke in Women. Dr. Johnston a „The RNA panel to identify TIA and risk stratify” (A TIA azonosítására és kockázati stratifikálására alkalmas RNS-panel) című szabadalom társtulajdonosa, és kutatási támogatást kap a következôktôl: sanofi-aventis, Strkyer Neurovascular, Boston Scientific, NIH (NCRR, NINDS), Kaiser-Permanente, AHA/ASA, Bugher Award. Dr. Sharp a Brain Research folyóirat rangidôs szerkesztôje, a „Gene expression profiles for the diagnosis of ischemic stroke” (Génexpressziós profilok az ischaemiás stroke diagnózisához) című szabadalom tulajdonosa, és az NIH/NINDS, valamint az American Heart Associationtôl kap kutatási támogatást. Beérkezett 2010. február 16-án. Végleges formában elfogadva 2011. május 4-én.

IRODALOM 1. Johnston SC, Nguyen-Huynh MN, Schwarz ME, et al. National Stroke Association guidelines for the management of transient ischemic attacks. Ann Neurol 2006;60:301–313. 2. Rothwell PM, Buchan A, Johnston SC. Recent advances in management of transient ischaemic attacks and minor ischaemic strokes. Lancet Neurol 2006;5:323–331. 35

3. Easton JD, Saver JL, Albers GW, et al. Definition and evaluation of transient ischemic attack: a scientific statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association Stroke Council; Council on Cardiovascular Surgery and Anesthesia; Council on Cardiovascular Radiology and Intervention; Council on Cardiovascular Nursing; and the Interdisciplinary Council on Peripheral Vascular Disease: the American Academy of Neurology affirms the value of this statement as an educational tool for neurologists. Stroke 2009;40:2276–2293. 4. Zhan X, Ander BP, Jickling G, et al. Brief focal cerebral ischemia that simulates transient ischemic attacks in humans regulates gene expression in rat peripheral blood. J Cereb Blood Flow Metab 2010;30:110–118. 5. Zhan X, Kim C, Sharp FR. Very brief focal ischemia simulating transient ischemic attacks (TIAs) can injure brain and induce Hsp70 protein. Brain Res 2008;1234:183–197. 6. Elneihoum AM, Falke P, Axelsson L, Lundberg E, Lindgarde F, Ohlsson K. Leukocyte activation detected by increased plasma levels of inflammatory mediators in patients with ischemic cerebrovascular diseases. Stroke 1996;27:1734–1738. 7. Ross AM, Hurn P, Perrin N, Wood L, Carlini W, Potempa K. Evidence of the peripheral inflammatory response in patients with transient ischemic attack. J Stroke Cerebrovasc Dis 2007;16:203–207. 8. McArdle N, Riha RL, Vennelle M, et al. Sleep-disordered breathing as a risk factor for cerebrovascular disease: a casecontrol study in patients with transient ischemic attacks. Stroke 2003;34:2916–2921. 9. Fon EA, Mackey A, Cote R, et al. Hemostatic markers in acute transient ischemic attacks. Stroke 1994;25:282–286. 10. Bigalke B, Stellos K, Geisler T, et al. Expression of platelet glycoprotein VI is associated with transient ischemic attack and stroke. Eur J Neurol 2010;17:111–117. 11. Arenillas JF, Alvarez-Sabin J, Molina CA, et al. C-reactive protein predicts further ischemic events in first-ever transient ischemic attack or stroke patients with intracranial large-artery occlusive disease. Stroke 2003;34:2463–2468. 12. Cucchiara BL, Messe SR, Sansing L, et al. Lipoproteinassociated phospholipase A2 and C-reactive protein for risk-stratification of patients with TIA. Stroke 2009;40:2332–2336. 13. Moore DF, Li H, Jeffries N, et al. Using peripheral blood mononuclear cells to determine a gene expression profile of acute ischemic stroke: a pilot investigation. Circulation 2005;111:212–221. 14. Tang Y, Xu H, Du X, et al. Gene expression in blood changes rapidly in neutrophils and monocytes after ischemic

36

stroke in humans: a microarray study. J Cereb Blood Flow Metab 2006;26:1089–1102. 15. Xu H, Tang Y, Liu DZ, et al. Gene expression in peripheral blood differs after cardioembolic compared with largevessel atherosclerotic stroke: biomarkers for the etiology of ischemic stroke. J Cereb Blood Flow Metab 2008;28:1320– 1328. 16. Chong PH, Kezele B. Periodontal disease and atherosclerotic cardiovascular disease: confounding effects or epiphenomenon? Pharmacotherapy 2000;20:805–818. 17. Beck J, Garcia R, Heiss G, Vokonas PS, Offenbacher S. Periodontal disease and cardiovascular disease. J Periodontol 1996;67:1123–1137. 18. Elter JR, Offenbacher S, Toole JF, Beck JD. Relationship of periodontal disease and edentulism to stroke/TIA. J Dent Res 2003;82:998–1001. 19. Andersohn F, Waring M, Garbe E. Risk of ischemic stroke in patients with Crohn’s disease: a population-based nested case-control study. Inflamm Bowel Dis 2010;16:1387–1392. 20. Freilinger T, Riedel E, Holtmannspotter M, Dichgans M, Peters N. Ischemic stroke and peripheral arterial thromboembolism in a patient with Crohn’s disease: a case presentation. J Neurol Sci 2008;266:177–179. 21. Karacostas D, Mavromatis J, Artemis K, Milonas I. Hemorrhagic cerebral infarct and ulcerative colitis: a case report. Funct Neurol 1991;6:181–184. 22. Schneiderman JH, Sharpe JA, Sutton DM. Cerebral and retinal vascular complications of inflammatory bowel disease. Ann Neurol 1979;5:331–337. 23. Shelat SG, Ai J, Zheng XL. Molecular biology of ADAMTS13 and diagnostic utility of ADAMTS13 proteolytic activity and inhibitor assays. Semin Thromb Hemost 2005;31:659–672. 24. Zhao BQ, Chauhan AK, Canault M, et al. von Willebrand factor-cleaving protease ADAMTS13 reduces ischemic brain injury in experimental stroke. Blood 2009;114:3329–3334. 25. Reid MJ, Cross AK, Haddock G, et al. ADAMTS-9 expression is up-regulated following transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) in the rat. Neurosci Lett 2009;452:252–257. 26. Just S. Methodologies and clinical utility of ADAMTS-13 activity testing. Semin Thromb Hemost 2010;36:82–90. 27. Uesu CT, Eisenman JI, Stemmer EA. The problem of dizziness and syncope in old age: transient ischemic attacks versus hypersensitive carotid sinus reflex. J Am Geriatr Soc 1976;24:126–135. Fordította: Dr. Okos Ella