A negyedleges szerkezet szerepe a kis hő-sokk fehérjék

A negyedleges szerkezet szerepe a kis h˝o-sokk fehérjék chaperon m˝uködésében

Készítette: Böde Csaba

Témavezet˝o: Dr. Fidy Judit egyetemi tanár

Semmelweis Egyetem Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola

Szigorlati Bizottság Elnök: Dr. Németh János egyetemi tanár, orvostudományok doktora Tagok: Dr. Simon István, biológiai tudományok doktora Dr. Gróf Pál, egyetemi docens Bírálók: Dr. Nyitrai Miklós, egyetemi docens Dr. Bauer Pál, egyetemi docens Budapest 2006

Tartalomjegyzék 1. Bevezetés, irodalmi áttekintés 1.1. A dajkafehérjék . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2. A kis h˝o-sokk fehérjék . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1. Az oligomer szerkezet . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.2. Az -krisztallin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.3. Methanococcus jannaschii HSP16.5 . . . . . . . . . 1.3. Nagy nyomás alkalmazása a fehérjék szerkezetvizsgálatában 1.4. Kémiai paraméterek hatása . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.5. Célkit˝uzés . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

5 5 8 10 14 16 17 21 22

2. Anyagok és módszerek 2.1. Fehérjeminták készítése . . . . . 2.2. pH sokk . . . . . . . . . . . . . 2.3. Nagy nyomás . . . . . . . . . . 2.4. Chaperon aktivitás mérése . . . 2.5. Fluoreszcencia mérések . . . . . 2.5.1. Triptofán fluoreszcencia 2.5.2. ANS jelölés . . . . . . . 2.6. FTIR spektroszkópiai mérések . 2.6.1. Mintakészítés . . . . . . 2.7. Sztatikus fényszórás . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

23 23 24 24 25 27 27 28 31 33 34

. . . . . . . .

36 36 36 40 47 53 53 55 58

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

3. Eredmények 3.1. Nagy nyomásos kísérletek . . . . . . . . . 3.1.1. Chaperon aktivitás mérések . . . . 3.1.2. Szerkezeti mérések . . . . . . . . . 3.1.3. A negyedleges szerkezet változásai 3.2. pH sokk kísérletek . . . . . . . . . . . . . 3.2.1. Chaperon aktivitás mérések . . . . 3.2.2. A másodlagos szerkezet változásai . 3.2.3. A negyedleges szerkezet változásai

2

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

. . . . . . . .

4. Az eredmények megbeszélése 4.1. A chaperon aktivitás változása . . 4.2. Szerkezeti változások . . . . . . . 4.2.1. Nagy nyomás . . . . . . . 4.2.2. Rövid ideig tartó pH sokk 4.3. Összegzés . . . . . . . . . . . . . 4.4. Utószó, további kérdések . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

. . . . . .

60 60 61 61 65 66 67

5. Következtetések

69

Összefoglalás

71

Summary

72

Irodalomjegyzék

73

Saját közlemények jegyzéke

89

Köszönetnyilvánítás

92

3

Rövidítések jegyzéke ANS – 5-dimetilamino 1-naftalénszulfonsav CD – cirkuláris dikroizmus spektroszkópia DTE – ditioeritritol FTIR – Fourier transzformációs infravörös spektroszkópia HSP – h˝o-sokk fehérje (Heat Shock Protein) HSP33 – 33 kDa tömeg˝u h˝o-sokk fehérje HSP60 – 60 kDa tömeg˝u h˝o-sokk fehérje család HSP70 – 70 kDa tömeg˝u h˝o-sokk fehérje család HSP90 – 90 kDa tömeg˝u h˝o-sokk fehérje család HSP100 – 100 kDa tömeg˝u h˝o-sokk fehérje család IR – Infravörös sHSP – kis h˝o-sokk fehérje (Small Heat-Shock Protein) TEM – transzmissziós elekronmikroszkópia

4

1. fejezet Bevezetés, irodalmi áttekintés 1.1. A dajkafehérjék A fehérjék m˝uköd˝oképes állapotához tartozó térszerkezetet fiziológiás körülmények között a fehérje aminosavsorrendje egyértelm˝uen meghatározza [1] (az újabb kutatások alapján legalábbis a fehérjedomének szintjén [2]), azonban a fehérjék egy része képtelen küls o˝ segítség nélkül megtalálni ezt a szerkezetet. Az élo˝ szervezetben egy külön fehérjecsalád, a dajkafehérjék (stresszfehérjék) vagy más néven chaperonok vesznek részt a fehérjék natív állapotának kialakításában, illetve stresszes körülmények közötti stabilizálásában. A chaperonok közé szerkezetét és funkcióját tekintve sokféle fehérje tartozik. Szerkezeti és m˝uködésbeli hasonlóság alapján családokba szokták sorolni ezeket a fehérjéket, legismertebbek a HSP100, HSP90, HSP70, HSP60 fehérjecsalád és a kis h o˝ -sokk fehérjék. A f˝obb dajkafehérje családokat összefoglalva az 1.1 táblázat, a fehérjék és a sejt életében betöltött szerepüket pedig az 1.1 ábra mutatja. Normális körülmények között a chaperonok a fehérjék felgombolyodásában játszanak szerepet. Ha a szervezetet valamilyen sokk vagy stressz éri (sokk, illetve stressz alatt értünk bármilyen olyan hatást, amely a fehérjékre veszélyt jelent: például magas h o˝ mérséklet, oxidáció, ozmotikus változások) a fehérjék szerkezete sérül. Így kialakul egy átmeneti (intermedier) állapot, ahonnan küls˝o segítség nélkül a fehérjék legtöbbször könnyen aggregálódhatnak. Ez az aggregáció nagyon veszélyes lehet, ugyanis az így aggregálódó fehérjék natív szerkezete általában nem állítható vissza, valamint számos betegség (amiloidózis [3], szürkehályog [4]) molekuláris eredete aggregációra vezethet o˝ vissza. Ezt az

5

1.1. táblázat. A f˝obb dajkafehérje családok, és egyes tagjaik. F. Narberhaus után [7] család

példa

f˝o feladat

hivatkozás

HSP100

ClpB

fehérjeaggragátumok disszociációja

[8]

ClpA

proteáz komplex

[9]

SC charonin

DegP

proteáz és chaperon

[10]

HSP60

GroEL

fehérjék betekerése

[5], [6]

HSP70

DnaK

fehérjék betekerése

[5], [11]

HSP33

HSP33

oxidatív sokk,

[12]

aggregáció elleni védelem HSP90 sHSP

HtpG

aggregáció elleni védelem

[13], [14]

-krisztallin

aggregáció gátlás

[15], [7]

MjHSP16.5

aggregáció gátlás

[16], [17]

aggregációt gátolják meg a kis h˝o-sokk fehérjék és a HSP90 család tagjai. Vegyük most sorra röviden a különböz˝o chaperon családokat! A HSP60 az egyik legrégebben ismert chaperoncsalád, és a HSP70-el együtt a legjobban ismert dajkafehérjék közé tartoznak. Mind a két család tagjai – megfelel o˝ segédfehérjékkel közösen – a fehérjék feltekeredésében, a megfelel o˝ térszerkezet kialakításában vesznek részt. A különböz˝o elektronmikroszkópos és röntgendiffrakciós felvételek alapján a HSP60 m˝uködési mechanizmusa jól ismert [5, 6]. M˝uködésében a fehérje hidrofób központi ürege játszik fontos szerepet. Ez a teljes betekerendo˝ fehérjét (illetve nagyméret˝u fehérjék esetében egy szerkezeti egységét) egyszerre köti meg, és nagymérték˝u konformációváltozásokkal segíti el˝o a betekeredést. Vele szemben a HSP70 a szubsztrát (segítendo˝ fehérje) csak egy kis részét köti meg, ezáltal már a transzláció (átíródás) közben is segítheti a fehérje betekeredését. A HSP70 fehérje pontos m˝uködési mechanizmusa még nem ismert. A HSP90 család tagjainak f˝o feladata a fehérjék aggregációjának gátlása. Eukariótákban a HSP90 számos jelátviv˝o és sejtciklust szabályozó molekula tekeredésében játszik fontos szerepet [13, 14]. A HSP90 ATP-t köto˝ molekula, az ATP köt˝odése a fehérjében konformáció változást idéz el˝o [18]. A fehérje in vivo aktivitásához az ATP köto˝ dése elengedhetetlen [19], habár in vitro ATP nélkül is mérheto˝ chaperon aktivitás. A fehérjék 6

Fehérjeszintézis HSP70

DEGRADÁCIÓ 


Polipeptidlánc  HSP60 HSP70




HSP70  NATÍV konformáció HSP60 HSP100 STRESSZ
sHSP   (s)HSP kötött INTERMEDIER HSP90 

AGGREGÁCIÓ

AGGREGÁCIÓ

1.1. ábra. A chaperonok szerepe a fehérjék szintézise során, illetve stresszes körülmények

között aggregációjának gátlásában a HSP90 mellett a kis ho˝ -sokk fehérjék játszanak fontos szerepet. A HSP100 családba tartozó fehérjék els˝odleges feladata a kis h˝o-sokk fehérjék vagy a HSP90 által kötött sérült fehérjék újra oldhatóvá tétele, a chaperon-szubsztát komplex szétbontása. Az így felszabadított sérült fehérjéknek kétféle sorsuk lehet. Az egyik lehet o˝ ség az, hogy más chaperonok – a HSP60 és HSP70 család tagjai – tekerik o˝ ket vissza natív állapotukba [8], a másik lehet˝oség, hogy a sérült fehérjéket a proteázok lebontják. Ezek ismeretében nem meglep˝o, hogy nagy hasonlóság van a HSP100 család tagjai és a proteázok között. Például az úgynevezett "SC charonin" fehérjéknél ugyanaz a fehérje lehet a körülményekt˝ol függ˝oen proteáz illetve chaperon is. A család egyik tagja a DegP proteáz, amelynél a h˝omérséklet dönti el, hogy chaperonként vagy proteázként m˝uködik-e [10]. A HSP33 fehérje nem sorolható be a nagy stresszfehérjecsaládok egyikébe sem. Számos más chaperon m˝uködését is befolyásolja a környezet redox potenciálja, azonban úgy t˝unik, hogy az E. coli baktériumból izolált HSP33-nak kifejezetten az oxidatív sokk elleni védelem az els˝odleges feladata [12]. Nagyon valószín˝u, hogy léteznek a HSP33-al homológ fehérjék az eukariótákban is, felfedezésük csak id o˝ kérdése. Ebb˝ol a leírásból és az 1.1 ábrán is látható, hogy a kis ho˝ -sokk fehérje családok szorosan együttm˝uködnek egymással a fehérjék tekeredése, illetve a stresszes körülmények kompenzálása során. 7

Az irodalomban aggregáció alatt több folyamatot is értenek. A szó tágabb értelmében aggregációnak neveznek minden olyan folyamatot, mely során nagyméret˝u fehérjekomplexek keletkeznek. Így aggregátumnak hívják az egyes fehérjéknél kialakuló amiloid fibrillumokat, a kis h˝o-sokk fehérjék és szubsztrátjaik által alkotott komplexeket valamint egyes esetekben natív fehérjék által alkotott fehérjekomplexeket is. Ezen aggregátumok biológiai szerepe más és más, gyakran az is er˝osen kérdéses, hogy az aggregátumokat alkotó fehérjék szerkezete milyen, denaturált vagy natív-e.

1.2. A kis h˝o-sokk fehérjék A kis h˝o-sokk fehérjék (sHSP vagy más néven -ho˝ -sokk fehérjék [7]) a dajkafehérjék egyik legsokszín˝ubb családját alkotják [17, 20, 21]. Az archebaktériumoktól a gerincesekig szinte minden él˝o szervezetben megtalálhatóak, azon kevés kivétel mindegyike ahol mégsem, parazita vagy patogén mikroorganizmus [7, 22, 23]. A család tagjai közti homológia sokkal kisebb, mint más dajkafehérje családokban, azonban minden kis h o˝ -sokk fehérje közös vonása a körülbelül 80 aminosav hosszúságú -krisztallin domén, amely a család egyik fontos tagjáról, a szemlencsében felfedezett -krisztallinról kapta a nevét [24]. Ennek az -krisztallin doménnek a jelenléte alapján (azaz szerkezeti, és nem funkcionális alapon) azonosítják a család különbözo˝ tagjait. Az él˝o szervezetben többféle kis h˝o-sokk fehérje található. Az o˝ sbaktériumok kivételével, ahol egy vagy két kis h˝o sokk fehérje van, a sejtben a kis h˝o-sokk fehérjék száma tízes nagyságrend˝u is lehet [25]. Általánosságban elmondható, hogy a kis h o˝ -sokk fehérjék száma korrelál a genom méretével [7]. A humán genom tíz, HSPB1-HSPB10-nek nevezett kis h˝o-sokk fehérjét tartalmaz [26], amelyek elo˝ fordulása szövetenként különböz˝o (1.2 táblázat). Jelenlegi tudásunk szerint a kis h˝o-sokk fehérjék nem vesznek részt közvetlenül a fehérjék újratekerésében. Els˝odleges feladatuk a stressz hatására aggregálódó fehérjék megkötése [38]. A legújabb kísérleti eredmények alapján a kis ho˝ -sokk fehérjék szorosan együttm˝uködnek a HSP100 fehérjecsalád tagjaival, ugyanis az utóbbi fehérjék vesznek részt a kis h˝o-sokk fehérjék által megkötött aggregálódó fehérjék fellazításában [39, 40]. Az a kérdés, hogy a kis h˝o-sokk fehérjék szubsztrátjaikkal alkotott komplexei fehérjeaggregátumnak tekinthet˝ok-e vagy sem, és ha igen, akkor ezt az aggregátumot mi jellemzi, még 8

nem teljesen tisztázott [41, 42]. Fehérjeaggregáció a kis ho˝ -sokk fehérjék jelenlétében is végbemegy, azonban jelenlegi tudásunk alapján úgy látszik, hogy a kis h o˝ -sokk fehérjéket tartalmazó fehérjeaggregátumok szerkezete más, mint az e fehérjék hiányában létrejötteké; a kis h˝o-sokk fehérje kötött aggregátumokból nagyobb eséllyel állítható helyre az aggreátumokat alkotó fehérjék szerkezete [39]. Így a kis ho˝ -sokk fehérjék köt˝odésének els˝odleges célja valószín˝uleg az, hogy a sérült, aggregálódó fehérjét újratekeredésre alkalmas állapotban tartsák [43, 44]. A kis-h˝o sokk fehérjék további haszna, hogy a sejtet megvédik a sejt számára káros aggregátumoktól, így például gátolják az amiloid fibrillumok kialakulását [45, 46]. A foszforiláció szerepe vitatott a kis h˝o-sokk fehérjék m˝uködésében. Valószín˝unek látszik, hogy a humán HSP27 esetében a foszforiláció a fehérje f o˝ szabályozási mechanizmusa [47]. Több kis h˝o-sokk fehérje esetében kimutatták, hogy foszforilációjuk a fehérje disszociációjához vezet [48, 47]. Foszforilált A és B krisztallint a szemlencséb o˝ l is izoláltak [49]. Az, hogy a foszforiláció illetve az ATP köto˝ dés a chaperon aktivitás növekedését vagy csökkenését okozza, vitatott. Muchowski és munkatársai ATP köt o˝ dését követ˝oen az aktivitás növekedését figyelték meg [50], Ito és munkatársai a fehérje foszforilációjának mutációval történt mimikálása után aktivitáscsökkenésro˝ l számoltak be [48]. Például az B krisztallin esetében a 45-ös pozícióban található szerin foszforilációja az oligomer 1.2. táblázat. A humán kis h˝o-sokk fehérjék, G. Kappé munkája nyomán [26] fehérje

alternatív elnevezés

el˝ofordulás

hivatkozás

HSPB1

HSP27, HSP25

szív, vázizomzat

[27]

HSPB2

MKBP

szív, vázizomzat

[28], [29]

HSPB3

HSPL27

szív

[30]

HSPB4

A-krisztallin

szemlencse

[15]

HSPB5

B-krisztallin

szemlencse, szív, vázizomzat

[15]

HSPB6

HSP20, p20

szív, vázizomzat

[31]

HSPB7

cvHSP

szív, vázizomzat

[32]

HSPB8

H11, HSP22

szív, vázizomzat

[33], [34], [35]

HSPB9

-

csecsem˝omirigy

[36]

HSPB10

ODF1

csecsem˝omirigy

[37]

9

szerkezet szétesését és a chaperon aktivitás csökkenését okozza [51]. Mások feltételezik az ATP szerepét a megkötött szubsztrátok elengedésében [52]. Az ellentmondások hátterében a különböz˝o vizsgálati módszerek állhatnak, illetve az, hogy a foszforilációnak esetleg a kis h˝o-sokk fehérjék más, kevésbé ismert funkciójában lehet szerepe. Nagyon valószín˝u, hogy nem csak a más fehérjék aggregációjának gátlása a kis h o˝ -sokk fehérjék egyedüli feladata. Ezt er˝osíti az is, hogy például a kis h˝o-sokk fehérjék családjába tartozó C. elegans HSP12.2-nek és a HSP12.3-nak nincs chaperon aktivitása, holott szerkezetük alapján a kis h˝o-sokk fehérjék családjának tagjai [53]. Más esetekben, például a HSP27 és az -krisztallin esetén kimutatták, hogy képesek gátolni az aktin polimerizációját [54, 55], illetve képesek az aktin filamentumok stabilizálására [56]. Ez arra utal, hogy a kis h˝o-sokk fehérjéknek szerepe lehet a sejtváz stabilizálásában is [57, 58]. A kis h˝o-sokk fehérjék további fontos szerepét feltételezik a programozott sejthalál, az apoptózis gátlásában. Az apoptózis az elo˝ szervezet normális m˝uködésének része, azonban stresszes körülmények között az apoptózis folyamata esetleg túl korán elindul, és a sok elpusztult sejt nyilvánvalóan káros a szervezetnek. A humán HSP27 és az B-krisztallin az apoptózis során számos ponton kölcsönhat az apoptózisban fontos szerepet játszó kaszpáz fehérjékkel, lehet˝oséget adva az apoptózis gátlására [59]. Mindezen eredmények is mutatják, hogy a korábbi elképzelésekkel ellentétben a kis h o˝ -sokk fehérjék nem csak más fehérjék védelmében, hanem számos sejtes folyamatban is fontos szerepet játszanak.

1.2.1. Az oligomer szerkezet A kis h˝o-sokk fehérjék monomer egységeinek (alegységeinek) molekulatömege 12 és 43 kDa között van. Ezek az alegységek legtöbbször nagyméret˝u oligomereket képeznek. Az oligomer szerkezet kialakulása a chaperon m˝uködés elo˝ feltétele [60, 61, 62]. A kis h˝o-sokk fehérjék oligomer szerkezete dinamikus, az alegységek az oligomerek között cserél˝odhetnek [63, 64, 65]. A kis h˝o-sokk fehérjék családján belül az egyes tagok oligomerizációja és az oligomer szerkezet stressz hatására bekövetkezo˝ változásai nagyon különböz˝oek lehetnek [66], az 1.2 ábra mutat erre pár példát. A legegyszer˝ubb esetben a monomerek (esetleg több lépcs˝oben) összeállnak nagyobb, chaperon aktivitással bíró oligomerekké. Például a MjHSP16.5 oligomerei 24 monomerb˝ol állnak (1.2 B ábra). Azonban a nagy oligomerek

10

A

Myobacterium tuberculosis HSP16.3             

Monomer B

Methanococcus jannaschii HSP16.5 (MjHSP16.5)                   

Monomer C

Dimer

24mer

Egér HSP25 

 

Monomer D

Nonamer

Trimer



24mer

 



 

     

Tetramer

Dimer

Éleszt˝o HSP26                      

Monomer





T



16mer



Dimer



 T                 

Granula

           

Chaperone-szubsztrát komplex

1.2. ábra. A kis h˝o-sokk fehérjék különböz˝o oligomerizációs formái és ezek kialakulása

Narberhaus nyomán [7] jelenléte nem minden esetben feltétele a chaperon aktivitésnak. A Myobacterium tuberculosis HSP16.3 oligomerei 9 alegységbo˝ l épülnek fel [67], ami 150 kDa-os oligomertömegnek felel meg. A 9 alegységb˝ol álló oligomert 3 darab kisebb egység, trimer alkotja (1.2 A ábra). A nonamerek és trimerek között dinamikus egyensúly áll fent, a nonamerek szétesése valószín˝uleg a chaperon m˝uködés egyik feltétele [68]. Ezideig csak három kis h˝o-sokk fehérje röntgendiffrakciós szerkezete ismert, a Methanococcus jannaschii archebaktériumból a 16.5 kDa tömeg˝u stresszfehérjéé [69], a búzából a HSP16.9-é [70], valamint a Taenia saginata szalagféregbo˝ l származó TSP36.5-é [71]. E fehérjéket azért sikerült kristályosítani, mert a negyedeleges szerkezetük jól meghatározott, a fehérje oligomerek egyformák. A Methanococcus jannaschii HSP16.5 (MjHSP16.5) 24 11

alegységb˝ol felépül˝o oligomerének épít˝okockái a röntgendiffrakciós adatok alapján a két alegységb˝ol felépül˝o dimerek (1.2 B ábra, 1.3 B ábra) [69]. E dimerek felteheto˝ en stabilak, az alegységek közötti intermolekuláris  -lemezek tartják o˝ ket össze. E szerkezeti motívum szinte minden kis h˝o-sokk fehérjére jellemz˝o, és az intermolekuláris  -lemezek jelenléte a fehérje infravörös spektrumán jól nyomon követhet o˝ . A dimerek között már csak másodlagos kölcsönhatások vannak. Ezt figyelembe véve nagyon meglep o˝ , hogy az MjHSP16.5-nél kizárólag a nagy, 24 alegységbo˝ l álló oligomer formát figyelték meg, különálló dimereket nem találtak. Érdekes kérdés, hogy mindezek mellett hogyan tud a fehérje oligomer szerkezete dinamikus maradni, ugyanis az alegységek kicserél o˝ dése az MjHSP16.5 esetében is bizonyított [64]. Hasonló szerkezetet figyeltek meg a búzából származó HSP16.9 esetében [70]. A 12 alegységb˝ol felépül˝o dodekamer épít˝oköve itt is a dimer, amit szintén a két alegység  lemezei közötti intermolekuláris  -kölcsönhatások tartanak össze. A dimerek közti kölcsönhatások kiépülésében nagy szerepük van az alegységek C és N terminális végeinek. Számos más kis h˝o-sokk fehérje esetében is bizonyítékokat találtak az N terminális fontosságára az oligomer szerkezet kialakításában, illetve arra vonatkozólag, hogy az oligomerek dimerekb˝ol épülnek fel [72]. A fent bemutatott példáktól eltér˝o a Taenia saginata szalagféregb˝ol származó TSP36 kis h˝o-sokk fehérje szerkezete [73, 71]. A fehérje különlegessége, hogy egy alegysége két -krisztallin domént is tartalmaz [74], ehhez hasonló szerkezet a kis h o˝ -sokk fehérjék között csak elvétve fordul el˝o [75, 76]. A röntgendiffrakciós szerkezet alapján [71] a fehérje oligomert összetartó kölcsönhatások mások, mint a többi kis h o˝ -sokk fehérje esetében, ugyanis hiányzik az intermolekuláris  -kölcsönhatás az alegységek között. A dimereket az alegységek N-terminális vége és az -krisztallin domének közti kölcsönhatás stabilizálja. A más kis h˝o-sokk fehérjék intermolekuláris  -szerkezetére emlékezteto˝ kölcsönhatás a molekulán belül csak egy helyen fordul elo˝ : az alegységen belül, a két -krisztallin domén között. Azonban a kis h˝o-sokk fehérjék többségének pontos negyedleges szerkezete nem meghatározott, az oligomer populáció heterogén [17, 77], ezért érdemes egy kicsit b o˝ vebben is beszélni a kis h˝o-sokk fehérjék oligomerizációjáról. Az egér HSP25 fehérje érdekes példája a heterogén oligomer populációval rendelkez o˝ kis h˝o-sokk fehérjéknek: esetében több különbözo˝ méret˝u oligomer van jelen egyidej˝uleg. 12

B

A

1.3. ábra. A Methanococcus jannaschii HSP16.5 oligomer szerkezete K.K. Kim munkája

nyomán [69] A: röntgendiffrakciós modell alapján alkotott kép az MjHSP oligomerr o˝ l, jól látható a belül üreges gömbszer˝u szerkezet. B: A két alegységb o˝ l felépül˝o dimer . A dimerek, tetramerek és 16merek arányát a fehérjekoncentráció határozza meg (1.2 C ábra) [78]. Mérhet˝o chaperon aktivitása a tetramereknek és a 16mereknek van. A h o˝ mérséklet emelkedésével még nagyobb méret˝u fehérjeoligomerek (granulák) keletkeznek. Az  -krisztallin vagy a HSP25 esetében a heterogén oligomer populációban találhatunk akár 10 MDa tömeg˝u oligomereket is [79, 80]. A humán HSP27 viselkedése hasonló az egér HSP25-höz, azonban megfigyelték, hogy a fehérje foszforilációja az oligomerek disszociációjához vezet. A így keletkezett kisebb méret˝u oligomerek képtelenek a feladatukat ellátni, a nagyméret˝u oligomerek jelenléte a feltétele a chaperon m˝uködésnek [47]. A szemlencsébo˝ l származó  -krisztallin oligomer mérete is megn˝o a h˝omérséklet emelkedés hatására [81]. J. Koretz és munkatársai ez alapján feltételezték, hogy ebben az esetben is korreláció van az oligomerek mérete és a chaperon aktivitás között [82]. Azonban, ahogy a HSP16.3 esetében láttuk, a nagy oligomerek jelenléte nem minden esetben feltétele a chaperon aktivitásnak. Például az éleszto˝ HSP26 esetében a nagy, 24 alegységb˝ol álló oligomerek a h˝omérséklet emelkedésével disszociálnak, és ez a disszociáció szükséges a chaperon m˝uködéshez [83] (1.2 D ábra). Kimutatták, hogy a sérült fehérjéket a dimerek kötik meg, amelyek ezután nagyméret˝u chaperon-szubsztrát komplexet képeznek. 13

Az oligomer szerkezet kialakulásában nagy szerepe van a kis h o˝ -sokk fehérje alegységek N terminális végének [84, 85]. Szemlencsébo˝ l izolált -krisztallin esetében megfigyelték id˝osebb korban az alegységek N terminális végének rövidülését és ezzel párhuzamosan az oligomerméret csökkenését [86]. Számos más mutációs vizsgálat is az N-terminális vég fontosságára mutat rá [87]. Giese kísérletei érdekes információkat szolgáltattak az alegységek N-terminális végének szerepér˝ol [88]. A Synechocystis cianobaktérium 16.6 kDa tömeg˝u kis h˝o-sokk fehérjéjénél találtak három olyan mutációt az alegységek N-terminális végén, amely in vivo a chaperon aktivitás elvesztését okozza, in vitro viszont nem mutatható ki aktivitáscsökkenés. Ennek feltételezheto˝ oka az, hogy az alegységek N-terminális végének nem csak az oligomer szerkezet kialakulásában, hanem más HSP-kel való kölcsönhatásban is szerepe lehet, ami in vivo a fehérje m˝uködésképtelenségét eredményezi, az in vitro chaperon teszt viszont nem tudja kimutatni. Az alegység kicserél˝odés nemcsak egy kis h˝o-sokk fehérje oligomerei, hanem különböz˝o kis h˝o-sokk fehérje oligomerek között is lehetséges [89, 90]. Például a humán kis h˝o-sokk fehérjék alegységei is cserél˝odhetnek egymás között [34, 64], így egy sHSP oligomerben többféle kis h˝o-sokk fehérje molekula is el˝ofordulhat. Az eddig felhozott példákból látható, hogy nem létezik a kis h o˝ -sokk fehérjék esetében általános m˝uködési mechanizmus. Összességében három, alapjaiban különböz o˝ chaperon mechanizmust tételeznek fel: egyik leheto˝ ségként a nagy oligomer a felszínén köti meg a szubsztrátot [15, 91]. Egy másik leheto˝ ség az, hogy a kis h˝o-sokk fehérje oligomer disszociál kisebb egységekre (ezek lehetnek monomerek, dimerek, vagy nagyobbak), amelyek hidrofób felszínüknél fogva megkötik a szubsztrátot, majd a szubsztrát köt o˝ dése után összeállnak oldható komplexekké [83]. A harmadik elképzelés szerint a kis h o˝ -sokk fehérje molekulák beépülnek a nagy, oldhatatlan aggregátumokba, lehet o˝ vé téve ezen aggregátumok disszociációját [41, 42, 92].

1.2.2. Az  -krisztallin A kis h˝o-sokk fehérjék közül az egyik leginkább kutatott fehérje az -krisztallin, amely már több, mint 100 éve ismert fehérje, és a gerincesek szemlencséjének közel egyharmadát alkotja [15, 93]. Az -krisztallin valójában két nagyon hasonló fehérje, az A és az B-krisztallin formájában van jelen a szervezetben. Az A és B alegységek közel

14

180 aminosav hosszúságúak, egy viszonylag kicsi N-terminális doménb o˝ l, egy nagyobb C-terminális doménb˝ol, és a kett˝ot összeköt˝o szakaszból állnak. A domének végén változó hosszúságú, rendezetlen szerkezet˝u szakaszok vannak [94]. A spektroszkópiai vizsgálatok során használt triptofánok az N-terminális doménen találhatóak, egy az A, kett o˝ az B alegységen. Az eml˝osök szemlencséjében az A és B alegységek aránya körülbelül 3:1 [95]. Az -krisztallin oligomerek heterogének [96], egy oligomer hozzávet o˝ legesen 30-40 alegységb˝ol áll [15]. Krio-elektronmikroszkópos felvételek tanúsága szerint az oligomerek alakja nem gömbszimmetrikus, szemben például a Methanococcus jannaschii HSP16.5 oligomerekkel [66]. Az oligomer szerkezet természetesen az -krisztallin esetében is dinamikus, az alegységek nem csak egymás között cserélo˝ dhetnek szabadon [63], hanem más kis h˝o-sokk fehérjékkel is lehetséges az alegységek kicserélo˝ dése [89]. Az -krisztallinról az elmúlt évtizedben mutatták ki, hogy chaperon tulajdonságokkal rendelkezik [97, 27]. Fontos szerepe lehet a szemlencse átlátszóságának fenntartásában [98] és a szürkehályog kialakulásának megakadályozásában [99]. Génkiütött állatokkal végzett kísérletek kimutatták, hogy a szemlencse átlátszóságának fenntartásához az Akrisztallin esszenciális [100] és valószín˝uleg nagy szerepe van a  -krisztallin aggregációjának megakadályozásában [15]. Érdekes módon az átlátszó szemlencséhez az B-krisztallin nem szükséges, viszont az B kiütött kísérleti állatok átlagos élethossza mintegy fele volt az egészséges állatokénak, azaz nem zárható ki az B-krisztallin alapvet o˝ szerepe az életm˝uködésben [101]. Hasonlóan más kis h˝o-sokk fehérjékhez az -krisztallin felszíne is ero˝ sebben hidrofób, mint más fehérjéké. Valószín˝u, hogy ezen oldószer által elérhet o˝ hidrofób felületeknek nagy szerepe van a chaperon m˝uködésben, és a szubsztrátok megkötésében. A chaperon m˝uködésben fontos szerepet játszik a fehérje oligomer szerkezete. Korábban feltételezték, hogy korreláció van az oligomer mérete és a chaperon m˝uködés között [82], azonban újabb eredmények azt mutatják, hogy az oligomer szerkezet és a chaperon m˝uködés összefüggése nem ilyen egyszer˝u [102, 103]. A magas h o˝ mérsékleten tapasztalt nagyobb aktivitás és nagyobb oligomerméret mögött a fehérje nagyobb dinamikája és a megnövekedett alegységkicserél˝odés állhat, míg a mutációkkal illetve a nagy nyomással el˝oállított kisebb oligomerek nagyobb aktivitásának oka a fehérjék nagyobb összfelülete, és ezáltal több elérhet˝o szubsztrát köt˝ohely lehet. 15

Míg az A krisztallin nagy mennyiségben a szemlencsében fordul el o˝ (más szervekben csak nyomnyi mennyiségben van jelen), addig az B krisztallin a szervezetben mindenütt megtalálható [104, 105], az A krisztallintól függetlenül [106] (1.2). Dajkafehérjeként az

-krisztallin nagyon stabil fehérje, az aminosav szekvenciában

történ˝o mutációk többségére érzéketlen [107]. Ismert azonban néhány olyan mutációja, ami ezt a stabilitást megszünteti, és ennek következtében a szemlencsében szürkehályogot okoz [98, 108, 109]. A szürkehályogon kívül számos más, f o˝ ként neurológiai betegségben is szerepe van, mint az Alexander betegség [110], a Creutzfelt-Jakob szindróma [111], a Parkinson kór [111], vagy az Alzheimer kór [112, 113]. Új felfedezés, hogy az -krisztallin megfelel˝o körülmények között amiloid fibrillumokat is képezhet [114], ugyanakkor más esetben pedig képes meggátolni az amiloid fibrillumok kialakulását [115]. Tehát az

-

krisztallin ideális jelölt a kis h˝o-sokk fehérjék chaperon m˝uködésének tanulmányozására, már csak orvostudományi jelent˝osége miatt is.

1.2.3. Methanococcus jannaschii HSP16.5 A Methanococcus jannaschii termofil baktériumból származó HSP16.5 szerkezetét röntgenkrisztallográfiás mérésekb˝ol ismerjük [69]. Habár az -krisztallintól sok tekintetben eltér˝o fehérje, jelenleg a röntgendiffrakciós szerkezete (az éleszto˝ HSP 16.9 mellett [70]) az elérhet˝o legjobb modellje az -krisztallin és a kis h˝o-sokk fehérjék oligomer szerkezetének. A Methanococcus jannaschii HSP16.5 oligomerje 24 alegységb o˝ l áll, amelynek épít˝oköve a 2 alegységb˝ol álló dimer (1.3. ábra). Az oligomer szimmetrikus, belül üreges, az üregnek az oligomer felszínén számos nyílása van. Annak ellenére, hogy az oligomer szerkezet szigorúan 24 alegységb o˝ l áll, a negyedleges szerkezet –hasonlóan más kis h˝o-sokk fehérjékhez– dinamikus [64]. Feltételezheto˝ , hogy a fehérje m˝uködésében nagy szerepe van az alegységek kicserél o˝ désének, mivel korreláció mérhet˝o az alegység kicserél˝odés sebessége és a chaperon aktivitás között. Az alegységek kicserél˝odése 50-60  C alatt nagyon lassú, e h˝omérséklet felett (vagyis a baktérium természetes környezetében el˝oforduló h˝omérsékleteken) viszont megn˝o. Az oligomer szerkezet és ezáltal a chaperon aktivitás kialakulásában itt is fontos szerepet játszanak az alegységek N és C terminális végei. Az alegységek C terminális végének ritkán tulajdonítanak szerepet a kis h˝o-sokk fehérjék oligomer szerkezetének kialakulása-

16

kor, azonban a Methanococcus jannaschii esetén – a röntgendiffrakciós képek alapján – fontosak az alegységek közti kölcsönhatások stabilizálásában. Bár az alegységek rendezetlen N terminális végeinek feltehet˝oen nincs ilyen szerepük [116], mégis megfigyelheto˝ , hogy az N-terminális vég rövidülése az oligomer szerkezet szétesését okozza [91]. A látszólagos ellentmondás feloldása Kim és munkatársai [91] véleménye szerint az, hogy az alegységek N-terminális végének a oligomer szerkezet kialakulásakor van jelent o˝ sége. Ugyanis az N-terminális vég sok hidrofób aminosavat tartalmaz, amelyek az oligomerek formálódásakor egyfajta "aggregációs magként" funkcionálnak: az alegységek ezek körül a hidrofób aminosavak körül „összeragadva” állnak egybe. Az így kilakult szerkezet inkább hasonlíthat egy amorf aggregátumra, mint a fehérje végleges oligomer szerkezetére. Így ez az N-terminális végek körül kialakuló aggregáció az oligomer szerkezet kialakulásának csupán az els˝o lépése. Az eddigi vizsgálatok alapján a fehérje negyedleges szerkezete érzéketlen a környezeti hatásokra. CD és különböz˝o kromatográfiás mérések szerint 70  C-on is megmarad a fehérje másodlagos és harmadlagos szerkezete, és az oligomerek se disszociálnak kisebb egységekre [91]. Dinamikus fényszórással és TEM mikroszkópos felvételekkel az oligomerek kismérték˝u növekedését figyelték meg 80  C felett [91]. A fehérje in vivo védelmet nyújt h˝o-sokk ellen [117], valamint számos fehérje ho˝ - és kémiai denaturációját akadályozza meg in vitro [64, 117]. Mivel termofil baktériumból származik, ezért szobah˝omérsékleten meglehet˝osen rossz chaperon, aktivitása csak 60  C felett jelentkezik [117]. Feltételezik, hogy a fehérje m˝uködése során a szubsztrát valószín˝uleg csak az oligomer küls˝o felszínére köt, a chaperon m˝uködéshez konformáció-változást mindeddig nem mutattak ki [91].

1.3. Nagy nyomás alkalmazása a fehérjék szerkezetvizsgálatában Kísérleteink során számos esetben a fehérjék szerkezetének vizsgálatára nagy nyomást alkalmaztunk. A nyomás a h˝omérséklettel egyenérték˝u termodinamikai paramétere a vizsgált rendszernek. Nagy nyomás használatával a fehérjék olyan különleges, a m˝uködés megértésében fontos állapotai állíthatók elo˝ és tanulmányozhatók, amelyek más módsze-

17

p

DENATURÁLT

NATÍV T

1.4. ábra. A fehérjék elliptikus fázisdiagramja Hawley [125] nyomán rekkel (h˝omérséklet, kémiai anyagok alkalmazása) nem érheto˝ ek el [118, 119, 120]. A nagy nyomás fehérjékre gyakorolt hatását már a múlt század elején vizsgálta Bridgman [121]. Kísérletében megfigyelte, hogy a tojásfehérjét nagy nyomásnak kitéve az hasonlóan kicsapódik, mint a f˝ott tojás. Ez volt az els˝o kísérleti bizonyítéka annak, hogy nagy nyomással ugyanúgy denaturálni lehet a fehérjéket, mint magas h o˝ mérséklettel. Kés˝obb elméleti alapon a fehérjék alacsony h˝omérsékleten történ˝o denaurációját is megjósolták és kísérletileg számos fehérje esetében igazolták is [122, 123, 124]. A fehérjék nyomás-h˝omérséklet fázisdiagramjának els˝o elméleti magyarázatát Hawley adta meg 1971-ben [125]. Az elméleti elliptikus alakot (1.4 ábra) több kísérlet is meger o˝ síti. Kés˝obb, a fehérjék denaturációjával kapcsolatos mérések rámutattak arra, hogy ez a kétállapotú modell tarthatatlan: sem a natív sem a denaturált állapot nem jellemezhet o˝ egyetlen jól definiált szerkezettel, ehelyett állapotok sokasága létezik, ami a natív és denaturált közötti átmeneti, intermedier állapotokat is magában foglalja [3, 127]. Számos kutató átmeneti, úgynevezett „olvadt gombóc” (molten globule) állapotokat figyelt meg a fehérjék nyomásdenaturációja során [128, 129, 130]. Smeller mioglobinon végzett nyomás- és ho˝ denaturációs kísérletei [131] alapján a fehérjék nyomás-h˝omérséklet fázisdiagramjára egy új modellt adott [126], kiegészítve Hawley elliptikus fázisdiagramját. A fehérjék módosított fázisdiagramját az 1.5 ábra mutatja.

18

p

DENATURÁLT N (I) N (I) (A)

N (A)

A T

1.5. ábra. A fehérjék elliptikus fázisdiagramjának kiegészítése Smeller [126] nyomán. Az ábrán (I) és (A) a metastabil intermedier és aggregált állapotokat, az N és A a natív, illetve aggregált állapotot jelöli

A módosított fázisdiagramon a natív tartományon belül számos átmeneti – intermedier – állapot található. Például mioglobin esetében kimutatták, hogy a fehérje nyomásdenaturációja után a feltekered˝o fehérje hajlamos az aggregációra [131, 132]. Ez az aggregáció nem közvetlenül a natív állapotból, hanem a nyomásdenaturáció után létrejöv o˝ intermedier állapotok sokaságából megy végbe [133]. Az 1.5 ábrán jól látható, hogy a fehérje denaturált állapota sem egyféle. Alacsony nyomáson a denaturálódott fehérje aggregálódhat, míg nagy nyomáson ez nem lehetséges, mivel nagy nyomáson a fehérjeaggregátumok — a bennük található viszonylag nagy üres térfogat miatt — nem stabilak. Tekintsük át röviden a nagy nyomás hatásait a fehérjeszerkezetre (1.6 ábra)! Relatíve kicsi (  100 MPa) nyomások a fehérjékben csak rugalmas, teljesen reverzíbilis szerkezetváltozásokat okoznak [120]. Ezekr˝ol a reverzíbilis szerkezetváltozásokról a kompresszibilitás mérésével szerezhetünk információt. A kompresszibilitás mérése történhet spektroszkópiai módszerrel [134], illetve ultrahangos sebességméréssel [135, 136]. El o˝ bbivel a fehérjében található kromofór csoport környezetének izotermikus kompresszibilitását, utóbbival a fehérjeoldat egészének adiabatikus kompresszibilitását mérhetjük. A spektroszkópiai módszerekkel mérheto˝ izoterm kompresszibilitás a fluktuáció-diszszipáció tétel következtében a kromofór csoport környezetének térfogati fluktuációival ará19

p 

500-800 MPa Másodlagos szerkezet sérülése, nyomásdenaturáció



200-400 MPa Oligomerek szétesése 

100 MPa Rugalmas, reverzíbilis változások

1.6. ábra. A különböz˝o nyomástartományok hatása a fehérjeszerkezetre nyos [137]: !#"%$&!"(')'+*-, .0/12(!#"3'

(1.1)

. 2 /1 a térfogatot, az izoterm kompresszibilitást, a ho˝ mérsékletet, a Boltzmann!' állandót jelöli, a jelölés pedig az id˝obeli átlagolást jelenti. A fentiek alapján a fehérje

ahol

"

kompresszibilitásának mérésével a fehéjemolekula dinamikájáról szerezhetünk információkat [138, 139]. Magasabb nyomáson ( 

200-400 MPa) az oligomer szerkezet˝u fehérjék disszociálód-

nak, miközben a másodlagos szerkezetük érintetlen marad [140]. Ezáltal az oligomerizációval összefügg˝o térfogatváltozás, illetve az oligomerek kialakulásának folyamata tanulmányozható. Erre más módszerekkel csak a fehérje mutációival [141, 107, 142, 143, 144], illetve a fehérje részleges elemésztésével van leheto˝ ség [91, 102], azonban ezek a módszerek mind módosítják a fehérje másodlagos szerkezetét. A nagy nyomás hatását a kis h˝o-sokk fehérjék vizsgálatakor nagyon jól ki lehet használni, mivel a fehérjék másodlagos szerkezete csak magasabb nyomáson, általában 500 és 800 MPa között sérül [126, 103]. Ebben, a 200-400 MPa nyomástartományban egyes fehérjéknél reverzíbilis másodlagos szerkezetváltozás is megfigyelhet˝o [145, 146, 147, 148]. Még magasabb nyomás a fehérjék denaturációjához vezet [149, 120]. A denaturációs nyomás a különböz˝o fehérjék esetén nagyon különböz˝o lehet, az 500-800 MPa-os adat csak tájékoztató jelleg˝u. Két extrém példaként megemlítjük a ribonukleázt, amely már 90 MPa körül széttekeredik [150], illetve a Methanococcus jannaschiii HSP16.5-öt, amelynek 20

másodlagos szerkezete 45  C-on 1900 MPa-ig stabil [151].

1.4. Kémiai paraméterek hatása A környezeti pH változása az aminosav oldalláncok töltésének megváltozását okozza. Ez nagy jelent˝oség˝u lehet a kis h˝o-sokk fehérjék esetében, hiszen a fehérje negyedleges szerkezete kulcsfontosságú a chaperone m˝uködésben [47, 87] és az oligomer szerkezetet többek között az alegységek oldalláncai közötti gyenge kölcsönhatások stabilizálják [70, 69, 71]. Méréseink során a környezeti pH-t a fiziológiás, pH 7.4 értékt o˝ l a savas irányba változtattuk. A választás oka egyrészt a valós fiziológiás körülmények modellezése, másrészt az volt, hogy az A- illetve az B-krisztallin izoelektromos pontja pH 5.3 és pH 6.3 [152], így savas irányban várható nagy változás az oligomer szerkezetben. A környezeti pH hatását korábban többen tanulmányozták az Augusteyn és munkatársai méréseik során az

-krisztallin esetében.

A- B heterooligomerr o˝ l B alegységek

disszociációját figyelték meg savas pH-n [153]. Más vizsgálatok kimutatták, hogy az A illetve B alegységekb˝ol képzett homooligomerek is disszociálnak savas pH-n [154], továbbá azt is megmutatták, hogy míg az B-krisztallin pH 3.4 alatt denaturálódik, addig az A-krisztallin pH 2-ig stabil marad. Mások infravörös spektroszkópia segítségével szintén az -krisztallin denaturációját figyelték meg pH 3 alatt [155]. Míg az -krisztallin denaturációját extrém savas pH-n jól leírták, addig a savas pH-nak a fehérje funkciójára gyakorolt hatásáról nem sokat tudunk. Koretz és munkatársai kimutatták, hogy pH 6-on az -krisztallin nem tudja meggátolni a szubsztrát fehérjék aggregációját in vitro [156]. Más kutatók viszont azt találták, hogy az B krisztallint kifejez o˝ E. coli baktériumok túlélése nagyobb volt extrém pH sokk után, mint az B krisztallint nem kifejez˝o társaiké [157]. Ehhez hasonlóan megfigyelték, hogy sejtekben más kis h o˝ -sokk fehérjék expressziója is megnövekszik ha a sejtek savas környezetbe kerülnek [158]. A kluszterin nev˝u, oligomer szerkezet˝u extracelluláris fehérjér o˝ l — ami ez ideig az egyetlen ismert extracelluláris dajkafehérje [159, 160] — kimutatták, hogy chaperon aktivitása megnövekszik enyhén savas pH-n, pH 5.5-ön [161]. Ez egy extracelluláris chaperon esetében nem meglep˝o, hiszen megfigyelték, hogy számos gyulladás, illetve betegség esetén az extracelluláris tér pH-ja 6-nál alacsonyabb értékre csökkenhet [162, 163, 164]. Fontos hangsúlyozni, hogy az irodalomban található eddigi kísérletek nagy része ala21

csony pH-n foglalkozik a fehérje szerkezetével és m˝uködésével. Alig ismert azonban a rövid ideig tartó pH sokk hatása az -krisztallin szerkezetére és m˝uködésére, annak ellenére, hogy ez utóbbi effektus fiziológiai szempontból fontosabb lehet, hiszen a sejtben számos esetben történhetnek pH ingadozások. Egy fontos példa a sejtek úgynevezett ischémiareperfúziós károsodása, melynek során a sejt elo˝ ször oxigénhiányos környezetbe kerül, majd hirtelen oxigént kap [165, 166]. Ilyen károsodás történhet a sejtekkel szívinfarktus során, vagy például koraszülött, inkubátorban tartott csecsem o˝ k esetében [167, 168]. Ilyen esetekben a sejteken belüli pH ingadozás mértéke savas irányban akár az 1 pH egységet is elérheti [169].

1.5. Célkituzés ˝ Munkánk során célunk a dajkafehérjék közé tartozó kis ho˝ -sokk fehérjék m˝uködési mechanizmusának és negyedleges szerkezetük kialakulásának vizsgálata volt. Vizsgált rendszerként az -krisztallint és az MjHSP16.5-öt választottuk. Kísérleteinkben különböz o˝ fizikai és kémiai módszerekkel (nagy nyomás rövid ideig való alkalmazása, a környezeti pH rövid ideig tartó módosítása savas irányban) módosítottuk a kis h o˝ -sokk fehérjék oligomer szerkezetét és vizsgáltuk az e hatásra bekövetkezo˝ szerkezeti és m˝uködésbeli változásokat. E vizsgálatok során a következ˝o kérdésekre kerestük a választ: 4 Milyen oligomer szerkezet˝u kis h˝o-sokk fehérjék képesek chaperon hatást kifejteni? 4 Mi a szerepe a kis h˝o-sokk fehérjék többségénél megfigyelheto˝ heterogén negyedle-

ges szerkezetnek e fehérjék chaperon m˝uködésében? Köthet o˝ -e a chaperon m˝uködés egy jól definiált negyedleges szerkezethez? 4 Milyen kölcsönhatások játszhatnak szerepet a kis ho˝ -sokk fehérjék negyedleges szer-

kezetének kialakításában?

22

2. fejezet Anyagok és módszerek 2.1. Fehérjeminták készítése Az

-krisztallin mintákat két forrásból szereztük be. Egyrészt munkacsoportunknak a

kievi Biokémiai intézettel való együttm˝uködését felhasználva marha szemb o˝ l izolált

-

krisztallint használtunk. A fehérje izolálását a kievi munkacsoport végezte. A mintakészítés során a kievi munkacsoportban frissen vágott állatok szeméb o˝ l kimetszett szemlencsékb˝ol indultak ki. A szemlencséket ötszörös térfogatú 0.02 % NaN 5 -ot tartalmazó 50 mM pH 7.4 TRIS pufferben homogenizálták. A homogenátumot 30 percig 15000 6 -vel centrifugálták, majd a felülúszót Sephracyl S-300 oszlopon kromatografálták 50 mM pH 7.4 TRIS pufferben. Az elválasztás után kapott -krisztallin mintát Budapesten SDS-PAGE módszerrel ellen˝oriztük, majd inzulin aggregációs kísérlettel vizsgáltuk a chaperon aktivitását. A kapott aktivitásokat irodalmi adatokkal vetettük össze [170], melyek alapján mintáink aktivitása megegyezett az irodalmi adatok alapján várhatóval. A marha szemb˝ol izolált -krisztallin mellett a SIGMA cégt˝ol is vásároltunk liofilizált -krisztallint (C4163). Ezt a fagyasztva, -18  C-on tárolt fehérjét mérés el˝ott 50 mM pH 7.4 BES pufferben oldottuk fel. Az MjHSP16.5 mintát Prof. K.K. Kim (Suwon Egyetem, Dél-Korea) bocsátotta rendelkezésünkre [117], akivel munkacsoportunk szintén együttm˝uködésben áll.

23

2.2. pH sokk A rövid ideig tartó pH sokk hatásának vizsgálatakor a fehérjeminta pH-jának változtatását dialízissel végeztük. A pH csökkentése során a fehérjét 10 mM-os pH 7.4 TRIS pufferben oldottuk fel. A fehérjemintát 10-60 másodpercig dializáltuk 0.1 M HCl-el szemben, a dialízis ideje az elérni kívánt pH-tól függött. A kívánt pH elérése után ellen o˝ riztük az oldat pH-ját, majd 2 percig ezen az alacsonyabb pH-n tartottuk a mintát. A pH növelésekor 1060 másodpercig dializáltuk a mintánkat 0.1 M NaOH-val szemben, majd ismét ellen o˝ riztük az oldat pH-ját. Ezután a mintánkat 2 percig dializáltuk 100 mM pH 7.4 TRIS pufferrel szemben az oldat pH-jának stabilizálása érdekében. Kontrollkísérletként megvizsgáltuk a sókoncentráció változásának hatását az -krisztallin mintára. A kontrollminta készítésekor a 10 mM pH 7.4 TRIS pufferben feloldott mintát 3 percig 0.1 M NaCl-el szemben dializáltuk. A rövid ideig tartó pH sokk vizsgálata során a funkció vizsgálatára szolgáló chaperon teszteket a pH sokk után, pH 7.4-en végeztük el. Savas pH-n csak szerkezeti mérésekre került sor.

2.3. Nagy nyomás Kísérleteinkben a nagy nyomást kétféle módon állítottuk elo˝ . Az FTIR mérések során üll˝os gyémántcellát használtunk. A gyémántcellában a fém tömítéssel körülzárt minta két gyémánt között helyezkedik el. A gyémántokat üllo˝ k tartják, és egy csavar segítségével szabályozható a gyémátokat összeszorító ero˝ , ezáltal a nyomás. A gyémántcellában alkalmazott er˝oátvitel és a kis felület miatt nagy nyomás érheto˝ el [171]. A nyomás mérésére bárium-szulfátot használtunk [172]. A mintatér kis térfogata ( 7

nl) miatt az alkalmazott

fehérje koncentráció igen nagy, 75 mg/ml volt. Pufferként 100 mM pD 7.0 TRIS puffert használtunk. A többi nyomáskísérletben hidraulikus nyomáscellát (úgynevezett "bombát") használtunk. Ebben a cellában a nagy nyomást egy külön pumparendszerrel építjük fel, és folyadék közvetíti [173]. A pumparendszer egy alacsony nyomású (<100 MPa) el o˝ pumpából, illetve egy magas nyomású (maximum 500 MPa) dugattyús fo˝ pumpából áll. Kísérleteinkben mindkét pumpa svájci Nova Swiss gyártmányú volt. A nyomást közvetít o˝ folyadékként 24

tiszta vizet használtunk, amivel ugyan nagyobb a csövek korróziójának veszélye, ugyanakkor nem zavarja a spektroszkópiai méréseket, szemben az általánosan használt nagy tiszta5 ságú olajjal. A cella térfogata 2 cm volt, három oldalról zafír ablakok határolják, leheto˝ vé téve a fluoreszencia és abszorbanciaméréseket. A cellába a mintát egy teflondugóval lezárt 100 8 l térfogatú kvarc küvettában helyeztük el. A nyomás mérését egy elektronikus nyomástávadóval végeztük el. A kísérletek során 50 mM pH 7.4 TRIS puffert használtunk, és a fehérje koncentráció 2 mg/ml volt.

2.4. Chaperon aktivitás mérése A kis h˝o-sokk fehérjék egyik fontos feladata más fehérjék aggregációjának gátlása. Aktivitásuk vizsgálatakor egy alkalmas szubsztrát fehérjét valamilyen módon aggregáltatnak, és e fehérje aggregációjának csökkenésével jellemzik a chaperon aktivitást. Az aggregációt spektrofotométerben, illetve luminométerben fényszórás mérésével követhetjük nyomon. Spektrofotométerben az aggregáció miatt fellépo˝ látszólagos abszorbancianövekedést figyelhetjük meg, míg konvencionális luminométerben az aggregátumok fényszórását mérhetjük közvetlenül. Az irodalomban található különböz o˝ szubsztrátokat a 2.1 táblázat tartalmazza. 2.1. táblázat. Különböz˝o szubsztrátok a kis h˝o-sokk fehérjék vizsgálatához szubsztrát

denaturáció módja hivatkozás

inzulin

redukció

[174]

 -krisztallin

UV besugárzás

[175]

 -krisztallin

h˝odenaturáció

[176]

rodanáz

h˝odenaturáció

[177]

citrát szintáz

h˝odenaturáció

[178]

abrin

redukció

[179]

Az inzulin redukcióján alapuló teszt során az inzulin A és B láncai közti diszulfidhidakat [180] redukálószer (DTE) segítségével felszakítjuk, ekkor a B láncok egymáshoz tapadva aggregálódnak, miközben az A láncok az oldatban maradnak. Többen kimutatták, hogy az

-krisztallin meggátolja, illetve lassítja az inzulin B láncok aggregációját 25

1.4

a

1.2 1 OD

9::

0.8 0.6

b

0.4 0.2 0

0

5

10

15

20

25

30

35

40

t (min) 2.1. ábra.

Inzulin DTE által kiváltott aggregációját jellemzo˝ 400 nm-en mért látszóla-

gos abszorbancia (OD; << ) változása -krisztallin nélkül (a), illetve -krisztallinnal (b) Az = -krisztallin hatásának szemléltetésére itt 1:1 inzulin: = -krisztallin monomer arányt használtunk, eltér˝oen a kés˝obbi mérésekto˝ l. A kísérlet során 0.1 mólos pH 7.4 TRIS puffert használtunk, az inzulin koncentrációja 0.5 mg/ml, az = -krisztallin koncentrációja 1.8 mg/ml volt.

[174, 175, 170]. Ennek hatásfoka függ az inzulin/ -krisztallin aránytól, az -krisztallin esetleges el˝okezelését˝ol, valamint a kémiai körülményekt˝ol. Szobah˝omérsékleten az krisztallin csak nagy mennyiségben védi meg az inzulint, a kismennyiség˝u -krisztallin véd˝ohatása elhanyagolható. A nyomás és a pH sokk hatásának vizsgálata során nem alkalmazhattunk olyan módszert, ahol magas h˝omérséklet hatására aggregálódik a megvédendo˝ fehérje, hiszen a h˝okezelés az -krisztallin chaperon aktivitását is megváltoztatja, megnöveli [175]. Így kísérleteinkben -krisztallin esetében az inzulin aggregációs tesztet alkalmazunk. Az inzulin koncentrációja 0.5 mg/ml, az -krisztallin koncentrációja 0.6 mg/ml, a DTE koncentrációja pedig 6 mg/ml volt. Pufferként 0.1 M 7.4 pH-jú TRIS puffert használtunk. Az inzulin/ krisztallin (monomer) arány kísérleteinkben megközelíto˝ leg 3 volt, abból a célból, hogy a kezeletlen -krisztallin még ne mutasson jelento˝ s védelmet. A kísérletek során a minta h˝omérséklete 21-22  C volt. A 2.1 ábrán inzulin DTE hatására kiváltott aggregációját láthatjuk -krisztallin nélkül (a), illetve -krisztallin jelenlétében (b). Az aggregáció mérése spektrofotométerben történt, az aggregáció miatt fellép˝o látszólagos abszorbancianövekedés detektálásával 400 26

nm-en. Látható, hogy a chaperon jelenléte csökkenti az aggregációt. Az aggregációs görbék jól illeszthet˝oek egy exponenciális telítési görbével. Az aggregáció jellemzésére a görbék határértéke volt alkalmas, amit az illesztésbo˝ l kaptunk. Ezt az abszorbanciaértéket a kontrollmintához (inzulin aggregációja chaperon nélkül) viszonyítva egy, a chaperon aktivitásra jellemz˝o mennyiséget kapunk. A kés˝obbiekben ezzel jellemezzük a chaperon aktivitást: chaperon aktivitás = 1 – minta aggregációja/kontroll aggregációja Más szubsztrát alkalmazása során is hasonló aggregációs görbéket kaptunk, ezeket a görbéket szintén a fenti módon értékeltük ki. Az MjHSP16.5 chaperon aktivitása csak 50  C felett jelentkezik [117]. Így chaperon aktivitását rodanáz és citrát szintáz teszttel vizsgáltuk, mert ezek a tesztek m˝uköd o˝ képesek ebben a h˝omérséklet-tartományban. Pufferként 50 mM TRIS puffert használtunk, a pH a kísérletek során 7.4 volt. A szubsztrátkoncentráció 3 mg/ml, a chaperon koncentráció 0.6 mg/ml volt. Az aggregációt 50  C-on mértük hagyományos luminométerben. A mérés során a minta fényszórását detektáltuk 400 nm-en. E módszerrel kisebb aggregáció is detektálható, mint a fényszórás miatt fellep˝o látszólagos abszorbancia mérésével abszorpciós spektrofotométerben.

2.5. Fluoreszcencia mérések 2.5.1. Triptofán fluoreszcencia Az -krisztallin A alegységén 1, B alegységén 2 triptofán található. Az MjHSP16.5-ben alegységenként 1 triptofán van [16]. A triptofán fluoreszcencia emissziója nagymértékben függ a triptofánok környezetét˝ol, így a spektrum alakja és a spektrum maximumának helyzete információt ad a triptofán aminosavak környezetében a fehérje másodlagos és harmadlagos szerkezetér˝ol. A fehérjék emissziós spektrumát EAI CD 900 és Jobin-Yvon Fluorolog fluoriméterekkel vettük fel. A nyomáscellában végzett mérések esetén a résméret 2 nm volt, más mérések esetében 1 nm-es résszélességgel dolgoztunk. A tirozinok emisszióját elkerülend˝o, 290 nm-en, 2 nm-es sávban gerjesztettük a triptofánt. A spektrumok maximumának meghatározására számos módszer áll rendelkezésünkre. 27

A klasszikus, Savitzky és Golay által kidolgozott módszernél [181] a maximum környezetében polinommal illesztjük a spektrumot, az illesztésbo˝ l meghatározva a maximum helyét. A maximum meghatározásának hibája a mérési pontok hibáiból számítható [182]. További lehet˝oség a spektrum súlypontjának meghatározása, ami már hordoz magában némi információt a spektrum alakjáról is, valamint található az irodalomban több olyan függvény, amivel a triptofán fluoreszcencia spektrumok alakja illesztheto˝ [183]. Az illesztéses módszerek el˝onye továbbá az, hogy a spektrumcsúcs helyzete a mérésnél alkalmazott hullámhosszlépésnél nagyobb pontossággal is meghatározható [182]. Burstein módszerénél [183] például az illesztés során a spektrumokat áttranszformáltuk hullámszámskálára, korrigálva az intenzitásokat a skálatranszformáció miatt fellép o˝ látszólagos intenzitásváltozással: >@?ACB *

>@?D0BFEGDIH

(2.1)

majd a hullámszámskálán ábrázolt spektrumra lognormális függvényt illeszthetünk: $ A H\[ >@?ACB * >KJMLONQPSRUTVXW $ A]J_^ (2.2) HZY TV [ TV >`?AaB A >bJ ahol a hullámszámnál mérhet˝o fluoreszcencia intenzitás, az illesztett spektrum Y A J maximumának magassága, a spektrum aszimmetriájára jellemz o˝ alakparaméter, a maximum helye, [ pedig egyéb illesztési paraméter. A maximum helyét az illesztésb o˝ l A]J kapott érték adja meg.

2.5.2. ANS jelölés A fehérjék hidrofób felületeinek vizsgálatára egy fluoreszcens jelz o˝ t, ANS-t használtunk [184]. Az ANS vizes oldatban gyengén fluoreszkál, emissziós maximuma 535 nm-nél található, azonban apoláros környezetben (például egy fehérje elérhet o˝ hidrofób felületéhez köt˝odve) emissziós maximuma kék irányba, 460 nm-re tolódik el, és a fluoreszcencia kvantumhatásfoka több, mint egy nagyságrenddel is megno˝ het. Ezáltal az ANS fluoreszcencia intenzitásának mérésével információt kaphatunk arról, hogy vannak-e a fehérjén található, oldószer által elérhet˝o hidrofób felületek. Méréseink során a Sigma cégt˝ol vásárolt ANS-t 96 %-os alkoholban oldottuk fel, majd a fehérjéhez való hozzáadása el˝ott a mérésben használt pufferrel higítottuk. Az ANS flu28

oreszcencia emissziójának intenzitását 460 nm-es hullámhosszon mértük, 380 nm-es gerjesztés mellett. A kísérlet során a fehérje/ANS arányt úgy kell megválasztani, hogy a kiindulási állapotban megkötött ANS molekulákon felül a szerkezetvátozás során esetlegesen szabaddá váló köt˝ohelyekre is be tudjon kötni az ANS, azaz legyen még szabad ANS az oldatban. A szükséges ANS mennyiségének megállapításához tegyük fel, hogy minden egyes kis / h˝o-sokk fehérje alegységen átlagosan köto˝ hely van! A fehérje szerkezetváltozásának következménye, hogy a fehérjén lév˝o ANS köt˝ohelyek száma változik. Ha feltesszük, hogy az egyes köt˝ohelyekre egymástól függetlenül kötnek be az ANS molekulák, akkor a köt o˝ dés az alábbi els˝orend˝u reakció szerint történik: szabad köt˝ohely + szabad ANS c

Komplex

a reakció egyenlete a következ˝o: ? /Qde$f2 Bhg%?i

$f2 B

2 c

(2.3)

/ a kis h˝o-sokk fehérje alegységek teljes (szabad és kötött állapotú) koncentrációja, i az egy alegységen lév˝o köt˝ohelyek átlagos száma, az ANS teljes (szabad és kötött) kon2 centrációja, a kis h˝o-sokk fehérjéhez kötött ANS koncentrációja. Az általunk mérhet o˝

ahol

d

jel (az ANS fluoreszcencia intenzitása) arányos a fehérjéhez kötött ANS mennyiségével, 2 -vel. Definíció szerint a folyamat disszociációs állandója: jlk *

Ha bevezetjük a op

*eq

?mi

$n2 Bb? /Qde$f2 B 2

(2.4)

arányt — mint az ANS/fehérje mólarányt — figyelembe véve, hogy

a keletkezett komplex mennyisége nem lehet nagyobb, mint a hozzáadott ANS mennyiséqsrtd(r jlk ge, akkor a keletkezett komplex koncentrációja kifejezheto˝ és függvényében: 2u*

A 2.2 ábrán

?q g

/ Bd

g\jvk $

, w?q g

jlk

W /

/ Bd

g\jvkyx H ${zq@/Qd H

(2.5)

=1,1 8 M [185] esetére ábrázoltuk a 2.5 egyenlet megoldásait különböz o˝

köt˝ohelyszám ( ) esetén. Fehérjekoncentrációnak 24 8 M-t választottunk, ami megfelel a kísérleteinkben szokásos fehérjekoncentrációnak. Látható, hogy a kötött ANS mennyisége ez esetben már viszonylag kis ANS/fehérje arány mellett is telítésbe megy az elméleti 29

T: Kötött ANS mennyisége ( M) |

/

50 40

/

30 /

=2 =1.5 =1

20 10 0

0

1

3 2 4 x=P/A: ANS/fehérje arány

5

2.2. ábra. A megkötött ANS mennyisége az ANS/fehérje arány függvényében különböz o˝ k köt˝ohelyszám eseténAz ábrán } =1,1 ~ M [185] esetére ábrázoltuk a 2.5 egyenlet megoldásait különböz˝o átlagos köt˝ohelyszámok (  =1;1,5;2) esetében. Fehérjekoncentrációnak 24 ~ M-t választottunk

maximum (minden köt˝ohely foglalt) felé, a feltétel a 2.5 egyenlet analízise alapján csak az, hogy a fehérje koncentrációja legyen legalább egy nagyságrenddel nagyobb, mint az egyensúlyi állandó. Az ábrából leolvasható az is, hogy kísérleteinkben célszer˝u minél nagyobb ANS/fehérje arányt választani, hiszen ebben a tartományban a kötött ANS mennyiségét els o˝ dlegesen a köt˝ohelyek száma befolyásolja és az eredményt a bemérési pontatlanságok gyakorlatilag nem zavarják. Abban az esetben, ha a köt˝ohelyek száma megn˝o, a kötött ANS mennyisége nagyobb P/A aránynál éri el a telítési értéket. Ha kis mennyiség˝u ANS-el dolgoznánk, egyes esetekben telítési görbét figyelhetnénk meg az ANS köto˝ désben akkor is, ha egyszer˝uen elfogyott a szabad ANS az oldatban. Hogy ezt a leheto˝ séget kizárjuk és ténylegesen az ANS köto˝ helyek számának változását figyeljük meg, a késo˝ bbiekben minden telítési görbét nagyobb mennyiség˝u ANS-el is reprodukáltunk.

30

2.6. FTIR spektroszkópiai mérések A triptofán emissziós spektruma csak a triptofánok lokális környezetének másodlagos és harmadlagos szerkezetér˝ol ad információt. Ahhoz, hogy a vizsgált fehérjék másodlagos szerkezetér˝ol teljesebb képet kapjunk, más vizsgálati módszerekhez kell nyúlnunk. Munkánk során FTIR (Fourier transzformációs infravörös spektroszkópia) és CD (cirkuláris dikroizmus) spektroszkópiát alkalmaztunk. Az infravörös abszorpciós spektrum vizsgálatával a molekulák rezgési állapotairól nyerhetünk információkat. Egy N atomból álló rendszernek 3N–6 rezgési módusza van [186], azonban ezek a móduszok fehérjemolekulák esetében nem teljesen függetlenek egymástól. Így a fehérjék infravörös (IR) spektrumában az elnyelési vonalak csoportokba, úgynevezett sávokba rendez˝odnek. Fehérjék esetében a peptidkötés 9 különbözo˝ elnyelési sáv kialakulásában játszik szerepet. A gyakorlatban e 9 sáv közül az amid I sávot használják a legtöbbet a fehérjék vizsgálatához.

O 


C „„†

€ €‚€  €€ € € € C€€ƒ

„„

„ „„ „ „‚… „

N H

2.3. ábra. Az amid I sávban szerepet játszó rezgésekAz amid I sáv elnyelése 80 %-ban a C – O nyújtási rezgésekbo˝ l adódik, de szerepet játszanak még benne a C – N kötés nyújtási, valamint a C ‡ – C – N atomhármas deformációs rezgései is

Az amid I sáv azért alkalmas különösen a fehérjék másodlagos szerkezetének vizsgálatára, mert 80%-ban a peptidkötésben lévo˝ C-O kötés nyújtási rezgéséb˝ol ered (2.3. ábra), így érzékeny a fehérjén belüli, illetve a fehérje és oldószere között kialakuló H-kötésekre. Jackson és Mantsch kimutatták továbbá, hogy a peptidkötés dihedrális szögei (amelyek a 31

fehérje másodlagos szerkezetét˝ol függenek [187]) és az amid I sáv elnyelési frekvenciái között korreláció van [188]. Az els˝o ilyen irányú kutatásokat az 1950-es évek elején végezték amikor Elliott és Ambrose a poli-L-glutamát dietil észtert vizsgálva azt találták, hogy amid I sávjában domináns az 1659 cm ˆI‰ -nél található elnyelési vonal. Mivel ez a polipeptid a röntgendiffrakciós vizsgálatok alapján -hélix szerkezet˝u, eredményük az elso˝ lépés volt a fehérjék infravörös elnyelési spektrumának megértésében. Késo˝ bb számos elméleti és gyakorlati kutatás során további ismeretekre tettek szert az amid I sáv és a fehérje másodlagos szerkezete közötti összefüggésekr˝ol. Mivel az amid I sávot több, egymással átfedo˝ elnyelési vonal alkotja (ezeket a vonalakat néha sávoknak is nevezik) az infravörös abszorpciós spektrumok kiértékelése során szükség van valamilyen eljárásra, amivel ezeket a vonalakat észlelni tudjuk. Ilyen módszer a spektrum deriválása [189], vagy a Fourier-dekonvolúció [190]. Az egyes elnyelési vonalak ismeretében további információkat szerezhetünk a fehérje másodlagos szerkezetér˝ol az elnyelési vonalak helyzete alapján. Az egyes szerkezeti motívumokra jellemz˝o abszorpciós csúcsok átlagos helyezetére vonatkozó információkat a 2.2 táblázat tartalmazza. Fontos megjegyezni, hogy a 2.2 táblázatban feltüntetett csúcspozíciók átlagos értékek, inkább csak a tájékozódást szolgálják. E csúcsok pontos pozíciója minden fehérjében más és más, így az adott fehérjét˝ol függetlenül nem lehet o˝ ket megadni. Például mioglobin esetében – amely nem tartalmaz  -lemez szerkezetet – az amid I sáv jelent˝os elnyelést mutat 1640 cm ˆI‰ alatt, holott ebben a tartományban általában a  -lemez szerkezetben gazdag fehérjék nyelnek el (2.2 táblázat). Modell számítások igazolták, hogy az 1640 cm ˆI‰ alatti tartományban megfigyelhet˝o elnyelési sáv származhat az -hélixekb˝ol is [191]. Egyes vélemények szerint ennek oka az, hogy az oldószer által elérhet o˝ C=O csoportok hidrogénkötést létesítenek a vízzel [192], mások szerint inkább a hélixeket összeköt˝o szakaszok okozzák ezeket az elnyelési vonalakat [193]. Így tehát kizárólag az IR spektrum ismeretében a fehérje másodlagos szerkezetéro˝ l nem lehet megbízható következtetéseket levonni. A kis h˝o-sokk fehérjék vizsgálata során számunkra az intermolekuláris  -szerkezetre jellemz˝o oldalsávok, valamint a rendezetlen fehérjeszerkezetre utaló 1645 cm ˆI‰ nél található elnyelési vonal volt a legfontosabb. Mivel a kis ho˝ -sokk fehérjék oligomer szerkezetének kialakulásában nagy jelent˝oségük van az alegységek közötti intermolekuláris  32

2.2. táblázat. A fehérjék másodlagos szerkezeti elemeire jellemz o˝ elnyelési csúcsok hely-

zete az amid I sávban motívum

csúcs helyzete (cm ˆI‰ )

intermolekuláris  -red˝o

1616

 -red˝o

1624

 -red˝o

1631

 -red˝o

1637

rendezetlen

1645

-hélix

1654

 -kanyar

1663

 -kanyar

1670

intermolekuláris  -red˝o

1675

 -kanyar

1683

intermolekuláris  -red˝o

1683

 -kanyar

1688

 -kanyar

1694

red˝onek, ezért az IR spektrum a fehérjék negyedleges szerkezetér o˝ l is információt ad. Ezáltal a rendezetlen szerkezetre jellemz˝o csúcs amplitúdójával az alegységek másodlagos szerkezetét követhetjük nyomon.

2.6.1. Mintakészítés FTIR méréshez a fehérjemintánkat D H O-ban kell feloldanunk, mivel a közönséges víz egyik elnyelési sávja egybeesik az amid I sávval. A mintakészítés során a liofilizált fehérjét nehézvízzel készült 100 mM pD 7.0 TRIS pufferben oldottuk fel 75 mg/ml koncentrációban. A mintát ezután egy éjszakán keresztül tároltuk, hogy a H/D kicserél o˝ désre elég id˝o jusson. A pD mérését hagyományos pH elekróddal végeztük, a nehézvíz hatását az izotópeffektusra történ˝o korrrekcióval vettük figyelembe: pD = leolvasott érték+0.4.

33

2.7. Sztatikus fényszórás Az eddig bemutatott vizsgálati módszerek a fehérje másodlagos és harmadlagos szerkezetér˝ol szolgáltattak helyi, illetve globális információkat. Az FTIR mérésekb o˝ l közvetve következtethetünk a negyedleges szerkezetre, de ez még nem ad teljes képet az oligomer szerkezetr˝ol, hiszen az intermolekuláris  -lemezek mellett más, gyengébb kölcsönhatások is részt vesznek az oligomerek kialakításában. Ezért a negyedleges szerkezet részletesebb vizsgálatához statikus fényszórásmérést alkalmaztunk. A sztatikus fényszórásmérés csupán kvalitatív információkat szolgáltat az oldatban lév˝o oligomerek átlagos méretér˝ol. A gyér információtartalom ellenére azonban nagyon jól alkalmazható, mivel mérése gyors és egyszer˝u, és nagy nyomás mellett is lehet mérni. A sztatikus fényszórásnál feltételezzük, hogy a részecskék megközelít o˝ en gömb alakúak, és ez az alak a kísérlet során nem változik jelento˝ sen, azaz az oligomerek szerkezetváltozása csupán abban nyilvánul meg, hogy kisebbek lesznek. Ha a vizsgált részecskék mérete legalább egy nagyságrenddel kisebb a mérésben alkalmazott fény hullámhosszánál, akkor a részecskék fényszórása jól közelítheto˝ a Rayleigh-szórással. Ez a feltétel mindkét vizsgált fehérje esetében teljesül, hiszen a mérések során a fényszórást 400 nm-nél vizsgáltuk, a kis h˝o-sokk fehérje oligomerek mérete pedig körülbelül 10 nm. Rayleigh szórás esetén a fehérjemintáról Š szög alatt szórt fény intenzitását a következ o˝ képlet adja meg: >b‹Œ *Ž

ŽI‘“’  ? ”•g\–O—˜H B D ; Š

(2.6)



D a szórócentrumok (a fehérjemolekulák) számát, ‘ a szórócentrumok sugarát, a  szóródó fény hullámhosszát, pedig egy, a fényt szóró molekulák alakjától és dielektro-

ahol

mos tulajdonságaitól függ˝o faktort jelöl. Fehérjeminta mérése esetén az oligomer térfogata arányos az oligomert alkotó alegységek számával, így a szórt fény intenzitása arányos az oligomereket alkotó alegységek számának négyzetével. Az oligomerek száma viszont fordítottan arányos az egy oligomerben lév˝o alegységek számával, így a szórt fény intenzitására azt kapjuk, hogy: >b‹Œ

%™

(2.7)

ahol ™ az egy oligomert alkotó alegységek száma. Azaz a mintáról szórt fény intenzitása arányos az oligomerek méretével. 34

A 2.7 egyenlet szerinti eredmény viszont csak abban az esetben érvényes, ha a szórócentrumok egyformák. Ez általában nem teljesül, például az -krisztallin esetében ismert, hogy az oligomerek nem egyformák, az átlagos méretük 40 alegység. Ha feltételezzük, hogy az oligomerek méreteloszlása normális eloszlású: ” š ? B * (2.8) ™ ›œ W žGŸ ˆ¡ £¢I§¤ © ¥)§ ¦¨§ š ? B ™ jelöli az ™ alegységb˝ol álló oligomerek relatív számát az összes oligomerhez ahol képest, ª az egy oligomert alkotó alegységek számának várható értékét, › pedig az oligomerek méretének szórását. Figyelembe véve azt, hogy a rendszerben a fehérjealegységek š ? Bt« száma állandó, az ™ alegységb˝ol álló oligomerek száma arányos lesz ™ ª -el. Mivel az egy molekuláról szórt fény intenzitása a térfogat négyzetével, és így az alegységet alkotó H oligomerek számának négyzetével arányos, a mintáról szórt fény intenzitását ™ várható értéke adja meg: >‹Œ

_¬­™

H ® * X

¯I° ±

” ›  ª œ W ž ˆ

°

™

H

ˆ  ²¢Z¤ ¥t¦ § ™ Ÿ §© §´³

* ª

g

› H ª

(2.9)

Azaz az oligomer populáció heterogenitása növeli a fényszórást. Amennyiben pedig az inhomogenitást jellemz˝o › szórás értéke nagyobb, mint az egy oligomert alkotó alegységek számának várható értéke, ª , a növekvo˝ átlagos oligomermérettel a minta fényszórása csökken. A minta fényszórását kétféle módon lehet mérni: mérhetjük konvencionális luminométerben a 90  alatt kiszórt fényintenzitást (ez az érzékenyebb), vagy pedig nyomon követhetjük abszorpciós spektrofotométerben a fényszórás miatt fellép o˝ látszólagos abszorbancianövekedést. Az utóbbi módszer kevésbé érzékeny, csak nagyobb koncentrációk és nagyobb méret˝u részecskék esetén alkalmazható, nagyobb méret˝u részecskék esetében azonban már nem alkalmazható a Rayleigh-szórásos közelítés. Vizsgálatainkban a fényszórást 400 nm-es hullámhosszúságú fénnyel, egy konvencionális luminométerben mértük. A sztatikus fényszórás mérése során a fehérjeminta koncentrációja 5 mg/ml volt.

35

3. fejezet Eredmények 3.1. Nagy nyomásos kísérletek 3.1.1. Chaperon aktivitás mérések A 3.1 ábrán a nagy nyomás hatását láthatjuk az

-krisztallin chaperon m˝uködésére. A

kísérlet során az -krisztallin mintát 20 percig 300 MPa nyomáson tartottuk, majd légköri nyomásra visszatérve mértük meg a minta chaperon aktivitását. Ebben a kísérletben inzulin aggregációs tesztet használtunk, az inzulin aggregációját az oldat látszólagos abszorbanciájának 400 nm-es hullámhosszon való mérésével követtük nyomon. Az inzulin koncentrációja 0.4 mg/ml, a DTE koncentrációja 2 mg/ml, míg az -krisztallin koncentrációja 0.5 mg/ml volt, ami 3:1 inzulin: -krisztallin (monomer) mólaránynak felel meg. Kontrollkísérletként megvizsgáltuk az inzulin aggregációját önmagában (3.1 ábra [ görbe), illetve kezeletlen -krisztallin jelenlétében is (3.1 ábra µ görbe). Látható, hogy a nyomás– kezelt -krisztallin jobban gátolja az inzulin aggregációját (3.1 ábra és görbe), és ez a ³ megnövekedett aktivitás id˝ovel csökken (3.1 ábra görbe). ³ Az aktivitásnövekedés id˝obeli csökkenését követhetjük nyomon a 3.2 ábrán. Ebben a kísérletben 20 percig 300 MPa nyomáson tartottuk az -krisztallint. A légköri nyomásra való visszatérés után megadott ideig 22  C-on tartottuk a mintát és az aktivitásmérést csak ezután végeztük el. A 3.2 ábrán látható, hogy a megnövekedett aktivitás id o˝ ben csökken, az adatokra exponenciális görbét illesztve a csökkenés karakterisztikus ideje 2.0 ¶ 0.5 h. A 3.2 ábrán látható chaperon aktivitásokat az inzulin -krisztallin nélkül történ o˝ aggregációjához viszonyítva az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint számoltuk ki. 36

Abszorbancia

2

a b

1.5

c

1

d

0.5 0 0

5

10

15 t (min)

20

25

30

3.1. ábra. Nyomáskezelés hatása az -krisztallin m˝uködésére: Inzulin DTE hatására tör-

tén˝o aggregációja -krisztallin nélkül ill. jelenlétében. a.) Inzulin aggregációja önmagában, b.) kezeletlen = -krisztallin jelenlétében, c.) 4 órával nyomáskezelés után, d.) nyomáskezelés után azonnal

chaperon aktivitás (a. u.)

0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1

0

5

10

15 t (h)

20

25

30

3.2. ábra. Az -krisztallin aktivitásának relaxációja nyomáskezelés után. Az ábrán az id o˝ a chaperon teszt megkezdésnek idejét jelenti a 300 MPa-os nyomáskezelés után. A vízszintes hibasávok mutatják az ido˝ mérés hibáját a chaperon teszt relatív hosszú ( · 30 perc) id o˝ tartama miatt.

37

Chaperon aktivitás (a.u.)

0.5 0.45 0.4 0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05

0

50

100

150 200 p (MPa)

250

300

350

3.3. ábra. Az -krisztallin chaperon aktivitásának függése az alkalmazott nyomástól A kísérlet során különbözo˝ nyomásokon 20 percig tartottuk az = -krisztallint, majd légköri nyomáson inzulin teszttel megmértük az aktivitását. Az x tengelyen a kísérlet során alkalmazott nyomás látható. Az eredményekre Boltzmann görbét illesztve az átmenet 170 MPa-nál található, szélessége 40 MPa

Megvizsgáltuk a nyomáskezelés során alkalmazott nyomás hatását is a chaperon aktivitás növekedésére (3.3 ábra). Az eredményekbo˝ l kit˝unik, hogy 0-340 MPa tartományban az aktivitás növekszik a perturbáció során alkalmazott nyomással. Az adatokra illeszteni lehet egy Boltzmann-görbét: ¸ ?q B *

$¹d ” ”•g

¤¼

g d H

(3.1)

Ÿaº º» Ez a függvény két állapot közötti átmenetet írº le, ahol a mért fizikai mennyiség értéke d $Žd d q a kiindulási állapotban H ; a végállapotban H . Az átmenet középpontja < -ban ‰ q található, a paraméter az átmenet szélességét jellemzi. ³ A chaperon aktivitás nyomáskezelés során való változásának mérésekor a két állapot

között történ˝o átmenetet feltételezve az illesztett átmeneti nyomás 170 MPa, az átmenet szélessége 40 MPa. A mérés során a mintákat 20 percig tartottuk a megfelel o˝ nyomásokon. Az aktivitásnövekedés a perturbáció id˝otartamától nem függ jelent˝osen, a méréseket 5, 10, 15 és 30 perces nyomásperturbációval megismételve hibahatáron belül ugyanazt az eredményt kaptuk. A nagy nyomás hatása az MjHSP16.5 esetében hasonló az -krisztallinnál találthoz. 38

Abszorbancia

0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0

a b c

0

5

10

15

20 25 t (min)

30

35

40

3.4. ábra. Nyomáskezelés hatása az MjHSP16.5 m˝uködésére. a.) rodanáz aggregációja önmagában, b.) kezeletlen MjHSP16.5 jelenlétében, c.) nyomáskezelés után azonnal

Mivel ez a fehérje termofil és szobah˝omérsékleten nincs chaperon aktivitása [64], ezért a méréseket magasabb h˝omérsékleten, 48  C-on végeztük el. Chaperon tesztnek rodanáz aggregációt választottunk. Az aggregációs kísérlet eredménye a 3.4 ábrán látható. A kísérlet során a rodanáz koncentrációja 0.5 mg/ml, az MjHSP16.5 koncentrációját úgy választottuk meg, hogy a rodanáz:MjHSP16.5 (monomer) mólarány 2:1 legyen. Kontrollkísérletként megvizsgáltuk a rodanáz aggregációját önmagában (3.4 ábra [ görbe), illetve kezeletlen MjHSP16.5 jelenlétében is (3.4 ábra µ görbe). Látható, hogy a nyomáskezelt – MjHSP16.5 jobban gátolja a rodanáz aggregációját (3.4 ábra görbe).

39

3.1.2. Szerkezeti mérések A chaperon aktivitás mérések után különbözo˝ szerkezetvizsgálati módszerekkel tártuk fel, hogy milyen szerkezeti változás állhat a megnövekedett chaperon aktivitás hátterében. Triptofán fluoreszcencia mérések A 3.5 ábrán a nagy nyomás hatását láthatjuk az -krisztallin fluoreszcencia spektrumára. A spektrumokat kétféle módon értékeltük ki. Elo˝ ször Savitzky-Golay módszerrel megkerestük a maximum helyét. Mivel a nyomás függvényében a spektrumok eltolódása kicsi volt, a kiértékelést ellen˝orzésképpen a Burstein-féle lognormális eloszlásfüggvény illesztésével is elvégeztük. A 3.5 ábrán a Burstein-féle illesztés eredményét láthatjuk, azonban ez megegyezik a Savitzky-Golay módszerrel kapott eredménnyel, a lognormális eloszlásfüggvény egyéb paraméterei nem adtak további információt. 335

(nm)

334.5

½a¾¿À

334 333.5 333 332.5 332

0

100

200 p (MPa)

300

3.5. ábra. Nagy nyomás hatása az -krisztallin fluoreszcencia spektrumára A folytonos vonal a nyomás növelésekor, a szaggatott vonal a nyomás csökkentésekor kapott eredményeket ábrázolja. A triptofánok gerjesztése 290 nm-en történt. A spektrumok maximumát a 2.2 egyenlet szerinti görbével illesztettük, majd az eredményeket visszatranszformáltuk hullámhosszskálára.

A 3.5 ábrán látható, hogy nagy nyomás hatására a fluoreszcencia spektrum 100 MPa felett eltolódik vörös irányba 350 MPa-ig közel 2 nm-t. Az eltolódás kismértékben, de még éppen mérhet˝oen a légköri nyomásra való visszatéréskor is fennmarad. A spektrum Y alakját jellemz˝o paraméter a mérési hibahatáron belül változik. Meg kell jegyezni, hogy 40

a spektrum eltolódása 350 MPa-ig még éppen mérheto˝ , de nagyon kicsiny, viszont nagyobb, mint amit triptofán esetében egy triptofánt tartalmazó 6 aminosavas peptid belsejében megfigyeltek [194]. Ezért kizárható, hogy csupán a triptofán nagy nyomás hatására bekövetkez˝o spontán spektrumeltolódását figyeltük volna meg. A változás azonban így is kicsi, azaz a triptofán fluoreszcencia spektrum nem mutat a fehérjében lényeges másodlagos és harmadlagos szerkezeti változást a 0-350 MPa nyomástartományban. A triptofánok környezetében csak nagyon finom szerkezeti változások történnek. 329

(nm)

328.5 328

½a¾¿À

327.5 327

0

100

200 p (MPa)

300

400

3.6. ábra. Nagy nyomás hatása az MjHSP16.5 fluoreszcencia spektrumára A triptofánok gerjesztése 290 nm-en történt. A spektrumok maximumát a 2.2 egyenlet szerinti görbével illesztettük, majd az eredményeket visszatranszformáltuk hullámhosszskálára.

Nagy nyomás hatására hasonló változás látható az MjHSP16.5 fluoreszcencia spektrumán (3.6 ábra), azzal az eltéréssel, hogy itt a triptofán fluoreszcencia spektrumának eltolódása még kisebb: 420 MPa-ig csupán 1 nm. Ez az eltolódás egybeesik a triptofán és származékai saját nyomáseffektusával [194], így elmondhatjuk, hogy a triptofán környezetének változása az MjHSP16.5 fehérjében 420 MPa nyomásig elhanyagolható. ANS köt˝odés Az ANS fluoreszcenciájának intenzitása olyan jel, ami a fehérje felszínén a festék köt o˝ dése számára elérhet˝o hidrofób tartományok mennyiségét jellemzi. Érdekes módon a kis h o˝ sokk fehérjék már natív állapotban jól kötik az ANS-t, ami azt sugallja, hogy már ekkor 41

20

(a.u.)

15

: Á 9Â

10 5 0

0

2

6 8 4 ANS/ -krisztallin arány

10

3.7. ábra. -krisztallin titrálása ANS-el. A titrálási eredményekre a 2.5 egyenlet szerinti elméleti görbét illesztettük, az illesztés eredménye alapján egy = -krisztallin alegységen átlagosan 1.1 Ã 0.1 ANS köt˝ohely van.

számos ANS által elérhet˝o hidrofób felszínük van [185]. Els˝o lépésként az -krisztallin által megköthet˝o ANS mennyiségét határoztuk meg titrálással. Az eredmények a 3.7 ábrán láthatóak. A mért értékekre jól illeszthet˝o a 2.5 egyenlet szerinti elméleti görbe, az illesztés eredménye alapján egy -krisztallin alegységen átlagosan 1.1 ¶ 0.1 ANS köt o˝ hely van. 1.5 ANS fluoreszcencia intenzitása (a. u.)

1.4 1.3 1.2 1.1 1 0.9 0.8

0

50

100

150 200 p (MPa)

250

300

3.8. ábra. A hidrofób környezetben lévo˝ ANS fluoreszcencia intenzitásának változása a

nyomás függvényében. A hidrofób környezetet etanollal modelleztük.

42

A mérések kiértékelése során megvizsgáltuk a nagy nyomás hatását az ANS fluoreszcencia spektrumára hidrofób környezetben. A hidrofób környezetet itt etanollal modelleztük. Azért választottunk hidrofób oldószert, mivel egyrészt kísérleteinkben a fehérje hidrofób felszínéhez kötött, hidrofób környezetben lévo˝ ANS-t vizsgáltuk, másrészt vizes oldatban az ANS fluoreszcencia intenzitása két nagyságrenddel kisebb, mint apoláros környezetben, így vizes oldatban az effektust nem is tudtuk volna tanulmányozni. Az ANS mérések során a gerjesztés 380 nm-en történt, míg az ANS fluoreszcencia emisszióját 460 nm-en figyeltük meg. A 3.8 ábrán látható, hogy az ANS fluoreszcencia intenzitása nagy nyomás hatására 200 MPa nyomásig 30%-ot növekszik. Ezzel az intenzitásnövekedéssel minden kés˝obbi mérési adatot korrigáltunk. Az -krisztallinhoz köt˝od˝o ANS fluoreszcencia intenzitásának változása nagy nyomás hatására igen szembet˝un˝o (3.9 ábra), 350 MPa nyomásig több, mint négyszeresére növekszik. A rendszert légköri nyomásra visszaengedve az ANS fluoreszcencia intenzitása csökken, azonban magasabb marad, mint a nyomáskezelés el o˝ tt, megközelít˝oleg 40%-al. A kísérletben tízszeres feleslegben adtuk az ANS-t az -krisztallinhoz. 5 ANS fluoreszcencia intenzitás (a. u.)

4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1

0

50

100

150 200 p (MPa)

250

300

350

3.9. ábra. Az -krisztallinhoz köt˝od˝o ANS fluoreszcencia intenzitásának változása nyomás hatására. A mérést 10:1 ANS/ = -krisztallin (alegység) arány mellett végeztük, az ANS-t a nyomáskezelés el˝ott adtuk az = -krisztallinhoz. A gerjesztés 380 nm-en történt, míg az ANS fluoreszcencia emisszióját 460 nm-en figyeltük meg. A folytonos vonal illetve tele pontok a nyomás növelését, a szaggatott vonal illetve üres pontok a nyomás csökkentését jelölik.

A nagy nyomás alatti intenzitásnövekedés oka valószín˝uleg az lehet, hogy ANS mole43

kulák a fehérje belsejébe is bejutnak. A mechanizmus elso˝ hallásra meglep˝o, a Le Chatelier elvb˝ol következ˝oen nagy nyomás hatására a rendszer térfogatának csökkennie kell. Azonban a rendszer térfogata a fehérje, a fehérjében található üregek és az azt körülvev o˝ hidrátburok térfogatának összege. A rendszer össztérfogata csökkenhet, amennyiben a fehérje belsejében lév˝o üregekbe víz — vagy kísérletünkben ANS — jut [140]. A nyomáskezelés után atmoszférikus nyomáson 40%-al megnövekedett ANS fluoreszcencia intenzitásból arra következtethetünk, hogy a nyomáskezelés után újabb elérhet o˝ hidrofób köt˝ohelyek jelenhettek meg az -krisztallin felszínén. A kísérletet úgy elvégezve, hogy az ANS-t csak nyomáskezelés után adjuk az -krisztallinhoz, hasonló változást tapasztalunk, és a megnövekedett ANS köt˝odés még 48 óra után is mérhet˝o. Azaz az ANS köt˝odés segítségével egy maradandó, nem relaxálódó szerkezeti változást sikerült kimutatnunk a nyomáskezelés után az -krisztallinon. FTIR spektroszkópiai mérések A másodlagos szerkezet változását FTIR spektroszkópiával is megvizsgáltuk, mind az krisztallin, mind az MjHSP16.5 esetében. FTIR spektroszkópiával a fehérje másodlagos szerkezetér˝ol globális információkat szerezhetünk, míg például a triptofán fluoreszcencia spektroszkópia csak lokális, a triptofán aminosavak környezetéb o˝ l származó másodlagos és harmadlagos szerkezeti információt nyújt. A 3.10 ábrán láthatjuk az -krisztallin infravörös spektrumának változását nagy nyomás hatására. Az ábra A részén az infravörös spektrumok amid I sávja látható, különböz o˝ nyomásokon. Az áttekinthet˝oség kedvéért a spektrumok el vannak tolva függo˝ leges irányban. A nyomás növekedésével jól látható az 1688 cm ˆI‰ -nél található oldalsáv fokozatos elt˝unése, valamint az amid I sáv közepének eltolódása. Az eredmények könnyebb áttekinthet˝osége végett a 3.10 ábra B részén ábrázoltuk az 1688 cm ˆI‰ -nél található oldalsáv területét (üres pontok, bal oldali skála), illetve az amid I sáv helyzetét (tele pontok, jobb oldali skála), a nyomás függvényében. Az intermolekuláris  -lemez jelenlétére utaló 1688 cm ˆI‰ -nél található oldalsáv intenzitásának csökkenése már 200 MPa nyomásnál elkezd o˝ dik, és 450 MPa nyomáson teljessé válik. Ezzel szemben az amid I sáv eltolódása csak 300 MPa nyomás felett kezd˝odik, és körülbelül 700 MPa nyomáson denaturálódik teljesen a fehérje. Az amid I sáv eltolódása és intenzitásának folkozatos csökkenése arra utal, hogy a fehérje másodlagos szerkezetében megnövekszik a rendezetlen szerkezet aránya. Így a 44

A

1600

1620

(cm ˆI‰ ) 1640 1660

A

amid I sáv

B

1

2

3 5 4 p (100 MPa)

6

7

1640 1639 Å Ä 1638 1637 1636 1635 1634 1633 1632 1631 1630

amid I sáv helyzete (cm

)

b

a 0

3.10. ábra. Az

1700

1688 cm ˆI‰ csúcs

Abszorbancia (a.u.) csúcs területe (a.u.) 1688 cm

ÅÄ

0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0

1680

8

-krisztallin infravörös spektrumának változása az amid I tartományban

különböz˝o nyomásokon. Az ábra A részén a fehérje infravörös abszorbciós spektrumát látjuk az amid I sávban különbözo˝ nyomásokon. A könnyebb láthatóság kedvéért a spektrumok növekv o˝ nyomással y irányban el vannak tolva. A B panelen az amid I sáv eltolódását (tele pontok), illetve az 1688 cm ˆI‰ csúcs területének csökkenését (üres pontok) láthatjuk a nyomás függvényében.

0-300 MPa nyomástartományban, ahol az aktivitás méréseket végeztük, az FTIR mérések tanúsága szerint az alegységek közötti intermolekuláris  -lemez kölcsönhatások már gyengébbek, viszont a fehérje másodlagos szerkezete még nem károsodott. Hasonló jelleg˝u változás tapasztalható az MjHSP16.5 infravörös elnyelési spektrumán is (3.11 ábra). A különbség az -krisztallinhoz képest az, hogy ez a fehérje sokkal stabilabb a nyomással szemben, mint az -krisztallin. A fehérjét nem is sikerült légköri nyomáson

45

denaturálni, hiszen 25  C h˝omérsékleten a víz 1000 MPa nyomáson megfagy [195]. Annak érdekében, hogy a fehérje denaturációját meg tudjuk figyelni, a kísérletet 45  C h˝omérsék-

1688 cm

ÅÄ

1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0

1644 1643Å Ä 1642 1641 1640 1639 1638 1637 1636 1635 2000

amid I sáv helyzete (cm )

csúcs területe (a.u.)

leten végeztük el.

0

500

1000 p (MPa)

1500

3.11. ábra. A MjHSP16.5 infravörös spektrumának változása az amid I tartományban kü-

lönböz˝o nyomásokon. A kísérlet során a ho˝ mérséklet 45  C volt. A bal oldali tengely, illetve az üres pontok az 1688 cm ˆI‰ csúcs területét, a jobb oldali tengely illetve a tele pontok az amid I sáv helyzetét mutatják. Az 1688 cm ˆI‰ csúcs területe közel 200 MPa nyomással hamarabb kezd csökknenni, mint az amid I sáv eltolódása.

A 3.11 ábrán látható, hogy az amid I sáv eltolódása csak 1600 MPa nyomás felett jelentkezik, míg az 1688 cm ˆI‰ csúcs területének csökkenése már 1400 MPa felett jelento˝ s. A Methanococcus jannaschii infravörös abszorpciós spektrumán az 1688 cm ˆI‰ csúcs területének csökkenése két szakaszból áll. Körülbelül 1400 MPa nyomásig a csúcs területe a növekv˝o nyomással lassan csökken, megközelíto˝ en 25 % mértékben. 1400 MPa nyomás felett egy átalakulás figyelhet˝o meg, és 2000 MPa nyomásig az 1688 cm ˆI‰ csúcs teljesen elt˝unik. A csúcs területének csökkenése a nyomás növelésével lassabban megy végbe, mint az amid I sáv eltolódása. Így, míg az átmeneti nyomások között csupán 90 MPa különbség van (1688 cm ˆI‰ : 1702 MPa, amid I: 1788 MPa), addig az 1688 cm ˆI‰ csúcs átmenete háromszor olyan széles, mint az amid I sáv eltolódásának átmenete. A jelenség egyik magyarázata lehet, hogy a lassú csökkenés oka az oligomerek disszociációja, miközben a két alegységb˝ol felépül˝o dimerek még épek maradnak. Nagy nyomáson azután a dimerek is disszociálhatnak. Mivel a dimereket összetartó kölcsönhatás az 46

intermolekuláris  -lemez, ezért az 1688 cm ˆI‰ csúcs elt˝unése meger˝osíti a dimerek szétesését.

3.1.3. A negyedleges szerkezet változásai Fényszórás mérések Nagy nyomás hatására az oligomer szerkezet˝u fehérjék disszociálnak [140]. Az FTIR spektroszkópiai mérések is arra utalnak, hogy nagy nyomás hatására lejátszódhat disszociáció a mintában. Egyszer˝u fényszórás méréssel leheto˝ ségünk nyílik az oligomerek disszociációjának megfigyelésére. A fényt szóró molekulák mérete ugyanis – gömb alakúnak tekinthet˝o szóró részecskék esetén – a mintáról szórt fény intenzitásával arányos a 2.7

Szórt intenzitás (cps)

egyenlet szerint. 3000 p=300 MPa 2800 2600 p=0.1 MPa p=300 MPa 2400 p=0.1 MPa 2200 2000 1800 1600 1400 1200 0 20 40 60 80 100 t (min)

120

3.12. ábra. Az -krisztallin fényszórása különbözo˝ nyomásokon A fényszórást 400 nm hullámhosszon 90  alatt, 25  C h˝omérsékleten mértük luminométerben. A nyomás változtatásakor a változtatás sebessége 100 MPa/perc volt. A nyilak azt az id o˝ pontot mutatják, amikor az adott nyomást elértük.

A 3.12 ábrán láthatjuk, hogy az -krisztallin fényszórása nagy nyomáson lecsökken, valószín˝uleg a fényt szóró részecskék (azaz az -krisztallin oligomerek) méretének csökkenése miatt. Atmoszférikus nyomásra visszatérve a fényszórás viszonylag gyorsan emelkedik, azonban nem éri el a nyomáskezelés elo˝ tti értéket. 300 MPa nyomást alkalmazva az oligomerek méretének (az egy oligomert alkotó alegységek számának) csökkenése a 47

Szórt intenzitás (a. u.)

95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45

0

0.5

1

1.5 2 2.5 p (100 MPa)

3

3.5

4

3.13. ábra. Az -krisztallin fényszórása különbözo˝ nyomásokon A fényszórást 400 nm hullámhosszon 90  alatt, 25  C h˝omérsékleten mértük. A nyomás változtatásakor a változtatás sebessége 100 MPa/perc volt. Minden egyes ponton 5 percet vártunk az egyensúly kialakulására. Az illesztés alapján az átmenet 150 MPa nyomásnál található, szélessége 50 MPa.

nyomáskezelés után a 2.7 és a 2.9 egyenletek segítségével becsülve körülbelül 30 % . A kísérlet során a minta fényszórását 90  alatt mértük konvencionális luminométerben. A méréshez használt fény hullámhossza 400 nm volt. Ennél a hullámhossznál a fehérjék már nem abszorbeálnak, viszont még elég rövid ahhoz, hogy a körülbelül 10 nm méret˝u oligomerek fényszórása jelent˝os legyen. A 3.13 ábrán látható, hogy a fényszórás – és felteheto˝ en a disszociáció mértéke – függ az alkalmazott nyomástól. A fényszórás csökkenése 300 MPa felett megáll, az adatokra Boltzmann görbét illesztve az átmenet 150 MPa nyomásnál található, szélessége 50 MPa. Minden mérés során az atmoszférikus nyomásra való visszatéréskor a fényszórás kisebb volt, mint a nyomáskezelés el˝ott. Ha jobban megvizsgáljuk a fényszórás változását az atmoszferikus nyomásra való viszszatérés után, azt tapasztaljuk, hogy a fényszórás lassan, több mint egy nap alatt visszatér a nyomáskezelés el˝otti értékre (3.14 ábra). A hosszú távú mérés bizonytalanságát csökkentend˝o, a nyomáskezelt -krisztallin mintával egyidej˝uleg egy kezeletlen -krisztallin mintát is mértünk folyamatosan, az így kapott fényszórás értékkel eredményünket korrigáltuk. A mérés el˝ott 20 percig 300 MPa nyomáson tartottuk az -krisztallint, majd atmoszférikus nyomásra visszatérve indítottuk el a mérést. A mintákat a mérés során mindvégig 25  C 48

h˝omérsékleten termosztáltuk. A relaxációs folyamat exponenciális lefutású, az exponen4 óra, ami több, mint másfél nap! Ez az ido˝ állandó egyébként

ciális id˝oállandója 33 ¶

mérési hibahatáron belül megegyezik az -krisztallin alegységkicserél o˝ désének 25  C h˝omérsékleten mérhet˝o id˝oállandójával.

Szórt intenzitás (a. u.)

1 0.96 0.92 0.88 0.84

0

10

20

30 40 t (h)

50

60

70

3.14. ábra. Az -krisztallin fényszórásának hosszútávú relaxációja nyomáskezelés után. A növekv˝o fényszórás az olgomerek méretének növekedésére utal. A fényszórást 400 nm hullámhosszon 90  alatt, 25  C h˝omérsékleten mértük. A mérés elo˝ tt az = -krisztallint 20 percig 300 MPa nyomáson tartottuk. Az x tengelyen feltüntetett id o˝ az atmoszférikus nyomásra való visszatérést o˝ l eltelt id˝ot mutatja. A relaxációs folyamat id o˝ állandója 33 Ã 4 h.

49

Nagy nyomású gélelektroforézis mérések Az MjHSP16.5 fehérje esetében lehet˝oségünk nyílt arra, hogy a fehérje nagy nyomáson történ˝o disszociációját natív poliakrilamid gélelektroforézissel is megfigyeljük. A 3.15 ábrán megfigyelhet˝o, hogy a kezdetben homogén rendszer (3.15 ábra, a sáv) hogyan válik a nyomás növelésével heterogénné.

a

c

b

d

e

3.15. ábra. Az MjHSP16.5 oligomerek natív poliakrilamid gélelektroforézise. Az akrilamid koncentráció 8% volt. A géleken alkalmazott nyomás balról jobbra haladva sorrendben 0, 25, 75, 125, 175 MPa volt. Az ábrán jól megfigyelhet o˝ az oligomer populáció heterogénné válása.

E mellett a kvalitatív információ mellett a kapott eredmények további elemzésével azt is megtudhatjuk, hogy az oligomerek mérete mennyit változott a nagy nyomás hatására. Ehhez Fergusson analízist végeztünk [196]. A Fergusson analízis során felhasználjuk, hogy a fehérjék gélben mérhet˝o mobilitása a gél koncentrációjától is függ, a következo˝ összefüggés szerint: Æ

ahol

Æ Æ

a fehérje mobilitása,

az akrilamid koncentrációja,

jlÊ

*

Æ <

E Ÿ

ˆQÇSÈÉ

(3.2)

< a fehérje mobilitás 0% akrilamid koncentráció mellett,

2

pedig az úgynevezett retardációs együttható. jËÊ Elvégezve a 3.2 egyenlet szerinti illesztést (3.16 ábra), a kapott értékeket ábrázoltuk

a nyomás függvényében (3.17. ábra). A magasabb nyomáson kapott széles, diffúz sávok esetében a sávok elejére, közepére és végére is elvégeztük a mobilitás kiszámítását és a re50

mobilitás (a.u.)

1

0.1

0.01

5

7 6 8 9 akrilamid koncentráció T %

10

3.16. ábra. Az MjHSP16.5 oligomerek mobilitása a gél koncentrációjának függvényében. Az ábra az úgynevezett „Fergusson Plot”. A mérés során a h o˝ mérséklet 25  C volt.

0.8 0.7 0.6 K

Ì

0.5 0.4 0.3 0.2

0

50

100 p (MPa)

150

200

jMÊ 3.17. ábra. Az MjHSP16.5 oligomerek retardácios koefficiense a nyomás függvényéÊ ben. A } értékeket a 3.16 ábra szerint végzett illesztésb o˝ l határoztuk meg. A magas nyomásokon kapott diffúz sávok esetén a sávok maximumára határoztuk meg a mobilitást. 50 és 100 MPa nyomás között két elkülönült sávot figyelhetünk meg.

tardációs együttható meghatározását. 50 és 100 MPa nyomás között diffúz sávot, és a diffúz sáv határaira elvégezve az illesztést két különbözo˝ retardációs együtthatót kaptunk az MjHSP16.5 oligomerekre. A retardációs együttható értéke légköri nyomáson 0,5. Ez az érték növekv˝o nyomással kismértékben növekszik, majd 50 MPa nyomásnál megjelenik egy 51

második populáció, melynek a retardációs koefficiense megközelít o˝ leg fele a már jelenlév˝o populációénak. Itt valószín˝uleg az oligomerek egy része disszociál, az oligomerméret a retardációs koefficiens alapján közel fele az eredeti 24 alegységb o˝ l álló oligomerekének. A disszociáció nem egyszerre történik az egész populációban, ezért figyelhetünk meg 50 és 100 MPa között két populációt. A 0,5 retardációs koefficiens kismérték˝u növekedése arra utalhat, hogy az oligomerek a disszociáció elo˝ tt felfúvódnak, belsejükbe víz jut.

52

3.2. pH sokk kísérletek 3.2.1. Chaperon aktivitás mérések A nagy nyomás hatása mellett a rövid ideig tartó pH sokk hatását is megvizsgáltuk az krisztallin m˝uködésére. Kísérleteinkben a pH kis változtatásával az aminosav oldalláncok töltésein keresztül az oligomer szerkezetet kialakító gyenge, másodlagos köt o˝ er˝oket változtatjuk meg, így módosítva a fehérje oligomer szerkezetét. Nagyobb pH változás, savas pH segítségével denaturálva a fehérjét a natív pH-ra való visszatéréskor a fehérje tekeredése, oligomer szerkezetének kialakulása, valamint eközben a chaperon aktivitás változása figyelhet˝o meg. A pH változtatását az Anyagok és módszerek fejezetben leírtak szerint végeztük el. A chaperon aktivitás méréseket a savas pH után pH 7.4-re való visszadializálás után hajtottuk végre. Az inzulin aggregációs tesztek eredményei a 3.18 ábrán láthatóak. Kontrollkísérletként itt is megmértük az inzulin aggregációját önmagában (3.18 ábra, [ görbe), illetve perturbálatlan -krisztallin jelenlétében (3.18 ábra, µ görbe). Mivel a pH változtatása során a fehérjeoldat ioner˝ossége megn˝o, ezért további kontrollként megvizs-

Abszorbancia

1.2 1

a b

0.8

c

0.6

d

0.4 0.2 0 0

5

10

15 t (min)

20

25

30

3.18. ábra. Savas pH hatása az -krisztallin m˝uködésére. Inzulin DTE hatására történ o˝ aggregációja = -krisztallin nélkül ill. jelenlétében. a.) Inzulin aggregációja önmagában, b.) kezeletlen = -krisztallin jelenlétében, c.) kontrollminta, megnövelt ioner o˝ sség˝u = -krisztallin oldat: 2 percig dializálva pH 7.4 0.1 M NaCl oldattal szemben, d.) pH kezelt = -krisztallin: 2 percig pH 4.0-n tartott = -krisztallin pH 7.4-en mérve.

53

gáltuk az inzulin aggregációját olyan -krisztallin minta jelenlétében, melynek ioner o˝ s– ségét 0.1 M NaCl oldattal szemben való dialízissel megnöveltük. A 3.18 ábra görbén látható, hogy az ioner˝osség megnövekedése nem okozza a chaperon aktivitás számottev o˝ növekedését, ezzel szemben a savas pH-nak kitett -krisztallin aktivitása nagyobb, mint a görbe). A nyomáskezelés hatására történ o˝ aktivitásnövekedéssel ³ szemben a savas pH-nak kitett -krisztallin megnövekedett aktivitása hosszú ideig fennmakezeletlené (3.18 ábra

rad. Megvizsgáltuk továbbá, hogy vajon van-e hatása a pH sokk id o˝ tartamának a chaperon aktivitásra. Méréseink szerint a pH sokk idejének 2 és 15 perc közötti változtatása nem befolyásolja az aktivitásnövekedés mértékét. A pH sokknak kitett -krisztallin aktivitása függ azonban a pH sokk során alkalmazott pH-tól. Az -krisztallin aktivitását a pH sokk során alkalmazott minimális pH függvényében ábrázoltuk a 3.19 ábrán. Az eredményekbo˝ l látható, hogy minél nagyobb sokknak (alacsonyabb pH-nak) volt kitéve az -krisztallin, annál nagyobb az aktivitása. Látható, hogy enyhén savas pH (pH 6) még nem okoz mérheto˝ aktivitásnövekedést, valamint pH 4 alatt az aktivitásnövekedés mértéke független a pH-tól. Az adatokra a 3.1 egyenlet szerinti

Chaperon aktivitás (a.u.)

Boltzmann-görbét illesztve az átmenet pH 5.0-nál található, szélessége 0.5 pH egység.

0.5 0.4 0.3 0.2 3

5 6 4 pH minimum a stressz során

7

3.19. ábra. Savas pH hatása az -krisztallin m˝uködésére A kísérlet során savas pH sokknak tettük ki az = -krisztallint, majd 5 perc elteltével visszaállítottuk a natív, pH 7.4 környezetet. Az x tengelyen a pH sokk során alkalmazott minimális pH-t tüntettük fel. A mérési eredményekre Boltzmann görbét illesztve az átmenet pH 5.0-nál található, szélessége 0.5 pH egység.

54

3.2.2. A másodlagos szerkezet változásai Triptofán fluoreszcencia mérések A nagy nyomásos kísérletek során mértnél lényegesen nagyobb változást tapasztalunk pH változás hatására az

-krisztallin fluoreszcencia spektrumán. Savas pH hatására az

-

krisztallin spektruma pH 4-ig nem változik, viszont pH 4 és pH 2 között jelent o˝ s, 10 nm-es eltolódást szenved a vörös irányba (3.20 ábra). E nagymértékü eltolódás arra utal, hogy pH 4 alatt a fehérje másodlagos szerkezete is sérül. Az adatokra Boltzmann-görbét illesztve az átmenet pH 3.0-nál található, szélessége pH 0.5. A savas pH-ról való visszatérést tekintve ez a másodlagos szerkezeti sérülés reverzíbilis, pH 7.4-re visszatérve a mérés id o˝ tartamán

(nm)

(1 percen) belül a triptofán spektruma visszaáll eredeti helyzetébe.

½ ¾¿À

341 340 339 338 337 336 335 334 333 332 331 330

2

3

4

pH

5

6

7

3.20. ábra. pH hatása az -krisztallin fluoreszcencia spektrumára. A gerjesztés 290 nm-en történt. Az adatokra Boltzmann-görbét illesztve az átmenet pH 3.0-nál található, szélessége 0.5 pH.

ANS köt˝odés ANS köt˝odéssel is megvizsgáltuk a savas környezet -krisztallinra gyakorolt hatását. Els˝o kísérletünkben az ANS-t savas pH-n kötöttük az -krisztallinhoz (3.21 ábra). Látható, hogy – összhangban a triptofán fluoreszcencia mérésekkel – a fehérjéhez kötött ANS fluoreszcenicia intenzitása több, mint tízszeresére növekszik pH 4 alatt, ami a fehérje denaturációjára utal. Ha összevetjük a 3.21 ábrát a 3.20 ábrával, látható, hogy az ANS kötödésének 55

ANS fluoreszcencia intenzitás (rel. egys.)

16 14 12 10 8 6 4 2 0

2

3

4

pH

5

6

7

3.21. ábra. Az

-krisztallinhoz köt˝od˝o ANS fluoreszcencia intenzitásának változása pH hatására – köt˝odés savas pH-n. A mérés során az = -krisztallin (alegység) koncentrációja 9 ~ M,

az ANS koncentrációja 90 ~ M volt. Az ANS-t a mintához az ábrán lév o˝ pontoknak megfelelo˝ pH-n kötöttük. A mérési pontokra illesztett Boltzmann-görbe átmenete pH 4.4-nél található, szélessége

ANS fluoreszcencia intenzitás (rel. egys.)

0.2 pH egység.

1.7 1.6 1.5 1.4 1.3 1.2 1.1 1 0.9

2

3

4

pH

5

6

7

3.22. ábra. Az

-krisztallinhoz köt˝od˝o ANS fluoreszcencia intenzitásának változása pH hatására – köt˝odés natív pH-n.A mérés során 15 percig az adott pH-n tartottuk az = -krisztallint,

majd a neutrális (pH 7.4) pH-ra visszatérve azonnal hozzákötöttük az ANS-t. Az = -krisztallin (alegység) koncentrációja 9 ~ M, az ANS koncentrációja 90 ~ M volt.

56

növekedése közel egy pH egységgel nagyobb pH-jú környezetben elkezd o˝ dik, mint a triptofán fluoreszcencia spektrumának eltolódása. Második kísérletünkben azt vizsgáltuk, hogy mi történik a fehérjében elérhet o˝ hidrofób felületekkel natív pH-ra való visszatérés utan. A 3.22 ábrán látható, hogy az

-

krisztallinhoz köt˝od˝o ANS fluoreszcencia intenzitása ebben az esetben is nagyobb, bár jóval kisebb mértékben, mint natív pH-n. A kísérlet érdekes eredménye, hogy a köt o˝ d˝o ANS mennyisége már abban az esetben is megnövekszik, ha a kísérlet során az elért minimális pH érték csak 6.5 volt. Ilyen pH-n a triptofán fluoreszcencia spektrumban (3.20. ábra) nem látszik változás, ellenben az ANS fluoreszcencia intenzitása (3.21 ábra) ebben a tartományban már növekszik.

Abszorbancia (a.u.)

FTIR spektroszkópiai mérések

pH 7 pH 4 pH 2 pH 1.8

1600

3.23. ábra. Az

1620

1640 1660 A (cm ˆI‰ )

1680

1700

-krisztallin FTIR spektruma pH 7, 4, 2, 1.8-on, szobah o˝ mérsékleten A

spektrumokat 25  C-on vettük fel, és el vannak tolva az y tengely irányában a jobb láthatóság kedvéért. Alacsony pH-n jelen van a fehérjeaggregációra jellemz o˝ 1624 cm ˆI‰ oldalsáv.

Infravörös spektroszkópiai méréseket csak savas pH-n tudtunk végezni, a rövid idej˝u pH sokk után nem. Ennek oka az, hogy a minta pH-jának változtatásakor a dialízissel óhatatlanul víz kerül a mintába, ami az infravörös spektrum mérését lehetetlenné teszi. Savas pH-n a fehérjeminta savas pufferben való feloldásával ezt a problémát ki tudtuk küszöbölni. 57

Az -krisztallin infravörös abszorpciós spektrumát pH 7, 4, 2, 1.8 esetén mértük meg (3.23 ábra). A széles elnyelési sáv felt˝unése 1645 cm ˆI‰ -nél, ami a rendezetlen szegmensek jelenlétére utal, azt mutatja, hogy a fehérje már pH 4-nél részlegesen kitekeredett, és ez a változás megfigyelhet˝o pH 2 és pH 1.8 esetén is. Az intermolekuláris kölcsönhatások er˝osségére utaló oldalsávok 1620 és 1683 cm ˆI‰ -nél pH 4 esetén er˝osebbek, mint pH 2, vagy pH 1.8-on. Ennek feltételezhet˝o oka, hogy a pH 4 környezet jobban elo˝ segíti az aggregcációt, míg alacsony pH-n a molekulák nagy, azonos töltése miatt az aggregáció nem mehet végbe. Az amid II sáv vizsgálatával iformációkat szerezhetünk a peptidkötések elérhet o˝ ségér˝ol. Ugyanis a peptidkötés N – H csoportjában proton van, ami abban az esetben, ha a kötés oldószer által elérhet˝o, deutériumra cserél˝odik, megváltoztatva ezzel az amid II sáv elnyelését. Az amid II sáv azt mutatja, hogy minden proton kicsrerél o˝ dött, ami alátámasztja a fehérje, legalább részleges, kitekeredését.

3.2.3. A negyedleges szerkezet változásai Fényszórás mérések

szórt intenztitás (a.u.)

80 70 60 50 40 30 20 10 0

3

4

5 pH

6

7

3.24. ábra. Az -krisztallin fényszórásának függése a pH-tól. A mérést 25  C h˝omérsékleten végeztük.

A 3.24 ábrán látható, hogy pH csökkenés hatására a fényszórás pH 6,5 és 4,5 között nagymértékben megnövekszik, azonban a pH 4,5-nél alacsonyabb pH-n illetve a pH 7-nél 58

mérhet˝o fényszórás értékek között nincs jelent˝osebb különbség. A pH 6,5 és 4,5 között több, mint hétszeresére növekedett fényszórás oka valószín˝uleg az, hogy ebben a tartományban található az -krisztallin alegységek izoelektromos pontja. Sajnos az irodalomban található információ az -krisztallin alegységek izoelektromos pontjáról ellentmodásos [197, 152], ezért az aminosav szekvencia alapján becsült izoelektromos ponttal számolunk. Az A alegység izoelektromos pontja 5.3, az B alegységeké pedig 6.8. Így a pH 6,5-4,5 tartományban az alegységek töltése ellentétes elo˝ jel˝u, ami a molekulák egyszer˝u – elektrosztatikus kölcsönhatás miatti – összetapadásához vezet. Alacsony pH-n nincs jelen ez a hatás, ezért – bár a fehérje másodlagos szerkezete feltehet o˝ leg denaturált – nem tapasztalunk aggregációt. Amennyiben megvizsgáljuk a fényszórás változását savas pH-ról pH 7,4-re visszatérés után, érdekes jelenséget tapasztalunk. Visszatérve a minta fényszórása közel tízszeresére ugrik, majd ez a megnövekedett fényszórás gyorsan, hozzávet o˝ legesen 5 perces relaxációs id˝ovel csökken. Azonban nem tér vissza a pH sokk elo˝ tt mérhet˝o értékre, hanem ezen érték felett marad (3.25 ábra). Ennek a megnövekedett fényszórásnak az oka valószín˝uleg más, mint a 3.24 ábrán látható aggregáció, ugyanis a fényszórás megugrását megfigyelhetjük abban az esetben is, ha pH 3 vagy pH 6,5 értékro˝ l hozzuk vissza a minta pH értékeét 7,4re.

szórt intenztitás (a.u.)

14000 12000 10000 8000 6000 4000

0

10

20

30 t (min)

40

50

60

3.25. ábra. Az -krisztallin fényszórásának relaxációja savas pH után. A mérést pH 7,4en végeztük, pH 4,6-ról való visszatérés után. Az id o˝ mérés a visszatérés pillanatától indult. A szaggatott vonal a kezeletlen = -krisztallin fényszórását jelöli.

59

4. fejezet Az eredmények megbeszélése Számos korábbi eredmény utal arra, hogy a kis ho˝ -sokk fehérjék chaperon aktivitását sokféle küls˝o környezeti hatás (magas h˝omérséklet [170], kémiai stressz [198]) megnöveli. Munkánk során mi is ilyen küls˝o hatásoknak tettük ki a vizsgált fehérjéket, nagy nyomás, illetve savas pH segítségével. Ezekkel a módszerekkel a fehérjét denaturálhatjuk, illetve a fehérje új, nem natív állapotait állíthatjuk el˝o. Nagy nyomás segítségével az oligomer szerkezet˝u fehérjéket disszociáltathatjuk, a rendszert légköri nyomásra visszatérítve megfigyelheto˝ az oligomer szerkezet visszaalakulása. Ezáltal nagy nyomás segítségével modellezhetjük a fehérje negyedleges szerkezetének kialakulása során elért állapotokat. A rövid ideig tartó pH sokk segítségével a szervezetben elo˝ forduló pH stressz hatását vizsgálhatjuk, kis pH változások esetén pedig az aminosav oldalláncok töltésének változásával lehet˝oségünk nyílik az aminosav oldalláncok közötti gyenge köt o˝ er˝ok negyedleges szerkezetre gyakorolt hatásának vizsgálatára.

4.1. A chaperon aktivitás változása Az általunk vizsgált mindkét kis h˝o-sokk fehérje ( -krisztallin és MjHSP16.5) esetében azt tapasztaltuk, hogy a chaperon aktivitás nyomáskezelés után magasabb volt mint nyomáskezelés el˝ott. A 4.1 táblázatban összefoglaltuk a nagy nyomás, savas pH, illetve a h˝omérséklet hatását az -krisztallin chaperon m˝uködésére. Az összehasonlításból látható, hogy a nyomáskezelés, a savas pH, illetve a magas ho˝ mérséklet hasonló mértékben növeli

60

meg a fehérje chaperon aktivitását. Az effektusok azonban egy szempontból mégis különböznek: míg a nagy nyomással elért aktivitásnövekedés ido˝ vel csökken (3.2 ábra), addig a rövid ideig tartó pH kezelés, illetve a magas ho˝ mérséklet [82] hatására bekövetkezett aktivitásnövekedés esetében nem, illetve csak részben figyelhet o˝ meg az aktivitás id˝obeli csökkenése. 4.1. táblázat. H˝omérséklet, savas pH és nyomáskezelés hatása az -krisztallin chaperon

m˝uködésére. A chaperon aktivitás mérését minden esetben légköri nyomáson és 25  C h˝omérsékleten végeztük el.

Kezelés módja

aktivitás

Nincs kezelés

0.15 ¶ 0.05

55  C 20 percig

0.21 ¶ 0.05

70  C 20 percig

0.47 ¶ 0.05

300 MPa 20 percig

0.43 ¶ 0.05

pH 5.6 20 percig

0.27 ¶ 0.05

pH 3 20 percig

0.47 ¶ 0.05

A szerkezeti perturbációval elért aktivitásnövekedés a szerkezeti perturbáció mértékével növekszik, mind nagy nyomás (3.3. ábra), mind savas pH esetén (3.19. ábra).

4.2. Szerkezeti változások 4.2.1. Nagy nyomás Az -krisztallinon végzett nagy nyomásos kísérleteknél azt tapasztaltuk, hogy a nyomás hatására történ˝o aktivitásnövekedés körülbelül 300 MPa nyomásnál vált teljessé (3.3. ábra). Ha ezt egybevetjük a fehérje másodlagos szerkezetét vizsgáló mérésekkel, akkor azt tapasztaljuk, hogy a fehérje másodlagos szerkezete ebben a tartományban nem változik jelent˝osen. A 3.10 ábrán látható, hogy az amid I sáv eltolódása csak 300 MPa nyomás felett jelentkezik és csak 700 MPa nyomáson válik teljesssé. A fluoreszcencia spektroszkópiai eredmények (3.5. ábra) sem utalnak a másodlagos szerkezet jelent o˝ sebb változására a 0-300 MPa nyomástartományban. Az MjHSP16.5 esetében még nagyobb másodlagos 61

szerkezeti stabilitásról gy˝oz˝odhedtünk meg, itt az amid I sáv eltolódása csak 1700 MPa nyomás felett jeletkezik. Az egyetlen mért másodlagos szerkezeti jel, ami nagy nyomás hatására számottev o˝ en változik, az az ANS köt˝odés mértéke. Az ANS a fehérje hidrofób aminosavaihoz kötve sokkal nagyobb hatásfokkal fluoreszkál, mint vizes környezetben. Az ANS köt o˝ désének, és ezáltal fluoreszcencia intenzitásának növekedéséb o˝ l arra követekeztethetünk, hogy a fehérje felszínén több oldószer által elérheto˝ hidrofób aminosav jelent meg (3.9. ábra). Légköri nyomásra visszatérve az ANS fluoreszcencia intenzitása közel 50 %-al magasabb marad, mint nyomáskezelés el˝ott. A nyomáskezelés után megnövekedett ANS köto˝ dés jelezheti a fehérje nagyobb chaperon aktivitását, hiszen a fehérjén található hidrofób felszíneknek nagy jelent˝osége lehet a szubsztrát köt˝odésben. Nagy nyomás alatt a több, mint négyszeres intenzitásnövekedés oka valószín˝uleg csak részben köszönhet o˝ a hidrofób aminosavak felszíni megjelenésének, a másik ok feltételezheto˝ en az ANS molekulák fehérje belsejébe jutása. Erre van lehet˝oség, hiszen mint azt az MjHSP16.5 esetében a röntgendiffrakciós szerkezet, az -krisztallin esetében pedig a krio elektronmikroszkópos felvételek alapján kimutatták, a fehérjeoligomerek belül üregesek. A másodlagos szerkezet viszonylagos érintetlensége ellenére a fehérje negyedleges szerkezete már ezekben a nyomástartományokban is megváltozik. A fehérjék fényszórása lecsökken a növekv˝o nyomással. A 2.7 egyenlet segítségével ebbo˝ l arra következtethetünk, hogy a fehérjeoligomerek disszociálnak. A disszociációra utalnak az MjHSP16.5 esetén a nagy nyomású gélelektroforézis mérések eredményei is (3.15 és 3.17. ábra). A fényszórásmérések során a szórt fény intenzitása a fehérjeoligomerek méret (térfogat) négyzetének várható értékével arányos. Ez a várható érték nem egyezik meg az átlagos méret négyzetével. A 2.9 egyenlet alapján a szórt fény intenzitását ugyanakkora átlagos méret mellet növelheti, ha az oligomerek méretelolszlása még inhomogénebbé válik, vagy csökkentheti a szórt fény intenzitását, ha az oligomer populáció méreteloszlásának szórása csökken. Amennyiben a populáció inhomogenitása (az oligomerek méretének szórása) nagy, növekv˝o oligomerméret csökken˝o fényszórást is eredményezhet (a 2.9 egyenletben › H « ª nagyobb, mint ª ). Ez utóbbi eset azonban csak akkor következik be, ha az oligomer méret szórása nagyobb, mint az oligomerméret várható értéke. Ilyen extrém nagy szórás az -krisztallin esetében sem fordul el˝o [98], a homooligomerekb˝ol álló MjHSP16.5 esetében pedig ez egyenesen lehetetlen. Így az egyszer˝u sztatikus fényszórás mérések eredményei 62

jól bizonyítják az oligomerek méretének csökkenését, vagyis disszociációját. Ezzel egyidej˝uleg látható, hogy az intermolekuláris  -kölcsönhatások gyengülnek krisztallin esetében a 200-500 MPa (3.10 ábra, B), MjHSP16.5 esetén a 1500-2000 MPa (3.11 ábra) nyomástartományban. Mindkét fehérje esetében az infravörös spektrumon ez a változás megközelít˝oleg 200 MPa-al hamarabb következik be, mint a másodlagos szerkezetre jellemz˝o amid I sáv eltolódása. Nem szabad azonban elmennünk amellett, hogy az intermolekuláris  -lemez kölcsönhatások gyengülése és a fehérjék fényszórás által észlelt disszociációja nem korrelál egymással. Míg a disszociáció már 50 MPa felett megfigyelheto˝ az -krisztallin illetve az MjHSP16.5 esetében (3.13 és 3.17 ábra), az intermolekuláris  kölcsönhatások gyengülése csak 200 MPa nyomás felett figyelhet˝o meg (3.10 és 3.11 ábra). Az ellentmondás egyik oka az lehet, hogy az FTIR mérések során az alkalmazott fehérjekoncentráció két nagyságrenddel nagyobb volt, mint a fényszórás mérésnél használt koncentráció. Mivel az oligomerizáció és az aggregáció nagyobb koncetráció esetén el o˝ nyösebb [140], ez megmagyarázza, hogy miért figyelhet˝o meg az aggregáció a nagyobb koncentrációval végzett FTIR mérések esetében magasabb nyomáson. A másik magyarázat, hogy az intermolekuláris  -kölcsönhatások er˝ossége nem jellemzi teljesen az oligomer szerkezetet: e kölcsönhatások ugyan fontosak az oligomer szerkezet kialakításában, azonban más, gyengébb köt˝oer˝ok ugyanúgy lényegesek lehetnek. Ezt a feltételezést ero˝ síti meg az MjHSP16.5 röntgendiffrakciós szerkezeti modellje [69] is. A röntgendiffrakciós képen jól látható, hogy intermolekuláris  -kölcsönhatások csupán a két alegységbo˝ l álló dimereken belül fordulnak el˝o, a dimerekb˝ol felépül˝o nagyobb, 24 alegységb˝ol álló oligomer kialakításában nem játszanak szerepet (1.3. ábra). Az MjHSP16.5 esetén az intermolekuláris  -lemez kölcsönhatások csak 1400 MPa nyomás felett gyengülnek számottev˝oen, addig csupán 25 % -os intenzitáscsökkenés figyelhet˝o meg. A nagy nyomású gélelektroforézis mérések analíziséb o˝ l azt állapíthatjuk meg, hogy 150 MPa nyomásig a fehérjeoligomerek mérete megfelez o˝ dik, megközelít˝oleg 12 alegységb˝ol álló oligomerek keletkeznek (3.17 ábra). Mivel az FTIR mérésekben valószín˝uleg a dimerek szétesése figyelhet˝o meg, ezért azt mondhatjuk, hogy az MjHSP16.5 nyomás hatására történ˝o disszociációja legalább két lépésb˝ol áll: els˝o lépésben a 24 alegységb˝ol álló oligomerek 12 alegységb˝ol álló oligomerekre disszociálnak 50 és 100 MPa nyomás között. Feltehet˝o, hogy ezek után van még egy lépés, mely során ezek a 12 alegy63

ségb˝ol álló oligomerek tovább disszociálnak dimerekre. Hogy ez valójában hány lépésben történik meg, és mekkora nyomásnál fejezo˝ dik be a dimerekre való szétesés, arról a rendelkezésünkre álló eszközökkel nem tudtunk információkat gy˝ujteni. A disszociáció utolsó lépése a dimerek disszociációja 1400 MPa nyomás felett, amely már FTIR méréssel nyomonkövethet˝o. Vizsgáljuk meg részletesen a nagy nyomású gélelektroforézis mérések eredményeit a már említett 50-100 MPa nyomástartományban. Úgy t˝unik, mintha az MjHSP16.5 oligomer populációja kettéválna (3.17.ábra): az oligomerek egy része disszociál 12 alegységb o˝ l álló oligomerekre, másik részük mérete pedig megközelíto˝ leg 10 %-al növekszik. A jelenség magyarázata az lehet, hogy az ekkor lejátszódó oligomerek szétesése (megfelez o˝ dése) nem egyszerre következik be minden oligomernél, hanem egy 50 MPa széles tartományban játszódik le. A szétesés el˝ott az oligomer belsejében lév˝o viszonylag nagy térfogatú üregbe víz juthat be. A víz bejutása az oligomer méretét megnöveli, ezért látjuk a retardációs koefficiens növekedését. Amikor a fehéje a belsejébe jutott vízzel együtt már nem stabil, akkor megtörténik az 24mer szétesése 12 alegységbo˝ l álló oligomerekké. Mivel a víz bejutása nem biztos, hogy egyforma módon történik meg az egyes oligomereknél, ezért létezhet egymás mellett egy 50 MPa széles tartományban a két populáció, amint azt a nagy nyomású gélelektroforézis során megfigyeltünk. Az oligomerméret növekedését -krisztallin esetében alacsony nyomásokon elektronmikroszkópos mérésekkel már J. Koretz és munkatársai is megfigyelték [79]. Munkájukban csak 80 MPa nyomásig vizsgálták az

-krisztallint, így a disszociációt nem tudták

megfigyelni. Eredményeik jelent˝osen különböznek az általunk kapott eredményekto˝ l, hiszen mi a fényszórás mérések esetében nem tapasztaltunk mérhet o˝ változást 100 MPa nyomásig (3.12 ábra). Ha csak kismérték˝u oligomerméret növekedést figyeltek volna meg, az még magyarázható volna azzal, hogy minden bizonnyal kisebb oligomerek is jelen lehettek a rendszerben, ezért nem tudtunk semmit megfigyelni a fényszórás mérések során, azonban az általuk megfigyelt hatalmas aggregátumokat nekünk nem sikerült megfigyelnünk. Az ellentmondást nem tudjuk megmagyarázni, azt azonban meg kell jegyeznünk, hogy cikkükben [79] teljesen eltér˝o módszerrel — elektronmikroszkóppal figyelték meg ezeket a nagy aggregátumokat. A minták készítése során a nyomást nagyon gyorsan (<100 ms) csökkentették, valamint a mintát ötvenszeres térfogatra higították. Így a mintát a nagy nyomáson kívül más stressz is érhette, ami megmagyarázhatja az eltéréseket. 64

4.2.2. Rövid ideig tartó pH sokk Savas pH hatására a fehérje másodlagos szerkezeti változása sokkal nagyobb, mint nagy nyomás esetén. A triptofán fluoreszcencia spektruma pH 4 alatt közel 10 nanométeres vöröseltolódást szenved (3.20. ábra). Ebbo˝ l a triptofán környezetének kitekeredésére következtethetünk. Másodlagos szerkezeti jelként az ANS köto˝ dése is megnövekszik ebben a tartományban. A savas pH-n mért ANS köto˝ dés (3.21. ábra) korrelál a triptofán fluoreszcencia spektrum eltolódásával (3.20. ábra), így megállapíthatjuk, hogy a fehérje másodlagos szerkezete pH 4.0 alatt változást szenved. A chaperon aktivitás növekedése azonban már akkor jelentkezik, ha a mintát pH 6.0-nál alacsonyabb pH-nal tesszük ki a pH stressz során (3.19 ábra). Továbbá, ha az ANS köt o˝ dési kísérletet a pH sokk után, pH 7.4-en végezzük el, látható, hogy már olyan esetekben is megnövekszik az ANS köt˝odés mértéke, amikor a stressz során az elért minimális pH 6.5 alatt van (3.22 ábra). Mivel a pH 7 – pH 4 tartományban feltehet o˝ leg csak negyedleges szerkezeti változások történnek, ezért a kis mértékben megnövekedett ANS köt o˝ dés a fehérje negyedleges szerkezetének átrendezo˝ déséb˝ol eredhet. Ezt valószín˝usíti az is, hogy a natív fehérje felszínén is számos eléhet˝o hidrofób felszín van, ami szükséges a szubsztrát kötéséhez. A fényszórás mérések eredményeib˝ol valóban arra következtethetünk, hogy a fehérje negyedleges szerkezete a savas pH sokk után nagymértékben megváltozik. A savas pH-n mérhet˝o fényszórás nagy változást mutat a pH 6.5-4.5 tartományban, de a pH 4.5 alatt illetve a pH 6.5 felett mérhet˝o fényszórás közt nincs jelent˝os különbség (3.24 ábra). A fényszórás több, mint egy nagyságrendnyi növekedésének az lehet az oka, hogy az krisztallin A és B alegységeinek eltér˝o az izolekektromos pontja, és pH 6.5 és 4.5 között a kétfajta alegység elektromos töltése ellentétes elo˝ jel˝u. Így ebben a tartományban az oligomerek az elektrosztatikus kölcsönhatás miatt összetapadnak. Ha az alegységek töltése újra egynem˝uvé válik, akkor ez az aggregáció megsz˝unik, ez látszik a fényszórás-pH ábrán pH 4.5 alatt (3.24.ábra). Érdekes jelenség történik azonban akkor, ha a fényszórást a savas pH-ról visszatérés után, pH 7.4-en mérjük. Itt minden esetben kissé megugrik a fehérje fényszórása (3.25. ábra), függetlenül attól, hogy mekkora savas pH stressznek tettük ki a fehérjét. Így mind az ANS, mind a fényszórás mérések eredményeibo˝ l arra következtethetünk,

65

hogy savas pH-n minden esetben történhet egy finom szerkezeti változás, amit a rendelkezésre álló módszerekkel nem tudunk azonosítani. Az, hogy a fehérje szerkezete megváltozott, natív pH-ra való visszatéréskor derül ki, hiszen ekkor a fehérje szerkezete eltér mind a natív, mind a savas pH-n megfigyelheto˝ szerkezett˝ol.Valószín˝uleg ez a kis eltérés tehet˝o felel˝ossé a megnövekedett chaperon aktivitásért. Vagyis a savas pH stresszel végzett kísérletek eredményei is arra engednek következtetni, hogy a fehérje chaperon m˝uködésében a negyedleges szerkezetnek kiemelkedo˝ fontossága van.

4.3. Összegzés Nagy nyomás segítségével el˝oször sikerült el˝oállítanunk a fehérje emésztése vagy mutálása nélkül kisebb -krisztallin oligomereket. A nyomáskísérletek eredményei egyértelm˝uen mutatják, hogy az -krisztallin nagyobb chaperon aktivitásához nem szükséges nagyobb oligomerek jelenléte. Bár az oligomerszerkezet fontossága a fehérje chaperon akitvitásában kísérleteinkb˝ol egyértelm˝u, azonban a magasabb rend˝u szerkezet és a chaperon aktivitás összefüggése bonyolultabb, mint egy egyszer˝u korreláció az oligomerek mérete és a chaperon aktivitás között. Az általunk alkalmazott szerkezeti perturbációkkal jórészt a fehérje negyedleges szerkezete változott hosszú id˝oskálán, a másodlagos szerkezet a natív környezetet visszaállítva azonnal visszatekeredett. Mind nagy nyomás, mind pH stressz alkalmazása esetén a negyedleges szerkezet relaxációja a fényszórás mérések alapján (3.12, 3.14 és 3.25 ábra) két szakaszból áll. Az els˝o szakaszban történik egy gyors reasszociáció, közel akkora id o˝ alatt, mint a nyomás változtatásának az ideje. A második szakasz relaxációja sokkal lassabb. Nagy nyomás alkalmazása után 25  C h˝omérsékleten a fényszórás megközelít˝oleg 1 nap alatt áll vissza a nyomáskezelés el˝ott mérhet˝o értékre. Savas pH stressz után a fényszórás még 3 nap elteltével is megközelít˝oleg 30 %-al magasabb, mint pH stressz el˝ott. Bár a szerkezetváltozás dinamikája hasonló, a negyedleges szerkezet és a chaperon aktivitás közötti összefüggés eltér˝o a két stressz esetén. Nagy nyomás esetében a megnövekedett aktivitás oka az oligomerek disszociációjában keresend˝o. Ha az oligomerek disszociálnak, úgy a fehérjék összfelülete nagyobb lesz, ezáltal több pontenciális szubsztrátköt˝ohely válik elérhet˝ové. pH stressz hatására a megnövekedett aktivitásnak más szerkezeti oka lehet. A megnö66

vekedett ANS köt˝odésb˝ol itt is a lehetséges szubsztrátköt˝ohelyek számának növekedésére következtethetünk, azonban ennek a növekedésnek más a szerkezeti háttere. A két kísérletsorozatot egybevetve arra gondolhatunk, hogy a kis-h o˝ sokk fehérjék szerkezeti aktivációjának akár többféle útja is lehetséges, ami a szervezet számára potenciálisan el˝onyös, hiszen ugyanazokkal a fehérjékkel a stresszhatás típusának megfelel o˝ en tud védekezni az o˝ t ér˝o többféle stresszhatás ellen.

4.4. Utószó, további kérdések Az általunk alkalmazott szerkezeti perturbációkkal a fehérje szerkezetét denaturáltuk, majd a kísérletek második lépéseként visszaállítottuk a fehérjék natív környezetét. Természetesen ekkor a fehérje szerkezete nem egyezik meg a natív állapotéval, hiszen csak a fehérje környezetét állítottuk vissza, a fehérje szerkezete ezt nem követi azonnal. A kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a fehérje szerkezeti perturbációval el o˝ állított új állapotai jobban kötik a szubsztrát fehérjéket, mint a natív kis ho˝ -sokk fehérjék, vagyis a szerkezeti perturbáció megnöveli a chaperon aktivitást. Annak oka, hogy a fehérje a nem natív állapotában nagyobb chaperon hatást fejt ki, mint a natív fehérje egyszer˝u – a kis h˝o sokk fehérjék els˝odleges feladata a sérült, denaturálódott vagy aggregálódó fehérjék megkötése, így ilyen irányú m˝uködésükre csak ezek megjelenésekor van szükség. Ahhoz, hogy a szubsztrát fehérjéket meg tudják kötni, némiképpen a kis h˝o-sokk fehérjéknek is hozzájuk hasonlóvá kell válniuk. Ezért vannak a kis h˝o-sokk fehérjéknek már natív állapotukban is az oldószer által elérhet o˝ hidrofób felszíneik. Logikusnak látszik, hogy a perturbált szerkezet˝u kis h o˝ -sokk fehérje szerkezete még több hasonlóságot mutat a denaturált szubsztrátok szerkezetével, például még több, oldószer által elérhet˝o hidrofób felszíne van. Erre utalnak az ANS köto˝ déses kísérleteink eredményei is. Vagyis a megnövekedett szubsztrátkötés oka a kis h o˝ -sokk fehérjék megváltozott, „sérült” szerkezetében keresendo˝ . Az azonban figyelemre méltó, hogy bár a „sérült” szerkezet˝u kis h o˝ -sokk fehérje éppen a sérülése miatt jobban köti az aggregálódó szubsztrátját, o˝ maga mégsem aggregálódik, hanem ellátja feladatát: a szubsztrát fehérjét addig köti irreverzíbilis aggregáció nélkül, amíg más h˝o-sokk fehérjék nem képesek a szubsztrát natív szerkezetét visszaállítani, vagy lebontani azt. Ez a tulajdonság különböztetheti meg a kis ho˝ -sokk fehérjéket más fehér67

jékt˝ol. Ha egy fehérje szerkezete sérült, akkor nyilvánvalóan köt más sérült fehérjéket, ez a fehérjék aggregációjának egyik mechanizmusa. A kis h o˝ -sokk fehérjék emellett arra is képesek, hogy az így létrejött fehérjeasszociátumok méretét korlátozzák, hogy azok ne n˝ojenek túl nagyra, ne következzen be a fehérjeaggregáció. A stresszes körülmények megváltoztatják a fehérje szerkezetét, és alkalmassá teszik a nagyobb szubsztrátkötésre. Ezt a hatást mindegyik kísérletünk kimutatta. Ezáltal maga a stresszhatás lehet az a „kapcsoló” a kis h˝o-sokk fehérjékben, ami a m˝uködésüket aktiválja. További el˝onye ennek a feltételezett mechanizmusnak, hogy a frissen szintetizált ki h˝o-sokk fehérjék chaperon aktivitása nagyobb, mivel a sejt stressz hatására kezd el kis h˝o-sokk fehérjét szintetizálni. A nagy nyomásos kísérleteknél láttuk, hogy bár a vizsgált fehérjék másodlagos szerkezetének kialakulása gyors, a negyedleges szerkezet kialakulása hosszú id˝ot vesz igénybe. Erre stresszes körülmények között nincs ido˝ , hiszen a kis h˝osokk fehérjékre a stresszelt sejtben azonnal szükség van a végzetes következményekkel járó fehérjeaggregáció megállításához. Így a szervezet számára kifejezetten el o˝ nyös, ha a stressz hatására szintetizálódott fehérje felgomolyodására nem kell várni, hanem azonnal rendelkezésre áll egy jó szubsztrátköt˝o képességgel rendelkez˝o fehérje. Érdekes kérdés, hogy vajon az evolúció során e szempontok játszhatták-e a f o˝ szerepet a kis h˝o-sokk fehérjéknek alkalmas szerkezetek kiszelektálódásában, vagy más, eddig még nem azonosított szempontok voltak a meghatározóak. Ennek a kérdésnek a megválaszolásáig azonban még hosszú út áll el˝ottünk.

68

5. fejezet Következtetések A dolgozat eredményei alapján a f˝obb következtetéseink az alábbiak: 1. Kísérleteink azt mutatják, hogy a kis ho˝ -sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításakor lényeges szerepük van a gyenge, másodlagos köt o˝ er˝oknek. A negyedleges szerkezet kialakulásában lényeges szerepet játszó másik kölcsönhatás az alegységek  -lemezei közti intermolekuláris  -kölcsönhatás. 2. Mind az -krisztallin, mind az MjHSP16.5 esetében bebizonyítottuk, hogy többféle, in vitro chaperon aktivitással bíró negyedleges szerkezet is létezik. 3. El˝oször figyeltünk meg az MjHSP16.5 fehérje esetében a 24 alegységb o˝ l álló oligomer formától különböz˝o, chaperon aktivitással bíró negyedleges szerkezetet. 4. Kimutattuk, hogy az

-krisztallin és az MjHSP16.5 nagy nyomással (<400 MPa)

való kezelése a chaperon aktivitás növekedését okozza. 5. Megmutattuk, hogy a nagy nyomás (>50 MPa) a kis ho˝ -sokk fehérje oligomerek disszociációját okozza. Ez a disszociáció megfigyeléseink szerint nem teljes, az oligomerek nem disszociálnak alegységeikre, csupán kisebb átlagos méret˝u oligomerek keletkeznek. Ez a disszociációs folyamat reverzíbilis. 6. Felderítettük a nyomás hatására történ˝o disszociáció egy lehetséges mechanizmusát az MjHSP16.5 fehérje esetében. Eszerint a disszociáció során elso˝ lépésben az oligomerek felfúvódnak, bels˝o üregükbe feltehet˝oen víz jut. Ezután történik maga a

69

disszociáció, melynek során el˝oször a 24 alegységb˝ol álló oligomerek két, 12 alegységb˝ol álló kisebb oligomerre esnek szét, melyek csak nagyobb nyomáson disszociálnak tovább. 7. Kimutattuk, hogy az

-krisztallin esetében nem szükséges az oligomerek méreté-

nek növekedése a chaperon aktivitás növekedéséhez, kisebb méret˝u oligomerek is képesek véd˝ohatást kifejteni. 8. Kimutattuk, hogy rövid ideig tartó savas pH sokk az -krisztallin chaperon aktivitásának növekedését okozza. Ilyen sokk a fehérjék aggregációjához vezet. 9. Az -krisztallin esetében megmutattuk, hogy savas pH-n történ o˝ denaturáció után a natív (pH 7) környezetet visszaállítva a fehérje chaperon aktivitással rendelkez o˝ szerkezete gyorsan visszaáll. Ilyen állapotban a fehérje chaperon aktivitása nagyobb, ami mutatja a kis h˝o-sokk fehérjék fontos szerepét a savas környezet és többek között az ischémia-reperfúziós károsodás elleni védekezésben.

70

Összefoglalás Munkánk során célunk a dajkafehérjék közé tartozó kis ho˝ -sokk fehérjék m˝uködési mechanizmusának és negyedleges szerkezetük kialakulásának vizsgálata volt. Vizsgálati rendszerként egy, az eml˝osökben mindenütt jelen lév˝o kis h˝o-sokk fehérjét, az -krisztallint és a Methanococcus jannaschii archebaktériumból származó MjHSP16.5-öt választottuk. Kísérleteinkben különböz˝o fizikai és kémiai módszerekkel (nagy nyomás rövid ideig való alkalmazása, a környezeti pH rövid ideig tartó változtatása) módosítottuk a kis h o˝ -sokk fehérjék szerkezetét és vizsgáltuk az e hatásra bekövetkezo˝ szerkezeti és m˝uködésbeli változásokat. A vizsgált fehérjék másodlagos szerkezetében bekövetkezett változások nagyon kicsik voltak, illetve extrém pH sokk után a fehérje másodlagos szerkezete nagyon gyorsan regenerálódott. A negyedleges szerkezet ezzel szemben minden esetben jelent o˝ s változást szenvedett, és egyátalán nem, vagy csak nagyon hosszú id o˝ után állt vissza a perturbáció alkalmazása el˝ott megfigyelhet˝o állapotba. Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a perturbáció után, feltehet o˝ leg a negyedleges szerkezet megváltozásának hatására, a fehérjék chaperon aktivitása minden esetben megnövekedett. Az -krisztallin esetében kimutattuk, hogy a fehérje aktív állapotához többféle negyedleges szerkezet is tartozik. A többféle, chaperon aktivitással rendelkez o˝ negyedleges szerkezet nagy jelent˝oség˝u lehet a kis h˝o-sokk fehérjék különböz˝o szubsztrátokhoz illetve stresszhatásokhoz való alkalmazkodásában. A nagy nyomáson végzett mérések rávilágítottak az MjHSP16.5 fehérje lehetséges disszociációs mechanizmusára, melynek során elo˝ ször az oligomer belsejébe víz jut. Kísérleteink azt mutatták, hogy a kis h˝o-sokk fehérjék oligomer szerkezetének kialakításában és stabilizálásában fontos szerepet játszhatnak – az intermolekuláris  kölcsönhatás mellett – az alegységek közötti gyenge, másodlagos köto˝ er˝ok.

71

Summary In our work we investigated the chaperone function and quaternary structure formation of small heat-shock proteins. We have choosen two members of the small heat-shock family:

-crystallin, an abundant mammalian sHSP, and MjHSP16.5 from archebacteria

Methanococcus jannaschii. With various physical and chemical methods (high pressure, change of the environmental pH) we modified the structure of these proteins, and investigated the related structural and functional changes. The secondary structure changes of the examined proteins were small, or after the extreme acidic pH shock the secondary structure quickly regenerated. On the contrary, the quaternary structure changes were large, and after the perturbation there was no, or only very slow rearrangement of the quaternary structure. We observed that after the preturbation, presumably the change in the quaternary structure caused an enhancement of the chaperon activity of the proteins. In case of -crystallin we observed more quaternary structures belonging to the active state of the protein. The existence of more, active quaternary structures might be important in the adjustment of small heat-shock proteins to different stresses and substrates. The high pressure experiments revealed a possible dissociation mechanism for MjHSP16.5, in which first water molecules enter the inner core of the protein. The experiments showed that the weak, secondary binding forces have an important role – beside the intermolecular  -sheets – in maintaining the oligomeric structure of small heat-shock proteins.

72

Irodalomjegyzék [1] C. B. Anfinsen. Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181 (1973):223–30. [2] A. L. Watters, D. Baker. Searching for folded proteins in vitro and in silico. Eur J Biochem, 271 (2004):1615–22. [3] C. M. Dobson. Protein folding and misfolding. Nature, 426 (2003):884–90. [4] L. Takemoto, D. Boyle. The possible role of -crystallins in human senile cataractogenesis. International Journal of Biological Macromolecules, 22 (1998):331–337. [5] B. Bukau, A. L. Horwich. The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell, 92 (1998):351–66. [6] H. Grallert, J. Buchner. Review: a structural view of the GroE chaperone cycle. J Struct Biol, 135 (2001):95–103. [7] F. Narberhaus. Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network. Microbiol Mol Biol Rev, 66 (2002):64–93. [8] P. Goloubinoff, A. Mogk, A. P. Zvi, T. Tomoyasu, B. Bukau. Sequential mechanism of solubilization and refolding of stable protein aggregates by a bichaperone network. Proc Natl Acad Sci U S A, 96 (1999):13732–7. [9] T. Ishikawa, F. Beuron, M. Kessel, S. Wickner, M. R. Maurizi, A. C. Steven. Translocation pathway of protein substrates in ClpAP protease. Proc Natl Acad Sci U S A, 98 (2001):4328–33. [10] C. Spiess, A. Beil, M. Ehrmann. A temperature-dependent switch from chaperone to protease in a widely conserved heat shock protein. Cell, 97 (1999):339–47. [11] X. Zhu, X. Zhao, W. F. Burkholder, A. Gragerov, C. M. Ogata, M. E. Gottesman, W. A. Hendrickson. Structural analysis of substrate binding by the molecular chaperone DnaK. Science, 272 (1996):1606–14. [12] U. Jakob, W. Muse, M. Eser, J. C. Bardwell. Chaperone activity with a redox switch. Cell, 96 (1999):341–52. 73

[13] J. Buchner. Hsp90 & Co. - a holding for folding. (1999):136–41.

Trends Biochem Sci, 24

[14] P. Csermely, T. Schnaider, C. Soti, Z. Prohaszka, G. Nardai. The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol Ther, 79 (1998):129–68. [15] J. Horwitz. Alpha-crystallin. Exp Eye Res, 76 (2003):145–53. [16] R. Kim, K. K. Kim, H. Yokota, S. H. Kim. Small heat shock protein of Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (1998):9129–33. [17] M. Haslbeck. sHsps and their role in the chaperone network. Cell Mol Life Sci, 59 (2002):1649–57. [18] P. Csermely, J. Kajtar, M. Hollosi, G. Jalsovszky, S. Holly, C. R. Kahn, Jr. Gergely, P., C. Soti, K. Mihaly, J. Somogyi. ATP induces a conformational change of the 90-kDa heat shock protein (hsp90). J Biol Chem, 268 (1993):1901–7. [19] W. M. Obermann, H. Sondermann, A. A. Russo, N. P. Pavletich, F. U. Hartl. In vivo function of Hsp90 is dependent on ATP binding and ATP hydrolysis. J Cell Biol, 143 (1998):901–10. [20] Y. Sun, T. H. MacRae. The small heat shock proteins and their role in human disease. Febs J, 272 (2005):2613–27. [21] M. Haslbeck, T. Franzmann, D. Weinfurtner, J. Buchner. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat Struct Mol Biol, 12 (2005):842– 6. [22] S. Shigenobu, H. Watanabe, M. Hattori, Y. Sakaki, H. Ishikawa. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature, 407 (2000):81–6. [23] C. M. Fraser, J. D. Gocayne, O. White, M. D. Adams, R. A. Clayton, R. D. Fleischmann, C. J. Bult, A. R. Kerlavage, G. Sutton, J. M. Kelley. The minimal gene complement of Mycoplasma genitalium. Science, 270 (1995):397–403. [24] W. W. de Jong, G. J. Caspers, J. A. Leunissen. Genealogy of the alpha-crystallin– small heat-shock protein superfamily. Int J Biol Macromol, 22 (1998):151–62. [25] M. Munchbach, P. Dainese, W. Staudenmann, F. Narberhaus, P. James. Proteome analysis of heat shock protein expression in Bradyrhizobium japonicum. Eur J Biochem, 264 (1999):39–48. [26] G. Kappe, E. Franck, P. Verschuure, W. C. Boelens, J. A. Leunissen, W. W. de Jong. The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspB1-10. Cell Stress Chaperones, 8 (2003):53–61. 74

[27] U. Jakob, M. Gaestel, K. Engel, J. Buchner. Small heat shock proteins are molecular chaperones. J Biol Chem, 268 (1993):1517–20. [28] Y. Sugiyama, A. Suzuki, M. Kishikawa, R. Akutsu, T. Hirose, M. M. Waye, S. K. Tsui, S. Yoshida, S. Ohno. Muscle develops a specific form of small heat shock protein complex composed of MKBP/HSPB2 and HSPB3 during myogenic differentiation. J Biol Chem, 275 (2000):1095–104. [29] A. Suzuki, Y. Sugiyama, Y. Hayashi, N. Nyu-i, M. Yoshida, I. Nonaka, S. Ishiura, K. Arahata, S. Ohno. MKBP, a novel member of the small heat shock protein family, binds and activates the myotonic dystrophy protein kinase. J Cell Biol, 140 (1998):1113–24. [30] W. C. Boelens, M. A. Van Boekel, W. W. De Jong. HspB3, the most deviating of the six known human small heat shock proteins. Biochim Biophys Acta, 1388 (1998):513–6. [31] F. A. van de Klundert, R. H. Smulders, M. L. Gijsen, R. A. Lindner, R. Jaenicke, J. A. Carver, W. W. de Jong. The mammalian small heat-shock protein Hsp20 forms dimers and is a poor chaperone. Eur J Biochem, 258 (1998):1014–21. [32] S. Krief, J. F. Faivre, P. Robert, B. Le Douarin, N. Brument-Larignon, I. Lefrere, M. M. Bouzyk, K. M. Anderson, L. D. Greller, F. L. Tobin, M. Souchet, A. Bril. Identification and characterization of cvHsp. A novel human small stress protein selectively expressed in cardiovascular and insulin-sensitive tissues. J Biol Chem, 274 (1999):36592–600. [33] M. V. Kim, A. S. Seit-Nebi, S. B. Marston, N. B. Gusev. Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (H11 or HspB8). Biochem Biophys Res Commun, 315 (2004):796–801. [34] X. Sun, J. M. Fontaine, J. S. Rest, E. A. Shelden, M. J. Welsh, R. Benndorf. Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. J Biol Chem, 279 (2004):2394–402. [35] S. Carra, M. Sivilotti, A. T. Chavez Zobel, H. Lambert, J. Landry. HspB8, a small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. Hum Mol Genet, 14 (2005):1659–69. [36] G. Kappe, P. Verschuure, R. L. Philipsen, A. A. Staalduinen, P. Van de Boogaart, W. C. Boelens, W. W. De Jong. Characterization of two novel human small heat shock proteins: protein kinase-related HspB8 and testis-specific HspB9. Biochim Biophys Acta, 1520 (2001):1–6. [37] J. M. Fontaine, J. S. Rest, M. J. Welsh, R. Benndorf. The sperm outer dense fiber protein is the 10th member of the superfamily of mammalian small stress proteins. Cell Stress Chaperones, 8 (2003):62–9. 75

[38] K. Rajaraman, B. Raman, T. Ramakrishna, C. M. Rao. The chaperone-like alphacrystallin forms a complex only with the aggregation-prone molten globule state of alpha-lactalbumin. Biochem Biophys Res Commun, 249 (1998):917–21. [39] A. G. Cashikar, M. Duennwald, S. L. Lindquist. A chaperone pathway in protein disaggregation. Hsp26 alters the nature of protein aggregates to facilitate reactivation by Hsp104. J Biol Chem, 280 (2005):23869–75. [40] A. Mogk, E. Deuerling, S. Vorderwulbecke, E. Vierling, B. Bukau. Small heat shock proteins, ClpB and the DnaK system form a functional triade in reversing protein aggregation. Mol Microbiol, 50 (2003):585–95. [41] W. Jiao, P. Li, J. Zhang, H. Zhang, Z. Chang. Small heat-shock proteins function in the insoluble protein complex. Biochem Biophys Res Commun, 335 (2005):227–31. [42] A. Mogk, C. Schlieker, K. L. Friedrich, H. J. Schonfeld, E. Vierling, B. Bukau. Refolding of substrates bound to small Hsps relies on a disaggregation reaction mediated most efficiently by ClpB/DnaK. J Biol Chem, 278 (2003):31033–42. [43] M. Ehrnsperger, S. Graber, M. Gaestel, J. Buchner. Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. Embo J, 16 (1997):221–9. [44] G. J. Lee, A. M. Roseman, H. R. Saibil, E. Vierling. A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. Embo J, 16 (1997):659–71. [45] Y. C. Kudva, H. J. Hiddinga, P. C. Butler, C. S. Mueske, N. L. Eberhardt. Small heat shock proteins inhibit in vitro A beta(1-42) amyloidogenesis. FEBS Lett, 416 (1997):117–21. [46] D. C. Thorn, S. Meehan, M. Sunde, A. Rekas, S. L. Gras, C. E. Macphee, C. M. Dobson, M. R. Wilson, J. A. Carver. Amyloid Fibril Formation by Bovine Milk kappa-Casein and Its Inhibition by the Molecular Chaperones alpha(S)- and betaCasein. Biochemistry, 44 (2005):17027–17036. [47] T. Rogalla, M. Ehrnsperger, X. Preville, A. Kotlyarov, G. Lutsch, C. Ducasse, C. Paul, M. Wieske, A. P. Arrigo, J. Buchner, M. Gaestel. Regulation of Hsp27 oligomerization, chaperone function, and protective activity against oxidative stress/tumor necrosis factor alpha by phosphorylation. J Biol Chem, 274 (1999):18947–56. [48] H. Ito, K. Kamei, I. Iwamoto, Y. Inaguma, D. Nohara, K. Kato. Phosphorylationinduced change of the oligomerization state of alpha B-crystallin. J Biol Chem, 276 (2001):5346–52.

76

[49] K. Wang, W. Ma, A. Spector. Phosphorylation of alpha-crystallin in rat lenses is stimulated by H2O2 but phosphorylation has no effect on chaperone activity. Exp Eye Res, 61 (1995):115–24. [50] P. J. Muchowski, J. I. Clark. ATP-enhanced molecular chaperone functions of the small heat shock protein human alphaB crystallin. Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (1998):1004–9. [51] J. A. Aquilina, J. L. Benesch, L. L. Ding, O. Yaron, J. Horwitz, C. V. Robinson. Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Chem, 279 (2004):28675–80. [52] K. Wang, A. Spector. ATP causes small heat shock proteins to release denatured protein. Eur J Biochem, 268 (2001):6335–45. [53] B. P. Kokke, M. R. Leroux, E. P. Candido, W. C. Boelens, W. W. de Jong. Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hsp12.2 and Hsp12.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBS Lett, 433 (1998):228–32. [54] T. Miron, K. Vancompernolle, J. Vandekerckhove, M. Wilchek, B. Geiger. A 25-kD inhibitor of actin polymerization is a low molecular mass heat shock protein. J Cell Biol, 114 (1991):255–61. [55] M. Wieske, R. Benndorf, J. Behlke, R. Dolling, G. Grelle, H. Bielka, G. Lutsch. Defined sequence segments of the small heat shock proteins HSP25 and alphaBcrystallin inhibit actin polymerization. Eur J Biochem, 268 (2001):2083–90. [56] K. Wang, A. Spector. alpha-crystallin stabilizes actin filaments and prevents cytochalasin-induced depolymerization in a phosphorylation-dependent manner. Eur J Biochem, 242 (1996):56–66. [57] T. P. Stossel, J. Condeelis, L. Cooley, J. H. Hartwig, A. Noegel, M. Schleicher, S. S. Shapiro. Filamins as integrators of cell mechanics and signalling. Nat Rev Mol Cell Biol, 2 (2001):138–45. [58] R. Quinlan. Cytoskeletal competence requires protein chaperones. Prog Mol Subcell Biol, 28 (2002):219–33. [59] A. P. Arrigo, C. Paul, C. Ducasse, F. Manero, C. Kretz-Remy, S. Virot, E. Javouhey, N. Mounier, C. Diaz-Latoud. Small stress proteins: novel negative modulators of apoptosis induced independently of reactive oxygen species. Prog Mol Subcell Biol, 28 (2002):185–204. [60] N. Lentze, S. Studer, F. Narberhaus. Structural and functional defects caused by point mutations in the alpha-crystallin domain of a bacterial alpha-heat shock protein. J Mol Biol, 328 (2003):927–37. 77

[61] K. C. Giese, E. Vierling. Changes in oligomerization are essential for the chaperone activity of a small heat shock protein in vivo and in vitro. J Biol Chem, 277 (2002):46310–8. [62] M. R. Leroux, B. J. Ma, G. Batelier, R. Melki, E. P. Candido. Unique structural features of a novel class of small heat shock proteins. J Biol Chem, 272 (1997):12847– 53. [63] M. P. Bova, L. L. Ding, J. Horwitz, B. K. Fung. Subunit exchange of alphaAcrystallin. J Biol Chem, 272 (1997):29511–7. [64] M. P. Bova, Q. Huang, L. Ding, J. Horwitz. Subunit exchange, conformational stability, and chaperone-like activity function of the small heat-shock protein 16.5 from Methanococcus Jannaschii. J Biol Chem, 277 (2002):38468–38475. [65] X. Fu, Z. Chang. Temperature-dependent subunit exchange and chaperone-like activities of Hsp16.3, a small heat shock protein from Mycobacterium tuberculosis. Biochem Biophys Res Commun, 316 (2004):291–9. [66] D. A. Haley, M. P. Bova, Q. L. Huang, H. S. McHaourab, P. L. Stewart. Small heatshock protein structures reveal a continuum from symmetric to variable assemblies. J Mol Biol, 298 (2000):261–72. [67] Z. Chang, T. P. Primm, J. Jakana, I. H. Lee, I. Serysheva, W. Chiu, H. F. Gilbert, F. A. Quiocho. Mycobacterium tuberculosis 16-kDa antigen (Hsp16.3) functions as an oligomeric structure in vitro to suppress thermal aggregation. J Biol Chem, 271 (1996):7218–23. [68] L. Gu, A. Abulimiti, W. Li, Z. Chang. Monodisperse Hsp16.3 nonamer exhibits dynamic dissociation and reassociation, with the nonamer dissociation prerequisite for chaperone-like activity. J Mol Biol, 319 (2002):517–26. [69] K. K. Kim, R. Kim, S. H. Kim. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature, 394 (1998):595–9. [70] R. L. van Montfort, E. Basha, K. L. Friedrich, C. Slingsby, E. Vierling. Crystal structure and assembly of a eukaryotic small heat shock protein. Nat Struct Biol, 8 (2001):1025–30. [71] R. Stamler, G. Kappe, W. Boelens, C. Slingsby. Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. J Mol Biol, 353 (2005):68–79. [72] Rob Van Montfort, Christine Slingsby, Elizabeth Vierlingt. Advances in Protein Chemistry. Elsevier Inc., 2002 pp. 105 – 156.

78

[73] L. Benitez, L. J. Harrison, R. M. Parkhouse, T. Garate. Sequence and preliminary characterisation of a Taenia saginata oncosphere gene homologue of the small heatshock protein family. Parasitol Res, 84 (1998):423–5. [74] G. Kappe, J. A. Aquilina, L. Wunderink, B. Kamps, C. V. Robinson, T. Garate, W. C. Boelens, W. W. de Jong. Tsp36, a tapeworm small heat-shock protein with a duplicated alpha-crystallin domain, forms dimers and tetramers with good chaperone-like activity. Proteins, 57 (2004):109–17. [75] V. Nene, D. W. Dunne, K. S. Johnson, D. W. Taylor, J. S. Cordingley. Sequence and expression of a major egg antigen from Schistosoma mansoni. Homologies to heat shock proteins and alpha-crystallins. Mol Biochem Parasitol, 21 (1986):179–88. [76] A. Merckelbach, M. Wager, R. Lucius. Analysis of cDNAs coding for immunologically dominant antigens from an oncosphere-specific cDNA library of Echinococcus multilocularis. Parasitol Res, 90 (2003):493–501. [77] M. R. Leroux, R. Melki, B. Gordon, G. Batelier, E. P. Candido. Structure-function studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J Biol Chem, 272 (1997):24646–56. [78] M. Ehrnsperger, H. Lilie, M. Gaestel, J. Buchner. The dynamics of Hsp25 quaternary structure. Structure and function of different oligomeric species. J Biol Chem, 274 (1999):14867–74. [79] Lynnell W. Radlick, Jane F. Koretz. Biophysical characterization of -crystallin aggregates: validation of the micelle hypothesis. Biochimia et Biophysica Acta, 1120 (1992):193–200. [80] P. J. Groenen, K. B. Merck, W. W. de Jong, H. Bloemendal. Structure and modifications of the junior chaperone alpha-crystallin. From lens transparency to molecular pathology. Eur J Biochem, 225 (1994):1–19. [81] B. Raman, C. M. Rao. Chaperone-like activity and temperature-induced structural changes of alpha-crystallin. J Biol Chem, 272 (1997):23559–64. [82] M. R. Burgio, C. J. Kim, C. C. Dow, J. F. Koretz. Correlation between the chaperone-like activity and aggregate size of alpha-crystallin with increasing temperature. Biochem Biophys Res Commun, 268 (2000):426–32. [83] M. Haslbeck, S. Walke, T. Stromer, M. Ehrnsperger, H. E. White, S. Chen, H. R. Saibil, J. Buchner. Hsp26: a temperature-regulated chaperone. Embo J, 18 (1999):6744–51. [84] T. Stromer, E. Fischer, K. Richter, M. Haslbeck, J. Buchner. Analysis of the regulation of the molecular chaperone Hsp26 by temperature-induced dissociation: the 79

N-terminal domail is important for oligomer assembly and the binding of unfolding proteins. J Biol Chem, 279 (2004):11222–8. [85] S. Studer, M. Obrist, N. Lentze, F. Narberhaus. A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial alpha-heat shock proteins. Eur J Biochem, 269 (2002):3578–86. [86] R. J. Kapphahn, C. M. Ethen, E. A. Peters, L. Higgins, D. A. Ferrington. Modified alpha A crystallin in the retina: altered expression and truncation with aging. Biochemistry, 42 (2003):15310–25. [87] M. Haslbeck, A. Ignatiou, H. Saibil, S. Helmich, E. Frenzl, T. Stromer, J. Buchner. A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. J Mol Biol, 343 (2004):445–55. [88] K. C. Giese, E. Basha, B. Y. Catague, E. Vierling. Evidence for an essential function of the N terminus of a small heat shock protein in vivo, independent of in vitro chaperone activity. Proc Natl Acad Sci U S A, 102 (2005):18896–901. [89] M. P. Bova, H. S. McHaourab, Y. Han, B. K. Fung. Subunit exchange of small heat shock proteins. Analysis of oligomer formation of alphaA-crystallin and Hsp27 by fluorescence resonance energy transfer and site-directed truncations. J Biol Chem, 275 (2000):1035–42. [90] F. Sobott, J. L. Benesch, E. Vierling, C. V. Robinson. Subunit exchange of multimeric protein complexes. Real-time monitoring of subunit exchange between small heat shock proteins by using electrospray mass spectrometry. J Biol Chem, 277 (2002):38921–9. [91] R. Kim, L. Lai, H. H. Lee, G. W. Cheong, K. K. Kim, Z. Wu, H. Yokota, S. Marqusee, S. H. Kim. On the mechanism of chaperone activity of the small heat-shock protein of Methanococcus jannaschii. Proc Natl Acad Sci U S A, 100 (2003):8151– 5. [92] M. Haslbeck, A. Miess, T. Stromer, S. Walter, J. Buchner. Disassembling protein aggregates in the yeast cytosol. The cooperation of Hsp26 with Ssa1 and Hsp104. J Biol Chem, 280 (2005):23861–8. [93] R. C. Augusteyn. alpha-crystallin: a review of its structure and function. Clin Exp Optom, 87 (2004):356–66. [94] P. N. Farnsworth, H. Frauwirth, B. Groth-Vasseli, Kamalendra Singh. Refinemet of 3D structure of bovine lens A-crystallin. International Journal of Biological Macromolecules, 22 (1998):175–185. [95] H. Bloemendal. Molecular and cellular biology of the eye lens. John Wiley New York, 1981. 80

[96] D. A. Haley, J. Horwitz, P. L. Stewart. The small heat-shock protein, alphaBcrystallin, has a variable quaternary structure. J Mol Biol, 277 (1998):27–35. [97] J. Horwitz. Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone. Proc Natl Acad Sci U S A, 89 (1992):10449–53. [98] J. Horwitz. The function of alpha-crystallin in vision. Semin Cell Dev Biol, 11 (2000):53–60. [99] V. Pigaga, R. A. Quinlan. Lenticular chaperones suppress the aggregation of the cataract-causing mutant T5P gamma C-crystallin. Exp Cell Res, 312 (2006):51– 62. [100] J. P. Brady, D. Garland, Y. Duglas-Tabor, Jr. Robison, W. G., A. Groome, E. F. Wawrousek. Targeted disruption of the mouse alpha A-crystallin gene induces cataract and cytoplasmic inclusion bodies containing the small heat shock protein alpha B-crystallin. Proc Natl Acad Sci U S A, 94 (1997):884–9. [101] J. P. Brady, D. L. Garland, D. E. Green, E. R. Tamm, F. J. Giblin, E. F. Wawrousek. AlphaB-crystallin in lens development and muscle integrity: a gene knockout approach. Invest Ophthalmol Vis Sci, 42 (2001):2924–34. [102] S. Saha, K. P. Das. Relationship between chaperone activity and oligomeric size of recombinant human alphaA- and alphaB-crystallin: a tryptic digestion study. Proteins, 57 (2004):610–7. [103] C. Bode, F. G. Tolgyesi, L. Smeller, K. Heremans, S. V. Avilov, J. Fidy. Chaperonelike activity of alpha-crystallin is enhanced by high-pressure treatment. Biochem J, 370 (2003):859–66. [104] S. P. Bhat, C. N. Nagineni. alpha B subunit of lens-specific protein alpha-crystallin is present in other ocular and non-ocular tissues. Biochem Biophys Res Commun, 158 (1989):319–25. [105] R. A. Dubin, E. F. Wawrousek, J. Piatigorsky. Expression of the murine alpha Bcrystallin gene is not restricted to the lens. Mol Cell Biol, 9 (1989):1083–91. [106] S. P. Bhat, J. Horwitz, A. Srinivasan, L. Ding. Alpha B-crystallin exists as an independent protein in the heart and in the lens. Eur J Biochem, 202 (1991):775–81. [107] B. K. Derham, M. A. van Boekel, P. J. Muchowski, J. I. Clark, J. Horwitz, H. W. Hepburne-Scott, W. W. de Jong, M. J. Crabbe, J. J. Harding. Chaperone function of mutant versions of alpha A- and alpha B-crystallin prepared to pinpoint chaperone binding sites. Eur J Biochem, 268 (2001):713–21.

81

[108] M. Litt, P. Kramer, D. M. LaMorticella, W. Murphey, E. W. Lovrien, R. G. Weleber. Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA. Hum Mol Genet, 7 (1998):471–4. [109] P. Vicart, A. Caron, P. Guicheney, Z. Li, M. C. Prevost, A. Faure, D. Chateau, F. Chapon, F. Tome, J. M. Dupret, D. Paulin, M. Fardeau. A missense mutation in the alphaB-crystallin chaperone gene causes a desmin-related myopathy. Nat Genet, 20 (1998):92–5. [110] T. Iwaki, A. Kume-Iwaki, R. K. Liem, J. E. Goldman. Alpha B-crystallin is expressed in non-lenticular tissues and accumulates in Alexander’s disease brain. Cell, 57 (1989):71–8. [111] T. Iwaki, T. Wisniewski, A. Iwaki, E. Corbin, N. Tomokane, J. Tateishi, J. E. Goldman. Accumulation of alpha B-crystallin in central nervous system glia and neurons in pathologic conditions. Am J Pathol, 140 (1992):345–56. [112] J. Lowe, H. McDermott, I. Pike, I. Spendlove, M. Landon, R. J. Mayer. alpha B crystallin expression in non-lenticular tissues and selective presence in ubiquitinated inclusion bodies in human disease. J Pathol, 166 (1992):61–8. [113] Y. Sun, T. H. MacRae. Small heat shock proteins: molecular structure and chaperone function. Cell Mol Life Sci, 62 (2005):2460–76. [114] S. Meehan, Y. Berry, B. Luisi, C. M. Dobson, J. A. Carver, C. E. MacPhee. Amyloid fibril formation by lens crystallin proteins and its implications for cataract formation. J Biol Chem, 279 (2004):3413–9. [115] B. Raman, T. Ban, M. Sakai, S. Y. Pasta, T. Ramakrishna, H. Naiki, Y. Goto, M. Rao Ch. AlphaB-crystallin, a small heat-shock protein, prevents the amyloid fibril growth of an amyloid beta-peptide and beta2-microglobulin. Biochem J, 392 (2005):573–81. [116] H. A. Koteiche, H. S. McHaourab. The determinants of the oligomeric structure in Hsp16.5 are encoded in the alpha-crystallin domain. FEBS Lett, 519 (2002):16–22. [117] K. K. Kim, H. Yokota, S. Santoso, D. Lerner, R. Kim, S. H. Kim. Purification, crystallization, and preliminary X-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from Methanococcus jannaschii, a hyperthermophile. J Struct Biol, 121 (1998):76–80. [118] K. Heremans, L. Smeller. Pressure versus temperature behaviour of proteins. European Journal of Solid State and Inorganic Chemistry, 34 (1997):745–758. [119] J. Jonas. High-resolution nuclear magnetic resonance studies of proteins. Biochim Biophys Acta, 1595 (2002):145–59. 82

[120] K. Heremans, L. Smeller. Protein structure and dynamics at high pressure. Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1386 (1998):353–370. [121] H. Bridgman. The coagulation of Albumen by pressure. Journal of Biological Chemistry, 19 (1914):511–512. [122] D. P. Nash, J. Jonas. Structure of the pressure-assisted cold denatured state of ubiquitin. Biochem Biophys Res Commun, 238 (1997):289–91. [123] P. L. Privalov, V. Griko Yu, SYu Venyaminov, V. P. Kutyshenko. Cold denaturation of myoglobin. J Mol Biol, 190 (1986):487–98. [124] D. P. Nash, J. Jonas. Structure of pressure-assisted cold denatured lysozyme and comparison with lysozyme folding intermediates. Biochemistry, 36 (1997):14375– 83. [125] S. A. Hawley. Reversible pressure–temperature denaturation of chymotrypsinogen. Biochemistry, 10 (1971):2436–42. [126] L. Smeller. Pressure-temperature phase diagrams of biomolecules. Biochimica Et Biophysica Acta-Protein Structure and Molecular Enzymology, 1595 (2002):11–29. [127] M. Dumoulin, H. Ueno, R. Hayashi, C. Balny. Contribution of the carbohydrate moiety to conformational stability of the carboxypeptidase Y high pressure study. Eur J Biochem, 262 (1999):475–83. [128] O. B. Ptitsyn, V. N. Uversky. The molten globule is a third thermodynamical state of protein molecules. FEBS Lett, 341 (1994):15–8. [129] C. Redfield, R. A. Smith, C. M. Dobson. Structural characterization of a highlyordered ’molten globule’ at low pH. Nat Struct Biol, 1 (1994):23–9. [130] C. Clery, F. Renault, P. Masson. Pressure-induced molten globule state of cholinesterase. FEBS Lett, 370 (1995):212–4. [131] L. Smeller, P. Rubens, K. Heremans. Pressure effect on the temperature-induced unfolding and tendency to aggregate of myoglobin. Biochemistry, 38 (1999):3816– 3820. [132] L. Smeller, P. Rubens, K. Heremans. Pressure unfolding facilitates the formation of temperature gels. High Pressure Research, 19 (2000):713–719. [133] R. W. Carrell, B. Gooptu. Conformational changes and disease–serpins, prions and Alzheimer’s. Curr Opin Struct Biol, 8 (1998):799–809.

83

[134] J. Zollfrank, J. Friedrich, J. Fidy, J. M. Vanderkooi. Photochemical Holes under Pressure - Compressibility and Volume Fluctuations of a Protein. Journal of Chemical Physics, 94 (1991):8600–8603. [135] D. P. Kharakoz, A. P. Sarvazyan. Hydrational and intrinsic compressibilities of globular proteins. Biopolymers, 33 (1993):11–26. [136] T. V. Chalikian, K. J. Breslauer. Thermodynamic analysis of biomolecules: a volumetric approach. Curr Opin Struct Biol, 8 (1998):657–64. [137] L.D. Landau, M. Lifsitz. Elméleti Fizika 5.. Tankönyvkiadó, Budapest, 1977. [138] N. Taulier, T. V. Chalikian. Compressibility of protein transitions. Biochim Biophys Acta, 1595 (2002):48–70. [139] L. Smeller, J. Fidy. The enzyme horseradish peroxidase is less compressible at higher pressures. Biophysical Journal, 82 (2002):426–436. [140] J. L. Silva, G. Weber. Pressure Stability of Proteins. Annual Review of Physical Chemistry, 44 (1993):89–113. [141] M. P. Bova, O. Yaron, Q. Huang, L. Ding, D. A. Haley, P. L. Stewart, J. Horwitz. Mutation R120G in alphaB-crystallin, which is linked to a desmin-related myopathy, results in an irregular structure and defective chaperone-like function. Proc Natl Acad Sci U S A, 96 (1999):6137–42. [142] P. Fernando, R. Abdulle, A. Mohindra, J. G. Guillemette, J. J. Heikkila. Mutation or deletion of the C-terminal tail affects the function and structure of Xenopus laevis small heat shock protein, hsp30. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, 133 (2002):95–103. [143] K. C. Giese, E. Vierling. Mutants in a small heat shock protein that affect the oligomeric state: analysis and allele-specific suppression. J Biol Chem, (2004). [144] J. Horwitz, M. Bova, Q. L. Huang, L. Ding, O. Yaron, S. Lowman. Mutation of alpha B-crystallin: effects on chaperone-like activity. Int J Biol Macromol, 22 (1998):263– 9. [145] K. Ruan, R. Lange, F. Meersman, K. Heremans, C. Balny. Fluorescence and FTIR study of the pressure-induced denaturation of bovine pancreas trypsin. Eur J Biochem, 265 (1999):79–85. [146] A. Freiberg, A. Ellervee, P. Kukk, A. Laisaar, M. Tars, K. Timpmann. Pressure Effects on Spectra of Photosynthetic Light-Harvesting Pigment-Protein Complexes. Chemical Physics Letters, 214 (1993):10–16.

84

[147] H. Frauenfelder, N. A. Alberding, A. Ansari, D. Braunstein, B. R. Cowen, M. K. Hong, I. E. T. Iben, J. B. Johnson, S. Luck, M. C. Marden, J. R. Mourant, P. Ormos, L. Reinisch, R. Scholl, A. Schulte, E. Shyamsunder, L. B. Sorensen, P. J. Steinbach, A. H. Xie, R. D. Young, K. T. Yue. Proteins and Pressure. Journal of Physical Chemistry, 94 (1990):1024–1037. [148] L. Smeller, K. Heremans. 2D FT-IR spectroscopy analysis of the pressure-induced changes in proteins. Vibrational Spectroscopy, 19 (1999):375–378. [149] C. Balny, R. Hayashi, K. Heremans, P. Masson. High Pressure and Biotechnology. John Libbey Eurotext Ltd. Montrogue, France, 1992. [150] J. Zhang, X. Peng, A. Jonas, J. Jonas. NMR study of the cold, heat, and pressure unfolding of ribonuclease A. Biochemistry, 34 (1995):8631–41. [151] E. Tolgyesi, C. S. Bode, L. Smelleri, D. R. Kim, K. K. Kim, K. Heremans, J. Fidy. Pressure activation of the chaperone function of small heat shock proteins. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 50 (2004):361–9. [152] O. Weinreb, A. Dovrat, I. Dunia, E. L. Benedetti, H. Bloemendal. UV-A-related alterations of young and adult lens water-insoluble alpha-crystallin, plasma membranous and cytoskeletal proteins. Eur J Biochem, 268 (2001):536–43. [153] R. C. Augusteyn, H. D. Ellerton, T. Putilina, A. Stevens. Specific dissociation of alpha B subunits from alpha-crystallin. Biochim Biophys Acta, 957 (1988):192– 201. [154] A. Stevens, R. C. Augusteyn. Acid-induced dissociation of alpha A- and alpha Bcrystallin homopolymers. Biophys J, 65 (1993):1648–55. [155] S. Y. Lin, M. J. Li, C. J. Ho. pH-dependent secondary conformation of bovine lens alpha-crystallin: ATR infrared spectroscopic study with second-derivative analysis. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 237 (1999):157–60. [156] J. F. Koretz, E. W. Doss, J. N. LaButti. Environmental factors influencing the chaperone-like activity of alpha-crystallin. Int J Biol Macromol, 22 (1998):283– 94. [157] S. Takeuchi, Y. Mandai, A. Otsu, T. Shirakawa, K. Masuda, M. Chinami. Differences in properties between human alphaA- and alphaB-crystallin proteins expressed in Escherichia coli cells in response to cold and extreme pH. Biochem J, 375 (2003):471–5. [158] H. Gonzalez-Marquez, C. Perrin, P. Bracquart, C. Guimont, G. Linden. A 16 kDa protein family overexpressed by Streptococcus thermophilus PB18 in acid environments. Microbiology, 143 ( Pt 5) (1997):1587–94. 85

[159] S. Poon, S. B. Easterbrook-Smith, M. S. Rybchyn, J. A. Carver, M. R. Wilson. Clusterin is an ATP-independent chaperone with very broad substrate specificity that stabilizes stressed proteins in a folding-competent state. Biochemistry, 39 (2000):15953–60. [160] S. Poon, T. M. Treweek, M. R. Wilson, S. B. Easterbrook-Smith, J. A. Carver. Clusterin is an extracellular chaperone that specifically interacts with slowly aggregating proteins on their off-folding pathway. FEBS Lett, 513 (2002):259–66. [161] S. Poon, M. S. Rybchyn, S. B. Easterbrook-Smith, J. A. Carver, G. J. Pankhurst, M. R. Wilson. Mildly acidic pH activates the extracellular molecular chaperone clusterin. J Biol Chem, 277 (2002):39532–40. [162] W. E. Jacobus, G. J. th Taylor, D. P. Hollis, R. L. Nunnally. Phosphorus nuclear magnetic resonance of perfused working rat hearts. Nature, 265 (1977):756–8. [163] A. Punnia-Moorthy. Evaluation of pH changes in inflammation of the subcutaneous air pouch lining in the rat, induced by carrageenan, dextran and Staphylococcus aureus. J Oral Pathol, 16 (1987):36–44. [164] T. Back, M. Hoehn-Berlage, K. Kohno, K. A. Hossmann. Diffusion nuclear magnetic resonance imaging in experimental stroke. Correlation with cerebral metabolites. Stroke, 25 (1994):494–500. [165] H. K. Eltzschig, C. D. Collard. Vascular ischaemia and reperfusion injury. Br Med Bull, 70 (2004):71–86. [166] R. Pluta. From brain ischemia-reperfusion injury to possible sporadic Alzheimer’s disease. Curr Neurovasc Res, 1 (2004):441–53. [167] S. G. Fisher, M. S. Marber. An in vivo model of ischaemia-reperfusion injury and ischaemic preconditioning in the mouse heart. J Pharmacol Toxicol Methods, 48 (2002):161–9. [168] A. Prasad, B. J. Gersh. Management of microvascular dysfunction and reperfusion injury. Heart, 91 (2005):1530–2. [169] H. El Banani, M. Bernard, D. Baetz, E. Cabanes, P. Cozzone, A. Lucien, D. Feuvray. Changes in intracellular sodium and pH during ischaemia-reperfusion are attenuated by trimetazidine. Comparison between low- and zero-flow ischaemia. Cardiovasc Res, 47 (2000):688–96. [170] Kali P. Das, Witold K. Surewicz. Temperature-induced exposure of hydrophobic surfaces and its effects on the chaperone activity of -crystallin. FEBS Letters, 369 (1995):321–325.

86

[171] D. J. Dunstan, I. L. Spain. The Technology of Diamond Anvil High-Pressure Cells .1. Principles, Design and Construction. Journal of Physics E-Scientific Instruments, 22 (1989):913–923. [172] P. T. T Wong, D. J. Moffat. A new internal pressure calibrant for high pressure infrared spectroscopy of aqueous systems. Applied Spectroscopy, 43 (1989):1279– 1281. [173] W.F. Sherman, A. A. Stadtmuller. Experimental Techniques in High Pressure Research. John Wiley & Sons, 1987. [174] Z. T. Farahbakhsh, Q. L. Huang, L. L. Ding, C. Altenbach, H. J. Steinhoff, J. Horwitz, W. L. Hubbell. Interaction of alpha-crystallin with spin-labeled peptides. Biochemistry, 34 (1995):509–16. [175] Ch. Mohan Rao, B. Raman, T. Ramakrishna, K. Rajamaran, D. Gosh, S. Datta, V. D. Trivedi, M. B. Sukhaswami. Structural perturbation of -crystallin and its chaperone-like activity. International Journal of Biological Macromolecules, 22 (1998):271–281. [176] J. I. Clark, P. J. Muchowski. Small heat-shock proteins and their potential role in human disease. Curr Opin Struct Biol, 10 (2000):52–9. [177] K. P. Das, W. K. Surewicz. On the substrate specificity of alpha-crystallin as a molecular chaperone. Biochem J., 311 (1995):367–370. [178] J. Horwitz, Q. L. Huang, L. Ding, M. P. Bova. Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol, 290 (1998):365–83. [179] G. B. Reddy, S. Narayanan, P. Y. Reddy, I. Surolia. Suppression of DTT-induced aggregation of abrin by alphaA- and alphaB-crystallins: a model aggregation assay for alpha-crystallin chaperone activity in vitro. FEBS Lett, 522 (2002):59–64. [180] Lubert Stryer. Biochemistry. W. H. Freeman and Co., New York, 1988. [181] Abraham Savitzky, Marcel J. Golay. Smoothing and Differentation of Data by Simplified Least Squares Procedures. Anal. Chem., 36 (1964):1627 –1639. [182] L. Smeller. How Precise Are the Positions of Computer-Determined Peaks?. Applied Spectroscopy, 52 (1998):1623 – 1626. [183] Edward A. Burstein, Victor I. Emelyanenko. Log-Normal Description of Fluorescence Spectra of Organic Fluorophores. Photochemistry and Photobiology, 64 (1996):316–320. [184] Joseph R. Lakowicz. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum Press, New York, USA, 1983. 87

[185] K. Krishna Sharma, Harjeet Kaur, G. Suresh Kumar, Kathryn Kester. Interaction of 1,1’-Bi(4-anilino)naphtalene-5,5’-Disulfonic Acid with -crystallin. The Journal of Biological Chemistry, 273 (1998):8965–8970. [186] L.D. Landau, M. Lifsitz. Elméleti Fizika 1.. Tankönyvkiadó, Budapest, 1977. [187] G. N. Ramachandran, V. Sasisekharan. Conformation of polypeptides and proteins. Adv Protein Chem, 23 (1968):283–438. [188] M. Jackson, H. H. Mantsch. The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Crit Rev Biochem Mol Biol, 30 (1995):95–120. [189] M. P. Horvath, R. A. Copeland, M. W. Makinen. The second derivative electronic absorption spectrum of cytochrome c oxidase in the Soret region. Biophysical Journal, 77 (1999):1694–1711. [190] J. K. Kauppinen, D. J. Moffatt, H. H. Mantsch, D. G. Cameron. Fourier SelfDeconvolution - a Method for Resolving Intrinsically Overlapped Bands. Applied Spectroscopy, 35 (1981):271–276. [191] H. Torii, M. Tasumi. Model calculations on the amide-I infrared bands of globular proteins. The Journal of Chemical Physics, 96 (1992):3379–3387. [192] Jr. Reisdorf, W. C., S. Krimm. Infrared amide I’ band of the coiled coil. Biochemistry, 35 (1996):1383–6. [193] D. M. Byler, H. Susi. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. Biopolymers, 25 (1986):469–87. [194] Kangcheng Ruan, Shaoming Tian, Reinhard Lange, Claude Balny. Pressure Effects on Tryptophan and Its Derivatives. Biochemical and Biophysical Research Communications, 269 (2000):681–686. [195] David Eisenberg, Walter Kauzmann. The Structure and Properties of Water. Oxford University Press, 1969. [196] D. Rodbard, A. Chrambach. Estimation of molecular radius, free mobility, and valence using polyacylamide gel electrophoresis. Anal Biochem, 40 (1971):95–134. [197] Annette Tardieu. -crystallin quaternary structure and interactive properties control eye lens transparency. International Journal of Biological Macromolecules, 22 (1998):211–217. [198] V. Srinivas, B. Raman, K. S. Rao, T. Ramakrishna, M. Rao Ch. Structural perturbation and enhancement of the chaperone-like activity of alpha-crystallin by arginine hydrochloride. Protein Sci, 12 (2003):1262–70.

88

Saját közlemények jegyzéke Cikkek referált folyóiratban 1. S. V. Avilov, Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, A. S. Klymchenko, J. Fidy, A. P. Demchenko. Heat perturbation of bovine eye lens alpha-crystallin probed by covalently attached ratiometric fluorescent dye 4’-diethylamino-3-hydroxyflavone. Biopolymers (2005) 78, 340-348 IF: 2.863 2. S. V. Avilov, Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, A. S. Klymchenko, J. Fidy, A. P. Demchenko. Temperature effects on alpha-crystallin structure probed by 6-bromomethyl-2(2-furanyl)-3-hydroxychromone, an environmentally sensitive two-wavelength fluorescent dye covalently attached to the single Cys residue. International Journal of Biological Macromolecules (2005) 36, 290-298 IF: 1.328 3. F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller, K. K. Kim, K. Heremans, J. Fidy. Pressure activation of the chaperone function of small heat-shock proteins. Cell. Mol. Biol. (2004) 50, 361-369 IF: 0.873 4. Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, L. Smeller, K. Heremans, S. V. Avilov, J. Fidy Chaperonelike Activity of a-Crystallin is Enhanced by High Pressure Treatment. Biochemical Journal (2003) 370, 859-866. IF: 4.101 5. L. Smeller, F. Meersman, F. Tölgyesi, Cs. Böde, J. Fidy, K. Heremans. From aggregation to Chaperoning: Pressure effect on Intermolecular Interactions of Proteins High Pressure Research (2002) 22, 751-756. IF: 0.414 A publikációk összesített impakt faktora: 9.579

89

Poszterek és el˝oadások 1. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins — poszter 30. FEBS kongresszus, 2005. 07. 02-07. Budapest, Magyarország 2. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins — poszter 29. FEBS kongresszus, 2004. 06. 26-07.01. Varsó, Lengyelország 3. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins — poszter 2003 Gordon Research Conference on Proteins 2003. 06. 23-27. Holderness School NH. USA. 4. Böde Cs., Tölgyesi F., Smeller L., Fidy J.: Szerkezeti perturbációk hatása az alfakrisztallin chaperone m˝uködésére el˝oadás MBFT Vándorgy˝ulés 2003. 08. 24-27. Szeged. 5. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, J. Fidy: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata — el˝oadás Ph.D. tudományos napok 2003. 04. 10-11. Budapest 6. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, S. Avilov and J. Fidy: High pressure induced chaperone activity at alpha-crystallin — poszter FEBS Forum for Young Scientists 2002 10. 18-20. Isztambul, Törökország 7. Cs: Böde, F: Tölgyesi, L. Smeller, K. Heremans, J. Fidy: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Oligomeric Protein Alpha Crystallin — poszter 2002. High Pressure Bioscience and Biotechnolgy, 2002. 09. 16-19. Dortmund, Németország 8. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, J. Fidy: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata — el˝oadás Ph.D. tudományos napok 2002. 06. 7.-8. Budapest 9. Cs. Böde, K. K. Kim, L. Smeller, F. Tölgyesi, J. Fidy: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Protein Oligomer Alpha Crystallin — poszter XIV. International Biophysical Congress 2002. 04. 27-05. 01. Buenos Aires, Argentína

90

10. J. Fidy, F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Oligomeric Protein Alpha Crystallin — poszter 2002. Gordon Research Conference on Protein Folding Dynamics 2002. 01. 20-25. Ventura, CA, USA 11. L. Smeller, F. Meersman, Cs. Böde, F. Tölgyesi, J. Fidy, K. Heremans: Intermolecular Interactions of Proteins Affected by Pressure Aggregation, Dissociation, Chaperoning — el˝oadás European High Pressure Research Group Conference 2001. 09. 16.-19. Santander, Spanyolország 12. F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller, K. Heremans, Sz. Avilov, J. Fidy.: Nagy nyomás által kiváltott chaperon aktivitás alfa-krisztallinnál — elo˝ adás Magyar Biofizikai Társaság 20. Kongresszusa, 2001. Júl. 5-7. Budapest 13. Cs. Böde: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata. — XXV. OTDK Fizika szekció, Biofizika, Radioaktív környezetvizsgálat tagozat, 2001. — 1. Díj 14. Cs. Böde: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata. — XXV. OTDK Orvostudományi szekció, Biokémia tagozat, 2001. — 3. Díj 15. F. Tölgyesi, L. Smeller, Cs. Böde, K. Módos, K. Heremans, J. Fidy.: Pressurization of alpha-crystallin Induces Chaperone Activity — poszter III. International Conference on Molecular Recognition 2000. 08. 12-16. Pécs 16. R. Galántai, F. Tölgyesi, L. Smeller, Cs. Böde, J. Fidy Pressure Perturbation of The Structure of alpha-crystallin and its Relation to Chaperone Activity — Poszter 2000. FASEB Summer Research Conference Saxtons River Vermont, USA

91

Köszönetnyilvánítás Egy ekkora munkát nem lehet segítség és támogatás nélkül elvégezni, ez nem vitás. El o˝ ször is hálás vagyok szüleimnek, hogy a gondolkodás és a természettudományok tiszteletére neveltek gyermekkorom óta. Köszönöm egykori fizikatanáromnak, Skoda Lászlónénak a fizika csodáinak megmutatását. Csermely Péter professzornak, a Kutató Diákok Szövetségének és az ELTE Bolyai Kollégium közösségének pedig azt, hogy bevezettek a tudomány világába. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Fidy Judit Professzorasszonynak, témavezet o˝ mnek, Dr. Rontó Györgyi Professzorasszonynak, az Inonizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai cím˝u doktori program vezeto˝ jének, Dr. Rosivall László professzor úrnak az Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola vezeto˝ jének a doktori tanulmányaim során nyújtott támogatásukért. Szintén köszönet illeti Monos Emil Professzor urat, az Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola volt vezeto˝ jét. Hálával tartozom egykori diplomamunka és TDK-témavezeto˝ mnek, Dr. Tölgyesi Ferencnek és közvetlen munkatársamnak, Dr. Smeller Lászlónak, akikre mindig számíthattam és akikt˝ol sok segítséget és ösztönzést kaptam munkám során. Köszönöm az egész LSL labornak: Dr. Kaposi Andrásnak, Szigeti Krisztiánnak, Schay Gusztávnak, Dr. Osváth Szabolcsnak, Dr. Kulcsár Ágnesnek, Dr. Herényi Leventének, Dr. Kis-Petik Katalinnak, Dr. Végh Attilának és Árpádiné Markács Rózsának a sok-sok termékeny beszélgetést és a jó hangulatot. Köszönöm mindenkinek a Biofizikai Intézetben, hogy segítettek mind a doktori, mind az oktatási munkám során. Külön köszönöm Dr. Budai Mariannak a rengeteg beszélgetést és hogy "bevezetett" a német gyakorlatok tartásába. Köszönet illeti a Trefort-kert portásait az együttm˝uködésért az estébe nyúló mérések során és a Doktori Titkárság munkatársait a mindig segít˝okész, rugalmas munkavégzésért.

92

Végül köszönöm Feleségemnek, Gabinak, azt, hogy végig mellettem állt és támogatott.

93