ČESKÁ LÉKAŘSKÁ SPOLEČNOST J. E. PURKYNĚ Společnost patologické a klinické fysiologie - Sekce pro atherosklerosu Česká pediatrická společnost - Komise pro prevenci atherosklerosy v dětském a adolescentním věku SLOVENSKÁ LÉKAŘSKÁ SPOLEČNOST Společnost klinické biochemie - Sekce pro atherosklerosu ve spolupráci se Společnostmi klinické biochemie, praktických lékařů pro děti a dorost, klinické výživy a intensivní metabolické péče, obesitologickou a diabetologickou
4. INTERNÍ KLINIKA 1. LF UK
Vás vítají na symposiu s edukačním programem
ATHEROSKLEROSA 2014 diagnostika, léčba, prevence v dětském i dospělém věku
P r a h a 10. - 11. září 2014
Hlavní název: ATHEROSKLEROSA 2014 Podnázev: Diagnostika, léčba, prevence v dětském i dospělém věku Vydavatel: IV. interní klinika 1. LF UK Praha Náklad: 100 ks Měsíc a rok vydání: září 2014 Cena: neprodejné
ISBN 978-80-905595-1-6
ČESTNÉ PŘEDSEDNICTVO Prof. MUDr. Aleksi Šedo, DrSc. děkan 1. LF UK Praha
Prof. MUDr. Jozef Kollár, DrSc. president Sekce pro atherosklerosu SSKB
Prof. MUDr. Stanislav Štípek, DrSc. proděkan 1. LF UK Praha
PROGRAMOVÝ VÝBOR Josef Hyánek, Jozef Kollár, Eva Kohlíková, Marie Kunešová, Magdalena Lejsková, Petr Nachtigal, František Stožický, Eva Tvrzická, Miloš Votruba, Miroslav Zeman, Aleš Žák
ADRESA SYMPOSIA Lékařský dům Sokolská 31 120 26 Praha 2
tel.: 224 266 201-4
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA
OBSAH Autor
Str.
Alberty
1
Cahová
2
Dostálová
6
Hyánek
11
Chrpová
13
Malínská
18
Marková
21
Nachtigal
26
Oliyarnyk
30
Pánek
35
Poruba
38
Sabolová
42
Šimková
47
Škop
52
Trnovská
60
Vávrová
65
Ždychová
68
Kazdová
S1
Zeman
S6
Žák
S19
* Experimentální práce – průběné číslování * Přehledové články – S…
Redakce: S. Eichlerová, E. Tvrzická 4. interní klinika 1. LF UK
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA GROWTH CURVES FOR LIPID CARDIOVASCULAR RISK FACTORS IN CHILDREN AND ADOLESCENTS: IMPLICATIONS IN CLINICAL PRACTICE R. Alberty1 & D. Albertyová2 1 2
Department of Biology & Ecology, Matthias Belivs University, Banská Bystrica Department of Clin Biochemistry, F.D. Roosevelt Faculty Hospital, Banská Bystrica
Background Abnormal lipid levels (dyslipidemia) appear in childhood and tend to continue into adulthood. The currently recommended procedure for the detection of lipid disorders is based on the single set of risk cut-off points for the whole child and adolescent population. Objective To create age- and sex-specific growth curves for serum total cholesterol (TC), triglycerides (TG), LDL- and HDL cholesterol (LDL-C and HDL-C, respectively) in Slovak children and adolescents, and to compare age- and sex-specific cut-off points with the current approach to identifying and managing atherogenic dyslipidemia. Methods Data were extracted from a cross-sectional Slovak Lipid Community Study conducted in 2005-2007; 873 healthy children and adolescents aged 7 - 18 years were selected for this study. Smoothed percentile curves were generated by LMS Pro-software. Results All lipid parameters (except for TC and LDL-C in girls) were higher in puberty than in adolescence, with the lowest serum lipids between the ages of 15 and 16 years. Mean TG levels were higher in girls than in boys in all age groups. At the age of 18 years, about 15 % boys and 25 % girls had borderline and 6 % boys and 15 % girls had elevated TC. Elevated TG levels were seen in 13 % of boys and 11 % of girls while abnormally low levels of HDLC were found in 17 % of boys and 10 % of girls. Conclusion The results of this study suggest that 1) age and gender play a strong role in lipid measurements in children and adolescents, 2) Slovak children and adolescents have a relative high proportion of abnormal lipid levels, and 3) age- and sex-specific cut-off points for serum lipids facilitate the identification of dyslipidemia more effectively than the currently fixedpoints recommendations. (Adv Biol Chem 2013; 3: 419-426.)
-1-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA PARENTERAL NUTRITION ASSOCIATED LIVER DISEASE: THE POTENTIAL THERAPEUTIC EFFECT OF N-3 POLYUNSATURATED FATTY ACIDS M. Cahová, P. Wohl, D. Wagnerová, P. Šedivý, M. Dezortová, M. Drobný, H. Daňková, Z. Papáčková, E. Páleníčková, W. Bogner, H. Baštová, L. Kazdová Center for Experimental Medicine and Center of Diabetology, Institute for Clinical and Experimental Medicine, Prague Summary The home application of total parenteral nutrition (TPN) represents an irreplaceable and lifesaving treatment in patients with severe intestinal malabsorption. However, the treatment is often seriously complicated by TPN-associated liver disease (PNALD). Its etiology combines a number of common pathogenic factors, whose understanding may help us to improve our treatment modalities for liver disease patients in general. Recently, a substantial research has been focused on therapeutic potential of nutrients. Among them, n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) attract growing attention as they were demonstrated to improve blood lipid profiles and to reduce inflammation, steatosis, and liver damage in NAFLD/NASH patients. Our objective is to test the potential beneficial effect of n-3 PUFA both in terms of their measurable effects as well as of underlying mechanisms. This pilot study was focused on following issues: (1) Identification of the best correlating markers of inflammation and markers of PNALD in TPN patients; (2) Determination of markers of altered bile acid metabolism; (3) Evaluation of liver energy metabolism in TPN patients by phosphorus 31P MRS. Introduction The home application of total parenteral nutrition (TPN) represents an irreplaceable and lifesaving treatment in patients with severe intestinal malabsorption but it can also induce hepatic injury, that further significantly increase the morbidity and mortality of the patients. The development of liver parenchymal injury associated with TPN is multifactorial, including sepsis, non-specific intestine inflammation, primary or secondary cholangitis, cholelithiasis, bacterial translocation, short bowel syndrome, the disturbance of hepato-biliary circulation, the lack of enteral nutrition, the shortage of some nutrients (proteins, essential fatty acids, choline, glycin, taurin, karnitin, etc.) and the toxicity of the components of the nutrition mixture itself (glucose, fytosterols, mangan, aluminium, etc.). The critical evaluation of recently published studies shows that the composition of the lipid emulsion belongs to the critical factors determining the onset and development of hepatopathy (Goulet 2009). It was reported that that pure n-3 fish oil-based lipid emulsion reversed severe cholestasis when administered instead of soybean oil emulsion, in one case even resulting in the removal from the liver intestine transplant list (Gura 2008). The mechanism, explaining at least some aspects of hepatopathy associated with TPN may be the effect of different lipid emulsions on the activation status of macrophages. The liver possess a specific macrophage subpopulation -“resident macrophages”- that undergo local activation in response to various stimuli and express distinct patterns of surface markers, chemokines and cytokines (Mills 2000). Depending on the triggering stimuli and genetic background macrophages can undergo either “classical” (M1) or “alternative” (M2) activation -2-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA pathway. M1 response is an essential part of innate immunity and this pro-inflammatory program serves to protect the host again invading pathogens. However, if excessive, the inflammatory response becomes detrimental and retards the healing process. Microbial stimuli (bacterial lipopolysacharides, lipoproteins, various proteins) are recognized by surface receptors (i.e. Toll-like receptors) and the macrophage response includes the production of pro-inflammatory cytokines (TNFalpha, IFNgamma, IL-6) and low MW metabolites (ROS, NO). Toll-like receptors could be activated also by non-microbial molecules including fatty acids (FA) (Shi 2006). The final effect of particular FA probably depends on the level of saturation; maximal pro-inflammatory potential is attributed to saturated fatty acids (SFA) while polyunsaturated fatty acids (PUFA) exhibit inhibitory effect on TLR-dependent pathway. n-3 PUFA (namely, eicosapentoic acid EPA and docosapentaenoic acid DHA) are much more potent inhibitors of TLR activation as compared with n-6 or n-9 PUFA (Lee 2006). “Alternative” (M2) activation pathway triggered by IL-13 or IL-4 results in protective phenotype – it promotes maturation of alternatively activated macrophages to counteract excessive inflammation, enhance repair of tissues and may have a beneficial role in regulating nutrient homeostasis (Odegaard 2007). As known for many decades the septic conditions are associated with the onset of cholestasis without the mechanical obstruction of bile ducts. The molecular basis of this phenomenon was explained only recently when it has been demonstrated that cytokines produced by the pro-inflammatory (M1) activated macrophages decrease the expression of hepatobiliary transporters that are responsible for the enterohepatal circulation of bile acids (Ntcp-1, Slc10a1, BSEP, Abcb11). On the other hand the pro-inflammatory state is associated with the adaptive increase of the expression of transporters that ensure the reverse transport of the bile acids from hepatocytes to the circulation (Kosters 2010). It has recently emerged that bile acids (BA), besides their well-established roles in dietary lipid absorption and cholesterol homeostasis, are also signaling molecules which may activate several signaling pathways to regulate biological processes. Various pathologies associated with TPN administration strongly suggest the occurrence of the disturbances in BA metabolism in these patients. Recent research brought growing amount of evidence that BA receptors may be promising targets for treatment of both liver and metabolic diseases but further research is needed in order to fully elucidate their mechanism of action and to develop effective therapeutic strategies. Therefore, the first goal of this study was to identify the possible correlation(s) between markers of inflammation and markers of parenteral nutrition-associated liver disease (PNALD). Numerous clinical studies further indicate that the energy metabolism in TPN patients may be a good indicator of the balanced nutrition mixture composition and administration scheme. The main objective to the wider application of this parameter in clinical practice is a problem with non-invasive evaluation of parameters of interest, particularly of the phosphorylation status of specific compounds in the liver and calf muscle tissues. We decided to employ 31P magnetic resonance spectroscopy (MRS) in order to validate a non-invasive method of examination reflecting the metabolic fitness of the subject. It may serve as an independent marker of liver and skeletal muscle mitochondrial function. In order to optimize the experimental MRS protocol we set out to explore whether there is any correlation between the signal intensity of 31P and 1H metabolites and time from disconnection of parenteral nutrition. -3-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Materials and Methods Study 1: The patients enrolled into the pilot study (n = 5) represent a homogenous group with respect to short bowel syndrome (short bowel residuum length 20-30 cm) of acute mesenterial ischemia origin. All of them were monitored every 5th week during last 6 months. Two patients were administered n-3 fatty acids only, three of them were provided a combination of SMOF lipid (mixture of saturated and unsaturated fatty acids) and pure n-3 fatty acids. Three of these patients are followed since 2012, including MR examination. Study 2: Three patients on long-term TPN were included into the study with different characteristics as regard to inflammation status, liver injury and cholestasis. The patients were examined three times a day, 3.5, 8.5 and 13.5 hours after disconnection of parenteral nutrition. MR examination was performed at 3 T whole body TRIO tomograph (Siemens). Using proton 1 H MR spectra, we measured hepatic fat content (HFC) as % of the liver (according to protocol described by Hajek et al.). Phosphorus 31P MRS was employed to determine relative content of ATP (βATP/total phosphorus signal [TP]; a marker of energy status), inorganic phosphate (Pi/TP; a marker of energy turnover) and phosphodiesters (PDE/TP; a marker of membrane phospholipids and catabolic processes) in the liver. All subjects were informed about the protocol of examinations and signed the consent with the examination protocol approved by local ethical committee. Results Study 1: Characterization of pilot cohort of patients In the group of five patients, the best correlation was found between conjugated bilirubin and serum bile acids (0.752), AST (0.705), ALP (0.678) and CRP (0.535). On the other hand, no correlation was found for CRP or conjugated bilirubin and ALT a GGT, resp. The correlations calculated for each individual patient did not significantly differ from values obtained for the whole group with exception of patient No. 2 who displayed significantly higher serum levels of bilirubin. Study 2: Stability of 31P and 1H MR metabolic profiles during post-TPN period Three patients with clinical characterization described in the Table 1 underwent examination according the protocol described above. The data of three long-term monitored patients are shown in Table 1. Patient ID 1 2 3
Bile acids
HFC (%)
CRP (mg/l)
2014 2.1 10 15.5
2012 19.6 6.7 2.6
2012 77.9 52.8 146.2
2014 1.2 17.4 2.7
2014 0.3 0.8 12.2
unconjugated bilirubin (µmol/l) 2012 2014 18.5 7 24.5 31.1 28.3 15.7
conjugated bilirubin (µmol/l) 2012 2014 12.3 4.2 10.2 7.4 10.1 7.1
ALP (µkat/l) 2012 2.28 4.07 2.14
2014 1.55 2.02 2.71
Following results were obtained: 1. In patient No. 1 (mild steatosis, no inflammation, no cholestasis) we observed statistically significant increase in HFC content along with duration of fasting period. In patient No. 2 (severe steatosis, positive markers of cholestasis, no inflammation,) and No. 3 (no steatosis, positive markers of cholestasis, acute inflammation) we did not find any changes during the tested period. -4-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA 2. We have not observed significant changes in 31P MR spectra during tested period in any patient. Some trends are under discussion and will be studied together with corrections to the relative voxel position to the coil and relaxation times. Conclusions: Study 1: Our data suggest that regression of steatosis may be associated with normalization of inflammation and cholestasis markers (patient No. 1). The progression of steatosis seems to be related rather to cholestasis and independent on inflammation (patient No. 2). Nevertheless, since the data are based only on extremely small sample, they can be viewed only as suggestive, and obviously do not allow drawing of any definite conclusions. The detailed study on a statistically sufficient cohort is supposed to bring convincing results. Study 2: Our pilot study demonstrates feasibility of this sophisticated technique for clinical use. It also shows that it is important to hold fixed time interval between magnetic resonance examination and time of TPN disconnection. Second, 31P MR data describe the actual metabolic situation in the liver. Metabolic changes in the liver of the healthy controls will be further studied. Furthermore, the first experience also point to importance of the selection of patients, who should be, in terms of etiology and current problems (inflammation, etc.) as much homogeneous as possible. This study was supported by MH CR-DRO (“Institute for Clinical and Experimental Medicine – IKEM, IN 00023001”) and IGA MH CR NT11275-6. Reference Goulet O., Joly F., Corriol O., Colomb-Jung V. Curr Opin Organ Transplant 2009, 14: 256261. Gura KM, et al. Pediatrics 2006, 121: e678 – e686. Hájek M., Dezortová M., Wagnerová D., et al. Magn Reson Mater Phy 2011, 24(5), 297-304. Mills C.D., Kincaid K., Alt J.M., et al. J Immunol 2000; 164: 6166-73. Shi H., Kokoeva M.V., Inouye K., et al. JCI 2006; 116: 3015-3025. Lee J.Y., Hwang D.H. Mol Cells 2006; 21: 174-185. Odegaard J.I., Ricardo-Gonzales R., Goforth M.H. et al. Nature 2007; 447: 1116-1120. Kosters A. and Karpen S. Sem Liv Disease 2010; 30: 186 - 194.
-5-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA OBSAH TUKU A SLOŽENÍ MASTNÝCH KYSELIN TUKU VYBRANÝCH POTRAVINÁŘSKÝCH VÝROBKŮ J. Dostálová, M. Doležal Ústav analýzy potravin a výživy, VŠCHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6 - Dejvice Abstract The fatty acids composition of 11 samples of commonly used fats and oils and 14 products which are used as spread on bakery products from Czech retail in year 2013 were analysed and evaluated from nutritional point of view. Úvod Složení mastných kyselin přijímaného tuku má významný vliv (pozitivní i negativní) na řadu závažných onemocnění s vysokým výskytem v populaci vyspělých průmyslových zemí (nemoci srdce a cév, diabetes typu 2, některá nádorová onemocnění, obezita aj.). Ve většině výživových doporučení jsou uvedena pouze doporučení k příjmu jednotlivých skupin mastných kyselin v % denní doporučené dávky energie. Detailní doporučení k příjmu tuků a olejů se vyskytují ojediněle, většinou se doporučuje pouze příjem tuku v poměru tuky rostlinné : živočišné 2:1. Složení mastných kyselin má také velký vliv na stabilitu olejů a tuků při vysokých teplotách používaných při oblíbených způsobech kulinární úpravy potravin, zejména při smažení. Většina běžných spotřebitelů a mnohdy ani odborníci neznají složení mastných kyselin tuků a olejů, které používají, a proto jsme v tržní síti České republiky zakoupili nejběžněji se vyskytující tuky a oleje. U oleje olivového i řepkového jsme zakoupili i oleje nerafinované (za studena lisované). Místo másla jsme analyzovali ghee, které lze použít i na smažení, protože neobsahuje vodu a bílkoviny jako máslo. Dále jsme analyzovali složení mastných kyselin tuku výrobků, které si mažeme na chléb a pečivo, protože se v mediích často objevují informace o nevhodném složení roztíratelných tuků (margarínů), zejména z hlediska vysokého obsahu trans mastných kyselin. Vybrali jsme zástupce másel, rostlinných roztíratelných tuků, tavených sýrů a jejich analogů, tukových pomazánek, přírodních čerstvých a termizovaných sýrů. Experimentální část Bylo analyzováno celkem 11 vzorků jednodruhových tuků a olejů a 14 výrobků, které se používají jako pomazánka na chléb a pečivo zakoupených v běžné tržní síti v r. 2013. Po izolaci tuku standardními metodami bylo zastoupení mastných kyselin stanoveno po jejich esterifikaci na methylestery methanolovým roztokem hydroxidu sodného metodou plynové chromatografie za použití kolony SP 2560 (Supelco). Obsah mastných kyselin byl vyhodnocen jako procentuální zastoupení plochy píku daného methylesteru mastné kyseliny v chromatogramu k celkové ploše všech methylesterů.
-6-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Výsledky
Tabulka I Zastoupení mastných kyselin v běžných olejích a tucích (% z celkových mastných kyselin) Vzorek Škvařené vepřové sádlo 1 Škvařené vepřové sádlo 2 Ghee, přepuštěné máslo Palmový olej rafinovaný Kokosový olej rafinovaný Olivový olej (směs raf. a pan. oleje) Extra panenský olivový olej Slunečnicový olej rafinovaný Sójový olej rafinovaný bio Řepkový olej rafinovaný Řepkový olej lisovaný za studena
TFA 0,3 0,5 3,3 0,4 0,1 0,3 0,1 0,5 0,1 0,1 0,1
SFA 49,4 40,2 67,6 41,2 89,8 16,1 15,5 11,4 16,2 7,3 7,6
MUFA 39,6 46,1 26,0 45,9 8,3 76,1 77,1 30,5 25,1 66,3 65,1
PUFA 10,7 13,3 3,1 12,5 1,9 7,5 7,4 57,6 58,5 26,4 27,2
n-3 0,8 0,5 0,4 0,2 0,0 0,4 0,4 0,0 7,2 7,6 7,7
n-6 9,5 12,2 2,2 12,3 1,9 7,1 7,0 57,5 51,3 18,5 19,2
Tabulka II Obsah tuku (%) a složení mastných kyselin (% z celkových mastných kyselin) tuku výrobků které se používají jako pomazánka na chléb a pečivo. Vzorek Rama Classic Flora Promiena SOLEIL Alfa Jihočeské AB Jihočeské máslo Máslo Dr. Halíř Pribina s máslem Javor jemný tavený Bonté natur Veselá kráva Pomazánkový krém Přírodní čerstvý sýr Lučina
Obsah tuku 60 45 70 70 78 82 82 19 20 23 20 28 22 27
SFA 29,5 23,1 23,9 27,5 65,2 67,4 66,3 67,8 43,5 48,7 68,8 53,5 64,5, 66,4
MUFA 46,3 28,0 37,6 50,7 27,8 26,2 27,0 26,3 40,8 41,1 26,0 38,0 28,8 27,0
-7-
PUFA 23,7 48,3 28,3 21,0 4,4 3,2 3,3 2,3 14,7 9,7 2,4 8,0 3,5 3,2
TFA 0,6 0,6 10,2 0,8 2,7 3,3 3,3 3,7 1,0 0,6 2,8 0,6 3,2 3,5
n-3 5,2 11,9 2,3 5,7 0,5 0,8 0,7 0,7 3,3 1,2 0,6 0,5 0,6 0,7
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Tabulka III Velikost porce a čerpání SFA a n-3 PUFA v % z doporučeného denního příjmu pro průměrného obyvatele jednou porcí Vzorek Rama Classic Flora Promiena SOLEIL Alfa Jihočeské AB Jihočeské máslo Máslo Dr. Halíř Pribina s máslem Javor jemný tavený Bonté natur Veselá kráva Pomazánkový krém Přírodní čerstvý sýr Lučina
Velikost porce v g 10 10 10 10 10 10 10 20 20 30 20 10 30 30
Čerpání SFA 8,8 5,2 8,4 9,6 25,4 27,6 27,2 12,9 8,5 16,5 13,8 7,5 20,9 26,9
Čerpání n- 3 14,2 24,3 7,2 18,0 1,7 2,8 2,6 1,2 5,8 3,6 1,1 0,6 1,8 2,4
Hodnocení jednotlivých tuků a olejů Sádlo jako každý živočišný tuk obsahuje cholesterol, který se při vysokých teplotách oxiduje. Oxidační zplodiny cholesterolu se snáze usazují v cévách než neoxidovaný cholesterol. Obsah nasycených mastných kyselin (SFA) je nižší než u mléčného tuku. Obsah polyenových mastných kyselin (PUFA) je nízký, ale vyšší než u mléčného tuku, obsah n-3 MK je minimální. Složení sádla velmi závisí na krmivu a dalších faktorech (více než u mléčného tuku). Ghee (přepuštěné máslo) je bezvodý mléčný tuk, který se připravuje z másla odstraněním vody a bílkovin, buď rozpuštěním a filtrací přes plátno nebo vyvařením vody a odstraněním usazeniny z mléčných bílkovin. Obsahuje cholesterol. V průměru dvě třetiny mastných kyselin mléčného tuku tvoří mastné kyseliny nasycené. Menší podíl (přibližně do 10 %) představují nasycené mastné kyseliny s krátkým a středním uhlíkovým řetězcem (do 10 uhlíků), které se metabolizují jinak než mastné kyseliny s dlouhým řetězcem, jsou lehce stravitelné, neukládají se ve formě zásobního tuku a nemají vliv na krevní lipidy. Velkým nedostatkem je nízký obsah PUFA, obsah n-3 MK je minimální. Palmový olej má poměrně vysoký obsah SFA (v námi analyzovaném oleji byl obsah SFA na dolní hranici rozsahu uváděném literaturou). Obsah PUFA je nízký, n-3 MK minimální. Jako ostatní rostlinné oleje a tuky neobsahuje cholesterol v množstvích významných z hlediska výživy, ale rostlinné steroly, které působí antagonisticky vůči cholesterolu. V rafinovaných olejích je jejich obsah snížen cca o jednu třetinu původního obsahu. Kokosový tuk (olej) má extrémně vysoký obsah nasycených mastných kyselin (téměř 90 %, podle literatury může být i vyšší) s vysokým podílem kyseliny laurové a myristové, které mají negativní vliv na krevní lipidy. Obsah PUFA je minimální (1,9 %), n-3 MK nulový. Olivový olej má nízký obsah SFA ale i PUFA (méně než sádlo i palmový olej). Hlavními MK jsou kyseliny monoenové, které mají na krevní lipidy neutrální vliv. Z hlediska výživového působí pozitivně rostlinné steroly a antioxidanty, především fenolové. Olej rafinovaný a panenský měly velmi podobné složení mastných kyselin (složení MK závisí více na jiných faktorech než na způsobu výroby). Panenský olej je nutričně výrazně hodnotnější vzhledem k vyššímu obsahu antioxidantů, rostlinných sterolů a v tuku rozpustných vitaminů. -8-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Slunečnicový olej má nízký obsah SFA, vysoký obsah PUFA, ale obsahuje pouze kyseliny n-6, obsah MK n-3 byl téměř nulový. Sójový olej má nízký obsah SFA, vysoký obsah PUFA. Obsahuje MK řady n-6, ale i poměrně vysoké množství MK řady n-3. Řepkový olej má nejnižší obsah SFA a vysoký obsah MUFA. Obsah PUFA je sice nižší než u slunečnicového a sójového oleje, ale obsah kyselin řady n-3 byl z analyzovaných tuků a olejů nejvyšší. Složení MK rafinovaného a nerafinovaného oleje se téměř neliší, rozdíl mezi oleji vyrobenými různým způsobem je v obsahu složek, které byly již zmíněny u olivového oleje. Všechny hodnocené oleje a tuky měly obsah trans-nenasycených mastných kyselin do 0,5 % z celkových mastných kyselin s výjimkou ghee, který měl obsah 3,2 %, což je pro mléčný tuk přirozené, ale z hlediska výživového vzhledem k běžnému konzumovanému množství zanedbatelné. Hodnocení výrobků, které si mažeme na chléb a pečivo Obsah tuku a složení MK ve výrobcích je uvedeno v tabulce 2. Vysoký obsah SFA (64,5 68,8 %) byl ve vzorcích obsahujících mléčný tuk. Tyto výrobky měly obsah TFA v rozmezí 2,7 - 3,7 % z celkových MK, což je běžný obsah pro mléčný tuk. Obsah PUFA byl také v rozmezí charakteristickém pro mléčný tuk (2,3 - 4,4 %). Ve výrobcích s přidaným rostlinným tukem bylo složení MK příznivější (nižší obsah SFA i TFA a vyšší obsah PUFA), protože nebyl přidán částečně ztužený rostlinný tuk nebo tuk kokosový. Z hlediska výživového měly nejvýhodnější složení rostlinné roztíratelné tuky Flora, Alfa a Rama Classic. Nejlepší složení měl roztíratelný tuk Flora, který měl nejnižší obsah SFA (23,1 %), nejvyšší obsah PUFA (48,3 %) s nejvyšším zastoupením kyselin řady n-3 (kyseliny linolenové) a zanedbatelný obsah TFA. Roztíratelný tuk Promiena měl ze všech výrobků nejvyšší obsah TFA (10,2 %), což při konzumaci cca 40 g výrobku vyčerpá tolerované množství TFA, které je pro průměrného obyvatele 2,5 g. Obsah SFA byl srovnatelný s ostatními výrobky tohoto typu. V tabulce 3 je uvedeno čerpání SFA a n-3 PUFA z doporučeného denního příjmu pro průměrného obyvatele jednou porcí. K příjmu SFA nejvíce přispívá máslo a výrobky mající vyšší obsah mléčného tuku jako je Lučina. Jedna porce (10 g másla a 30 g čerstvého sýra) vyčerpá pětinu až čtvrtinu tolerovaného denního příjmu SFA.Tyto výrobky přispívají minimálně k příjmu PUFA, zejména řady n-3. Z hlediska výživového je nejvýhodnější používání rostlinných tuků, které mají nízký obsah SFA a přispívají k plnění doporučení pro příjem MK řady n-3 PUFA. Závěr Složení mastných kyselin všech analyzovaných vzorků tuků a olejů bylo v souladu s údaji uváděnými v literatuře. Z hlediska výživového můžeme nejlépe hodnotit olej řepkový - nízký obsah SFA, vysoký obsah MUFA a nejvyšší obsah kyselin řady n-3, jejichž příjem je v naší populaci nedostatečný. Za ním následuje olej olivový, který nemá tak výhodné složení MK jako olej řepkový, ale obsahuje velké množství látek ochranných, zejména antioxidantů. Na třetím místě je hodnocen olej sójový vzhledem k nízkému obsahu SFA a relativně vysokému obsahu MK řady n-3. Všechny tyto oleje jsou rostlinného původu a neobsahují cholesterol. Jako nejméně vhodný pro lidskou výživu je možno hodnotit tuk (olej) kokosový s extrémně vysokým obsahem SFA a téměř nulovým obsahem PUFA. Tuky živočišného původu obsahují velké množství SFA, malé množství PUFA a cholesterol. Z hlediska vhodnosti na smažení jsou výhodné tuky s vysokým obsahem SFA (kokosový a palmový) a nízkým obsahem PUFA, neobsahující vodu a cholesterol. Ghee sice také neobsahuje vodu a bílkoviny jako máslo, na kterém se často smaží, ačkoliv je na smažení -9-
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA velice nevhodné, ale obsahuje velké množství SFA a cholesterolu. Všechny tyto jmenované tuky ale mají nevhodné složení MK z hlediska výživového. Na smažení se hodí i olej řepkový a olivový (zejména rafinovaný) vzhledem k nízkému obsahu PUFA. Na základě našich experimentů jsou tyto oleje poměrně stabilní. Mají i výhodné nutriční složení. Z hlediska nutriční hodnoty i tepelné stability je nejvhodnější olej řepkový. Pozitivním zjištěním je, že až na jeden výrobek (Promiena) rostlinné roztíratelné tuky mají zanedbatelný obsah TFA. Složení MK ostatních analyzovaných roztíratelných tuků je m příznivé - nízký obsah SFA a relativně vysoký obsah PUFA, Flora i kyseliny linolenové (n-3). Másla a další výrobky obsahující mléčný tuk z hlediska výživového výhodné složení nemají, ale pro zdravé jedince není nutné je z jídelníčku vylučovat, pokud se konzumují v přiměřeném množství. Vhodnější je používat jako pomazánku na chléb a pečivo rostlinné tuky, protože mléčného tuku konzumujeme většinou poměrně velké množství prostřednictvím mléčných výrobků, zejména sýrů. Literatura 1. Dostálová J., Dlouhý P., Tláskal P.: Výživová doporučení pro obyvatelstvo České republiky, Výživa a potraviny 67(3), 80-82, 2012, http://www.vyzivaspol.cz/rubrikadokumenty/konecne-zneni-vyzivovych-doporuceni.html) 2. Brát J.: Doporučení WHO 2013 - akční plán proti civilizačním chorobám, Sborník přednášek z 51. Mezinárodní konference o olejích a tucích, 15.-17.5.2013, Hrotovice, s. 19-23 3. Dostálová J., Doležal M.: Vývoj kvality tuků v potravinách z pohledu výživy, Sborník z XLIII. Symposia o nových směrech výroby a hodnocení potravin, 27.-29.5.2013, Skalský Dvůr, s. 26-29
- 10 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA NAŠE ÚSPĚCHY A NEÚSPĚCHY S LÉČENÍM VYSOKÉHO LIPOPROTEINU (A) U VYBRANÝCH DOSPĚLÝCH PACIENTŮ S HYPERCHOLESTEROLEMIÍ J. Hyánek, L. Dubská, S. Vaingátová, L. Táborský, B. Miková, J. Dvořáková, V. Martiniková, J. Privarová Metabolická ambulance a OKBHI Nemocnice Na Homolce, Praha Cíl Presentace vlastních positivních zkušeností s diagnostikou a léčbou u vybraných familiárních dyslipidemií provázených vysokou hladinou lipoproteinu (a)(Lp(a)) > 1000 mg/l. Úvod Lp(a) je důležitý metabolit lipidového spektra ze skupiny plasminogenové „rodiny“, který v současné době přitahuje pozornost. Představuje svojí protromboticko-antifibrinolytickou aktivitou největší podíl tzv.“residuálního rizika“ léčených pacientů pro kardiovaskulární onemocnění (KVO). Makromolekulární komplex o velikosti 300 až 850 kDa obsahuje částice LDL-cholesterolu, cholesterolové estery,fosfolipidy a triacylglyceroly (TAG). -S-S- vazbou spojený s apolipoproteinem B 100, ke kterému je připojen různě dlouhý glykolipidový (plasminogenový) decivariantní cringel; vykazuje 6-34 druhů isoforem; malé isoformy jsou velice agresivní pro cévní výstelku zatímco velké obsahující TAG jsou méně invasivní. Pacienti Dospělí pacienti z naší s hladinou Lp(a) > 1000 mg/l z ambulance (2003-2013)-celkem 58 pacientů, z nich 8 s výsledkem Lp(a) > 2000 mg/l a 5 > 3000 mg/l. Léčba Vybraní pacienti pro léčebné podávání niacinu (kys. nikotinové) byli poučeni o známých a dosti častých vedlejších účincích a po opakovaném stanovení vysoké iniciální hladiny Lp(a), určení individuální variace a stability hladin Lp(a) byla nasazena tehdy dopor. léčba Tredaptivem (MSD) 1-2tbl d.Po jeho stažení z lékáren nahrazena kys. nikotinová tuzemským výrobkem-vitamin B3,- Niacin v dávce 1-3 tbl/d. (B. Svoboda-praktik, Říčany, 18 mg v tbl = DDD), který je volně v lékárnách dostupný potravinový výrobek. Metoda Stanovení Lp(a) provedeno na principu kinetické nefelometrie na analyzátoru IMMAGE Beckman Coulter za použití kalibrátoru „Lipoprotein (a) kalibrator fy. Beckman Coulter“. Hodnota kalibrátoru 658 mg/l, liší se dle šarže. Analytické rozmezí metody: 20-1280 mg/l, rozšířené po automatickém ředění (20 - 6400 mg/l, ref. hodnoty: 70 - 300 mg/l). Centrifugace vzorků: do 2 hod po odběru, stabilita v séru 48 hod při uchovávání při 2 - 8o C. Výsledky 26 pacientů (31 %) odmítlo léčebné použití Tredaptivu ihned po seznámení s průvodním letákem preparátu, ostatní 2/3 pacientů se snažily brát 1 - 2 g/d po dobu několika týdnů, kdy skoro další 1/3 pacientů se středně těžkou prognosou KVO pro vedlejší účinky (kožní vyrážku, nevolnost, střevní dyskomfort, návaly horka, parestesie aj.) léčbu přerušila. Zbývající 1/3 pacientů (n = 12) vzhledem ke své velice vážné kardiovaskulární prognóze (restenózy, trombóza stentů, stenokardie, tromboembolie, opak. IM. a CMP) se snažila niacinovou léčbu udržet dokud byl Tredaptive u nás dostupný a po jeho stažení si jej dokonce získávala ze zahraničí. Tito pacienti i dnes konsumují 5 - 10 tbl. tuzemského Niacinu denně. U nich registrujeme výrazný pokles Lp(a) z tisícových hodnot na 500 - 600mg/l, který zůstává snížený jen po dobu léčby. Předkládáme a komentujeme typické kasuistiky vybraných pacientů v průběhu léčby .
- 11 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Závěr Přes dobrou laboratorní diagnostiku vysokých hladin Lp(a) byl úspěch její léčby Tredaptivem u vybraných pacitů efektivní, léčba tuzemským Niacinem je málo efektivní a další prognoza pacientů zůstává problematická. Studie s Tredaptivem (HPS2-THRIVE) byla pro výrazné vedlejší účinky zastavena. Jak vysvětlit situaci dosud úspěšně léčeným pacientům a kde seženou efektivní dávku niacinu(500-1000mg/tbl)? Zůstává pro nás dilematem, zda hladinu Lp(a) vůbec vyšetřovat (i když byl selektivní screening pacientů v EU doporučen) a co dělat s dětmi a adolescenty z rizikových rodin s enormně vysokými hodnotami Lp(a)?
- 12 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA POTENCIÁLNÍ DEFICIENCE NENASYCENÝCH MASTNÝCH KYSELIN U ŠETŘÍCÍCH DIET DIETNÍHO SYSTÉMU Chrpová D.1,2, Šimková Š.1, Pánek J.1 1 2
Ústav analýzy potravin a výživy, VŠCHT Praha VOŠZ a SZŠ 5. května, Praha 4
Správně volená výživa, resp. dieta, je nedílnou součástí léčebné terapie. Její složení a technologická úprava, které zohledňují zdravotní stav pacienta, by co nejvíce měly odpovídat složení stravy zdravého jedince. Měla by být jak energeticky tak biologicky plnohodnotná, tzn. měla by obsahovat doporučená množství energetických živin, vitaminů, minerálních látek a stopových prvků, vlákniny a tekutin. Vynechejme v tomto pojednání nutrici u akutních stavů, kdy je pacient živen parenterálně nebo enterálně, či mu je indikována krátkodobá přísná neplnohodnotná dieta, která řeší jeho aktuální zdravotní stav. Tato diskuse je zaměřena na hodnocení těch typů vybraných diet, které pacient dodržuje dlouhodobě, nezřídka po celý život. Například pacienti s některými onemocněními gastrointestinálního traktu celoživotně dodržují některou ze šetřících diet doporučovaného Dietního systému. Mezi nejčastěji používané šetřící diety patří „dieta č. 2 šetřící“. Je jakýmsi standardem šetřících diet. Ostatní šetřící diety z ní vycházejí a odvozují se od ní. Je energeticky i v podstatě biologicky plnohodnotná, v pevné konzistenci. Její složení je 9 500 kJ, 80 g bílkovin, 70 g tuků, 320 g sacharidů, 90 mg vitaminu C. Indikací pro tuto dietu jsou např. některá chronická zánětlivá onemocnění žaludku, jater či střev. Další šetřící dietou je „dieta č. 1 šetřící kašovitá“, která je jen mechanickou úpravou diety č. 2. Indikací diety č. 1 jsou zánětlivá onemocnění a chirurgické zákroky hlavně v horní části gastrointestinálního traktu – dutina ústní, jícen, žaludek. Dále se k šetřícím dietám řadí „šetřící dieta č. 4 s omezením tuku“. Její indikací jsou zánětlivá onemocnění střev, pankreatu, žlučníku. Má snížené množství tuku na cca 55 g za den. Celkovou energii doplňuje vyšší množství sacharidů. Šetřící dietou s dlouhodobým podáváním je i „dieta č. 5 s omezením zbytků“. Má stejné složení jako dieta č. 2. Díky striktnímu omezení vlákniny se doporučuje chybějící látky, které nejsou díky tomuto omezení dostatečně přijímány (vitaminy, hlavně vit C), doplňovat medikamentózně. Indikací jsou v některých případech zánětlivá onemocnění střev. Dieta č. 10 neslaná šetřící“ jak je vidět podle jejího názvu, je také šetřící dietou. Doporučuje se někdy pacientům s hypertenzí nebo při vzniku otoků jakékoliv etiologie. Odpovídá dietě č. 2, jen se připravuje v neslané podobě. V šetřící podobě lze připravit i jakoukoliv jinou dietu. Často se využívají diety diabetické v šetřící úpravě, jako je dieta č. 9/S. Je vhodná pro pacienty, kteří kromě onemocnění diabetes mellitus mají ještě zdravotní problém na gastrointestinálním traktu. Šetření těmito dietami spočívá ve výběru potravin a v technologické úpravě pokrmů. Gastrointestinální trakt se takto šetří jednak mechanicky – nepodávají se tvrdé slupky, kůrky vzniklé při pečení potraviny, nevhodná jsou zrníčka či semínka, dále termicky, kdy vadí ledové potraviny či velmi horké pokrmy a hlavně pak tzv. chemicky. Tento typ šetření je velmi důležitý zvláště pak pokud se šetřící diety podávají dlouhodobě. Výběr potravin se totiž při dlouhodobém podávání šetřící diety často rozšíří o druhy a typy potravin, které dříve tolerovány nebyly. Šetřící technologická úprava však zůstává. V rámci chemického šetření se pacientům nedoporučují dráždivá a výrazná koření, stejně tak se nedoporučují pikantní a různě ochucované potraviny. Do tohoto typu šetření náleží i důležitá zásada: tuk pro přípravu pokrmů nesmí být tepelně namáhán, ale je přidáván až do hotového pokrmu. Např. maso obalené v mouce se opéká na sucho, zalije vroucím vývarem či vodou a nechá dusit. Do vydušené šťávy masa, - 13 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA nezahuštěné přírodní či zahuštěné na sucho opraženou moukou, se pak vkládá čerstvý tuk. Stejně tak se vkládá tuk až do hotové polévky. Prakticky nejvíce používaným tukem pro tento účel je máslo, které je nejlépe senzoricky pacienty hodnoceno a je lehce stravitelné díky krátkým mastným kyselinám v něm obsažených. Máslo je ovšem také zdrojem nasyceného tuku a cholesterolu. Příklad jednodenního jídelního lístku pro šetřící dietu č. 2: Snídaně: Přesnídávka: Oběd: Svačina: Večeře.
Šípkový čaj. Pečivo. Máslo. Žervé. Ovoce. Zeleninová polévka. Kuřecí plátek. Rýže. Hlávkový salát Bílý jogurt. Banán. Brambory s tvarohem. Červená řepa.
Provedení denní bilance typu tuku v těchto šetřících dietách ukazuje (snídaně: máslo, tuk mléčného výrobku nebo tuk uzeniny; oběd: máslo v polévce, máslo v hlavním pokrmu, tuk v mase; svačina: tuk v zakysaném mléčném výrobku; večeře: máslo v hlavním pokrmu, tuk v mase), že pacienti dlouhodobě dodržující šetřící diety, mají ve své stravě výraznou převahu nasyceného tuku (záleží na typu masa, a i přestože občas někteří zařazují ryby), což odporuje současným nutričním doporučením, kdy převaha tuku ve stravě by měla být 2:1 ve prospěch tuku nenasyceného. Tabulka 1 Obsah tuku a poměr SAFA: UFA v potravinách použitých pro uvedený příklad jednodenního jídelního lístku pro jednu osobu diety č. 2 obsahující významnější množství tuku potravina množství množství tuku (g) SAFA : UFA potraviny(g) skutečný žervé 90 13,5 8,6 : 4,9 máslo 10 8,1 5,2 : 2,9 máslo polévka 5 4,0 2,6 : 1,5 kuřecí prso (bez kůže) 100 3,2 1,1 : 2,1 máslo hl. pokrm 10 8,1 5,2 : 2,9 bílý jogurt 150 2,3 1,5 : 0,8 tvaroh tvrdý 50 1,0 0,9 : 0,2 máslo 10 8,1 5,2 : 2,9 celkem ---50,1 30,3 : 18,2 SAFA : UFA doporučovaný 1:2 1,6 : 1 (Program Nutriservis; Potravinové tabulky Společnosti pro výživu.1992; Velíšek J. a J. Hajšlová. Chemie potravin I. Ossis Tábor. 2009) Z tabulky 1 je patrné, že doporučovaný poměr SAFA : UFA vychází u typizovaného jednodenního jídelního lístku šetřících diet pro jednu osobu prakticky opačně, než je poměr těchto typů mastných kyselin doporučovaný. Dalším příkladem bohužel dlouhodobě konzumované diety, převážně geriatrickými pacienty v geriatrických zařízeních, je dieta tekutá (v dietním systému označena jako „dieta č. 0 tekutá“). Patří také k šetřícím dietám. Na rozdíl od výše uvedených šetřících diet je však neplnohodnotná jak energeticky tak biologicky a proto způsobuje nebo zhoršuje malnutrici těchto pacientů, a proto jako taková je nevhodná k dlouhodobému dodržování. Při této dietě - 14 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA dochází k deficitu energie, bílkovin, nenasyceného tuku, vitaminů, minerálních látek a stopových prvků a vlákniny. Tuto dietu je nutné doplňovat nejlépe modulárními dietetiky, kterými se dieta zplnohodnotní. Tato modulární dietetika obsahují i nenasycené mastné kyseliny, které udržují jejich poměr s mastnými kyselinami dodávanými pokrmy alespoň přibližně v doporučovaném poměru. Pro úplnost je dále uvedeno, jakým způsobem vznikají jednotlivé typy mastných kyselin v organismu, a v kterých potravních zdrojích se vyskytují. Nasycené mastné kyseliny Nasycené mastné kyseliny se syntetizují z acetyl-CoA a z něj vzniklého malonyl-CoA kondenzačními reakcemi. Při každém cyklu se prodlouží řetězec mastné kyseliny vždy o dva atomy uhlíku a vzniklý poly-β-oxo řetězec, -[CH2-C(=O)]n-, se před připojením další molekuly acetyl-CoA skupiny redukuje. Proto se mastné kyseliny se sudým počtem atomů uhlíku vyskytují v lipidech daleko častěji než mastné kyseliny s lichým počtem atomů uhlíku. Syntéza se uskutečňuje pomocí komplexu zvaného synthasa mastných kyselin, ve kterém se vyskytuje specifický SH protein ACP (acyl carrier protein) obsahující vázanou pantothenovou kyselinu. Na konci syntézy je mastná kyselina s vázaným ACP, ze které se buď tvoří acyl-CoA, který reaguje s glycerol fosfátem (syntéza lipidů) nebo dochází k následným reakcím vedoucím k nenasyceným kyselinám. Biosyntéza se zastavuje obvykle po dosažení 16 atomů uhlíku, živočichové jsou obecně schopni k této molekule připojit ještě jednu molekulu acetyl-CoA, ale tato reakce již je obtížná. Vyšší mastné kyseliny již živočichové nesyntetizují. Rostliny produkující vosky mohou připojit ještě více molekul acetyl-CoA, ale i v tomto případě je to obtížnější. Proto je v běžných tucích a olejích obsah palmitové kyseliny (C16) podstatně vyšší než obsah stearové kyseliny. Vyšší kyseliny se i v rostlinách vyskytují vzácně a do tuku živočichů se dostávají výhradně přenosem z rostlinných tuků. Nenasycené mastné kyseliny Palmitoyl-ACP a stearoyl-ACP jsou výchozími látkami pro biosyntézu nenasycených mastných kyselin palmitolejové (cis-hexadec-7-enová kyselina) a olejové (cis-oktadec-9enová kyselina) (reakci katalyzuje ∆9-desaturasa). Působením ∆6-desaturasy vzniká z palmitové kyseliny cis-hexadec-4-enová kyselina, z níž vzniká petroselinová kyselina (cisoktadec-6-enová kyselina; reakci katalyzuje elongasa). Působením elongasy vzniká z palmitolejové kyseliny asklepová (cis-oktadec-11-enová) kyselina. Olejová kyselina je prekurzorem gondoové (cis-eikos-11-enové) kyseliny, ze které mohou vznikat další mastné kyseliny. Ze skupiny monoenových kyselin se v rostlinných i živočišných tucích nejběžněji vyskytuje olejová kyselina (v desítkách % všech mastných kyselin; některé oleje, např. olivový nebo vysokoolejový slunečnicový olej obsahují až 80 % olejové kyseliny), palmitolejová kyselina se vyskytuje obvykle v množství 0,5 až 4 %, asklepová a gondoová kyselina v desetinách % a ostatní kyseliny jsou ještě vzácnější. Působením ∆6-desaturasy přeměňují savci olejovou kyselinu na cis,cis-oktadeka-6,9dienovou kyselinu (polohový isomer linolové kyseliny), ale nemohou syntetizovat linolovou ani linolenovou kyselinu. Obě tyto kyseliny vznikají jen u rostlin a hub. Působením ∆12desaturasy vzniká linolová (cis,cis-oktadeka-9,12-dienová) kyselina, ∆15-desaturasa katalyzuje biosyntézu linolenové (all cis-oktadeka-9,12,15-trienové) kyseliny. Biosyntéza a metabolismus esenciálních kyselin V lidském organismu se řetězec linolové a α-linolenové kyseliny prodlužuje o 2, 4 a 6 atomů uhlíku (tzv. elongací za katalýzy elongasami /enzymy, které obecně prodlužují alifatický řetězec, jsou ale specifické právě pro mastné kyseliny/) a vytvářejí se další dvojné vazby (tzv. desaturací katalyzovanou desaturasami /enzymy z třídy oxidoreduktas/). Vznikají mastné kyseliny s 20-24 atomy uhlíku a se třemi až šesti dvojnými vazbami v molekule - 15 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA v uspořádání n-3 a n-6. Tyto vyšší esenciální mastné kyseliny mají v organismu živočichů nezastupitelnou úlohu jako prekurzory biologicky aktivních látek nazývaných souhrnně eikosanoidy a jako modulační složky biologických membrán (obvykle vázané esterovou vazbou na fosfolipidy), neboť ovlivňují jejich fluiditu a flexibilitu. Biosyntéza n- 6 kyselin je jednodušší. Z linolové kyseliny (C18:2 ∆9,12), která je výchozím prekurzorem, vzniká působením ∆6-desaturasy γ-linolenová kyselina (C18:3 ∆6,9,12), působením elongasy vzniká dihomo-γ-linolenová kyselina (C20:3 ∆8,11,14) a ∆5desaturasa katalyzuje vznik arachidonové kyseliny (C20:4 ∆5,8,11,14), která je vlastní esenciální kyselinou. Biosyntéza n- 3 kyselin vychází z α-linolenové kyseliny (C18:3 ∆9,12,15), ze které působením ∆6-desaturasy vzniká stearidonová kyselina (C18:4 ∆6,9,12,15). Následně působením elongasy a ∆5-desaturasy vzniká eikosapentaenová kyselina (EPA) (C20:5 ∆5,8,11,14,17), která je vlastní esenciální kyselinou. Biosyntéza pokračuje za účasti dvou elongas a ∆6-desaturasy přes klupanodonovou kyselinu (C22:5 ∆7,10,13,16,19) k tetrakosahexaenové kyselině (C24:6 ∆6,9,12,15,18,21), ze které β-oxidací vzniká dokosahexaenová kyselina (DHA) (C22:6 ∆4,7,10,13,16,19). Enzymy katalyzující desaturaci a elongaci n-6 a n-3 mastných kyselin jsou stejné, snadněji však probíhá desaturace a elongace u n-3 mastných kyselin. Určitá část populace má málo aktivní ∆6-desaturasu, což může vést k problémům v tvorbě vlastních esenciálních kyselin. Hlavními faktory, které mohou aktivitu ∆6-desaturasy negativně ovlivnit, jsou věk, stav výživy (inhibiční účinek na enzym má ethanol, negativní vliv má deficience vitaminu B6, biotinu, Zn, Mg a Ca, vyšší příjem kompetitivních inhibitorů - trans-nenasycených mastných kyselin a polohových isomerů nenasycených kyselin potravou), stres a virové infekce. Linolová kyselina se ve významném množství vyskytuje ve většině běžných rostlinných olejů a s jejím příjmem v dietě není problém. Příjem linolenové kyseliny je problematičtější, z běžných olejů jsou významnějším zdrojem pouze řepkový a sójový olej (velké množství je ve lněném oleji, který se ale potravinářsky prakticky nevyužívá). Proto lze za nejvýznamnější zdroj n-3 kyselin považovat tuk mořských ryb, obsahující EPA a DHA. Další oleje obsahující mastné kyseliny, které jsou meziprodukty syntézy (a které mohou sloužit jako vhodný doplněk při problémech s ∆6-desaturasou, jsou již méně známé. Patří sem např. pupalkový (Oenothera spp.) nebo brutnákový (Borago officinalis L.) olej, které jsou zdrojem γ-linolenové kyseliny, hadincový olej (Echium spp.), obsahující stearidonovou a γ-linolenovou kyselinu a oleje z řas (např. rodu Ulkenia), obsahující EPA a DHA. Existuje i řada doplňků stravy s γ-linolenovou kyselinou, dihomo-γ-linolenovou kyselinou, EPA aj. Závěr Jak je nastíněno v tomto sdělení, používání másla prakticky jako jediného volného tuku jak pro přípravu pokrmů, tak i ve studené kuchyni při dlouhodobém dodržování šetřící diety není z hlediska doporučovaného poměru nasycených a nenasycených mastných kyselin nejvhodnější. Je potřeba ve studené kuchyni naučit pacienty zařazovat i kvalitní margarin. Pro přípravu teplých pokrmů, kdy se tuk vkládá do hotového pokrmu, na prostřídání s máslem použít kvalitní jednodruhový olej, jako je např. řepkový, olivový, či slunečnicový. Korenspondenční adresa:
[email protected] Tabulka 2 Obsah mastných kyselin v procentech ve vybraných druzích tuku. (Velíšek J. a J. Hajšlová. Chemie potravin I. Ossis Tábor, 2009
- 16 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA
%
Kokosový tuk
Palmový tuk
Vepřové sádlo
kuřecí tuk
Rybí tuk
Olivový olej
Slunečni cový olej
Řepkový olej
Světlicov ý olej
Mléčný tuk
SSFA
14
x
x
x
x
x
x
x
x
10
LaMy
65
1
1
1
9
x
x
x
x
13
P
9
44
26
22
18
12
6
5
6
30
S
3
5
12
6
3
2
5
2
3
9
Sat ost.
x
x
x
x
x
1
1
x
1
2
celkem
91
50
39
29
30
15
12
7
10
64
Po
x
x
3
6
11
2
x
x
x
x
O
7
40
48
37
12
74
24
56
16
29
Mono ost.
x
x
x
1
4
x
x
3
2
x
celkem
7
40
51
44
27
76
24
59
18
29
L
2
9
10
20
1
12
63
21
70
2
Ln
x
x
x
1
1
1
1
10
x
1
EPA
x
x
x
x
15
x
x
x
x
x
DHA
x
x
x
x
10
x
x
x
x
x
n-6 ost
x
x
x
x
2
x
x
x
x
2
n-3 ost
x
x
x
x
6
x
x
x
x
x
celkem
2
9
10
21
35
13
64
31
70
S:M:P
50 : 4 : 1
5:4:1
4:5:1
3:4:2
1:1:1
1:5:1
1:2:5
1:8:5
n-6/n-3
x
x
x
20 : 1
1 : 10
12 : 1
63 : 1
2:1
- 17 -
Margarin y
Ztužené p. tuky
25 - 35
35 - 55
30 - 40
35 - 50
5
30 - 40
2. - 10
1:2:7
10 : 5 : 1
1:1:1
9:9:1
x
x
30 : 1
x
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA THE EFFECT OF METFORMIN ON CARBONYL AND OXIDATIVE STRESS IN HYPERTRIGLYCERIDEMIA AND CHRONIC INFLAMMATION VLIV METFORMINU NA KARBONYLOVÝ A OXIDAČNÍ STRES PŘI HYPERTRIGLYCERIDÉMII A CHRONICKÉM ZÁNĚTU H. Malínská1, J. Trnovská1, V. Škop1, O. Oliyarnyk1, M. Pravenec2, L. Kazdová1 Center for Experimental Medicine, 1 Institute for Clinical and Experimental Medicine, Prague 2 Institute of Physiology, Academy of Science, Prague Glycation process leading to advanced glycation end-product (AGE) has been identified as a biological phenomenon in the pathogenesis of diabetes and related-complications (Brownlee, 2005). Protein glycation is enhanced by increased blood glucose, however glucose appears to be less potent in AGE formation than the side-products of metabolic networks – reactive dicarbonyls commonly called glycotoxins. Dicarbonyls, in general, are formed as glycolytic intermediates in metabolic conversion of glucose, by degradation of glycated proteins and during lipid peroxidation process and are characterized by extremely high chemical activity. They are up to 20,000-fold as reactive as glucose, thus being able to form AGE-structures even at very low concentrations (Turk, 2010). Excessive generation of dicarbonyls has many pathological implications - leads to AGE production, activates inflammatory pathway, increases oxidative stress, has a toxic effect on insulin secretion and can play a key role in the development of diabetic vascular complications. Increased generation of reactive dicarbonyls occurs in diabetic patients and is related to glycemic and lipids status. Plasma level of methylglyoxal reflects the degree of hyperglycemia as correlated with postprandial glycemia. Biogenesis of dicarbonyls is assumed not to dependent exclusively on persisting hyperglycemia, but to be also conditioned by glycemic variability and production from ketone precursors. Therefore, it is likely that glycotoxins, even at good glycemic control can discreetly promote the pathology of diabetes complications. Dicarbonyls determination could be early biomarker risk for these complications (Matafome, 2013). Methylglyoxal is also produced in the course of lipid metabolism, but their percentille share has not yet been examined and effect of dyslipidemia on dicarbonyl stress is not fully clarified. The production of methylglyoxal related to lipid metabolism involves either enzymatic or non-enzymatic reactions, in which glycerol, acetoacetate or aceton is converted to dicarbonyls. This support the increasing evidence that lipids are as important as carbohydrates in chemical modification of protein. Methylglyoxal could be a common factor linking two dominant metabolic disorders – hyperglycemia and intensive lipolysis, with attendant AGE-pathologic sequels (Turk, 2011). Methylglyoxal accumulation may occur with impaired detoxification of dicarbonyls by the glyoxalase system or depletion of available glutathione due to oxidative stress. Carbonyl and oxidative stress interplay with each other. Excess of dicarbonyls induced mitochondrial oxidative stress and thus may contribute to inflammation and atherogenesis (Tikellis, 2014). According to recent study with apoE knock-out mice, dicarbonyl stress in the absence of hyperglycemia increases endothelial inflammation and atherogenesis similar to that observed in hyperglycemic diabetic mice (Tikellis, 2014). Dicarbonyl stress augments endothelial
- 18 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA activation and adhesion – elevated expression of adhesion molecules VCAM, ICAM-1 and inflammatory chemokine MCP-1. All therapeutic strategies for the prevention of diabetic complications rely on the premise that the deleterious effects of high glucose levels and enhanced metabolic flux are mediated by the generation of toxic metabolites. Of these, reactive dicarbonyls are among the most important. Metformin, the most widely prescribed glucose- and lipid-lowering agent for treatment of type 2 diabetes, has also been proposed as a scavenger of methylglyoxal. However its effect on individual dicarbonyls metabolism in tissue is not fully clarified. In our study we analyzed level of individual reactive dicarbonyls – methylglyoxal (MG), glyoxal (GL) and 3-deoxyglucosone (3-DG) in relation to lipid disorders, chronically inflammation and after metformin administration. Each dicarbonyls are determined by HPLC method with fluorescence detection after previous derivatisation with DDB (1,2-diamino-4,5dimethoxy-benzene). As experimental model we used non-obese rats with hereditary hypertriglyceridemia (HHTg rats), which exhibited other features of metabolic syndrome (fatty liver and insulin resistance) and transgenic rats with expression of human CRP. Transgenic expression of CRP worses insulin resistance and other disorders associated with metabolic syndrome (Pravenec, 2011). Reactive dicarbonyls in hypertriglyceridemia The relationship between lipid status and level of reactive dicarbonyls was analyzed in normotriglyceridemic (Wistar) and hypertriglyceridemic rats (HHTg) in serum and tissues. Table 1 Dicarbonyls levels in serum and tissues in HHTg rats compared to control Wistar (W) rats.
W HHTg W HHTg W HHTg W HHTg
serum myocardium aorta kidney
Data are mean ± SEM.
MG nM/mg 0,66 ± 0,10 1,79 ± 0,22** 8,66 ± 1,28 14,99 ± 0,78*** 9,78 ± 0,54 15,44 ± 0,42** 1,77 ± 0,03 2,79 ± 0,12**
GL nM-mg 0,87 ± 0,13 1,64 ± 0,18* 2,45 ± 0,43 3,53 ± 0,51* 8,61 ± 0,03 15,46 ± 0,74** 0,52 ± 0,06 0,83 ± 0,10*
3-DG nM/mg 0,53 ± 0,09 0,57 ± 0,11 3,19 ± 0,33 3,46 ± 0,45 4,30 ± 0,70 4,38 ± 0,75 0,69 ± 0,20 0,63 ± 0,16
* p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001
Compared with control, HHTg rats exhibited markedly elevated serum and tissue level of MG and moderate increased serum and tissue level of GL (Table 1). Level of 3-DG were not significantly different between HHTg and control rats. Serum level of MG negatively correlated with level of glutathione (r = 0,71, p < 0,01) as a consequence of detoxification of MG. Reactive dicarbonyls in chronic inflammation The relationship between chronic inflammation and level of reactive dicarbonyls was analyzed in spontaneously hypertensive rats with transgenic expression of human CRP. Compared to SHR control rats, transgenic rats exhibited significantly elevated level of MG in serum (0,342 ± 0,007 vs 0,234 ± 0,015 nM/ml p < 0,001) and myocardium (10,264 ± 0,897 vs - 19 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA 8,291 ± 0,999 nM/mg p < 0,05) and kidney cortex (2,942 ± 0,359 vs 2,207 ± 0,066 nM/mg p < 0,05). Level of GL and 3-DG were not significantly different in serum and tissues. Effect of metformin on carbonyl stress In hypertriglyceridemic rats metformin treatment (300mg/kg b.wt. for 4 weeks) was associated with significantly reduced level of reactive dicarbonyls in myocardium (MG: p < 0.05, GL: p < 0.05, 3-DG: p < 0.01), when compared to untreated HHTg rats. But there were no significant effects of metformin on dicarbonyls concentration in kidney cortex. Metformin administration also significantly improved glutathione metabolism in myocardium (GSH/GSSG: 4,65 ± 1,61 vs 2,15 ± 0,009; p < 0,001). In transgenic rats with increased expression of human CRP metformin treatment significantly decreased serum level of methylglyoxal (0,281 ± 0,003 vs 0,342 ± 0,07 nM/ml p < 0,05), but has no significant effect on dicarbonyls level in myocardium or kidney cortex. According to our results and Fleming human study with diabetic patients (Fleming, 2012), possible mechanism of metformin on dicarbonyl stress could be explained that metformin binds and inactivate methylglyoxal and increase carbonyl degradation (elevated glutathione level and glyoxalase 1 activity). Methylglyoxal also contribute to glycation of LDL particules and formation of proaterogenic sdLDL. Thus decreased of methylglyoxal can contribute to cardioprotective effect of metformin. Conclusion Results indicate that chronically elevated hypertriglyceridemia and FFA was associated with increased levels of methylglyoxal in serum and with markedly elevated reactive carbonyls in heart and kidney. Chronic elevated inflammation was also associated with increased reactive dicarbonyls in serum, heart and kidney. Results supported hypothesis that lipids and chronic inflammation can be associated with excess reactive dicarbonyls generation. Metformin administration in hypertriglyceridemia reduced methylglyoxal in heart but not in kidney. Beneficial effect of metformin administration on reactive dicarbonyls in heart could contribute to cardioprotective effect of metformin. Supported by Ministry of Health, Czech Republic – conceptual development of research organization („Institute for Clinical and Experimental Medicine – IKEM, IN 00023001“). References: Brownlee M. Diabetes 54, 1615-1625, 2005 Fleming T et al. Diabetologia 55: 1151-1155, 2012. Matafome P et al. Endocrine 43, 472-84, 2013 Pravenec M et al. Hypertension 57: 731-7, 2011. Tikellis Ch et al. Diabetes 2014 Turk Z. Physiol Res 59: 147-156, 2010. Turk Z et al. Life Science 89, 485-490, 2011
- 20 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA METABOLICKÉ ÚČINKY ZVÝŠENÉ KONZUMACE KYSELINY MYRISTOVÉ METABOLIC EFFECTS OF INCREASED CONSUMPTION OF MYRISTIC ACID I. Marková, H. Malínská, V. Škop, J. Trnovská, L. Kazdová Centrum experimentální medicíny, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha Úvod Saturované mastné kyseliny (MK) hrají významnou roli v rozvoji obezity, metabolického syndromu a inzulínové rezistence (IR). Indukují zánět tukové tkáně a stimulují sekreci prozánětlivých faktorů, negativně ovlivňují řadu komponent glukózového metabolismu, vedou k ektopické akumulaci triacylglycerolů ve tkáních, zhoršují utilizaci glukózy ve svalech, poškozují přenos inzulínového signálu v tukové i ostatních tkáních (Funaki et al. 2009, Vessby et al. 2004). Lipotoxicita, způsobená saturovanými MK, je tedy jedním z důležitých patofyziologických mechanismů rozvoje obezity a diabetu 2. typu. Negativní metabolické účinky saturovaných MK jsou spojovány převážně s kyselinou palmitovou, ale řada studií v nedávné době ukázala, že i další saturované MK (myristová, stearová) negativně ovlivňují metabolismus glukózy a zvyšují inzulínovou rezistenci. Jednotlivé saturované MK mají specifické vlastnosti a mohou se lišit svými metabolickými účinky. Na rozdílný vztah jednotlivých saturovaných MK k parametrům glukózového metabolismu a inzulínové senzitivity u původních obyvatel Aljašky upozornila recentní studie GOCADAN (Ebbesson et al. 2010). V této studii byla kyselina myristová pozitivně asociována s hladinami inzulínu a HOMA indexem, zatímco kyseliny palmitová a stearová byly významně spojeny jen s hladinami glukózy. Kyselina myristová (C14:0) patří mezi nasycené MK s dlouhým řetězcem. Ve formě acylu v triacylglycerolech je široce rozšířená v rostlinné a živočišné říši. Dietními zdroji kyseliny myristové jsou především tropické rostlinné tuky (kokosový, palmojádrový a palmový), živočišným zdrojem je mléko, máslo, sádlo a lůj (Tvrzicka et al. 2001). Hojně je využívána v potravinářském průmyslu jako univerzální přísada a látka zlepšující strukturu a vlastnosti vyráběných potravin (mražené krémy, cukroví, dorty, polevy) (Burdock et al. 2007, Dostálová et al. 2013). Endogenní syntéza kyseliny myristové je velmi malá. Podle posledních studií se ukazuje, že kyselina myristová může mít důležité regulační role v buňkách. Prostřednictvím acylace modifikuje aktivity enzymů a proteinů a tím ovlivňuje regulační a signalizační pochody v buňkách, včetně regulace aktivit desaturáz. Desaturázy hrají významnou roli v biosyntéze a metabolismu lipidů, u lidí je důležitá zejména stearoylCoA desaturáza (SCD), která je považována za hlavní enzym zodpovědný za přeměnu kyseliny palmitové (C16:0) a stearové (C18:0) na kyselinu palmitolejovou (C16:1) a olejovou (C18:1) (Ntambi et al. 2004). Význam SCD je v poslední době intenzivně zkoumán, protože její role byla prokázána v řadě metabolických chorob jako je diabetes, obezita, IR a hyperlipidémie (Flowers et al. 2008, Ntambi et al. 2003). Úloha kyseliny myristové ve vztahu k IR a metabolickému syndromu není zcela objasněna. V naší studii jsme sledovali účinky dlouhodobého podávání kyseliny myristové na parametry glukózového a lipidového metabolismu a na inzulínovou senzitivitu jednotlivých tkání. Obsah lipidů a spektrum mastných kyselin ve fosfolipidech jednotlivých tkání bylo doplněno výpočtem aktivit SCD a stanovením její exprese v tukové a jaterní tkáni. Materiál a metody Pokusy byly provedeny u tříměsíčních potkaních samců kmene Wistar. Potkanům byla podávána po dobu 2 měsíců vysokosacharózová dieta (60 kal% sacharózy) s 2% kyseliny - 21 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA myristové (Sigma-Aldrich), kontrolní skupina byla krmena dietou s 2% arašídového oleje (Rinatura, Německo). Koncentrace glukózy, inzulínu, triacyglycerolů, neesterifikovaných mastných kyselin v séru a obsah triacylglycerolů ve tkáních byly stanoveny komerčně dostupnými enzymatickými kity. Koncentrace redukované a oxidované formy glutathionu byla měřena HPLC kitem (Chromsystems) s fluorescenční detekcí. Glukózová tolerance byla sledována v průběhu orálního glukózového tolerančního testu (OGTT) po intragastrickém podání glukózy v dávce 3g/kg tělesné hmotnosti. Rezistence svalové (bránice) a epididymální tukové tkáně k účinku inzulínu byla sledována podle basální a inzulínem stimulované (250 μU/ml) inkorporace 14C-U-glukózy do glykogenu, lipidů a CO2 ex vivo. Zastoupení jednotlivých mastných kyselin ve fosfolipidech séra a tkání bylo stanoveno plynovou chromatografií s plamenově ionizačním detektorem po předchozí extrakci lipidů směsí dichlormetan/metanol a rozdělením jednotlivých lipidových tříd tenkovrstevnou chromatografií. Exprese mRNA SCD v jaterní a epididymální tukové tkáni byla měřena metodou real time PCR (Applied Biosystems ViiA 7, Life Technologies) po předchozí izolaci RNA (RNA Blue, Top bio) a její kvantifikaci (Nanodrop). Změny v expresi SCD byly vyhodnoceny pomocí komparativní Ct metody (Livak et al. 2001). Výsledky a diskuse U potkanů krmených kyselinou myristovou jsme nenalezli změny v sérových hladinách triacylglycerolů (TAG), neesterifikovaných mastných kyselin (NEMK), cholesterolu, glukózy a inzulínu (tabulka 1). Rovněž glukózová tolerance hodnocená jako plocha pod glykemickou křivkou (AUC) při OGTT se mezi experimentálními skupinami nelišila. Hladina HDLcholesterolu v séru byla vyšší po dietě s kyselinou myristovou. Podobný nález publikoval i Tholstrup a spol ve studii, kde konzumace diety s kyselinou myristovou postprandiálně zvyšovala HDL-cholesterol u mladých mužů (Tholstrup et al. 2003). Také u křečků došlo k nárůstu hladiny HDL-cholesterolu v plasmě po dietě s kyselinou myristovou (Loison et al. 2002). Kyselina myristová neovlivnila koncentraci redukované (GSH) a oxidované formy glutathionu (GSSG) v játrech (GSH: 44,11 ± 0,04 vs 44,50 ± 7,95 µmol/g; GSSG: 2,55 ± 0,07 vs 2,92 ± 0,12 µmol/g). Tabulka 1 Vliv podávání kyseliny myristové na sérové koncentrace lipidů a parametry glukózové tolerance Myristová
Olej
p
S-TAG (mmol/l)
1,738 ± 0,229
2,646 ± 0,433
N.S.
S-NEMK (mmol/l)
0,800 ± 0,099
0,678 ± 0,046
N. S.
S-cholesterol (mmol/l)
1,962 ± 0,122
1,792 ± 0,141
N. S.
S-HDL cholesterol (mmol/l)
1,208 ± 0,079
0,921 ± 0,038
<0,01
S-glukóza (mmol/l)
5,754 ± 0,174
5,475 ± 0,160
N. S.
769 ± 24
856 ± 36
N. S.
AUC0-120min při OGTT (mmol/l/120 min) S-inzulín (nmol/l)
0,432 ± 0,042
0,466 ± 0,070
Data jsou uvedena jako průměr ± SEM, počet zvířat ve skupině 8. - 22 -
N. S.
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Podávání kyseliny myristové nezměnilo citlivost epididymální tukové tkáně k basální (800 ± 81 vs 717 ± 123 nmol/g/2 hod) a inzulínem stimulované inkorporaci 14C-U-glukózy do lipidů (910 ± 183 vs 996 ± 223 nmol/g/2 hod). Také inzulínová senzitivita bránice se mezi experimentálními skupinami nelišila (bazální inkorporace: 200 ± 28 vs 182 ± 24 nmol/g/2 hod; inzulínem stimulovaná inkorporace: 292 ± 31 vs 332 ± 25 nmol/g/2 hod). U skupiny potkanů krmených dietou s kyselinou myristovou jsme naměřili zvýšený obsah kyseliny myristové v séru a ve všech sledovaných tkáních (epididymální tuková tkáň, játra, myokard). Největší nárůst zastoupení kyseliny myristové byl v lipidové třídě volných MK (p<0,001). Podávání kyseliny myristové neovlivnilo celkové množství saturovaných MK, ale mírně změnilo zastoupení jednotlivých MK (tabulka 2). Dieta s kyselinou myristovou vedla k výraznému zvýšení n-3 PUFA (polynenasycené MK) v séru i ve všech tkáních, které bylo doprovázeno snížením n-6 PUFA. Recentní studie ukázaly, že kyselina myristová může ovlivňovat metabolismus n-3 PUFA. Dabadie a spol. zjistili, že kyselina myristová u lidí zvyšovala zastoupení DHA (kyselina dokosahexaenová) v esterech cholesterolu v séru (Dabadie et al. 2004), nárůst n-3 PUFA v plasmě a játrech vlivem kyseliny myristové byl pozorován i u potkanů (Rioux et al. 2005). Tabulka 2 Vliv kyseliny myristové na zastoupení vybraných mastných kyselin ve fosfolipidech séra, epididymální tukové tkáně a jater Myristov
Palmitová
Stearová
ΣSFA
ΣPUFA n-
ΣPUFA n-
Sérum
↑
−
−
−
↑↑
↓↓↓
Epid. t. tkáň
↑
−
↓↓
−
↑
↓
Játra
↑
−
−
−
↑↑↑
↓↓↓
PLP
PLP fosfolipidy, ΣSFA součet saturovaných mastných kyselin, ΣPUFA n-3 součet polynenasycených mastných kyselin řady n-3, ΣPUFA n-6 součet polynenasycených mastných kyselin řady n-6, ↓ snížení, ↑ zvýšení, − beze změn ↑ p<0,05, ↑↑ p<0,005, ↑↑↑ p<0,001 V naší studii kyselina myristová ovlivnila aktivitu SCD, desaturační indexy SCD byly významně zvýšené v séru i všech analyzovaných tkáních (tabulka 3). Tabulka 3 Desaturační indexy SCD SCD (C16) Myristová
SCD (C18)
Olej
p
Myristová
Olej
p
Sérum
0,064 ± 0,007
0,041 ± 0,005
<0,05
0,401 ± 0,022 0,339 ± 0,024 N. S.
Epid.tuk. tkáň
0,190 ± 0,021
0,115 ± 0,014
<0,05
1,022 ± 0,091 0,705 ± 0,055 <0,05
Játra
0,156 ± 0,008
0,082 ± 0,005
<0,0001
0,368 ± 0,038 0,282 ± 0,011 <0,05
Data jsou uvedena jako průměr ± SEM, počet zvířat ve skupině 8.
- 23 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Graf 1 Relativní exprese mRNA SCD v epididymální tukové tkáni a játrech
** p < 0,005, *** p < 0,0001 U potkanů krmených dietou s kyselinou myristovou jsme naměřili vyšší relativní expresi SCD v epididymální tukové tkáni i játrech (graf 1). Tento nález je v souladu s vypočítanými desaturačními indexy SCD. SCD protein podléhá rychlé degradaci, proto lze usuzovat, že aktivita SCD je primárně určena transkripcí genu, tedy mRNA hladinou SCD (Sjögren et al. 2008). Zvýšená aktivita SCD byla nalezena v řadě studií a je v některých studích dávána do souvislosti s vyšším rizikem rozvoje IR (Sjögren et al. 2008, Hulver et al. 2005). V naší práci kyselina myristová nezhoršovala parametry inzulínové rezistence. Zvýšená aktivita a relativní exprese SCD může být způsobena vysokosacharózovou dietou, neboť je známo, že dietní ale i hormonální faktory zvyšují hladiny SCD (Flowers et al. 2008). Závěr Dlouhodobé podávání diety s kyselinou myristovou bylo doprovázeno řadou pozitivních efektů. Zjistili jsme, že kyselina myristová nezhoršovala inzulínovou sensitivitu periferních tkání, zvyšovala hladinu HDL-cholesterolu v séru a vedla k výraznému zvýšení n-3 polynenasycených MK v séru, epididymální tukové tkáni a játrech. Na druhou stranu, dieta obohacená kyselinou myristovou zvyšovala aktivitu a relativní expresi SCD v játrech a tukové tkáni. Z uvedených výsledků vyplývá, že vliv dlouhodobého podávání kyseliny myristové na lipidový metabolismus je nejednoznačný a je potřeba dalších studií. Důležitá je také otázka množství podávané kyseliny myristové v dietě, délka jejího podávání, ale i použití různých experimentálních modelů. Podpořeno MZ ČR- RVO (,,Institut klinické a experimentální medicíny – IKEM, IČ 00023001“) Literatura Burdock GA, Carabin IG. Safety assessment of myristic acid as a food ingredient. Food and chemical toxikology 2007; 45, 517-29. Dabadie H, Peuchant E, Bernard M, Mendy F. Physiological intakes of myristic acid from milk improve lipid profile. Lipid Technol 2004; 16, 149-152. Dostálová J, Doležal M. Nasycené mastné kyseliny-význam ve výživě a obsah v potravinách. Sborník Atherosklerosa 2013; 6-10. Ebbesson SOE, Tejero ME, López-Alvarenga JC, et al. Individual saturated fatty acids are associated with different components of insulin resistance and glucose metabolism: the GOCADAN study. Int J Circumpolar Health 2010; 69 (4), 344-351. - 24 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Flowers MT, Ntambi JM. Role of stearoyl-coenzyme A desaturase in regulating lipid metabolism. Curr Opin Lipidol 2008; 19(3), 248-56. Funaki M. Saturated fatty acids and insulin resistance. J Med Invest 2009; 56, 88-92. Hulver MW, Berggren JR, Carper MJ, et al. Elevated stearoyl-CoA desaturase-1 expression in skeletal muscle contributes to abnormal fatty acid partitioning in obese humans. Cell Metab 2005; 2(4), 251-261. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods 2001; 25, 402-408. Loison C, Mendy F, Sérougne C, Lutton C. Dietary myristic acid modifies the HDLcholesterol concentration and liver scavenger receptor BI expression in the hamster. Br J Nutr 2002; 87, 199-210. Ntambi JM, Miyzaki M. Recent insights into stearoyl-CoA desaturase-1. Curr Opin Lipidol 2003; 14(3), 255-61. Ntambi JM, Miyzaki M, Dobrzyn A: Regulation of stearoyl-CoA desaturase expression. Lipids. 2004; 39(11), 1061-5. Rioux V, Catheline D, Bouriel M, Legrand P. Dietary myristic acid at physiological relevant levels increases the tissue content of C20:5 n-3 and C20:3 n-6 in the rat. Reprod Nutr Dev 2005; 45, 599-612. Sjögren P, Sierra-Johnson J, Gertow K, et al. Fatty acids desaturases in human adipose tissue: relationship between gene expression, desaturation indexes and insulin resistance. Diabetologia 2008; 51, 328-335. Tholstrup T, Vessby B, Sandstrom B. Difference in effect of myristic and stearic acid on plasma HDL cholesterol within 24h in young man. Eur J Clin Nutr 2003; 57, 735-742. Tvrzicka E, Kremmyda LS, Stankova B, Zak A. Fatty acids as biocompounds: their role in human metabolism, health and disease-a review. Part 1: classification, dietary sources and biological functions. Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub 2011; 155(2), 117-30. Vessby B, Aro A, Skarfos E, et al. The risk to develop NIDDM is related to the fatty acid composition of the serum cholesterol esters. Diabetes. 1994; 43(11), 1353-1357.
- 25 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA SOLUBLE ENDOGLIN AS BIOMARKER OR INDUCER OF ENDOTHELIAL DYSFUNCTION P. Nachtigal, I. Němečková, K. Ježková, J. Rathouská, M. Vařejčková, I. P. Fikrová, A. Serwadczak2, B. Oujo4, S. Chlopicki2,3 1
Department of Biological and Medical Sciences, Faculty of Pharmacy in Hradec Kralove, Charles University in Prague, Heyrovskeho 1203, Hradec Kralove 500 05, Czech Republic 2 Jagiellonian Centre for Experimental Therapeutics (JCET), Bobrzyńskiego 14, 30-348, Krakow, Poland 3 Department of Experimental Pharmacology, Chair of Pharmacology, Medical College Jagiellonian University, Grzegorzecka 16, 31-531 Krakow, Poland 4 Renal and Cardiovascular Physiopathology Unit; Department of Physiology and Pharmacology, University of Salamanca, 37007 Salamanca, Spain. Abstract A soluble form of endoglin (Sol-Eng) circulating in plasma and its increased levels have been detected in various pathological conditions related to cardiovascular system. High concentration of sEng was also proposed to contribute to the development of endothelial dysfunction, but there is no direct evidence to support this hypothesis. Therefore, in the present work we analyzed whether high sEng levels induce endothelial dysfunction in aorta in transgenic mice with high expression of human sEng (Sol-Eng+). As expected, male Sol-Eng+ transgenic mice showed higher levels of plasma concentrations of human sEng as well as increased blood arterial pressure, as compared to wild-type control littermates. Functional analysis either in vivo or ex vivo in isolated aorta demonstrated that the endothelium-dependent vascular function was similar in Sol-Eng+ and control mice. In addition, Western blot analysis showed no differences between Sol-Eng+ and control mice in the protein expression levels of endoglin, endothelial NO-synthase (eNOS) and proinflammatory ICAM-1 and VCAM-1 from aorta. Our results demonstrate that high levels of soluble endoglin alone do not induce endothelial dysfunction in Sol-Eng+ mice. However, these data do not rule out the possibility that soluble endoglin might contribute to alteration of endothelial function in combination with other risk factors related to cardiovascular disorders. Introduction Atherosclerosis is a chronic inflammatory disease of arteries that represents the most important cause of development of ischemic heart disease. One of the most important steps in atherogenesis is alteration of the function and/or morphology of vascular endothelium (Chatterjee et al., 2008). Therefore, monitoring of various markers that affect the behavior of vascular endothelium in arteries is still of interest by many researchers. It has been demonstrated that transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) and members of its signaling cascade play an important role in atherosclerosis (Mallat et al., 2001). TGF-β1 can affect inflammatory reaction in the atherosclerotic plaques, plaque stability and the function of vascular endothelium (Goumans et al., 2009). Endoglin (CD 105, TGF-β receptor III, ENG) is a membrane glycoprotein that plays a regulatory role in several TGF-β signaling pathways (Albert et al., 2001). Endoglin is a dimer composed of 95 kDa disulfide-linked subunits (Cheifetz et al., 1992), which interplays with other receptors and downstream signal transducers (Santibanez et al., 2011). Endoglin, in association with TGF-β receptors II and I, can bind TGF-β1 and TGF-β3 isoforms and form a functional receptor complex (Santibanez et al., 2011). It is actually not the true receptor, but it - 26 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA strongly modulates activities (phosphorylation status) of TGF-βRII, ALK-1 and ALK-5 (Guerrero-Esteo et al., 2002). Many in vitro studies demonstrated that endoglin affects TGF-β signaling by modulation of the activity of intracellular transducers called Smad proteins (Santibanez et al., 2007; Tian et al., 2010). Except for the membrane endoglin, several papers demonstrated the presence of a soluble form of endoglin in blood or in culture media. The soluble form of endoglin (Sol-Eng) is generated by the cleavage of the extracellular domain from the intact membrane by MT1MMP (membrane-type metalloprotease-1, MMP-14) and plays a central role in preeclampsia, a disease characterized by hypertension, endothelial dysfunction and severe alterations in placental circulation (Venkatesha et al., 2006). There were several studies monitoring endoglin levels in the blood of patients with hypercholesterolemia and atherosclerosis. The first evidence of increased levels of endoglin in patients with hypercholesterolemia came from Blann et al. (Blann et al., 1996). They speculated that increased Sol-Eng levels could be related to endothelial damage/dysfunction. In the study of Blaha et al., they searched for a marker that would allow determination of the necessary intensity of therapy and frequency of future therapeutic interventions in patients with familial hypercholesterolemia (FH). They showed that Sol-Eng levels are increased in patients with familial hypercholesterolemia when compared with the control group. In addition, Sol-Eng levels were significantly lower after a series of extracorporeal eliminations, more after rheophereses when compared to LDLaphereses (Blaha et al., 2008). Since Sol-Eng levels were reduced together with CRP levels and sCD40 levels, they suggested that reduced Sol-Eng levels might be related to improvement of endothelial dysfunction and decreased activity of the immune system after removal of atherogenic substances during these extracorporeal eliminations (Blaha et al., 2008). Moreover, increased levels of Sol-Eng were correlated with hyperglycemia, increased systolic blood pressure, pulse pressure, pressure wave velocity and electrocardiographically assessed left ventricular hypertrophy in patients with hypertension and diabetes mellitus with a higher cardiovascular risk. These authors suggested that soluble endoglin is an indicator of hypertension and diabetes-associated vascular pathologies like endothelial dysfunction and cardiovascular damage (Blazquez-Medela et al., 2010). Moreover, it is of interest to mention that levels of soluble endoglin might be important for endoglin activity (signaling) in cells or vessels. It was demonstrated that plasma from patients with preeclampsia (with high levels of Sol-Eng) significantly increases VCAM-1 endothelial expression (Endresen et al., 1998) and leukocyte adhesion to endothelial cells in vitro (Wang et al., 1999). In addition, administration of adenoviral Sol-Eng in non-pregnant mice resulted in an increased expression of P-selectin, increased number of rolling leukocytes and impaired endothelial dependent vascular autoregulation which was related to neutralization of VEGF and TGF-β signaling (Walshe et al., 2009). Our group published several papers focusing on the role of endoglin in the most widely used experimental models for atherosclerosis, in mice. Hypercholesterolemia and increased atherosclerotic plaque size in apoE/LDLr-deficient mice were accompanied by increased levels of Sol-Eng in blood (Strasky et al., 2011). In addition, atorvastatin treatment reduced plaques size in aorta and lowered Sol-Eng in blood in mice with advanced atherosclerosis (Rathouska et al., 2011). In addition TNF-α, and hydrogen peroxide (oxidative stress) increased soluble endoglin levels in HUVECs culture medium (Ikemoto et al., 2012). Taken together, soluble endoglin levels might be monitored in blood in cardiovascular diseases, and soluble endoglin might participate in the development of endothelial dysfunction. However, a complex study confirming the hypothesis that soluble endoglin participates in the induction of endothelial dysfunction has not been performed. We are currently perform several experiments where we ask the question whether high levels of soluble endoglin might induce systemic endothelial dysfunction. In this study, we - 27 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA hypothesized that high levels of soluble endoglin induce endothelial dysfunction in aorta. In order to answer this question, mice expressing human soluble endoglin (Sol-Eng+) were used. The Sol-Eng+ mice exhibit a pre-eclampsia-like phenotype, including hypertension, small pup size, proteinuria and renal damage (Valbuena-Diez et al., 2012). Experimental study - summary A mouse line that overexpresses human soluble endoglin (Sol-Eng+) on the CBAxC57BL/6J background was generated at the Generation Unit of OMGs (University of Salamanca, Spain), as previously described (Valbuena-Diez et al., 2012). Four to six month old Sol-Eng+ male and female mice with high plasma levels of soluble endoglin and their age matched male and female littermates with low plasma levels of soluble endoglin (control mice) were used in this study. We focused on the analysis of functional and morphological properties of aorta with respect to the possible development of endothelial dysfunction in relation to high soluble endoglin levels. ELISA analysis was used to assess human soluble endoglin levels in studied mice. Soluble endoglin concentration in plasma was substantially and significantly higher in male Sol-Eng+ mice when compared to control mice. Measurements of arterial pressure showed that the systolic pressure in male Sol-Eng+ mice is higher than that of control mice suggesting that high soluble endoglin might affect functional properties in the arteries. Surprisingly urinary excretion of nitrites measured in urine from Sol-Eng+ and control mice showed no significant differences between high and low endoglin mice. Moreover, vascular contractility, NO-dependent endothelial function on isolated aortas showed no effect between Sol-Eng+ mice and control mice. Finally, Western blot analysis of aortas was focused on the study of possible markers of endothelial dysfunction and inflammation. The analysis revealed no differences in the expression of endoglin, eNOS, ICAM-1 and VCAM-1 in aorta of Sol-Eng+ and control mice. Conclusion Despite the fact that current literature suggested that high soluble endoglin levels might be at least partially responsible for induction of endothelial dysfunction we showed that soluble endoglin might be responsible for the development of arterial hypertension, however high concentration of soluble human endoglin in plasma alone is not able to induce endothelial dysfunction in aorta of Sol-Eng+ mice. It does not rule out a possibility that soluble endoglin might contribute to alteration of endothelial function in combination with hypercholesterolemia and/or inflammation. Acknowledgment This work was supported by grants from the Grant Agency of Charles University in Prague (300811/C and 1158413/C), Charles University in Prague (SVV/2014/260064), European Regional Development Fund under the Innovative Economy Program of the European Union (grant coordinated by JCET-UJ, No POIG.01.01.02-00-069/09).
- 28 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA References Albert M.A., Danielson E., Rifai N., Ridker P.M., 2001. Effect of statin therapy on C-reactive protein levels: the pravastatin inflammation/CRP evaluation (PRINCE): a randomized trial and cohort study. JAMA 286, 64-70. Blaha M., Cermanova M., Blaha V., et al. 2008. Elevated serum soluble endoglin (sCD105) decreased during extracorporeal elimination therapy for familial hypercholesterolemia. Atherosclerosis 197, 264270. Blann A.D., Wang J.M., Wilson P.B., et al. 1996. Serum levels of the TGF-beta receptor are increased in atherosclerosis. Atherosclerosis 120, 221-226. Blazquez-Medela A.M., Garcia-Ortiz L., Gomez-Marcos M.A., et al. 2010. Increased plasma soluble endoglin levels as an indicator of cardiovascular alterations in hypertensive and diabetic patients. BMC Med 8, 86. Endresen M.J., Morris J.M., Nobrega A.C., et al. 1998. Serum from preeclamptic women induces vascular cell adhesion molecule-1 expression on human endothelial cells in vitro: a possible role of increased circulating levels of free fatty acids. Am J Obstet Gynecol 179, 665-670. Goumans M.J., Liu Z., ten Dijke P. 2009. TGF-beta signaling in vascular biology and dysfunction. Cell Res 19, 116-127. Guerrero-Esteo M., Sanchez-Elsner,T., Letamendia A., Bernabeu C. 2002. Extracellular and cytoplasmic domains of endoglin interact with the transforming growth factor-beta receptors I and II. J Biol Chem 277, 29197-29209. Chatterjee A., Black S.M., Catravas J.D. 2008. Endothelial nitric oxide (NO) and its pathophysiologic regulation. Vascul Pharmacol 49, 134-140. Cheifetz S., Bellon T., Cales C., et al. 1992. Endoglin is a component of the transforming growth factorbeta receptor system in human endothelial cells. J Biol Chem 267, 19027-19030. Ikemoto T., Hojo Y., Kondo H. et al. 2012. Plasma endoglin as a marker to predict cardiovascular events in patients with chronic coronary artery diseases. Heart Vessels 27, 344-351. Mallat Z., Gojova A., Marchiol-Fournigault C., et al. 2001. Inhibition of transforming growth factor-beta signaling accelerates atherosclerosis and induces an unstable plaque phenotype in mice. Circ Res 89, 930-934. Rathouska J., Vecerova L., Strasky Z., et al. 2011. Endoglin as a possible marker of atorvastatin treatment benefit in atherosclerosis. Pharmacol Res 64, 53-59. Santibanez J.F., Letamendia A., Perez-Barriocanal F., et al. 2007. Endoglin increases eNOS expression by modulating Smad2 protein levels and Smad2-dependent TGF-beta signaling. J Cell Physiol 210, 456468. Santibanez J.F., Quintanilla M., Bernabeu C. 2011. TGF-beta/TGF-beta receptor system and its role in physiological and pathological conditions. Clin Sci (Lond) 121, 233-251. Strasky Z., Vecerova L., Rathouska J., et al. 2011. Cholesterol effects on endoglin and its downstream pathways in ApoE/LDLR double knockout mice. Circ J 75, 1747-1755. Tian F., Zhou A.X., Smits A.M., et al. 2010. Endothelial cells are activated during hypoxia via endoglin/ALK-1/SMAD1/5 signaling in vivo and in vitro. Biochem Biophys Res Commun 392, 283288. Valbuena-Diez A.C., Blanco F.J., Oujo B. et al. 2012. Oxysterol-induced soluble endoglin release and its involvement in hypertension. Circulation 126, 2612-2624. Venkatesha S., Toporsian M., Lam C.,et al. 2006. Soluble endoglin contributes to the pathogenesis of preeclampsia. Nat Med 12, 642-649. Walshe T.E., Dole V.S., Maharaj A.S., et al. 2009. Inhibition of VEGF or TGF-{beta} signaling activates endothelium and increases leukocyte rolling. Arterioscler Thromb Vasc Biol 29, 1185-1192. Wang Y., Adair C.D., Weeks J.W., et al. 1999. Increased neutrophil-endothelial adhesion induced by placental factors is mediated by platelet-activating factor in preeclampsia. J Soc Gynecol Investig 6, 136-141.
- 29 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA FUMARIC ACID ESTER AMELIORATES OXIDATIVE STRESS AND CORRECT METABOLIC DISTURBANCES IN SPONTANEOUSLY HYPERTENSIVE RATS WITH TRANSGENIC EXPRESSION OF HUMAN C-REACTIVE PROTEIN O. Oliyarnyk1, H. Malínská1, J. Trnovská1, V. Skop1, H. Seidlová1, L. Kazdová1, M. Pravenec2 1 2
Center for Experimental Medicine, IKEM, Prague, Czech Republic. Institute of Physiology, Academy of Sciences, Prague, Czech Republic.
Abstract Growing evidence indicate that inflammation and oxidative stress are implicated in the pathogenesis of metabolic syndrome. In the current study, we tested the hypothesis that esters of fumaric acid, mainly dimethylfumarate (DMF) (Fumaderm) treatment of an animal model of inflammation and metabolic syndrome, the spontaneously hypertensive rat transgenically expressing human C-reactive protein (SHR-CRP), will ameliorate inflammation, oxidative stress, and metabolic disturbances. Fumaderm treatment contributed to decreased levels of endogenous CRP, ameliorated inflammation (reduced levels of serum IL-6 and TNFα) and oxidative stress (decreased concentration of lipoperoxidation products and enchanced activity of the antioxidant enzymes in liver, heart, kidney, and plasma). Fumadermtreatment was also associated with lower visceral fat weight and less ectopic fat accumulation in liver and muscle, greater levels of lipolysis and lipogenesis in adipose tissue. Introduction Fumaderm is a preparation of fumaric acid esters, mainly dimethylfumarate (DMF) and monomethylfumarate (MMF) salts approved for treatment of psoriasis vulgaris in Germany and some neighboring countries [1]. Owing to its immunomodulatory and anti-inflammatory effects, DMF was recently approved by the European Medicines Agency and US Food and Drug Administration as a first-line therapy for adults with relapsing forms of multiple sclerosis (Tecfidera) [2]. In addition, DMF has been explored for the treatment of other diseases including sarcoidosis, necrobiosis lipoidica or granuloma annulare and has also been studied in a variety of animal models including for disorders such as cancer, malaria, and Huntington disease. The mechanism of current positive effect of fumaric acid esters treatment is mostly attributed only to its anti-inflammatory action and has been not fully described yet [1, 3]. Inflammation and oxidative stress have been implicated in the pathogenesis of obesity, metabolic syndrome, diabetes, and cardiovascular disease [4]. Recently, we derived a new strain of “humanized” spontaneously hypertensive rats (SHR-CRP) in which transgenic expression of human C-reactive protein (CRP) in liver induces inflammation, oxidative stress, several features of metabolic syndrome, and target organ damage [5]. In the current study, we tested whether fumaric acid esters can exert anti-inflammatory and anti-oxidative actions associated with metabolic effects in this animal model. Materials and Methods Transgenic SHR rats (SHR-CRP) were derived by microinjections of ova with a previously described construct containing the cDNA for human CRP under control of the apoE promoter [5,6]. We studied 2 groups of 16 month old male transgenic rats: 1) experimental group fed a high sucrose (70 %) diet containing Fumaderm (Biogen Idec, Inc.) at a concentration of 500 mg/kg diet to deliver an approximate dose of 10 mg/kg body
- 30 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA weight/day for 4 weeks, and 2 age matched, untreated control group fed the same high sucrose diet without Fumaderm for 4 weeks. CRP, blood glucose, NEFA, triacylglycerols (TAG), insulin, IL-6 and TNFα were measured by commercially available kits [for review see 6]. Antioxidant enzymes activities: superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-Px), glutathione reductase (GR), glutathioneS-transferase (GST) were detected using kits of Cayman Chemicals, MI, USA, Catalase activity, concentrations of GSH and TBARS were measured spectrophotometrically according to previously described methods [for review see 7]. Insulin sensitivity of muscle and adipose tissue was measured in vitro without or with insulin (250 µU/ml) according to basal and insulin-stimulated 14C-U-glucose incorporation into diaphragm glycogen and TAG respectively. The rate of lipolysis was determined by NEFA release under basal and adrenalin stimulated conditions. Results Fumaderm treated SHR–CRP rats exhibited reduced serum concentrations of endogenous CRP (85 ± 5 vs. 143 ± 17 pg/ml, p < 0.05), ameliorated inflammation as confirmed by lower levels of inflammatory cytokines IL-6 (9.5 ± 0.6 vs. 16.7 ± 1.3 pg/ml, p < 0.01) and TNFα (1.37 ± 0.24 vs. 2.19 ± 0.21 pg/ml, p < 0.05). The activity of SOD was significantly greater in liver and renal cortex of Fumaderm treated SHR-CRP rats compared to controls (Table 1). The activities of GSH-dependent enzymes, GSH-Px and GST, in liver and myocardium were also higher. The activity of the GSHregenerating enzyme GR was elevated in plasma in the Fumaderm treated rats (134 ± 9 vs. 98 ± 6 nM NADPH/min/mg protein, p < 0.05), but the concentration of GSH in tissues remained unchanged. The activity of catalase was greater in liver, renal cortex, and plasma in Fumaderm treated rats compared to controls. Activation of antioxidant enzymes was associated with decreased lipid peoxidation measured as TBARS in plasma, liver, myocardium, and renal cortex after Fumaderm therapy. As shown in the Table 2, Fumaderm treatment appeared to be associated with reduced adiposity as reflected by lower weight of epididymal fat, and reduced ectopic fat accumulation in liver and skeletal muscle. Fumaderm therapy was also associated with increased adrenaline stimulated lipolysis and higher levels of plasma NEFA and TAG. SHRCRP treated with Fumadermshowed significantly greater levels of both basal and insulin stimulated incorporation of glucose into adipose tissue lipids compared to control animals. There were no significant differences between groups in insulin stimulated incorporation of glucose into muscle glycogen, plasma glucose and insulin. On the other hand, Fumadermtreated rats had significantly higher levels of adiponectin when compared to untreated controls (Table 2). Discussion Inflammation and oxidative stress play important roles in the pathogenesis of disorders associated with metabolic syndrome [4]. There is also evidence indicating that increased levels of CRP may not only reflect the presence of inflammation, but also may promote inflammatory processes and the risk for features of the metabolic syndrome and diabetes [8]. Therefore, in the current study in an animal model with inflammatory and metabolic disturbances induced by transgenic expression of human CRP, we tested the antiinflammatory, anti-oxidative, and metabolic effects of Fumaderm, a preparation of fumaric acid esters containing DMF. Fumadermtreatment was associated with lower serum levels of endogenous rat CRP, IL-6 and TNFα, which likely reflects the anti-inflammatory effects of the drug. Anti-inflammatory effects of Fumaderm has been observed previously in multiple - 31 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA sclerosis [9], but this is, according to our knowledge, the first study about this drug effect in metabolic syndrome. Anti-inflammatory treatment was associated with lower level of oxidative stress as indicated by increased antioxidant enzymes activity and decreased concentrations of lipoperoxidation products (TBARS) in tissues. Table 1 Parameters of oxidative stress associated with Fumaderm treatment Tissue
SHR-CRP Placebo Superoxide dismutase Plasma (U/ml) 1.79±0.16 Liver (U/mg protein) 0.129±0.010 Myocardium (U/mg protein) 0.047±0.006 Renal cortex (U/mg protein) 0.030±0.003 Glutathione peroxidase Plasma (μmol NADPH min/ml) 186±11 Liver (μmol NADPH min mg protein) 208±17 Myocardium (μmol NADPH/min/mg protein) 82±2 Renal cortex (μmol NADPH min/mg protein) 129±6 Glutathione transferase Plasma (nmol CDNB/min/ml) 4.42±0.40 Liver (nmol CDNB/min/mg protein) 182±19 Myocardium (nmol CDNB/min/mg protein) 25±2 Renal cortex (nmol CDNB/min/mg protein) 52±3 Catalase Plasma (μmol H2O2/min/ml) 1166±64 Liver (μmol H2O2/min/mg protein) 1136±25 Myocardium (μmol H2O2/min/mg protein) 617±44 Renal cortex (μmol H2O2/min/mg protein) 441±19 TBARS Plasma (nmol/ml) 1.861±0.228 Liver (nmol/mg protein) 1.701±0.110 Myocardium (nmol/mg protein) 0.900±0.039 Renal cortex (nmol/mg protein) 0.962±0.030
SHR-CRP Fumaderm 1.79±0.14 0.165±0.009* 0.050±0.003 0.068±0.005** 163±6 292±18** 103±4** 178±6** 5.00±0.28 239±7* 32±1** 53±3 1442±79* 1346±30** 600±31 534±32* 1.221±0.105* 1.273±0.58** 0.777±0.021* 0.685±0.048**
** and * denote p < 0.001 and p < 0.05, respectively. Abbreviations: CDNB, 1-Chloro-2,4dinitrobenzene; TBARS, thiobarbituric acid reactive substances Application of DMF led to stabilization of the transcription factor nuclear factor (erythroidderived 2)-related factor 2 (Nrf2) and activation of Nrf-dependent transcriptional activity. A lot of antioxidant enzymes including SOD, GSH-Px, GST, GR and catalase are coded by Nrf2 target genes. Furthermore, the immediate metabolite of DMF, monomethylfumarate (MMF), leads to direct modification of the inhibitor of Nrf2 Kelch-like ECH-associated protein 1, at cysteine residue 151 [10]. Concentration of important intracellular antioxidant - GSH did not changed in all investigated tissues, which could be ascribed to using of GSH in GSH dependent antioxidant reaction and/or binding of GSH to DMF in gastrointestial mucosa [11]. In contrast, MMF treatment can increase cellular GSH levels, which is consistent with the demonstrated up-regulation of γ- glutamyl-cystein ligase, Nrf2 target gen and rate-limiting enzyme in GSH biosynthesis [3]. The amelioration of oxidative stress in myocardium in SHR - 32 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA rats overexpressing human CRP confirms previous results from Ashrafian et al [12] about heart protection against ischemia-reperpusion injury in mice with impaired metabolism of fumarate in the heart. Amelioration of inflammation and oxidative stress in Fumaderm treated SHR-CRP rats was associated with less adiposity and ectopic fat accumulation, greater levels of lipolysis, and increased insulin sensitivity of adipose tissue. Table 2 Metabolic parameters in SHR-CRP transgenic rats treated with Fumaderm or placebo Trait Body weight (g) Relative liver weight (g/100 g BW) Relative epididymal fat weight (g/100 g BW) Plasma TAG (mmol/L) Plasma NEFA (mmol/L) Plasma glucose (mmol/L) Plasma insulin (nmol/L) Plasma adiponectin (ng/mL) Liver TAG (nmol/g) Heart TAG (nmol/g) Muscle TAG (nmol/g) Basal lipolysis, NEFA (µmol/g) Adrenaline stimulated lipolysis, NEFA (µmol/g) Basal lipogenesis (nmol gl./g/2 h) Insulin stimulated lipogenesis (nmol gl./g/2h) Basal glycogenesis (nmol gl./g/2 h) Insulin stimulated glycogenesis (nmol gl./g/2h)
SHR-CRP placebo 407±7 3.89±0.12 0.94±0.02 1.08±0.13 0.35±0.03 8.6±0.4 0.73±0.11 8.2±0.5 25.7±4.1 1.62±0.20 3.10±0.17 3.26±0.30 5.91±0.90 949±62 1646±96 70.8±11.9 231.4±16.8
SHR-CRP Fumaderm 405±12 3.88±0.12 0.73±0.05** 1.42±0.06* 0.59±0.05** 8.4±0.3 0.70±0.06 10.1±0.5* 14.2±1.2* 1.64±0.13 2.41±0.25* 3.33±0.42 9.27±1.04* 1375±181* 2683±274** 54.7±6.8 247.9±10.8
** and * denote p < 0.005 and p < 0.05, respectively Conclusion Current findings provide evidence for potentially important actions of fumaric acid esters on adipose tissue biology together with anti-inflammatory and anti-oxidative effects in a model of inflammation and metabolic disturbances induced by human CRP. Although the exact mechanisms mediating such actions of fumaric acid esters in this model remain to be determined, the current studies raise the possibility that corresponding effects might be observed with DMF treatment in humans with metabolic disturbances associated with increased levels of CRP.
Supported by MH CZ-DRO (“Institute for Clinical and Experimental Medicine - IKEM, IN 00023001”)
- 33 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA References 1. Meissner M, Valesky EM, Kippenberger S, et al. (2012). J Dtsch Dermatol Ges 10: 793– 801. 2. Arnold P, Mojumder D, De Toledo J, et al. (2014). Clin Pharmacol 24: 35-42. 3. Scannevin RH, Chollate S, Jung M. (2012). J Pharmacol Exp Ther 341: 274-284. 4. Ye J. (2013). Front Med 7: 14–24. 5. Pravenec M, Kajiya T, Zidek V, et al. (2011). Hypertension 57: 731–737. 6. Silhavy J, Zidek V, Mlejnek et al. (2014). Plos One 9: e101906. 7. Malinska H, Oliyarnyk O, Hubova M, et al. (2010). Mol Cell Biochem 335: 119–125. 8. Bisoendial RJ, Boekholdt SM, Vergeer M, et al. (2010). Eur Heart J 31: 2087–2091. 9. Gold R, Linker RA, Stangel M. (2012). Clin Imunol. 142: 44-48. 10. Linker RA, Lee DH, Ryan S, et al. (2011). Brain 134: 678–692. 11. Dibbert S, Clement B, Skak-Nielsen T. (2013). Arch Dermacol Res 305: 447-451. 12. Ashrafian H, Czibik G, Bellahcene M. (2012). Cell Metab 15: 361-371.
- 34 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA VYBRANÉ BIOLOGICKY AKTIVNÍ LÁTKY V POTRAVINÁCH SELECTED BIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS IN FOOD J. Pánek, M. Sabolová, Š. Šimková, I. Roubíčková, D. Chrpová* VŠCHT Praha * VOŠZ a SZŠ 5. května a VŠCHT Praha Úloha produktů sekundárního metabolismu rostlin ještě není jednoznačně objasněna, pravděpodobně hrají roli v ochraně rostliny před predátory, pathogenními mikroorganismy nebo konkurenčními rostlinami, působí jako signální molekuly (lákadla pro opylovače nebo přenašeče semen), některé metabolity mohou být odpadními produkty aj. Tyto biologicky aktivní látky jsou ale i velmi důležitou a unikátní součástí potravního řetězce. Přestože existují pouze 4 výchozí sloučeniny sekundárního metabolismu (mevalonová kyselina, šikimová kyselina, acetylkoenzym A a aminokyseliny), je skupina finálních produktů velmi široká. Je to způsobeno rozsáhlou enzymovou výbavou každé rostliny. Spektrum těkavých a netěkavých sekundárních metabolitů je obvykle unikátní pro každý rod a někdy i druh. Toto, spolu s pokročilou analytickou technikou (obvykle GC/HPLC spojené s některou technikou vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie) umožňuje autentikaci potravin a dalších biologických materiálů. Dělení sekundárních metabolitů do skupin reflektuje spíše jejich vlastnosti než přesnou chemickou strukturu. Biologicky aktivní látky se obvykle dělí do řady podskupin: vitaminy a příbuzné sloučeniny, rostlinná barviva, silice, fenolové sloučeniny a jejich glykosidy, terpenoidy, včetně steroidů, alkaloidy, gumy a slizy, hořké látky a další. Hranice mezi těmito skupinami jsou ale poněkud vágní, např. karotenoidy jako významná rostlinná barviva jsou chemicky tetraterpeny a některé z nich jsou prekurzory vitaminu A; tokoferoly a tokotrienoly, jako látky s aktivitou vitaminu E patří mezi velmi účinné fenolové antioxidanty a podobných příkladů by bylo možno najít celou řadu. Protože jde o velmi širokou skupinu, budou na tomto místě dále diskutovány pouze fenolové sloučeniny a terpenoidy. Struktura terpenoidů vychází z pětiuhlíkatého isoprenu (2-methylbuta-1,3-dien), který je v rostlinách přítomen v aktivované fosforylované formě isopentenyl difosfátu a dimethylallyl difosfátu. Aktivní formy isoprenu se v cytosolu buněk syntetizují z acetyl-CoA obvykle přes mevalonovou kyselinu, ale existují i další cesty. Další biosyntéza vede ke vzniku geranyldifosfátu a následně dalších monoterpenů a vyšších terpenů. Současně dochází k řadě chemických reakcí, z nichž nejvýznamnější jsou oxidace, ale i různé přesmyky a další. Spojení biosyntetických a chemických reakcí potom vede k obrovské diverzitě těchto sloučenin. Terpeny se vyskytují jako uhlovodíky nebo častěji jako kyslíkaté sloučeniny – alkoholy, karbonylové deriváty, případně karboxylové kyseliny. V přírodě je v současné době známo asi 30 tisíc sloučenin patřících do této skupiny. Terpeny s nízkou molekulovou hmotností jsou za běžné teploty více či méně těkavé a jsou tudíž významnou součástí tzv. silic („essential oils“), které vytvářejí aroma a chuť („flavour“) většiny rostlin. Silice se využívají jako přirozené aditivum v mnoha potravinách, široce se využívají v kosmetice, ale i v tradiční a alternativní medicíně. Řada silic a částí rostlin, které silice obsahují, patří mezi lékopisné suroviny. Řada z nich vykazuje významnou biologickou aktivitu, typické jsou antimikrobní (hlavně antibakteriální), antioxidační a další účinky. Monoterpeny (10 uhlíků) a seskviterpeny (15 uhlíků) jsou převážně součástí vonných silic. Složení silic bývá poměrně významným znakem jednotlivých rostlinných taxonů, závisí ale i na zemi původu a lokalitě a i na klimatických podmínkách. Ze skupin monoterpenů stojí - 35 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA za zmínku např. myrcen, α- a β-pinen, limonen, nerol, geraniol, linalool, menthol, citral, karvon, kafr a řada dalších. Speciální zmínku zaslouží fenolové monoterpenové alkoholy karvakrol a thymol (Thymus spp., Thymbra spp. a další), které vykazují poměrně významnou antioxidační a antimikrobní aktivitu. Ze skupiny seskviterpenů jsou to např. farnesen, α- a β-karyofylen, bisabolol, valerenová kyselina a další. Ze skupiny diterpenů zaslouží pozornost (kromě vitaminu A) skupina fenolových diterpenů, které vykazují velmi významnou antioxidační aktivitu. Patří sem zejména karnosol a příbuzné sloučeniny karnosová kyselina, rosmanol, epirosmanol a isorosmanol (Rosmarinus officinalis L., Salvia officinalis L.). Steroidní sloučeniny jsou typickou a známou skupinou triterpenoidů. Tato skupina látek je ale natolik rozsáhlá a významná, že se z praktických důvodů diskutuje vždy samostatně. Vedle toho ale k triterpenoidům patří i řada méně známých sloučenin s významnou biologickou aktivitou, které se někdy označují jako terpenoidní a steroidní saponiny. V rostlinách se obvykle vyskytují ve formě polárnějších glykosidů. Ke steroidním saponinům patří řada látek spirostanové nebo furostanové struktury, které mohou být prekurzory steroidních hormonů a byly ve své době hojně zneužívány ve sportu. K triterpenoidním saponinům patří např. ginsenosidy a dammaranové deriváty - aktivní látky ženšenu (Panax ginseng C.A.Mey), lupanové deriváty, např. betulin (Betula pendula Roth), boswellové kyseliny (Boswellia serrata L.), withanosidy (Withania somnifera Duval) a řada dalších. Přestože jsou tyto látky známy již desítky let, vědecký výzkum v oblasti jejich biologických účinků je stále na počátku a výsledky je možno hodnotit jako silně kontroverzní. Tyto látky, resp. rostliny a jejich extrakty, které je obsahují, využívá v hojné míře tradiční asijská medicína. Nicméně, deficit seriózních vědeckých informací o účincích většiny těchto látek je značný. Nejznámějšími tetraterpenoidy jsou již zmíněné karotenoidy – karoteny a xanthofyly. Nejjednoduššími fenolovými sloučeninami jsou fenylpropanové deriváty, které jsou významnou součástí silic. Většina derivátů obsahuje jednu nebo více hydroxymethylových nebo hydroxylových skupin. Patří sem např. anethol (Anethum graveolens L., Carum carvi L., Coriandrum sativum L., Illicium verum Hook), estragol a eugenol (Ocimum basilicum L., Illicium verum Hook, Syzigium aromaticum L., Cinnamomum zeylanicum Blume, Pimpinella anisum L., Artemisia dracunculus L.) nebo apiol, dillapiol a myristicin (Petroselinum crispum A.W.Hill, Apium graveolens L., Anethum graveolens L.) a další. I v tomto případě je možno zmínit určitou antioxidační, ale hlavně antimikrobní, případně antiparazitickou aktivitu. Podobnou strukturu mají i netěkavé ketony zázvoru (Zingiber officinale Rosc.) zingeron, gingerol, paradol a shagoal. Vyšší fenoly jsou v rostlinách většinou ve formě hydrofilních glykosidů. Důvodem je možnost transportu těchto sloučenin v rostlině. Většina rostlin obsahuje izolovaně rovněž enzymy štěpící glykosidické vazby a při poškození rostlinného pletiva dochází k hydrolýze glykosidů a uvolnění aktivních, hydrofobnějších aglykonů. Fenolové kyseliny se jako volné vyskytují v přírodě minimálně, většinou tvoří estery s dalšími sloučeninami. Gallová kyselina tvoří např. estery s katechiny, vzniklé katechingalláty jsou odpovědné za extrémně vysokou antioxidační kapacitu zeleného čaje (Camelia sinensis L., Camelia japonica L.). Kávová kyselina tvoří obvykle estery s dalšími organickými hydroxykyselinami. Patří sem např. chlorogenová, rosmarinová, cichorová, kaftarová a další kyseliny. Všechny tyto látky jsou velmi účinnými antioxidanty. V některých rostlinách, hlavně rodu Origanum (O. vulgare, O. heracleoticum a dalších) se ještě někdy vyskytují p-hydroxybenzylderiváty fenolových kyselin, hlavně protokatechuové a rosmarinové kyseliny. Extrakty rozmarýnu lékařského (Rosmarinus officinalis L., Lamiaceae) obsahující poměrně významné koncentrace rosmarinové kyseliny, ale i např. karnosolu a rosmanolu jsou v současné době již komerčně dostupné a poměrně široce se využívají - 36 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA v potravinářském průmyslu (hlavně v masném průmyslu) jako přirozený a velmi účinný antioxidant, nahrazující dříve využívané syntetické antioxidanty BHT, BHA a jiné. Výsledky sledování antioxidační aktivity ukazují na významný antioxidační potenciál i dalších rostlin čeledi Lamiaceae (hluchavkovité), např. rostlin rodu Thymus (T. vulgaris L. aj.), Satureja , Origanum a dalších, ale i rostlin některých jiných čeledí, např. Apiaceae (miříkovité), Rosaceae (růžovité) a dalších. Velmi významnou skupinou fenolových sloučenin jsou flavonoidy a katechiny, které patří k nejvýznamnějším antioxidantům zeleniny, některých pseudocereálií, luštěnin a řady léčivých a kořeninových rostlin. Významné jsou zejména kvercetin, taxifolin, myricetin a kemferol ze skupiny flavonolů, flavanon eridictiol, flavony apigenin a luteolin a katechiny. Významné jsou i jejich oligomery označované jako proanthokyany (prokyanidiny nebo pycnogenoly) vyskytující se např. v čaji, hroznovém víně a dalších. Z dalších fenolových sloučenin stojí za zmínku isoflavony (např. daidzein, genistein a další) a lignany (secoisolariciresinol, sesamol, oleuropein aj.), které vykazují určitou estrogenní aktivitu a některé z nich jsou také významné antioxidanty. Z dalších látek je ještě třeba zmínit resveratrol, elemicin, kurkuminoidy, ale i celou skupinu tokoferolů a tokotrienolů. Poděkování Podpora MŠMT ČR č. MSM 6046137305 Korenspondenční adresa:
[email protected]
- 37 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA THE POSITIVE EFFECT OF SILYMARIN IN DIFFERENT PHARMACEUTICAL FORMS – INHIBITION OF CYTOCHROME P450 2E1 M. Poruba1, L. Kazdová2, V. Škop2, Z. Matušková1 and R. Večeřa1* 1
Department of Pharmacology, Faculty of Medicine and Dentistry, Palacký University, Olomouc, Czech Republic 2 Center for Experimental Medicine, Institute for Clinical and Experimental Medicine, Prague, Czech Republic Silymarin is a standardised extract from Milk Thistle (Silybum marianum). This extract has been used in supportive therapy of liver diseases for centuries (Rainone 2005) and shows positive effects on lipoprotein profile (Škottová et al. 2003). Our study studied effect of silymarin on rat cytochrome P450 CYP2E1. This cytochrome P450 metabolizes many substances to more toxic metabolites. For example paracetamol is converted to a highly toxic metabolite, N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI). This study aims to investigate the effect of silymarin (standardised silymarin, micronised silymarin and Phytosome silymarin (1 % w/w)), administered in standard laboratory diet (STD) for 4 weeks, on the expression of liver CYP2E1 in a hereditary hypertriglyceridemic (HHTg) rats. These animals breed from Wistar rats, exhibit hypertriglyceridemia, insulin resistance, hypertension and liver steatosis. This strain of rat represents an accepted model of metabolic syndrome (Vrána, Kazdová 1990). Our results show that all three types of silymarin (in case of Phytosome silymarin significantly) decreased protein expression of CYP2E1 in HHTg rats. It may be suggested that this extract has the potential to decrease levels of toxic metabolites (for example NAPQI) by inhibition of CYP2E1 in rats under conditions associated with metabolic syndrome and ectopic lipid accumulation in liver. Further studies are needed to elucidate the effects of silymarin on CYP2E1 in man. Úvod Cytochrom P450 2E1 metabolizuje v játrech řadu látek a léčiv (halotan, benzen, chlorzoxazon, paracetamol a další) na metabolity, z nichž některé mohou být více toxické. Například benzen je metabolizován cestou CYP2E1 na fenol, hydrochinon a katechol, které mají ještě větší kancerogenní a mutagenní potenciál než původní látka (Tsutsui et al. 1997). Paracetamol, který je v játrech z větší části odbouráván na netoxické metabolity (sulfatace nebo glukuronidace) může být z 5 až 10% cestou CYP2E1 přeměněn na velice toxický N-acetyl-p-benzochinonimin (NAPQI). Indukovaný CYP2E1 (etanolem) může zvýšit produkci tohoto toxického metabolitu paracetamolu natolik, že dochází až k nekróze hepatocytů. Ve Velké Británii nebo USA je intoxikace NAPQI jedna z nejčastějších příčin selhání jater. Vzhledem k rekordně vysoké konzumaci alkoholických nápojů v České republice je i zde toto nebezpečí stejně aktuální (Součková 2013). Pravidelní konzumenti alkoholu mají v játrech zvýšen obsah tohoto cytochromu P450 až trojnásobně. V literatuře je popsáno, že zvýšená aktivita CYP2E1 může vést k řadě závažných patologických stavů jako je zvýšení rizika vzniku rakoviny tlustého střeva, jater, plic nebo nosohltanu (Le Merchand et al. 2002, Seitz et al. 2013). Cílem naší studie bylo zjistit, jak působí silymarin (extrakt ze semen Ostropestřce mariánského – Silybum marianum) na expresi cytochromu P450 2E1 u potkana s hereditární hypertriglyceridemií (HHTg potkan), akceptovaném modelu metabolického syndromu (Vrána, Kazdová 1990). Silymarin (1% w/w) byl ve třech různých lékových formách (standardizovaný silymarin, mikronizovaný silymarin a silymarin ve formě fytozomů) - 38 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA podáván jako součást standardní laboratorní diety po dobu 28 dnů. Metodou Western blotu byla u těchto potkanů stanovena jaterní exprese proteinu CYP2E1. Materiál a metody Zvířata HHTg potkani (samci, hmotnost 280 - 300g) byli rozděleni do 4 skupin (po 4 jedincích) a krmeni 4 týdny (ad libitum) experimentálními dietami. První (kontrolní) skupině byla podávána standardní laboratorní dieta – STD, druhá skupina byla krmena STD obohacenou o 1% (w/w) standardizovaného silymarinu – SSD (Favea, Kopřivnice, ČR), třetí skupina byla na STD obohacené o 1% (w/w) mikronizovaného silymarinu – MSD (Favea, Kopřivnice, ČR). Poslední čtvrtá skupina potkanů byla krmena STD s přídavkem 1% (w/w) silymarinu ve formě fytozomů - PSD (Phytosome silymarin, Indena, Milan, Italy). Následně byli potkani uvedeni do celkové anestezie (i.m. fentanyl 40 μg.kg-1, dexmedetomidin 100 μg.kg-1, diazepam 5 mg.kg-1). Po exsanguinaci z bifurkace břišní aorty byly odebrány vzorky jater pro izolaci mikrozomů. Odborná etická komise MŠMT ČR schválila projekt pokusů pro práci s těmito experimentálními zvířaty. Western blot Z jater zamražených na -80°C byly metodou dle Lake (1990) získány mikrozomy. U každého vzorku mikrozomů bylo změřeno množství proteinu za použití BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce, Rockford, USA). 60 μg proteinu z každého vzorku mikrozomů bylo přidáno k vzorkovému pufru (62,5 mM TRIS, 10% glycerol, 4% merkaptoethanol, 2% SDS, pH 6,8) 1:1, na 5 minut vloženo do vroucí lázně a 5 minut centrifugováno při 600 × g. Vzorky byly naneseny na diskontinuální SDS polyakrylamidový gel (4% startovní gel, 8% separační gel). Elektroforéza probíhala 15 minut při 120V a následně 45 minut při 180V. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Immobilon-P Membrane, Merck Millipore, Darmstadt, Germany) za použití přístroje Trans Blot Turbo (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Membrány byly dále inkubovány 120 min. s primární polyklonální protilátkou anti-rat CYP2E1 (Abcam, Cambridge, UK) a poté 20 min. sekundární protilátkou značenou křenovou peroxidázou (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Detekce imunokomplexů byla provedena chemiluminiscenčně za použití WB Luminol Reagent (Santa Cruz, CA, USA). Relativní obsah proteinu byl stanoven denzitometricky pomocí ElfoMan software, ver. 2.6 (Semecký Inc., Praha, Česká republika). Statistické zpracování Všechna data jsou vyjádřena jako průměr ± SD, n = 4. Pro statistické vyhodnocení získaných výsledků byla použita ANOVA a t-test (Statistica Cz 12, StatSoft CR, Praha, Česká republika). Výsledky a diskuse Vzhledem k tomu, že zvýšená exprese a aktivita CYP2E1 je spojována do souvislosti se vznikem řady závažných patologických stavů, je studium ovlivnění jeho exprese v jaterní tkáni velice zajímavé a cenné. Jak již bylo uvedeno, přeměna paracetamolu na toxický NAPQI (obr. č. 1) se děje cestou cytochromů P450. Klíčovou roli, mimo CYP1A2, 2A6 nebo 3A4, zde hraje právě CYP2E1 (Chen et al., 1998, Patten et al., 1993, Thummel et al., 1993). Jak ukazuje obrázek č. 2, silymarin ve všech svých lékových formách snížil jaterní expresi cytochromu P450 2E1 na úrovni proteinu. Ke statisticky významnému poklesu došlo po podávání silymarinu ve formě fytozomů (Phytosome silymarin), který má dle studií lepší biodostupnost než ostatní námi studované formy silymarinu (Morazzoni et. Al. 1993). Jeho zvýšená hladina v cirkulaci a následně pak i jeho koncentrace v jaterní tkáni patrně vede - 39 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA ke zvýšení jeho inhibičního působení na expresi CYP2E1. Tato zjištění jsou v souladu s literaturou, která uvádí, že silymarin má spíše inhibiční vliv na expresi cytochromů P450 (Doehmer et al 2011). Naše výsledky o působení různých lékových forem silymarinu byly popsány na akceptovaném modelu metabolického syndromu (HHTg potkan) poprvé. V literatuře jsou studie převážně prováděny na buněčné úrovni (lidské hepatocyty) nebo u zdravých experimentálních zvířat a ne u jedinců s patologickým stavem organismu – metabolickým syndromem. O C
O
O NH
H3C
H3C
NH
sulfatace
NH
glukuronidace
O
O
OH
O
O
OH
S
GlcA
paracetamol
CYP 2E1 1A2 2A6 3A4 O H3C
O N
H3C
NH
GSH konjugace GSH O
OH
NAPQI
Obr. 1 Schéma přeměny paracetamolu v jaterní tkáni. N-acetyl-p-benzochinonimin (NAPQI)
Obr. 2 Působení silymarinu (1 % w/w) ve formě standardizované (SSD), ve formě mikrozomů (MSD) a ve formě fytozomů (PSD) na expresi CYP2E1. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD, n = 4, *p < 0,01 vs STD (standardní laboratorní dieta)
Závěr Naše zjištění ukazují, že silymarin ve všech námi sledovaných lékových formách snížil jaterní expresi CYP2E1 na úrovní proteinu u hereditárně hypetriglyceridemického potkana. Tyto výsledky naznačují, že extrakt silymarin může mít touto cestou určitý potenciál ke snížení hladiny vznikajících toxických metabolitů řady látek a léčiv. To může následně zabránit nebo alespoň zmírnit možné toxické poškození hepatocytu způsobené indukčním efektem etanolu na expresi cytochromu P450 2E1. Interpretace námi získaných závěrů a jejich využití u člověka (pacienta) není jednoduchá. Je třeba dalších experimentů, které detailněji objasní působení tohoto extraktu na expresi cytochromů P450 u jedince s patologickým stavem organismu. Poděkování Autoři děkují za finanční podporu grantu GAČR 13-10813S
- 40 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA
Literatura Chen W, Koenigs LL, Thompson SJ, et al. Oxidation of acetaminophen to its toxic quinone imine and nontoxic catechol metabolites by baculovirus-expressed and purified human cytochromes P450 2E1 and 2A6. Chem Res Toxicol 1998;11:295-301 Doehmer J, Weiss G, McGregor GP, Appel K. Assessment of a dry extract from milk thistle (Silybum marianum) for interference with human liver cytochrome-P450 activities. Toxicol in Vitro. 2011;25(1):21-7 Lake BG. Preparation and characterization of microsomal fraction for studies on xenobiotic metabolism. In: Snell EK, Mullock B. Biochemical toxicology and practical approach. IRL Press: Oxford-Washington DC. 1990 Le Merchand L, Donlon T, Seifried A, Wilkens LR. Red meat intake, CYP2E1 genetic polymorphism, and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2002;11(10):1019-24 Morazzoni P, Montalbetti A, Malandrino S, Pifferi G. Comparative pharamcokinetics study of silipide and silymarin in rats. Eur J Drug Metab Pharmacokinet 1993;18(3):289-97 Patten CJ, Thomas PE, Guy RL, et al. Cytochrome P450 enzymes involved in acetaminophen activation by rat and human liver microsomes and their kinetics. Chem Res Toxicol 1993;6:511-8 Rainone F. Milk thistle. Am. Fam. Physician 2005;72(7):1285-92 Součková L. Správné dávkování paracetamolu, analgetická účinnost paracetamolu v kombinaci s kofeinem. Praktické lékárenství 2013;9(6):240-2 Seitz HK, Wang XD. The role of cytochrome P450 2E1 in ethanol-mediated carcinogenesis. Subcell Biochem 2013;67:131-43 Škottová N, Večeřa R, Urbánek K, et al. Effects of polyphenolic fraction of silymarin on lipoprotein profile in rats fed cholesterol-rich diets. Pharmacol Res 2003; 47(1):17-26 Thummel KE, Lee CA, Kunze KL, et al. Oxidation of acetaminophen to N-acetyl-paminobenzoquinone imine by human CYP3A4. Biochem Pharmacol 1993;45:1563-9 Tsutui T, Hayashi N, Maizumi H, et al. Benzene-, catechol-, hydroquinone- and phenolinduced cell transformation, gene mutations, chromosome aberrations, aneuploidy, sister chromatid exchanges and unscheduled DNA synthesis in Syrian hamster embryo cells. Mutat Res 1997;373(1):113-23 Vrána A, Kazdová L. The hereditary hypertriglyceridemic nonobese rat: an experimental model of human hypertriglyceridemia. Transplant Proc 1990;22:2579 *
Corresponding author: tel.: +420 585 632 553; fax.: +420585632966; e-mail:
[email protected]
- 41 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA
VZNIK OXYSTEROLŮ PŘI TEPELNÉM ZPRACOVÁNÍ MASA M. Sabolová, V. Ilko, D. Chrpová, J. Pánek VŠCHT Praha Abstrakt Cholesterol a fytosteroly mají podobnou chemickou strukturu a jsou náchylné k oxidaci za přítomnosti kyslíku, světla, tepla a působení jiných faktorů. Negativní zdravotní efekt oxidačních produktů cholesterolu je předmětem mnohých studií. Role oxidačních produktů fytosterolů pro lidské zdraví je pořád nejasná a rozporuplná. Prekurzory oxidačních produktů sterolů (SOPs), cholesterol a fytosteroly (např. sitosterol, kampesterol, stigmasterol), mohou být oxidovány v potravinách a také in vivo. Čerstvé potraviny obsahují obvykle malá množství SOPs. Koncentrace SOPs narůstá (někdy dramaticky) při výrobě, zpracování a skladování potravin. SOPs rovněž vznikají při standardních podmínkách tepelného zpracování potravin v domácnosti. Rozsah vzniku SOPs závisí hlavně na teplotě, době zahřívání, přítomnosti antioxidantů/ pro-oxidantů, vodní aktivitě, povrchu zpracovávané potraviny. V této práci byl sledován vznik a distribuce SOPs při tepelném zpracování masa. Úvod Cholesterol a fytosteroly jsou náchylné k oxidaci v přítomnosti kyslíku, světla, chemických katalyzátorů a působením jiných faktorů. Může tak vznikat několik typů hydroxyl, epoxy, keto a triol derivátu, které jsou známy jako oxidační produkty sterolů (SOPs). Cytotoxický, mutagenní, aterogení, potenciálně karcinogenní a prozánětlivý efekt oxidačních produktů cholesterolu (COPs) je dobře znám a prozkoumán (Ryan et al. 2005, Hovenkamp et al. 2008, Otaegui-Arrazola et al. 2010, Shibata et al. 2010, Poli et al. 2013). Role oxidačních produktů fytosterolů (POPs) není doposud zcela objasněna a názory jsou poměrně kontroverzní. POPs jsou strukturně podobné COPs, proto se předpokládá, že budou mít podobný zdravotní efekt jako COPs (Hovenkamp et al. 2008, Vanmierlo et al. 2013) SOPs mohou vznikat in vivo, nebo je můžeme přijímat stravou. Hlavním zdrojem SOPs ve stravě jsou potraviny bohaté na cholesterol jako maso, vaječné žloutky, ryby a mléčné produkty a potraviny bohaté na fytosteroly, zejména rostlinné oleje. Jídelníček západních zemí (tj. oblíbenost smažených potravin a FAST-FOODs) je významným zdrojem SOPs (proto část populace západních zemí může byt vystavena vyššímu příjmu SOPs). Studie z posledních let ukazují, že čerstvé potraviny obsahují pouze malá množství SOPs, nebo je neobsahují vůbec. K vzniku SOPs a zvýšení jejich obsahu v potravinách dochází v důsledku nevhodného skladování, při výrobě a zpracování potravin. K vzniku SOPs dochází i během tepelného zpracování potravin v domácích podmínkách (Lakerson et al. 2000, Osada et al. 1993). Rozsah vzniku SOPs závisí hlavně na teplotě, době zahřívání, přítomnosti antioxidantů/ pro-oxidantů, nasycenosti tuku, vodní aktivitě, povrchu zpracovávané potraviny (Hur et al. 2007, Lee et al. 2006). Práce zkoumající SOPs jsou zaměřeny na různé potraviny většinou živočišného původu jako maso a masné výrobky (po tepelné úpravě, hlavně po smažení, nebo po skladování, zejména po mražení), najdou se i práce zaměřené na ryby, mléko (jedná se hlavně o sušené plnotučné mléko) případně mléčné výrobky, vejce (hlavně sušená a důležitý je samozřejmě žloutek). Objevuji se i práce zabývající se například lojem nebo máslovými sušenkami (Dinh et al. 2011). Pozitivní vliv fytosterolů na hladinu cholesterolu je znám již od roku 1951 . V současné době je na trhu poměrně široká nabídka produktů obohacených fytosteroly (známé jsou hlavně margariny, které se však běžně nepoužívají pro smažení). I tyto výrobky se staly zájmem - 42 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA zkoumání z hlediska vzniku oxidačních produktu fytosterolů. Ty se ale sledují zejména v různých rostlinných olejích po přípravě hranolků nebo bramborových lupínků (Dutta 1997, Dutta and Apelquist 1997, Grandgirard et al. 2004, Garcia-Llatas et al. 2010). Často se v různých pracích potkáváme se sledováním vlivu zpracování (např. rafinace, sušení) a tepelné úpravy (zejména smažení), ale i netepelné úpravy (např. marinováni), či skladováni (hlavně mražení) na vznik oxysterolů (Rudzińska et al. 2009, Barriuso et al. 2012). Vliv zpracování potravin na vznik SOPs byl sledován u různých potravin jako je například konzervovaný tuňák (Zunin et al. 2001). Lakerson et al. (2000) se zaměřili na obsah SOPs u syrových a předsmažených karbanátků, syrového hamburgeru a předsmaženého mraženého burgeru. SOPs byli nalezeny i u salámu (Novelli et al. 1998), strouhaného sýra (Finocchiaro et al. 1984), plnotučného sušeného mléka (Zunin et al. 1998), sušených vajec (Lai et al. 1995), sušených žloutků (Obara et al. 2005). Cílem této práce bylo sledování vzniku a distribuce SOPs při tepelném opracování masového pokrmu. V práci jsou prezentovány předběžné výsledky analýzy SOPs. Materiál a metody Maso. Vepřová krkovice (600g) a hovězí zadní (600g) zakoupeno v maloobchodní síti. Mletí. Maso bylo umleto na elektrickém masovém mlýnku do středně jemné konzistence. Ze směsi masa byla podle standardní receptury (Runštuk a kol. 2012) s malými úpravami připravena sekaná. Sekaná byla složena z: 1200 g masa, 2 bílků, 70 g strouhanky, 17 g soli, 25 g polohrubé mouky a 75 ml vody. V receptuře byly vynechány žloutky, bylinky a přidaný tuk (na vymazání formy), které by komplikovaly interpretaci výsledků. Pečení sekané bylo realizováno v pečící obdélníkové kovové formě s teflonovým povrchem (10 cm x 20 cm x 7 cm) a probíhalo v elektrické troubě předem vyhřáté na 200°C. Při této teplotě byla sekaná pečena 10 minut a následně byla teplota trouby nastavena na 180 °C, při které se sekaná pekla dalších 50 minut. Na konci pečení byla skutečná teplota uvnitř trouby 162 °C a v mase (ve středu) 63°C. Odběr vzorku. Analyzována byla jak syrová směs masa, tak maso odebírané z různých části upečené sekané po jejím rozkrájení na 1,5 cm plátky (viz obrázek č. 1). Detailní popis odběru vzorků je uveden v kap. Výsledky a diskuse. Lyofilizace. Odebrané vzorky byly uloženy v mrazáku a následně lyofilizovány 6 dní. Extrakce tuku. Tuk z lyofilizovaných vzorků byl extrahován v Soxhletově přístroji směsí hexan:diethylether (80:20) po dobu 6 hodin. SPE extrakce pomocí SPE aminokolonky Mega BE-NH2 (Agilent, USA). Jednotlivé frakce sterolů byly získávány elucí rozpouštědly o stoupající polaritě. Frakce byly odpařeny do sucha po přidání vnitřního standardu 5α-cholestanu (99 %) Sigma-Aldrich, St.Louis, USA. Derivatizace. Přečištěné SOPs byly převedeny na trimethylsilyl ethery pomocí 50µl BSTFA (Bis(trimethylsilyl)-trifluoro-acetamid - Merck, Darmstadt) v 100 µl pyridinu při 60°C, 1 hodinu. GC-MS analýza. Plynový chromatograf Agilent 7820A s hmotnostním detektorem Agilent 5975 Series MSD (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA). Analyty byly separovány kapilární kolonou Supelco (SACTM5, 60m x 0,25 mm x 0,25 µm). Nosným plynem bylo helium. Výsledky a diskuse Odběr vzorků byl realizován tak, aby bylo možno odlišit části pokrmu s odlišnou teplotou a přístupem kyslíku při pečení. Pokrm byl rozdělen na dvě části:
- 43 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA • středový plátek, který byl následně rozdělen do 4 oblastí, jak je znázorněno na obr. 1. Lze předpokládat, že v části A (střed) bude nejnižší úroveň oxidace a naopak v části B (kůrka) bude rozsah oxidace nejvyšší • krajní plátky byly rozděleny do 3 oblastí, jak je znázorněno na obr. 2. Oblast A´ byla následně ještě rozdělena do 3 příčných sektorů označených A´x (vnější plátek přiléhající k formě), A´y (střední plátek) a A´z (vnitřní plátek).
b
B
b
D
a
b
C
C A
Obrázek 1 Schéma odběrových míst sekané - střed (a = 1,5 cm; b = 0,5 cm) B´
b b
b C
A´
C ´
Obrázek 2 Schéma odběrových míst sekané – kraje (a = 0,5 cm) Ze všech uvedených částí, ze směsi původního syrového masa a směsi kompletní suroviny byl extrahován tuk (viz kap. Materiál a metody). Obsah tuku v surovinách a jednotlivých částech pokrmu je uveden v tab. 1. Tabulka 1 Obsah tuku v surovině a upečené sekané Obsah tuku (%) Surovina střed 48,8 Směs syrového masa A 29,9 Směs kompletní suroviny B C D
- 44 -
Pokrm kraje 30,3 33,9 32,2 28,9
A´x A´y A´z B´ C´
28,9 27,0 27,4 26,0 31,3
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Byl sledován výskyt tří obvykle nejvíce zastoupených oxysterolů – 7-ketocholesterolu (5cholesten-3β-ol-7-on), 5,6-epoxycholesterolu (5,6α-epoxycholestan-3β-ol) a cholesteryltriol (5α-cholestan-3β,5,6β-triol). K detekci byl použit jednoduchý kvadrupol v modu SIM. Vzhledem k tomu, že se u reálného, tepelně opracovaného potravinářského materiálu jedná prakticky o stopovou analýzu, je získání spolehlivých dat poměrně obtížné. Spolehlivé výsledky jsou k dispozici u stanovení oxysterolů v původní surovině, u které byl nad mezí kvantifikace pouze 7-ketocholesterol - koncentrace 351 µg/kg tuku, což odpovídá 171 µg/kg původní suroviny (3 paralelní stanovení; RSD 23,2 %). Ve středovém plátku (část A) byl nad mezí kvantifikace opět jen 7-ketocholesterol - koncentrace 911 µg/kg tuku, což odpovídá 276 µg/kg dané části pokrmu (3 paralelní stanovení; RSD 7,8 %). Ostatní hodnoty jsou zatím bez spolehlivých paralelních stanovení a nelze z nich vyvozovat relevantní závěry. Závěr Dosud získané výsledky ukazují na to, že nejvýznamnějším oxysterolem vznikajícím při tepelném zpracování masa je 7-ketocholesterol. I ve středu pokrmu, kde se předpokládá nejmenší míra oxidace, je nárůst jeho obsahu možno považovat za významný – obsah je 2,6 násobkem obsahu v původní surovině. Výsledky ukazují, že takto nastavený experiment může poskytnout cenné informace o vzniku těchto negativně hodnocených sloučenin a může sloužit jako východisko k úpravě technologických procesů vedoucích k minimalizaci jejich vzniku. Literatura Barriuso B., Otaegui-Arrazola A., Menéndez-Carreńo M., Asrziasarán I., Ansorena D.: Sterols heating: Degradation and formation of their ring-structure polar oxidation products. Food Chemistry 135 (2012) 706-712. Dinh Thu T.N., Thompson L.D., Galyean M.L., Brooks J.Ch., Patterson K.Y., Boylan L.M.: Cholesterol content and method for cholesterol determination in meat and poultry. Reviews in Food science and Food Safety 10 (2011) 269-289. Garcia-Llatas G., Rodriguez-Estrada M.T.: Current and new insights on phytosterol oxides in plant sterol-enriched food. Chemistry and Physics of Lipids 164 (2011) 607-624. Dutta P.CH., Appelqvist L.A.: Studies on Phytosterol Oxides. I: Effect of Storage on the Content in Potatoe Chips Prepared in Different Vegetable Oils. Journal of the American Oil Chemists´Society 74 (1997) 647-657. Dutta P. CH.: Studies on Phytosterol Oxides. II: Content in Some Vegetable Oils and in French Fries Prepared in These Oils. Journal of the American Oil Chemists´Society 74 (1997) 659-666. Finocchiaro E.T., Lee K., Richardson T.: Identification and quantification of cholesterol oxides in grated cheese and bleached butter oil. Journal of American Oil Chemist Society 61 (1984) 877-883. Grandgirard A., Martine L., Joffre C., Juaneda P., Berdeaux O.: Gas chromatographic separation and mass specrometric identification of mixtures of oxyphytosterol and oxycholesterol derivatives. Application to a phytosterol-enriched food. Journal of Chromatography A 1040 (2004) 239-250. Hovenkamp E., Demonty I., Plat J., Lütjohann D., Mensik R.P., Trautwein E.A.: Biological effects of oxidized phytosterols: A review of current knowledge. Progress in Lipids Research 47 (2008) 37-49. Hur S.J., Park G.B., Joo S.T.: Formation of cholesterol oxidation products (COPs) in animal products. Food Control 18 (2007) 939-947.
- 45 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Lai S. M., Gray J.I., Buckley D.J., Kelly P.M.: Influence of free radicals and other factors on formation of cholesterol oxidation products in spray-dried whole egg. Journal of Agricultural and Food Chemistry 43 (1995) 1127-1131. Lakerson B., Dutta P.C., Hansson I.: Effect of frying and storage on cholesterol oxidation in Minced Meat Products. Journal of the American Oil Chemists´Society 77 (2000) 675680. Lee H.W., Chien J.T., Chen B.H.: Formation of Cholesterol Oxidation Products in Marinated Foods durring Heating. Journal of Agricultural and Food Chemistry 54 (2006) 48734879. Novelli E. Zanardi E., Ghiretti G.P., Campanini G., Dazzi G., Madarena G., Chizzolini R.: Lipid and cholesterol oxidation in frozen stored pork, salame Milano and mortadella. Meat Science 48 (1998) 29-40. Obara A., Obiedzinski M., Kolczak T.: The efect of water activity on cholesterol oxidation in spray- and freeze-dried egg powders. Food Chemistry 95 (2005) 173-179. Osada K., Kodama T., Yamada K., Sugano M.: Oxidation of Cholesterol by Heating. Journal of Agricultural and Food Chemistry 41 (1993) 1198-1202. Otaegui-Arrazola A., Menéndez-Carreño M., Anstorena D., Astiasarán I.: Oxysterols: A world to explore. Food and Chemical Toxicology 48 (2010) 3289-3303. Peterson D.W. : Effect of soybean sterols in the diet on plasma and liver cholesterol in chicks. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 78 (1951) 143–147. Poli G., Biasi F., Leonarduzzi G.: Oxysterols in the patogenesis of major chronic diseases. Redox Biology 1 (2013) 125-130. Rudzińska M., Przybylski R., Wąsowicz E.: Products formed during thermo-oxidative degradation of phytosterols. Journal of the American Oil Chemists´ Society 86 (2009) 651-662. Runštuk J., Syrový F., Bocan J., Rusnaková S., Šourek J.: Receptury teplých pokrmů. Radek Runštuk – R plus, Hradec Králové (2012) ISBN 978-80-904093-0-9. Ryan E., Chopra J., McCarthy F., Maguire A. R., O´Brien N.M.: Qualitative and quantitative comparison of the cytotoxic and apoptotic potential of phytosterol oxidation products with their corresponding cholesterol oxidation products. British Journal of Nutrition 94 (2005) 443-451. Shibata N., Glass C.K.: Macrophages, oxysterols and atherosclerosis. Circulation Journal 74 (2010) 2045-2051. Vanmierlo T., Husche C., Schött H.F., Pettersson H., Lütjohann D.: Plant sterol oxidation products – Analogs to cholesterol oxidation products from plant origin? Biochemie 95 (2013) 464-472. Zunin P., Calcagno C., Evangelisti F.: Sterol oxidation in infant milk formulas and milk cereals. Journal of Dairy Science 65 (1998) 591-598. Zunin P., Boggia R., Evangelisti F.: Identification and quantification of cholesterol oxidation products in canned tuna. Journal of the American Oil Chemists´ Society 78 (2001) 1037 1040.
- 46 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA OXIDAČNÍ A POLYMERAČNÍ PRODUKTY V TEPELNĚ NAMÁHANÝCH OLEJÍCH A TUCÍCH Š. Šimková, B. Pohořelá, M. Sabolová, J. Pánek Ústav analýzy potravin a výživy, VŠHT Praha, Technická 5, 166 28 Praha 6 Abstract The heating of oils and fats at high temperature and in the presence of air leads to the formation of oxidation and polymeric products. These decomposition products may adversely affect the taste, aroma, colour, texture, nutrition value and quality of food. To evaluate the degree of oxidation changes, we determined the amounts of polymeric triacylglycerols and oxo-carboxylic acids. Rapeseed oil, sunflower oil and lard were heated at 180°C for 24 hours. A process partially mimics the frying of food. Silica column chromatography was used to fractionation of lipids into non-polar and polar fraction. Both fractions were analysed by high performance size-exclusion chromatography (HPSEC) to determine the levels of polymeric triacylglycerols and by HPLC to determine the levels of oxidative products. Further the oxocarboxylic acids were established by GC/MS in the polar fraction. The non-volatile aldehydic acids could be transfered to fried food and they may be harmful to human because these compounds are easily absorbed in the intestinal tract after hydrolysis by pancreatic lipase. Zahřívání olejů a tuků za vysoké teploty a přítomnosti vzduchu vede k tvorbě oxidačních a polymeračních produktů, ať těkavých či netěkavých. Tyto rozkladné produkty mohou mít nepříznivý vliv na chuť, vůni, barvu, texturu, nutriční hodnotu a hygienicko-toxikologickou kvalitu potravin. Za nejrizikovější jsou přitom považovány zejména degradační produkty se střední a nižší molekulovou hmotností, k nimž se řadí relativně méně toxické dimery, cyklické monomery a karbonylové deriváty mastných kyselin. Pro posuzování celkového stupně degradace olejů a tuků se používá parametr obsahu polymerních triacylglycerolů, oxidačních produktů a obsahu celkových polárních látek. Řepkový olej, slunečnicový olej a vepřové sádlo byly zahřívány na topné desce 15 minut až 24 hodin při teplotě 180°C. Oleje a tuky byly poté frakcionovány metodou IUPAC 2.507 na koloně silikagelu elučními rozpouštědly o rostoucí polaritě a tím získány nepolární a polární frakce. V obou frakcích byly analyzovány polymerní triacylglyceroly (pTAG) a oxidační produkty. pTAG byly stanovovány vysokoúčinnou vylučovací chromatografií (HPSEC) s refraktometrickým detektorem HP 1047 A (Hewlett Packard, USA) nastaveným na teplotu 30°C. Princip dělení složek tuku a oleje je na základě rozdílu velikosti molekuly. Byla použita kolona PL-gel Mixed-E 300 mm x 7,5 mm x 3 µm (Agilent, USA). Tetrahydrofuran (HPLC, Merck, USA) byl použit jako mobilní fáze o průtoku 0,6 ml/min. Nástřik byl 5 µl automatickým dávkovačem HP 1050 (Hewlett Packard, USA). Obsah pTAG byl vyhodnocen pomocí programu CSW 1.6. (Data Apex, ČR). Oxidační produkty byly stanovovány vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií s refraktometrickým detektorem HP 1047 A (Hewlett Packard, USA) nastaveným na teplotu 35°C. Dělení oxidovaných a neoxidovaných triacylglycerolů se děje na základě jejich polarity, která zahrnuje počet uhlíků v molekule (délku jednotlivých mastných kyselin), počet dvojných vazeb a vliv případného substituentu (hydroperoxid, hydroxyderivát atd.). Byla použita kolona Purospher RP – 18 250 mm x 4 mm x 5 µm (Merck, USA) vyhřívaná na 40°C a mobilní fáze aceton: acetonitril: methanol v poměru 4:2:1 (v/v/v) o průtoku 1 ml/min. Nástřik byl 100 µl automatickým dávkovačem HP 1050 (Hewlett Packard, USA). Obsah oxidačních produktů byl vyhodnocen pomocí programu CSW 1.6. (Data Apex, ČR). - 47 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Rozsah oxidace a následných reakcí mastných kyselin v řepkovém oleji byl sledován, po převedení mastných kyselin na methylestery dle metody IUPAC 2.301 s modifikací pro vnitřní standard (nonadekanová kyselina), pomocí plynové chromatografie s hmotnostním detektorem. Analýzy methylesterů mastných kyselin byly provedeny na přístroji Agilent 7820 A (Agilent, USA) s hmotnostním detektorem Agilent 5975 (Agilent, USA). Byla použita kolona Innowax 19091N-133 (Agilent, USA) 30 m x 250 µm x 0,25 µm a následující teplotní program: 110°C, 5 °C/min; 245°C (40 min). Jako hmotnostní analyzátor byl použit jednoduchý kvadrupol. Průtok nosného plynu, helia, byl 1 ml/min. Pro kvantifikaci mastných kyselin byla použita metoda vnitřního standardu. Obsah oxidačních produktů stoupal s prodlužující se dobou zahřívání. Obsah u řepkového oleje a sádla nebyl nijak vysoký (0 - 9 %), zatímco u slunečnicového oleje vzrostl až na 20 %. V nepolární frakci se obsah oxidačních produktů pohyboval v rozmezí 0 - 5 %, zatímco v polární frakci vzrostl u sádla na 55 % a u slunečnicového oleje na 94 %.
Fig. 1 The content of oxidation products in original samples and polar fraction Hygienický limit pro obsah polymerních triacylglycerolů není legislativně určen, nicméně uzančně se za nejvyšší přípustnou hodnotu považuje 12 %. Obsah polymerních triacylglycerolů u nefrakcionovaných vzorků postupně stoupal s dobou zahřívání. Po 24hodinovém zahřívání slunečnicového oleje obsah pTAG stoupl na 28 %. V nepolární frakci byl obsah pTAG nulový. Veškeré polymery byly eluovány v polární frakci. Lze tedy předpokládat, že se bude jednat o oxidované polymery. Po 24hodinovém zahřívání vzrostl obsah pTAG v této frakci na 62 % u slunečnicového oleje, 48 % u sádla a po 12hodinovém zahřívání u řepkového oleje na 43 %.
Fig. 2 The content of polymeric triacylglycerols in original samples and polar fraction
- 48 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Řepkový nízkoerukový olej patří mezi vysoce nenasycené a tudíž výrazně oxylabilní a termolabilní rostlinné oleje. Ve srovnání se slunečnicovým olejem má výrazně nižší obsah oxylabilní linolové kyseliny. Na druhé straně obsahuje (podobně jako např. sójový olej) vyšší množství (až 10 %) ještě labilnější linolenové kyseliny. Právě linolenová kyselina tento olej výrazně destabilizuje, takže ve výsledku je jeho termostabilita ve srovnání se slunečnicovým olejem nižší nebo srovnatelná, přestože celkový obsah oxylabilních polyenových kyselin je v řepkovém oleji nižší. V pokusu byl řepkový olej zahříván na teplotu 180 °C, což jsou podmínky, které jsou běžně užívány pro hodnocení termostability a oxidační stability oleje a do určité míry i simulují podmínky při smažení. Z uvedených výsledků je vidět, že obsah nasycených a monoenových mastných kyselin zůstává po celou dobu zahřívání prakticky neměnný. Během zahřívání dochází k výrazné oxidaci linolové a zejména linolenové kyseliny. Jejich obsah v řepkovém oleji po 16 hodinách klesá na 77 % v případě linolové kyseliny a na 47 % u linolenové kyseliny. Dále je uvedena dynamika tvorby tří typických oxidovaných mastných kyselin – 9,10-epoxystearové, 9,10-dihydroxystearové a 9-oxostearové kyseliny. Obsah epoxystearové a dihydroxystearové kyseliny roste v průběhu záhřevu prakticky lineárně a v 16. hodině záhřevu již je obsah těchto derivátů srovnatelný s obsahem palmitové kyseliny. Identita těchto tří uvedených kyselin je prokázána analýzou hmotnostního spektra a srovnáním s literárními údaji. V tabulce 1 nejsou uvedeny mastné kyseliny s obsahem pod 1 % veškerých mastných kyselin – eikosanová (arachová), eikosadienová, heneikosanová, dokosanová (behenová), dokosenová (eruková), trikosanová, trikosenová, tetrakosanová a tetrakosenová. Další potenciální oxidované deriváty buď nebyly s dostatečnou spolehlivostí identifikovány nebo byly pod mezí stanovitelnosti.
Tab. 1 The content of fatty acids in thermally processed rapeseed oil (mg/kg sample) Kyselina 0h C 16:0 4508 C 18:0 6317 C 18:1 217987 C 18:2 64062 C 18:3 29717 C 20:1 15294 9,100 epoxystearová 9,100 dihydroxystearová 9-oxostearová 0
30 min 4545 7144 244641 71761 32323 16309
45 min 4583 7100 239113 70476 31966 16046
1h 4620 7161 244563 70526 31789 17236
2h 4665 7252 248508 70629 31403 18020
4h 4750 7150 238005 68452 30096 16884
8h 4164 6905 230158 58962 23468 17844
12 h 4654 7436 243915 53925 18195 21491
16 h 4812 7415 247173 49715 13898 20622
794
965
1089
1276
1546
2793
3665
5265
0
0
0
0
0
1965
3639
4563
0
0
0
0
0
477
729
907
- 49 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA
Fig. 3 Dependence of the content of fatty acids in rapeseed oil on heating time
Fig. 4 Chromatogram of fatty acids methyl esters in rapeseed oil after 16 hours of heating 1. hexadecanoic acid (Rt= 19,78 min); 2. stearic acid (Rt=23,47 min); 3. oleic acid (Rt=23,95 min); 4. linoleic acid (Rt=24,71 min); 5. nonadecanoic acid, internal standard (Rt=25,22 min); 6. linolenic acid (Rt=25,80 min); 7. 11-eicosenoic (Rt=27,24 min); 8. 9-oxostearic acid (Rt=32,86 min); 9. 9,10epoxystearic acid (Rt=36,02 min); 10. 9,10-dihydroxystearic acid (Rt=38,72 min)
- 50 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Nejstabilnější tuk z hlediska obsahu tvorby polymerních triacylglycerolů a oxidačních produktů se jeví sádlo, následované řepkovým olejem. Naopak slunečnicový olej je nejméně stabilní při podmínkách, které imitují proces smažení. Tokoferoly přítomné v řepkovém a slunečnicovém oleji se velmi rychle degradují a na průběh oxidace za této vysoké teploty prakticky nemají vliv. Stabilita je v tomto případě ovlivněna pouze obsahem a složením polyenových kyselin. Obsah nasycených a monoenových kyselin byl během zahřívání prakticky neměnný. Oproti tomu, esenciální mastné kyseliny podléhaly poměrně výraznému rozkladu. To dokazuje, že smažicí oleje, kdy při smažení jsou podmínky pro oxidaci daleko příznivější, nemohou být reálně dobrým zdrojem esenciálních mastných kyselin. Financováno z účelové podpory na specifický vysokoškolský výzkum (MŠMT č.20/2014). Reference 1. IUPAC b– Comission on Oils, Fats and Derivatives. Method 2.507 – Determination of polar compounds in frying fats, In: Standard Methods for the analysis of oils, fats and derivatives. 7th Edition, Paquot C., Hautfenne A., Eds., Blackwell Sci. Publications, Oxford, 1987. 2. IUPAC - Comission on Oils, Fats, and Derivatives: Methods 2.301 – Preparation of the Fatty Acid Methyl Esters. Standard Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives, 7th Edition, Paquot C., Hautfenne A., Eds., Blackwell Sci. Publications, Oxford, 1987. 3. Berdeaux O., Velasco J., Márquez-Ruiz G., Dobarganes C. Evolution of Short-Chain Glycerol-Bound Compounds During Thermoxidation of FAME and Monoacid TAG, J. Amer Oil Chem Soc 79, 279-285, 2002 4. Velasco J., Marmesat S., Márquez-Ruiz G., Dobarganes C.: Formation of Short-Chain Glycerol-Bound Oxidation Products and Oxidised Monomeric Triacylglycerols During Deep-Frying and Occurence in Used Frying Fats. Eur J Lipid Sci Technol 106, 728-735, 2004
- 51 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA VLIV METFORMINU NA PARAMETRY METABOLICKÉHO SYNDROMU A AKTIVITU HNĚDÉ TUKOVÉ TKÁNĚ U HEREDITÁRNĚ HYPERTRIACYLGLYCEROLEMICKÝCH POTKANŮ EFFECT OF METFORMIN ON THE METABOLIC SYNDROME PARAMETERS AND THE ACTIVITY OF BROWN ADIPOSE TISSUE IN HEREDITARY HYPERTRIACYLGLYCEROLEMIC RATS V. Škop, H. Malínská, J. Trnovská, L. Kazdová Centrum experimentální medicíny, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha Abstract Metformin is the first-line drug for the treatment of type 2 diabetes. Besides its wellcharacterized anti hyperglycemic properties, metformin has also positive effect on dyslipidemia. In this study, we investigated the effect of 4 weeks metformin treatment on the metabolic syndrome parameters and the activity of brown adipose tissue (BAT) in hereditary hypertriacylglycerolemic rats. We found that metformin markedly lowered weight of animals, serum TAG, NEMK, insulin and glycerol levels, and increased serum levels of HDL cholesterol and β-hydroxybutyric acid and increased insulin sensitivity and lipolysis in white adipose tissue. Metformin next decreased level of hepatic TAG, but had no effect on TAG content in heart, m. gastrocnemius and diaphragm. We found that metformin modified the proportion of fatty acids in membrane phospholipids of heart, the changes that we found has been linked to better insulin sensitivity. The most important part of this study was investigate the effect of metformin on BAT. Metformin increased oxidation and deposition of glucose, but had no effect on oxidation or deposition of exogenous fatty acid and had negative effect on the oxidation of intracellular lipid. Collectively, our results identify the new possible mechanisms of metformin action on glucose and lipid metabolism. Úvod Jestřabina lékařská se k léčbě symptomů provázejících diabetes 2. typu používala v Evropě již od středověku. Jako účinné látky jestřabiny lékařské, které mají vliv na hladinu krevní glukózy, byly identifikovány galegin (isopentenyl guanidin) a guanidin. Guanidin a jeho deriváty byly v souvislosti s léčbou diabetu studovány v první polovině 20. století, avšak kvůli jejich toxicitě se od jejich využití upustilo. Následně byly pro léčbu diabetu syntetizovány a testovány biguanidy (obsahují dvě spojené guanidinové skupiny), z nichž tři (metformin, fenformin a buformin) se ukázaly jako užitečné a byly používány v 50. a 60. letech. Kvůli častým případům laktátové acidózy a zvýšené mortalitě však byly fenformin a buformin staženy v 70. letech (Witters, 2001; Maric´, 2010). Metformin (1,1-dimethylbiguanid) je ve srovnání s nimi méně lipofilní, následkem čehož je jinak transportován mezi mitochondriemi a cytozolem a nezpůsobuje tak laktátovou acidózu (Owen et al., 2000). Přestože byl metformin poprvé syntetizován již v roce 1922, začal se k léčbě více využívat až v poslední čtvrtině 20. století. Dnes je metformin nejčastěji předepisovaným lékem pro pacienty s diabetem 2. typu (Witters, 2001; Maric´, 2010). Nejvýznamnějším efektem metforminu na metabolizmus je inhibice jaterní produkce glukózy a glukoneogeneze. Účinek metforminu je zprostředkován inhibicí komplexu I mitochondriálního dýchacího řetězce, následkem toho dojde ke snížení produkce ATP a ke zvýšení aktivity AMP aktivované protein kinázy (AMPK), která je klíčovým regulačním bodem mnoha biochemických drah a slouží buňce jako „energetický senzor“. AMPK reguluje zejména glukózový transport, glukoneogenezi, lipolýzu a lipogenezi na úrovni genové - 52 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA exprese a regulace aktivity vybraných enzymů (Owen et al., 2000; Ruderman et al., 2014). Řada prací však ukazuje, že ne všechny účinky metforminu je možné vysvětlit tímto mechanizmem (Halley et al., 2002). Nově popsaným mechanizmem účinku metforminu je inhibice mitochondriálního enzymu glycerol-3-fosfátdehydrogenázy. Inhibice tohoto enzymu má za následek změnu oxidačně-redukčního stavu cytozolu a mitochondrií, což způsobí inhibici syntézy glukózy z laktátu a glycerolu (Madiraju et al., 2014). Tato teorie však prozatím nebyla potvrzena v dalších pracích a detailní pochopení účinku metforminu tak bude vyžadovat ještě další studie. Metformin je předepisován zejména pro svoji schopnost účinně snižovat hladinu krevní glukózy. Často jsou však přehlíženy jeho další důležité vlastnosti, zejména jeho pozitivní vliv na dyslipidémii. Metformin snižuje koncentraci sérových triacylglycerolů (TAG) a pozitivně ovlivňuje metabolizmus lipoproteinů. Účinek metforminu na metabolizmus lipidů je zprostředkován opět zejména jeho vlivem na AMPK (Geerling et al., 2013), nicméně popis jeho účinku na lipidový metabolizmus v jednotlivých tkáních stále ještě nebyl dostatečně objasněn. Snížení koncentrace sérových triacylglycerolů může být dáno buď jejich sníženým uvolňováním z jater ve formě VLDL nebo jejich zvýšenou absorpcí z krve v periferních tkáních a odbouráním. Tkání, která má velký význam při odbourávání lipidů a mohla by tak být důležitým cílem pro účinek metforminu, je hnědá tuková tkáň. Savci mají dva hlavní typy tukové tkáně – bílou a hnědou. Zatímco bílá tuková tkáň slouží především jako místo k ukládání energetických zásob, hnědá tuková tkáň je místem, kde jsou energetické zásoby odbourávány a přeměněny na teplo. V poslední době se hnědá tuková tkáň opět dostává do popředí zájmu vědeckého zkoumání. To je způsobeno nedávnými studiemi, které ukázaly, že se u lidí hnědá tuková tkáň nenachází pouze v novorozeneckém období, ale že přetrvává v aktivní podobě i v dospělosti (Saito, 2014). Vliv metforminu na hnědou tukovou tkáň je dosud nejasný. Dvě starší práce, zabývající se vlivem metforminu na hnědou tukovou tkáň, nenalezly žádný vliv metforminu na její aktivitu a na odbourávání energetických zásob v této tkáni (Keates a Bailey, 1993; Rouru et al., 1993). Nejnovější práce, která se tímto tématem zabývá, naopak ukazuje velký vliv metforminu na aktivitu hnědé tukové tkáně a zároveň naznačuje, že hlavní efekt metforminu na metabolizmus lipidů je zprostředkován právě touto tkání (Geerling et al., 2013). Cílem této práce je studovat vliv metforminu na parametry asociované s metabolickým syndromem, zejména jeho vliv na ektopické ukládání lipidů v jednotlivých tkáních a na metabolické vlastnosti hnědé tukové tkáně u hereditárně hypertriacylglycerolemických potkanů. Metody Pokusy byly provedeny u neobézních hereditárně hypertriacylglycerolemických (HHTg) potkanů, vyselektovaných z kmene Wistar jako model lidské hyper-triacylglycerolemie. U tohoto kmene potkanů se vyskytují i další abnormality, zejména, inzulinová rezistence, poruchy glukózového metabolizmu a hypertenze (Zicha et al., 2006). V pokusech byli použiti potkaní samci ve věku 9 měsíců. Všechna zvířata byla krmena ad libitum standardní peletovanou dietou. Pokusné skupině byl do diety přidáván metformin (Teva Pharmaceuticals, ČR) v dávce 300 mg/kg/den po dobu 4 týdnů. Celkový počet zvířat v každé skupině byl 6. Množství triacylglycerolů (TAG) v séru a po extrakci z tkání podle metody popsané v publikaci (Qi a Kazdová, 2002) bylo stanoveno analytickou soupravou TG L 250 S (ErbaLachema, ČR). Koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin (NEMK) byla měřena komerčním kitem free fatty acids, half micro test (Roche Diagnostic, Německo), koncentrace glycerolu byla stanovena kitem GLY (Randox, UK) a konceentrace β-hydroxybutyrátu kitem RANBUT (Randox, UK). Koncentrace sérového inzulinu byla měřena komerčním imunochemickým kitem Rat Insulin ELISA kit (Mercodia, Švédsko). - 53 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Zastoupení jednotlivých mastných kyselin ve fosfolipidech levé srdeční komory bylo stanoveno plynovou chromatografií s FID detektorem po předchozí extrakci lipidů směsí dichlormethan/methanol a rozdělením jednotlivých lipidových tříd tenkovrstvou chromatografií. Metabolické parametry bílé a hnědé tukové tkáně byly stanoveny ex vivo. Oxidace (inkorporace do CO2) glukózy a kyseliny palmitové a inkorporace těchto látek do intracelulárních lipidů byly stanoveny inkubací tkáně v přítomnosti radioaktivně (14C) značené glukózy nebo kyseliny palmitové. Lipolýza byla sledována podle uvolňování NEMK a glycerolu z tkáně do média. Výsledky a diskuse Podávání metforminu HHTg potkanům mělo za následek 20% snížení tělesné hmotnosti v průběhu 4-týdenního experimentu (tab. 1). Zvířata, kterým byl podáván metformin, vykazovala v porovnání s kontrolními potkany zlepšené některé parametry asociované s metabolickým syndromem (tab. 2,3). Zejména byla snížena koncentrace glukózy na lačno, koncentrace triacylglycerolů (TAG) na lačno i postprandiálně, koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin (NEMK). Na zlepšení inzulínové senzitivity ukazuje snížení koncentrace inzulínu a zvýšená inzulínem stimulovaná lipogeneze v bílé tukové tkáni (tab. 4). Dále byla zvýšena koncentrace HDL cholesterolu při zachování koncentrace celkového cholesterolu. Změny v metabolizmu po podávání metforminu se dále projevily ve sníženém množství triacylglycerolů (TAG) ektopicky uložených v játrech. V ostatních námi zkoumaných tkáních (kosterní sval, srdce a bránice) neměl metformin na množství TAG vliv (tab. 3). Negativním projevem podávání metforminu byla výrazně zvýšená ketogeneze (tab. 2). Tab. 1 Změna hmotnosti experimentálních zvířat v průběhu pokusu
tělesná hmotnost před pokusem (g) tělesná hmotnost na konci pokusu (g) P<
HHTg
HHTg + metformin
494 ± 12 493 ± 14 NS
539 ± 7 441 ± 16 0,01
Hodnoty udávají průměr ± SE; P: statistická významnost rozdílu hmotnosti před pokusem a na konci pokusu
- 54 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Tab. 2 Vliv metforminu na koncentraci analytů v krevním séru parametr glukóza na lačno (mmol/l) glukóza postprandiálně (mmol/l) TAG na lačno (mmol/l) TAG postprandiálně (mmol/l) NEMK (mmol/l) inzulín (nmol/l) celkový cholesterol (mmol/l) HDL cholesterol (mmol/l) glycerol (mmol/l) β-hydroxybutyrát (mmol/l)
HHTg
HHTg + metformin
P<
5,30 ± 0,27
4,49 ± 0,26
0,07
7,60 ± 0,53
7,05 ± 0,23
NS
6,72 ± 0,69
3,13 ± 0,15
0,01
9,79 ± 0,51
4,00 ± 0,63
0,01
0,874 ± 0,044 0,398 ± 0,083 1,54 ± 0,08 0,75 ± 0,05 0,362 ± 0,009 0,233 ± 0,047
0,342 ± 0,055 0,155 ± 0,028 1,58 ± 0,4 1,13 ± 0,13 0,256 ± 0,023 0,862 ± 0,149
0,01 0,05 NS 0,05 0,02 0,02
Hodnoty udávají průměr ± SE; P: statistická významnost rozdílu mezi skupinami
Tab. 3 Vliv metforminu na ektopické ukládání triacylglycerolů tkáň játra (µmol/g) m. gastrocnemius (µmol/g) srdce (µmol/g) bránice (µmol/g)
HHTg
HHTg + metformin
P<
12,84 ± 1,33 7,05 ± 1,03 1,17 ± 0,1 23,67 ± 4,59
8,54 ± 0,72 8,15 ± 1,02 1,40 ± 0,24 24,65 ± 4,29
0,02 NS NS NS
Hodnoty udávají průměr ± SE; P: statistická významnost rozdílu mezi skupinami Madiraju et al. (2014) ukázali, že metformin působí prostřednictvím inhibice mitochondriálního enzymu glycerol-3-fosfátdehydrogenázy. Tato inhibice se následně projeví sníženou glukoneogenezí z laktátu a glycerolu a zvýšeným množstvím laktátu a glycerolu v krvi. Tuto teorii však naše výsledky nepotvrzují (tab. 2). Dlouhodobé podávání metforminu HHTg potkanům mělo za následek snížené množství glycerolu v krvi. Metformin však ex vivo aktivoval uvolňování glycerolu a NEMK z bílé tukové tkáně (tab. 4). Na zvýšenou lipolýzu v bílé tukové tkáni po podávání metforminu ukazuje i snížení celkového množství viscerální bílé tukové tkáně, ve které je zvýšený obsah proteinů. Podobný efekt metforminu na bílé tukové buňky - aktivaci bazální lipolýzy doprovázenou zvýšenou rychlost β-oxidace ukázali Lenhard et al. (1997). Zvýšené uvolňování glycerolu a NEMK z tukové tkáně při současném snížení koncentrace těchto látek v séru ukazuje na jejich zvýšené odbourávání.
- 55 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Tab. 4 Vliv metforminu na parametry bílé a hnědé tukové tkáně parametr
HHTg
HHTg + metformin
P<
Bílá tuková tkáň (epididymální tukové těleso) hmotnost g(ETT+PRTT)/100 g t. hm 3,73 ± 0,19 3,15 ± 0,06 obsah bílkovin % 0,56 ± 0,02 0,66 ± 0,03 bazální (nmol/g/2h) 435,84 ± 31,13 510,86 ± 108,8 lipogeneze z glukózy + inzulín (nmol/g/2h) 497,88 ± 30,65 691,70 ± 106,5 bazální (µmol/g/2h) 1,11 ± 0,09 1,94 ± 0,11 glycerol + adrenalin (µmol/g/2h) 1,44 ± 0,22 2,43 ± 0,53 lipolýza bazální (µmol/g/2h) 1,54 ± 0,13 2,73 ± 0,46 NEMK + adrenalin (µmol/g/2h) 2,05 ± 0,18 3,53 ± 0,91 bazální 1,39 ± 0,05 1,44 ± 0,12 reesterifikace + adrenalin 1,47 ± 0,31 1,45 ± 0,19
0,05 0,05 NS 0,07 0,02 NS 0,07 NS NS NS
Hnědá tuková tkáň (interskapulární) hmotnost g/100g 0,07 ± 0,005 bílkoviny % 7,22 ± 0,65 bazální (nmol/g/2h) 296 ± 59 oxidace glukózy + inzulín (nmol/g/2h) 698 ± 45 bazální (nmol/g/2h) 400 ± 83 lipogeneze z glukózy + inzulínem (nmol/g/2h) 954 ± 196 lipogeneze z palmitátu bazální (nmol/g/2h) 1376 ± 75 oxidace palmitátu bazální (nmol/g/2h) 182,5 ± 10 glycerol bazální (µmol/g/2h) 8,65 ± 1,13 lipolýza NEMK bazální (µmol/g/2h) 2,05 ± 0,48 reesterifikace bazální 0,26 ± 0,074
0,05 NS NS 0,01 NS NS NS NS NS NS NS
0,05 ± 0,004 6,07 ± 0,502 421 ± 62 1354 ± 102 660 ± 108 1521 ± 228 1421 ± 67 150,7 ± 17,6 10,76 ± 1,17 4,35 ± 1,09 0,41 ± 0,098
Hodnoty udávají průměr ± SE; P: statistická významnost rozdílu mezi skupinami; ETT: epididymální tuková tkáň, PRTT: perirenální tuková tkáň V posledních letech se pozornost vědců zabývajících se metabolickým syndromem zaměřuje na studium hnědé tukové tkáně. Je to dáno zejména tím, že i malé množství této tkáně je schopno odbourat velké množství energetických zásob a nedávným objevem, že se aktivní hnědá tuková tkáň u lidí nachází i v dospělém věku. Z tohoto důvodu bylo důležitou částí této studie sledování efektu metforminu na metabolické parametry hnědé tukové tkáně. Geerling et al. (2013) studovali vliv metforminu na metabolizmus lipidů na myším modelu a ukázali, že hlavním mechanizmem, kterým metformin pozitivně ovlivňuje dyslipidemii je výrazně zrychlené odbourávání TAG ve hnědé tukové tkáni, kam jsou dopravovány ve formě VLDL, nikoliv změny v jaterní syntéze lipidů a lipoproteinů. Tato teorie však není podporována předchozími studiemi, při kterých nebyl nalezen významný vliv metforminu na aktivitu hnědé tukové tkáně (Keates a Bailey, 1993; Rouru et al., 1993), ale významný inhibiční vliv metforminu na jaterní lipogenezi (Zang et al., 2004; Li et al., 2011). - 56 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Přestože z našich výsledků ukazujících změny v metabolizmu hnědé tukové tkáně vyšlo statisticky významné pouze zvýšení inzulínem stimulované oxidace glukózy, je možné pozorovat ještě další číselně změněné parametry, které však kvůli velkému rozptylu a relativně malému počtu zvířat ve skupině nevyšly statisticky významné. Výsledky ukazují, že metformin aktivuje bazální i inzulínem stimulované využití exogenní glukózy, zejména její oxidací, která je v bazálním stavu zvýšena o 42 % a v přítomnosti inzulínu dokonce o 94 %, ale také její inkorporaci do lipidů. Nenalezli jsme však žádný efekt metforminu na ukládání nebo oxidaci exogenních mastných kyselin dodaných v neesterifikované formě vázané na albumin. Tento výsledek však neukazuje, jakým způsobem jsou v hnědé tukové tkáni degradovány nebo ukládány mastné kyseliny, které jsou do ní přijímány z VLDL po hydrolýze TAG pomocí lipoproteinlipázy. Z tohoto důvodu není možné na základě našeho výsledku vyvracet teorii, kterou publikovali Geerling et al. (2013). Dále jsme sledovali, jak dlouhodobé podávání metforminu ovlivní lipolýzu v hnědé tukové tkáni. Přestože uvolňování glycerolu metforminem téměř nebylo ovlivněno, pozorovali jsme navýšení uvolňování mastných kyselin o 112 %, což bylo doprovázeno významnou změnou vypočítané reesterifikace. Reesterifikace se počítá jako podíl uvolněných NEMK a glycerolu. V případě, že jsou veškeré NEMK i glycerol uvolněny z buněk, je esterifikace rovna číslu 3. Čím více mastných kyselin je však intracelulárně reesterifikováno nebo oxidováno, tím nižší hodnotu bude číslo udávající reesterifikaci mít (k oxidaci dochází zejména v hnědé tukové tkáni a proto je číslo vypočítané reesterifikace v hnědé tukové tkáni výrazně nižší než v bílé tukové tkáni). Tento výsledek naznačuje, že přestože se podáváním metforminu výrazně nezvyšuje množství celkových odbouraných intracelulárních TAG, negativně se změní způsob, jakým jsou uvolněné mastné kyseliny dále využívány – je snížena jejich oxidace a zvýšeno uvolňování. Tento výsledek však může být ovlivněn možným dalším využitím glycerolu v hnědé tukové tkáni, protože je zde, na rozdíl od bílé tukové tkáně, exprimován gen pro glycerolkinázu, což je při výpočtu reesterifikace zanedbáváno. Dalším negativním efektem metforminu na hnědou tukovou tkáň bylo celkové snížení jejího množství bez výrazného ovlivnění obsahu bílkovin. Obsah bílkovin v tukové tkáni je nepřímým parametrem velikosti a struktury buněk. Je tedy možné usoudit, že vlivem metforminu dochází ke snížení hmotnosti hnědé tukové tkáně nikoliv vlivem sníženého obsahu intracelulárních lipidů, ale vlivem snížení počtu hnědých adipocytů, které obsahují přibližně stejné množství lipidů jako hnědé adipocyty z kontrolních potkanů. Dalším parametrem, kterým jsme se v této studii zabývali, bylo složení mastných kyselin v membránových fosfolipidech srdečního svalu. Toto složení výrazně ovlivňuje fluiditu membrány a má vliv zejména na inzulínovou citlivost, ale také na působení dalších hormonů a cytokinů a může tak mít vliv na rozvoj zánětlivé odpovědi a aterosklerózy (Anderson et al. 1998; Vessby et al., 2001). Podávání metforminu výrazně ovlivnilo zastoupení jednotlivých mastných kyselin (tab. 5). Z těchto výsledků je možné poukázat na ty nejdůležitější změny. Efekt podávání metforminu se projevil v zastoupení nasycených mastných kyselin, kdy bylo zvýšeno množství kyseliny stearové na úkor palmitové, dále ve sníženém celkovém množství mononenasycených mastných kyselin, z čehož je nejdůležitější snížení množství kyseliny palmitoolejové o 54 %. Množství polynenasycených mastných kyselin (PUFA) z řady n-6 bylo po podávání metforminu celkově sníženo, zejména bylo sníženo množství kyseliny linolové, dihomo-γ-linolenové a γ-linolenové při současném zvýšení množství kyseliny arachidonové. Přestože byly v řadě n-3 PUFA po podávání metforminu nejmenší změny, bylo celkové množství mastných kyselin této řady zvýšeno. Souhrnně tyto výsledky ukazují, že podávání metforminu má pozitivní vliv na složení mastných kyselin v membránových fosfolipidech srdce, kdy dochází ke změnám, které jsou spojovány se zlepšením inzulínové senzitivity (Anderson et al. 1998; Vessby et al., 2001). Negativně se metformin projevil pouze snížením množství kyseliny linolové a zvýšením množství kyseliny arachidonové, - 57 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA která je prekurzorem biosyntézy zánětlivých eikosanoidů. Naopak dalším pozitivním efektem metforminu je zvýšená aktivita ∆5desaturázy a snížená aktivita ∆9desaturázy, což jsou opět změny spojované s lepší inzulínou senzitivitou (Vessby et al., 2001). Tab. 5 Vliv metforminu na spektrum mastných kyselin v membránových fosfolipidech levé komory myokardu HHTg
HHTg + metformin
P<
14:00 16:00 18:00 SFA
0,08 ± 0,05 13,00 ± 0,4 20,97 ± 0,06 34,05 ± 0,4
0,06 ± 0,02 11,04 ± 0,09 24,06 ± 0,25 35,17 ± 0,21
NS 0,05 0,01 NS
16:1n7 18:1n9 18:1n7 MUFA
0,50 ± 0,05 3,93 ± 0,06 5,60 ± 0,1 10,03 ± 0,004
0,23 ± 0,003 3,36 ± 0,09 4,40 ± 0,11 7,99 ± 0,07
0,05 0,01 0,01 0,01
18:2n6 18:3n6 20:2n6 20:3n6 20:4n6 22:4n6 PUFA n6
22,39 ± 0,54 0,15 ± 0,001 0,18 ± 0,01 0,64 ± 0,02 21,84 ± 0,57 0,45 ± 0,01 45,65 ± 0,02
18,07 ± 0,34 0,11 ± 0,002 0,13 ± 0,005 0,44 ± 0,01 24,94 ± 0,27 0,66 ± 0,03 44,35 ± 0,38
0,05 0,00 0,05 0,02 0,07 0,01 0,05
18:3n3 18:4n3 20:4n3 20:5n3 22:5n3 22:6n3 PUFA n3
0,06 ± 0,02 0,03 ± 0,001 0,02 ± 0,01 0,17 ± 0,002 4,16 ± 0,28 5,84 ± 0,66 10,27 ± 0,37
0,05 ± 0,01 0,03 ± 0,001 0,02 ± 0,002 0,10 ± 0,003 4,44 ± 0,14 7,86 ± 0,41 12,50 ± 0,32
NS NS NS 0,01 NS 0,05 0,03
n6/n3 elongasa ∆5desaturáza ∆9desaturáza
4,45 ± 0,16 1,61 ± 0,05 34,15 ± 1,83 0,04 ± 0,002
3,56 ± 0,12 2,18 ± 0,04 56,5 ± 1,04 0,02 ± 0,0003
0,04 0,01 0,02 0,01
mastné kyseliny
Hodnoty udávají průměr ± SE; P: statistická významnost rozdílu mezi skupinami
- 58 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Závěr Metformin kromě svého známého účinku na metabolizmus sacharidů výrazně zlepšuje také parametry spojované s metabolizmem lipidů. Zejména snižuje množství TAG a NEMK v krvi a zvyšuje množství HDL cholesterolu. Dále metformin ovlivňuje složení membránových mastných kyselin v srdci, kde byly nalezeny změny spojované s lepší inzulínovou senzitivitou. Jedním z mechanismů účinku metforminu by mohlo být ovlivnění metabolických parametrů hnědé tukové tkáně, kde je vlivem metforminu ve zvýšené míře metabolizována glukóza. Avšak na metabolizmus mastných kyselin v hnědé tukové tkáni má metformin vliv spíše negativní. Studie byla podpořena a projektem (Ministerstva zdravotnictví) rozvoje výzkumné organizace 00023001(IKEM) - Institucionální podpora. Literatura Andersson A., Sjödin A., Olsson R., Vessby B. Am J Physiol 1998, 274, E432. Geerling JJ., Boon MR., van der Zon GC., et al. Diabetes 2014, 63, 880. Hawley SA.. Gadalla AE., Olsen GS., Hardie DG. Diabetes 2002, 51, 2420. Keates AC., Bailey CJ. Biochem Pharmacol 1993, 45, 971. Li Y., Xu S., Mihaylova MM., et al. Cell Metab 2011, 13, 376. Lenhard JM., Kliewer SA. Paulik MA., et al. Biochem Pharmacol 1997, 54, 801. Madiraju AK., Erion DM., Rahimi Y., et al. Nature 2014, 510, 542. Maric´ A. Diabetologia Croatica 2010, 39, 95. Owen MR., Doran E., Halestrap AP. Biochem J 2000, 348 Pt 3, 607. Rouru J., Isaksson K., Santti E., et al. Eur J Pharmacol 1993, 246, 67. Ruderman NB., Carling D., Prentki M., Cacicedo JM. J Clin Invest 2013, 123, 2764. Saito M. Endocr J 2014, 61, 409. Vessby B., Gustafsson IB., Tengblad S., et al. Ann N Y Acad Sci 2002, 967, 183. Witters LA. J Clin Invest 2001, 108, 1105. Zang M., Zuccollo A., Hou X., et al. J Biol Chem 2004, 279, 47898. Zicha J., Pechánová O., Cacányiová S., et al. Physiol Res 2006, 55 Suppl 1, S49.
- 59 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA VLIV OXIDACE MASTNÝCH KYSELIN V HNĚDÉ TUKOVÉ TKÁNI NA RIZIKOVÉ FAKTORY METABOLICKÉHO SYNDROMU J. Trnovská1., V. Škop1., L. Kazdová1., M. Pravenec2 1 2
Centrum experimentální medicíny, Institut klinické a experimentální medicíny, Fyziologický ústav AV ČR Praha
Abstract Metabolic syndrome is known as a cluster of risk factors for cardiovascular disease and type 2 diabetes mellitus. It has been demonstrated that brown adipose tissue (BAT) plays important role in triglyceride a glucose utilisation and thus prevent obesity, ectopic fat accumulation and associated metabolic disturbances. Recent studies confirm that brown adipose tissue (BAT) is retained in humans into adulthood. In this study we analysed palmitate oxidation in BAT, glucose oxidation in skeletal muscle, sensitivity of adipose and muscle tissues to insulin action dependent on age, physical activity and cold exposure. Additionally we measured glucose incorporation into BAT determined by PET/CT in hairless SHR-Dsg4 strain of rats compared to SHR rats. Our results demonstrated increased activity of BAT in young rats, after physical activity and during cold exposure which was associated with improved metabolism of carbohydrates and lipids and higher sensitivity of muscle and adipose tissue to insulin exposure. These results support the hypothesis that increased activity of BAT, which leads to the use of energy substrates, may affect metabolic processes associated with dyslipidemia, obesity and metabolic syndrome. Metabolický syndrom je multifaktoriální komplexní onemocnění. Současný výskyt hned několika rizikových faktorů silně zvyšuje pravděpodobnost rozvoje kardiovaskulárních chorob a diabetu 2. typu (Haffner et al., 1992). Dle Světové zdravotnické organizace (WHO) žije na světě 367 milionů lidí s diabetem. V roce 2004 zemřelo na následky diabetu 3,4 milionu lidí. Je známé, že jako prevence onemocnění diabetu 2. typu, je potřeba správně se stravovat, pravidelně provozovat fyzickou aktivitu a udržovat si optimální tělesnou hmotnost. Proto se stále hledají nové možnosti, jak zvýšit energetický výdej. V posledních letech se diskutuje o způsobu aktivace a využití hnědé tukové tkáně (HTT) jako jedné z možností zvýšení utilizace triacylglycerolů a glukózy. Hnědá tuková tkáň je velmi podstatná u novorozenců a hibernujících zvířat, u nichž pomáhá v udržení stálé tělesné teploty pomocí tzv. netřesové termgeneze. Předpokládalo se, že tato tkáň s přibývajícím věkem mizí a v dospělosti již nemá žádný význam. Ovšem s vývojem moderních pozorovacích technik, mezi které můžeme zařadit PET/CT (pozitronovou emisní tomografi/počítačovou tomografii) bylo náhodně zjištěno, že aktivní HTT se nachází i u dospělých jedinců (Cypess et al., 2009, Virtanen et al., 2009, van Marken Lichtenbelt et al., 2009). Dále bylo potvrzeno, že ženy mají více hnědé tukové tkáně než muži, přičemž množství hnědé tukové tkáně negativně koreluje s BMI a věkem (Cypess et al., 2009). U starších jedinců klesá schopnost netřesové termogeneze a snižuje se schopnost udržení homotermie. Hlavní funkcí hnědé tukové tkáně je tvorba tepla. Barva HTT je způsobena velkým množstvím mitochondrií v jednotlivých buňkách. Tyto mitochondrie mají velké množství krist a jsou velmi hojně inervovány pomocí sympatického nervového systému (Sell et al., 2004, Richard et Picard, 2011). Sympatická nervová zakončení uvolňují noradrenalin v blízkosti hnědých tukových buněk, kde aktivují G proteiny vázané na β-adrenergní receptory, tím se spustí kaskáda reakcí končící aktivací odpřahujícího proteinu 1 (UCP1). Tento protein je markerem adipocytů HTT a umožňuje tvorbu tepla po nervové stimulaci. - 60 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Nachází se na vnitřní membráně mitochondrií, kde UCP1 „odpřahuje“ oxidační pochody dýchacího řetězce od syntézy ATP (Sell et al., 2004, Richard et Picard, 2011). Pro tvorbu tepla a termogenezi se jako zdroj v HTT nejprve využívají uskladněné lipidy (Nedergaard et al., 2011). Tato časná fáze termogeneze molekulárně odpovídá noradrenalinu z vláken sympatiku, který aktivuje uvolnění volných mastných kyselin z triacylglycerolů. Mastné kyseliny se dostávají do mitochondrií, kde je z nich uvolněna energie v podobě tepla v závislosti na aktivitě UCP1 (Nedergaard et al., 2011). Ve studii Bartelt et al. (2011) popsali schopnost hnědého tuku vychytávat triacylglyceroly a glukózu z cirkulace. Při vystavení myší chladu se dramaticky snížila hladina triacyglycerolů v krvi, protože byly využity hnědou tukovou tkání. HTT také metabolizuje glukózu, která se do hnědé tukové tkáně dostává pomocí přenašečů GLUT1/4, jejichž zvýšená exprese a aktivita je podmíněna chladovou expozicí. Vzhledem k výše uvedeným skutečnostem je pravděpodobné, že zvýšená oxidace lipidů v této tukové tkáni by mohla příznivě ovlivnit rizikové faktory metabolického syndromu. V těle se nacházejí různé typy tukové tkáně, které můžeme rozlišit na bílou a hnědou tukovou tkáň. Hlavním rozdílem mezi bílou a hnědou tukovou tkání je to, že zatím co bílá tuková tkáň slouží k ukládání triacylglycerolů (TAG), hnědá tuková tkáň je naopak spotřebovává. Tyto dvě tkáně tak spolupracují na zpracování lipidů při metabolických procesech a termogenezi. U potkanů a myší se tuková tkáň nachází v několika podkožních a viscerálních depech. Některé části těchto dep jsou tvořeny převážně hnědou tukovou tkání, avšak většina je tvořena bílou tukovou tkání (Cinti, 2001). Hnědá tuková tělesa můžeme obvykle najít v oblasti mezi lopatkami, pod lopatkami, kolem ledvin, v podpaží a mezižeberní oblasti. U velkých savců se v dospělosti snižuje počet multilokulárních hnědých adipocytů a přibývá počet unilokulárních bílých adipocytů, které nemají schopnost tvořit teplo (Sell et al., 2004). Všechna tato depa se skládají jak z bílých tukových buněk, tak z hnědých tukových buněk. Jejich poměr v tkáni souvisí a mění se v závislosti na kmeni, věku, pohlaví a nutričních a okolních podmínkách (Cinti, 2001, Cinti, 2005, Cinti, 2006). Barva každého depa záleží na jeho histologickém složení. Tam, kde převládají hnědé tukové buňky, je hnědá tuková tkáň a naopak, v bílé tukové tkáni převládají bílé tukové buňky (Cinti, 2006). Hnědá tuková tkáň se během intrauterního vývoje vyvíjí z paraxiálního (segmentovaného) mezodermu z progenitorových buněk, které exprimují myogenní faktor 5 (Myf5+), stejně jako svalové buňky. Zatímco bílá tuková tkáň se vyvíjí z laterálního mezodermu a buňky jsou Myf5 negativní (Enerbäck et al., 2010). Pro určení, zda se z progenitorových buněk Myf5+ začnou vyvíjet buňky HTT je podstatný transkripční regulátor PRDM16. Pokud PRDM16 není aktivní, vyvíjí se z těchto buněk buňky svalové (Seale et al, 2008). V poslední době také přibývá poznatků o tzv. béžové (brite) tukové tkáni, někdy také označované rBAT (recruitable brown adipose tissue). Jedná se o buňky tukové tkáně, které jsou rozptýlené v bílé tukové tkáni. Mají stejný původ jako bílé adipocyty, ovšem svojí strukturou a funkcí se spíše podobají buňkám hnědé tukové tkáně. Markery rBAT jsou CD137 a TMEM26 (transmembrane protein 26). Vzhledem k tomu, že HTT se aktivuje několika způsoby, například chladovou expozicí, fyzickou aktivitou i různými výživovými doplňky, jsou ve výsledcích shrnuty poznatky o aktivitě HTT získané z více pokusů. Jako první jsou uvedeny výsledky z porovnání aktivity HTT a metabolizmu sacharidů a lipidů u mladých (věk 1 měsíc) a starých (věk 1 rok) HHTg potkanů (hereditárně hypertriglyceridemický kmen potkanů) (tabulka 1).
- 61 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Tabulka 1 Vliv věku na aktivitu HTT a metabolizmus sacharidů a lipidů HHTg mladé Sérové NEMK (mmol/l) 0,643 ± 0,07 Sérové TG (mmol/l) 3,183 ± 0,232 Oxidace glukózy v HTT (nmol/g) 823,6 ± 64,8 Oxidace palmitátu v HTT (nmol/g) 375,5 ± 102 Lipogeneze v epididymální tukové tkáni (nmol/l /2 hod) - bazální 674 ± 50 - inzulinem stimulovaná 1783 ± 184 Syntéza glykogenu ve svalové tkáni (nmol/l /2 hod) - bazální 1348,6 ± 219 - inzulinem stimulovaná 1488,2 ± 187 Oxidace glukózy ve svalu (nmol/l/2 hod) -bazální 409,4 ± 44,5 -inzulínem stimulovaná 417,7 ± 37,7
HHTg staré 0,697 ± 0,03 7,884 ± 1,205 276,9 ± 57,0 169,5 ± 29
p< N.S. 0,01 0,001 0,001
213 ± 19 221 ± 12
0,001 0,001
935 ±117 1014 ± 124
N.S. N.S.
119,8 ± 5,5 122,2 ± 9,0
0,001 0,001
Uvedené hodnoty udávají průměr ± SD; počet zvířat ve skupině = 10 Z výsledků je patrné, že aktivita hnědé tukové tkáně u mladých potkanů byla významně vyšší než u potkanů starých. A to jak při měření uvolňování CO2 při oxidaci radioaktivně značeného 14 -C-palmitátu, tak i radioaktivně značené 14C-U-glukózy. Také můžeme pozorovat, že u mladých zvířat byla svalová i tuková tkáň citlivější k účinkům inzulínu, což je sledováno podle inkorporace 14C-U-glukózy do svalového glykogenu a lipidů v tukové tkáni. Další možností, jak aktivovat HTT je fyzická aktivita. Předpokládá se, že irisin, uvolňovaný během cvičení svaly, aktivuje HTT. V tabulce 2 jsou uvedeny výsledky z měření aktivity HTT po fyzické aktivitě. Potkani měli možnost spontánní fyzické aktivity po dobu 1 měsíce. Byli použiti potkani ve věku 4 měsíců. Tabulka 2 Vliv fyzické aktivity na aktivitu HTT HHTg Hmotnost interskapulární HTT (g/100g t. hm.) Oxidace palmitátu v HTT (nmol/g/2h) Zastoupení bílkovin v HTT (%) Sérové koncentrace Irisinu (µg/l)
0,054 ± 0,084 58,2 ± 9 5,25 ± 0,27 3,003 ± 0,021
HHTg fyzická aktivita 0,062 ± 0,081 83,4 ± 11,1 7.12 ± 0.46 3,054 ± 0,85
p< N.S. 0,05 0,05 N.S.
Uvedené hodnoty udávají průměr ± SD; počet zvířat ve skupině = 6. Fyzická aktivita zvýšila u potkanů množství buněk v HTT, sledovaného podle zastoupení bílkovin. Zvýšila se také oxidace 14C-palmitátu, přičemž sérové koncentrace irisinu byly u obou pozorovaných skupin podobné. Hnědá tuková tkáň se také aktivuje po chladové expozici přes adrenergní receptory. Sledovali jsme tedy, zda u mutantních bezsrstých potkanů SHR Dsg4 -/-, dojde k aktivaci HTT. Vzhledem k tomu, že tito potkani nemají srst, dá se předpokládat, že i při normální teplotě v chovném zařízení budou vystaveni chladu oproti normálně osrstěným kontrolám SHR. - 62 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Metabolické parametry u samců tohoto kmene ve věku 3 měsíců a u kontrolních potkanů kmene SHR s normálním ochlupením jsou uvedeny v tabulce 3 Tabulka 3 Vliv mutantní alopecie u SHR potkanů na metabolické parametry SHR kontroly 372 ± 6
Tělesná hmotnost (g) Hmotnost viscerální tukové tkáně 1,42 ± 0,06 (g /100g t. hm.) Hmotnost interscap. HTT (g /100g t. hm.) 0,094 ± 0,006 Sérové NEMK (mmol/l) 0,637 ± 0,03 Sérové TG (mmol/l) 0,796 ± 0,06 Oxidace palmitátu v HTT (nmol/g) 17,2 ± 1,7 18 Spotřeba F-FDG v HTT (kBq/cc)*(ccm) 76 ± 7 Lipogeneze v epididymální tukové tkáni (nmol/l /2 hod) - bazální 519 ± 44 - inzulinem stimulovaná 856 ± 103 Syntéza glykogenu ve svalové tkáni (nmol/l /2 hod) - bazální 494 ± 54 - inzulinem stimulovaná 841 ± 95 Oxidace glukózy ve svalu (nmol/l/2 hod) -bazální 150 ± 10 -inzulínem stimulovaná 180 ± 20
SHR-Dsg4-/330 ± 11
P< 0,01
1,06 ± 0,06
0,005
0,099 ± 0,004 0,504 ± 0,03 0,765 ± 0,04 65,5 ± 5,1 418 ± 40
N.S. 0,05 N.S. 0,001 0,05
664 ± 48 1437 ±222
0,05 0,05
776 ±95 1405 ± 213
0,05 0,05
220 ± 17 306 ± 31
0,01 0,01
Hodnoty udávají průměr ± SD; počet zvířat ve skupině = 7 V porovnání s kontrolami měli mutantní bezsrstí potkani nižší tělesnou hmotnost a hmotnost viscerální tukové tkáně, zatímco hmotnost interskapulární hnědé tukové tkáně nebyla rozdílná. U mutantních potkanů byly sníženy sérové koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin pravděpodobně v důsledku jejich sníženého uvolňování z viscerální tukové tkáně a jejich zvýšeného transportu do HTT. Nejvýraznější změnou bylo trojnásobné zvýšení oxidace mastných kyselin v HTT bezsrstých potkanů měřené podle inkorporace 14C-palmitátu do CO2 měřené ex vivo stejně jako spotřeba radioaktivně značené 18-fluordeoxyglukózy v HTT měřené pomocí PET/CT in vivo. Vyšší utilizace lipidů pro tvorbu tepla v HTT spolu s nižšími sérovými hladinami NEMK pozitivně ovlivnily i senzitivitu svalové a viscerální tukové tkáně k účinku inzulinu sledovanou podle inkorporace 14C-U-glukózy do svalového glykogenu a lipidů v tukové tkáni. Výsledky prokázaly, že u mladých jedinců je HTT mnohonásobně aktivnější v porovnání se staršími jedinci. Tento trend můžeme pozorovat i u lidí, kdy množství HTT a její aktivita negativně koreluje s věkem a BMI (Cypess et al., 2009). Zároveň bylo potvrzeno, že u mladých jedinců byla metabolicky aktivnější a k inzulínu senzitivnější, jak tuková, tak i svalová tkáň. Dále se potvrdilo, že aktivita HTT se zvyšuje při fyzické aktivitě. Hodnoty sérového irisinu ovšem zůstaly u aktivních potkanů nezměněny. Prvním, kdo prokázal spojitost myokinu irisinu s hnědnutím tukové tkáně po fyzické aktivitě byl Boström et al. (2012). Ovšem tyto výsledky se v několika dalších studiích uskutečněných na lidech nepotvrdily (Aydin et al, 2013; Hecksteden et al., 2013, Pekkala et al., 2013). Hladiny irisinu zůstávaly i po fyzické aktivitě nezměněné. Proto zůstává otázkou, zda je tento mechanizmus funkční. - 63 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Po chladové expozici, v souvislosti se ztrátou ochlupení, byla HTT až trojnásobně aktivnější a byla rovněž spojena se zlepšením senzitivity tukové a svalové tkáně k učínkům inzulínu a pozitivně ovlivnila metabolizmus lipidů a sacharidů. Tento fakt byl také potvrzen u lidí (Chen et al., 2013; van der Lans et al., 2013). Vyšší aktivita HTT, která byla prokázána u mladých potkanů, po fyzické aktivitě i při chladové expozici příznivě ovlivnila metabolizmus sacharidů i lipidů a senzitivitu svalové i tukové tkáně k účinkům inzulínu. Tyto výsledky podporují hypotézu, že zvýšená aktivita HTT, která vede k využití energetických substrátů, může příznivě ovlivnit řadu metabolických pochodů spojených s dyslipidémií, obezitou a metabolickým syndromem. Literatura Aydin S., Aydin S., Kuloglu T., et al. 2013. Alterations of irisin concentrations in saliva and serum of obese and normal-weight subjects, before and after 45 min of a Turkish bath or running. Peptide 50: p.13–18. Bartelt A., Bruns OT., Reimer R., et al. 2011. Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance. Nature Medicine. 17(2): p. 200-205. Boström P., Wu J., Jedrychowski MP., et al. 2012. A PGC1-α-dependent myokine that drives brownfat-like development of white fat and thermogenesis. Nature 481: p.463–468. Cinti S. 2001. The adipose organ: Morphological perspectives of adipose tissues. Proceedings of the Nutrition Society. 60: p. 319-328. Cinti S. 2005. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73: p. 9–15. Cinti S. 2006. The role of brown adipose tissue in human obesity. Nutrition, Metabolism and Cardiovascular Diseases. 16: p. 569-574. Cypess AM., Lehman S., Williams G., et al. 2009. Identification and Importance of Brown Adipose Tissue in Adult Humans. The new england journal of medicine. 360(15): p. 1509-1517. Enerbäck S. 2010. Brown adipose tissue in humans. International Journal of Obesity. 34(1): p. 43-46. Haffner SM., Valdez RA., Hazuka HP., et al. 1992. Prospective analysis of the insulin-resistance syndrome (syndrome X). Diabetes 41(6): p. 715-722. Hecksteden A., Wegmann M., Steffen A., et al. 2013. Irisin and exercise training in humans – results from a randomized controlled training trial. BMC Medicine 11: 235. Chen KY., Brychta RJ., Linderman JD., et al. 2013. Brown Fat Activation Mediates Cold-Induced Thermogenesis in Adult Humans in Response to a Mild Decrease in Ambient Temperature. Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 98(7): p. 1218-1223. Nedergaard J., Bengtsson T., Cannon B. 2011. New powers of brown fat: Fighting the metabolic syndrome. Cell Metabolism.13(2): p. 238-240. Pekkala S., Wiklund PK., Hulmi JJ., et al. 2013. Are skeletal muscle FNDC5 gene expression and irisin release regulated by exercise and related to health? Journal of Physiology 591: p.53935400. Richard D., Picard F. 2011. Brown fat biology and thermogenesis. Frontiers in Bioscience 1(16): p. 1233-1260. Seale P., Bjork B., Yang WL., et al. 2008. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454(7207): p. 961-967. Sell H., Deshaies Y., Richard D. 2004. The brown adipocyte: update on its metabolic role. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 36: p. 2098-2104. van der Lans AJJ., Hoeks J., Brans B., et al. 2013. Cold acclimation recruits human brown fat and increases nonshivering thermogenesis. Journal of Clinical Investigation 123(8): p. 3395-3403. van Marken Lichtenbelt WD., Vanhommerig JW., Smulders NM., et al. 2009. Cold-Activated Brown Adipose Tissue in Healthy Men. The New England Journal of Medicine 360: p.1500-1508. Virtanen KA., Lidell ME., Orava J., et al. 2009. Functional Brown Adipose Tissue in Healthy Adults. The New England Journal of Medicine. 360: p. 1518-1525.
- 64 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA PARAOXONÁZA U PACIENTŮ S KARCINOMEM PRSU A PANKREATU PARAOXONASE IN PATIENTS WITH BREAST AND PANCREATIC CANCER L. Vávrová, J. Rychlíková, M. Kocík, T. Krechler, A. Žák IV. interní klinika, 1. lékařská fakulta Univerzity Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze; U Nemocnice 2; Praha 2; 128 01 Úvod V rámci této studie jsme sledovali aktivitu paraoxonázy1 (PON1) a koncentrace sérového amyloidu A (SAA) a jejich roli v patogenezi karcinomu prsu (BC) a pankreatu (PC). Paraoxonáza1 je kalcium dependentní esteráza vázaná na HDL prostřednictvím apoA1, je schopná hydrolyzovat organofosfáty, insekticidy a nervové jedy (Davies et al., 1996; Aviram et al., 1998a). Dále také vykazuje laktonázovou aktivitu (Billecke et al., 2000; Rajkovic et al., 2011). Významnou úlohou PON1 v organismu je ochrana LDL před lipoperoxidací a hydrolýza oxidovaných fosfolipidů (Mackness et al., 1993; Watson et al., 1995). V současnosti byly publikovány dvě práce zabývající se aktivitou PON1 u pacientů s PC a v obou případech byla u tohoto onemocnění pozorována snížená aktivita PON1 (Kodydková et al., 2013; Akçay et al., 2003). Taktéž u pacientů s BC byly pozorovány snížené aktivity PON1 (Samra et al., 2011). Cílem této studie bylo stanovení aktivit PON1 u pacientů s karcinomem prsu a pankreatu ve srovnání se zdravými kontrolami a dále pak prozkoumání vzájemného vztahu mezi aktivitou PON1 a koncentracemi SAA. Metodika Do studie bylo zařazeno 82 žen s karcinomem prsu (BC), 82 pacientů (M/Ž - 43/39) s karcinomem pankreatu (PC) a na základě věku spárovaná kontrolní skupina (KON; M/Ž 43/39). Mezi vylučovací kritéria patřila: současné podávání antioxidantů (vitamin C, vitamin E, alopurinol, N-acetylcystein, suplementace s preparáty obsahující stopové prvky, vícenenasycené mastné kyseliny řady n-3), nefropatie, klinicky manifestní proteinurie, jaterní cirhóza, dekompenzovaný DM, srdeční nedostatečnost (NYHAIII/IV), současné další malignity; hormonální antikoncepce, chronická imunosupresivní, protizánětlivá léčba a chemoterapie, endokrinopatie, akutní a chronická pankreatitida. Všichni sledovaní podepsali informovaný souhlas se zařazením do studie. Odběry krve byly prováděny po celonočním lačnění. Hladiny sledovaných parametrů (aktivita PON1, koncentrace SAA, koncentrace konjugovaných dienů v precipitovaných LDL CD/LDL) byly stanovovány v séru. Vzorky byly před analýzou skladovány při - 80ºC. Rutinní laboratorní analýzy byly měřeny taktéž v séru pomocí komerčních setů na automatických analyzátorech v laboratořích Ústavu lékařské biochemie a laboratorní diagnostiky VFN. Arylesterázová aktivita paraoxonázy 1 byla stanovována s použitím fenylacetátu jako substrátu na základě modifikované metody popsané dříve ve studii Kodydková et al., 2013. Ke stanovení koncentrace SAA byl použit ELISA kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Všechny výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± směrodatná odchylka (SD) u parametrických a jako medián (25 % - 75 %) percentil u neparametrických proměnných. Ke statistické analýze parametrických veličin byla použita one-way ANOVA s Newman-Keuls post testy, u neparametrických veličin byla použita Kruskal-Wallis ANOVA. Data byla zpracována v programu Statistica verze 12.0 (Statsoft, 2013 CZ). Za statisticky významné byly výsledky považovány při p < 0,05.
- 65 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Výsledky Základní klinické a biochemické charakteristiky zkoumaných skupin podává tabulka 1. V naší studii byly pozorovány signifikantně zvýšené koncentrace CRP a SAA (obrázek 1b) a naopak signifikantně snížené aktivity PON1 (obrázek 1a) a koncentrace albuminu a HDL-C u pacientů s karcinomem pankreatu v porovnání s pacienty s karcinomem prsu a kontrolní skupinou. U obou skupin pacientů byla pozorována zvýšená hladina CD/LDL a bilirubinu.
Obrázek 1 Paraoxonáza a SAA u pacientů s karcinomem prsu a pankreatu PC: pacienti s karcinomem pankreatu, BC: pacienti s karcinomem prsu, KON: kontrolní skupina; PON1: arylesterázová aktivita paraoxonázy 1, SAA: sérový amyloid A; * PC nebo BC vs. KON, *** p < 0,001; b PC vs. BC, bbb p < 0,001. Závěr V naší studii byla pozorována snížená arylesterázová aktivita PON1 u obou skupin pacientů. Tyto změny byly výraznější u pacientů s karcinomem pankreatu, který je spojen se systémovým zánětem, jak prokazují zvýšené hladiny koncentrací CRP a SAA, ale též pokles albuminu. Mezi hladinami SAA a PON1 byla u těchto pacientů pozorována signifikantní negativní korelace. Poděkování Studie byla podpořena výzkumným projektem Ministerstva zdravotnictví RVOVFN64165/2012 a výzkumným projektem 1. lékařské fakulty Karlovy Univerzity v Praze PRVOUK-P25/LF1/2 Literatura Akçay MN, Polat MF, Yilmaz I, Akçay G.: Serum paraoxonase levels in pancreatic cancer. Hepatogastroenterology 2003; 50 Suppl 2: ccxxv-ccxxvii. Aviram M, Billecke S, Sorenson R, Bisgaier C, Newton R, Rosenblat M, Erogul J, Hsu C, Dunlop C, La Du B.: Paraoxonase active site required for protection against LDL oxidation involves its free sulfhydryl group and is different from that required for its arylesterase/paraoxonase activities: selective action of human paraoxonase allozymes Q and R. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1998a; 18(10): 1617-1624. Billecke S, Draganov D, Counsell R, Stetson P, Watson C, Hsu C, La Du BN.: Human serum paraoxonase (PON1) isozymes Q and R hydrolyze lactones and cyclic carbonate esters. Drug Metab Dispos 2000; 28, 1335–1342. Davies, H. G., Richter, R. J., Keifer, M., Broomfield, C. A., Sowalla, J. and Furlong, C. E.: The effect of the human serum paraoxonase polymorphism is reversed with diazoxon, soman and sarin. Nat Genet 1996; 14: 334–336.
- 66 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Kodydková J, Vávrová L, Staňková B, Macášek J, Krechler T, Žák A.: Changes in antioxidants and oxidative stress markers in pancreatic diseases. Pancreas. 2013; 42(4):614-621. Mackness MI, Arrol S, Abbot C, Durrington PN.: Protection of low-density lipoprotein against oxidative modification by high-density lipoprotein associated paraoxonase. Atherosclerosis 1993; 104: 129–135. Rajkovic MG, Rumora L, Barisic K.: The paraoxonase 1, 2 and 3 in humans. Biochem Med (Zagreb) 2011; 21(2): 122-30. Samra ZQ, Pervaiz S, Shaheen S, Dar N, Athar MA.: Determination of oxygen derived free radicals producer (xanthine oxidase) and scavenger (paraoxonase1) enzymes and lipid parameters in different cancer patients. Clin Lab 2011; 57(9-10): 741-747. Watson AD, Berliner JA, Hama SY, La Du BN, Faull KF, Fogelman AM, Navab M.: Protective effect of high density lipoprotein associated paraoxonase. Inhibition of the biological activity of minimally oxidised low density lipoprotein. J Clin Invest 1995; 96, 2882–2891.
Tabulka 1 Charakteristika sledovaných skupin PC
BC
KON
N (M/Ž)
82 (43/39)
82 (0/82)
82 (43/39)
Věk (roky)
62,4 ± 8.8
60,8 ± 8,3
60,4 ± 10,2
Stage 2 (N, (%))
11 (13,4%)
56 (68,3%)
-
Stage 3 (N, (%))
38 (46,3%)
8 (9,7%)
-
Stage 4 (N, (%))
33 (40,3%)
18 (22,0)
-
DM (N, (%))
30 (36,6%)
9 (11,0%)
0 (0%)
BMI (kg/m2)
25,1 ± 4,8bbb
30,4 ± 6,5***
25,6 ± 3,6
CRP (mg/l)
16,0 (6,6 – 54,8)***,bbb
4,1 (1,6 – 8,9)
3,2 (1.4 – 5,4)
TC (mmol/l)
5,6 ± 2,4
5,5 ± 0,8
5,3 ± 0,9
TG (mmol/l)
1,69 (1,30 – 2,12)***,bb
1,30 (0,96 – 1,73)***
0,97 (0,73 – 1,32)
HDL-C (mmol/l)
0,95 ± 0,40***,bbb
1,55 ± 0,32*
1,64 ± 0,38
LDL-C (mmol/l)
3,1 (2,5 – 4,1)
3,3 (2,7 – 3,8)
3,2 (2,7 – 3,7)
40,1 ± 6,3***,bbb
44,5 ± 2,9**
46,6 ± 3,3
19,3 (10,8 – 76,2)***
69,2 (14,8 – 75,9)***
10,4 (8,1 – 16,0)
0,01735 ± 0,0067*
0,01836 ± 0,0052**
0,01546 ± 0,0038
Albumin (g/l) Bilirubin (µmol/l) CD/LDL (ratio)
PC: pacienti s karcinomem pankreatu, BC: pacienti s karcinomem prsu, KON: kontrolní skupina; DM: diabetes mellitus, BMI: body mass index, TC: celkový cholesterol, TG: triglyceridy, HDL-C: high density lipoprotein, LDL-C: low density lipoprotein, CRP: Creaktivní protein, CD/LDL – konjugované dieny v precipitovaných LDL; Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (S.D.) u parametrických a medián (IQR) u neparametrických proměných; * PC nebo BC vs. KON, * p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; b PC vs. BC, b p < 0,05; bb p < 0,01; bbb p < 0.001.
- 67 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA ROLE OF EPICARDIAL FAT TISSUE IN THE DEVELOPMENT OF PROLIFERATIVE VASCULAR DISEASES J. Ždychová, S. Čejková, I. Králová Lesná, A. Králová, J. Malušková, L. Janoušek, L. Kazdová Institute for Clinical and Experimental Medicine, Prague SUMMARY The abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) is thought to play a role in the pathogenesis of atherosclerosis. Adipocytes produce several bioactive paracrine substances that can affect the growth and migration of VSMCs. Our study focuses on the direct effect of the bioactive substances in conditioned media (CM) that was obtained by incubation with primary adipocyte-derived cell lines, including cell lines derived from both preadipocytes and from more mature cells, on the proliferation rate of human aortic smooth muscle cells (HAoSMCs). We used a Luminex assay to measure the adipokine content of the CM and showed that there was a higher concentration of monocyte chemoattractant protein-1 in renal preadipocyte-CM compared with the HAoSMC control (p < 0.5). The addition of both renal preadipocyte- and epicardial adipocyte- CM resulted in the elevated production of vascular endothelial growth factor compared with the control HASoSMC CM (p < 0.001). The adiponectin content in renal adipocyte-CM was increased compared to all the remaining adipocyte-CM (p < 0.01). Moreover, the results showed a higher proliferation rate of HAoSMCs after co-culture with epicardial adipocyte-CM compared to the HAoSMC control (p < 0.05). These results suggest that bioactive substances produced by adipocytes have a stimulatory effect on the proliferation of VSMCs. Currently, adipose tissue is perceived not only as a reservoir of energy but also as an important endocrine and immunologically active tissue that produces various bioactive substances. Virtually all blood vessels are surrounded by various amounts of a special type of adipose tissue. For a long time, perivascular adipose tissue (PVAT) was considered to be a rather passive structural support for vessels, but nowadays the vasocrine function of PVAT is extensively studied (Gao 2007). Perivascular adipocytes are similar to adipocytes of visceral adipose tissue, which is a well-known producer of various bioactive substances with apocrine, paracrine and endocrine effects. They appear to be powerful endocrine cells capable of responding to metabolite cues (Chartterjee et al. 2009) and are capable of signal transduction to adjacent blood vessels through a paracrine or vasocrine signaling pathway (Gustafson 2010). This “outside–to–inside signaling paradigm” suggests that biologically active mediators produced by PVAT may have a pathologic role in the development of atherosclerosis (Mazurek et al. 2003, Yudkin et al. 2005). Epicardial adipose tissue (EAT) is a type of perivascular fat, located in the chest near the adventitia of the coronary arteries. Clinical findings, together with ex vivo and in vitro studies, suggest that EAT plays an important role in the process of the pathogenesis of atherosclerosis (Mazurek et al. 2003, Zhou et al. 2011, Chartterjee et al. 2009). The abnormal proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is thought to play an important role in the pathogenesis of atherosclerosis via the mechanism of neo-intimal formation. The migration of VSMCs from the media to the intima, together with phenotypic modulation, is defined as a switch from a common contractile phenotype to a synthetic phenotype (where cells, although less contractible, upregulate the machinery required for proliferation, migration, and production of the extracellular matrix) (Owens et al. 2004). Several studies indicate that growth factor/cytokine-signaling can dramatically affect the - 68 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA phenotypic status of VSMCs. For example, interleukin 6 (IL-6), interleukin 8 (IL-8), interleukin-1 alpha (IL-1 alpha), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), vascular endothelial growth factor (VEGF) and platelet-derived growth factor (PDGF) can promote DNA synthesis in VSMCs and cause cell proliferation (Yue et al. 1994, Ikeda et al. 1991, Schultz et al. 2007, Schlich et al. 2013, Miao and Li 2012). Adipocytes produce several paracrine bioactive substances that can affect the growth and migration of VSMCs and which can eventually contribute to the development of proliferative vascular disease (Szasz et al. 2013). However, the network of mechanisms and factors responsible for aberrant VSMC proliferation is far from understood. Our study was designed to compare the effect of bioactive substances produced by epicardial and visceral preadipocyte and adipocyte primary cell lines on the proliferation rate of human aortic smooth muscle cells (HAoSMCs). Materials and Methods Cell culture Renal adipose tissue was selected to represent visceral fat. Samples of visceral and subcutaneous adipose tissues were collected exclusively from healthy volunteers during kinship organ transplantations. The EAT samples were obtained from the explanted hearts of patients who received a transplant because of cardiomyopathy. All fat samples used in our study were obtained from middle aged overweight men. To minimize the influence of preexisting pathologies, all patients experienced no clinical signs of atherosclerosis and had no evidence of diabetes according to routine laboratory tests. The preparation of the adipose tissue cultures was performed as previously described (Fried and Moustaid-Moussa 2001). Briefly, fat samples were digested by collagenase, washed and centrifugated to obtain the stromal vascular fraction (SVF). The SVF that contained the preadipocytes was cultivated in a selective preadipocyte growth medium to obtain the primary preadipocytes cell line that was later differentiated under 21 days lasting protocol in order to obtain mature adipocytes. The conditioned medium was prepared as follows: subconfluent preadipocytes or adipocytes were washed and kept in a preadipocyte growth medium or adipocyte nutrition medium for 24 h. The conditioned medium was collected, frozen and kept at -80°C until further use. All experiments were performed on cells at passage 6 or less, and each condition was assayed in triplicate in two independent experiments. Luminex assay The Luminex assay, using a procedure that is very similar to an ELISA. There are, however, several substantial differences between bead array assays and ELISAs. The Luminex assay is a multiplex bead-based immunoassay, which allows for the simultaneous measurement of multiple analytes (e.g., adipokines) using a library of antibody-coupled color-coded beads. Based on the foundations set forth in previous studies, we focused on the following adipokines: IL-6, IL-8, MCP-1, VEGF and adiponectin. Cell proliferation assay The proliferation level of primary cell cultures of HAoSMCs during co-cultivation with conditioned media obtained by protocol mentioned above was measured by the Real-Time cell analyzer xCELLigence System. All experiments were performed on cells at passage 6 or less, and each condition was assayed in triplicate in two independent experiments. Statistical analysis The statistical analysis was performed using Student’s t-test or ANOVA (post hoc test: Bonferroni´s multiple comparison test). Differences were considered statistically significant at the level of p < 0.05.
- 69 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Results Our results showed that there was a higher concentration of monocyte chemoattractant protein-1 in renal preadipocyte-CM compared with the HAoSMC control (p < 0.5). The addition of both renal preadipocyte- and epicardial adipocyte- CM resulted in the elevated production of vascular endothelial growth factor compared with the control HASoSMC CM (p < 0.001). The adiponectin content in renal adipocyte-CM was increased compared to all the remaining adipocyte-CM (p < 0.01). Moreover, the results showed a higher proliferation rate of HAoSMCs after co-culture with epicardial adipocyte-CM compared to the HAoSMC control (p < 0.05).
Fig. 1 Relative content of adipokine production (IL-6, IL-8, MCP-1, VEGF and adiponectin) in conditioned media
Conditioned media were obtained during a 24-hour incubation with control primary cell line derived from HAoSMCs and with both undifferentiated and mature adipocyte cell lines. The adipokine content in the conditioned medium of the HAoSMCs was considered a reference standard (100 % or 1.0). Fig. 1A shows relative content of IL-6, IL-8, MCP-1, and VEGF in conditioned media. Fig. 1B show relative content of adiponectin in conditioned media. All experiments were performed in triplicate for each condition, and the results are presented as the mean ± SD for two independent experiments. Fig 1A AND 1B are associated with the p value data displayed in Tab. 1. Values were considered to be significantly different at p < 0.05.
- 70 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Tab. 1 The level of significance of the adipokine content (IL-6, IL-8, MCP-1, VEGF and adiponectin) associated Fig 1A and Fig. 1B.
IL-6 IL-8 MCP-1 VEGF Adiponectin IL-6 IL-8 MCP-1 VEGF Adiponectin IL-6 IL-8 MCP-1 VEGF Adiponectin IL-6 IL-8 MCP-1 VEGF
vs HAoSMC CM vs HAoSMC CM vs HAoSMC CM vs HAoSMC CM vs HAoSMC CM vs Epicardial adipocyte CM vs Epicardial adipocyte CM vs Epicardial adipocyte CM vs Epicardial adipocyte CM vs Epicardial adipocyte CM vs Renal adipocyte CM vs Renal adipocyte CM vs Renal adipocyte CM vs Renal adipocyte CM vs Renal adipocyte CM vs Subcutaneous adipocyte CM vs Subcutaneous adipocyte CM vs Subcutaneous adipocyte CM vs Subcutaneous adipocyte CM
Epicardial preadipocyte CM *** ↓ n.s. *** ↓ *** ↓ ** ↑ *** ↓
Renal preadipocyte CM *** ↓ *** ↓ * ↑ *** ↑ n.s. *** ↓
Subcutaneous preadipocyte CM *** ↓ n.s. *** ↓ *** ↓ n.a. *** ↓
Epicardial adipocyte CM *** ↓ ** ↓ ** ↓ *** ↑ n.s. p=1
Renal adipocyte CM *** ↓ *** ↓ *** ↓ n.s. *** ↑ *** ↓
Subcutaneous adipocyte CM
n.s.
n.s.
n.s.
p=1
*↓
n.s.
n.s.
*** ↑
n.s.
p=1
*↓
** ↓
*** ↓
n.s.
*** ↓
p=1
*** ↓
*** ↓
n.s.
n.s.
n.a.
p=1
** ↑
n.a.
n.s.
n.s.
n.s.
*** ↑
p=1
n.s.
n.s.
*** ↑
n.s.
*↑
p=1
*** ↑
*** ↑
*** ↑
n.s.
*↑
p=1
*** ↓
** ↓
*** ↑
n.s.
*** ↑
p=1
n.s.
*** ↓
*** ↓
n.a.
** ↓
p=1
n.a.
n.s.
*** ↑
n.s.
*** ↑
n.s.
p=1
n.s.
*** ↑
n.s.
n.s.
*** ↓
p=1
*** ↑
*** ↑
n.s.
** ↑
*** ↑
p=1
*** ↓
*** ↑
n.s.
*** ↑
n.s.
p=1
*** ↓ *** ↓ *** ↓ *** ↓ n.a. *** ↓
Values were considered to be significantly different at p < 0.0, *** p < 0.001, ** p < 0.01, * p < 0.05, n.s. – not significant, n.a. – not analyzed Discussion Perivascular fat is an important endocrine and paracrine organ that produces various adipokines and many other substances (Mazurek et al. 2003, Yudkin et al. 2005, Miao and Li 2012). Due to the absence of an anatomic barrier, the active substances secreted by adipocytes readily gain access to the blood vessel wall (Barandier et al. 2005). The local secretion of adipokines by perivascular adipose tissue via this mechanism may provide a direct link between obesity and vascular complications (Iacobellis et al. 2008). The bioactive substances secreted by adipocytes could lead to smooth muscle cell dysfunction and perhaps contribute to the development of proliferative vascular disease. Our previous results showed that under basal conditions, i.e., in the absence of signs of atherosclerosis, not only are the adipose tissue-infiltrating cells important, but the adipocytes themselves are an important source of proinflammatory mediators; indeed, their phenotype is affected by the degree of adipocyte differentiation (Zdychova et al. 2012). Our results suggest that epicardial adipocytes - 71 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA substantially differ from visceral (renal) adipocytes and that the former exhibit a proinflammatory phenotype even under basal conditions. Moreover, we reported an increased proliferation rate of HAoSMCs during co-culture with epicardial adipocyte-conditioned medium. It was previously shown (Lamers et al. 2011) that the conditioned medium from human adipocytes that were differentiated in vitro induces the proliferation of VSMCs in the human coronary artery. The same study also postulated that the proliferation-stimulating effect of conditioned media negatively correlated with the levels of adiponectin. Further studies by the same group found a strong correlation among conditioned medium VEGF content and the VSMC proliferation rate (Schlich et al. 2013). Although our results partially agreed with Schlich’s findings, we were unable to confirm the prominent role of VEGF as the mediator of adipocyte paracrine action. We may speculate about several possible explanations for this phenomenon. First, we used conditioned media obtained from primary adipocyte cell lines that were derived exclusively from donors with no signs of diabetes and atherosclerosis. It should be noted from Schlich´s study that more complex conditioned media obtained by incubation with adipose tissue biopsies obtained also from patients with diabetes were used. Second, the discrepancy between the results of the HAoSMC proliferation rate could be, at least in part, related to the adiponectin produced by renal adipocytes. The study by Lamers et al. (2011) showed that adiponectin content negatively correlates with the proliferation of VSMCs. The third possibility is that because the secretory profile of human adipocytes is complex, it is probable that the interactions of many adipokines affect the final result. A limitation of the present study is that EAT samples and samples of subcutaneous and visceral fat tissue cannot be sampled simultaneously during a surgical procedure in the same donor. We attempted to overcome this obstacle by matching donors. Moreover, we obtained fat samples exclusively from donors with no clinical signs of atherosclerosis. In conclusion we found no effects on the proliferation rate of HAoSMCs of conditioned medium produced by visceral preadipocyte and adipocyte cell lines. On the other hand, bioactive substances produced by epicardial adipocytes demonstrated a potential stimulatory effect on the HAoSMC proliferation rate under basal conditions, i.e., in the absence of clinical signs of atherosclerosis, which could locally contribute to the development of proliferative vascular disease. This study was supported by grant no. NT 13188-4 from IGA MHCR. References BARANDIER C, MONTANI J-P, YANG Z: Am J Physiol Heart Circ Physiol 289: 1807-1813, 2005. FRIED SK, MOUSTAID-MOUSSA N: Methods Mol Biol 155: 197-212, 2001. GAO Y-J: Curr Pharm Des 13: 2185-2192, 2007. GUSTAFSON B: J Atheroscler Thromb 17: 332-341, 2010. CHATTERJEE TK, STOLL LL, DENNING GM, et al. : Circ Res 104: 541-549, 2009. IACOBELLIS G, GAO Y-J, SHARMA AM: Curr Diab Rep 8: 20-24, 2008. IKEDA U, IKEDA M, OOHARA T, et al. : Am J Physiol 260: 1713-1717, 1991. LAMERS D, SCHLICH R, GREULICH S, et al.: J Cell Mol Med 15: 1177-1188, 2011. MAZUREK T, ZHANG L, ZALEWSKI A, et al. : Circulation 108: 2460-2466, 2003. MIAO C-Y, LI Z-Y: growth. Br J Pharmacol 165: 643-658, 2012. OWENS GK, KUMAR MS, WAMHOFF BR: Physiol Rev 84: 767-801, 2004. SCHLICH R, WILLEMS M, GREULICH S, et al.: Mediators Inflamm 2013: Article ID982458,2013. SCHULTZ K, MURTHY V, TATRO JB, et al.: Am J Physiol Heart Circ Physiol 292: H2927- H2934, 2007. SZASZ T, BOMFIM GF, WEBB RC: Vasc Health Risk Manag 9: 105-116, 2013. YUDKIN JS, ERINGA E, STEHOUWER CDA: Lancet 365: 1817-1820, 2005. YUE TL, WANG X, SUNG CP, et al.: Cardiovasc Res 75: 1-7, 1994. ZDYCHOVA J, KRALOVA LESNA I, et al.: Neuro Endocrinol Lett 33 Suppl 2: 93-97, 2012. ZHOU Y, WEI Y, WANG L, et al.: Cardiovasc Diabetol 10: 2, 2011.
- 72 -
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA METABOLICKÉ ÚČINKY TOKOTRIENOLŮ METABOLIC EFFECTS OF TOCOTRIENOLS L. Kazdová, H. Malínská, M. Cahová, J. Urbanová, J. Trnovská, H. Seidlová, V. Škop Centrum experimentální medicíny, Institut klinické a experimentální medicíny, Praha Abstract Tocotrienols and tocopherols are members of the vitamin E family. They are further subdivided into alpha, beta, gamma, and delta isomers. All the vitamin E isomers have antioxidant properties. But chemical structure is different, whereas tocopherols have a saturated phytyl tail, tocotrienols possess an unsaturated isoprenoid side chain. Growing evidence indicates that tocotrienols have potentially greater physiologic effects than tocopherols (Kannappan et al., 2012) Evidence suggests that tocotrienols have anticancer, neuroprotective, antiplatelet, and cholesterol-lowering activities. Tocotrienols, similar to statins, suppress the activity of HMG CoA reductase, although through different mechanisms. Statins inhibit the enzyme activity through competitive inhibition, while tocotrienols modulate the intracellular mechanism of controlled degradation of the reductase protein (Parker et al., 1993). Therefore, administration of statins and α-tocotrienol together may have synergistic or additive effects. Tocotrienols have been reported to improve lipid profiles, reduce atherosclerotic lesions, decrease blood glucose and glycated haemoglobin concentrations, normalise blood pressure in vivo and inhibit adipogenesis in vitro. Rats fed a high carbohydrate, high fat diet for 16 weeks developed abdominal obesity, hypertension, impaired glucose and insulin tolerance with increased ventricular stiffness, lower systolic function and reduced liver function. Tocotrienol treatment improved ventricular function, attenuated cardiac stiffness and hypertension, and improved glucose and insulin tolerance, with reduced left ventricular collagen deposition and inflammatory cell infiltration. These results suggest that tocotrienols protect the heart and liver, and improve plasma glucose and lipid profiles (Wong et al., 2012). Úvod Vitamin E (VE) je důležitou součástí antioxidačního systému, který chrání buněčné membrány před škodlivými účinky volných radikálů. Membránové lipidy, na rozdíl od zásobních lipidů, obsahují více nenasycených mastných kyselin s více dvojnými vazbami v molekule, které jsou náchylnější k toxickému poškození. Pro snížení tohoto rizika mají fosfolipidy mitochondrií a plasmatických membrán začnou afinitu k vitaminu E, který se v nich kumuluje. VE je generickým názvem pro čtyři tokoferoly (T) a čtyři tokotrienoly (T3), které se liší rozdílnou chemickou strukturou postranního řetězce. Zatímco tokoferoly mají tento řetězec saturovaný, T3 mají v postranním řetězci tři dvojné vazby. To ovlivňuje řadu jejich fyziologických vlastností jako je m.j. vyšší penetrace do tkání, zejména do těch, které mají více saturovaných mastných kyselin v membránách, jako je tomu v mozku a v játrech (Suzuki 1993). T a T3 se dále rozlišují podle umístění metylové skupiny v chromanovém jádře, které ovlivňuje lipofilní vlastnosti molekuly a transport lymfatickým systémem do biologických membrán (Fairus et al., 2006) na izoformy α, β, γ, δ. Všechny T a T3 jsou výraznými antioxidanty, tím že přerušují oxidační řetězové reakce volných radikálů a tím chrání lipidy buněčných membrán a lipoproteiny o nízké hustotě (LDL) před oxidací volnými radikály. Od roku 1965, kdy byly zjištěny antioxidační vlastnosti VE byly předmětem zájmu zejména účinky αT, který je převažující formou VE v cirkulaci a ve tkáních a jehož deficience vede
S1
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA k závažným poruchám jako je anemie u novorozenců, jaterní nekrosa nebo neurologické poruchy-ataxie. Přibývající poznatky o úloze oxidačního stresu v patogenezi řady civilizačních onemocnění stimulovaly mnoho studií zaměřených na možnou prevenci a léčbu těchto onemocnění podáváním αT. Zatímco v některých studiích vysoký příjem αT koreloval se snížením rizika kardiovaskulárních chorob (Rimm et al., 1993), většina klinických studií, v nichž byl αT často podáván i ve vysokých dávkách (200 – 1200mg/den) však neprokázala jeho protektivní roli na rozvoj kardiovaskulárních nemocí, komplikací diabetu nebo rakoviny (Vivekananthan et al., 2003). Recentní experimentální studie ukázaly, že jiné formy VE, T3, mají kromě antioxidačních vlastností i další fyziologické funkce, které mohou významně ovlivňovat metabolické procesy. Ukázalo se, že v porovnání s T, T3 účinněji zabraňují peroxidaci lipidů a snižují oxidační poškození mozkových a jaterních mitochondrií, pravděpodobně v důsledku jejich vyšší mobility a výhodnější distribuci mezi tukovými vrstvami v membránách a jejich větší afinitě k vychytávání volných radikálů (Packer et al., 2001; Serbinova et al., 1991). Zásadním poznatkem, který vysvětluje rozdíly mezi účinky T a T3 je recentní nález, který ukazuje, že T3 mohou být aktivátory transkripčního faktoru Nrf2, který kóduje řadu antioxidačních a cytoprotektivních enzymů (Magesh et al., 2012). Tokoferol ani vitamin C tento faktor neindukují (Pazdro et al., 2010). Tato zjištění mohou vysvětlit jednu z příčin neúspěchu dosavadní antioxidační terapie αT. Zdroje T3 v potravě Přírodní formy VE jsou syntetizovány v rostlinách. Zatímco T je obsažen v listech rostlin a méně v plodech, T3 jsou obsaženy výhradně v semenech. Hlavním potravinovým zdrojem je palmový olej, který obsahuje 70 % T3 a 30 %T. Palmový olej je rozdílný od ostatních rostlinných olejů v tom, že obsahuje 50 % saturovaných mastných kyselin, 40 % nesaturovaných mastných kyselin a 10 polyenových MK. Pro vysoký obsah saturovaných MK nebyl dříve v Evropě a v USA doporučován pro výživu. Tato situace se v posledních letech na základě nových poznatků o účincích T3 mění. Dalšími zdroji T3 jsou: olej z rýžových otrub, který je hlavním zdrojem γT3 a obsahuje navíc i dva nově identifikované T3 - isoformy, desmethyl- a didesmethyl-T3, a je považován v asijských zemích za zdraví prospěšný olej. V malém množství jsou T3 obsaženy v ovsu a v ječmenu (převážně αT3, 56mg/kg a 40mg/kg sušiny, resp.), v pšenici (33 - 43mg/kg sušiny). Ke ztrátám T3 dochází při loupání obilovin a kuchyňské úpravě. Např. lisování tepelně upraveného ovsa vede ke kompletní ztrátě T3. Ačkoliv jsou T3 přítomny v potravinách, je otázkou zda tyto dietní zdroje mohou poskytnout dostatečný příjem T3. Pro získání 1 kg komerčně vyráběného γT (Tocomin 50%, Carotech, USA) je nutné zpracovat 1 000 kg palmového oleje. Pro dosažení terapeutických dávek, které jsou testovány v klinických studiích, by muselo být zkonzumováno 100 - 200 g palmového/rýžového oleje nebo 1,5 - 4 kg pšeničných klíčků, ječmene nebo ovsa (Sen et al., 2007). Metabolismus T3 V trávícím traktu jsou T3 a T absorbovány spolu s dietními tuky a jsou sekretovány v chylomikronech společně s triacylglyceroly, fosfolipidy a cholesterolem lymfatickým systémem do tkání, kde jsou zachyceny lipoprotein receptorovým systémem. Transport pomocí chylomikronů přispívá k akumulaci jiných izoforem VE než αT. Tento mechanismus může vysvětlit proč jsou koncentrace γT ve tkáních neočekávaně vysoké v kontrastu s jeho nízkou plasmatickou koncentrací. Chylomikronové remnanty jsou následně transportovány do jater, kde je přednostně αT vázán αT-transfer proteinem (α-TTP), který má vysokou afinitu pro αT (100 %), ale daleko nižší pro ostatní tokoferoly (βT, γT, δT : 50 %, 20 %, nebo1 %, resp). Zachycený α-T je z jater transportován do tkání spolu s VLDL. α-TTP je hlavním regulátorem αT v organizmu a jeho selektivní afinita pouze pro T vysvětluje nižší plasmatické
S2
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA hladin TE po orálním poddání, přestože ve tkáních mohou mít daleko větší antioxidační aktivitu v porovnání s T. V recentní studii autoři sledovali tkáňovou distribuci γT u myší po jednorázovém podání 100 mg γT-kg t.hm. a ukázali, že akumulace γT byla třetí den po podávání nejvyšší v tukové tkáni, ledvinách, játrech a v myokardu. Po 14 dnech byly koncentrace v séru, ledvinách, játrech, svalech a mozku sníženy přibližně o 50 %, ale v myokardu a ve slezině byly hladiny γT zvýšeny na dvojnásobek (Deng et al., 2012). Tyto změny jsou pravděpodobně důsledkem vyššího výchytu γT těmito tkáněmi po jeho uvolnění při lipolýze z tukové tkáně. Otázky týkající se tkáňové distribuce jiných izoforem T a T3 nejsou zcela objasněny a tyto nálezy naznačují, že transport γT do tkání se může odehrávat bez účasti jater. Další z klinického hlediska důležitou nevyřešenou otázkou je vztah vzájemného ovlivnění plasmatických a tkáňových koncentrací T a T3 při suplementaci. Zatímco některé studie ukázaly, že podávání αT snižuje hladiny nejen γT, ale i koncentraci T3 ve tkáních, ve studii Patela a spol. byl prokázán pokles hladin T3 pouze v jaterní tkáni. Naproti tomu suplementace T3 hladiny αT ve tkáních neovlivnila (Patel a spol., 2012). Antioxidační aktivita T3 Peroxidace membránových lipidů a oxidativní modifikace nízkodenzitních lipoproteinů (LDL) představují klíčové procesy vedoucí ke kardiovaskulárním chorobám. V řadě modelových systémů bylo prokázáno, že T3 mají v porovnání s T větší antioxidační aktivitu. Bylo zjištěno, že αT3 je 40x účinnější v v protekci jaterních mikrosomálních membrán proti peroxidaci lipidů a 6,5 x účinněji ochraňuje cytochrom P-450 před oxidačním poškozením. K vyšší antioxidační aktivitě přispívá a) uniformní distribuce T3 v membránové lipidové dvojvrstvě, b) struktura chromanolového jádra, která vede k účinnější interakci s lipidovými radikály, c) vyšší recyklace předávání tokoferoxylového radikálu a tím i větší regenerace T3 (Serbinova et al. 1991; Vasanthi et al-, 2012). Hypocholesterolemické a kardioprotektivní účinky T3 Epidemiologické studie ukázaly, že T3 snižují plasmatické hladiny aterogeního lipoproteinu ApoB o 10 - 15 %. V jiné studii podávání tokotrienolů isolovaných z rýžových otrub s obsahem didesmethylové isoformy T3, která nemá na chromanolovém jádře molekuly žádnou methylovou skupinu, snížilo plasmatické hladiny lipoproteinu („a“) o 17 %. U isoforem T3, které nemají na chromanolovém jádře molekuly metylovou skupinu v pozici 5 (γT, δT a didesmethylové isoforma) byly zjištěny hypocholesterolemické účinky.Tyto izoformy, podobně jako statiny, inhibují aktivitu klíčového enzymu syntézy cholesterolu, hydroxy-methyl-glutarylCoA reduktázy (HMG-CoA), ale rozdílným mechanismem. Zatímco statiny inhibují enzymovou aktivitu kompetitivní inhibicí, T3 ovlivňují metabolickou dráhu mevalonátu post-transkripční inhibicí HMG-CoA reduktázy a snížením degradace jejího proteinu (Parker et al., 1993). Synergický vliv statinů a T3 byl prokázán v klinické studii, ve které u pacientů s hypercholesterolémií podávání lovastatinu (10mg/den) v kombinaci s T3 isolovanými z rýžových otrub (50mg/den) mělo větší hypocholesterolemický efekt než podávání lovastatinu samotného (Quereshi et al., 2001). Další studie ukázaly, že T3 nejen zlepšují lipidové parametry, ale příznivě ovlivňují i rozvoj aterosklerózy u pacientů a zvířecích modelů. V několika studiích T3 frakce z palmového oleje snížila rozvoj aterosklerotických lézí u ApoE-/-myší a u králíků. Studie provedená v New Jersey , USA ukázala, že T3 z palmového oleje podávaný v dávce 240mg /den po dobu tří let pacientům ateroklerózou v karotidách vedl u 92 % pacientů k regresi stenózy, zatímco u skupiny s placebem u žádného pacienta nedošlo ke zlepšení (Tomeo et al., 1995). V mechanismu antiaterogenního působení T3 může hrát roli a) jejich antioxidační aktivita, b) vliv T3 na sekreci cholesterolu z jater a nebo c) podle recentních nálezů i ovlivnění aktivity PPAR -α, - γ, - δ (Li et al. 2010).
S3
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Protizánětlivé a další účinky T3 Chronický zánět se podle současných poznatků uplatňuje v iniciálních fázích aterogeneze, její progresi a v terminální fázi při ruptuře plátu. Experimentální studie ukázaly, že T3 částečně inhiboval lipopolysacharidy indukovaný zánět pravděpodobně v důsledku snížení kyseliny arachidonové, která je prekurzorem prostaglandinů a leukotrienů. Nejvíce efektivní v potlačení zánětu byl δ T3, což může souviset s jeho schopností aktivovat nukleární transkripční faktor Nrf2 (Wu et al. 2008). V řadě dalších studií, v nichž byly sledovány účinky T3, bylo pozorováno příznivé ovlivnění vasodilatace, nižší exprese adhesních molekul a adherence monocytů na endotel. Recentní studie ukázala, že T3 mají příznivé účinky na metabolické poruchy asociované s metabolickým syndromem. Podávání diety s ysokým podílem sacharosy a tuků po dobu 16 týdnů vedlo u potkanů k obezitě, zhoršené glukózové tolerance, hypertenzi a ke zhoršení jaterních funkcí. Podávání extraktu T3 z palmového oleje, který obsahoval αT3 (32 %), γT3 (25 %), βT3 (2 %) δT3 (18 %) a αT (23 %) v dávce 120mg/kg/den snížilo sérové koncentrace triacylglycerolů. neesterifikovaných mastných kyselin, zlepšilo glukózovou toleranci, vedlo k poklesu hypertenze, zlepšilo funkci levé komory a v játrech snížilo hladiny AST a ALT, infiltraci zánětlivými buňkami a snížilo množství tukových vakuol (Wong et al., 2012). Závěr Oxidační stres má důležitou úlohu v patogenezi kardiovaskulárních nemocí, metabolického syndromu, diabetu 2. typu a jeho komplikací. Proti jeho působení je organizmus vybaven antioxidačními enzymy, které jsou kódovány geny regulovanými Nrf2 transkripčním faktorem. Nový zásadní poznatek, že T3 mohou být aktivátory tohoto transkripčního faktoru a aktivovat řadu antioxidačních enzymů a cytoprotektivních genů spolu s recentními nálezy o jejich účincích naznačuje nové možnosti terapie těchto civilizačních metabolických onemocnění. Z uvedeného je patrné, že vitamin E reprezentuje skupinu přírodních látek, které mají široké spektrum účinků ovlivňujících zdraví a nemoce. Studie byla podpořena MZ ČR – RVO („Institut klinické a experimentální medicíny – IKEM, IČ 00023001“) Literatura Deng L, Peng Y, Wu Y, et al. Tissue distribution of emulsified γ-tocotrienol and its long-term biological effects after subcutaneous administration. Lipids in Health and Disease 13: 66, 2014. Fairus S, Nor RM, Cheng HM, Sudram K. Postprandial metabolic fate of ticotrienol-rich vitamin E differs significantly from that of α-tocopherol. Am J Clin Nutr 84; 835-842: 2006. Serbinova E, Kagan V, Han D, Packer L. Free radical recycling and intramembrane mobility in the antioxidant properties of α-tocopherol and α-tocotrienol. Free Radic Biol Med 10:263-275, 1991. Kannappan R, Gupta SC, Kim JH, Aggarwal BB. Tocotrienols fight cancer by targeting cell signaling pathways. Genes Nutr 7; 43-52: 2012. Li F, Tan W, Kang Z, et al. Tocotrienol enriched palm oil prevents atherosclerosis through modulating the activities of peroxisome proliferators-activated receptors. Atherosclerosis 211; 278-282: 2010. Magesh S, Chen Y, Hu L. Small molecule modulators of Keap1-Nrf2-ARE pathway as potential preventive and therapeutic agents. Med Res Rev 32; 687-726: 2012. Packer L, Weber SU, Rimbach G. Molecular aspects of αT3 antioxidant action and cell signalling. J Nutr 131; 369S-373S: 2001.
S4
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Parker RA, Pearce BC, Clark RW, et al. Tocotrienols regulate cholesterol production in mammalian cells by post-transcriptional suppression of 3-hydroxy-3-methylglutarylcoenzyme A reductase. J Biol Chem 1993; 268(15): 11230-11238. Pate V, Rink C, Gordillo GM, et al. Oral tocotrienols are transported to human tissue and delay the progression of the model for end-stage liver disease score in patients. J Nutr doi 10.3945/jn.111.151902, 2012. Pazdro R, Burgess JR. The role of vitamin E and oxidative stress in diabetes complications. Mech Ageing Dev 131; 276-86: 2010. Quereshi AA, Sami SA, Salser WA, et al. Synergistic effect of tocotrienol rich fraction (TRF26) of ruce bran and lovastatin on lipid parameters in hypercholesterolemic humans. J Nutr Biochem 123; 318-329: 2001. Sen Ch, Khanna S, Rink C, Roy S. Tocotrienols: The emerging face of natural vitamine E. Vitam Horm 76; 203-261: 2007. Suzuki YJ, Tsuchiya M, Wassall SR, et al. Structural and dynamic membrane properties of alpha-tocopherol and alpha-tocotrienol: implication to the molecular mechanism of their antioxidant potency. Biochemistry 32; 10692-10699: 1993. Tomeo AC, Geller M, Watkins TR, et al. Antioxidant effect of tocotrienols in patients with hyperlipidemia and carotid sclerosis. Lipids 30; 1179-1183: 1995. Vasanthi HR, Paramesvari RP, Das DK. Multifacet role of tocotrienols in cardioprotection supprts their structure: function relation. Genes Nutr 7; 19-28: 1012. Vivekananthan DP, Penn MS, Sapp SK, et al. Use of antioxidant vitamins for the prevention of cardiovascular dinase: metaanalysis of randomized trials. Lancet 361; 2017-2023: 2003. Wong WY, Poudyal H, Ward LC, Brown L. Tocotrienols reverse cardiovascular, metabolic and liver changes in high carbohydrate, high fat diet-fed rats. Nutrients 4; 1527-41: 2012. Wu SJ, Liu PL, Ng LT. Tocotrienol-rich fraction of palm oil exhibits anti-inflammatory property by suppressing the expression of inflammatory mediators in human monocytic cells. Mol Nutr Food Res 52; 921-929: 2008.
S5
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA LIPIDY A LIPOPROTEINY U ALZHEIMEROVY DEMENCE M. Zeman1, M. Vecka1, R. Jirák2, J. Macášek1, T. Vařeka1, E. Tvrzická1, A. Žák1 Univerzita Karlova v Praze, 1. lékařská fakulta, IV. interní klinika, Všeobecná fakultní nemocnice v Praze, 2 Psychiatrická klinika 1. LF UK a VFN Praha, centrum pro Alzheimerovu chorobu 1
Úvod Alzheimerova choroba (AD) je neurodegenerativní onemocnění, charakterizované progredující atrofií neuronů zejména v oblasti mozkové kůry a hippocampu, úbytkem synapsí a snížením neuronální plasticity, nálezem extracelulárních depozit amyloidu β (Aβ) v senilních placích a přítomností intracelulárních neurofibrilárních klubek (neurofibrillar tangles, NFT). Rozlišují se dvě základní formy AD: (1) familiární forma, manifestující se mezi 40. až 60. rokem věku, u které je většina případů spojena se vzácnými, vysoce penetrantními mutacemi tří genů: gen pro amyloidový prekurzorový protein, APP, gen pro presenilin 1, PSEN1 a gen pro presenilin 2, PSEN2 a (2) pozdní („late-onset AD, LOAD“), zvaná též sporadická forma. LOAD představuje nyní nejméně 90 % všech případů AD a její výskyt stále vzrůstá, zřejmě v souvislosti se stoupajícím významem nepříznivých faktorů zevního prostředí. Patogeneze LOAD dosud není objasněna, uplatňuje se zde oxidační stres, zánět a řada metabolických faktorů, z nichž jsou v popředí odchylky v metabolismu lipidových látek, což vzhledem k zastoupení lipidů v centrálním nervovém systému (CNS) není překvapující. Patří sem zejména poruchy přeměny sterolů, glycerofosfolipidů (Kosicek a Hecimovic 2013) a sfingolipidů (Haughey et al., 2010). U LOAD se uplatňuje složitá interakce genetických a environmentálních faktorů (Traynor a Singleton 2010). Nejvýznamnějším genetickým rizikovým faktorem spojeným s výskytem LOAD je gen APOE, resp. přítomnost alely ε4. Významnými rizikovými faktory jsou také zejména věk, dále obezita, vysoký příjem kalorií a nasycených tuků ve stravě, kouření cigaret, diabetes mellitus typu 2 (DM2), hyperhomocysteinémie nebo deprese, (Reitz a Mayeux 2014, Wuwongse et al., 2010). Patologicko-anatomické charakteristiky AD Charakteristickými neuropatologickými znaky AD jsou extracelulární depozita amyloidu β (Aβ) v senilních placích (SP), dále nález intracelulárně uložených neurofibrilárních klubek (neurofibrillary tangles, NFT), Depozice Aβ vede k oxidačnímu stresu, excitotoxicitě, energetické depleci, zánětu, apoptóze a neuronální smrti (Parihar a Hemnani 2004) zejména v mozkové kúře a hippokampu. Amyloid beta je ukládán extracelulárně a vzniká z amyloidového prekurzorového proteinu (APP). APP je transmembránově uložený protein, který je proteolyticky štěpen dvěma možnými způsoby. Působením enzymu alfa-sekretázy je APP štepen v místě domény Aβ, takže vznikají pouze štěpy, které nejsou amyloidogenní. Naproti tomu beta-sekretáza štěpí APP poblíže N-konce APP za vzniku tzv. beta-APP a Cterminálního fragmentu (C99), který obsahuje intaktní doménu Aβ. Další enzym, gammasekretáza pak z C99 odštěpuje isoformy Aβ39 až Aβ43, z nichž nejvíce jsou zastoupeny Aβ40 a Aβ42. Fragment Aβ42 snadno agreguje a tvoří solubilní oligomery uvnitř endosomálních vesikul a podél mikrotubulů neuronových výběžků (Takahashi et al., 2004). Extracelulární agregáty Aβ tvoří centra plaků a indukují uvolnění zánětlivých mediátorů, volných radikálů a zvýšení aktivity zánětlivých enzymů (např. cyklooxygenáz). Jsou aktivovány gliální buňky, které mimo jiné zvyšují produkci enzymu butyrylcholinesterázy, tím přispívají k deficitu acetylcholinu a poklesu acetylcholinové neurotransmise, uplatňující se v mechanismech paměti. Postižen je i další, glutamátergní neuropřenašečový system. Oligomery Aβ také
S6
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA označované jako ADDL (Aβ derived diffusible ligands), indukují dysregulaci funkce NMDA (N-methyl-D-aspartate) receptorů s následnou synaptickou mitochondriální dysfunkcí a excesivní tvorbou volných radikálů (De Felice et al., 2007). Následná kaskáda dějů vede k neuronální apoptóze. Nadměrná excitace NMDA receptorů navíc narušuje základní mechanismus učení a paměti – dlouhodobou potenciaci (long-term potentiation, LTP). Dalším charakteristickým znakem AD jsou neurofibrilární klubka (neurofibrillary tangles, NFT). Představují hlavní mikroskopickou lézi u AD a jsou lokalizována zejména ve velkých pyramidálních neuronech Ammonova rohu a v mozkovém neokortexu, ale i v dalších strukturách, jako je střední mozek, tegmentum pontu, nucleus basalis Meynerti a hypothalamus. (Braak a Braak 1991). Podkladem NFT jsou degenerované hyperfosforylované tau proteiny. Proteiny tau jsou spojené s mikrotubuly (MAPT, microtubule-associated proteins tau), zejména v neuronech CNS. Odpovídající množství a lokalizace proteinů tau v neuronech je nezbytná pro transport molekul a organel. Proteiny tau obsahují řadu serinových a threoninových zbytků, které mohou podléhat fosforylaci, přičemž míra fosforylace ovlivňuje vazbu tau proteinů na mikrotubuly (Ballatore et al., 2007). Funkcí tau proteinů je stabilizace mikrotubulů, která má význam pro homeostázu neuronů. Tato funkce může být regulována ovlivněním stavu fosforylace. Cholesterol, oxysteroly a lipoproteiny v CNS Lidský mozek obsahuje asi 25% celkového cholesterolového poolu v těle, i když tvoří jen asi 2 % tělesné hmotnosti (Bjorkhem, 2006; Dietschy and Turley, 2004). Většina cholesterolu je uložena v myelinových pochvách a plasmatických membránách astrocytů a neuronů (Dietschy a Turley 2004). Asi 70 – 80 % cholesterolu v mozku je v myelinu, tvořeného v oligodendrocytech. Po dokončení myelinogeneze je syntéza cholesterolu v CNS nízká a probíhá v astrocytech (Nieweg et al., 2009). V neuronech nedochází k významné syntéze cholesterolu, a proto jsou neurony závislé na jeho externím přísunu. Neurony přijímají cholesterol z lipoproteinů po jejich vazbě na receptory LDL receptorové rodiny. Ligandem pro tyto receptory je apolipoprotein E (Herz 2009). Stálá syntéza a obrat cholesterolu v neuronech jsou mimo jiné nezbytné pro mechanismy učení a paměti funkce neuronů, jako je LTP (Kotti et al., 2006). Katabolismus cholesterolu v mozku je zajišťován pouze jedním enzymem, cholesterol 24-hydroxylázou (CYP46A1), který přeměňuje cholesterol na 24(S)-hydroxycholesterol (Bjorkhem a Meaney, 2004). 24(S)-hydroxycholesterol snadno prochází buněčnou membránou a jakmile je syntezován, přestupuje hematoencefalickou bariérou do periferního oběhu a do jater, kde je vyloučen do žluči. Enzym je téměř výlučně lokalizován v neuronech mozku a sítnice. 24(S)-hydroxycholesterol má antiamyloidní charakter, zvyšuje aktivitu α-sekretázy i poměr aktivit α/β-sekretáza. U pacientů s AD jsou plasmatické hladiny 24(S)-hydroxycholesterolu sníženy, zatímco koncentrace v mozkomíšním moku (CSF) zvýšeny. Charakteristickým rysem různých stádií AD, včetně mírné kognitivní poruchy, je nález zvýšené hladiny celkového i fosforylovaného tau proteinu v CSF, zatímco hladiny Aβ42 a poměru Aβ42:Aβ40 jsou zde sníženy. Hladiny jiného metabolitu cholesterolu, 27-hydroxycholesterolu jsou u AD zvýšeny, přičemž v experimentu bylo zjištěno, že 27-hydroxycholesterol může ovlivněním funkce NMDA receptoru interferovat s paměťovou funkcí (Mateos et al., 2009). Cholesterol má velký význam pro organizaci a funkci dvojvrstevných buněčných membrán, zejména pro strukturu lipidových mikrodomén, nazývaných „lipid rafts“, vyskytujících se v buněčných membránách, v membránách Golgiho systému a endosomálních membránách. „Lipid rafts“obsahují významný podíl cholesterolu, sfingomyelinu, glykosfingolipidů. V těchto mikrodoménách jsou lokalizovány některé membránové proteiny. Významná je zde kolokalizace APP s amyloidogenními sekretázami -sekretázou a -sekretázou ; -sekretázy se nacházejí mimo tyto mikrodomény (Kojro et al., 2001). Bylo zjištěno, že cholesterol přímo stimuluje aktivitu - a -sekretáz a naopak deplece cholesterolu např. působená statiny vede
S7
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA k poklesu jejich aktivity a zvyšuje se podíl štěpení -sekretázou (Grimm et al., 2013). Vztahy mezi hladinami plasmatického cholesterolu a rizikem vývoje AD jsou přesto dosud ještě předmětem diskuze. Zvýšené hladiny cholesterolu ve středním věku byly v jedné studii spojeny s 2 – 3 násobným rizikem rozvoje AD v pozdějším věku (Kivipelto et al., 2001). V jiné studii byly nízké hladiny HDL-C asociovány s vyšším rizikem demence, zatímco vysoký HDL-C byl spojen s větším objemem hippokampu a nižším rizikem AD (Wolff et al., 2001). Naproti tomu některé epidemiologické studie ukázaly negativní s asociace mezi celkovým cholesterolem a AD. Např. Mielke et al. (2005) zaznamenali, že vysoký celkový cholesterol mezi 70 a79 léty věku snižoval riziko demence mezi 79 až 88 rokem. Panza et al. (2006) vyslovili hypotézu, že několik let před nástupem demence celkový cholesterol klesá, zřejmě v souvislosti s progredující patologií AD. Na rozdíl od plasmy jsou lipoproteiny v CNS zastoupeny jen částicemi podobnými HDL (Hayashi 2011). Tyto částice jsou sekretovány z gliálních buněk, zejména astrocytů a mikroglií, za určitých podmínek, např. v souvislosti s excitotoxickým poškozením, mohou být sekretovány i neurony (Hayashi et al., 2011). Apolipoproteiny a receptory Apo E je glykoprotein složený z 299 aminokyselin (AMK), který je exprimován v několika typech buněk, ale nejvíce v játrech a v CNS (Mahley 1988). V mozku je apo E se nachází zejména v astrocytech, ale také v mikrogliích. Za určitých podmínek, např. poranění je apo E syntetizován také v neuronech (Xu et al. 2006). Gen pro ApoE je lokalisován na 19. chromozómu. Byly popsány dva bodové polymorfizmy genu pro ApoE, kódující tři izoformy : ApoE2 (cys112, cys158), ApoE3 (cys112, arg158), a ApoE4 (arg112, arg158). Ačkoliv se tyto tři isoformy liší jen jednou nebo dvěma aminokyselinami v pozici 112 nebo 158, tyto rozdíly významně mění strukturu i funkci apo E (Mahley et al. 2006). Alela ε4 apolipoproteinu E je pokládána za rizikový faktor Alzheimerovy choroby, kde se zřejmě více mechanizmy podílí na vzniku a akumulaci Aβ. Homozygocie ApoE ε4 zvyšuje relativní riziko vzniku AD 15 - 18krát, přítomnost jedné alely ε4 asi třikrát. Naopak ε2 alela apoE je spojena s nižším rizikem AD (Corder et al. 1994). Mechanismy, jakými se isoformy apoE uplatňují v patologii AD, nejsou zcela objasněny. Je známo, že apoE se váže přímo na Aβ. Apo ε4 má k vazbě Aβ nižší afinitu než ostatní isoformy, takže to může vést k méně efektivnímu odstraňování Aβ z buněčného povrchu. V experimentu je přítomnost Apo ε4 spojena s pomalejším transportem Aβ přes HEB a tím se zvýšenou retencí Aβ v mozku, dále s vyšší intenzitou zánětu v mozku a s menší reparační kapacitou (Villeneuve et al., 2014). Nedávno bylo popsáno, že za situací, kdy je Apo E syntezován neurony, mohou v případě produkce apo E4 vznikat neurotoxické fragmenty, které působí řadu poruch, např. zvyšují fosforylaci tau, produkci NFT a mitochondriální dysfunkci v neuronech (Mahley a Huang, 2012; Liu et al., 2013). Na rozdíl od plasmy, kde je Apo E součástí několika typů lipoproteinových částic, v CNS je sekretován gliálními buňkami za vzniku částic, podobných HDL (high-density lipoprotein (HDL)-like particles), které jsou diskoidální a obsahují cholesterol a fosfolipidy. Koncentrace apo E v mozkomíšním moku (CSF) je asi 5 mg/ml. Úloha apo E v CNS v homeostáze cholesterolu a dalších lipidů v CNS není také plně objasněna. Lipoproteiny, obsahující apo E, stimulují růst axonů neuronů v CNS a cholesterol v nich obsažený podporuje synaptogenezi (Hayashi et al., 2011). Apo E působí také jako molekula s protizánětlivým účinkem po vazbě na LDL receptor a LRP1 receptor na gliálních buňkách, aktivovaných Aβ. Lipoproteiny obsahující apo-E z glií chrání neurony v CNS před apoptózou signální cestou indukovanou LRP1 a zahrnující působení fosfolipázy C γ 1, protein kinázy Cδ a glykogen syntáza kinázy 3β. Vedle apo E jsou v CNS ještě další apolipoproteiny, zejména apo J (clusterin) a apo A-I, který ovšem není tvořen přímo v CNS, ale přichází z periferního oběhu. Apo J je multifunkční heterodimerický glykoprotein, jenž se vyskytuje zejména v játrech a mozku. Lipoproteiny
S8
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA v CNS, obsahující apo J jsou malé částice chudé na lipidovou složku, secernované v astrocytech (Fagan et al., 1999). Nálezy experimentálních studií ukazují že apo J je pravděpodobně neuroprotektivní molekula (Imhof et al., 2006), za různých okolností může mít v mozku pro i anti apoptotické účinky. Funkce apo- A-I v CNS není jasná. V CNS se nacházejí dvě třídy lipoproteinových receptorů: rodina LDL-receptorů a scavengerové receptory. K rodině LDL-receptorovů patří LDL receptor, VLDL receptor, apoER2, LRP-1 (neboli α2-makroglobulinový receptor, A2MR), a gp330 (neboli megalin či LRP-2) mezi scavengerové receptory patří SR-A, SR-B a SR-C. Všechny scavengerové receptory vážou acetylované a oxidované lipoproteiny, scavengerové receptor B-I vážou HDL bez apo E (Rebeck a Hyman 1999). Za fyziologických podmínek mohou být lipoproteiny z CSF v mozku vychytávány v LDL receptorech nebo scavengerových receptorech. V případě poranění produkují gliální buňky vysoké hladiny apo E, částice jsou pak směřovány k receptorům LRP. Apo E vytvářený mimo neurony, slouží k přenosu cholesterolu do poškozených neuronů a pomáhá jejich regeneraci. Receptory apo E hrají roli v patofyziologii AD. LRP1 receptor (low density lipoprotein receptor-related protein 1), také nazývaný alfa-2-makroglobulinový receptor (A2MR), apolipoprotein E receptor (APOER) je protein na plasmatických membránách buněk zúčastněných v receptorem zprostředkované endocytóze, lipidové homeostáze,i odstraňování apoptotických buněk. Mezi jeho funkce patří i clearance APP a Aβ, které jsou složkami amyloidových plaků u nemocných s AD. Exprese genu pro LRP1 klesá s věkem a v mozkové tkáni nemocných s AD je obsah LRP1 snížen. Receptor LRP1 je lokalizován na abluminální straně HEB a zprostředkuje transcytózu Aβ do krevního oběhu, podporuje také internalizaci Aβ do neuronálních buněk a depozici v lysosomech, LRP1 také moduluje metabolismus APP v buňkách (Hayashi et al, 2011). SORL1(sortilin-related receptor, LR11) je receptor apo E, který reguluje zpracovávání APP a je považován za významný rizikový faktor pro sporadickou formu AD. SORL1 kontroluje uvolňování APP do povrchu buněčné stěny, a chrání neurony před amyloidogenním štěpením APP β-sekretázou v Golgiho aparátu. U nemocných AD je jeho exprese snížena (Scherzer et al., 2004). Dalšími receptory, účastnícími se v patogeneze AD jsou také receptory LXR (liver x receptors), jejichž agonisty jsou oxysteroly. Cílovými geny jsou apo E, ABCA1 (ATPbinding cassette transporter) A1 a ABCG1, účastněné v lipidovém metabolismu transport (Kalaany a Mangelsdorf 2008). V experimentech absence LXR zvyšuje depozici Aβ a aplikace agonistů LXR působila pokles hladin Aβ, zmenšení amyloidových plaků a úpravu paměťového deficitu u zvířecích modelů (Hayashi et al, 2011). V mikrogliích a astrocytech se nachází také receptor SR-B1 (scavenger receptor class B type 1), sloužící jako receptor HDL. V experimentálním modelu jeho deplece vedla k deterioraci paměti a učení a k depositům Aβ, v hippokampu (Chang et al., 2009). Fosfolipidy a AD Membrány neuronů jsou složeny z glycerofosfolipidů (GP), sfingolipidů (SL), cholesterolu a proteinů, přičemž distribuce lipidů v membránové dvojvrstvě není symetrická. Neuronální aktivita je modulována souhrou mezi membránovými receptory na buněčném povrchu a intracelulárními signálními proteiny. V mozkových buňkách jsou homeostatické pochody zajišťovány komplexní sítí lipidových mediátorů odvozených z GP, SL a cholesterolu. Lipidové mediátory jsou uvolňovány po aktivaci fosfolipáz A2 (PLA2), sfingomyelináz a cytochrom P450 dependentních oxygenáz. Jejich široké spektrum zajišťuje celé spektrum účinků na homeostázu neuronů, regulaci imunitní odpovědi, oxidačního stresu a zánětu (Frisardi et al., 2011). Štěpení GP účinkem PLA2 vede ke vzniku řady biologicky aktivních molekul, jako jsou eikosanoidy, lysofosfolipidy, destičky aktivující faktor - PAF, endokanabinoidy, dokosanoidy, isoprostany, neuroprostany a řada dalších (Frisardi et al., 2011). S9
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Fosfolipidy jsou důležitou součástí membrán neuronů i gliálních buněk. V membránách jsou glycerofosfolipidy, sfingolipidy a proteiny asymetricky uspořádané mezi dvěma vrstvami membrán. Fosfolipidy hrají v membránách roli v udržování strukturální integrity, ale také jsou spolu s cholesterolem součástí sítě, která zabezpečuje signální transdukci, převádějící extracelulární signály z buněčného povrchu do buněčného jádra, kde dochází k biologické odpovědi, zajišťované druhotnými posly (second messengers), kterými jsou bioaktivní lipidové mediátory (Farooqui 2010). Glycerofosfolipidy jsou amfipatické molekuly, nutné k optimální funkci integrálních membránových proteinů, receptorů, transportérů, iontových kanálů, ale slouží také jako zásobní depot lipidových mediátorů (Farooqui et al., 2010). V autoptickém materiálu, získaném z mozků osob zemřelých na AD byly nalezeny nižší koncentrace glycerofosfolipidů (GP) ve srovnání se stejně starými kontrolami (Kosicek a Hecimovic 2013). Pokles hladiny fosfolipidů není stejný u všech třídy. Deficit pPE (fosfatidyletanolamin plasmalogen) v bílé hmotě činil asi 40% již u časného stadia AD a byl konstantní během progrese onemocnění, zatímco v šedé hmotě během progrese postupně stoupal z 10 % na 30 % (Han et al., 2001). Je zajímavé, že v časném stadiu AD hladiny jiných fosfolipidových tříd hmotě (fosfatidylcholin, fosfatidylinositol, fosfatidyletanolamin) v mozku nebyly změněny v bílé ani šedé (Han et al., 2002). Je možné, že pokles hladiny GP v mozku nemocných s AD souvisí se zvýšenou aktivitou PLA2, která je u AD popisována (Frisardi et al., 2011). Příčiny vyšší aktivity nejsou jasné, může ji zvyšovat Aβ, cytokiny, jež jsou u nemocných s AD uvolňovány z aktivovaných mikroglií nebo hromadící se metabolity sfingolipidů, zejména ceramid nebo ceramid - 1 fosfát (Frisardi et al., 2011). Molekula GP obsahuje na druhém uhlíku esterifikovanou kyselinu arachidonovou (AA) nebo dokosahexaenovou (DHA), které jsou působením PLA2 uvolněny za vzniku lysofosfolipidů. Další metabolismus AA a DHA vede ke vzniku řady derivátů, v případě AA jsou to eikosanoidy (prostaglandiny, leukotrieny, lipoxiny, tromboxany, nebo kyseliny hydroxyeicosatetraenové, HETE), v případě DHA dokosanoidy (resolviny, neuroprotektiny, maresiny) (Marcheselli et al., 2003, Yang et al., 2011, Serhan et al., 2011). Sphingolipidy jsou heterogenní třída lipidů, jejichž základem je molekula 18 uhlíkatého alkoholu sfingosinu, který je syntezován z palmitoyl-CoA a serinu enzymem serin palmitoylCoA transferáza (SPT). Acylací sfingosinu vzniká ceramid, Cer (N-acyl-sphingosin). Mastnou kyselinou je většinou nasycená nebo monoenová mastná kyselina. Enzym sphingomyelin syntáza (SM-syntáza) přeměňuje ceramid na sfingomyelin tak, že fosfatidylcholin reaguje s ceramidem a vedle sfingomyelinu vniká diacylglycerol. Jiný enzym, neutrání sfingomyelináza (nSMase) katalyzuje přeměnu SM na Cer. V autoptických vzorcích nemocných s AD jsou nacházeny zvýšené hladiny Cer v šedé i bílé hmotě, dokonce již u časných stádií AD. Současně byly prokázány i abnormality exprese enzymů, ovládajících metabolismus sfingolipidů a hromadění Cer, jako např. serin palmitoyltransferáza, neutrální sphingomyelináza a kyselá sphingomyelináza (Grimm et al., 2013). Nedávno byla publikována studie, ve které bylo zjištěno, že zvýšené hladiny Cer v séru jsou spojeny s několikanásobným zvýšením rizika rozvoje AD během devítiletého sledování (Mielke et al., 2012). Ceramidy indukují apoptózu a mají přímý neurotoxický účinek (Dawson et al., 1998). Cer zvyšuje produkci Aβ a současně Aβ zvyšuje syntézu Cer zvýšením aktivity neutrální SMázy, což vede ke vzniku bludného kruhu (Lee et al., 2004, Grimm et al., 2013). V mozkomíšní tekutině nemocných s prodromálním stadiem AD byly nalezeny zvýšené hladiny SM, zatímco u jedinců s mírnou až střední formou AD byly koncentrace SM nevýznamně nižší (Kosicek a Hecimovic., 2013). V mozcích nemocných s AD byla prokázána vyšší aktivita neutrální SMázy, vedoucí ke zvýšenému štěpení SM (Grimm et al., 2013). Vyšší sérová hladina SM nemocných s AD přitom korelovala s pomalejším rozvojem kognitivního deficitu (Mielke et al., 2011).
S10
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Další lipidovou třídou s předpokládanou úlohou v patogeneze AD jsou sulfatidy. Sulfatidy vznikají tak, že nejprve je k Cer za účasti enzymu ceramid galaktosyltransferázy (CGT) připojena galaktóza a pak na galaktoyl připojena sulfátová skupina reakcí, katalyzovanou cerebrosid sulfotransferázou (CST). Sulfatidy jsou zastoupeny hlavně v myelinových pochvách, kde tvoří asi 5 % myelinového lipidu. Jsou tvořeny převážně v oligodendrocytech a Schwannových buňkách. V mozcích osob s AD byl prokázán významný deficit sulfatidů současně se zvýšeným obsahem Cer. (Han et al.,2002). Zajímavé je, že deficit sulfatidů byl v jedné studii zjištěn v bílé hmotě frontálního laloku pouze u nemocných se sporadickou formou AD, na rozdíl jak od kontrol, tak osob s časnou formou AD (Gottfries et al., 1998). Nízká hladina sulfatidů byla zjištěna v mozkomíšním moku a mohla by být prediktorem progrese postižení bílé hmoty (Jonsson et al., 2012). Mastné kyseliny a AD Asi 50 - 60 % sušiny mozku dospělého člověka tvoří lipidy. Z toho asi 35 % tvoří mastné kyseliny s dlouhým řetězcem (LCPUFA) mezi kterými převažují kyselina arachidonová (AA, 20:4 n-6) a dokosahexaenová (DHA, 22:6 n-3). V tuku frontálního kortexu lidí, zemřelých ve věku 25 - 45 let našli NcNamara a Carlson 36 % nasycených mastných kyselin, kde byly zastoupeny téměř výlučně kyselina stearová (18:0) a palmitová (16:0). Podíl celkových omega-6 MK činil 17 % (převažovala AA) a podíl celkových omega-3 MK byl cca 14 % (prakticky pouze DHA, ostatní, tj. EPA, ALA a DPA představovaly méně než 1 %). Omega-9 mastné kyseliny byly zastoupeny 20 % (prakticky pouze kyselina olejová, 18:1 n-9 a omega-7 MK činily 8 % (McNamara a Carlson, 2006). Kyselina arachidonová je obsažena ve všech tkáních, zatímco DHA převažuje v šedé hmotě mozku, v sítnici a testes. Obsah AA a DHA v mozku přibývá zejména v období největšího růstu mozku, cca 3 měsíce před porodem a krátce v postnatálním období (Wainwright 2000). Fosfolipidy buněčných membrán jsou potencionálními zdroji signálních molekul, působících uvnitř buňky i mezi buňkami. Fosfolipázy A2 uvolňují z fosfolipidů AA, DHA či EPA. Ty jsou pak působením cyklooxygenáz, lipoxygenáz nebo monooxygenáz cytochromu P450 přeměňovány na eikosanoidy (AA a EPA) či dokosanoidy (DHA). Eikosanoidy a dokosanoidy snadno procházejí membránami neuronů a působí jako autokrinní i parakrinní signální molekuly. Intracelulárně mohou PUFA působit samy jako second messenger nebo jejich zastoupení v signálních strukturách ovlivňuje funkci transkripčních faktorů a genovou expresi (Deckelbaum 2006). Např. DHA po uvolnění z membrány účinkem iPLA2 (calciumindependent phospholipase A2) účinkuje jako second messenger v modulaci signální transdukce nebo jako součást molekuly diacylglycerolu (DAG) usnadňuje DAG-dependentní aktivaci proteinkinázy C (PKC). DHA může také být přeměněna na dokosanoidy, které působí protizánětlivě a chrání neurony před oxidačním stresem (Bazan 2009). Může být také opět reacylována do membrán účinkem acyltransferáz (McNamara a Carlson 2006). PUFA n-3 ovlivňují expresi genů např. v játrech, tukové tkáni atd. V experimentech na krysách bylo zjištěno, že PUFA n-3 ovlivňují expresi řady genů i v mozku. Tyto geny kontrolují synaptickou plasticitu, signální transdukci, interakci cytoskeletu s buněčnou membránou, tvorbu iontových kanálů, regulační proteiny a další faktory (např. expresi synukleinu α i γ , kalmodulinů,aktuinu, ras onkogenu a dalších (Kitajka et al., 2002). Arachidonová kyselina (AA) v mozku pochází buď z dietních zdrojů nebo je dodávána z jater, kde je vytvářena z kyseliny linolové (LA). Asi 17.8 mg AA za den je dodáváno do lidského mozku (Farooqui et al., 2007). Po vstupu do mozku je po aktivaci enzymem LC-fatty acyl CoA syntetázou (LC-FACS) esterifikována do sn-2 pozice fosfolipidů. Uvolnění z membrány zprostředkuje fosfolipáza A2, v případě AA jde o cPLA2, která je lokalizována v postsynaptických zakončeních (Strokin et al., 2003). Volná AA je transportována do endoplasmatického retikula a pak bud zpětně esterifikována do fosfolipidu, další (menší) část je metabolizována beta-oxidací v mitochondriích nebo přeměňována na eikosanoidy. AA
S11
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA reguluje aktivitu řady enzymů jako protein kináza C, NADPH oxidáza nebo cholin acetyltransferáza (Farooqui et al., 2007), moduluje funkci iontových kanálů, uvolňování neurotransmitterů, i genovou expresi (Farooqui et al., 2012). Do patofyziologických procesů Alzheimerovy nemoci zasahuje AA a její deriváty řadou mechanismů. AA uvolňovaná fosfolipázou A2 z fosfolipidů ovlivňuje synaptickou transmisi zprostředkovanou glutamátem . AA amplifikuje vzestup kalciových iontů v neuronech po stimulaci NMDA (N-methyl-Daspartát) receptorů (Goracci et al., 2010). Je známo, že NMDA receptory hrají významnou roli v mechanismech dlouhodobé potenciace (long-term potentiation), která ovlivněním synaptické účinnosti ve specifických oblastech mozku, zejména v hippokampu ovlivňuje procesy paměti a učení (Bliss a Collingridge, 1993) a na druhé straně nadměrná stimulace NMDA receptorů např. nadbytkem glutamátu vede k poškození neuronů (glutamátová excitotoxicita) (Zhou a Sheng 2013). Deriváty AA, jako jsou prostaglandiny (PG), leukotrieny (LT), a tromboxany (TX) po vazbě na odpovídající receptory ovlivňují řadu biologických funkcí, např. cévní tonus, imunitní a zánětlivé pochody. Modulace jejich působení by mohla mít potenciálně terapeutické účinky. Inhibice COX-2 interferuje s glutamátovou neurotoxicitou zprostředkovanou NMDA receptorem (Pepicelli et al., 2005) a antagonista receptoru prostaglandinového receptoru EP1 v experimentu snižoval neuronální excitotoxicitu zprostředkovanou NMDA receptory (Kawano et al., 2006). PGE2 zvyšuje expresi genu pro amyloidový prekursorový protein (APP) in vitro, což je spojeno s aktivací receptoru EP2 v mikrogliích (Pooler et al., 2004). Předpokládá se, že zánětlivá aktivita v mozku je významným činitelem patofyziologie AD (Halliday et al., 2000). V mozkové kůře a hippokampech nemocných s AD byla zjištěna ve srovnání se stejně starými kontrolami zvýšená exprese COX-1 a COX-2. V experimentu PGE2-zvšoval aktivitu γ- sekretázy (Qin et al., 2003). Je zajímavé, že několik epidemiologických studií zjistilo, že dlouhodobé užívání nesteroidních protizánětlivých farmak (NSAIDs) může nositelům alely ε4 apolipoproteinu E (APOE ε4) chránit proti vzniku AD. Biologické mechanismy tohoto jevu nejsou jasné a mohou zahrnovat protizánětlivé účinky NSAIDs nebo jejich schopnosz interferovat s kaskádou β-amyloidu (Aβ). Na druhé straně dlouhodobé, placebem kontrolované klimické studie s neselektivními i COX-2 selektivními inhibitory u nemocných s mírnou až střední formou AD nepřibesly pozitivní výsledky. Podávání NSAIDs by proto mohlo být prospěšné jen u velmi časných stádií AD v koincidenci s iniciální depozicí Aβ, aktivací mikroglií, a následným uvolněním zánětlivých mediátorů (Imbimbo et al., 2010). Nyní se pozornost obrací k možnosti příznivého ovlivnění AD působením na receptory PGE2 (Frisardi et al., 2011). Naproti tomu kyselina dokosahexaenová (DHA) a její deriváty působí na patogenetické pochody u AD příznivě. Epidemiologické údaje ukázaly, že dostatečný dietní přísun PUFA n-3 (DHA) je spojen s pklesem rizika vzniku demence (Johnson a Schaefer 2006). V prospektivní studii bylo nalezeno, že jedinci, kteří maji koncentrace DHA v plasmatickém fosfatidylcholinu v horním kvartilu, mají ve srovnání s jedinci s DHA v dolním kvartilu významně nižší riziko vývoje AD během devítiletého sledování. (Schaefer et al. 2006). Nemocní se sporadickou formou AD mají nižší expresi proteinu SorLA (LR11) i jeho mRNA. Tento protein snižuje štěpení APP α- a β-sekretázami, což snižuje tvorbu, β-amyloidu. Podávání DHA transgenním myším zvyšovalo expresi LR11 v neuronech snižovalo tvorbu β-amyloidu (Ma et al., 2007). DHA je podobně jako AA přeměňována oxidací. Za účasti 12- a 15-lipoxygenáz na deriváty, (resolviny, Rvs, neuroprotektiny, NP a maresiny, Mar) které mají významné biologické účinky (Serhan 2011). Resolviny (resolution-phase interaction products) a dokosatrieny antagonizují účinky derivátů AA (prostaglandinů, leukotrienů a tromboxanů) a mají významné protizánětlivé a imunoregulační vlastnosti (Serhan 2011). Resolviny blokují tvorbu IL-1 v mikrogliích a snižují infiltraci mozku polymorfonukleáry. Neuroprotektin D1 rovněž snižuje příliv leukocytů, snižuje expresi
S12
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA zánětlivých cytokinů a NFκB a indukuje expresi antiapoprotických proteinů BCL-2, snižuje expresi proapoptotických proteinů BAX a BAD (Bazan 2005) a neuroprotektivních genů, které omezují neurotoxicitu působenou amyloidem beta (Lukiw et al., 2005, Bazan 2009). Tvorba NPD1 z DHA je regulována redox stavem neuronů, takže zvýšený oxidační stres, působený Aβ či hypoxií zvyšuje tvorbu NPD1 z DHA (Jicha a Markesbery 2010). NPD1 dále zvyšuje antioxidační ochranu neuron indukcí tvorby antioxidačních enzymů (Hashimoto et al., 2002) a inhibuje aktivaci kaspázy 3, indukovanou oxidačním stresem a expresi COX-2 stimulovanou interleukinem 1 ((Bazan 2005). Enzym 14-lipoxygenáza v makrofázích přeměnuje DHA na maresin 1 (7,14-dihydroxy DHA), který omezuje přísun leukocytů a stimuluje odstraňování apoptotického materiálu (Serhan et al., 2009), jeho význam u AD ještě není prostudován. Neuroprotektivní účinek DHA u AD je zřejmě podmíněn i jejími fyzikálněchemickými vlastnostmi. DHA pomáhá udržovat flexibilitu neuronálních membrán, což hraje roli při signální transdukci, neurotransmisi, a tvorbě “lipid rafts” (Innis 2007, Cunnane et al., 2009). V autoptickém materiálu frontálních kortexů osob s AD byl ve srovnání s kontrolami prokázán významněnižší obsah DHA a také monoenových mastných kyselin (zejména olejové) v „lipid rafts“ (Martin et al., 2010). DHA moduluje expresi řady genů interakcí s transkripčními faktory. Význam zde má hlavně interakce s PPARγ, jelikož uvolňování Aβ je na PPARγ dependentní (Cunnane et al., 2009). Dalšími transkripčními faktory, na které se DHA váže, jsou liver retinoid X (LRX) receptor, hepatic nuclear factor-(HNF)4α a sterol regulatory element-binding protein (SREBP) (Frisardi et al., 2011). Jinými metabolity AA, které mají v patofyziologii neuropsychiatrických onemocnění, jsou kanabinoidy. Mezi nejvýznamnější kanabinoidy, které vznikají při metabolismu GP, patří anandamid (arachidonyl-ethanolamid, AEA) a 2-arachidonoylglycerol (2-AG). Tato látky působí na kanabinoidní receptory které byly v CNS identifikovány. V neuronech jsou exprimovány zejména CB1 ,kde se účastní regulace uvolňování neurotransmitterů a intensity synapse, zatímco CB2 receptory byly nalezeny zejména gliích a mikrogliích. Kanabinoidy mají v CNS řadu funkcí, účastní se na proliferaci neuronů, jejich diferenciaci,morfogenezi a synaptogenezi (Harkany et al., 2008). V několika studiích bylo zjištěno, že kanabinoidy přispívají k neuroprotekci proti působení Aβ (Aso a Ferrer 2014). Bylo popsáno odstraňování amyloidu po aktivací CB2 receptorů v makrofázích či jeho usnadněný transport přes plexus choroideus. V jiné experimentální studii bylo zjištěno, že Δ 9-THC (tetrahydrocannabinol) zvyšuje expresi neprilysinu, což je endopeptidáza degradující Aβ (Chen et al., 2013). Podávání směsi kanabinoidů vedlo v experimentu u myšího modelu rovněž k výrazné redukci neurofibrilárních klubek (Casarejos et al., 2013). Kannabinoidy zřejmě také významně interagují s neurotrofickými faktory a příznivě ovlivňují další faktory rozvoje AD, jako je zánět či oxidační stres v CNS (Aso a Ferrer 2014). Shrnutí Výsledky experimentálních studií ukázaly na význam odchylek v metabolismu řady lipidových tříd v patofyziologii Alzheimerovy demence. Vzhledem k celosvětově progresivně narůstajícímu výskytu tohoto devastujícího onemocnění je věnována pozornost možnosti jeho zjištění již v počátečních fázích. Studie na zvířecích modelech i laboratorní nálezy u postižených lidských jedinců přinesly řadu poznatků o patofyziologii neurodegenerativních onemocnění včetně působení amyloidu beta . V současné době je mimořádné úsilí věnováno snaze o identifikaci faktorů biochemických i genetických, spojených s přechodem prodromálního stadia onemocnění v progredující demenci. Některé z identifikovaných faktorů by mohly sloužit jako cíl terapie a jejich intervence by mohla přispět k zabránění nebo oddálení progrese onemocnění.
S13
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Práce byla podpořena výzkumnými projekty: RVO VFN64165 (Ministerstvo zdravotnictví ČR) a PRVOUK-P25/LF1/2 (1. lékařská fakulta Karlovy University v Praze). Literatura Aso E, Ferrer I.Cannabinoids for treatment of Alzheimer's disease: moving toward the clinic. Front Pharmacol. 2014 Mar 5;5:37. doi: 10.3389/fphar.2014.00037. eCollection 2014 Ballatore C, Lee VM, Trojanowski JQ. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 2007; 8(9): 663-672. Bazan NG, Colangelo V, Lukiw WJ. Prostaglandins and other lipid mediators in Alzheimer's disease. Prostaglandins Other Lipid Mediat 2002; 68–69: 197–210. Bazan NG. Neuroprotectin D1 (NPD1): a DHA-derived mediator that protects brain and retina against cell injury-induced oxidative stress. Brain Pathol. 2005; 15(2): 159-166. Bazan NG. Neuroprotectin D1-mediated anti-inflammatory and survival signaling in stroke, retinal degenerations, and Alzheimer‘s disease. J Lipid Res 2009; 50: S400–S405. Bjorkhem I, Meaney S. Brain cholesterol: long secret life behind a barrier. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 806–881. Bjorkhem I. Crossing the barrier: oxysterols as cholesterol transporters and metabolic modulators in the brain. J Intern Med. 2006; 260: 493–508. Bliss TV, Collingridge GL. A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus. Nature. 1993; 361(6407): 31-39. Braak H, Braak E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol 1991; 82: 239–259. Casarejos MJ, Perucho J,Gómez A, et al. Natural cannabinoids improve dopamine neuro transmission and tau and amyloid patology in a mouse model of tauopathy. J Alzheimers Dis 2013; 35: 525–539. Corder EH, Saunders AM, Risch NJ, et al. Protective effect of apolipoprotein E type 2 allele for late onset Alzheimer disease. Nat Genet 1994; 7: 180–184. Cunnane SC, Plourde M, Pifferi F, et al. Fish, docosahexaenoic acid and Alzheimer's disease. Prog Lipid Res. 2009; 48(5): 239-256. Dawson G, Goswami R, Kilkus J, et al. The formation of ceramide from sphingomyelin is associated with cellular apoptosis. Acta Biochimica Polonica. 1998; 45(2): 287–297. De Felice FG, Velasco PT, Lambert MP, et al. Aβ oligomers induce neuronal oxidative stress through an NMDA receptor-dependent mechanism that is blocked by the Alzheimer's drug memantine. J. Biol. Chem. 2007; 282(15): 11590-11601. Deckelbaum RJ, Worgall TS, Seo T. n-3 fatty acids and gene expression. Am J Clin Nutr 2006, 83(6 Suppl): 1520S–1525S. Dietschy JM, Turley SD. Cholesterol metabolism in the central nervous system during early development and in the mature animal. J Lipid Res. 2004; 45:1375–1397. Fagan AM, Holtzman DM, Munson G, et al. Unique lipoproteins secreted by primary astrocytes from wild type, apoE (-/-), and human apoE transgenic mice. J Biol Chem. 1999; 274(42): 30001-30007. Farooqui AA, Horrocks LA, Farooqui T. Interactions between neural membrane glycerophospholipid and sphingolipid mediators: a recipe for neural cell survival or suicide. J Neurosci Res. 2007; 85(9): 1834-1850. Farooqui AA, Ong WY, Farooqui T. Lipid mediators in the nucleus: Their potential contribution to Alzheimer's disease. Biochim Biophys Acta. 2010; 1801(8): 906-916. Farooqui AA. Lipid mediators and their metabolism in the nucleus: implications for Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 2012; 30(Suppl 2): S163-S178.
S14
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Frisardi V, Panza F, Seripa D, et al. Glycerophospholipids and glycerophospholipid-derived lipid mediators: a complex meshwork in Alzheimer's disease pathology. Prog Lipid Res. 2011; 50(4): 313-330. Goracci G, Ferrini M, Nardicchi V.Low molecular weight phospholipases A2 in mammalian brain and neural cells: roles in functions and dysfunctions. Mol Neurobiol. 2010; 41(2-3): 274-289. Gottfries CG, Karlsson I, Svennerholm L. Membrane components separate early-onset Alzheimer’s disease from senile dementia of the Alzheimer type. International Psychogeriatrics 1996; 8(3): 365–372. Grimm MO, Zimmer VC, Lehmann J, Grimm HS, Hartmann T. The Impact of Cholesterol, DHA, and Sphingolipids on Alzheimer’s Disease. Biomed Res Int. 2013; 2013:814390. Halliday G, Robinson SR, Shepherd C, Kril J.Alzheimer's disease and inflammation: a review of cellular and therapeutic mechanisms. Clin Exp Pharmacol Physiol. 2000; 27(1-2): 1-8. Han XL, Holtzman DM, McKeel DW Jr., et al. Substantial sulfatide deficiency and ceramide elevation in very early Alzheimer’s disease: potential role in disease pathogenesis. J Neurochem 2002; 82(4): 809–818. Han, XL.; Holtzman DM; McKeel DW Jr. Plasmalogen Deficiency in Early Alzheimer’s Disease Subjects and in Animal Models: Molecular Characterization Using Electrospray Ionization Mass Spectrometry. J. Neurochem. 2001; 77: 1168–1180. Harkany T, Mackie K, Doherty P. Wiring and firing neuronal networks: endocannabinoids take center stage. Curr Opin Neurobiol. 2008; 18(3): 338-345. Hashimoto M, Hossain S, Shimada T, Sugioka K, Yamasaki H, Fujii Y, Ishibashi Y, Oka J, Shido O. Docosahexaenoic acid provides protection from impairment of learning ability in Alzheimer‘s disease model rats. J Neurochem 2002; 81(5): 1084–1091. Haughey NJ, Bandaru VV, Bae M, Mattson MP. Roles for dysfunctional sphingolipid metabolism in Alzheimer's disease neuropathogenesis.Biochim Biophys Acta. 2010; 1801(8): 878-886. Hayashi H. Lipid metabolism and glial lipoproteins in the central nervous system. Biol Pharm Bull. 2011; 34(4): 453-461. Herz J. ApoE Receptors in the Nervous Systém. Curr Opin Lipidol. 2009; 20(3): 190–196. Chang EH, Rigotti A, Huerta PT. Age-related influence of the HDL receptor SR-BI on synaptic plasticity and cognition. Neurobiol Aging. 2009; 30(3): 407-419. Chen R, Zhang J, Fan N, et al. Δ(9)-THC-caused synaptic and memory impairments are mediated through COX-2 signaling. Cell 2013; 155: 1154–1165. Imbimbo BP, Solfrizzi V, Panza F. Are NSAIDs useful to treat Alzheimer's disease or mild cognitive impairment? Front Aging Neurosci. 2010; 2. pii: 19. doi: 10.3389/fnagi.2010.00019. Imhof A., Charnay Y, Vallet PG, et al. Sustained astrocytic clusterin expression improves remodeling after brain ischemia. Neurobiol. Dis. 2006; 22: 274-283. Innis SM. Dietary (n-3) fatty acids and brain development. J Nutr 2007; 137: 855–859. Jicha GA, Markesbery WR. Omega-3 fatty acids: potential role in the management of early Alzheimer‘s disease. Clin Interv Aging 2010; 5: 45–61. Johnson EJ, Schaefer EJ. Potential role of dietary n-3 fatty acids in the prevention of dementia and macular degeneration. Am J Clin Nutr. 2006, 83(6 Suppl):1494S-1498S. Jonsson M, Zetterberg H, Rolstad S, et al. Low Cerebrospinal Fluid Sulfatide Predicts Progression of White Matter Lesions—The LADIS Study. Dementia Geriatr Cognit. Disord. 2012; 34: 61–67. Kalaany NY, Mangelsdorf DJ. LXRS and FXR: the yin and yang of cholesterol and fat metabolism. Annu Rev Physiol. 2006; 68: 159-191.
S15
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Kawano T, Anrather J, Zhou P, et al. Prostaglandin E2 EP1 receptors: downstream effectors of COX-2 neurotoxicity. Nat Med. 2006; 12(2): 225-229. Kitajka K, Puskas LG, Zvara A, et al. The role of n-3 polyunsaturated fatty acids in brain: modulation of rat brain gene expression by dietary n-3 fatty acids. Proc Natl Acad Sci U S A2002; 99(5): 2619–2624. Kivipelto M, Helkala EL, Hanninen T, et al. Midlife vascular risk factors and late-life mild cognitive impairment: A population-based study. Neurology 2001; 56(12): 1683–1689. Kojro E, Gimpl G, Lammich S, et al. Low cholesterol stimulates the nonamyloidogenic pathway by its effect on the alpha -secretase ADAM 10. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001; 98(10): 5815-5820. Kosicek A, Hecimovic S. Phospholipids and Alzheimer’s Disease: Alterations,Mechanisms and Potential Biomarkers. Int. J. Mol. Sci. 2013; 14: 1310-1322. Kotti TJ, Ramirez DM, Pfeiffer BE, et al. Brain cholesterol turnover required for geranylgeraniol production and learning in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006;103:3869–3874 Lee T, Xu J, Lee JM, et al. Amyloid-β peptide induces oligodendrocyte death by activating the neutral sphingomyelinase-ceramide pathway. Journal of Cell Biology. 2004; 164(1): 123–131. Liu CC, Kanekiyo T, Xu H, Bu G. Apolipoprotein E and Alzheimer disease: risk, mechanisms and therapy. Nat.Rev.Neurol 2013; 9: 106–118. Lukiw WJ, Cui JG, Marcheselli VL, et al. A role for docosahexaenoic acid-derived neuroprotectin D1 in neural cell survival and Alzheimer disease. J Clin Invest. 2005; 115(10): 2774-2783. Ma QL, Teter B, Ubeda OJ, et al. Omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid increases SorLA/LR11, a sorting protein with reduced expression in sporadic Alzheimer‘s disease (AD): relevance to AD prevention. J Neurosci 2007; 27(52): 14299–14307. Mahley RW, Huang Y. Apolipoprotein e sets the stage: response to injury triggers neuropathology. Neuron 2012; 76: 871–885. Mahley RW, Huang Y, Weisgraber KH. Putting cholesterol in its place: ApoE and reverse cholesterol transport. J Clin Invest 2006; 116: 1226–1229. Mahley RW. Apolipoprotein E: cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science. 1988; 240(4852): 622-630. Marcheselli VL, Hong S, Lukiw WJ, et al. Novel Docosanoids Inhibit Brain IschemiaReperfusion-mediated Leukocyte Infiltration and Pro-inflammatory Gene Expression. J Biol Chem. 2003; 278(44): 43807–43817. Martín V, Fabelo N, Santpere G, et al. Lipid alterations in lipid rafts from Alzheimer's disease human brain cortex. J Alzheimers Dis. 2010; 19(2): 489-502. Mateos L, Akterin S, Gil-Bea FJ, et al. Activity-regulated cytoskeleton-associated protein in rodent brain is down-regulated by high fat diet in vivo and by 27-hydroxycholesterol in vitro. Brain Pathol 2009; 19(1): 69–80. McNamara RK, Carlson SE. Role of omega-3 fatty acids in brain development and function: potential implications for the pathogenesis and prevention of psychopathology. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 2006; 75(4-5): 329-349. Mielke MM, Bandaru VV, Haughey NJ, et al. Serum ceramides increase the risk of Alzheimer disease: the Women's Health and Aging Study II. Neurology. 2012; 79(7): 633–641. Mielke MM, Haughey NJ, Bandaru VVR, et al. Plasma sphingomyelins are associated with cognitive progression in alzheimer’s disease. Journal of Alzheimer’s Disease. 2011; 27(2): 259–269.
S16
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Mielke MM, Zandi PP, Sjogren M et al. High total cholesterol levels in late life associated with a reduced risk of dementia. Neurology 2005; 64(10): 1689–1695. Nieweg K., Schaller H. and Pfrieger F. W.. Marked differences in cholesterol synthesis between neurons and glial cells from postnatal rats. J. Neurochem 2009; 109(1): 125-134. Panza F, D'Introno A, Colacicco AM, Capurso C, Pichichero G, Capurso SA, Capurso A, Solfrizzi V. Lipid metabolism in cognitive decline and dementia. Brain Res. Rev. 2006; 51(2): 275–292. Parihar MS, Hemnani T. Alzheimer's disease pathogenesis and therapeutic interventions.J Clin Neurosci 2004; 11(5): 456-467. Pepicelli O, Fedele E, Berardi M, Raiteri M, Levi G, Greco A, Ajmone-Cat MA, Minghetti L. Cyclo-oxygenase-1 and -2 differently contribute to prostaglandin E2 synthesis and lipid peroxidation after in vivo activation of N-methyl-D-aspartate receptors in rat hippocampus. J Neurochem. 2005; 93(6): 1561-1567. Pooler AM, Arjona AA, Lee RK, Wurtman RJ. Prostaglandin E2 regulates amyloid precursor protein expression via the EP2 receptor in cultured rat microglia. Neuroscience Letters 2004; 362: 127–130. Qin W, Ho L, Pompl PN, et al. Cyclooxygenase (COX)-2 and COX-1 potentiate beta-amyloid peptide generation through mechanisms that involve gammasecretase activity. J Biol Chem 2003, 278: 50970–50977. Rebeck GW, Bradley T. Hyman BT. Lipoprotein Receptors in Brain. (In) Clusterin in Normal Brain Functions and During Neurodegeneration, Caleb E. Finch (Ed) , R.G. Landes Company1999. Reitz C & Mayeux R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers Biochem Pharmacol. 2014; 88(4): 640-651. Serhan CN, Krishnamoorthy S, Recchiuti A, Chiang N. Novel Anti-Inflammatory -- ProResolving Mediators and Their Receptors Curr Top Med Chem 2011; 11(6): 629–647. Serhan CN, Yang R, Martinod K, et al. Maresins: novel macrophage mediators with potent antiinflammatory and proresolving actions. J Exp Med. 2009; 206(1): 15-23. Schaefer EJ, Bongard V, Beiser AS, et al. Plasma phosphatidylcholine docosahexaenoic acid content and risk of dementia and Alzheimer disease: the Framingham Heart Study. Arch Neurol. 2006; 63(11): 1545-1550. Scherzer CR, Offe K, Gearing M, et al. Loss of apolipoprotein E receptor LR11 in Alzheimer disease. Arch Neurol. 2004; 61(8): 1200–1205. Strokin M, Sergeeva M, Reiser G. Docosahexaenoic acid and arachidonic acid release in rat brain astrocytes is mediated by two separate isoforms of phospholipase A2 and is differently regulated by cyclic AMP and Ca2+. Br J Pharmacol. 2003; 139(5): 10141022. Takahashi RH, Almeida CG, Kearney PF, et al. Oligomerization of Alzheimer's beta-amyloid within processes and synapses of cultured neurons and brain. J Neurosci. 2004; 24(14): 3592-3599. Traynor BJ, Singleton AB. Nature versus nurture: death of a dogma, and the road ahead. Neuron. 2010, 68:196-200, Villeneuve S, Brisson D, Marchant NL, Gaudet D The potential applications of Apolipoprotein E in personalized medicine. Front Aging Neurosci. 2014; 6:154. doi: 10.3389/fnagi.2014.00154. eCollection 2014 Wainwright P. Nutrition and behaviour: the role of n-3 fatty acids in cognitive function. Br J Nutr 2000, 83(4): 337–339. Wolf H, Grunwald M, Kruggel F, et al. Hippocampal volume discriminates between normal cognition; questionable and mild dementia in the elderly. Neurobiol. Aging 2001; 22(2), 177–186.
S17
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Wuwongse S, Chang RC, Law AC. The putative neurodegenerative links between depression and Alzheimer's disease. Prog. Neurobiol 2010, 91:362-375. Xu Q, Bernardo A, Walker D, et al. Profile and regulation of apolipoprotein E (ApoE) expression in the CNS in mice with targeting of green fluorescent protein gene to the ApoE locus. J Neurosci. 2006; 26(19): 4985-4994. Yang R, Chiang N, Oh SF, Serhan CN. Metabolomics-Lipidomics of Eicosanoids and Docosanoids Generated By Phagocytes . Curr Protoc Immunol. Nov 2011; CHAPTER: Unit–14.26. Zhou Q, Sheng M. NMDA receptors in nervous system diseases. Neuropharmacology. 2013; 74: 69-75.
S18
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA NOVÉ LIPIDOVÉ MEDIÁTORY: JEJICH PATOFYZIOLOGIE A KLINICKÝ VÝZNAM A. Žák, M. Vecka, M. Zeman, E. Tvrzická IV. interní klinika 1. lékařské fakulty University Karlovy a Všeobecné fakultní nemocnice v Praze Souhrn Akutní zánětlivá reakce je uniformní adaptační odpověď organismu na porušení jeho integrity iniciovaná humorálními faktory (cytokiny, prozánětové lipidové mediátory) a hypotalamopituito-adrenální osou. Za fyziologického stavu je účelnou obrannou reakcí, která spontánně odeznívá. Vystupňování místní akutní zánětlivé reakce a do její generalizované formy přestavuje syndrom systémové zánětové odpovědi (SIRS). Spuštění prozánětových dějů je zásadní život zachraňující reakcí, avšak přestřelení této reakce při nedostatečné funkci protizánětových mediátorů má stejně neblahé důsledky jako selhání reakce prozánětové. Jestliže protizánětová reakce není včas zpomalena a zabrzděna, vyvine se kritický katabolický stav charakterizovaný zánětovou mediátorovou a cytokinovou bouří s následným orgánovým selháním. Současně se SIRS se iniciuje soubor dějů známý jako syndrom kompenzační protizánětové odpovědi (CARS), který představuje systém negativních zpětných vazeb cytokinové sítě, endokrinních dějů i aktivitu působků neproteinové povahy – lipidových mediátorů, mezi které zahrnujeme, kromě klasických prostanoidů, také hepoxiliny, protektiny, resolviny a maresiny. Tvorba protizánětových lipidových mediátorů závisí především na dostupnosti jejich prekurzorů, zejména EPA a DHA, na jejich konverzi na cílové mediátory, jejich transportu i dostupnosti v buněčných membránách. V současné době je také sledována role protizánětových lipidových mediátorů u chronických subklinických zánětů provázejících metabolická onemocnění jako je obezita, metabolický syndrom, diabetes mellitus, nealkoholová steatohepatitida a neurodegenerativní onemocnění. Předpokládá se, že dysregulace protizánětových procesů by mohla významně přispívat k iniciaci i udržování zánětu u chronických metabolických chorob. Úvod Zánět je ustálená forma obranné a reparativní reakce vaskularizovaných tkání organismu, vedoucí k eliminaci příčiny poškození buněk a tkání, odstranění poškozených tkání a následné náhradě tkáňových defektů regenerací nebo reparací. Pod pojmem zánět se rozlišuje několik termínů odrážejících tento stav. Mluví se jednak o reakci akutní fáze, kterou se rozumí soubor fyziologických dějů obranné a reparační povahy, které doprovázejí tkáňové poškození rozličné etiologie. Reakce akutní fáze představuje souhrn změn iniciovaných humorálními faktory, především cytokiny (a prozánětovými lipidovými mediátory) a hypotalamo-pituitoadreální osou. Reakce akutní fáze zahrnuje děje imunitní, endokrinní a metabolické. Za fyziologického stavu je účelnou obrannou reakcí, která je rozsahem i časově limitovaná. Jejím cílem je udržení homeostázy (vodní, elektrolytové a tepelné), zajištění protiinfekčních dějů, odstranění poškozené tkáně a dodávka energie a sloučenin nezbytných pro tvorbu protilátek, enzymů, hormonů i pro reparační a regenerační děje (Maruna 2004, Povýšil 2011). Vystupňování místní akutní zánětlivé reakce do její generalizované formy přestavuje syndrom systémové zánětové odpovědi (SIRS, systemic inflammatory response syndrom). Jedná se o obrannou reakci, jejímž cílem je lokalizace a eliminace patogenu. Spuštění prozánětových dějů je zásadní život zachraňující reakcí, avšak přestřelení této reakce při nedostatečné funkci protizánětových mediátorů má stejně fatální důsledky jako selhání reakce prozánětové. Jestliže protizánětová reakce není včas zpomalena a zabrzděna, vyvine se
S19
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA kritický katabolický stav charakterizovaný zánětovou mediátorovou a cytokinovou bouří s následným orgánovým selháním. Spuštění prozánětových procesů je zásadní život zachraňující reakcí, avšak přestřelení této reakce při nedostatečné funkci protizánětových mediátorů má stejně fatální důsledky jako selhání reakce prozánětové. Současně se SIRS se iniciuje soubor dějů známý jako syndrom kompenzační protizánětové odpovědi (CARS, compensatory antiinflammatory response syndrom), který představuje systém negativních zpětných vazeb cytokinové sítě, endokrinních dějů i aktivity působků neproteinové povahy – lipidových mediátorů, mezi které zahrnujeme, kromě klasických prostanoidů, také hepoxiliny, protektiny, resolviny a maresiny. Intenzita a průběh zánětové odpovědi je určena rovnováhou pro- a proti-zánětových faktorů na lokální i celkové úrovni. Vedle cytokinů s prozánětovým působením se v iniciálním stádiu obranných dějů uplatňují kontraregulační děje. Poměr mezi SIRS a CARS určuje rovnováhu mezi obrannou zánětovou odpovědí na straně jedné a „endogenní imunosupresí“ i endogenními protizánětlivými a prorezolučními procesy na straně druhé. Prakticky se jedná o to, kdy dojde k vyhojení zánětu ad integrum (resolucí zánětu) a za jakých okolností vznikne chronický zánět se zhojením fibrózou. A konečně, za jakých podmínek dojde k dysregulaci generalizované zánětové reakce a vzniku jejích těžkých klinických forem spojených s orgánovou dysfunkcí (MODS, ARDS, sepse). V klinické praxi se setkáváme s kombinovanými pro- (SIRS) a protizánětovými stavy (CARS), která se označuje jako syndrom smíšené adaptační odpovědi (MARS, mixed antagonist response syndrom). Klinicky se jedná o trvalý stav, který je kombinací či narušením obou dějů s kardiovaskulárním selháním, orgánovou dysfunkcí a imunosupresí. Kompenzační protizánětová odpověď zahrnuje několik dějů: (1) aktivaci hypothalamo-pituitoadrenální osy a nadprodukcí glukokortikoidů; (2) účinky cytokinů s protizánětovým působením [(IL-4, IL-10, IL-13)], TGFβ, afunkční cytokiny s antagonistickým působením (IL-1ra), (3) solubilní receptory vyvazující cirkulující cytokiny (sTNFRp55, sTNFRp75, sIL2R), (4) kompetici cytokinů na úrovni společných receptorových podjednotek, (5) „downregulaci membránových buněčných receptorů; (6) účinky lipidových mediátorů s protizánětovým působením (lipoxinů, resolvinů, protektinů a maresinů) (Maruna 2004; Kumar et al. 2010; Serhan 2014). K protagonistům zánětu (resp. zánětové reakce) patří endotel, trombocyty, leukocyty, bílkoviny plasmy včetně komplementu. Významné místo v zánětové reakci mají proteiny akutní fáze a cytokiny. Proteiny akutní fáze (APP) jsou plasmatické bílkoviny tvořené převážně v játrech, jejichž tvorba a uvolnění do cirkulace je regulována prozánětovými cytokiny, především působením TNFα, IL-1β a IL-6 nebo jejich kombinací. Mezi základní skupiny pozitivních APP patří pentraxiny, (CRP, SAP), SERPINy (AAT, AACT, PCI, PAI-1, AP), metalopreoteinásy (Cpl, Hp, Hpx, SOD), imunomodulační proteiny (AGP, AM), koagulační faktory (Fng, vWf), složky komplementu (C3,C4, a další), mezi negativní APP se řadí viscerální proteiny (albumin, prealbumin, transferin, RBP a další). Cytokiny jsou zánětové mediátory, které koordinovaně s hormony a proteiny akutní fáze působí v zánětové reakci a vytvářejí signální síť. Cytokiny představují rozsáhlou skupinu signálních molekul polypeptidové struktury (Mr < 80 kDa) s převážně parakrinními a autokrinními účinky. Některé z nich s výrazným prozánětovým působením v průběhu SIRS vykazují endokrinní působení (IL-6, IL-1β, TNFα). Stejný cytokin může být produkován různými buňkami, a naopak a jeden typ buněk může syntetizovat různé typy cytokinů. Cytokiny se rozdělují se na interferony, kolonie stimulující faktory (CSF), chemokiny a interleukiny. Většina z nich vykazuje stimulační vliv na zánětové projevy, jiné tlumivý vliv na zánětové reakce a inhibují biologické působení monocytů (resp. makrofágů). Mezi cytokiny s protizánětovým působením se zařazují IL-4, IL-10 a IL-13 (Maruna 2004, Serhan 2014).
S20
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Rozdělení zánětu je možné na zánět akutní (lokální), kdy zánětový reakce probíhá ohraničeně (v částech organismy nebo orgánech a systémech) a zánět systémový, kdy zánětová reakce neohraničeně. Dále je možné rozdělit na zánět akutní a zánět chronicky, či na zánět obranný či autoagresivní podle výsledného efektu zánětu na postižené tkáně či organismus. V dalším průběhu zánětu může dojít k vývoji v několika směrech. V optimálním případě dochází ke kompletnímu vyhojení (zhojení ad integrum) zánětového procesu (resolution), které je možné za předpokladu eliminace příčiny zánětu a včasného zastavení zánětové reakce. Ustanou příznaky zánětu, obnoví se původní architektura tkání s regenerací buněk, cévního zásobení a extracelulární matrix. Další možností je vyhojení jizvou, kdy výsledkem zánětu v případě ireverzibilního poškození místních struktur je plně funkční tkáň nahrazena tkání neplnohodnotnou. Konečně zánětový proces při perzistence příčiny zánětu a dysregulaci pro- a protizánětových dějů může přecházet v zánět chronický. Přetrvává infiltrace leukocytů, destrukce tkáně. Chronický zánět je dále charakterizován angiogenezí, infiltrací mononukleárními buňkami, jizvením (fibrózou) a progresivním poškozením funkční tkáně (Povýšil 2011, Kumar et al. 2010). Význam a postavení lipidových mediátorů v procesu zánětu Časová a místní souhra mezi prozánětovými a protizánětovým faktory a ději (SIRS a CARS) je podmínkou vyhojení zánětu ad integrum a zabránění eskalace systémového zánětu do multiorgánového selhání. Význam prozánětových lipidových mediátorů − prostanoidů (prostaglandinů, tromboxanů a leukotrienů) v patogeneze zánětu je znám dlouhou dobu. Dříve se zastavení prozánětových dějů považovalo za pasivní, spontánně mizející proces (self-limited děj), na kterém se podílela především disipace prozánětlivých mediátorů (Serhan 2007). Tabulka 1 podává přehled hlavních mediátorů účastnících se jednotlivých pochodů v zánětové reakci. V poslední době je známo, že ukončení zánětu, resp. lokální akutní zánětové odpovědi je proces aktivní, který je spuštěn současně se začátkem prozánětových procesů. Je známo, že vícenenasycené mastné kyseliny (PUFA) řady n-6 a především n-3 [kys. eikosapentaenová (EPA, C20:5n-3) a kys. dokosahexaenová (DHA, C22:6n-3)] jsou prekurzory nové skupiny lipidových mediátorů, které mají účinnost protizánětovou a prorezoluční (Serhan 2008; Serhan et al. 2009). V anglosaské literatuře se nazývají specializované pro-resoluční mediátory (SPM, specialized pro-resolving mediators). Do skupiny těchto signálních lipidových molekul se zařazují eikosanoidy (molekuly s 20 atomy C) a dokosanoidy (molekuly s 22 atomy C). Jedná se o skupiny působků secernovaných imunitními buňkami – tkáňovými makrofágy, dendritickými buňkami, neutrolily a žírnými buňkami. Eikosanoidy jsou syntetizovány z PUFA n-6, především z kyseliny arachidonové (AA, C20:4n-6). Eikosanoidy působí parakrinně a mají integrální funkci při zánětovém procesu, která spočívá v zajištění komunikace mezi imunokompetentními buňkami a cévním řečištěm, koordinací imunitní odpovědi, indukci transportu leukocytů do ložiska zánětu (Kumar et al. 2010; Liu et al. 2014). Do skupiny specializovaných pro-rezolučních mediátorů se zahrnují lipoxiny, resolviny, protektiny a maresiny. Lipoxiny Substrátem pro syntézu lipoxinu A4 (LXA4) je kys. arachidonová (AA, C20:4n-6). Lipoxin A4 byl prvním objeveným pro-resolučním mediátorem. U lidí byl popsán v epitelu zažívacího ústrojí, bronchiálního stromu, kde vzniká při interakci epitelových buněk s leukocyty. Během lokalizovaného zánětu představují PMN první obrannou linií buněk proti infekci. Po úmrtí PMN nekrózou či apoptózou jsou LX signálem makrofágům k fagocytóze odumřelých PMN. Biologické účinky pro-resolučních lipidových mediátorů syntetizovaných z AA zahrnují celou škálu prozánětových i protizánětových dějů. Lipoxiny syntetizované z kyseliny
S21
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA arachidonové mají chemoatrakční působení, aktivují infiltraci neutrofilních granulocytů (PMN) do ložiska zánětu, ale bez stimulace uvolňování prozánětových cytokinů a bez aktivace prozánětových genů. Rovněž stimulují vychytávání PMN podlehlých apoptóze a aktivují endogenní antimikrobiální obranné mechanismy. Lipoxiny jsou vysoce účinné protizánětová mediátory a jejich koncentrace v tkáních dosahuje piko- až nano- gramových koncentrací. Lipoxiny limitují adhezi PMN v zánětovém ložisku a jeho infiltraci. Jsou nezbytné k zastavení PMN zprostředkovaného poškození tkání (Serhan 2009, Rius et al. 2012, Claria et al. 2012). Na obrázku 1 je znázorněna chemická struktura lipoxinů A4. Během zánětu je AA konvertována působením 15-lipoxygenázy (15-LOX) na 15S-HETE (hydroxyeikosatetraenovou kyselinu), která je rychle přeměněna působením 5-LOX na LXA4 a LXB4. K tvorbě 15 epi-LXA4 a 15epi epi-LXB4 dochází působením cyklooxygenáza-2 (COX-2) po acetylací jejího aktivního centra kys. acetylsalicylovou (aspirin-triggered formy lipoxinů) (Rius et al. 2012; Spite et al. 2014). Resolviny Tato skupina patří do nové rodiny protizánětových mediátorů syntetizovaných z PUFA řady n-3. Byly izolovány a identifikovány v resorbujících se exsudátech ložisek zánětu. Termínem resolvin neboli resolution phase interaction products jsou endogenní mediátory syntetizované z EPA a DHA. Existují dvě rodiny resolvinů, resolviny série E (RvE) syntetizované z EPA a série D (RvD) syntetizované z DHA. Syntéza RvE1 z EPA probíhá za účasti cytochromu P450 (CYP450) a 5-LOX přes 18R-hydroperoxy-eikosapentaenovou kyselinu na 5S-hydroperoxy-18R-hydroxy-EPE, ze které redukcí vzniká RvE2. Z 5S-hydroperoxy-18R-hydroxy-EPE je generován 5S(6) epoxy-18hydroxy-EPE, ze které vnesením další hydroxyl skupina vzniká RvE1 (5,12,18R-trihydroxy-eikosapentaenová kyselina). Z DHA sekvenčním působením leukocytární 5-LOX vznikají lipoxygenázové produkty 17S-H(p)DHA, následně epoxidové intermediární produkty a RvD1 až RvD4. Resolviny mají protizánětové a imunoregulační působení, které spočívá v blokádě působení prozánětových mediátorů a regulace transportu leukocytů (chemotaxe, adherence na endotel, diapedéza do intersticia a koncentrace leukocytů v místě zánětu). Resolviny zastavují infiltraci tkání PMN a jejich migraci. V buňkách mikroglie potlačují expresi cytokinů. Již na nanogramových koncentracích potlačují biologické účinky PMN zhruba na polovinu. Resolvin E1 in vitro potlačuje aktivaci NF-κB v izolovaných PMN a in vivo snižuje infiltraci PMN v zánětovém ložisku. Dále potlačuje migraci dendritických buněk a jejich produkci IL-12. V krevních mononukleárech RvE2 aktivuje MAPK. Dále snižuje obliteraci cév a neovaskularizaci sítnice (Serhan a Chiang, 2008; Serhan 2009; Claria et al. 2012). Protektiny Jsou novou rodinou protizánětových mediátorů syntetizovaných z DHA samostatnou metabolickou cestou. Charakteristická je jejich chemická struktura sestávající z konjugovaných trienů. Název protektiny je odvozen z jejich protizánětového a protektivního účinku. Předložka neuroprotektiny označuje místo jejich syntézy v nervové tkáni. Protektiny mají účinky podobné resolvinům. Neuroprotektiny (NPD1) v experimentu potlačují poškození rohovky a sítnice i ischémii mozku. Na obrázku 2 je znázorněna chemická struktura protektinů i jejich syntéze z DHA. Protektiny (resp. neuroprotektiny) vznikají působením lipoxygenáz (obsažených v mozku, mikroglie a sítnici) za vzniku meziproduktu [17SH(p)DHA] který následně enzymaticky epoxydován a hydrolyzován na konečný produkt − NPD1 (resp. PD1). Kromě protizánětového a imunomodulačního působení potlačuje dopady ischemicko-reperfúzního syndromu v mozku a ledvinách (Serhan a Chiang 2008; Rius et al. 2012). Příznivé působení resolvinů a protektinů bylo popsáno v řadě experimentálních modelů zánětu (periodontitida, peritonitida, kolitida, ischemické mozkové cévní příhody, ischemickoreperfusní poškození ledvin, astma bronchiale) u laboratorních zvířat. V klinických studiích
S22
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA bylo popsáno snížení koncentrace PD1 u astmatiků a pokles produkce NPD1 u Alzheimerova choroby. Maresiny Jsou novou skupinou protizánětových mediátorů vznikajících z DHA v makrofázích. Maresiny neboli macrophage mediators in resolving inflammation mají biologické účinky podobné RvE1 a PD1. Aktivované makrofágy jsou schopny z DHA nebo z 14S-hydroperoxydocosa 4Z, 7Z, 10Z, 12E, 16Z, 19Z-hexaenové kyseliny na maresiny za enzymatické katalýzy 14-lipoxygenázou. Obrázek 2 ukazuje chemickou strukturu maresinů a syntézu maresinů za účasti 12-LOX a 5-LOX. Význam lipidových mediátorů v experimentu a klinice Existuje řada převážně experimentálních i klinických studií zabývajících se rolí protizánětových a pro-resolučních mediátorů u chronických metabolických chorob a patologických stavů jako je obezita, metabolický syndrom, hypercholesterolémie, klinická ateroskleróza, diabetes mellitus, nealkoholová steatóza jater, steatohepatitida a neurodegenerativní onemocnění (Spite et al. 2014). Předpokládá se, že významnou roli v iniciaci udržování chronického zánětu u těchto chorob hraje dysfunkce leukocytů, nadbytek nutrientů a zvýšené koncentrace glukózy a neesterifikovaných mastných kyselin. Deficit pro-resolučních a protizánětových mediátorů byl popsán u chronického subklinického zánětu tukové tkáně obézních. V tukové tkáni obézních myší a lidské tukové tkáni byl popsán pokles syntézy resolvinů (RvD1 a RvD2) syntetizovaných z DHA. Inkubace tukové tkáně s RvD1 a RvD2 zvyšuje expresi adiponektinu a je spojena potlačením produkce a sekrece prozánětových cytokinů – leptinu, TNFα, IL-6 a IL-1α (Claria et al. 2012). Plasmatické koncentrace LXA4 u pacientů s aterosklerózou koronární a periferních tepen negativně korelovaly rozsahem aterosklerózy periferních tepen (Ho et al. 2010). U diabetes mellitus 1. typu (DMT1) a DM2T hyperglykémie, zvýšené koncentrace volných mastných kyselin a oxidační stres se spolupodílí na defektní fagocytóze apoptóze podlehlých buněk i mikroorganismů. Tyto pochody participují na defektním hojení ran a zvýšené náchylnosti diabetiků k infekcím. Dysregulace protizánětových a proresolučních faktorů se předpokládá při rozvoji nealkoholové jaterní steatózy a jejím přechodu do nealkoholové steatohepatitidy a v patogeneze jaterní fibrózy (Rius et al. 2012). Obrázek 1 Chemická struktura a syntéza hepoxilinů
Upraveno volně podle Rius et al. 2012, Serhan 2014, Spite et al. 2014
S23
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Obrázek 2 Chemická struktura a syntéza resolvinů, protektinů a maresinů
Upraveno volně podle Rius et al. 2012, Serhan 2014, Spite et al. 2014 Tabulka 1 Funkce mediátorů v různých procesech zánětové reakce Funkce v zánětové reakci vasodilatace
Zvýšená permeabilita cévní
Leukocyty - chemotaxe - infiltrace - aktivace Horečka
Poškození tkání
Účast mediátorů PG NO histamin histamin, serotonin C3a, C5a bradykinin LTC4, LTB4, LTE4 PAF substance P TNFα, IL-1, IL-6 chemokiny C3a, C5a, LTB4 IL-1, TNFα PGI2, PGE2, PGD2 bradykinin lysosomální enzymy RONS NO
Použité zkratky: NO – oxid dusnatý; PG – prostaglandin;C3a – aktivovaná 3 složka komplementu; LT – leukotrien, PAF – faktor aktivující destičky, TNF – tumor nekrotizující faktor; IL – interleukin; RONS – reaktivní sloučeniny kyslíku a dusíku Práce byla podpořena výzkumnými projekty: RVO VFN64165 (Ministerstvo zdravotnictví ČR) a PRVOUK-P25/LF1/2 (1. lékařská fakulta Karlovy University v Praze).
S24
ATHEROSKLEROSA__________________2014__________________ATHEROSKLEROSA Literatura Povýšil C. Zánět. (In) Obecná patologie (C. Povýšil, I. Steiner, Eds.) Galén, Praha 2011, s. 75-106. Maruna P. Proteiny akutní fáze. Fyziologie - diagnostika - klinika. Jessenius Maxdorf, Praha 2004, 282 s. Kumar V, Abbas AK, Fausto N, Aster JC. Acute and chronic inflammation. (In) Robbins Cotran Pathologic Basis of Disease. Saunders Elsevier, Philadelphia 2010, s. 43-77. Serhan CN. Systems approach to inflammation resolution: identification of novel antiinflammatory and pro-resolving mediators. J Thromb Haemost 2009; 7(Suppl.): 44-48. Serhan CN. Resolution phase of inflammation: novel endogenous anti-inflammatory and proresolving lipid mediators. Annu Rev Immunol 2007; 25: 101-137. Serhan CN, Chiang N. Endogenous pro-resolving and anti-inflammatory lipid mediators. Br J Pharmacol 2008; 153: S200-S215. Liu S, Alexander RK, Lee C-H. Lipid metabolites as metabolic messengers in inter-organ communication. Trends Endocrionol Metab 2014; 25: 356-363. Claria J, Dalli J, Yacoubian S, et al. Resolvin D1 and resolvin D2 govern local inflammatory tone in obese fat. J Immunol 2012; 189: 2597-2605. Rius B, López-Vicario C, González-Périz A, et al. Resolution of inflammation in obesityinduced liver disease. Front Immunol 2012; 3: article 257. Serhan CN. Pro-resolving lipid mediators are leads for resolution physiology. Nature 2014; 510: 92-99. Spite M, Claria J, Serhan CN. Resolvins, specialized proresolving lipid mediators, and their potential roles in metabolic disease. Cell Metab 2014; 19: 21-36. Ho KJ, Spite M, Owens CD, et al. Aspirin-triggered lipoxin and resolvin E1 modulate vascular smooth muscle phenotype and correlate with peripheral atherosclerosis. Am J Pathol 2010; 177: 2116-2123.
S25
