A morfofunkcionális mátrixok módszere idegsejtek dendritfáinak morfofunkcionális összehasonlítására
Somogyi Attila
2013
1 Tartalomjegyzék 1 Tartalomjegyzék ...................................................................................................................... 2 2 Absztrakt ................................................................................................................................. 3 3 Bevezetés ................................................................................................................................. 4 4 Módszerek ............................................................................................................................... 5 4.1 Előzmények .................................................................................................................. 5 4.2 Membrán- és szinapszis modellek................................................................................ 6 4.3 A vizsgált sejttípusok ................................................................................................... 8 4.4 A morfofunkcionális mátrixok módszere ................................................................... 10 5 Eredmények ........................................................................................................................... 14 5.1 100x100-as morfofunkcionális mátrixok ................................................................... 14 5.2 Dendrit felszínek eloszlása a sejttesttől mért távolság függvényében ....................... 15 5.3 A dendrit felszínek eloszlása az elektrotónikus térben .............................................. 16 5.4 A dendrit felszínek eloszlása a temporális térben ...................................................... 18 5.5 A dendritikus felszínek szómától mért távolságainak összehasonlítása .................... 20 5.6 Klaszteranalízis .......................................................................................................... 22 6 Megbeszélés .......................................................................................................................... 24 7 Köszönetnyilvánítás ............................................................Hiba! A könyvjelző nem létezik. 8 Irodalomjegyzék .................................................................................................................... 25 9 Függelék .............................................................................. Hiba! A könyvjelző nem létezik.
2
2 Absztrakt A neuronok nagyon különböző morfológiával és funkcióval rendelkeznek és általában nagyszámú szinapszist fogadnak, főképpen a dendritikus felszínükön. A sejt tüzelési aktivitását a sejttestre (axon eredési kúpra) érkező posztszinaptikus potenciálok (PSP) nagysága és időbeli szummációja határozza meg. Ezért fontos a dendritfa különböző területein található szinapszisok aktivitása során generált PSP-ok szomatopetális terjedése során bekövetkező gyengülésének és a terjedéshez szükséges időnek a vizsgálata. A morfoelektrotónikus transzformáció (MET) (Zador és mtsai., 1995) két fajtája lehetővé teszi az idegsejtek morfológiájának funkcionális térbe való transzformációját, ahol a dendritikus pontok és a sejttest illetve a dendritikus pontok távolságai (path distance) arányosak a PSP-ok két pont közötti gyengülésével, vagy a két pont közötti terjedéséhez szükséges idővel (funkcionális távolságok). Azonban a dendritikus felszínnek azon részeit, melyek adott geometriai és funkcionális távolságokra vannak a szómától nehéz azonosítani a MET
módszerével.
E
probléma
megoldására
továbbfejlesztettük
a
MET-t
és
morfofunkcionális mátrixokat (MFM) készítettünk, hogy feltérképezzük a dendritek teljes felszínének milyen hányada (az összes fogadott szinapszis arányának egy közelítése) található különböző geometriai és funkcionális távolságokban. A MFM-ok két fajtáját használtuk (morfoelektrotónikus és morfotemporális), melyekben a mátrix elemek megmutatják, hogy a valamely geometriai és funkcionális (PSP gyengülés, illetve terjedési idő) távolságban a teljes dendrit felszín hány százaléka található. Vizsgálatainkat morfológiailag nagy hűségű passzív szegmentális kábel modellekben végeztük a NEURON (Duke University, USA) program segítségével. Három különböző típusú központi idegrendszeri neuront hasonlítottunk össze a MFM-ok módszerével: hippokampális piramis sejteket egérben, kisagyi Purkinje sejteket egérben és tengeri malacban, valamint gerincvelői végtagmozgató motoneuronokat békában. A sejteket vizsgáltuk homogén és inhomogén membrán modellekben (ahol a szóma és dendrit membránja azonos, illetve különböző) is. Eredményeink azt mutatják, hogy az MFM módszer alkalmas különböző sejtek morfofunkcionális összefüggéseinek megjelenítésére, valamint képes a különböző neuron típusokat elkülöníteni egymástól.
3
3 Bevezetés Az idegrendszert alkotó neuronok nagy változatosságban fordulnak elő, mind morfológiai, mind funkcionális szempontból. A morfológiai és funkcionális tulajdonságok korrelatív összehasonlítását lehetővé tevő módszerek palettája igen szűkös. Vizsgálták a különféle neuronok morfológiai és elektromos sajátságait (pl. Bui és mtsai., 2003), mások ugyanolyan típusú, de különböző lokalizációjú neuronokat hasonlítottak össze (Carnavale és mtsai., 1997; Stelescu és mtsai., 2012). A neuronok komplex morfofunkcionális vizsgálatához és grafikus szemléltetéséhez a Morfoelekrotónikus Transzformációt (MET-et) (Zador és mtsai., 1995) használhatjuk, mely lehetővé
teszi,
hogy
a
dendritek
morfológiai
architektúráját
funkcionális
térbe
transzformáljuk, ahol a dendritikus pontok (szinaptikus területek) egymástól, valamint a szómától mért path distance távolságai a mikrométerben mért geometriai távolságok helyett, a PSP-ok gyengülésével illetve az azok terjedéséhez szükséges idővel arányosak (gyengülési görbék, ill. késleltetési görbék). A forma-funkció összefüggéseinek együttes vizsgálatához ez a módszer csak korlátozottan alkalmas. Az összefüggések jobb megértéséhez a morfoelektrotónikusan transzformált dendriteket MFM-okkal jellemeztük.
4
4 Módszerek 4.1 Előzmények A
Morfofunkcionális
Mátrix
(MFM)
kifejlesztéséhez
a
Morfoelektrotónikus
transzformációból (MET) indultunk ki (Zador és mtsai., 1995). A MET-tel lehetőségünk van gyengülési görbék (attenogram) készítésére, melyek a PSP-ok szomatopetális terjedése során fellépő gyengülést szemléltetik, valamint, késleltetési görbék (delayogram) készítésére melyek a PSP-ok terjedéséhez szükséges időt szemléltetik grafikus úton. A MET módszerében a neuronok grafikus szemléltetéséhez; a PSP -ok dendritikus terjedés során bekövetkező gyengülésének és késésének a mérésére additív mérőszámokat kell használnunk (1. ábra).
1. ábra A PSP-ok gyengülésének és késési idejének mérése A PSP-ok gyengülésének és késési idejének mérése során azt használjuk ki, hogy a PSP egy a dendriten végighaladó potenciál különbség, melynek során mérhető egy adott dendrit szakaszon a membránpotenciál csökkenése, valamint, hogy egy ilyen szakaszt, mennyi idő alatt tesz meg az ingerület. A MET során a PSP gyengülést a szóma dendrit membrán két pontja között „log attenuation” segítségével (A ábra), a PSP terjedéséhez szükséges időt pedig az (Iin) áraminjekció hatására keletkező dendritikus és szomatikus potenciál-idő függvények centroidjainak különbségével (B ábra) mérjük. Adaptálva (Zador és mtsai., 1995)ből.
5
A gyengülést az ún.”log attenuation”–nel (Lij) mérjük, amely egyenlő a szinaptikus aktivitás során a posztszinaptikus membránban, ill. a sejttesten mérhető feszültség-idő függvények alatti területek arányának a logaritmusával. A késési időt pedig az ún. "propagation delay" vel (Pij) mérjük, ami a szinapszis helyén, ill. a szinaptikus működés során, a sejttesten mérhető
feszültség-idő
függvények
centroidjainak
az
időkülönbsége.
(A
centroid
szemléletesen egy tetszőleges síkidom (test) geometriai középpontja. Esetünkben ez egy kétdimenziós kordináta rendszerben egy függvény alatti terület, ahol a késési idő definíciójában használt centroid ezen terület geometriai középpontjának vízszintes koordinátája (lásd 1/B. ábra),. Fizikailag, ha ezt a területet kivágnánk kartonból, akkor ennek a karton lemeznek a centroidja a lemez tömegközépontja.) Az így definiált, a PSP terjedését jellemző mennyiségek additívak, de nagyságuk függ a dendritikus ingerületterjedés irányától. A PSP sebességét végtelen hosszú, hengeres idegsejt nyúlvány esetében a következő képlet határozza meg: 2λ/τ, ahol λ a térkonstans, τ az idő konstans. A térkonstans; λ=(Rm*d/2Ri)1/2.,az időkonstans; τ=Rm*Cm, ahol Rm: felületegységenkénti (specifikus) membrán ellenállás, d: az idegsejt nyúlvány átmérője, Ri: citoplazma fajlagos ellenállása, Cm: membrán felületegységenkénti (specifikus) kapacitása Egy valódi idegsejt esetében a szignál sebessége pontonként változó, a dendrit fa arborizációjától (elágazódási mintázat, dendrit hosszak és vastagságok) és biofizikai paramétereitől (ioncsatornák típusától és mennyiségétől, a membrán kapacitásától, ellenállásától, citoplazma ellenállásától) függően (Agmon-Snir és mtsai, 1993). 4.2 Membrán- és szinapszis modellek A PSP-ok gyengülését két esetben is vizsgáltuk a választott sejtek passzív szegmentális kábelmodelljeiben: az egyikben konstans áramot injektáltunk a dendritfa különböző (sejtenként ~1000 pont) pontjaiba (steady-state eset), a másikban 50Hz-es, szinuszoid karakterű áram injekciókat használtunk, majd az általuk okozott PSP-okat mértük a szómán és az áraminjekció helyén. A konstans karakterű áram input segítségével a lassú kinetikájú, a szinuszoid áram inputtal a gyors kinetikájú szinaptikus kapcsolatokat modelleztük. A különböző dendritikus pontokban történt áraminjekciók során mért potenciálokból minden esetben kiszámítottuk az Lij és Pij értékeket. A valódi idegsejtekben azonban általában több szinapszis is működik a vizsgált szinapszissal egyidőben. A többi szinapszis által létrehozott PSP-okat átlagosan, mint szinaptikus háttéraktivitást vettünk figyelembe. A szinaptikus háttéraktivitás szempontjából két esetet vizsgáltunk meg. Az első esetben a szóma és a dendritek felületegységenkénti membrán 6
ellenállását azonosnak tételeztük fel, ez a homogén szóma-dendrit membrán esete, a másik esteben pedig a dendritek ellenállását a szómáénál nagyobbnak, 50000 Ωcm2-nek választottuk, ez az inhomogén eset. A két eset vizsgálata releváns, mivel a szinaptikus háttéraktivitás változásai, valamint a membránok inherens különbségei is okozhatnak membrán inhomogenitásokat. Irodalmi források szerint motoneuronok esetén a dendritek felületegységenkénti ellenállása nagyobb a szómáénál (Iansek és Redman 1973; Fleshman és mtsai., 1988; Rose és Vanner, 1988). A piramis és Purkinje sejtekre jellemző szóma és dendrit membránellenállás értékek viszonyairól, illetve azok abszolút értékeiről sincs általánosan elfogadott irodalmi adat.
7
4.3 A vizsgált sejttípusok Az MFM módszer kifejlesztése során három sejttípust vizsgáltunk meg; felnőtt béka, gerincvelői végtag mozgató motoneuronjait, felnőtt egerek hippokampális piramis sejtjeit, valamint kisagyi Purkinje sejteket (tengeri malac és egerek), mindhárom sejttípusból 5-5 neuront felhasználva. Az idegsejtek számítógépes modelljeiben a neuronok ellenállásait a fiziológiás értékek közt tartottuk: piramis sejteknél: 40-200 MΩ, Purkinje sejtek esetén 10-45 MΩ, motoneuron esetén 1-6 MΩ (Magherini és mtsai., 1976; Frank és mtsai., 1956; Urbán és mtsai., 1987; Yang és mtsai., 1996; Dégenètais és mtsai., 2002; Rapp és mtsai., 1994). A sejtek morfológiai adatait azok térbeli, szubmikronos pontosságú Neurolucidával (MicroBrightField Inc., USA) történt rekonstrukcióiból nyertük. A Neurolucida rendszer egy mikroszkópból és a hozzákapcsolt számítógépből áll és lehetőséget ad nagy pontosságú, térbeli leképezésre, mely során minden dendritikus pont esetén regisztrálásra kerül annak X, Y és Z koordinátája, valamint a dendrit vastagsága is. A motoneuronok morfológiai adatai az Anatómia, Szövet- és Fejlődéstani Intézet anyagából származnak, (Birinyi és mtsai., 1992) míg a piramis és Purkinje sejteket a „Neuromorpho” internetes adatbázisból (http://neuromorpho.org, Ascoli GA 2006) vettük. A szimulációkhoz egy speciális program csomagot, a NEURON szimulációs szoftvert használtunk (Hines és Carnavale, 1997, 2001). A 2. ábrán látható az általunk vizsgált sejtek morfológiai képe.
8
2. ábra Az általam vizsgált három sejttípus 5-5 sejtjének dendritarborizációja A dendritikus ingerületvezetés vizsgálatához a Rall féle passzív, szegmentális kábelmodellt (Rall, 1977, Stelescu és mtsai., 2012) használtuk. A morfológiai adatokat felhasználva, a MET során kapott gyengülési görbét és késleltetési görbét a 3. ábrán mutatjuk be, az adott sejt morfológiai képével összehasonlítva, szemléltetve az egyes sejttípusok esetén létrejövő változásokat.
9
3. ábra MET szemléltetése Az első oszlopban mindhárom sejttípus egy-egy tipikus sejtjének morfológiai képe látható. Melletük a belőlük a MET-val képzett gyengülési görbét (attenogramot), valamint a késleltetési görbét (delayogramot) ábrázoltuk. Látható, hogy a MET során a sejt dendritikus architektúrája megváltozik, hiszen a homológ dendritikus pontok közötti távolságok aránya a transzformáció után módosul. 4.4 A morfofunkcionális mátrixok módszere A MET módszerét oly módon fejlesztettük tovább, hogy a dendritek transzformáltjait morfofunkcionális mátrixokkal (MFM) jellemeztük (4. ábra). Kétféle MFM-ot készítettünk, morfoelektrotónikus és morfotemporális mátrixokat. Morfoelektrotónikus mátrixoknál a mátrix egy eleme azon dendritek felszínét adja meg a teljes dendrit felszín százalékában, amelyek ugyanakkora geometriai távolság tartományban találhatóak és az ezekről induló PSPok ugyanakkora gyengüléssel érik el a szómát. Morfotemporális mátrixoknál, egy mátrix elem azon dendritek felszínét adja meg, amelyek a szómától mért, adott geometriai távolság
10
tartományba esnek és emellett az ezen dendritekről induló PSP-ok késési ideje adott időintervallumba esik. A MFM-ok n x n-es kvadratikus mátrixok. Statisztikai összehasonlításokhoz 10x10-es, míg grafikus szemléltetéshez 100x100-as mátrixokat használtunk.
4. ábra A morfofunkcionáis mátrix általános felépítése 10x10-es minta morfoelektrotónikus mátrix, melyben magenta színnel kiemeltük a mátrixra jellemző sajátságokat. Az egyes cellák (A) az adott geometriai és elektrotónikus távolságban található dendrit felszínt a teljes dendrit felszín százalékában adják meg a színskálának (B) megfelelően. Az egyes sorok (C) a geometriai, míg az oszlopok (D) az egyes elektrotónikus távolságtartományoknak felelnek meg, a sejttesttől a legtávolabbi geometriai ill. elektrotónikus távolságban lévő dendritikus pont távolságát 100%-nak véve. Hasonlóan morfotemporális mátrixok is képezhetőek, melyekben az elektrotónikus távolságok helyett a PSP-ok sejttestre történő terjedéshez szükséges időt mérjük a legnagyobb terjedési idő (100%) százalékában.
11
Mivel a mátrixok elemei (4. ábra A) a valamely geometriai ÉS elektrotónikus (ill. temporális) távolságban található dendrit felszínt adják meg a dendritek összfelszínének százalékában, ezért az összes mátrix elem összege 100%. A melegebb színekkel nagyobb, a hidegebb színekkel kisebb felszíneket jelölünk (4. ábra B). A sejttesttől mért távolságokat szintén százalékosan ábrázoltuk, a maximális geometriai, illetve elektrotónikus távolságú dendritikus pont távolságát 100%-nak tekintve. A mátrix sorai különböző geometriai (4. ábra C), míg az oszlopai különböző elektrotónikus távolságoknak (4. ábra D) felelnek meg. A mátrix sorösszegei adják az adott geometria távolságban, az oszlopösszegei pedig az adott elektrotónikus távolságban található dendrit felszínt. A statisztikai elemzés során az egyes sejttípusok közötti összehasonlításokat, a mátrixok sor és oszlop összegeiből kapott görbék (a dendrit
felszín
eloszlása
a
geometriai,
elektrotónikus
illetve
temporális
térben)
összehasonlításához ANOVA tesztet használtunk, p<0,05-ös szignifikancia szint mellett. Az átlagtávolságok páros összehasonlítását Mann-Whitney teszttel végeztük. A statisztikai számításokhoz a PAST programot (Hammer és mtsai., 2001) alkalmaztuk. A sejtek dendritfáit leíró mátrixok csoportosításához, vagyis annak tesztelésére, hogy a MFMok képesek-e szétválasztani a sejttípusokat, klaszteranalízist (Hartigan 1975) használtunk. A klaszteranalízishez először a MFM-okból egy távolság mátrixot készítettünk, melyben a mátrix elemek az összehasonlítandó MFM-ok absztrakt távolságát (azaz azok hasonlóságát) adják meg. Ez a távolság mátrix az autós térképekben használt, a városok közötti távolságokat tartalmazó táblázat analógja. A távolság mátrixban, ha két MFM távolsága kisebb, akkor azokat hasonlóbbaknak tekintjük. Két MFM távolságát (hasonlóságát) a MFM-ok azonos soraiban és oszlopaiban lévő elemek abszolút értékben vett különbségeinek összegeként értelmeztük (10x10-es MFM-ok esetében ez tehát egy száztagú összeg). Bevezettük a kompozit
távolság
mátrix
fogalmát,
a
sejttípusok
dendritikus
architektúrájának
legkomplexebb összehasonlításához és csoportosításához. A kompozit távolság mátrix hat távolság mátrix összegeként áll elő. Az összeadandó távolságmátrixok közül négy a morfoelektrotónikus mátrixok hasonlóságát méri homogén illetve inhomogén szóma-dendrit membrán mellett, konstans illetve szinuszoid áraminput esetében. További két távolságmátrix a kétfajta membrán esetében kapott morfotemporális mátrixok hasonlóságát mérő távolságmátrix. Az így létrejött kompozit távolság mátrix alapján végeztük el a klaszteranalízist a WARD'S féle módszerrel (diszperzitás növekedés). Ehhez az SPSS 19 (IBM) programot használtuk. A kapott eredményt dendrogramon jelenítettük meg.
12
A grafikonok készítéséhez a PAST (Hammer és mtsai., 2001) és a MS Excel (Microsoft Corporation) programokat használtuk. A görbéken az átlagok mellett a középértékek közepes hibáját ábrázoltuk.
13
5 Eredmények 5.1 100x100-as morfofunkcionális mátrixok A sejtekre kapott MFM-okat 100x100-as felbontásban is elkészítettük, (5. ábra) melyekben a különbségek szemmel is jól láthatóak.
5. ábra 100x100 morfofunkcionális mátrixok A három sejttípus egy-egy reprezentatív sejtjének 100x100-as morfoelektrotónikus mátrixa, konstans ("steady-state") és szinuszoid áram input esetén, homogén és inhomogén szómadendrit membrán mellett. Látható, hogy a dendritikus felszínek eloszlásai sejttípusra jellemzőek, valamint a homogén és inhomogén szóma-dendrit membrán esetében eltérőek.
14
5.2 Dendrit felszínek eloszlása a sejttesttől mért távolság függvényében A morfofunkcionális mátrixokat elemenként és azok sor-, ill. oszlopösszegei alapján is analizáltuk. Először a dendrit felszínek geometriai eloszlását hasonlítottuk össze a sejttesttől mért távolságok függvényében (6. ábra). A geometriai eloszlás adatpontjai a MFM-ok sorösszegei.
6. ábra Dendrit felszínek eloszlása a sejttesttől mért távolság függvényében A távolságtartományokban a szignifikáns különbségeket csillaggal jelöltük, (ANOVA, p<0,05). A motoneuronokra és a piramis sejtekre jellemző görbék gyakorlatilag együtt futnak, az eltérést a Purkinje sejtek okozzák. A középértékek közepes hibái sok esetben az ábrázolhatósági határ alatt vannak a nagyszámú mérési pont miatt. A dendrit felszínek eloszlása jól közelíti a fogadott szinapszisok eloszlását (Antal és mtsai., 1992), azaz megállapítható, hogy a sejttesttől milyen százalékos távolság tartományban fogadják az egyes neuron típusok a legtöbb szinapszist. A MN-ok és a piramis sejtek dendritjei relatív skálán nagyon hasonló térbeli eloszlást mutatnak. A Purkinje sejtek azonban 10-ből 9 távolság tartományban különböznek (6. ábra).
15
5.3 A dendrit felszínek eloszlása az elektrotónikus térben A dendritek elektrotónikus térben való eloszlásának az összehasonlítását is elvégeztük, mind „steady-state”, mind pedig szinuszoid áram input esetében, melyeket homogén és inhomogén szóma-dendrit membrán mellett is megvizsgáltunk (7. és 8. ábra). Ezekben a vizsgálatokban a morfoelektrotónikus mátrixok oszlopösszegeit használtuk.
7.ábra A dendrit felszínek eloszlása az elektrotónikus térben steady-state áram input mellett A homogén szóma-dendrit membrán esetében (A) a dendritek felszín szerinti eloszlása nagyon hasonló mindhárom neuron típus esetében és csak a legtávolabbi dendritek felszín arányában mutatható ki szignifikáns különbség (csillagok, ANOVA, p<0,05). Inhomogén esetben (B) a dendrit felszínek eloszlásai különböző távolságokban veszik fel maximális értéküket, de az eloszlások alakilag hasonló unimodális eloszlások. A dendrit felszínek aránya inhomogén esetben 10-ből 9 távolságtartományban különbözik a három neuron típusban (ANOVA, p<0,05).
16
Homogén esetben (7/A ábra), amikor a szóma és a dendritek membránjának felületegységenkénti ellenállását azonosnak tételeztük fel, a három görbe gyakorlatilag együtt fut. Inhomogén esetben (7/B ábra), amikor a dendrit membrán felületegységenkénti ellenállását a sejttestéénél nagyobbnak feltételeztük, látható, hogy a három görbe, ugyan alakilag hasonló, de különböző elektrotónikus távolság tartományokban van a maximális értékük. Ötven Hz frekvenciájú szinuszoid input és homogén szóma-dendrit membrán esetén (8/A ábra) a különböző sejttípusok görbéi majdnem teljesen egybe esnek az elektrotónikus térben, vagyis a három neuron típus esetében nem volt kimutatható szignifikáns különbség a dendrit felszínek arányában. Inhomogén esetben (8/B ábra) ezzel szemben a dendrit felszínek eloszlás görbéi különböző távolság tartományokban veszik fel maximális értéküket, bár a homogén esettel megegyezően, alakilag hasonló unimodális eloszlások. Az inhomogén esetben a három sejttípusban 10-ből 5 távolságtartományban különbözik a dendrit felszínek aránya (ANOVA, p<0,05)
17
8.ábra A dendrit felszínek eloszlása az elektrotónikus térben szinuszoid áraminput mellett Homogén szóma-dendrit membrán esetén (A) a dendritek felszín szerinti eloszlása megegyezik mindhárom neuron típus esetében; azaz a dendritek felszín arányában nem mutatható ki szignifikáns különbség. Inhomogén esetben (B) a dendrit felszínek eloszlásai különböző távolságokban veszik fel maximális értéküket, és a dendrit felszínek aránya 10-ből 5 távolságtartományban különbözik.(csillagok ANOVA, p<0,05) 5.4 A dendrit felszínek eloszlása a temporális térben Végül a dendritek ingerületvezetésének morfotemporális aspektusát vizsgáltuk, a különböző dendritikus pontok geometriai távolsága és az ezen pontokból induló PSP-ok szómára való terjedéséhez szükséges idő (késési idő) összefüggéseit elemeztük. E vizsgálatokhoz a morfoelektrotónikus mátrixok analógiájára morfotemporális mátrixokat készíttettünk, melyek
18
oszlopösszegei most azon dendritek összfelszínét adják, ahonnan a PSP-ok azonos késési idővel jutnak el a szómára. Ha a három neuron típus dendrit felszíneinek eloszlásait a PSP-ok késési idejének függvényében hasonlítjuk össze, azt találjuk, hogy azok a homogén szóma-dendrit membrán esetében térnek el jobban és inhomogén membrán esetében kevésbé. Homogén esetben (9/A ábra) a tízből kilenc temporális távolságtartományban van eltérés (p<0,05 ANOVA) a dendrit felszínekben, míg az inhomogén esetben (9/B ábra) csak ötben.
9.ábra A dendrit felszínek eloszlása a temporális térben steady state áraminput mellett A dendritek felszín szerinti eloszlása homogén (A) és inhomogén (B) szóma-dendrit membrán esetén konstans áram input mellett. A dendrit felszínek eloszlásai különböző temporális távolságokban veszik fel maximális értéküket, de homogén esetben a görbék jobban, míg inhomogén esetben kevésbé különböznek egymástól a három neuron típus esetében. Azon
19
temporális távolságtartományokat, ahol a neuron típusok dendrit felszínei szignifikánsan különböznek (ANOVA, p<0,05) csillaggal jelöltük. 5.5 A dendritikus felszínek szómától mért távolságainak összehasonlítása A dendritek átlagos, szómától mért „path distance” távolságait is összehasonlítottuk a geometriai, valamint az absztrakt elektrotónikus és temporális térben. Elektrotónikus térben mind a konstans, mind pedig a szinuszoid input esetét megvizsgáltuk. A távolságokat a geometria térben mikrométerben, az elektrotónikus térben térkonstans egységekben, a temporális térben pedig milisecundumban mértük és azok maximális értékének százalékában ábrázoltuk. Minden átlagtávolságot a parciális dendrit felszínekkel súlyozva számoltunk. A geometriai térben a Purkinje sejtek dendritjeinek átlagos távolsága eltért mind a MN-ok mind a piramis sejtek dendritjeinek szómától mért távolságától, míg a MN-ok és a piramis sejtek ebből a szempontból megegyeznek (10. ábra). Az elektrotónikus térben, konstans és szinuszoid áraminput esetében is, a három neuron típus között csak inhomogén szóma-dendrit membrán esetében találtunk különbséget, homogén esetben nincs különbség (11. ábra). A temporális térben homogén és inhomogén membrán esetében is találtunk különbségeket (12. ábra).
10.ábra: A dendritikus felszínek szómától mért távolságainak összehasonlítása a geometriai térben A geometriai térben vizsgálva a Purkinje sejtek dendritjeinek átlagos távolsága eltért (csillag, Mann-Whitney teszt, p<0,05) mind a MN-ok, mind a piramis sejtek dendritjeinek szómától
20
mért távolságától, míg a MN-ok és a piramis sejtek ebből a szempontból megegyeznek (MannWhitney teszt, p>0,05)
11. ábra A dendritikus felszínek szómától mért átlagos távolságainak összehasonlítása az elektrotónikus térben Az elektrotónikus térben, konstans (A) és szinuszoid áram input (B) esetében is, a három neuron típus között csak inhomogén szóma-dendrit membrán esetében találtunk különbséget (csillagok, Mann-Whitney teszt, p<0,05). Homogén esetben nincs különbség a sejttípusok között.
21
12. ábra A dendritikus felszínek szómától mért átlagos távolságainak összehasonlítása temporális térben A temporális térben mind homogén, mind pedig inhomogén szóma-dendrit membrán esetében találtunk különbségeket, a sejttípusok között. (csillagok, Mann-Whitney teszt, p<0,05) 5.6 Klaszteranalízis A sejtek szétválasztásához a MFM-okból képzett kompozit távolság (hasonlósági) mátrixot (lásd Módszerek 4.4) és a klaszteranalízist használtuk. A klaszteranalízis bizonyította, hogy a MFM módszer képes szétválasztani a különböző típusú neuronokat, vagyis a módszer egy érzékeny
eszköz
az
idegsejtek
morfofunkcionális
összehasonlítására (13. ábra).
22
dendritikus
architektúrájának
13. ábra Kompozit dendrogram A klaszteranalízis során a különböző vizsgálatokból származó távolságmátrixok szummációja révén kapott összesítő (kompozit) távolságmátrix alapján kapott dendrogram. A dendrogramot elemzve látható, hogy az adott sejttípushoz tartozó sejtek egymáshoz sokkal hasonlóbbak, mint a többi sejttípus sejtjeihez. A sejttípusok között a motoneuronok és a piramis sejtek csoportja egymáshoz hasonlóbb, mint a Purkinje sejtek csoportjához.
23
6 Megbeszélés A számítástechnika fejlődése az eltelt 20 évben lehetővé tette, a sokkal bonyolultabb számításokat, köztük a sok lebegőpontos műveletet igénylő szimulációk gyors elvégzését, ami a morfológiailag nagy hűségű szegmentális kábelmodellek elterjedéséhez vezetett. A Zador és mtsai által 1995-ben publikált MET-t fejlesztettük tovább. Saját, érzékenyebb módszerünk, a dendriteket ún. morfofunkcionális mátrixokkal (MFM) írja le. A MET, nem alkalmas működő feszültségfüggő ioncsatornákkal (aktív membránnal) rendelkező sejtek grafikus vizsgálatára, mivel a transzformáció csak passzív membrán mellett végezhető el. Ezzel szemben a MFMok módszerével minden idegsejt leírható a dendriteken jelenlévő ioncsatornák mennyiségétől és minőségétől függetlenül, amennyiben az ioncsatornák sűrűségeloszlása és kinetikája ismert. Ez azért lehetséges, mert az MFM módszer használatának, a MET-tel szemben, nem feltétele a „log attenuation” és a „propagation delay” paraméterek additivitása. Jelen kezdeti vizsgálataink során ugyan még nem vizsgáltunk aktív membránokat, de ezek vizsgálata a jövőbeni kutatási tervek részét képezi. Az általunk használt passzív kábellmodell használata több okból is releváns. Az aktív csatornák pontos száma, típusa és elhelyezkedése a legtöbb neuron típus esetében nem ismert. Motoneuronokra vonatkozóan (Larkum és mtsai., 1996) azt találták, hogy a passzív membránmodellen kapott eredmények illeszthetőek a tényleges kísérleti adatokra, vagyis valószínűnek tűnik, hogy motoneuronok esetén, a piramis és Purkinje sejtekkel ellentétben, az ingerület döntően passzívan terjed a dendriteken. Több kutató is osztja azt a véleményt, hogy az aktív csatornáknak a dendritikus ingerületvezetésben játszott szerepének teljes megértéséhez ismernünk kell a passzív membrán viselkedését az adott geometriájú dendritfa esetében (Zador és mtsai., 1995, Carnevale és mtsai., 1997). A MFM segítségével, vizsgálni lehet az egyes neuronokat érintő, idegrendszeri megbetegedések morfofunkcionális hatásait, amennyiben ismerjük az egyes betegségek által okozott morfológiai és biofizikai változásokat. Ezen szimulációk segíthetnek a betegségek pathomechanizmusának jobb megértésében. Közeli tervink közt szerepel egészséges és mutáns; humán amiloid prekurzor fehérjét expresszáló egerekből származó piramis sejtek vizsgálta a MFM-ok segítségével.
24
8 Irodalomjegyzék Agmon-Snir H, Segev I. (1993) Signal Delay and Input Synchronization in Passive Dendritic Structures. J Neurophysiol 70(5) 2066-2085. Antal M, Kraftsik R, Szekely G, Vanderloos H. (1992) Synapses on Motoneuron Dendrites int he Brachial Section of the Frog Spinal-Cord-a Computer-Aided Electron-Microscopic Study of Cobalt-Filled Cells. J Neurocytol 21(1):34-49. Ascoli GA (2006) Mobilizing the base of neuroscience data: the case of neuronal morphologies. Nature Rev. Neurosci., 7:318-324. Birinyi A, Antal M, Wolf E, Szekely G. (1992) The Extent of the Dendritic Tree and the Number of Synapses in the Frog Motoneuron. Eur J Neurosci 4(11):1003-1012. Bui TV, Cushing S, Dewey D, Fyffe RE, Rose PK. (2003) Comparison of the Morphological and Electrotonic Properties of Renshaw Cells, Ia Inhibitory Interneurons, and Motoneurons int he Cat. J Neurophysiol 90(5):2900-2918. Carnevale NT, Tsai KY, Claiborne BJ, Brown TH. (1997) Comparative Electronic Analysis of Three Classes of Rat Hippocampal Neurons. J Neurophysiol 78(2):703-720. Dégenètais E, Thierry AM, Glowinski J, Gioanni Y. (2002) Electrophysiological Properties of Pyramidal Neurons in the Rat Prefrontal Cortex: An In Vivo Intracellular Recording Study Cereb. Cortex (2002) 12 (1): 1-16. Fleshman JW, Segev I, Burke RE. (1988) Electrotonic Architecture of Type-Identified AlphaMotoneurons int he Cat Spinal Cord. J Neurophysiol 60(1):60-85. Frank K, Fuortes MG. (1956) Stimulation of spinal motoneurons with intracellular electrodes. J Physol 134(2):451-470. Hammer O, Harper DAT, Ryan PD. (2001) PAST. Paleontological Statistics Software Package for Education and Data Analysis. Palaentological Electronica 4(1):1-9. Hartigan JA (1975) Clustering algorithms John A. Hartigan New York: Wiley
25
Hines ML, Carnevale NT. (1997) The NEURON Simulation Environment. Neural Comput 9(6):1179-1209. Hines ML, Carnevale NT. (2001) NEURON: A Tool for Neuroscientists. Neuroscientist 7(2):123-135. Iansek R, Redman SJ. (1973) The Amplitude, Time Course and Charge of Unitary Excitatory Post-Synaptic Potentials Evoked in Spinal Motoneuron Dendrites. J Physiol 234:665-688. Larkum ME, Rioult MG, Luscher HR. (1996) Propagation of Action Potentials in the Dendrites of Neurons from Rat Spinal Cord Slice Cultures. J Neurophysiol 75:154-170. Magherini PC, Precht W, Schwindt PC. (1976) Electrical-Properties of Frog Motoneurons in Insitu Spinal-Cord. J Neurophysiol 39(3):459-473. Rall, W. (1977) Handbook of Physiology, The Nervous System, Vol. 1, Cellular Biology of Neurons, Core Conductor Theory and Cable Properties of Neuron (3. fejezet), American Physiological Society, Bethesda Rapp M, Segev I, Yarom Y. (1994) Physiology, morphology and detailed passive models of guinea-pig cerebellar Purkinje cells. J Physiol 474(1):101-18. Rose PK, Vanner SJ. (1988) Differences in Somatic and Dendritic Specific Membrane Resistivity of Spinal Motoneurons: An Electrophysiological Study of Neck and Shoulder Motoneurons in the Cat. J Neurophysiol 60:149-166. Stelescu A, Sümegi J, Wéber I, Birinyi A, Wolf E. (2012) Somato-dendritic morphology and dendritic signal transfer properties differentiate between fore- and hindlimb innervating motoneurons in the frog Rana esculenta BMC Neuroscience 13:68. Urbán L, Oláh S, Birinyi A. (1987) Correlative physiological and morphological investigation of frog motoneurons: an intracellular study with cobalt-lysine. Neuroscience Suppl, 22. Yang CR, Seamans JK, Goreloval N. (1996) Electrophysiological and Morphological Properties of Layers V-VI Principal Pyramidal Cells in Rat Prefrontal Cortex In Vitro The Journal of Neuroscience 76(5):1904-1921.
26
Zador AM, Agmonsnir H, Segev I. (1995) The Morphoelectrotonic Transform: A Graphical Approach to Dendritic Function. Journal of Neuroscience 15(3):1669-1682.
27
