Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Ionizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai program Programvezet˝o: Dr. Rontó Györgyi Budapest, 2006
A negyedleges szerkezet szerepe a kis h˝o-sokk fehérjék chaperon m˝uködésében Doktori értekezés tézisei Böde Csaba Semmelweis Egyetem, Biofizikai és Sugárbiológiai Intézet Témavezet˝o: Dr. Fidy Judit
.
1. Bevezetés A kis h˝o-sokk fehérjék (sHSP vagy más néven -ho˝ -sokk fehérjék [?]) a dajkafehérjék egyik legsokszín˝ubb családját alkotják [?], az archebaktériumoktól a gerincesekig szinte minden él˝o szervezetben megtalálhatóak. A család tagjai közti homológia sokkal kisebb, mint más dajkafehérje családokban, azonban minden kis h˝o-sokk fehérje közös vonása a körülbelül 80 aminosav hosszúságú homológ -krisztallin domén, amely a család egyik fontos tagjáról, a szemlencsében felfedezett -krisztallinról kapta a nevét [?]. Az alfa-krisztallin domén jelenléte alapján (azaz szerkezeti és nem funkcionális alapon) azonosítják be a család különböz˝o tagjait. Jelenlegi tudásunk alapján a kis h˝o-sokk fehérjék nem vesznek részt közvetlenül a fehérjék tekeredésében. Els˝odleges feladatuk a stressz hatására aggregálódó fehérjék megkötése [?]. A kis h˝o-sokk fehérjék a szervezetben legtöbbször nagyméret˝u oligomereket képeznek, bár monomer egységeik (alegységeik) molekulatömege mindössze 12 és 43 kDa között van [?]. Az egyes tagok oligomerizációja, és az oligomer szerkezet stressz hatására bekövetkezo˝ változásai a kis h˝o-sokk fehérjék családján belül nagyon különbözo˝ ek lehetnek [?]. Továbbá többségük negyedleges szerkezete is többféle lehet, oligomer populációjuk heterogén [?, ?], vagyis egyszerre különböz˝o méret˝u és szerkezet˝u oligomereket tartalmaz. E szerkezeti heterogenitás az oka annak, hogy kevés kis ho˝ -sokk fehérjér˝ol áll rendelkezésre röntgendiffrakciós szerkezeti modell, mivel a heterogén oligomerpopuláció miatt e fehérjéket nem lehet kristályosítani. Az oligomer szerkezet kialakulása a chaperon m˝uködés elo˝ feltétele [?, ?], az azonban nem ismert, hogy pontosan milyen negyedleges szerkezeti változások szükségesek a megfelel˝o chaperon m˝uködéshez. Munkánk során két kis h˝o-sokk fehérjét vizsgáltunk, a eml˝osök szemlencséjéb˝ol származó -krisztallint, illetve a Methanococcus jannaschii archebaktériumból származó 16.5 kDa tömeg˝u kis h˝o-sokk fehérjét (MjHSP16.5). Az MjHSP16.5 röntgendiffrakciós szerkezete ismert, és esetében eddig csupán 24 alegységb o˝ l álló oligomereket figyeltek meg, más negyedleges szerkezetet nem [?]. Az krisztallin negyedleges szerkezete nem ismert, azonban feltételezték [?], hogy a fehérje oligomer méretének növekedése szükséges a nagyobb chaperon aktivitás eléréséhez.
1
2. Célkituzés ˝ Munkánk során célunk a következ˝o kérdések vizsgálata volt:
Milyen oligomer szerkezet˝u kis h˝o-sokk fehérjék képesek chaperon hatást kifejteni?
Mi a szerepe a kis h˝o-sokk fehérjék többségénél megfigyelheto˝ heterogén negyedleges szerkezetnek e fehérjék chaperon m˝uködésében? Köthet o˝ -e a chaperon m˝uködés egy jól definiált negyedleges szerkezethez?
Milyen kölcsönhatások játszhatnak szerepet a kis ho˝ -sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában?
3. Módszerek Munkánk során marha szemb˝ol izolált -krisztallint használtunk. A frissen vágott állatok szemlencséjéb˝ol izolált -krisztallin aktivitását irodalmi adatokkal összevetve ellen˝oriztük. Az E. coli baktériumban kifejezett MjHSP16.5 fehérjét Prof. K.K. Kim (Suwon Egyetem, Dél-Korea) bocsátotta rendelkezésünkre [?], akivel munkacsoportunk együttm˝uködésben áll. A fehérjék szerkezetét két módszerrel: nagy nyomás rövid ideig tartó alkalmazásával és a környezeti pH rövid ideig tartó, savas irányú megváltoztatásával módosítottuk, majd vizsgáltuk az ennek hatására bekövetkez o˝ szerkezeti és funkcionális változásokat. A nagy nyomás különösen alkalmas az oligomer szerkezet˝u fehérjék vizsgálatára, mivel a másodlagos szerkezet sérülése nagyobb nyomáson következik be, mint az oligomer szerkezet disszociációja. Ezáltal leheto˝ ségünk van az oligomer szerkezet tanulmányozására a fehérje denaturációja nélkül, amit semmilyen más módszerrel nem tudunk megtenni. A környezeti pH változása az aminosav oldalláncok töltésein keresztül hat a fehérjék szerkezetére. Kis pH változás az oldallácok által kialakított gyenge kötések felbomlásához, míg nagy pH változás a fehérje denaturációjához vezet. Az -krisztallin esetében a chaperon aktivitás mérését inzulin aggregációs teszttel végeztük [?], amely során az inzulin aggregációjának gátlásával jellemezhetjük a chaperon aktivitást. Az MjHSP16.5 fehérje esetében rodanáz aggregációs tesztet használtunk a fehérje termofil jellege miatt. 2
A fehérjék másodlagos és harmadlagos szerkezeti változását fluoreszcencia spektroszkópiával (triptofán illetve ANS jelölés), illetve Fourier transzformációs infravörös spektroszkópiával vizsgáltuk. Az oligomerek disszociációját és a fehérjék negyedleges szerkezetét sztatikus fényszórással, illetve illetve az MjHSP16.5 esetében natív poliakrilamid gélelektroforézissel követtük nyomon.
4. Eredmények és következtetések 1. Az -krisztallin esetében kimutattuk, hogy a nagy nyomással (<400 MPa) való kezelés a chaperon aktivitás növekedését okozza. Ezáltal bebizonyítottuk, hogy többféle, in vitro chaperon aktivitással rendelkezo˝ negyedleges szerkezete is létezik. Nagy nyomás segítségével megfigyeltük az -krisztallin oligomerek részleges disszociációját, míg a rövid ideig tartó pH stressz hatására az oligomerek aggregálódtak. Mindkét kezelés az chaperon aktivitás növekedését okozta, azonban a nagy nyomással elért aktivitásnövekedés légköri nyomásra visszatérve 2 0,5 órás relaxációs id˝ovel elt˝unt. Ezzel szemben a rövid ideig tartó savas pH-sokkal elért aktivitásnövekedés még hosszú ido˝ (1 nap) után is megyfigyelhet˝o volt. Vagyis a fehérje chaperon m˝uködését több, különböz o˝ negyedleges szerkezet mellett is megfigyeltük. 2. Kimutattuk, hogy az -krisztallin esetében nem szükséges az oligomerek méretének növekedése a chaperon aktivitás növekedéséhez, kisebb méretu˝ oligomerek is képesek véd˝ohatást kifejteni. 3. Felderítettük az MjHSP16.5 fehérje nyomás hatására történo˝ disszociációjának egy lehetséges mechanizmusát és eközben elo˝ ször figyeltünk meg a 24 alegységb˝ol álló oligomer formától különböz˝o, chaperon aktivitással rendelkez˝o negyedleges szerkezetet. A fehérjét korábban mindig csak 24 alegységb o˝ l álló oligomer formában sikerült megfigyelni, az egyértelm˝uen definiált negyedleges szerkezet tette lehet˝ove a fehérje kristályosítását is [?]. Nagy nyomáson végzett natív poliakrilamid gélelektroforézis mérések segítségével felderítettük az MjHSP16.5 fehérje nyomás hatására történo˝ disszociációjának egy lehetséges mechanizmusát. Eszerint a disszociáció során elso˝ lépésben az oligomerek felfúvódnak, bels˝o üregükbe feltehet˝oen víz jut. Ezután történik a disszociáció, melynek során el˝oször a 24 alegységb˝ol álló oligomerek két, 12 alegységb˝ol álló kisebb oligomerre esnek szét. Ezzel párhuzamosan az elvégzett chaperon aktivitás vizs3
gálatok azt mutatták, hogy ez a szerkezet is aktív. 4. Kísérleteink alapján arra következtethetünk, hogy a kis ho˝ -sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában az intermolekuláris -kölcsönhatások mellett lényeges szerepük van a gyenge, másodlagos köto˝ er˝oknek is. Az elvégzett szerkezeti méréseinkb˝ol meg tudtuk állapítani, hogy milyen kölcsönhatások vesznek részt a kis h˝o-sokk fehérjék negyedleges szerkezetének kialakításában. Az általunk vizsgált kis h˝o-sokk fehérjék infravörös elnyelési spektrumában az amid I sávban található egy komponens 1688 cm -nél, ami az intermolekuláris -kölcsönhatások jelenlétére utal. Ezek az intermolekuláris -lemezek megfigyelhet˝oek mindhárom eddig ismert szerkezet˝u kis ho˝ -sokk fehérje (MjHSP16.5, Búza HSP16.9, TSP36) röntgendiffrakciós szerkezetén is. Amennyiben megfigyeljük a fehérjék disszociációjának nyomásfüggését, azt összehasonlítva az 1688 cm komponens nyomás hatására megfigyelheto˝ gyengülésével azt tapasztaljuk, hogy a fehérjék disszociációja kisebb nyomáson elkezd˝odik, mint az 1688 cm -nél található infravörös elnyelési komponens gyengülése. A disszociáció mindkét fehérje esetében 50 MPa nyomásnál megfigyelhet˝o, míg az intermolekuláris -kölcsönhatások ero˝ sségére jellemz˝o 1688 cm nél található infravörös elnyelési komponens gyengülés -krisztallinnál 200 MPa, MjHSP16.5 fehérje esetében pedig 1700 MPa nyomás felett látható. Azaz a fehérje disszociációja nem jár együtt az intermolekuláris -kölcsönhatások gyengülésével, ami alátámasztja a gyenge köt˝oer˝ok szerepét az -krisztallin negyedleges szerkezetének kialakításában. 5. Az -krisztallin esetében kimutattuk, hogy savas pH-n történo˝ denaturáció után a natív (pH 7) környezetet visszaállítva a fehérje másodlagos szerkezete gyorsan visszaáll, a negyedleges szerkezet ezzel szemben nem. Ilyen állapotban a fehérje chaperon aktivitása nagyobb, ami megero˝ síti azt a feltételezést, hogy a kis h˝o-sokk fehérjéknek fontos szerepük van a savas környezet és többek között az Ischémia-Reperfúziós károsodás elleni védekezésben.
4
5. Saját közlemények jegyzéke Cikkek referált folyóiratban 1. S. V. Avilov, Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, A. S. Klymchenko, J. Fidy, A. P. Demchenko. Heat perturbation of bovine eye lens alpha-crystallin probed by covalently attached ratiometric fluorescent dye 4’-diethylamino-3hydroxyflavone. Biopolymers (2005) 78, 340-348 IF: 2.863 2. S. V. Avilov, Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, A. S. Klymchenko, J. Fidy, A. P. Demchenko. Temperature effects on alpha-crystallin structure probed by 6-bromomethyl-2-(2-furanyl)-3-hydroxychromone, an environmentally sensitive two-wavelength fluorescent dye covalently attached to the single Cys residue. International Journal of Biological Macromolecules (2005) 36, 290-298 IF: 1.328 3. F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller, K. K. Kim, K. Heremans, J. Fidy. Pressure activation of the chaperone function of small heat-shock proteins. Cell. Mol. Biol. (2004) 50, 361-369 IF: 0.873 4. Cs. Böde, F. G. Tölgyesi, L. Smeller, K. Heremans, S. V. Avilov, J. Fidy Chaperone-like Activity of a-Crystallin is Enhanced by High Pressure Treatment. Biochemical Journal (2003) 370, 859-866. IF: 4.101 5. L. Smeller, F. Meersman, F. Tölgyesi, Cs. Böde, J. Fidy, K. Heremans. From aggregation to Chaperoning: Pressure effect on Intermolecular Interactions of Proteins High Pressure Research (2002) 22, 751-756. IF: 0.414 A publikációk összesített impakt faktora: 9.579
Poszterek és el˝oadások 1. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins — poszter 30. FEBS kongresszus, 2005. 07. 02-07. Budapest, Magyarország 2. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins — poszter 29. FEBS kongresszus, 2004. 06. 26-07.01. Varsó, Lengyelország
5
3. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, K. K. Kim and J. Fidy: Structural Mechanisms of the Chaperone Activity of Small Heat-Shock Proteins — poszter 2003 Gordon Research Conference on Proteins 2003. 06. 23-27. Holderness School NH. USA. 4. Böde Cs., Tölgyesi F., Smeller L., Fidy J.: Szerkezeti perturbációk hatása az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésére elo˝ adás MBFT Vándorgy˝ulés 2003. 08. 24-27. Szeged. 5. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, J. Fidy: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata — el˝oadás Ph.D. tudományos napok 2003. 04. 10-11. Budapest 6. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, S. Avilov and J. Fidy: High pressure induced chaperone activity at alpha-crystallin — poszter FEBS Forum for Young Scientists 2002 10. 18-20. Isztambul, Törökország 7. Cs: Böde, F: Tölgyesi, L. Smeller, K. Heremans, J. Fidy: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Oligomeric Protein Alpha Crystallin — poszter 2002. High Pressure Bioscience and Biotechnolgy, 2002. 09. 16-19. Dortmund, Németország 8. Cs. Böde, F. Tölgyesi, L. Smeller, J. Fidy: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata — el˝oadás Ph.D. tudományos napok 2002. 06. 7.8. Budapest 9. Cs. Böde, K. K. Kim, L. Smeller, F. Tölgyesi, J. Fidy: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Protein Oligomer Alpha Crystallin — poszter XIV. International Biophysical Congress 2002. 04. 27-05. 01. Buenos Aires, Argentína 10. J. Fidy, F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller: High Pressure Enhances the Chaperon Activity of the Oligomeric Protein Alpha Crystallin — poszter 2002. Gordon Research Conference on Protein Folding Dynamics 2002. 01. 20-25. Ventura, CA, USA 11. L. Smeller, F. Meersman, Cs. Böde, F. Tölgyesi, J. Fidy, K. Heremans: Intermolecular Interactions of Proteins Affected by Pressure Aggregation, Dissociation, Chaperoning — el˝oadás European High Pressure Research Group Conference 2001. 09. 16.-19. Santander, Spanyolország 6
12. F. Tölgyesi, Cs. Böde, L. Smeller, K. Heremans, Sz. Avilov, J. Fidy.: Nagy nyomás által kiváltott chaperon aktivitás alfa-krisztallinnál — elo˝ adás Magyar Biofizikai Társaság 20. Kongresszusa, 2001. Júl. 5-7. Budapest 13. Cs. Böde: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata. — XXV. OTDK Fizika szekció, Biofizika, Radioaktív környezetvizsgálat tagozat, 2001. — 1. Díj 14. Cs. Böde: Az alfa-krisztallin chaperone m˝uködésének vizsgálata. — XXV. OTDK Orvostudományi szekció, Biokémia tagozat, 2001. — 3. Díj 15. F. Tölgyesi, L. Smeller, Cs. Böde, K. Módos, K. Heremans, J. Fidy.: Pressurization of alpha-crystallin Induces Chaperone Activity — poszter III. International Conference on Molecular Recognition 2000. 08. 12-16. Pécs 16. R. Galántai, F. Tölgyesi, L. Smeller, Cs. Böde, J. Fidy Pressure Perturbation of The Structure of alpha-crystallin and its Relation to Chaperone Activity — Poszter 2000. FASEB Summer Research Conference Saxtons River Vermont, USA
Hivatkozások [1] F. Narberhaus: Alpha-crystallin-type heat shock proteins: socializing minichaperones in the context of a multichaperone network, Microbiol Mol Biol Rev 66 (2002), 64–93. [2] M. Haslbeck, T. Franzmann, D. Weinfurtner és J. Buchner: Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins, Nat Struct Mol Biol 12 (2005), 842–6. [3] W. W. de Jong, G. J. Caspers és J. A. Leunissen: Genealogy of the alphacrystallin–small heat-shock protein superfamily, Int J Biol Macromol 22 (1998), 151–62. [4] K. Rajaraman, B. Raman, T. Ramakrishna és C. M. Rao: The chaperonelike alpha-crystallin forms a complex only with the aggregation-prone molten globule state of alpha-lactalbumin, Biochem Biophys Res Commun 249 (1998), 917–21.
7
[5] D. A. Haley, M. P. Bova, Q. L. Huang, H. S. McHaourab és P. L. Stewart: Small heat-shock protein structures reveal a continuum from symmetric to variable assemblies, J Mol Biol 298 (2000), 261–72. [6] M. R. Leroux, R. Melki, B. Gordon, G. Batelier és E. P. Candido: Structurefunction studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides, J Biol Chem 272 (1997), 24646–56. [7] M. Haslbeck: shsps and their role in the chaperone network, Cell Mol Life Sci 59 (2002), 1649–57. [8] N. Lentze, S. Studer és F. Narberhaus: Structural and functional defects caused by point mutations in the alpha-crystallin domain of a bacterial alphaheat shock protein, J Mol Biol 328 (2003), 927–37. [9] K. C. Giese és E. Vierling: Changes in oligomerization are essential for the chaperone activity of a small heat shock protein in vivo and in vitro, J Biol Chem 277 (2002), 46310–8. [10] D. R. Kim, I. Lee, S. C. Ha és K. K. Kim: Activation mechanism of hsp16.5 from methanococcus jannaschii, Biochem Biophys Res Commun 307 (2003), 991–8. [11] M. R. Burgio, C. J. Kim, C. C. Dow és J. F. Koretz: Correlation between the chaperone-like activity and aggregate size of alpha-crystallin with increasing temperature, Biochem Biophys Res Commun 268 (2000), 426–32. [12] K. K. Kim, H. Yokota, S. Santoso, D. Lerner, R. Kim és S. H. Kim: Purification, crystallization, and preliminary x-ray crystallographic data analysis of small heat shock protein homolog from methanococcus jannaschii, a hyperthermophile, J Struct Biol 121 (1998), 76–80. [13] Z. T. Farahbakhsh, Q. L. Huang, L. L. Ding, C. Altenbach, H. J. Steinhoff, J. Horwitz és W. L. Hubbell: Interaction of alpha-crystallin with spinlabeled peptides, Biochemistry 34 (1995), 509–16. [14] K. K. Kim, R. Kim és S. H. Kim: Crystal structure of a small heat-shock protein, Nature 394 (1998), 595–9.
8
6. Köszönetnyilvánítás Egy ekkora munkát nem lehet segítség és támogatás nélkül elvégezni, ez nem vitás. El˝oször is hálás vagyok szüleimnek, hogy a gondolkodás és a természettudományok tiszteletére neveltek gyermekkorom óta. Köszönöm egykori fizikatanáromnak, Skoda Lászlónénak a fizika csodáinak megmutatását. Csermely Péter professzornak, a Kutató Diákok Szövetségének és az ELTE Bolyai Kollégium közösségének pedig azt, hogy bevezettek a tudomány világába. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Fidy Judit Professzorasszonynak, témavezet˝omnek, Dr. Rontó Györgyi Professzorasszonynak, az Inonizáló és nem ionizáló sugárzások biológiai hatásai cím˝u doktori program vezeto˝ jének, Dr. Rosivall László professzor úrnak az Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola vezet o˝ jének a doktori tanulmányaim során nyújtott támogatásukért. Szintén köszönet illeti Monos Emil Professzor urat, az Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola volt vezet˝ojét. Hálával tartozom egykori diplomamunka és TDK-témavezeto˝ mnek, Dr. Tölgyesi Ferencnek és közvetlen munkatársamnak, Dr. Smeller Lászlónak, akikre mindig számíthattam és akikt˝ol sok segítséget és ösztönzést kaptam munkám során. Köszönöm az egész LSL labornak: Dr. Kaposi Andrásnak, Szigeti Krisztiánnak, Schay Gusztávnak, Dr. Osváth Szabolcsnak, Dr. Kulcsár Ágnesnek, Dr. Herényi Leventének, Dr. Kis-Petik Katalinnak, Dr. Végh Attilának és Árpádiné Markács Rózsának a sok-sok termékeny beszélgetést és a jó hangulatot. Köszönöm mindenkinek a Biofizikai Intézetben, hogy segítettek mind a doktori, mind az oktatási munkám során. Külön köszönöm Dr. Budai Mariannak a rengeteg beszélgetést és hogy "bevezetett" a német gyakorlatok tartásába. Köszönet illeti a Trefort-kert portásait az együttm˝uködésért az estébe nyúló mérések során és a Doktori Titkárság munkatársait a mindig segíto˝ kész, rugalmas munkavégzésért. Végül köszönöm Feleségemnek, Gabinak, azt, hogy végig mellettem állt és támogatott.
9
