A személyre szabott orvoslás lehetőségei a lymphoproliferativ kórképek és az autoimmun betegségek kezelésében Váróczy László dr. Debreceni Egyetem OEC, Belgyógyászati Intézet, III. sz. Belgyógyászati Klinika Szodoray Lajos Ösztöndíj bemutatkozó előadás 2011. november 14.
Malignus lymphoproliferativ kórképek vagy lymphomák
az immunrendszer heterogén, daganatos megbetegedései
az összes malignitás 4-5 %-a
WHO felosztás: - B-sejtes - T-sejtes - Hodgkin
bővülő terápiás paletta, jobb gyógyulási feltételek - új generációs citosztatikumok: purin analógok, bendamustin, liposzomális készítmények - monoklonális antitestek: rituximab, ofatumumab, aletuzumab, elotuzumab - radio-immunoterápia: Zevalin, Bexxar - egyéb: proteasoma gátlók, angiogenezis gátlók, mTOR inhibitorok, hiszton-deacetiláz gátlók, immunokonjugátumok
Rizikó stratifikáció kezelés előtt
Hagyományos score rendszerek - NHL: International Prognostic Index életkor, stádium, ECOG, extranodalis érintettség, ECOG - myeloma: ISS albumin, béta-2-mikroglobulin Nem tisztázott, individuális tényezők – genetika?
Személyre szabott gyógyítás lehetősége?
2008-2011 Mecenatura projekt Az Fc-gamma- receptor IIIa polimorfizmus és a génexpressziós profil jelentőségének vizsgálata diffúz nagy Bsejtes lymphoma esetén
A CD20 antigén
Pre-B sejt stádiumtól kezdve, a plasmasejtekről már eltűnik változó denzitásban expresszálódik 4 db membránt átivelő domain „shedding” nem jellemző, solubilis CD20 molekulát csak CLL esetén figyeltek meg ligandja nincs, funkciója kérdéses (Ca-influx?, sejtciklusszabályozás?, apoptosis?)
A Rituximab és hatásai
az elmúlt 10 év legsikeresebb gyógyszere a B-sejtes lymphomák terápiájában IgG1 típusú anti-CD20 monoklonális ellenanyag humán konstans és egér variabilis régió ADCC reakció komplement mediált sejtlízis direkt apoptózis indukció (caspase-8, caspase-9, Cainflux, bcl-2) „vakcinációs hatás” (dendritikus sejtek
Az Fc gamma receptor (CD16)
Az ADCC reakció effektor sejtjeinek felszínén (NK, macrophag)
I, II és III típus
Az 1. kromoszóma hosszú karján 8 gén kódolja
allél polimorfizmusok lehetősége, mely a funkcióban is megmutatkozhat autoimmun kórképekre való hajlam?
Fc gamma receptor IIIa polimorfizmus és NK-sejt aktivitás
A 158. pozicióban levő aminosav lehet Val és Phe In vitro körülmények között létrehozott ADCC reakció eltérő az NK-sejt aktivitás a V/V, V/F és F/F genotípusú emberek mintáiban Fekete: F/F genotípus Fehér: V/V genotípus Koene, H. R. et al. Blood 1997;90:1109-1114
ADCC intenzitás és Rituximab kötődés az FCGR3A polimorfizmus tükrében
Hatjiharissi, E. et al. Blood 2007;110:2561-2564
Follicularis lymphoma és Rituximab monoterápia (2002)
-
-
49 beteg, korábban kezeletlen populáció FCGR3A polimorfizmus meghatározás 4 dózis Rituximab (375 mg/m2 az 1.,8.,15.,22. napokon Bcl2-JH génátrendeződés vizsgálat 2 és 12 hónappal a terápia után Objektív terápiás válasz 2 hónap: 100 % (V/V) vs 67 % (V/A és A/A) 12 hónap: 90 % (V/V) vs 51 % (V/A és A/A) Cartron, G. et al. Blood 2002;99:754-758
p=0,031
DLBCL és R-CHOP kezelés
113 beteg V/V genotípus esetén jobb terápiás válasz De nem jobbak a túlélési eredmények
Kim, D. H. et al. Blood 2006;108:2720-2725
CLL és Rituximab monoterápia
Mindössze 30 vizsgált beteg
4 héten keresztül, heti 3x-i dózis Rituximab
Nem volt különbség a V/V, V/F és V/A csoport között a PR-t elértek arányában
Blood, Vol. 103, Issue 4, 1472-1474, February 15, 2004
Follicularis lymphoma és R-CHOP kezelés
94 újonnan diagnosztizált FL beteg
6 ciklus R—CHOP kezelés
Nincs szignifikáns különbség a remissziós ráta és a túlélési görbék tekintetében
Carlotti, E et al: FcgRIIIa and FcgRIIA polymorphisms do not predict clinical outcome of follicular non-Hodgkin’s lymphoma patients treated with sequential CHOP and rituximab Haematologica 2007; 92: 1127-1130
A diffúz nagy B-sejtes lymphoma génexpressziós profil szerinti felosztása +
GCB
-
Mum 1
+
CD10
-
+ Bcl-6
-
ABC
(non GC)
A génexpressziós profil hatása a DLBCL-es betegek túlélésére
Nyman H et al. Blood 2007;109:4930-4935
FCGR3A polimorfizmus és GEP vizsgálatok a DEOEC III. Belklinikán kezelt DLBCL-es betegek körében
51 beteg, 32 férfi, 19 nő, átlagéletkor 53,1 év 2007-2010 között felismert és kezelt DLBCL R-CHOP-14 vagy R-CHOP-21 kezelés, 1-8 ciklus
Módszer I. I. NESTED PCR SNP: GC-TA 1. PCR Target szekvencia, 94bp
1,2 kb termék 2. PCR
Target szekvencia, 94bp
Módszer II. II. RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS NlaIII 5’
CATTTT 3’
5’
CATGTT 3’
5’
CATTTT 3’
3’
GTAAAA 5’
3’
GTACAA 5’
3’
GTAAAA 5’
5’
CATTTT 3’ CATGTT 3’
CATGTT 3’
3’
5’
5’
GTAAAA 5’
3’
GTACAA 5’
3’
GTACAA 5’
FCγRIIIA-158F/F
FCγRIIIA-158V/V
FCγRIIIA-158V/F
150bp 100bp 75bp
94bp 61bp
50bp 35bp
33bp
Eredmények I. FF
VF
VV
p
10 (19.6)
29 (56.8)
12 (23.5)
-
7/3
16/13
7/5
NS
62.5 (37-70)
49.82 (19-83)
53.5 (25-86)
NS
1.8
2.1
1.7
NS
CR
7 (70)
20 (69)
10 (83)
NS
PR
1 (10)
5 (17)
0 (0)
NS
SD/PD
2 (20)
4 (14)
2 (17)
NS
OR (PR+CR)
8 (80)
25 (86)
10 (83)
NS
Betegek száma (%) Nemi megoszlás, nő / férfi Átlagéletkor
IPI átlag Terápiás válasz (%)
Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]
Eredmények II.
Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]
Eredmények III. GC
Non-GC
P
Betegek száma (%)
20 (39)
31 (61)
-
Nő / férfi arány
14/6
16/15
NS
Átlag életkor
51.6 (19-75)
54.5 (18-86)
NS
Átlag IPI score
1.8
2.06
NS
CR
15 (75)
21 (68)
NS
PR
3 (15)
4 (13)
NS
SD/PD
2 (10)
6 (19)
NS
OR (PR+CR)
18 (90)
25 (81)
NS
Terápiás válasz (%)
Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]
Eredmények IV.
Váróczy L et al. Pathol Oncol Res 2011; [Epub ahead of print]
Konklúzió
Az FCGR3A polimorfizmus és a GEP hatása a lymphomás betegek kezelési és túlélési eredményeire még nem egyértelmű a nagyobb rizikójú betegek kezelése eltérhet a standard protokolltól
A Rituximab kezelés hatékonyságának fokozása
Cartron, G. et al. Blood 2004;104:2635-2642
Jelenlegi projekt I. Gyógyszermetabolizmusban résztvevő enzimek genetikai polimorfizmusainak lehetséges szerepe a lymphomás betegek prognózisában
„Metabolic pathway” enzimek
környezeti carcinogének aktiválása vagy eliminációja gyógyszer metabolizmus befolyásolhatják a terápiára adott választ Képviselőik: - citokróm P 450 (CYP) - glutation S-transzferáz (GST) - N-acetil-transzferáz (NAT)
GSTT1 deléció
jó prognózis follicularis lymphomában, gyermekkori ALL-ben gyakoribb kemoterápia-asszociált toxicitás és kedvezőtlenebb túlélés DLBCL-ben
Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56 Cho, HJ et al. Cancer Gen Cytogen 2010; 198: 40-46
CYP2E1
Az enzim fontos szerepet játszik számos gyógyszer metabolizmusában (cyclophosphamide, fludarabin, bendamustin, rituximab, alemtuzumab) Az A allél hordozói CLL/SLL-ben kedvező prognózissal bírnak
Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56
NAT 1
CLL-ben az AG vagy az AA genotípus rossz prognózist jelent
Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56
GSTP 1
CLL-ben az AG vagy a GG genotípus prognózisa rossz
Han, X et al. Am J Hematol 2009; 88:51-56
Terv
Vizsgálni a „metabolic pathway” gének szerepét lymphomás betegeink prognózisát illetően NHL, Hodgkin, CLL, myeloma Terápiára adott válasz, túlélési adatok
Módszerek
a. A DNS izolálás perifériás vérből QIAamp Blood Mini kittel (QIAGEN GmbH, Germany). b. genotípus meghatározása a polimorfizmusokra specifikus PCR primerek és TaqMan próba kiválasztása az Applied Biosystems Assay-on-Demand kínálatából (http://www.appliedbiosystems.com) történt. PCR futtatása multiplex reakciókban történt Corbett Rotor-Gene 3000 készüléken két párhuzamos mintából. c. betegek genotípusának meghatározása a genotípus megállapítása pozitív és negatív kontroll bevonásával történt Corbett Rotor-Gene 3000 6.1. software segítségével alléldiszkriminációt alkalmazva.
TaqMan próba elve
Genotípusok meghatározása alléldiszkriminációval
Vizsgált polimorfizmusok Gén
SNP száma
SNP
FCGR3A
rs396991
G→T
CYP2E1
rs2070673
A→T
NAT1
rs4986782
G→A
NAT2
rs1208
A→G
GSTP1
rs1695
A→G
Jelenlegi projekt II. Genetikai eltérések myeloma multiplexben
Háttér
Drámai fejlődés a myeloma multiplex kezelési, túlélési eredményeiben az elmúlt 10 év során Bizonyos genetikai eltérések kedvezőtlen prognózissal bírnak del (13), del (17p), t (4;14), t (14;16) Ezen betegcsoportban a „hagyományos” kezelési módszerek jórészt eredménytelenek, csak a bortezomib alapú kombinációs terápiákra vagy kísérleti szerekre reagálnak
Terv
FISH módszerrel meghatározni újonnan diagnosztizált betegeink genetikai eltéréseit DEOEC Gyermekklinika Genetikai Laboratórium
Az immunrendszer regenerációjának vizsgálata autoimmun betegekben autológ őssejt-transzplantációt követően
A HSCT és az autoimmun betegségek
krónikus gyulladás, szervkárosodás fulmináns lefolyás, életet veszélyeztető szövődmények szigorú kritériumrendszer a szakmai szervezetek ajánlásai alapján: fenyegető, de még nem végleges szervkárosodások (tüdő, vese, ízületek?) alapelv: lymphoablativ kezeléssel megszüntethető az immunregulációs zavar őssejtgyűjtés: manipulálatlan vs. CD34+ szelektált graft kondicionálás: myeloablativ vs. lymphoablativ kemoterápia
Engraftment az AHSCT után
Sorrend: monocyták granulocyták thrombocyták NK-sejtek Klinikai engraftment: a granulocytaszám > 0,5 G/l három egymást követő napon Az innate immunitással ellentétben az adaptív immunrendszer csak hosszú idő elteltével regenerálódik
Lymphocyták regenerációja: NKsejtek
számuk a tx utáni 1-3. hónapban szupranormális fenotípus: CD56highCD16IFN-gamma termelés IL-2, IL-12 és IL-15-ben gazdag millieu
T-sejtek
A repopuláció forrásai: thymus (ha működik) és keringő érett T-sejtek A CD8+ sejtek hamarabb jelennek meg – inverz CD4/CD8 hányados IL-7 és IL-15 szerepe EBV és CMV specifikus sejtek magas aránya Autoimmun betegekben a Foxp3+ Treg sejtek aránya fordítottan korrelál a betegségaktivitással
B-sejtek
Igen alacsony szám az első 2-3 hónap során Legjellemzőbb az IgM termelő naiv Bsejt a VDJ gének szomatikus mutációja nélkül A fehérje természetű antigének elleni antitestek termelődése hamarabb normalizálódik, mint a polyszacharidok ellen termelt ellenanyagoké
Betegek és módszerek I.
2006. augusztus – 2010. november között 14 terápiarefrakter autoimmun beteg: 3 SLE, 4 rheumatoid arthritis, 4 scleroderma, 2 sclerosis multiplex, 1 overlap Graft: 10 esetben manipulálatlan, 4 esetben CD34-szelekció (SSc betegek) Kondicionálás: cyclophosphamide + ATG (12 eset), BEAM + ATG (2 SM-es beteg)
Betegek és módszerek II.
Vérvétel a tx előtt, majd a +30., 60., 90.,150. napon Lymphocyta szubpopulációk: áramlási citometria + immunfluoreszcencia Citokinek: ELISA (R & D Systems)
Sejtpopulációk Markerek
Lymphoycta populáció
CD3+
T-sejt
CD19+
B-sejt
CD4+
T-helper sejt
CD8+
T-cytotoxicus sejt
CD3-CD56+
Natural killer sejt
CD4+25+bright
Regulatorikus T-sejt
CD4+CD62ligand+CD45RA+
Naiv T-helper sejt
CD4+CD62ligand+CD45RA-
Centralis memória T-helper sejt
CD4+CD62ligand-CD45RA-
Effektor memória T-helper sejt
CD8+CD62ligand+CD45RA+
Naiv T-cytotoxicus sejt
CD8+CD62ligand+CD45RA-
Centralis memória T-cytotoxicus sejt
CD8+CD62ligand-CD45RA-
Effektor memória T-cytotoxicus sejt
CD8+CD62ligand-CD45RA+
Terminalisan differenciált effektor memória T-cytotoxicus sejt
CD19+CD27-IgD-
Naiv B-sejt
CD19+CD27+IgD+
IgM memória B-sejt
CD19+CD27+IgD-
IgG memória B-sejt
Citokinek
IL-2 IL-3 IL-4 IL-6 IL-7 IL-10 IL-13 IL-15 IL-16 IFN-gamma TNF-alfa
Lymphocyta szubpopulációk regenerációja I. 100 90 80 70 CD3-CD56+ NK cells
%
60
CD3+CD8+ T cells
50
CD3+CD4+ T cells
40
CD19+ B cells
30 20 10 0 before TX
day 30
day60
day 90
day 150
1 yr
Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]
Lymphocyta szubpopulációk regenerációja II. 100 90 80
%
70 60
CD4 naive
50
CD4 central memory
40
CD4 effector memory
30 20 10 0 before TX day 30
day60
day 90
day 150
1 yr
2 yrs
Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]
Lymphocyta szubpopulációk regenerációja III.
100 90 80
CD8 naive
70 CD8 central memory
%
60 50
CD8 effector memory
40 CD8 terminally differentiated effector memory
30 20 10 0 before TX day 30
day60
day 90 day 150
1 yr
2 yrs
Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]
Lymphocyta szubpopulációk regenerációja IV. 100 90 80
%
70 60
CD19 naive
50
CD19+IgG memory
40
CD19+IgM memory
30 20 10 0 before TX
day 30
day60
day 90
day 150
1 yr
2 yrs
Szodoray P, Váróczy L et al. Scan J Rheumatol 2011; [Epub ahead of print]
Terv
A vizsgálatok folytatása nagyobb beteganyagon A citokinek szerepének meghatározása a lymphocyták regenerációjában
Köszönöm a figyelmet!
