A mesenchymális őssejtek regeneratív és immunmoduláló hatása Kiss Judit ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Strukturális és funkcionális biológia Doktori Program
A Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Erdei Anna Programvezető: Prof. Dr. Sass Miklós Témavezető: Dr. habil. Uher Ferenc OGYK/OVSZ
1
Tartalomjegyzék
Rövidítések jegyzéke
4
1. Bevezetés (irodalmi háttér)
6
1.1 Regeneráció
6
1.2 Őssejtek
7
1.3 A mesenchymális őssejtek
11
A mesenchymális őssejtek eredete és előfordulása
12
A mesenchymális őssejtek izolálása és tenyésztése
12
MSCk és a regeneráció
15
Immunszuppresszió
18
1.4 A diabetes mellitus
25
2. Célkitűzések
28
3. Anyagok és módszerek
29
3.1 Betegminták
29
3.2 Emberi mesenchymális sejtek izolálása és tenyésztése
30
3.3 Kísérleti állatok
31
3.4 Az egér MSCk izolálása, tenyésztése
31
3.5 A galektin-1 fehérje hatásának vizsgálata a csontvelői sejtek mobilizációjára
33
3.6 Kombinált őssejtterápia vizsgálata cukorbeteg egér modell felhasználásával
36
3.7 Myelodysplasiás és myelomás betegek stromájának vizsgálata
38
3.8 Statisztikai elemzés
41
4. Eredmények
42
4.1 A galektin-1 fehérje gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálata
2
42
4.2 Az I-es típusú diabetes őssejtterápiája
54
4.3 Myelodysplasiás (MDS) és myeloma multiplexes (MM) betegek mesenchymális őssejtjeinek vizsgálata
64
5. Megbeszélés
69
6. Következtetések
78
7. Összefoglalás
80
7.1 Összefoglalás
80
7.2 Abstract
82
8. Irodalomjegyzék
83
9. Publikációk jegyzéke
99
10. Köszönetnyilvánítás
100
3
Rövidítések jegyzéke APC BDF1 egér BFU-E BSA CAFC Cy CFU-F CFUGEMM CFU-GM CsA DAB DAPI DBM DC DMEM EAE EDTA EGFP EMT ES sejt FACS FCS FISH FITC gal-1 G-CSF GVHD HBSS HGF HLA HPC HSPC-k HSC IBMX ICAM IDO IFN-α,γ
antigen presenting cell
burst forming unit erythroid bovine serum albumine cobblestone area forming cell cyclophosphamide colony forming unit - fibroblast CFU granulocyte, erythrocyte, macrophage, megakaryocyte CFU granulocyte and macrophage Cyclosporine A diaminobenzidine diamidino-phenylindole demineralized bone matrix dendritic cell Dulbecco’s modified Eagle’s medium experimental autoimmune encephalomyelitis ethylenediaminetetraacetic acid enchanced green fluorescent protein epithelial-mesenchymal transition/transformation embryonic stem cell fluorescence activated cell sorter fetal calf serum fluorescent in situ hibridisation fluorescein-isotiocyanate
antigén bemutató sejt (C57Bl/6 x DBA1)F1 keresztezésből származó egér erythroid kolóniát képző sejtek szarvasmarha szérumalbumin macskakő kolóniaképző sejt ciklofoszfamid fibroblaszt-szerű kolóniát képző sejt granulocyta-erythrocyta-makrofágmegakaryocyta kolóniaképző sejt granulocyta-makrofág kolóniaképző sejtek Ciklosporin-A diaminobenzidin diamino-fenilindol (fluoreszcens festék) demineralizált csontmátrix dendritikus sejt Dulbecco által módosított Eagle-féle médium kísérletes autoimmun encephalomyelitis (a sclerosis multiplex egérmodellje) etilén-diamin-tetraecetsav zöld fluoreszcens fehérje
epitheliális-mesenchymális transzformáció embrionális őssejt áramlási citométer borjú savó fluoreszcens in situ hibridizáció fluoreszcein-izotiocianát (fluoreszcens festék) galectin-1 galektin-1 granulocyte colony stimulating granulocyta kolóniastimuláló faktor factor graft versus host disease graft vs host betegség Hank’s balanced salt solution Hank-féle pufferelt sóoldat hepatocyte growth factor hepatocyta növekedési faktor human leukocyte atigen humán leukocita antigén haematopoetic precursor cell vérképző elődsejt haematopoetic stemand vérképző ős- és elődsejtek precursor cells haematopoetic stem cell vérképző őssejt isobuthyl-methyl-xanthine izobutil-metilxantin inter-cellular adhesion molecule intercelluláris sejtadhéziós molekula indolamine-2,3-dioxygenase indolamin-dioxigenáz interferon interferon
4
ILlin-/+ LTRA M-CSF
interleukine lineage markers long term repopulating ability
interleukin érett vérsejt markerek hosszútávú csontvelő repopulációs képesség colony-stimulating makrofág kolóniastimuláló faktor
macrophage factor MDS myelodysplastic syndrome MHC-I,II major histocompatibility antigen MM multiple myeloma MMP matrix metalloprotease MSC mesenchymal stem / stromal cell NK-sejt natural killer cell OVA ovalbumine PBS phosphate buffered saline PE phycoerythrine PI propidium-iodide PGE2 prostaglandin-E2 Sca-1 stem cell antigen-1 SDF-1 stromal derived factor-1 SSC standard saline citrate STRA short term repopulating ability STZ streptozotocine TBI total body irradiation TBS Tris buffered saline TGFβ trasforming growth factor-β Treg regulatory T-cell VCAM vascular cell adhesion molecule
5
myelodysplasiás szindróma fő hisztokompatibilitási antigén myeloma multiplex mátrix metalloproteáz mesenchymális őssejt / stroma sejt természetes ölősejt ovalbumin foszfáttal pufferelt sóoldat fluoreszcens festék propídium jodid (fluoreszcens festék) prosztaglandin-E2 őssejt-antigén-1 stroma eredetű faktor-1 standard citrátos sóoldat rövidtávú repopulációs képesség teljestest besugárzás Tris-szel pufferelt sóoldat transzformáló növekedési faktor-β regulátor T-sejt endothelre jellemző sejtkapcsoló molekula
1. Bevezetés (irodalmi háttér) 1.1 Regeneráció
Már az ókorban is foglalkoztatta az embereket a kérdés: miért van az, hogy bizonyos állatok könnyedén képesek regenerálódni súlyos sérülések után, míg az emberek öngyógyító képessége hozzájuk képest erősen korlátozott. A kérdésre ma is keressük a választ. Számtalan kutatócsoport foglalkozik hidrák, halak, kétéltűek, vagy éppen rágcsálók regenerációjának vizsgálatával. Bizonyos hidrafajok akár azt is képesek túlélni, hogy sejtjeikre bontják őket. A hozzánk jóval közelebb álló gerincesek között is akadnak olyanok, amelyek új uszonyt, lábat, farkat növesztenek az elvesztett végtagok helyére, pótolják a hiányzó szemlencsét. Rágcsálók is képesek arra, hogy több ujjpercüket, vagy éppen műtétileg eltávolított májlebenyeiket újranövesszék, míg más fajok nem, vagy csak igen kis mértékben tudják regenerálni elvesztett szöveteiket. Az irodalomban fellelhető információk alapján a regeneráció többféle mechanizmussal is történhet, az hogy ezek körül melyik dominál, függ az állatfajtól, életkortól, illetve a sérülés helyétől, mértékétől is. Néha a sérült szövet épen maradt, már differenciált sejtjei újra ciklusba lépnek és osztódnak, magukhoz hasonló sejteket hozva létre. Más esetekben ezek a sejtek először dedifferenciálódnak, és egy sarjszövetet alakítanak ki a sérülés helyén. A sarjszövet osztódik, növekszik, és végül a megfelelő irányokba differenciálódva pótolja a hiányzó sejttípusokat, amelyek az embrionális fejlődés lépéseihez hasonló módon újra elrendeződnek a kívánt mintázat szerint – létrehozva például egy teljesen új uszonyt, lábfejet vagy farkat az amputált régi végtag helyén. Ez a mechanizmus embereknél nagyon korlátozottan működik – bár körülbelül kétéves korunkig mi is képesek vagyunk regenerálni egyetlen ujjpercet megfelelő körülmények között. Hogy mi az oka ennek a különbségnek, az még felderítésre vár. A megfejtés óriási segítség lehetne az orvostudomány számára, azonban napjainkban elég távolinak tűnik. Egy további módja a regenerációnak az, amikor a pótlás őssejtek segítségével történik: a szervezetünkben erre a célra „tartalékolt”, addig nyugvó állapotban lévő sejtek osztódnak, ha szükséges, a sérülés helyére vándorolnak, és kijavítják azt. A regeneratív orvoslás napjainkban azt tűzte ki céljául, hogy ezeket az őssejteket felkutassa a szervezetünkben, és a gyógyítás szolgálatába állítsa, így segítve olyan betegeken, akiknek valamilyen baleset, betegség, vagy genetikai rendellenesség következtében szövet- vagy szervpótlásra volna szükségük.
6
1.2 Őssejtek
Őssejtnek nevezzük azokat a sejteket, amelyek önfenntartó osztódás(ok)ra, és – egyidejűleg –egy vagy több differenciálódott sejttípus létrehozására képesek. Szervezetünk kifejlődéséhez, állandó megújulásához, működésének fenntartásához nélkülözhetetlenek az őssejtek. Az egyedfejlődés során legelőször kialakuló korai embrionális őssejtek még totipotensek, vagyis a fejlődő embrió bármely szövete, vagy akár a magzatburkok is kialakulhatnak belőlük. A fejlődő embrió (blastocysta) belső sejttömegéből izolált embrionális őssejtek (ES sejtek) már csak pluripotensek, extraembrionális szöveteket nem képesek kialakítani. Felnőtt korban is szükség van szervezetünkben az elhasználódott sejtek pótlására, cseréjére, illetve a sérült, elhalt területek regenerációjára. – Ezt a feladatot az úgynevezett szöveti őssejtek látják el – ezek már nem differenciálódhatnak bármilyen irányba, de képesek a nekik otthont adó szövet jellemző sejttípusait kialakítani (azaz multipotensek), sőt, in vitro ill. in vivo kísérletek tanulsága szerint esetenként még plasztikusabbnak bizonyulhatnak, mint ahogy azt eredetileg gondoltuk. Szinte minden szövetünkben találhatunk szöveti őssejteket (ma nagyjából 20 félét tartunk számon), köztük például az agyban is, ami megcáfolja azt a korábbi dogmát, hogy felnőtt korban már egyáltalán nem keletkeznek új neuronok, ezért az idegrendszer károsodásai soha nem képesek regenerálódni.
Embrionális őssejtek Az embrionális őssejtek igen vonzó alternatívát jelenthetnének a regeneratív orvoslás számára: amellett, hogy in vitro körülmények között korlátlan számú osztódásra képesek, testünk bármely sejttípusát létrehozhatják (Gerecht-Nir és Itskovitz-Eldor, 2004) - azonban számos probléma is felmerült a gyakorlati felhasználásukkal kapcsolatban. Az első probléma etikai jellegű (Gerald és Ruth Fischbach, 2004): mivel minden egyes új humán embrionális őssejttenyészet létrehozása egy emberi embrió elpusztításával jár, ezért számos országban nem tartják megengedhetőnek az ilyen sejtvonalak létrehozását – még a mesterséges megtermékenyítési klinikákon feleslegessé
vált
szám
feletti,
amúgy
megsemmisítésre
kerülő
magzatok
felhasználásával sem - , illetve többhelyütt a már meglévő sejtvonalak fenntartása és a rajtuk való kísérletezés is tiltott. Emellett jelenleg nem megoldott az a kérdés, hogy a szövettenyészet összes sejtjét a kívánt irányba tudjuk differenciáltatni, vagy a differenciálatlan sejteket valamilyen módszerrel 100-%os hatékonysággal kiválogatni és
7
eltávolítani a tenyészetből, márpedig ha akár egyetlen differenciálatlan sejt is a kezelt páciens szervezetébe kerül, az szinte bizonyosan teratomaképződéssel jár – éppen az ES sejtek pluripotenciája miatt (Deb és Sarda, 2008). Mivel ES sejtek csak pár napos embrióból nyerhetők, és a rendelkezésre álló sejtvonalak száma igen korlátozott, ez még tovább nehezíti a recipienséhez minél hasonlóbb hisztokompatibilitási antigénekkel rendelkező őssejtek felkutatását, vagyis a kezelés után a betegnek élete végéig erős immunszuppresszív kezelést kellene kapnia, hogy az idegen szöveteket ne lökje ki az immunrendszere. (Gruen és Grabel, 2006). Erre a problémára megoldást jelenthetne a terápiás klónozás, vagyis az, hogy a beteg egy testi sejtjének magját egy enukleált ES sejtbe juttatva vele genetikailag tökéletesen megegyező ES sejtvonalat hozzanak létre – ez azonban ember esetében eddig még nem sikerült.
Szöveti őssejtek A szöveti őssejtek olyan, az egyedfejlődés során egészen felnőtt korunkig differenciálatlan állapotban maradó sejtek, melyeknek szerepe a szervezet megújulási képességének biztosítása: ők pótolják az elhasználódott, vagy valamilyen sérülés következtében elpusztult sejteket a nekik otthont adó szövetben. Ilyenek például a bőr legalsó rétegében, vagy a vékonybél bolyhainak tövében meghúzódó Lieberkühn kripták mélyén megtalálható őssejtek, amelyek folyamatosan pótolják a nagy igénybevételnek kitett, folyamatosan pusztuló felsőbb sejtrétegeket. A vérképző rendszer őssejtjei a haematopoieticus őssejtek (HSCk), amelyek életünk végéig biztosítják az összes vérsejt típus folyamatos utánpótlását – ezeket a sejteket használják bizonyos vérképzőszervi megbetegedések gyógyítására a legelsőként kifejlesztett, és azóta is rutinszerűen alkalmazott őssejtterápiás eljárás, a csontvelőátültetés során. Szintén megtalálhatjuk a csontvelőben a HSCk mellett a számukra nélkülözhetetlen csontvelői mikrokörnyezetet biztosító stroma őssejtjeit, az MSCket – mesenchymális őssejteket - is. Emellett ismerünk neurális őssejteket (Rietze és Reynolds, 2006), és izolálhatunk őssejteket például a retinából (Reh és Fischer, 2006), fogpulpából (Liu, Gronthos és Shi, 2006), veséből (Smith, Buffington és Humes, 2006), tüdőből (Liu, Driskell és Engelhardt, 2006) vagy a hasnyálmirigyből (Bonner-Weir, 2000) is. A szöveti őssejtek előnye az ES sejtekkel szemben, hogy felhasználásuk, vizsgálatuk nem vet fel etikai aggályokat, felnőtt korban is izolálhatók, tehát a lehetséges donorok száma jóval nagyobb, illetve bizonyos esetekben magától a betegtől is származhatnak az
8
őssejtek, valamint, mivel jóval differenciáltabbak az ES sejteknél, ezért belőlük nem fejlődik tumor a recipiensbe oltva.
A csontvelő őssejtjei Terápiás szempontból a szöveti őssejtek közül legígéretesebbnek talán az MSCk vizsgálata tűnik: ezek a sejtek könnyen izolálhatóak és tenyészthetőek- a csontvelő mellett számos más, könnyen hozzáférhető mesenchymális eredetű szövetből, például zsírszövetből (Zuk és mtsai, 2001) is kinyerhetők-, in vitro, illetve in vivo kísérletekben is meglepően plasztikusnak tűnnek. Az MSCkhez hasonlóan igen plasztikusnak bizonyulnak a HSCk is, melyek a vér sejtjei mellett endothel-, máj-, epithel- és izomsejtek létrehozására is képesek, és viszonylag könnyen hozzáférhetőek (Pittenger és mtsai, 1999)(Herzog, Chai és Krause, 2003)(Jiang és mtsai, 2002)(Anjos-Afonso, Siapati és Bonnet, 2004) (Leschner és Habener, 2003)(Tang és mtsai, 2004)(Oswald és mtsai, 2004)(Sanchez-Ramos, 2002). A recipiens besugarazása után – amellyel helyet biztosítunk a donor eredetű vérképző sejtek számára a nekik otthont adó csontvelőben hosszabb távon is fennmaradnak szervezetben, és képesek a sérült, károsodott szövetekbe vándorolni és segíteni azok regenerációját - így szintén alkalmasak lehetnek nem csak vérképzőszervi megbetegedések, hanem más szövetpótlást igénylő betegségek gyógyítására is (Forbes és mtsai, 2002)(Bianco és mtsai, 2001). Az őssejtek vizsgálatához azonban figyelembe kell venni azt is, hogy ezen sejtek működése mindig szoros kapcsolatban áll a környezetükkel. A szomszédos sejtek által biztosított speciális mikrokörnyezetből (niche-ből) érkező jelek: az adhéziós molekulák, extracelluláris mátrix komponensek, szolúbilis és sejtfelszínhez vagy a mátrixhoz kötött szignál molekulák hordozta információk integrálása után dől el az őssejt további sorsa (Moore és Lemischka, 2006). Osztódhat, vagy nyugalmi állapotban maradhat, ha osztódik, akkor szimmetrikus vagy aszimmetrikus osztódást is végezhet: az őssejtekre jellemző aszimmetrikus osztódás esetén a két utódsejt egyike őssejt marad, a másik pedig differenciálódik valamilyen érett sejttípussá, a szimmetrikus osztódások pedig vagy két őssejtet eredményeznek – ami szükség esetén az őssejt raktár növelését biztosíthatja - vagy pedig két differenciált sejtet, aminek eredménye a gyors sejtpótlás, de emellett az őssejt pool csökkenésével jár (Yin és Li, 2006). A legtöbbet vizsgált ilyen őssejt niche a csontvelőben található: a HSCk és MSCk egymással szoros kapcsolatban állnak, és csak együtt képesek biztosítani a megfelelő vérképzést. Az őssejtek in vivo nyomonkövetése általában nehézségekbe ütközik (ld. később az őssejt markerek
9
kérdését), azonban a legújabb kutatások alapján az MSCből származó mesenchymális sejttípusok közül legfontosabb szerepe a csontképző osteoblastoknak, és az erek külső felszínéhez kapcsolódó pericytákhoz hasonló sejteknek van a hamatopoiesis szabályozásában. Ezek a sejtek két különböző niche-t alakítanak ki a csontvelőben: az osteoblastok biztosította endosteális niche feladata a HSCk nyugvó állapotban tartása és az önfenntartó osztódások elősegítése, míg az erek körüli vaszkuláris niche-ben a HSCk gyorsabban osztódnak és differenciálódnak, majd az újonnan keletkezett sejtek szabályozottan a keringésbe jutnak (Yin és Li, 2006). A szervezet aktuális állapotától függ, hogy mennyi és milyen vérsejt képződik. Egészséges szervezetben az elöregedett, elpusztult alakos elemek folyamatosan kiszűrődnek a keringésből és lebomlanak, helyükre pedig folyamatosan újak lépnek. Szükség esetén (például stressz, DNS károsodás, szöveti sérülés, gyulladás) a szervezet nagyobb mennyiségben is képes új vérsejteket termelni, és azokat a keringésbe juttatni. Ilyenkor éretlenebb sejtek, progenitorok, illetve őssejtek is a perifériára jutnak – ez a mobilizáció jelensége. A keringő, vagy a szervezetbe kívülről beadott HSCk kemotaktikus faktorok segítségével képesek újra eljutni az otthonukul szolgáló csontvelőbe, és ott megtelepedni (homing). Nem csak a mobilizáció, a homing is előfordul tehát fiziológiás körülmények között: az őssejtek egy kis része folyamatosan cirkulál a csontvelő és a keringés között, illetve az embrionális fejlődés során, amikor a vérképzés helyszíne a szikzacskóból az embrionális májba, majd onnan a csontvelőbe tevődik át, szintén megfigyelhető a mobilizáció és a homing jelensége is (Lapidot és Petit, 2002). Mind a mobilizáció, mind a homing több lépésből álló, bonyolult folyamat, szabályozásukban pedig részt vesznek a vaszkuláris és endosteális niche sejtjei, illetve az erek belső borítását adó endothel sejtek is (Papayannopoulou, 2004). Nem csak az egészséges őssejtek rendelkeznek azonban ilyen segítő, szabályozó szerepű stroma állománnyal. Az ún. tumor őssejtek körül is megfigyelhető egy kötőszövetes eredetű niche. Kimutatták, hogy a szervezetbe kívülről bejuttatott MSCk ugyan valóban nem alakítanak ki daganatokat, ám a már meglévő tumoros sejtek közelébe vándorolva képesek a tumor stromájának kialakításában részt venni, ezután pedig elősegítik a daganat terjedését, növekedését, táplálják a kóros sejteket, és az immunrendszertől is képesek megvédelmezni őket (Djouad és mtsai, 2003)(Zhu és mtsai, 2006)(Hall és mtsai, 2007).
10
1.3 Mesenchymális őssejtek
A felnőttkori vérképzés helyszínén, a csontvelőben találjuk tehát a haematopoeticus sejtek mellett a működésükhöz nélkülözhetetlen mikrokörnyezetet biztosító, heterogén összetételű csontvelői stromaállományt. Azokat a multipotens szöveti őssejteket, amelyekből a stroma összes sejttípusa (csont-, porc-, zsírszövet és haematopoesist támogató stroma) kialakulhat, mesenchymális őssejtneknek (MSC) / stroma őssejteknek nevezik. Tulajdonképpen a korábban leírt őssejt definíció alapján az MSC-ket nem is tekinthetjük valódi őssejteknek, mivel nem képesek korlátlan számú önfenntartó osztódásra: az emberi MSC kultúra sejtjei kb. 40 osztódás után szeneszcenssé válnak, vagyis elöregszenek, és nem osztódnak többé, plaszticitásuk pedig már ez előtt lecsökken, – noha a sejtek tenyésztés után is megtartják normál karyotípusukat és telomeráz aktivitásuk sem csökken. Különböző körülmények között ez a szám változhat. Egér és patkány sejteknél eddig nem sikerült hasonló jelenséget (szeneszcenciát) megfigyelni (Javazon, Beggs és Flake, 2004)(Minguell, Erices és Conget, 2001). A mesenchymális őssejtek (MSC-k) csont, porc, zsír- és vérképzést támogató stroma sejteken kívül idegsejtekké, asztrocytákká, inzulintermelő bétasejtekké, szív- és harántcsíkolt izom-, ín-, máj-, vagy vesesejtekké alakulhatnak, sokszor a csíralemezek által alkotott korlátokat is átlépve
(Pittenger
és
mtsai,
1999)(Herzog
és
mtsai,
2002)(Jiang
és
mtsai,2002)(Anjos-Afonso és mtsai, 2004)(Leschner és Habener,2003)(Tang és mtsai, 2004)(Oswald és mtsai, 2004)(Sanchez-Ramos, 2002). In vitro kísérletekben a differenciálódás különböző természetes és mesterséges induktorokkal érhető el, míg in vivo elsősorban a sérült szövetek regenerációját figyelhetjük meg (Galamb és mtsai, 2003)(Forbes és mtsai, 2002)(Bianco és mtsai, 2001). Állatkísérletek, és néhány
esetben
klinikai
vizsgálatok
is
igazolják,
hogy
allo-
illetve
xenotranszplantáció esetén sem váltanak ki immunválaszt (hipoimmunogének) (Bartholomew és mtsai, 2002)(Mansilla és mtsai, 2005), valamint in vitro ill. in vivo is megfigyelhető immunszuppresszív hatással rendelkeznek, amely a klinikumban használt
immunszuppresszív
szerekével
összevethető
nagyságú.
Emiatt
laboratóriumunkban főleg a mesenchymális őssejtek vizsgálatával foglalkozunk, ezért a fejezet további részében részletesen szeretnék beszélni az MSCk plaszticitásáról,
immunológiai
tulajdonságairól,
illetve
lehetséges
felhasználásáról az irodalomban fellelhető eredmények áttekintésével.
11
terápiás
A mesenchymális őssejtek eredete és előfordulása A MSC-k forrása általában a csontvelő, de megtalálhatók kötőszövetekben, zsírszövetben,
testüregekben,
amnionfolyadékban,
köldökzsinórvérben,
magzati
szövetekben is (Javazon és mtsai, 2004)(Baksh és mtsai, 2004)(Anker és mtsai, 2003). Becsült gyakoriságuk a csontvelőben 1:105 - 1:106-ra tehető (Baksh és mtsai, 2004). In situ identitásuk pontosan nem ismert, bár vannak, akik a csont belső felszínét borító osteoblastok egy részével, valamint az erek felszínén megtalálható pericytákkal azonosítják őket (Yin és Li, 2006). Pontos eredetük kérdéses, lehetséges, hogy az embrió mesenchymális szöveteiből alakulnak ki (primer mesenchyma), tehát a szervezet úgymond „tartalékol” néhány őssejtet még a korai embrionális korból, nem kizárt azonban az sem, hogy az embrió fejlődése és tumorok progressziója során is előforduló epitheliális-mesenchymális transzformáció (EMT) (Prindull és Zipori, 2004) révén kialakuló szekunder mesenchymából származnak. A fő probléma az, hogy az őssejtek azonosítása egyetlen, vagy kis számú specifikus marker alapján, mint például sejtfelszíni fehérjék, génexpressziós mintázat vizsgálata, igen nehéz feladat. Sokak szerint nem is várhatunk ilyen „aláírás”-szerű mintázatokat, mivel az őssejteknek, a differenciált sejtekkel ellentétben nincs meghatározott funkciójuk, amelynek ellátásához egy adott génkészletre lenne szükségük, hanem csak a képességgel rendelkeznek, hogy többféle fenotípusú sejtet alakíthassanak majd ki. Ez megnyilvánulhat abban, hogy a sejt az elköteleződés, differenciálódás egy bizonyos fázisáig nem fejez ki szövetspecifikus géneket, vagy épp ellenkezőleg - több fejlődési sorra jellemző gént expresszál egyidejűleg kis mennyiségben (genetikai promiszkuitás) (Zipori, 2004).. A differenciálódás egy későbbi fázisában aztán a megfelelő sejtsor-specifikus gének expressziója növekszik, a többi sejttípusra jellemző gén kifejeződése pedig lecsökken, illetve gátlás alá kerül.
A mesenchymális őssejtek izolálása és tenyésztése Mindezek ellenére a mesenchymális őssejtek a gyakorlatban könnyen hozzáférhetőek, izolálhatóak, szövettenyészetben viszonylag egyszerűen fenntarthatók és szaporíthatóak, így hamar az érdeklődés középpontjába kerültek, mivel lehetséges terápiás alkalmazásuk során ez igen előnyös tulajdonság. A mesenchymális őssejteket a tenyésztőtálcához való kitapadás (adherencia) képessége jellemzi. Ezen tulajdonságuk segítségével könnyen izolálhatjuk őket, mivel a non-adherens haematopoietikus sejtek egyszerű mosással eltávolíthatók a kultúrából,
12
többszöri átoltás után pedig megfelelő tápfolyadék alkalmazása mellett az adherens vérsejtek (pl. monocyták) is eltűnnek a tenyészetből. A megmaradt sejtek a tenyésztőedény falához tapadva fibroblaszt-szerű morfológiával rendelkező sejtekből álló kolóniákat képeznek (CFU-F), amik fokozatosan zárt (konfluens) stroma réteggé alakulnak. Megfelelő körülmények – speciális összetételű tápoldatok jelenléte - esetén csont, porc, és/vagy zsírsejtekké differenciálódhatnak (Pittenger és mtsai, 1999). A stromatenyészetek
azonban
heterogének
mind
a
sejtek
morfológiája,
mind
differenciálódási képessége tekintetében. Egyetlen sejtből kialakított MSC kultúra esetén is igaz, hogy a sejteknek csak egy kis hányadát alkotják a multipotens mesenchymális őssejtek, míg jelentős részük csak 3, 2 vagy egy sejttípus kialakítására képes, érettebb elődsejt. A tenyészetben tehát az őssejtek az önfenntartó osztódás mellett spontán differenciálódnak is (Bianco és mtsai, 2001)(Javazon és mtsai, 2004)(Minguell és mtsai, 2001) (ld. 1. ábra).
13
A sejtek karakterizálásához leggyakrabban immuncitokémiai módszereket, és/vagy áramlási cytometriát alkalmaznak. Az MSC-k felszínén számos adhéziós molekula: CD44, CD49e, CD62, ICAM-1,2, VCAM-1, L-szelektin található. Kifejezik a simaizomban is előforduló α- aktint. Nem expresszálnak viszont sem vérsejt markereket - mint a pán-leukocyta marker CD45, vagy az ún. lineage markerek: CD3 (T-sejt), CD11b (monocyta), CD45R (B-sejt), TER-119 (vörösvérsejt), Gr-1 (granulocyta) - sem pedig az endothel sejtekre jellemző CD31 molekulát. MHC-I antigén molekulák vannak a felszínükön, de nem fejeznek ki MHC-II-t, CD40-et és CD40-L-ot, CD80-at vagy CD86-ot, ami összefüggésben állhat azzal, hogy nem váltanak ki immunválaszt, valamint képesek toleranciát indukálni. Tenyészetenként és fajonként (egér, patkány, ember) változó, hogy található-e a felszínükön CD90 (Thy-1), CD119 (c-kit), SH2 (CD105/endoglin), SH3, SH4 (CD73), Stro-1 vagy CD34. In vitro kultúrában a sejtfelszíni molekulák expressziója megváltozik, pl. egér MSC sejtek felszínén a sorozatos passzálások során egyre nő az Sca-1 mennyisége, ugyanakkor számos adhéziós molekuláé csökken, ami miatt a kultúrában tartott egér mesenchymális sejtek kísérleti állatba oltva nem, vagy alig képesek „visszatalálni” a csontvelőbe (homing) (Anjos-Afonzo, Siapati és Bonnet, 2004).
14
Mivel a mesenchymális őssejtekkel foglalkozó munkacsoportok különböző markereket tartanak fontosnak, és különböző további kritériumokat használtak a fent leírt eljárással kitenyésztett sejtek karekterizálásához, illetve mivel a különböző eredetű (csontvelőből, magzati szövetekből, zsírszövetből, stb), és/vagy különböző fajokból (pl. egér, patkány, ember) izolált MSC-nek tartott sejtek között különbségek figyelhetők meg a különféle markerek tekintetében, ezért 2006-ban egy nemzetközi konferencia keretében meghatározták, hogy ezután milyen feltételek mellett tekinthető egy sejttenyészet humán MSC tenyészetnek (Dominici és mtsai, 2006):
•
A sejtek adherensek;
•
CD105, CD73 és CD90 pozitívak, de nem hordoznak semmilyen, vérképző ősés elődsejtekre, illetve a különböző vérsejtfejlődési sorokra jellemző felszíni markert (azaz CD45, CD34, CD14, CD11b, CD79a és CD19 negatívak), és
•
csont-, porc- és zsírsejtekké egyaránt képesek differenciálódni in vitro.
Külön-külön tehát nem lehet egyetlen vagy néhány sejtfelszíni molekula segítségével biztonsággal meghatározni, vagy in situ megjelölni a mesenchymális őssejteket, azonban több markert egyszerre vizsgálva bizonyos molekulák jelenléte illetve hiánya már segítségünkre lehet az azonosításban, és emellett bizonyítanunk kell differenciációs képességüket is. MSCk és regeneráció Az, hogy a mesenchymális őssejtek képesek csont-, porc-, zsír- és vérképzést támogató stroma sejteket létrehozni, az ún. orthodox plaszticitás körébe tartozik, ami azt jelenti, hogy egy szöveti őssejtből az adott szövetre jellemző – hierarchikus fejlődési sorba tartozó – sejtek alakulnak ki. Ugyanakkor az elmúlt néhány évben számos munkacsoport közölt olyan meglepő eredményeket, amelyek már a nem-ortodox plaszticitás témakörébe tartoznak. Ezekben az esetekben az MSC-kből mind in vivo, mind in vitro körülmények között glia- és idegsejtek, izomrostok, szívizomsejtek, endothelium, vesesejtek, inzulintermelő β-sejtek jöttek létre (Herzog, Chai és Krause, 2003)(Tang és mtsai, 2004)(Oswald és mtsai, 2004)(Sanchez-Ramos, 2002)(Forbes és mtsai, 2002)(Bianco és mtsai, 2001)(Minguell, Erices és Conget, 2001)(Tessem és DeGregori, 2004). Itt tehát egy egészen új és szokatlan jelenségről van szó, amely ellentmond eddigi fejlődéstani ismereteinknek, miszerint a differenciálódás egy
15
irreverzibilis, előrehaladó lépésekből álló folyamat, amelynek során az egyes csíralemezekből eredő sejtfejlődési sorok között lehetetlen az átlépés. A
nem-ortodox
plaszticitás
létezése
alapvetően
megváltoztatja
a
differenciálódásról, plaszticitásról és szöveti regenerációról eddig kialakult képet. Kérdés azonban, hogy e folyamat miként megy végbe. A kutatók egy része a sejtek deés redifferenciációját, mások direkt transzdifferenciációt feltételeznek, néhányan pedig a sejtfúzió lehetőségét vetik fel, mint lehetséges mechanizmust, amelynek révén egy differenciált szövet más fenotípusú sejteket hozhat létre (Herzog, Chai és Krause, 2003)(Forbes és mtsai, 2002)(Rudnicki, 2003)(Alison és mtsai, 2003)(Pochampally és mtsai, 2004). Az sem kizárt azonban, hogy bizonyos kitüntetett szövetekben - vagy akár a szervezet valamennyi szövetében - olyan embrionális őssejtek maradnak fenn az egyedfejlődés során, amelyek megőrzik pluripotenciájukat, általában nyugvó állapotban vannak, de szükség esetén aktiválódva igen sokféle sejttípus létrehozására képesek (Javazon, Beggs és Flake, 2004)(Bianco és Robey, 2000). A vélemények megoszlanak azzal kapcsolatban is, hogy ezek a sejtek minden szövetben, vagy csak a szervezet bizonyos kitüntetett részein fordulnak-e elő, valamint hogy egy- vagy többféle ilyen őssejt található-e a felnőtt szervezetben? Azok, akik úgy gondolják, hogy a regenerálódásért felelős sejtek a csontvelőben találhatók, feltételezik, hogy ezek a károsodott szövetek által kibocsátott anyagok jelzése nyomán aktiválódnak és a vérkeringésbe kerülve jutnak el a sérülés helyére (kemotaxis), ahol megtelepedve a megfelelő sejttípusokká differenciálódnak (AnjosAfonso, Siapati és Bonnet, 2004). Ez a modell azt indikálná, hogy csontvelői sejteket juttatva a keringésbe – azaz csontvelő transzplantációval - számos degeneratív betegségben gyors javulás után teljes gyógyulást lehetne elérni. Fontos azonban megjegyezni, hogy a különböző in vitro ill. in vivo kísérletekben a differenciálódás, transzdifferenciálódás tényét legtöbbször nem igazolják meggyőzően, igen gyakran csak néhány jellemző fehérje vagy mRNS kimutatása történik meg, esetleg morfológiai megfigyelésekkel kiegészítve, azonban legtöbbször nem bizonyított, hogy valóban működőképes, és az adott szöveti környezetben ténylegesen „beépült”, szabályozottan funkcionáló sejtekről van szó, amelyek minden kétséget kizáróan a beadott őssejtekből származnak.
16
A mesenchymális őssejtek plaszticitásának terápiás felhasználása A regeneratív orvoslás célja a baleset vagy betegség következtében elpusztult sejtek és szövetek őssejtek segítségével történő pótlása. Az MSC-k – a bevezetésben vázolt sajátságaiknak (könnyű hozzáférhetőség, tenyészthetőség, és nagyfokú plaszticitás) köszönhetően - hamar felkeltették az e területen dolgozó kutatók és gyakorló orvosok figyelmét. Az MSC-k terápiás célú felhasználásával kapcsolatban - az embriókból izolálható ES sejtekkel ellentétben - nem merülnek fel erkölcsi kételyek, ráadásul, szemben a differenciálatlan állapotban lévő embrionális őssejtekkel, direkt módon nem okoznak tumort sem - habár bizonyítást nyert, hogy elősegíthetik a már meglévő daganatok fennmaradását, növekedését (Zhu és mtsai, 2006)(Hall és mtsai, 2007) - így igen nagy remények fűződnek olyan módszerek kidolgozásához, amelyek segítségével az MSC-ket különböző szöveti sérülések, genetikus eredetű betegségek gyógyítására használnák. Ilyen például az osteogenesis imperfecta (üvegcsontúság) – ebben a betegségben szenvedő gyermeknél sikerült átmeneti javulást, a csont alapállományának növekedését és a csonttörések gyakoriságának csökkenését elérni MSC-k adásával (Horowitz és mtsai, 2001). Kiderült, hogy a sejttenyészetben felszaporított és a szervezetbe intravénásan visszajuttatott MSC-k – a HSCktől eltérően - nem vándorolnak a csontvelőbe (minden csontvelő-transzplantált beteg és kísérleti állat stromája recipiens eredetű), hanem inkább szétszóródnak a különböző – elsősorban sok kapillárist tartalmazó – szövetekben. Tetemes részük például a tüdőben és a vesékben telepszik meg (Gao és mtsai, 2001)(Anjos-Afonso, Siapati és Bonnet, 2004). Ennek lehet egyszerű fizikai oka: a nagyméretű és könnyen összetapadó sejtek elakadnak a szűk kapillárisokban. Más feltételezések szerint azonban az MSC-k igazi „hazája” az erek falában található, ahol pericytákként funkcionálnak, és ezért vándorlásuk („homing”-juk) is ide irányul. Sérülés esetén viszont – kemotaktikus ingerek hatására - egy részük a sérült szervekbe, szövetekbe vándorol, ahol kulcsszerepet játszik az adott szövet, illetve szerv regenerációjában. Közvetlenül a sérülés helyére adva az őssejteket általában még jobb eredmények érhetők el (Chamberlain és mtsai, 2007).
Az MSC terápia klinikai kipróbálása A számtalan sikeres állatkísérlet után ma már folyik az „MSC terápia” klinikai kipróbálása is. Porc és csontsérülések gyógyításával (Caplan, 2005), szívinfarktuson
17
átesett betegek (Bunnell, 2005) (Zimmet és Hare, 2005) és stroke-osok (Bang, 2005) kezelésével próbálkoznak különböző munkacsoportok. Számos kísérlet végződött azonban olyan, nem várt eredménnyel, amelyekből arra következtethetünk, hogy a beadott sejtek nem jutottak el a megfelelő helyre, és/vagy nem a megfelelő sejttípusokká differenciálódtak, hanem pl. fibrózist, hegesedést okoztak, ami tovább súlyosbította a beteg állapotát (Anjos-Afonso, Siapati és Bonnet, 2004). Kísérletek folynak tehát abba az irányba is, hogy a betegtől nyert őssejtekből in vitro körülmények között a megfelelő irányba differenciáltatott sejtet vagy szövetdarabkát ültethessenek majd be a sérülés helyére. Más esetekben, noha a betegek állapotának meggyőző javulását írták le, azt mégsem sikerült igazolni, hogy az MSCk a megfelelő irányba differenciálódva pótolták a károsodott szöveteket, vagy egyáltalán eljutottak a sérülés helyére és ott tartósan fennmaradtak. Lehetséges, hogy ilyenkor a mesenchymális őssejtek inkább az általuk termelt szolúbilis faktorokkal segítik elő a szervezet endogén regenerációját (Caplan és Dennis, 2006), és/vagy a károsodott terület oxigénellátását javítják azáltal, hogy új erek képződését indukálják, esetleg valamilyen addig ismeretlen módon voltak képesek elősegíteni a gyógyulást.
Immunszuppresszió Részben az állatkísérletek, részben a klinikai kipróbálás során derült ki, hogy az MSC-k két további különleges sajátsággal is rendelkeznek: •
allogén (ugyanazon faj genetikailag eltérő másik egyede), sőt néha xenogén (másik faj egyede) recipiensbe oltva sem váltanak ki erőteljes, a sejtek kilökődésével
járó
immunválaszt
(Mansilla
és
mtsai,
2005),
azaz
hipoimmunogének; ráadásul •
kifejezett – in vitro és in vivo egyaránt megfigyelhető - immunszuppresszív hatásuk van. (Bartholomew és mtsai, 2002) (Uccelli, Moretti és Pistoia, 2006)
Egy beteg kezeléséhez tehát nincs szükség feltétlenül autológ őssejtekre, elvben bármely egészséges donor MSC-je felhasználható anélkül, hogy gyógyszerekkel gátolnánk a recipiens immunrendszerének működését. Számos, az immunrenszer kórosan fokozott aktivitására visszavezethető gyulladásos és autoimmun betegség kezelésében pedig éppen ezeket a sokszor súlyos mellékhatásokat okozó és igen drága immunszuppresszív gyógyszereket lehetne – reményünk szerint - mesenchymális sejtekkel helyettesíteni. Kérdés, hogy mennyire megalapozottak ezek az elképzelések? Valóban használhatunk-e allogén MSC-ket terápiás célra? Ha igen, akkor létre lehetne
18
hozni olyan „MSC bankokat”, amelyekből bármikor hozzájuthatunk lefagyasztott sejtekhez, amiket rövid tenyésztés után – HLA-tipizálás nélkül - beadhatunk a betegeknek. Nem lenne tehát szükség hosszadalmas és drága donorkeresésre akkor sem, ha valamiért nem juthatunk autológ sejtekhez, vagy ezek alkalmatlanok terápiás célra.
2.ábra A mesenchymális őssejtek immunszuppresszív hatásának feltételezett mechanizmusa További magyarázatot lásd a szövegben.
MSC-indukált immunszuppresszió in vitro Ma már kétségtelen, hogy a szövettenyészetben tartott MSC-k minden, az immunválaszban fontos szerepet betöltő sejt – T- és B-lymphocyta, NK-sejt, és hivatásos antigén bemutató sejt (APC) - funkcióját képesek gátolni in vitro (2. ábra). MSC-k jelenlétében az aktivált T-sejtek proliferációja csökken, függetlenül az aktiválódás módjától. A hatás MHC-független, autológ (saját) és allogén (más egyedből származó) MSC-k gyakorlatilag azonos mértékben gátolják az aktivált T-sejtek osztódását (Le Blanc és mtsai, 2003). Az MSC-k az 1-es típusú „helper” (az immunválaszt segítő) T-sejtek pusztulását (apoptózisát) is előidézhetik. Mivel a 2-es
19
típusú „helper” sejteket nem ölik meg, jelentősen megváltoztathatják a kétféle T-sejt szubpopuláció arányát (Ryan és mtsai, 2005). Az MSCk
képesek megbénítani a célsejtet. A gátolt T-sejtek nem képesek
osztódni és nem termelnek gyulladásos citokineket sem. (Ennek nagy jelentőséget tulajdonítanak a perifériás tolerancia kialakításában és fenntartásában) (Augello és mtsai, 2005). A T-sejt válasz szabályozásának egy egészen más szintjét érinti, hogy az MSC-k fokozzák az immunválaszt gátló, regulátor T-sejtek (Treg) osztódását (Maccario és mtsai, 2005)(Prevosto és mtsai, 2007). Az MSC-k Treg sejtekre gyakorolt hatása tehát éppen ellentétes a többi, az immunválaszt segítő (helper) és citoxikus T-sejtek esetében megfigyelt, a sejtek expanzióját gátló hatásukkal. Az MSCk részben szolúbilis faktorok segítségével, részben közvetlen sejt-sejt kapcsolaton keresztül fejtik ki hatásukat a Tsejtekre. A dendritikus sejtek (DC) a legfontosabb hivatásos antigén bemutató sejtek (APC), amelyek kulcsszerepet játszanak mind a saját, mind a nem-saját antigének elleni humorális és celluláris immunválasz szabályozásában. Érett állapotban elsősorban az immunválaszt elindító, éretlen vagy csak részben érett állapotban inkább gátló (tolerogén) szerepet látnak el a szervezetben. Utóbbi esetben az immunválaszt segítő (helper) és effektor (citotoxikus) T-sejtek válaszképtelenségét, illetve a Treg sejtek osztódását idézik elő. A mesenchymális őssejtek a DC-k differenciálódását, érését, és funkcióját egyaránt gátolják (Aggraval és Pittenger, 2005)(Ramasamy és mtsai, 2007). MSC-k jelenlétében a monocyták nem képesek dendritikus sejtekké alakulni (Jiang és mtsai, 2005). Felszínükön nem nő az MHC II-es antigének és a CD40, CD80, és CD86os kostimulátor molekulák expressziója. A gyulladásos citokinek – IL-12, IFN-γ, TNFα - termelése és szekréciója viszont csökken. Ugyanakkor a lymphoid-eredetű (vagy plasmacytoid) DC-k IL-10 termelése nő. Az eredmény az immunválaszt gátló, tolerogén DC-k kialakulása (Jiang és mtsai, 2005). Az MSC-k gátló hatását ebben az esetben is főként szolúbilis mediátorok közvetítik. Az MSC/tolerogén DC sejtkombináció további közvetett hatása, hogy olyan citokin mikrokörnyezetet hoz létre, amely megváltoztatja a segítő T-sejtek arányát az adott területen. Az 1-es típusú helper T-sejtek mennyisége jelentősen csökken, a 2-es típusúaké viszont nő. Ez a sejtes immunreakció(k) erejének csökkenésével és a humorális (ellenanyag-közvetített) immunválasz erősödésével jár.
20
Az
MSC-k
és
B
lymphocyták
közti
kölcsönhatás
funkcionális
következményeiről nagyon keveset tudunk. Corcione és mtsai (2006) szerint az MSC-k gátolják a poliklonálisan aktivált emberi B-sejtek osztódását és ellenanyag-termelő plazmasejtekké történő differenciálódását. Egyidejűleg több kemokin receptor expresszióját is csökkentik a B-sejteken, gátolva azok kemotaxisát. Rasmusson és mtsai (2007) szerint viszont a B-sejt aktiváció erősségétől függ, hogy az MSC-k gátolják, vagy éppen fokozzák az ellenanyag termelést in vitro kultúrában. Figyelembe véve, hogy in vivo a B-sejt fejlődés jó része a csontvelőben, az MSC eredetű stroma sejtek által kialakított mikrokörnyezetben történik, még sok izgalmas eredmény várható ezen a sajnálatosan elhanyagolt kutatási területen. A természetes ölősejtek (NK-sejtek) a vírus-fertőzött sejtek és a daganatsejtek legfőbb pusztítói a szervezetben. A mesenchymális őssejtek erősen gátolják a frissen szeparált NK-sejtek IL-2 és IL-15 indukált proliferációját, de a preaktivált NK-sejtek osztódását már alig lassítják. Magát a citotoxikus reakciót - ha például allogén célsejteket akarunk elpusztítani frissen szeparált NK-sejtek segítségével – az MSC-k nem befolyásolják. Ha viszont MSC-k jelenlétében 4-5 napig előaktiváljuk az NKsejteket IL-2-vel, akkor a célsejtek hozzáadása után már csökkent citotoxikus aktivitást tapasztalunk
(Spaggiari
és
mtsai,
2006).
A citotoxikus reakció
gátlásához
elengedhetetlen a közvetlen NK-sejt - MSC kölcsönhatás. Érdekes jelenség, hogy bár a frissen izolált NK-sejtek nem lizálják az MSC-ket, az IL-2-vel aktivált természetes ölősejtek mind az autológ, mind az allogén mesenchymális őssejteket képesek elpusztítani (Sotiropoulou és mtsai, 2006).
MSC-indukált immunszuppresszió in vivo Az in vitro kísérletek mellett számos állatmodellben - sőt néhány esetben már betegekben is - igazolták, hogy az MSC-k képesek gátolni mind a saját, mind a nemsaját antigének elleni, (auto- illetve alloantigén-specifikus) immunválaszt. Elsőként páviánokon figyelték meg, hogy MSC-k szisztémás adásával megnövelhető az allogén (hisztoinkompatibilis) bőrgraftok túlélése (Bartholomew és mtsai, 2002). Csontvelő transzplantáció során – furcsa módon - a recipiensből (vagy azzal genetikailag azonos egyedből) származó MSC-k képesek elősegíteni a szemiallogén és allogén graftok megtapadását és esetenként túlélését egerekben (Le Blanc és Ringden, 2006). Kísérletes autoimmun encephalomyelitisben (EAE), ami az emberi sclerosis multiplex egy egér modellje, az intravénásan bejuttatott MSC-k
21
elsősorban a másodlagos nyirokszervekben telepednek meg és – ha a betegség korai stádiumában adják őket - hatékonyan gátolják az autoreaktív T- és B-sejtek működését (Gerdoni és mtsai, 2007). Az állatok keringésében csökken a gyulladásos citokinek – TNF-α és IFN-γ - szintje. Az idegrendszerben kevésbé kifejezett a gyulladásos beszűrődés és a demyelinizáció. Az MSC-k az endotoxinnal kiváltott lokális és szisztémás gyulladást is gátolják egerekben (Xu és mtsai, 2007). Ha nagy mennyiségű endotoxinnal egy időben intravénásan mesenchymalis őssejteket is adunk az állatoknak, akkor tüdejükben nem alakul ki gyulladás, nem figyelhető meg sérülés vagy ödéma, keringésükben pedig csökken a gyulladásos citokinek mennyisége. A bleomycinnel indukált tüdő károsodás szintén megelőzhető MSC-k adásával (Rojas és mtsai, 2005). Az őssejtek megakadályozzák a gyulladás és a fibrózis kialakulását a bleomycinnel kezelt egerek tüdejében, és ezzel egyidejűleg csökkentik a szérum TNF-α és IL-1α szintjét. A legfrissebb adatok szerint megfelelő időben adott MSCk segítségével még a sepsis is leküzdhető (Németh és mtsai, 2009).
Teljesen ellentmondó eredmények
születtek viszont kollagén-indukált arthritisben szenvedő egerek vizsgálata során. Djouad és mtasi (2005) szerint sem a szisztémásan, sem a lokálisan (közvetlenül az ízületbe) adott MSC-k nem befolyásolják a betegség lefolyását, tehát az MSC kezelés arthritisben hatástalan. Ugyanakkor Augello és mtsai (2007) szerint allogén MSC-k egyszeri intraperitoneális adásával jelentősen csökkenthető a szérum TNF-α szintje az állatokban, sőt a csont- és porckárosodás(ok) kialakulása is megelőzhető. Mindezt az MSC kezelés hatására keletkező, antigén(kollagén II)-specifikus Treg sejtek hatásával magyarázzák. Mindenképpen további kiterjedt állatkísérletekre van tehát szükség ahhoz, hogy eldönthessük: •
mikor és milyen betegségek kezelésében van egyáltalán esélyünk az MSC-k sikeres alkalmazására; és
•
mi
lehet
az
MSC-k
immunszuppresszív
szervezetben?
22
hatásának
mechanizmusa
a
3. ábra A gal-1 fehérje szerkezete
Az MSCk immunmodulálásának egyik lehetséges eszköze: a galektin-1 fehérje A galektinek az állati lektinek egyre növekvő családjába tartoznak. A βgalaktozidokhoz való affinitás és a szénhidrát-felismerő domainjeikben bizonyos konzervált szekvencia-elemek jellemzik őket (Kilpatrick, 2002). A gal-1 a család legtöbbet tanulmányozott tagjai közé tartozik (3.ábra). Ez egy homodimér fehérje, amely két nem-kovalansen kötött alegységből tevődik össze, és tartalmaz egy 134 aminosavból álló szénhidrát-felismerő domaint. A gal-1 expressziót kimutatták a lymphoid szervekben, valamint más, olyan immunprivilegizált helyeken, mint a placenta és a cornea, ami valószínűsíti, hogy szerepe lehet az immuntolerancia kialakításában és fenntartásában (Rabinovich, 1999)(Illaregui és mtsai, 2005). In vitro, a gal-1 a sejtciklus leállását és apoptózist okoz aktivált T-sejtekben vagy T-sejt vonalakban (Perillo és mtsai, 1995)(Fajka-Boja és mtsai, 2002)(Matarrese és mtsai, 2005)(Ion és mtsai, 2005)(Ion és mtsai, 2006). A gal-1 in vivo funkciói azonban jelenleg nem egyértelműek, mivel a gal-1 kiütése nem okoz látható/kimutatható fenotípusos elváltozásokat, talán a család más tagjai képesek kompenzálni a hiányát (Poirier és Robertson, 1993). Másrészt viszont, rekombináns gal-1 beadásával megelőzhető az EAE kialakulása patkányokban (Offner és mtsai, 1990). Ha olyan fibroblastokat juttatnak
egerekbe,
amelyeket
genetikailag
23
módosítottak
úgy,
hogy
gal-1et
szekretáljanak, akkor azok meggátolják a kollagén-indulált arthritis kialakulását (Rabinovich és mtsai, 1999/2). Ezt a gyulladásgátló hatást szintén megfigyelték concavalin-A indukált hepatitisben (Santucci és mtsai, 2000), kísérletesen indukált colitisben (Santucci és mtsai, 2003), GVHDban (Baum és mtsai, 2003). Kimutatták továbbá azt is, hogy a gal-1 in vivo gátolja a polymorphonuclearis fehérvérsejtek kemotaxisát és transz-endotheliális migrációját (La és mtsai, 2003). A gal-1 expressziót a csontvelői MSCken is megfigyelték – szerepe lehet a csontvelői sejtek differenciálódásában is (Pannepucci és mtsai, 2004)(Kadri és mtsai, 2005). Labortóriumunkban leírtuk a gal-1-nek a csontvelői sejtekre gyakorolt kettős hatását: a különböző differenciációs állapotokban elősegítheti a növekedést, vagy apoptózist is indukálhat (Vas és mtsai, 2005).
Az MSCk immunmoduláló hatásának terápiás felhasználása 2004-ben Le Blanc és mtsai (2004) a „The Lancet” című folyóiratban számoltak be az első, az MSC-k in vivo gyulladásgátló és immunszuppresszív hatásán alapuló sikeres terápiás beavatkozásról. Egy 9 éves, akut lymphoid leukaemiája miatt allogén csontvelő-transzplantációval kezelt kisfiúban rendkívül súlyos (IV. stádiumú, a bőrt, az emésztőrendszert és a májat is érintő) gyógyszer rezisztens akut graft versus host betegség (GVHD) alakult ki. Ezt sikerült leküzdeni a gyermek édesanyjából (haploidentikus donor) származó MSC-k ismételt intravénás adásával. Azóta számos, a mesenchymális őssejteknek az akut és a krónikus GVHD megelőzésében és gyógyításában történő felhasználására irányuló, randomizált vizsgálat indult. Európában ezek nemzetközi összehangolását az EBMT (European Group for Blood and Marrow Transplantation) végzi. Közben az Egyesült Államokban az FDA (Food and Drug Administration) már engedélyt adott több „gyári” (Osiris Therapeutics, Inc.) MSC készítmény klinikai kipróbálására GVHD-ban (fázis II/III), Crohn-betegségben (fázis II) és rheumatoid arthritisben (fázis I/II). Az eddigi, korlátozott számú betegen végzett vizsgálat azt mutatja, hogy az MSC kezelésnek (legalábbis viszonylag rövidtávon) nincs káros mellékhatása, és a beavatkozás során érvényesül az őssejtek szövet-regenerációt elősegítő képessége is. Nem csak megállítják, vagy legalábbis lassítják a GVHD progresszióját, hanem fokozzák a betegség következtében károsodott szövetek, például a bélhám és a máj regenerációját is.
24
1.4 A diabetes mellitus A cukorbetegség (diabetes mellitus) a jóléti társadalmakban gyorsan terjedő betegség, amely szövődményeivel együtt évről évre több embert érint. Két alapvető típusa közül az első az I.-es típusú diabetes mellitus, amely általában fiatal korban kialakul, és a hasnyálmirigy inzulintermelő sejtjeinek autoimmun eredetű pusztulása okozza. Az immunrendszer a Langerhans szigetek β-sejtjeit idegenként felismerő és elpusztító Tsejtekkel folyamatosan támadja a hasnyálmirigyet, míg végül az inzulintermelés teljesen leáll (Homo-Delarche és Drexhage, 2004) (Narendran és mtsai, 2005), és az inzulin kívülről történő pótlása nélkül a betegek nem képesek életben maradni. A II.-es típusú diabetes mellitus gyakran, de nem minden esetben összefügg az elhízással. Időskori cukorbetegségnek is nevezik, de egyre gyakrabban fordul elő fiataloknál is. Ezt a típust inzulinrezisztencia jellemzi, vagyis a betegek szervezete eleinte normális mennyiségű inzulint termel, de az inzulin jelátviteli útvonal működési zavara miatt relatív inzulinhiány lép fel. Idővel az inzulinszekréció is csökken a betegség előrehaladtával, és a β-sejtek bizonyos hányadának pusztulása is jellemző lehet (Donath és Halban, 2005).
Terápiás lehetőségek
Konzervatív terápia A II.-es típusú diabetes enyhébb formáinál vércukorszint csökkentő gyógyszereket és diétát alkalmaznak, amelyet később szükséges lehet inzulinkezeléssel kiegészíteni. Az Ies típusú diabetesben szenvedők kezelése csak az 1920-as évek óta lehetséges, mivel ekkor sikerült először állati eredetű inzulint előállítani – korábban az inzulintermelés teljes leállása után a beteg minden esetben meghalt. Ma már módosított baktériumsejtek segítségével termeltetett rekombináns humán inzulinkészítmények állnak rendelkezésre, és az adagolás módszere is sokat fejlődött. A kezelési eljárás korszerűsödése ellenére a szénhidrát-anyagcsere szabályozása az inzulin kívülről történő pótlásával sosem lehet olyan pontos, mint amilyen egy jól működő szervezetben. Figyelembe kell venni emellett azt is, hogy a cukorbetegség hosszútávon kialakuló szövődményei – mint például a végtagok keringési elégtelensége, érzéskiesése, a csökkent vérellátású területek fekélyei, elhalása, a kis erek sérülése miatt kialakuló vakság, veseelégtelenség, a nagyobb erek károsodása, vagy a megnövekedett infarktus veszély - erősen rontják a cukorbetegek életminőségét, sőt akár halálos következményekkel is járhatnak. A fenti
25
okok miatt régóta próbálkoznak a diabetest nem tünetileg kezelni, hanem egy kuratív terápiás eljárást kifejleszteni. Transzplantáció Lehetséges például az endokrin hasnyálmirigy szigeteket egy halott donorból cukorbetegekbe átültetni (Merani és Shapiro, 2006). Ehhez azonban nem áll rendelkezésre elegendő donor (egyetlen beteg transzplantációjához 3-4 donor is szükséges
lehet),
a
szigetsejt-beültetésen
átesett
betegek
életük
végéig
immunszuppresszív kezelésre szorulnak a kilökődés megelőzése miatt (Nanji és Shapiro, 2004), ráadásul gyakran néhány év után az átültetett sejtek nem működnek többé, sőt akár teljesen fel is szívódhatnak (Ryan EA és mtsai, 2005). Őssejtterápia Diabetes esetében is felmerülhet az őssejtterápia alkalmazásának lehetősége (Jones és mtsai, 2008). Embrionális őssejteket in vitro körülmények között inzulintermelő sejtekké differenciáltatva elvileg pótolhatóak lennének az elpusztult β-sejtek – amennyiben terápiás klónozás segítségével állítják elő a kiindulásként használt ES sejteket, úgy tulajdonképpen autológ transzplantációról lehetne beszélni, vagyis immunszuppresszív kezelésre sem volna szükség. Ez a megoldás azonban jelenleg több ok miatt sem megvalósítható: ahogy azt korábban már említettük: számos országban törvény tiltja új embrionális őssejtvonalak létrehozását, valamint a recipienssel immunológiailag azonos ES sejtek létrehozásához szükséges terápiás klónozást is, amellyel az immunszuppresszív kezelés elkerülhető lenne. Emellett nem áll rendelkezésre olyan protokoll, amelynek segítségével az ES sejtek 100%-át a megfelelő irányba lehetne differenciáltatni, vagy a differenciálódott sejteket elválasztani azoktól, amelyek megőrizték őssejt tulajdonságaikat, így viszont elkerülhetetlen a tumorképződés (Deb és Sarda, 2008). Mindemellett olyan sejtekre volna szükség, amelyek a hasnyálmirigy β-sejtjeivel összehasonlítható mennyiségű inzulint képesek előállítani, és azt szabályozottan a vérbe üríteni, és lehetőség szerint tartósan fennmaradnak a recipiens szervezetében. Sajnos könnyen belátható az is, hogy az I.-es típusú diabetes autoimmun eredete miatt bármilyen módon pótoljuk is az inzulintermelő sejteket, a szervezet idővel azokat is el fogja pusztítani. A szöveti őssejtek felhasználása sokkal ígéretesebb megoldásnak tűnik. Szöveti őssejteket felnőtt korban is bárkitől nyerhetünk, így a beteg saját sejtjeit felhasználva
26
lehetőség van az autológ transzplantációra. Ilyen módon nem kell kilökődési reakcióra számítani, és etikai aggályok sem merülhetnek fel. Lehetséges volna például β-sejteket meglévő β-sejtekből, vagy a hasnyálmirigy feltételezett β-sejt prekurzoraiból előállítani – ezidáig azonban senkinek nem sikerült in vitro körülmények között β-sejteket felszaporítani, sem pedig felnőtt hasnyálmirigyből olyan „sziget-őssejtet” izolálni, amely képes szabályozottan, nagy mennyiségben inzulint kiválasztó sejteket létrehozni - ilyen őssejtet eddig csak a foetalis pancreasban mutattak ki (Zhang és mtsai, 2005). Állatkísérletekben sikerült kimutatni, hogy ha az endokrin pancreast pusztító immunreakciót leállítják, akkor a hasnyálmirigy önállóan képes a regenerációra (Sherry, 2006). Azt, hogy ilyenkor a β-sejtek osztódnak (Dor, 2006), vagy a hasnyálmirigyben, vagy esetleg a szervezet más részén található őssejtek pótolják a hiányzó szöveteket (Hao, 2006) (Bonner-Weir és Sharma, 2002), nem lehet pontosan tudni. Génsebészeti módszerekkel bizonyos májsejteket is sikerült inzulinszekrécióra bírni (Ferber és mtsai, 2000), (Zalzman és mtsai, 2003). Ezzel az eljárással a beteg saját májának egy részét felhasználva lehetne működőképes inzulintermelő sejteket létrehozni. Ezek a sejtek azonban megnövelhetik a tumor kialakulásának kockázatát, mivel a módosítások a telomeráz enzim génjét is érintik: az folyamatosan bekapcsolt állapotban marad . Egy újabb lehetőséget jelent a csontvelői őssejtek felhasználása. Számos állatkísétletben csontvelő-transzplantációval a cukorbetegség átmeneti vagy végleges gyógyulását sikerült elérni (Banerjee és mtsai, 2005),(Lee és mtsai, 2006), bár a csontvelői őssejtek kis száma és nehéz azonosítása miatt nem könnyű megfejteni, hogy mely őssejtek és hogyan járultak hozzá a gyógyuláshoz. Felmerült a transzdifferenciálódás (Ianus és mtsai, 2003), valamint a sejtfúzió lehetősége. Bizonyos esetekben a donor eredetű sejteken endothel markereket fedeztek fel, tehát ezekben az állatokban a csontvelői őssejtek új ereket hoztak létre, és vagy a keringés javításával (Hess és mtsai, 2003), vagy az általuk termelt szolúbilis faktorok segítségével (Li és mtsai, 2003) (Izumida és mtsai, 2005) fokozták a hasnyálmirigy endogén regenerációját Más kísérletekben maguk a differenciálatlan csontvelői sejtek válthatták ki ezt a hatást. Olyan vizsgálatok is folynak, ahol a csontvelői őssejteket előbb inzulintermelő sejtekké differenciáltatják in vitro, majd utána ültetik be őket (Tang és mtsai, 2004) (Chen és mtsai, 2004)(Oh és mtsai, 2004)(Moriscot és mtsai, 2005) – kérdés, hogy ezek a sejtek mennyi ideig maradnak életben és működnek a szervezetben.
27
2. Célkitűzések Munkánk során három nagyobb kérdést, illetve kérdéskört vizsgáltunk. Tisztázni szerettük volna, hogy:
1. Az MSC-k által is nagy mennyiségben termelt galektin-1 képes-e gátolni a vérképző
ős-
és
elődsejtek
ciklofoszfamiddal
és
G-CSF-el
indukált
mobilizációját? Ha igen, akkor ez elsősorban a limfoid, vagy - a gyulladási folyamatok szempontjából sokkal fontosabb myeloid – elődsejtek mobilizációját érinti-e? Mi az esetleges gátlás mechanizmusa, a sejtek kemotaktikus képessége, vagy inkább transzendotheliális migrációjuk csökken?
2. Kidolgozható-e egy olyan, viszonylag kíméletes előkezelést igénylő csontvelőtranszplantációs protokoll, amelynek segítségével meggyógyítható az STZ indukált diabetes? Friss csontvelővel, vagy in vitro kultúrában felszaporított mesenchymalis őssejtekkel, esetleg a kettővel együtt érdemes végezni a beavatkozást? Gyógyulás esetén a regenerálódott hasnyálmirigy szigetek új inzulin-termelő β-sejtjei donor, vagy recipiens eredetűek-e?
3. Elképzelhető-e, hogy egy érdekes, ismeretlen eredetű myeloproliferatív betegség, a myelodysplasia kialakulásában a vérképző sejtek mellett a mesenchymalis őssejtekből kialakuló, vérképzést támogató stroma is érintett? Vajon ugyanúgy osztódnak és differenciálódnak-e a betegek csontvelőjéből izolált MSC-k, mint az egészséges emberek stroma-képző őssejtejei?
28
3. Anyagok és módszerek 3.1 Betegminták A csontvelőminták 10 kezeletlen MDS-es betegtől (Varga Gergely, SE (ÁOK) III.sz. Belklinika), 15 myeloma multiplexes betegtől (Mikala Gábor, OGYK) és 15 egészséges donortól származtak. Az MDS-es betegeket klinikai és hematológiai adataik alapján a WHO útmutatása szerint (Vardiman és mtsai, 2002) soroltuk be a különböző altípusokba, az adatokatt az 1. táblázat foglalja össze. A donorok egyike sem kapott citotoxikus kezelést a mintavételt megelőző 3 hónapon belül. A kontroll csoport hematológiai betegségben nem szenvedő, főleg ortopédiai műtéten átesett, a betegekhez hasonló korcsoportba tartozó személyekből állt. Nem minden esetben végeztük el az összes kísérletet, az egy donortól nyerhető minta korlátozott mennyisége miatt.
fvs szám Beteg
kor
nem
WHO
citogenetika
hemoglobin
vérlemezke
(x10 /l)
(g/dl)
(x109/l)
9
besorolás MDS-1
71
férfi
RA
46, XY
5,2
13,0
114
MDS-2
80
férfi
RARS
49,XY,+8,+12,+13
6,6
5,8
127
MDS-3
90
férfi
RAEB II.
ND
1,6
9,4
26
MDS-5
84
nő
RA
46,XX, del 16q
9,5
7,7
355
MDS-7
68
nő
RA
43,XX,del5q, -8,-18,-20
2,9
8,2
191
MDS-11
78
férfi
RARS
43,XY,del5q,-14,-18,-20
4,0
8,4
40
MDS-12
51
férfi
RAEB I.
45,XY, -7
2,7
12,6
25
MDS-24
66
nő
RAEB I.
47, XX, +10
5,5
10,0
10
MDS-25
58
férfi
Post-MDS
46, XY
50,0
8,1
50
46, XY
1,4
9,0
80
AML MDS-26
68
férfi
RARS
1. táblázat A betegek klinikai és hematológiai jellemzése AML: akut myeloid leukémia, RA: refrakter anémia, RAEB: blaszt sejtes RA, RARS: RA ring szideroblasztokkal, WHO: World Health Organization
29
4.ábra Mesenchymális őssejt tenyészet létrehozása A csontvelő aspirátumból szeparált mononukleáris sejtekből primer kultúrát hoztunk létre. Az adherens sejteket sorozatosan átoltva vérképző elemektől mentes, fibroblaszt-szerű morfológiával rendelkező sejttenyészetet kapunk.
3.2 Emberi mesenchymális sejtek izolálása és tenyésztése
Az eljárást a 4. ábra foglalja össze. A csontvelőmintákat csípőprotézis műtéten átesett, egészséges
emberek
combfejéből,
valamint
myelodysplasiában
ill.
myeloma
multiplexben szenvedő betegek sternum biopsiáiból nyertük (etikai engedély száma: 12988-60/2003-1018EKU).
A
mononukleáris
sejtfrakciót
sűrűség
gradiens
(Lymphoprep, Nycomed Pharma, Oslo, Norvégia) centrifugálással izoláltuk. Ezen sejteket 10 % foetális borjúsavót (GIBCO, Grand Island, NY, USA) 50 U/ml penicillint és 50 µg/ml streptomicynt (GIBCO) tartalmazó tápfolyadékban reszuszpendáltuk, 25 cm2 alapterületű tenyésztőflaskákba (BD Falcon, Bedford, MA, USA) helyeztük, és 37oC-os, 5% CO2-t tartalmazó, párásított levegőjű termosztátban inkubáltunk. 24 óra múlva a nonadherens sejteket eltávolítottuk a kultúrákból, és folyékony nitrogénben
30
tároltuk a további felhasználásig. Az adherens sejtréteget alaposan megmostuk Hank’s pufferelt sóoldatban (HBSS) (GIBCO). Ezután komplett médiumba helyeztük őket, amelyet 3-4 naponta cseréltünk. Amikor a sejtek az edény alján összefüggő monolayert hoztak létre, és elérték a 80%-os konfluenciát, 0,25 % tripszin és 1 µM EDTA (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) segítségével felszedtük, és alacsony sejtszám mellett (1:3-1:5 arányban hígítva) továbboltottuk őket 175 cm2-es edényekbe (BD Falcon). A tenyészetek a harmadik átoltás után vérképző elemeket már nem tartalmaznak, így tiszta mesenchymális őssejt kultúrának tekinthetők. A kísérletek során 3-6x passzált sejteket használtunk fel MSC-ként. Az élő mononukleáris sejtek számát Türk oldat és tripánkék festék alkalmazása mellett Bürker kamrában határoztuk meg. Az MSC-k morfológiai vizsgálatát hetente elvégeztük inverz mikroszkóppal (Olympus CK3, Tokió, Japán), hogy megtudjuk, különböznek-e egymástól az MDS-es, MM-es, illetve az egészséges mesenchymális sejtek.
3.3 Kísérleti állatok
A 8-12 hetes hím és nőstény C57Bl/6, valamint (C57Bl x DBA/2)F1 (BDF1) egereket az Onkológiai Intézet állatházából vásároltuk. Az EGFP-t expresszáló transzgénikus B5/EGFP egértörzset (Hadjantonakis és mtsai, 1998) Nagy Andrástól (Mount Sinai Hospital, Toronto, Kanada) kaptuk, és CD1 háttérrel tartottuk fenn (Charles River Laboratories, Wilmington, MA). Kísérleti eljárásaink egyike sem sérti az etikai bizottság
állatkísérletekre
vonatkozó
egyezményét
(etikai
engedély
száma:
830/003/Főv/2006)
3.4 Az egér MSCk izolálása, tenyésztése Az egér MSC-k izolálását és tenyésztését néhány kisebb változtatástól eltekintve a Peister és mtsai (2004) által leírt módszer szerint végeztük. Röviden, a 8-10 hetes hím egerek combcsontjából és sípcsontjából komplett médiummal (CM) – amely DMEM/F12-t (Invitrogen, Carlsbad, CA), 10% FCS-t, 10% lósavót (Invitrogen), 50 U/ml penicillint, 50 µg/ml streptomycint (Sigma), és 2 mM L-glutamint tartalmaz, 5 U/ml heparinnal kiegészítve – kimostuk a csontvelőt. A sejteket ezután kétszer megmostuk HBSS-ben, egy 25 cm2-es flaskába (BD Falcon, Bedford, MA, USA) oltottuk 2-5 x 106 sejtsűrűséggel, komplett médiumban, majd párásított, 5% CO2 inkubátorban tartottuk őket 37oC-on 72 órán át. A non-adherens sejteket a médium
31
hetente kétszer történő cseréje közben eltávolítottuk a tenyészetből. Amikor a sejtréteg konfluenssé vált, PBS-sel lemostuk, majd 37oC-on 5 perc tripszines EDTA-s inkubálással felszedtük őket. Ezután a sejteket újra megmostuk, és egy 75 cm2-es flaskába (BD Falcon) oltottuk tovább. A további passzálásokat hasonlóképpen végeztük. A 6., 7. passzálásig a tenyészetekben még megtalálhatók voltak vérképző sejtek
(CD34+
és/vagy
granulocyta-makrofág
kolóniaképző
kísérleteinket 8-15x passzált egér MSCkkel végeztük.
32
sejtek)
is,
ezért
3.5 A galektin-1 fehérje hatásának vizsgálata a csontvelői sejtek mobilizációjára
a
b
5.ábra A kísérlet leírása A BDF-1 egerek az a, ábrán jelölt rendszer szerint CY és G-CSF kezelést kaptak. A gal-1 fehérjét a CY vagy G-CSF injekcióval együtt adtuk be i.p. vagy s.c. Az ötödik napon az állatokat feláldoztuk, és csontvelő, valamint vérmintát vettünk tőlük. A b, ábra a mobilizációs eljárás csontvelőre gyakorolt hatását szemlélteti.
33
Mobilizációs eljárás A 0. és 2. napon az egerek ~ 200 mg/tkg (állatonként 3-4 mg) cytoxant (CY) (BristolMeyers Squibb, Baar, Svájc) kaptak i.p., minden ezt követő napon pedig ~250 µg/kg (5 µg/egér) humán rekombináns G-CSF-et (Neupogen, F Hoffman-La Roche, Basel, Svájc) s.c. injekcióban. Az ötödik napon az állatokat feláldoztuk és csontvelő, valamint vérmintát vettünk tőlük. Az eljárást az 5. ábra szemlélteti.
Galektin-1 kezelés A humán rekombináns galektint a korábban már leírt módon állítottuk elő (Fajka-Boja és mtsai, 2002). Az in vivo kísérletekhez a gal-1-et 250 µM β-merkaptoetanolt (Sigma, St. Louis, USA) tartalmazó PBS-sel hígítottuk a kívánt koncentrációra, és az 5.ábrán látható módon alkalmaztuk.
A sejtek preparálása és festése A csontvelőt a combcsontokból fecskendővel kimostuk, és egysejt szuszpenziót készítettünk belőle. A vörösvérsejtek hipotóniás oldatban történő lízise után a magvas sejteket kétszer megmostuk a további felhasználás előtt. A fenotipizáláshoz a csontvelői sejteket PE-nel konjugált monoklonális anti-Sca-1-el, és egy sejtsor-specifikus biotinált ellenanyag panellel (anti-CD3ε a T-sejtek, anti- CD45R/B220 a B-sejtek, anti- CD11b a monocyták
és
makrofágok,
anti-Ly-6G
a
granulocyták
és
anti-TER-119
a
o
vörösvértestek jelölésére) festettük 30 percig 4 C-on. A sejtekhez kötődött első ellenanyagokat streptavidin-PE-nel mutattuk ki (Sigma). A festett sejteket PBS-sel megmostuk, áramlási cytométerrel (FACSCalibur) lemértük, és az eredményeket a Cell Quest szoftver segítségével (Becton-Dickinson, Mountain View, CA, USA) analizáltuk. A vérmintákat a szívből vettük, heparinnal (Sigma) vagy anélkül, a további felhasználástól függően (funkcionális vizsgálatok, ill. vérkenet). A vérkeneteket MayGrünwald-Giemsa oldattal festettük meg.
Őssejt átültetés A recipiens BDF1 egerek letális (9 Gy) besugárzást kaptak, majd a mobilizáción átesett állatoktól vett 50 ill. 100 µl vért a farokvénájukba oltva transzplantáltuk őket. A túlélést legalább 90 napig követtük.
34
Annexin V jelölés Az apoptózis során a sejtfelszínre kerülő foszfatidilszerin kimutatásához a magvas csontvelői sejteket kétszer megmostuk PBSben, majd reszuszpendáltuk a „kötő puffer”ben (0,01 M HEPES, 0,14 M NaCl, és 2,5 mM CaCl2). Az Annexin V-FITC (Sigma) és propídium jodid (10 µg/mL) (Sigma), ill. Annexin V-FITC és PE-jelölt anti-Sca-1 antitestekkel 15 percig inkubáltuk a sejteket szobahőmérsékleten. Mosás után a sejteket FACS-sal lemértük.
A kemotaxis és transzendotheliális migráció vizsgálata A kemotaxis és transzendotheliális migráció vizsgálatát 24 lyukú szövettenyésztő tálcákon (BD Falcon) végeztük, 12 mm átmérőjű, 3 µm-es pórusokkal ellátott Millicell plate-betétek (Millicell-PCF, Millipore Co., Cork, Írország) használatával (ld. 6. ábra). La és mtsai (2003) módszerét alkalmaztuk, néhány kisebb módosítással. Röviden, a transzendotheliális migrációs kísérleteknél KS-IMM sejtekből (egy Kaposi-szarkóma eredetű, CD31, CD34, vWF és cKit+ immortalizált endothel sejtvonal) inzertenként 100.000-et a 24 lyukú plate-ekre helyeztünk. 18 óra múlva a nonadherens sejteket eltávolítottuk, az adherens sejteket pedig további 2-3 napig tenyésztettük, hogy egy összefüggő endothel sejtréteg alakuljon ki. A kísérlet napján 106 frissen preparált magvas csontvelői sejtet helyeztünk a betét feletti részre 400 µl médiumban (DMEM + 10% FCS), galektin-1-el vagy anélkül, az alsó részbe pedig 600 µl 100 ng/ml rekombináns egér SDF-1-et (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) tartalmazó médium került. 4 - 6 óra 37 Co-on, 5% CO2 mellett történő inkubáció után az üres (kemotaxis) illetve endothel monolayerrel borított (transzmigráció) szűrőkön keresztül az alsó kamrákba átjutott sejteket megszámoltuk, megmostuk, és kolóniatesztet végeztünk rajtuk.
6.ábra. A kemotaxist és transzmigrációs kísérletet vizsgáló kísérlet elrendezése
35
3.6 Kombinált őssejtterápia vizsgálata cukorbeteg egér modell felhasználásával
A cukorbetegség indukciója, a vércukorszint mérés A 8-10 hetes nőstény C57Bl/6 egerek 5 egymást követő napon 5 mg/testsúly kg STZ-t (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) kaptak i.p.. Az STZ oldat pH-ját Na-citrát pufferrel 4,5-re állítottuk be, és az elkészítés után 15 percen belül felhasználtuk. A vércukorszintet heti két alkalommal mértük (Accu-Chek Active vércukorszintmérő, F. Hoffmann-La Roche, Basel, Svájc). Azokat az állatokat minősítettük cukorbetegnek, amelyeknek a vércukorszintje túllépte a 10 mM-t a 14. és 15. napon. A szérum inzulinszintet egy patkány/egér inzulinra specifikus ELISA kit segítségével határoztuk meg (Linco Research, St. Charles, MI).
Glükóz tolerancia teszt 4 óra éhezés után az egereknek i.p. injekcióban 2 g/ tkg glükózt adtunk be. A glükóz felszívódását a vércukorszint többszöri mérésével követtük.
Sejtszeparálás és a cukorbeteg egerek transzplantációja A szingén C57Bl/6 hím egerek comb- és sípcsontjaiból vett csontvelőt a farokvénába adott injekcióval transzplantáltuk szubletálisan (250 cGy) besugárzott diabéteszes nőstény recipiensekbe az STZ kezelés megkezdése utáni 15. napon. A C57Bl/6 vagy BDF1
hím
egerekből
származó
szingén
vagy
szemiallogén
MSC-ket
a
tenyésztőedényhez való adherenciájuk segítségével izoláltuk, és a beadás előtt legalább 8x új edénybe oltottuk át, hogy kizárjuk a vérképző sejtek fennmaradását a kultúrában. Az allogén MSCket CD1 hím egerekből nyertük. Az in vitro tenyésztett MSCket és a csontvelő graftot 0,2 ml szérummentes médiumban adtuk be.
Az antigén-specifikus T-sejtek osztódásának vizsgálata A T-sejt proliferáció vizsgálata Horowitz és mtsai (2002) módszere alapján történt, kisebb változtatásokkal. Röviden, az antigén-prezentáló sejteket (APC-ket) kezeletlen és STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egerek lépéből nyertük (az STZ kezelt egereknél a kezelés kezdete utáni 8. napon). A homogenizált lépből NH4Cl-os lizálással eltávolítottuk a vörösvértesteket. A maradék sejteket 10% FCS-t tartalmazó DMEM-ben reszuszpendáltuk 107 sejt/ml sejtsűrűséggel, és petricsészékben 4 órán át 37oC-on inkubáltuk. Ezután a non-adherens sejteket többszöri hideg PBS-es mosással
36
eltávolítottuk, az adherens sejteket pedig kaparással szedtük fel. Ezt az APCkben gazdag sejtpopulációt használat előtt 15 Gy-el besugaraztuk. A T-limfocitákat STZ kezelt állatok hasnyálmirigyéből, ill. OVA-t kapott állatok (állatonként 10 mg OVA plusz 1 mg Al(OH)3 i.p.) lépéből szeparáltuk. A szervekből proteázos emésztés nélkül, mechanikusan állítottunk elő egysejt szuszpenziót. A sejteket megmostuk, és a Tsejteket Pan T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Németország) segítségével izoláltuk. Az APCket (lyukanként 5 x 104 sejt) és a T-sejteket (lyukanként 2 x 105 sejt) 96 lyukú tálcákon (BD Falcon), szolúbilis antigének (hasnyálmirigy szövet extraktum, ill. OVA) jelenlétében vagy anélkül együtt inkubáltuk 37oC-on 72 órán keresztül. Tizennyolc órával az aratás előtt a sejtekhez 1 µCi tríciummal jelzett timidint adtunk, és a beépülést folyadékszcintillátorral mértük. A ciklosporin A-t (Sandimmun) a Sandoz-tól vásároltuk (Novartis Hungaria Kft, Budapest).
Hisztológia, immunhisztokémia A hasnyálmirigy-, máj- és tüdődarabokat 4 %-os, semleges pH-jú formalinban fixáltuk 3 órán keresztül, azután paraffinba ágyaztuk, és a metszeteket hematoxylin-eosin festéssel megfestettük. Az immunhisztokémiát a formalinnal fixált szövetekből készült 5 µm-es metszeteken végeztük el. A metszeteket viasztalanítottuk, rehidráltuk, és 5 percig hidrogénperoxid oldatban inkubáltuk, hogy az endogén peroxidázokat blokkoljuk. Ezután felvittük a metszetekre az egér monoklonális anti-inzulin antitestet (Sigma)(1:1000) és 15 percig hagytuk kötődni, majd a biotinált nyúl anti-egér IgG és sztreptavidin-peroxidáz konjugátum következett. A metszeteket DAB-bal hívtuk elő (DAKO Peroxidase Kit). Végül hematoxylines háttérfestést alkalmaztunk, és lefedtük a metszeteket.
Immunhisztokémia és Y kromoszóma specifikus in situ hibridizáció Hogy a hím donorokból származó esetleges inzulintermelő sejtek kimutassuk az STZ kezelt nőstény recipiensek szöveteiben, inzulin jelöléssel kombináltuk az Y kromoszómát kimutató in situ hibridizációs eljárást (Albera C és mtsai, 2005). A formalinnal fixált, paraffinba ágyazott metszeteket viasztalanítottuk, rehidráltuk, és Tris pufferelt zsírszegény tejporral (Sigma) 1 órán át blokkoltuk. TBS-es mosás után egér monoklonális anti-inzulin ellenanyagot (Sigma) tettünk a mintákra 1:1000 hígításban egy órára, ezután pedig nyúl anti-egér IgG-alkalikus foszfatáz antitestet (Sigma) 1:100 hígításban 1 órára. A foszfatáz aktivitást Fast Red festékkel mutattuk ki (Sigma).
37
Az Y koromoszóma kimutatásához FITC jelölt Y-kromoszóma specifikus próbát alkalmaztunk (StarFish 1189-YMF-01, Cambio, Cambridge, UK) a gyártó ajánlása szerint. A metszeteket desztillált vízzel mostuk, Na-tiocianáttal inkubáltuk 10 percig 80 o
C-on, majd 0,4 %-os pepszinnel emésztettük 0,1 M sósavat tartalmazó oldatban 10
percig. A metszeteket ezután 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk, dehidráltuk felszálló alkoholsorban, és hagytuk megszáradni. Egy csepp StarFish Y próbát vittünk fel a metszetekre, lefedtük őket, lezártuk gumicementtel, 60 fokon denaturáltuk 10 percig, majd egy éjszakán át 37 oC-on inkubáltuk. A fedőlemezek eltávolítása után a metszeteket formamid oldatban átöblítettük, majd 2xSSC-ben (standard citrátos sóoldat) vagy 1x SSC-ben is átmostuk 37oC-on 15 percig, ezután 0,05%-os Tween 20-at tartalmazó SSC-be tettük 37oC-ra, 10 percre, végül pedig PBSbe. Ezután DAPI háttérfestést alkalmaztunk, és Vectashield-del lefedtük (Vector Lab, Burlingame, CA). A reakció specificitását egészséges kontroll hím és nőstény egerekből készült metszetekkel vizsgáltuk. A metszeteket Olympus BX51 fluoreszcens mikroszkópban vizsgáltuk, és Fview II digitális fényképezőgéppel rögzítettük. A képeket 40x-es nagyítású 0,75 NA lencse mellett készítettük, és AnalySIS Pro szoftverrel dolgoztuk fel.
A csontvelői kimérizmus vizsgálata A csontvelői sejtek FISH analízisét a szokásos citogenetikai módszerekkel végeztük, beleértve a KCl-os inkubációt (37oC, 20 perc) és a fixálási lépéseket (ecetsav/metanol 1:3). A FISH-t a gyártó ajánlása szerint végeztük, rhodamin jelölt, teljes Y kromoszómára specifikus DNS próbával (Q BIOgene). A legjobb eredményt úgy értük el, hogy a próbakeveréket 73 oC-on 5 percig denaturáltuk. A poszthibridizációs mosási lépésekhez a formamidos mosási eljárást használtuk. Egy metszeten minimum 50 sejtmagot számoltunk le.
3.7 Myelodysplasiás és myelomás betegek stromájának vizsgálata
Kolóniatesztek A granulocyta-makrofág kolóniaképző sejtek (CFU-GM), az erythroid kolóniát képző sejtek (BFU-E), és a granulocyta-erythrocyta-makrofág-megakaryocyta kolóniaképző (CFU-GEMM) sejtek számát lágygél kultúrában vizsgáltuk. A nonadherens csontvelői sejteket Iscove-féle módosított Dulbecco médiumban végeztük, amelyhez 1%
38
metilcellulózt, 30% FCS-t, 10% v/v 5637 (ATCC, HTB-9) humán hólyagkarcinóma sejt-felülúszót, 5IU/ml erythropoetint, 4x10-3 M/l L-glutamint, 2,5 x 10-4 α-tioglicerolt, 1% ionmentesített BSA-t (Sigma) és antibiotikumokat adtunk. A sejteket 35 mm-es petricsészékbe (BD Falcon) helyeztük, és nedves 5% CO2 inkubátorban, 37oC-on tartottuk. A 9. és 14. napon az 50-nél több sejtből álló kolóniákat megszámoltuk.
7.ábra A vérképző ős- és elődsejtek korstruktúrájának meghatározása A CAFC (macskakő kultúra) a vérképző ős- és elődsejtek korstruktúrájának meghatározására alkalmas módszer. 96 lyukú tenyésztőtálcán stromasejtekből monolayert hoztunk létre, majd a vizsgálandó csontvelői sejteket limitáló hígítási sor szerint szétosztottuk a lyukakban. A vérképző sejtek által létrehozott ún. macskakő kolóniákat nem tartalmazó, negatív lyukakat hetenként leszámolva meghatározható a haematopoetikus ős- és elődsejtek (CAFC) gyakorisága az adott mintában. Az első 2 hétben az elkötelezett elődsejtek, ezután az átmeneti repopulációra (STRA), végül a tartós repopulációra képes (LTRA) őssejtek alakítanak ki kolóniákat.
39
Macskakő kultúra – a vérképzést támogató képesség vizsgálata A módszert a 7. ábra szemlélteti. Az egészséges, ill. MDS-es valamint MM-es MSCkből CAFC médiumban (α-módosított DMEM, 12,5% FCS, 12,5% lósavó, HEPES (3,5 mM), L-glutamin (2 mM), β-merkaptoetanol (10-4 M) (mind GIBCO termék), hidrokortizon 21-hemiszukcinát (10-6) és antibiotikumok) vérképzést támogató stromasejtréteget hoztunk létre. A konfluens stromarétegeket 15 Gy-el besugároztuk, hogy további növekedését megakadályozzuk. Mivel a macskakő kultúra egy limitált hígításos módszer, ezért a teszt sejteket (egészséges emberektől származó csontvelői sejteket) különböző hígításokban adtuk a stromasejtekhez. Minden hígításnál 24-36 párhuzamost alkalmaztunk. Az ún. macskakő kolóniákat (a stromaréteg alatt növekvő, fáziskontraszt mikroszkópban sötétnek mutatkozó sejtek csoportja) nem tartalmazó lyukakat hetente leszámolva képet kaphatunk a vérképző ős- és elődsejtek korstruktúrájáról a vizsgált mintában. A kokultúra időtartama alatt a sejteket 33oC-os CO2 termosztátban inkubáltuk – a csontvelőben feltételezett alacsony oxigéntenzió modellezése céljából - és minden héten fél médium cserét végeztünk. A legkorábban, már a 7. napon megjelenő macskakő kolóniákat a legjobban differenciálódott elődsejtek alakítják ki. Ezek a sejtek viszonylag nagy gyakorisággal fordulnak elő a csontvelőben, ezért az alacsony sejtszámú hígításoknál kapunk értékelhető eredményt (csak azok a hígítások értékelhetőek, ahol pozitív és negatív lyukakat is kapunk). Később képeznek kolóniákat az átmeneti repopulációra képes, kevésbé elkötelezett elődsejtek, és legkésőbb, csak az 5. héten mutatkoznak meg a hosszú távú repopulációra képes haematopoeticus őssejtek. A CAFC gyakoriságokat az L-Calc szoftver (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC, Kanada) segítségével számítottuk ki.
A plaszticitás vizsgálata: adipocyta és osteocyta irányba történő differenciáltatás A csont- és zsírsejt irányú differenciálódás vizsgálatához a tápfolyadékokat Pittenger és mtsai (1999) módszere alapján állítottuk össze. Zsírsejtképződés indukálásához 10% foetális borjúsavót, 10-7 M dexamethazont és 0,5 mM izobutil-metil-xantint (IBMX) (Sigma) tartalmazó DMEM médiumot használtunk. Heti kétszeri médiumcserével 37oCos CO2 termosztátban inkubálva a sejteket, 2-3 hét alatt többségük zsírcseppeket halmozott fel, melyek gyakran az egész citoplazmát kitöltötték. A sejtek vizsgálata olajvörös (Oil red O) (Sigma) festéssel történt.
40
Az osteogén médium 10% FCS-t, 10-8 M hidrokortizont, 10 mM βglicerofoszfátot és 50 mg/ml aszkorbinsavat (Sigma) tartalmazó DMEM médiumból állt, melynek hatására 2-3 hét alatt a sejtek kalciumot is tartalmazó extracelluláris mátrixot kezdtek termelni. A differenciációt alizarinvörös (Alizarin Red S) (Sigma) festék segítségével vizsgáltuk.
Adipogén médium
Osteogén médium
DMEM
DMEM
10% FCS
10% FCS
10-7 M dexamethazon
10-8 M hydrokortizon
0,5 mm IBMX
10 mM β-glicerofoszfát
(izo-butil-metil-xantin)
50 mg/ml aszkorbinsav (vagy DBM)
o
2-3 hét 37 C-on
2-3 hét 37oC-on
3.8 Statisztikai elemzés A statisztikai analízist a Student-féle t-próbával végeztük. 0,05-nél kisebb p értéket tekintettünk szignifikánsnak.
41
4. Eredmények 4.1 A gal-1 fehérje gyulladáscsökkentő hatásának vizsgálata
Mivel súlyos gyulladás esetén a haematopoetikus ős-és elődsejtek (HSPC-k) erőteljes mobilizációja figyelhető meg, megvizsgáltuk, hogy az MSC-k által nagy mennyiségben termelt, ismert immunszuppresszív és gyulladásellenes hatással rendelkező gal-1 fehérje befolyásolja-e az immunválaszt a csontvelői sejt-mobilizáció szintjén. A mobilizációs kísérletekhez egér modellrendszert használtunk. Az állatokat a klinikumban is alkalmazott Cy/GCSF kezelésnek vetettük alá. Ennek során a ciklofoszfamid (Cy) nevű citosztatikum által részben kipusztított csontvelő életben maradt őssejtjei a granulocyta kolónia-stimuláló faktor (G-CSF) támogatása mellett gyors osztódásokkal és differenciációval regenerálják a károsodott vérképző rendszert (Morrison, Wright és Weissman, 1997). A keletkező érett sejtek, valamint a normálisnál nagyobb mennyiségben jelenlévő ős- és elődsejtek az érfalakon átlépve a csontvelőből a keringésbe jutnak. A kísérletek során rekombináns technikával előállított gal-1 fehérjét használtunk a gal-1 mobilizációra gyakorolt hatásának vizsgálatához.
A gal-1 gátolja az elkötelezett vérképző elődsejtek mobilizációját A gal-1 kezelés HSPC-k mobilizációjára kifejtett hatásának vizsgálatához először meghatároztuk az össz fehérvérsejtszámot és a CFU-GM gyakoriságot a mobilizációs protokollon átesett egerek vér- és csontvelőmintáiban (8. ábra). Az állatok vérében a Cy/G-CSF kezelés hatására a CFU-GM gyakoriság kb. 40x-esére nőtt a kezelés megkezdését követő 5. napon (a), ami az össz fehérvérsejtszám 3x-os növekedését eredményezte (b). A gal-1 és Cy/G-CSF együttes alkalmazása nagymértékben csökkentette a progenitor sejtek migrációját a csontvelőből a perifériára (a,b). A gal-1 mediált gátlás nem volt teljes (kb. 85%), mivel a gátló hatással egyidejűleg a gal-1 önmagában kis, de szignifikáns mértékű fehérvérsejt mobilizációt is okozott. A csontvelőben a CFU-GM gyakoriság több mint 2x-esére emelkedett a Cy/G-CSF kezelés hatására, melyet a gal-1 egyidejű adása jórészt meggátolt (c). Ezzel ellentétben az összes magvas sejtek száma csökkent a csontvelőben a Cy/G-CSF kezelés eredményeként, és a gal-1 ezt nem befolyásolta szignifikáns mértékben (d). Meg kell jegyezni, hogy noha a CFU-GM gyakoriság kétségtelenül csökkent a csontvelőben,
42
amikor a mobilizáló kezeléssel egyidejűleg gal-1-et is adtunk, azonban - ha magvas sejtek számának egyidejű változását is figyelembe vesszük - a progenitor sejtek össz mennyisége valójában nem változott szignifikánsan egy-egy combcsontban. A csontvelői sejt mobilizáció gátlása tehát valószínűleg nem a gal-1 citotoxicitásának következménye. Ezt igazolta az is, amikor a különböző kísérleti csoportokba tartozó, valamint kezeletlen kontroll állatok csontvelő- mintáiban áramlási citometria (PI vs. Annexin V, ill. Sca-1 vs. Annexin V festés) segítségével vizsgáltuk a pusztuló sejtek arányát. A gal-1 sem a teljes magvas csontvelői sejtpopulációban (9/a. ábra), sem az Sca-1+, jórészt vérképző ős- és progenitorsejtek között (9/b. ábra) nem okozott apoptózist vagy nekrózist.
43
CFU-GM
ÖSSZ FEHÉRVÉRSEJTSZÁM
VÉR
CSONTVELŐ
8. ábra A Gal-1 hatása a granulocyta/makrofág kolóniaképző sejtek mobilizációjára.
A fiziológiás sóoldattal (kontroll), Cy/GCSF-el, Cy/GCSF + Gal-1-gyel, illetve csak galektin-1-gyel kezelt egerek vérében (A, B) illetve csontvelejében (C,D) meghatároztuk az össz fehérvérsejt számot és a CFU-GM gyakoriságot. A Gal-1 és Cy/G-CSF együttes alkalmazása nagymértékben csökkentette a progenitor sejtek migrációját a csontvelőből a perifériára. A gal-1 önmagában kis, de szignifikáns mértékű mobilizációt okozott. Az eredményeket és a szórást (+/- SD) 7 független kísétlet átlagából számoltuk ki. A statisztikailag szignifikáns különbségeket csillaggal jelöltük. (* p<0,05; ** p<0,001). Fvs: fehérvérsejt CFU-GM: lágygél kultúrában kolóniát képző, granulocyta és makrofág sejtfejlődési sor irányába elkötelezett vérképző elődsejtek Cy: ciklofoszfamid G-CSF: granulocyta kolónia stimuláló faktor
44
9.ábra A gal-1 citotoxicitásának vizsgálata Az apoptotikus csontvelői (A) és Sca-1+ (B) sejtek számát annexin V jelöléssel vizsgáltuk. Az ábrán egy tipikus kísérlet eredményét mutatjuk be. A gal-1 kezelés nem okozza sem a csontvelői őssejtek, sem ezek Sca-1+ alpopulációjának apoptózisát jelen kísérlet/vizsgálat körülményei között (Az egyszerre PI+/Annexin V+ ill. Sca-1+/Annexin V+ sejtek azok, amelyek apoptózis jeleit mutatják)
A gal-1 kezelés hatása a fehérvérsejt szubpopulációk megoszlására a vérben és a csontvelőben a mobilizáció alatt Az össz fehérvérsejtszám szignifikánsan megemelkedett a mobilizált állatok keringésében a kezeletlen kontrollcsoporthoz képest, és ezzel egyidejűleg a különböző sejttípusok aránya is jelentősen eltolódott. Ahogy az a 2. táblázatban látható, a granulocyták és monocyták aránya megnőtt (22%-ról 33%-ra és 1,2%-ról 19%-ra) a limfociták „rovására”, melyeknek aránya 78%-ról 48%-ra csökkent a mobilizáció 5. napján.
Ez
arra
utal,
granulocyta/monocyta
hogy
populációt
a
csontvelői
érintette,
sejtek
vagyis
mobilizációja
perifériás
főleg
granulofíliát
a és
monocytózist okozott. A gal-1 a mobilizáló ágensekkel együtt alkalmazva meggátolta a granulofília kialakulását, és részben megakadályozta a monocytózist is. A csontvelői sejtpopulációk vizsgálatából kiderült, hogy a fiatal (Sca-1+) és a granulocyta/makrofág
45
irányba elkötelezett (Gr-1+ és CD11b+) elődsejtek száma megemelkedett a mobilizáció 5. napjára, ami intenzív csontvelői regenerációra utal. Gal-1 egyidejű adása a magvas sejtek számának még erőteljesebb emelkedését okozta a Cy/G-CSF kezelés egyedüli alkalmazásához képest. (11,7% vs. 30,8% az Sca1+ sejteknél, 54,8% vs. 73,9% a Gr-1+aknál és 55,1% vs.30,8% a CD11b+ sejteknél). A progenitor- és/vagy recirkuláló Bsejtek (B220+) aránya csökkent a mobilizált csontvelőben, és a gal-1 ezt nem befolyásolta, ami alátámasztja azt, hogy a gal-1 csontvelői sejt-mobilizációt gátló hatása főleg a fiatal vérképző sejtekre, valamint a granulocytákra és monocytákra korlátozódik. Érdekes módon a gal-1 önmagában adva szignifikánsan csökkentette a B-sejt progenitorok és/vagy recirkuláló B-sejtek gyakoriságát a kezeletlen kontrollhoz képest (27,6% ± 1,8% a kontroll 19,9 ± 2,1% a gal-kezelt egerek csontvelejében (2. táblázat)
46
47,6 ± 5,3*
65,4 ± 5,9*
79,8 ± 5,7
Cy/G-CSF
Cy/G-CSF + Gal-1
Gal-1
19,1 ± 1,8
23,2 ± 1,3
33,1 ± 4,3*
22,1 ± 1,3
1,1 ± 0,1
11,4 ± 1,4*
19,3 ± 1,5*
1,2 ± 0,2
5,5 ± 0,7
30,8 ± 2,9*
11,7 ± 1,1*
6,9 ± 0,5
1,9 ± 0,3
1,6 ± 0,5
1,9 ± 0,2
1,8 ± 0,2
19,9 ± 2,1*
5,9 ± 0,4*
5,8 ± 0,6*
27,6 ± 1,8
B220
9,6 ± 1,1
15,1 ± 1,1*
16,2 ± 0,9*
10,7 ± 0,8
Ter-119
52,7 ± 3,2
73,9 ± 5,4*
54,8 ± 3,7*
51,1 ± 2,9
Gr-1
51,6 ± 2,8
70,1 ± 3,9*
55,1 ± 4,5*
49,9 ± 4,4
CD11b
47
vörösvérsejtek, a Gr-1 a granulocyták, a CD11b pedig a monocyták, makrofágok jellemző markere.
expresszióját áramlási citometriával határoztuk meg. Az Sca-1 a korai vérképző sejtek, a CD3 a T limfociták, a B220 a B limfociták, a Ter-119 a
Grünwald-Giemsa eljárással megfestett vérkeneteken a sejtszámokat fénymikroszkópban, a csontvelő esetében a sejtfejlődési sorokra jellemző markerek
szórást három független kísérlet átlagából számoltuk. A csillaggal (*) jelölt eredmények szignifikánsan eltérnek a kontroll értékektől (p<0,05). A May-
A gal-1 csontvelői sejt mobilizációt gátló hatása főleg a fiatal vérképző ős- és elődsejtekre, granulocytákra és monocytákra korlátozódik. Az adatokat és a
2.táblázat A különböző fehérvérsejt szubpopulációk megoszlása a vérben és a csontvelőben
76,7 ± 4,5
CD3
Sca-1
Monocyta
Limfocyta
Granulocyta
Magvas csontvelői sejtek (% pozitív)
Fehérvérsejtek %os aránya a vérben
Kontroll (sóoldat)
.
A gátlás létrejöttéhez a gal-1 fehérje jelenléte a mobilizáció második szakaszában nélkülözhetetlen A következő lépésben megvizsgáltuk, hogy a gal-1 jelenléte a mobilizáció teljes ideje alatt szükséges-e a gátlás kialakulásához? Ahogy ez a 10. ábrán megfigyelhető, a hatást nem befolyásolta szignifikánsan, ha a gal-1 adása elmaradt a mobilizáció első két napján. Ha a gal-1 et a 3. naptól kezdve kapták az állatok, az még mindig nagymértékben csökkentette a csontvelői mobilizációt. A lektin jelenléte ezen a napon feltétlenül szükséges volt, elhagyásával ugyanis egyáltalán nem figyelhető meg gátló hatás. Ha az utolsó nap kivételével mindig adtunk galektint, akkor a gátlás 50%-ra csökkent, ami azt jelenti, hogy a gal-1 jelenléte ezen a napon is szükséges a teljes hatás kialakulásához. Az eredmények tehát azt mutatják, hogy a gal-1 a 3. és az 5. nap között fejti ki hatását, amikor a legintenzívebb mobilizáció zajlik. Az, hogy a gal-1re csak a mobilizáció késői szakaszában van feltétlenül szükség, felveti annak a lehetőségét, hogy a lektin egyszerűen hozzákötődik a G-CSF-hez, és közvetlenül gátolja annak mobilizáló hatását.
Ennek
kizárására
egy
kontroll
kísérletet
végeztünk,
ahol
a
granulocyta/makrofág kolóniaképző sejteket csak Cy-dal mobilizáltuk, és azt tapasztaltuk, hogy a gal-1 többszöri adása ekkor is jelentősen csökkentette a mobilizációt.(11. ábra)
10.ábra A gal-1 a mobilizáció második felében fejti ki gátló hatását Az egereket CY/G-CSF kezeléssel mobilizáltuk, és egy részük a mobilizáció mellett gal-1-et is kapott. Az állatok a mobilizáló kezelésekkel együtt 5µg/állat/nap mennyiségben kapták a gal-1 fehérjét. Az eredményeket és a szórást 3 független kísérlet eredményéből számoltuk. A statisztikailag szignifikáns különbségeket csillaggal jelöltük (*p <0,05 ; **p<0,001).
49
11. ábra A Gal-1 hatása a granulocyta.makrofág kolóniaképző sejtek ciklofoszfamid (Cy) indukált mobilizációjára. A fiziológiás sóoldattal, Cy-dal, Cy + Gal-1-gyel, illetve csak galektin-1-gyel kezelt egerek vérében meghatároztuk a CFU-GM gyakoriságot (a) és az össz fehérvérsejt számot (b). A gal-1 többszöri adása akkor is jelentősen csökkenti a mobilizációt, ha az állatok nem kapnak G-CSF-et, tehát a galektin gátló hatása független a citokintől. Az eredményeket és a szórást (+/- SD) 3 független kísétlet átlagából számoltuk ki. A statisztikailag szignifikáns különbségeket csillaggal jelöltük. (* p <0,05; ** p<0,001).
A gal-1 gátolja a csontvelői eredetű fehérvérsejtek SDF-1 indukálta transz-endotheliális migrációját Az eddigi eredmények ismeretében szerettük volna megtudni, hogy a gal-1 milyen módon képes kifejteni gátló hatását. A mobilizáció több lépésből áll, ezek közül az egyik az, amikor a csontvelői sejtek az érfal endothel sejtjei között átlépve a keringésbe jutnak (Papayannopoulou, 2004). Mivel feltételeztük, hogy a gal-1 hatással lehet erre a folyamatra, ezért megvizsgáltuk a magvas csontvelői sejtek és granulocyta-makrofág kolóniaképző sejtek SDF-1 indukált kemotaxisát és transz-endotheliális migrációját galektin jelenlétében. (Az SDF-1 – stromal derived factor 1 vagy más néven CXCL12 a csontvelői stromasejtek felszínén megtalálható kemokin, receptora, a CXCR4 pedig a vérképző sejtek membránjában helyezkedik el. Az SDF-1 kemotaktikus hatással rendelkezik, azaz a receptorát expresszáló sejtek a kemokin nagyobb koncentrációja irányába vándorolnak(Kucia M és mtsai, 2005). Mint azt a 12. ábra mutatja, sem a csontvelői sejtek (a), sem a CFU-GM sejtek (b) kemotaxisát nem gátolta a gal-1 a transwell kísérletben, ahol a sejtek SDF-1 gradiens hatására migráltak 4 órán keresztül. Ezzel ellentétben a csontvelői sejtek és CFU-GM sejtek transz-endotheliális migrációját dózisfüggő módon meggátolta a gal-1 6 órán belül.
50
12. ábra A gal-1 hatása a csontvelői magvas sejtek és a vérképző elődsejtek kemotaxisára és transzendotheliális migrációjára
A csontvelői sejteket az üres (a,b) illetve endothel sejtekkel fedett (c,d) Millicell betétekbe helyeztük galektin nélkül, illetve növekvő koncentrációjú gal-1 hozzáadása mellett. A tálca lyukainak inzert alatti részébe 100 ng/ml rekombináns egér SDF-1-et tettünk (a-d), és 6 órával később leszámoltuk az inzerten keresztül a lyukak alsó részébe átvándorló csontvelői (a,c) és granulocyta-makrofág kolóniaképző sejteket (b,d). A migrációs index kiszámításához az SDF-1 hatására migráló sejtek számát elosztottuk a spontán vándorló sejtek számával. Az eredményeket és a szórást 3 független kísérlet eredményéből számoltuk ki. A statisztikailag szignifikáns különbségeket csillaggal jelöltük. (* p<0,05; ** p<0,001). A gal-1 nem volt hatással a csontvelői sejtek kemotaxisára, azonban megakadályozta az átjutásukat az endothel sejtek között.
51
A Cy/G-CSF-fel és gal-1-gyel kezelt egerek vére nem képes életben tartani a halálosan besugárzott állatokat A mobilizációs protokoll hatására a csontvelőből a perifériás vérbe kerülnek olyan differenciálatlan, korai vérképző őssejtek is, amelyek képesek a hosszútávú vérképzés fenntartására, mert az összes vérsejttípus, illetve azok progenitorai kialakulhatnak belőlük (Molineux és mtsai, 1990). Ezen sejtek jelenlétét csak in vivo csontvelő transzplantációs kísérlet segítségével lehet igazolni. Mivel tudni akartuk, hogy a gal-1 milyen hatással van ezekre a sejtekre a mobilizáció alatt, ezért következő kísérleteink során egésztest besugárzással (9Gy) csontvelőirtáson átesett egereket transzplantáltunk a kontroll, mobilizált, mobilizált és galektinnel kezelt, illetve csak gal-1-el beoltott szingén állatok vérével. Az eredményeket a 13. ábra foglalja össze. A halálos dózisú besugárzáson átesett recipiensek közül a 100 vagy 50 µl, Cy/G-CSF kezelt donor állatból származó vérrel történő transzplantációt 7 állatból 5, illetve 7-ből 4 élte túl 90 napnál tovább. Ezzel ellentétben, ha Cy/G-CSF-el és gal-1-el egyidejűleg kezelt egerek véréből oltottunk 100 µl-t a besugárzott recipiensekbe, akkor az összes állat elpusztult a besugárzást követő 5.-22. napon belül. Azok közül a besugárzott egerek közül, amelyeket kezeletlen, kontroll állatok vérével transzplantáltunk, egy sem élt 14 napnál tovább. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a gal-1 képes volt meggátolni mind a progenitor sejtek, mind a tartós repopulációra képes vérképző ősssejtek Cy/G-CSF indukált mobilizációját.
52
13.ábra A gal-1 hatása az in vivo repopulációra képes vérképző őssejtek mobilizációjára A halálos besugárzást (900 cGy) kapott BDF1 egereket transzplantáltuk a különböző előkezelésen átesett szingén állatoktól származó, az ábrán jelölt mennyiségű vérrel. A grafikonon két független kísérlet összesített eredményét ábrázoltuk. Látható, hogy a csontvelőirtott egerek vérképzését csak a Cy+G-CSF mobilizált donoroktól származó vér volt képes helyreállítani. A mobilizáció mellett galektinnel is kezelt egerek vére nem tartalmaz elegendő ős- és elődsejtet ahhoz, hogy megmentse a recipiens állatokat, vagyis a gal-1 gátolja ezen sejtek mobilizációját.
53
4.2. Az I.-es típusú diabetes őssejtterápiája
Több tanulmányban is beszámoltak a cukorbetegség eredményes őssejtterápiájáról, amelyhez csontvelői sejteket használtak fel (Banerjee és mtsai, 2005) (Lee és mtsai, 2006). Ezért munkánk következő részében megvizsgáltuk a csontvelői mesenchymális őssejtek (MSCk), haematopoetikus őssejtek, illetve a kétféle sejttípus együttes alkalmazásának hatását is. Ahhoz, hogy megvizsgálhassuk, a csontvelői eredetű ős/elődsejtek mennyire képesek helyreállítani a károsodott hasnyálmirigyszövet funkcióját, STZvel diabetest indukáltunk felnőtt C57Bl/6 nőstény egerekben. A méreg szelektíven a hasnyálmirigy bétasejtjeit pusztítja el, majd a széteső, nekrotizáló sejtekből felszabaduló saját antigének ellen autoimmun válasz is kialakul, ami az I.-es típusú diabeteshez hasonló betegséget eredményez a kísérleti állatokban (Like és Rossini, 1976) (Paik és mtsai, 1980) (Kiesel és Kolb, 1982). A betegség kialakulása után inzulin adása nélkül az egerek 4-6 héten belül elpusztultak. A kísérletek során a recipiens állatok a transzplantáció előtt szubletális sugárdózist kaptak, amely nem irtja ki a teljes vérképző rendszert, azonban kisebb mértékű károsodást és sejtpusztulást okoz, ami nélkülözhetetlen ahhoz, hogy a beadott sejteknek „helyet biztosítsunk” a csontvelőben.
A mesenchymális őssejtek együttműködnek a csontvelői vérképző sejtekkel a diabetes sikeres kezelésében Ismert, hogy a szingén vagy allogén MSCk több különböző sérült szövetféleséget is képesek regenerálni. Hogy megvizsgáljuk, az MSCk önmagukban is képesek-e a hasnyálmirigy-funkciók helyreállítására vagy csak a csontvelői vérképző sejtekkel együtt, frissen izolált szingén csontvelői magvas sejteket és/vagy BDF1 hím egerekből izolált MSC-ket adtunk intravénásan STZ kezelt, 250 cGy-el szubletálisan besugárzott állatoknak. Az optimális besugárzási dózist, valamint a transzplantáció időpontját előkísérletekben határoztuk meg, amiknek az eredményét nem mutatjuk, de közleményünkben (Urbán VS és mtsai, 2008 ) ezek az adatok is szerepelnek. A kísérlet menetét a 14. ábra mutatja.
54
14. ábra. Frissen izolált csontvelői magvas sejtek és mesenchymális őssejtek együttes transzplantációjának vázlata A kétféle sejttípust az STZ kezelés megkezdésétől számított 15. napon, 250cGy TBI-t követően, a farokvénán keresztül juttattuk az állatok keringésébe, majd a felsorolt vizsgálatokat végeztük el. Rövidítések: STZ = streptozotocin, i.p.: intraperitoneális (hasüregbe adott) injekció, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek) TBI = total body irradiation (egésztest besugárzás), FISH = fluoreszcens in situ hibridizáció, EGFP = enhanced green fluorescent protein (zöld fluoreszcens fehérje)
A vércukorszint (15.ábra) és szérum inzulin koncentráció (16.ábra) a beteg állatokban gyorsan visszatért a normál értékekhez, ha a 15. napon 106 csontvelői sejtet és 105 MSCt kaptak, és ezek az állatok több mint 180 nappal túlélték az STZ kezelést. Sem az MSCk (2x105), sem a frissen izolált csontvelői sejtek (106) önmagukban nem befolyásolták sem a magas vércukor- és alacsony szérum inzulin szintet, sem pedig a túlélést.
55
15. ábra Önmagában sem a BMC, sem az MSC transzplantáció nem hatásos, azonban a BMCk és MSCk együttes transzplantációja képes meggyógyítani a cukorbeteg egereket (a) az állatok csak STZ kezelést kaptak (diabéteszes kontroll), vagy az STZ kezelés után 250 cGy szubletális egésztest besugárzás után transzplantáltuk őket (b) 106 BMC-vel (d) 2x105 MSCvel vagy (c) 106 BMC-vel és 105 MSC-vel együtt. Minden szimbólum egy-egy állatot reprezentál. A szimbólum eltűnése a diagramról az adott állat halálát mutatja. Rövidítések: STZ= streptozotocin, Tr = a (ko)transzplantáció időpontja, BMC = bone marrow cells (csontvelői sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek) A kezeletlen állatok 6 héten belül elpusztulnak (a). A csak BMCvel kezelt egerek vércukorszintje átmeneti javulást mutat, néhány héttel később azonban a betegség visszatér (b). A kotranszplantáció hatására az egerek vércukorszintje normalizálódik, és később is egészségesek maradnak (c). Csak MSCk transzplantációjával szintén nem érhető el gyógyulás (d)
56
16. ábra A csontvelői magvas sejtek és mesenchymális sejtek kotranszplantációja helyreállítja a diabéteszes egerek szérum inzulin szintjét (a) az állatok csak STZ kezelést kaptak (diabéteszes kontroll), vagy az STZ kezelés után transzplantáltuk őket (b) 106 BMC-vel és 105 MSC-vel (c) csak 106 BMCvel (d) csak 105 MSCvel. Az adatokat és a szórást 3 kísérlet (összesen 9 állat) átlagából számoltuk. A kísérleti elrendezést a 7. ábra szemlélteti. Látható, hogy önmagukban sem a BMCk (c), sem az MSCk nem képesek normalizálni a cukorbeteg egerek SI szintjét (d), azonban a kotranszplantáció hatására az egerek szérum inzulinszintje tartósan visszatér az egészséges értékekhez.
57
A glükóz tolerancia teszt (17.ábra) és a hasnyálmirigy metszetek immunhisztokémiai festése (18.ábra) inzulin pozitív sejtekre szintén az MSC-k és a csontvelői sejtek szoros együttműködését bizonyították a diabetes kezelésében, mivel mind a glükóz tolerancia, mind pedig az inzulintermelő sejtek száma az egészséges kontrollhoz mérhető értékeket ért el a kétféle sejttel optimális arányban transzplantált egerekben. Más szervekben, mint a máj, lép, tüdő és csontvelő, nem jelentek meg inzulin pozitív sejtek. Szingén (C57Bl/6 hím egerekből izolált) és allogén (CD1 vagy EGFP-Tg-CD1 egerekből származó) MSC-k transzplantálása hasonló eredményekkel járt. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az MSC-k és csontvelői sejtek együttműködtek a kísérletesen indukált cukorbetegség gyógyításában.
Kontroll STZ (4.hét) STZ/BMT+MSC (12.hét)
17. ábra Glükóz tolerancia teszt Az előzőleg éheztetett állatok 2g/kg glükózt kaptak intraperitoneálisan, majd a jelzett időpontokban mértük a vércukorértékeket. Üres oszlopok: egészséges kontroll állatok értékei Világoskék oszlopok: STZ indukálta diabetesben szenvedő állatok értékei Sötétkék oszlopok: 5x104 MSC és 106 BMC együttes transzplantációját követő 12. héten mért glükóz tolerancia teszt értékek Az adatok az átlagokat és a szórásokat mutatják ( n = 15) A kotranszplantált állatok glükóz tolerancia teszt eredményei nem térnek el az egészséges állatok értékeitől.
58
18. ábra. Anti-inzulin ellenanyaggal végzett immunhisztokémia Megfigyelhető a kontroll állat (a) és az STZ kezelésen átesett állat (b) inzulinra nézve pozitív β-sejtjeinek jelentős számbeli eltérése. A kotranszplantált, gyógyult állatok (c) Langerhans-szigeteinek mérete és inzulintermelése a 12. héten csaknem azonos mértékű a kontroll állatokéval. Lépték: 20 µm
A gyógyulás nem a donor eredetű csontvelői sejtek vagy MSC-k inzulintermelő β-sejtté történő differenciálódásának köszönhető A diabetesből meggyógyult egerek új hasnyálmirigy β-sejtjei származhatnak endogén forrásból (Li és mtsai, 2003)(Izumida és mtsai, 2005), vagy lehetnek donor eredetűek is (Ianus és mtsai, 2003). Hogy megállapíthassuk, a donor eredetű csontvelői- és/vagy mesenchymális sejtek képesek-e inzulintermelő sejteket létrehozni, Y-kromoszómára specifikus FISH-t végeztünk a hasnyálmirigy metszeteken, anti-inzulin immunfestéssel kombinálva (19.ábra). A hím egerekből származó csontvelői- és mesenchymális sejtek transzplantációja utáni 2., ill. 84. napon végzett FISH nem mutatott pozitivitást a cukorbeteg nőstény állatok acinus- és szigetsejtjeiben. Ellenkező nemű, EGFP-Tg-CD1 egeret használva az MSCk forrásául, zölden fluoreszkáló sejtek sem voltak láthatók a recipiensek hasnyálmirigyében. Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy az új βsejtek nem donor eredetűek. Átmenetileg kimutathatók voltak viszont Y-kromoszómát hordozó sejtek a csontvelőben, ami azt jelenti, hogy a donor eredetű csontvelői sejtek és/vagy MSC-k eljutottak a recipiens csontvelejébe. A csontvelői kimérizmus a transzplantációt követő 10. napon volt a legmagasabb (6-12% donor eredetű sejt a recipiens csontvelejében), majd gyorsan csökkenni kezdett, miközben a magvas sejtek össz száma fokozatosan nőtt a csontvelőben. EGFP-t expresszáló MSC-k nem jelentek meg a transzplantált állatok perifériás vérében, csontvelejében, májában, tüdejében vagy lépében. Ezek az adatok azt igazolják, hogy a hasnyálmirigy inzulinszekretáló sejtjeinek újbóli megjelenése és a vércukor- és szérum inzulin szintek normalizálódása a recipiens szervezetében aktiválódott endogén regenerációs folyamat eredménye.
59
d
e
19.ábra A donor eredetű sejtek nem mutathatók ki a recipiensek regenerálódó Langerhansszigeteiben, de átmeneti csontvelői chimerizmus megfigyelhető A kombinált immunfluoreszcens festésen a sejtmagok: kékek (DAPI) / inzulin: (vörös immunhisztokémia) / Y-kromoszómák: zölden fluoreszkálnak (FISH) (a): egészséges hím C57Bl/6 egér pancreas metszete (mint pozitív kontroll) (b): STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egér pancreas metszete a kotranszplantáció 2. napján (c): STZ kezelt nőstény C57Bl/6 egér pancreas metszete a kotranszplantáció utáni 84. napon Lépték: 100 µm (d) A donor sejteket Y-kromoszóma specifikus FISH analízissel mutattuk ki és számoltuk meg a recipiens csontvelejében. Látható, hogy a chimerizmus a transzplantációt követő 10. napon a legkifejezettebb. Minden szimbólum egy-egy állat adatát jelképezi (n=5) (e) A magvas csontvelői sejtek száma gyorsan nő a recipiens állatok femurjában. Az adatok az átlagokat és szórásokat mutatják (n=5).
60
Az MSCk gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ Ismert, hogy az STZ indukált diabéteszben a β-sejtek direkt károsodását autoreaktív Tsejtek aktiválódása követi, amelynek eredménye a hasnyálmirigy-szigetek pusztulása (Like és Rossini, 1976) (Paik és mtsai, 1980). Másfelől, az MSC-knek a T-sejt válasz gátlásán keresztül kifejtett immunszuppresszív hatása szintén jól dokumentált jelenség (Di Nicola és mtsai, 2002). Ezért arra gondoltunk, hogy az MSCk a β-sejtek elleni specifikus immunreakció gátlásával segíthetik elő a hasnyálmirigy-szigetek endogén regenerációját. Ennek igazolásához csak BMC-vel, csak MSC-kkel, vagy mindkettővel egyszerre transzplantált, illetve egyáltalán nem transzplantált diabeteses egerek hasnyálmirigyéből T-sejteket izoláltunk. Cukorbeteg egerek lépéből származó antigénprezentáló sejtek (a lépsejtek adherens frakciója) a nem transzplantált, vagy csak BM sejtekkel kezelt egerekből izolált autoreaktív T-sejtek igen intenzív proliferációját váltották ki, míg az önmagában alkalmazott MSC, és a kombinált MSC-BMC kezelésen átesett egerek T-sejtjeinél fokozott osztódás nem volt megfigyelhető. A kísérlet menetét a 20. ábra szemlélteti, a 21. ábrán pedig az eredmények láthatók. Ezek az eredmények alátámasztják azt a feltevést, hogy a kezelés során az MSCk képesek meggátolni a β-sejt specifikus T-sejt választ. Meg kell azonban említeni, hogy sem egy erős immunszuppresszív gyógyszer, CsA adásával (10 mg/kg s.c., a 15, 17 és 19. napon), sem gal-1 kezeléssel nem normalizálható a vércukorszint, és az összes állat elpusztul a 10. és 12. hét között (az adatokat nem mutatjuk), ami azt jelzi, hogy az immunszuppresszió szükséges, de nem elégséges a diabetes gyógyításához.
61
BMC
C57Bl/6
Autoreaktív T-sejtek proliferációja
MSC In vitro kultúra 3
H-timidin
Transzplantáció a 15. napon
TBI 15. nap, 250 cGy
15 Gy T-sejtek a pancreasból Lép APC-k (a 8. napon)
C57/Bl/6 C57Bl/6
STZ kezelés
STZ kezelés 20.ábra Antigén-specifikus T-sejt proliferáció vizsgálata (Az STZ-kezelt állatok pancreasában található β-sejt specifikus T-sejtek kimutatására szolgáló kísérletek vázlata) Az STZ-vel kezelt állatok lépéből, a pusztuló β-sejtekből felszabaduló saját antigéneket bemutató adherens sejteket nyertünk ki. Ezek a sejtek felhasználhatóak voltak a β-sejt specifikus, autoreaktív T lymphocyták proliferációjának kiváltására. A proliferációt tríciummal jelzett timidin felvételének mérésével követhettük nyomon. Rövidítések: STZ = streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői magvas sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek), TBI = total body irradiation (egésztest besugárzás) APC = antigén presenting cell (antigén bemutató sejt)
62
21. ábra Az MSC-k gátolják a β-sejt specifikus T-sejt választ (a) STZ-vel kezelt, de nem transzplantált állatok pancreasából származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata (b): STZ-vel kezelt, majd BMC-vel és MSC-vel kotranszplantált állatok pancreasából származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata (c): STZ-vel kezelt, majd csak BMC-vel transzplantált állatok pancreasából származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata (d): STZ-vel kezelt, majd csak MSC-vel transzplantált állatok pancreasából származó T-sejtek β-sejt specikus proliferációjának vizsgálata Kontrollként olyan APC-ket használtunk melyek STZ-vel nem kezelt állatok lépéből származtak. Rövidítések: STZ= streptozotocin, BMC = bone marrow cells (csontvelői magvas sejtek), MSC = mesenchymal stem cells (mesenchymális őssejtek).
63
4.3 Myelodysplasiás (MDS) és myelomás (MM) betegek mesenchymális őssejtjeinek vizsgálata – a vérképzőrendszer megbetegedése együtt jár-e a stroma betegségével?
Vérképző elődsejtek a kiindulási csontvelőben A betegektől és az egészséges donoroktól származó csontvelőminták mindegyikén elvégeztük az in vitro kolóniatesztet. A lágy gélben csontvelői vérképző kolóniát létrehozni képes sejtek gyakorisága az MDS-es – és kisebb mértékben az MM-es – betegekben általában a normálisnál alacsonyabb volt (az eredményeket nem mutatjuk).
Adherens stromasejt rétegek létrehozása A csontvelői mononukleáris sejtek kirakása után 5-7 nappal fibroblaszt-szerű sejtekből álló kolóniák jelentek meg a tenyésztőedényben. Az egészséges donoroktól származó stromasejt rétegek korábban (8-14 nap alatt) elérték a konfluenciát, míg az MDS-es pácienseknél ehhez 10-18 nap kellett, tehát ezeknek a betegeknek az adherens sejtjei csökkent osztódási képességgel rendelkeznek. 3 vagy több átoltás után a növekedés sebességében még mindig hasonló különbséget lehetett felfedezni, de a sejtek morfológiája nem különbözött. Az egészséges MSCk sikeresen passzálhatók voltak 2025 alkalommal is, míg az MDSes MSCk 10-15 átoltás után szeneszcenssé váltak. Néhány MDSes beteg stromájában spontán zsírsejtképződés nem volt megfigyelhető. A 3. átoltás után azonban mind a kontroll, mind a betegekből származó MSC tenyészetek egységes kinézetű, orsó alakú sejtekből álltak, sem makrofágok, sem vérképző (CD 133+, CD34+, lin+) sejtek nem voltak köztük. Az MM-ben szenvedő betegek stromája az egészséges donorokból izolált adherens sejtekhez hasonlóan növekedett.
A stromák vérképzést támogató (myeloszupportív) képességének összehasonlítása Először a normál donorokból frissen izolált csontvelői mononukleáris sejtfrakciókat limitált hígítási sorban elosztottuk egy – ugyancsak egészséges csontvelőből kialakított – konfluens MSC réteggel fedett 96 lyukú platen (ld. Anyag és módszer). Köztudott, hogy a macskakő-szerű kolóniák megjelenésének időpontjai az ilyen hosszútávú csontvelői kultúrákban erősen korrelálnak a vérképző sejtek érettségi fokával. Emberben az elkötelezett elődsejtek 7-14 nap után képeznek kolóniát (7-14 napos CAFC), míg a primitívebb ős- és korai progenitor sejtek csak 5-6 hét után kezdenek osztódni (35-42 napos CAFC).
64
a
b
22. ábra MDS és MM betegek mesenchymális őssejtjeinek vérképzést támogató stroma irányú differenciálódása A CAFC módszer elsősorban a vérképző ős- és elődsejtek vizsgálatára alkalmas, jelen esetben azonban egészséges emberektől származó hematopoeticus sejteket MDS és MM betegek MSC-iből kialakított stromarétegen tenyésztve, azok hematopoesist támogató képességének vizsgálatára alkalmaztuk. Az ábrák a macskakő kolónia kialakítására képes sejtek gyakoriságát mutatják a vizsgát hematopoeticus sejteken belül, az idő függvényében. A szürke terület a normál tartományt jelzi, egészséges stroma és vérképző sejtek esetén az értékek ide esnek (n = 7–9). A myelodysplasiás betegeknél (a) a kapott pontok egy-két esettől eltekintve nem esnek a normál tartományba, tehát megállapíthatjuk, hogy e betegek stromája nem képes a vérképzést megfelelően támogatni. Ezzel szemben a myelomás betegek (b) esetében nem figyelhetünk meg eltérést a normál értékektől, tehát a stroma funkciója nem károsodott.
65
Ezután MDS-es csontvelőből származó mononukleáris sejteket tettünk normál MSC-vel fedett plate-re, míg a normál csontvelői sejteket MDS-es stromával tenyésztettük együtt, CAFC médiumban. Amikor az MDS-es csontvelői mononukleáris sejteket normál MSC-vel tartottuk ko-kultúrában, mind a korai, mind a késői CAFC-gyakoriság szignifikánsan csökkent a normál értékekhez képest a 8-ból 4 betegnél (az eredményeket nem mutatjuk). Fordított esetben a CAFC gyakoriságok 6-ból 5 mintánál (ebből négynél jelentősen) csökkentek a kontrollhoz képest (ld. 22/a. ábra). Amikor MDS-es mononukleáris sejteket MDS-es stromával inkubáltunk, a 7 és 14 napos CAFC gyakoriság extrém mértékben lecsökkent, és a legtöbb primitív HSC (28-42 napos CAFC) nem is osztódott (az adatokat nem mutatjuk). Végül, egészséges vérképző sejtek MM-es betegek stroma sejtjeivel inkubálva gyakorlatilag ugyanannyi kolóniát képeznek, mint normális stroma jelenlétében (ld. 22/b ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az MDS kórlefolyásában a hematopoietikus mikrokörnyezet – a vérképző sejtek klonális megbetegedése mellett - sok esetben szintén szerepet játszik. Ugyanakkor myeloma multiplexben a betegek stroma sejtjeinek myeloszupportív képessége megtartott.
Az MDS-es és MM-es betegek csontvelőmintáiból származó MSCk plaszticitása Hogy megvizsgáljuk a betegek MSC-inek multipotencialitását, 7 MDS-es beteg, 8 MMes beteg és 8 egészséges donor adherens sejtjeit differenciáltattuk 2 különböző irányba. (23. ábra) Az adipocyta irányú differenciálódást olajvörös festéssel vizsgáltuk. Az olajvörössel jelölődő vakuolákat tartalmazó sejtek százalékos aránya változó volt az egyes tenyészetekben, de az MDS-es stromák zsírsejt irányú differenciációs képessége szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll sejtekénél. Az oszteogén differenciálódás ellenőrzésére alizarin vörös festést alkalmaztunk, amely a kalcium ionok jelenlétét mutatja ki a sejtek által termelt extracelluláris mátrixban. Itt nem volt szignifikáns különbség az MDSes és normál minták között. A myelomás betegektől származó MSCk mind adipocyta, mind osteoblast irányba az egészséges MSC-khez hasonlóan differenciálódtak (24. ábra).
66
23.ábra A normál donoroktól és MDS-es betegektől izolált MSCk plaszticitása. (a)-(e): 14 napig osteogén médiumban tartott
(f)-(j): 14 napig adipogén médiumban tartott
sejtek, alizarinvörös festés (a): kontroll; (b), (c):
sejtek, olajvörös festés (f): kontroll; (g),(h):
MDS; (d), (e): MM;
MDS; (i), (j): MM (eredeti nagyítások: 100x)
24.ábra Myelodysplasiás és myelomás betegek mesenchymális őssejtjeinek plaszticitása (A) az ábrán azt hasonlítottuk össze, hogy beteg, ill. egészséges MSC sejteket adipogén médiumban inkubálva a sejtek hány százaléka alakult zsírsejtté. MM esetén a kontrollhoz képest nem látható szignifikáns különbség, míg az MDSes betegeknél az esetek többségében jelentősen csökkent az adipocyta irányú differenciáció képessége. (B) Az MSC sejteket osteogén médiumban inkubáltuk. Az ábrán a sejtek által látrehozott extracelluláris mátrixban az alizarinvörös festés után megfigyelhető csontképződési gócok számát hasonlítottuk össze adott területen az MM, MDS és egészséges stroma esetében. A normálishoz képest nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést egyik betegség esetében sem.
67
Összefoglalásként tehát elmondhatjuk, hogy a myelodysplasiában szenvedő betegek MSC-i a normális MSC-khez viszonyítva rosszabbul növekednek in vitro kultúrában, kevésbé képesek támogatni a fiatal vérképző sejtek (ős- és elődsejtek) fejlődését, és kevésbé plasztikusak, azaz az MDS a csontvelői stromát is érintő megbetegedés. A myeloma multiplex esetében ugyanakkor hasonló károsodást nem tapasztalhatunk, ez a neoplasztikus megbetegedés tehát valóban egyetlen – vérképző sejt / B limfocita eredetű – klónt érint.
68
5. Megbeszélés Munkánkban a csontvelő őssejtjeit vizsgáltuk. Célunk a vérképző rendszer és a vérképzést szabályozó csontvelői stroma együttműködésének jobb megértése, valamint a csontvelőben található szöveti őssejtek regeneráló, gyógyító képességének megismerése volt.
Laboratóriumunkban évek óta foglalkozunk a gal-1 fehérje in vitro és in vivo hatásainak vizsgálatával. Ez a fehérje ugyanis az egyik kulcsmolekula lehet a lektint nagy mennyiségben expresszáló mesenchymális őssejtek immunszuppresszív, illetve toleranciát indukáló képességének megértéséhez, valamint a gyógyszerkutatás számára is nagy jelentőséggel bírhat, mint erős gyulladáscsökkentő hatású anyag. A vérképző ős- és elődsejtek a gyulladás okozta stressz szignálok hatására a csontvelőből a perifériára vándorolnak – mobilizálódnak –, így téve lehetővé a szervezet számára a gyors alkalmazkodást a kialakult vészhelyzethez. Feltételeztük, hogy a gal-1 a csontvelői sejt-mobilizáció szintjén befolyásolhatja az immunválaszt, megakadályozva a gyulladásos reakcióban résztvevő sejtek célba jutását. Ennek vizsgálatához szükségünk volt egy in vivo modellrendszerre, amelynek segítségével megfigyelhetjük a gal-1 mobilizációra gyakorolt hatását. A mobilizáció során végbemenő fiziológiás folyamatot utánozza az az eljárás, amikor kemoterápiás szerek, mint a Cy, ill. citokinek, mint a G-CSF hatására kerülnek az ős- és elődsejtek a csontvelőből a keringésbe. A G-CSFet a klinikumban széles körben alkalmazzák a csontvelői sejtek mobilizálására, általában azért, hogy a perifériás vérből elegendő mennyiségű ős- és elődsejtet nyerhessenek ki transzplantációs célokra (Molineux és mtsai, 1990). A citokin hatását gyakran Cy kezeléssel fokozzák, ami növeli a mobilizáció hatékonyságát azáltal, hogy a csontvelő pusztításával gyors osztódásokra és differenciálódásra kényszeríti a károsított szövet megmaradt őssejtjeit (Morrison, Wright és Weissman, 1997). Rágcsálókban és az emberben a Cy/G-CSF kezelés dózis- és időfüggő módon mobilizál. A folyamatra jellemző a gyorsan kialakuló neutrofília, melyet később a vérben lévő HPC-k számának növekedése követ. Ez az emelkedés 10-100x-os is lehet az alapértékhez képest.
69
Az elterjedt alkalmazás ellenére keveset tudunk arról, hogy hogyan indukálja a Cy/G-CSF kezelés a primitív vérképző sejtek mobilizációját. A legújabb kutatások eredményei arra utalnak, hogy a folyamatot a neutrofil granulocyták és osteoclastok stressz-indukált aktivációja indítja el. Ennek eredményeként a membránkötött SCF lehasad a sejtek felszínéről és felszabadul, a progenitor sejtek osztódni kezdenek, és bizonyos adhéziós molekulák, például a VLA-4 és a P és E szelektinek, aktiválódnak vagy degradálódnak (Papayannopoulou, 2004)
A mobilizáció fő szabályozói lépései: -
kemokinek, például az SDF-1/CXCL12 és az IL-1/CXCL8 gyors szekréciója vagy inaktivációja
-
az
extracelluláris
mátrix
molekuláinak
többlépéses
inaktivációja/degradációja proteolitikus enzimek által, többek között az elasztáz, cathepsin-G, proteináz-3, CD26 (dipeptidil-peptidáz IV) és számos metalloproteináz (MMP), különösen az MMP9 részvételével
A modellrendszer kiválasztása után a Cy/G-CSF-mobilizált BDF1 egerek vér- és csontvelőmintáin számos vizsgálatot végeztünk, többek között meghatároztuk az össz fehérvérsejt számot, a kolóniaképző sejtek gyakoriságát, valamint a különböző érett és éretlen vérsejttípusok százalékos arányát is. A modellrendszer leírása után megvizsgáltuk, hogy a gal-1 fehérje önmagában, illetve a mobilizáló eljárással egyidejűleg adva milyen hatással van a fenti értékekre. Úgy találtuk, hogy a gal-1 dózis- és időfüggő módon képes meggátolni a Cy/GCSF-indukált mobilizációt és perifériás neutrofíliát. A csökkent HPC mobilizáció ellenére az Sca1+, GR1+ és CD11b+ sejtek gyakorisága és abszolút száma jelentősen magasabb a Cy/G-CSF + gal-1 kezelést kapott egerek csontvelejében, mint azokéban, amelyek csak Cy/G-CSF kezelést kaptak. Emellett, bár a csontvelői magvas sejtek számát a gal-1 önmagában nem befolyásolta, de a CFU-GM gyakoriság enyhén megnőtt mind a csak gal-1-gyel kezelt, mind a gal-1 kezelt és ezzel egyidejűleg mobilizáló kezelést kapott egerekben. A gal-1 tehát nem gátolja, sőt, stimulálja a HPC-k osztódását és felszaporodását a
csontvelőben
a
Cy/G-CSF
kezelés
alatt.
Ez
összhangban
van
korábbi
eredményeinkkel, ahol kimutattuk, hogy kis mennyiségű gal-1 serkenti az elkötelezett
70
HPC-k növekedését szövettenyészetben. Emellett az alacsony koncentrációjú gal-1-nek nincs citotoxikus hatása a csontvelői sejtekre.
Ezután azt próbáltuk kideríteni, hogy milyen mechanizmus állhat a megfigyelt gátló hatás hátterében. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy számos különféle sejtfelszínhez kötött és szolúbilis neutrofil proteáz mennyiségének növekedése, különösen a csontvelőben található MMP-ké, az ős- és elődsejtek mobilizációjának kritikus lépése (Heissig és mtsai, 2002). A megfelelő proteolítikus aktivitás nélkül a HPC-k nem tudnak elszakadni a környező csontvelői stromaelemektől, enélkül pedig nem
képesek
osztódni
sem.
Munkacsoportunk
igazolta,
hogy
a
gal-1
hatásmechanizmusa ettől eltérő kell, hogy legyen, mivel a mobilizált, illetve a mobilizáló kezelés mellett gal-1-et is kapott állatok csontvelőmintái között nem találtunk különbséget a gelatinase enzim aktivitásában (az eredményeket nem mutatjuk).
A csontvelői sejtek perifériára kerülésének következő szabályozó lépése az endotheliumon keresztül történő migráció. La és mtsai (2003) szerint a gal-1 gátolja a polimorfonukleáris fehérvérsejtek IL-1β-indukált felszaporodását a hasüregben, valamint a kemotaxisukat és transzendotheliális migrációjukat is. He és Baum (2006) pedig úgy találta, hogy csökken a T-sejtek transzmigrációja, ha ez endothel sejtekkel nagy mennyiségű gal-1et fejeztetnek ki. Ezért azt feltételezzük, hogy a gal-1 úgy gátolja meg a HSCk, érett granulocyták és monocyták kijutását a csontvelőből a keringésbe a Cy/G-CSF-indukált mobilizáció során, hogy megakadályozza a fehérvérsejtek transzendotheliális migrációját. Ezt az alábbi megfigyelések is alátámasztják:
1, in vitro a gal-1 meggátolja a csontvelői HSC-k SDF-1 indukált transzendotheliális migrációját 2, a gal-1 ellentétes hatással van a csontvelő és a vér cellularitására a Cy/G-CSF kezelés alatt in vivo. Gal-1 egyidejű adásakor a magvas sejtek száma a csontvelőben megnövekszik, a vérben viszont csökken. 3, a gal-1 jelenlétére csak a mobilizáció második szakaszában –amikor a migrációs lépés történik - van feltétlenül szükség a teljes gátlás kialakulásához.
71
Munkánk tehát igazolja a gal-1 egy új, gyulladáscsökkentő hatását. A fehérje megakadályozza a HSC-k, granulocyták és monocyták kijutását a keringésbe, így segíthetne az akut és krónikus gyulladással járó állapotok kezelésében. Mivel a csontvelői stromasejtek (MSC-k) nagy mennyiségű gal-1et expresszálnak, ezért okkal feltételezhetjük, hogy a korai vérképzősejtek lassú „szivárgása” a keringésbe, és a csontvelőbe történő gyors homingjuk közötti dinamikus egyensúly fiziológiás körülmények között is szabályozást igényel, és ezt a szerepet (legalább részben) a gal-1 is betöltheti. Persze ennek az igazolásához további kísérletekre lesz szükség. Az őssejtterápiával kapcsolatos kutatások során a csontvelő őssejtjei – a mesenchymális és haematopoetikus őssejtek – kerültek a legközelebb ahhoz, hogy a közeljövőben
a
klinikai
gyakorlatban
alkalmazhassák
őket
különböző,
szövetkárosodással járó betegségek gyógyítására. Munkacsoportunk egy olyan, kombinált kezelési eljárást dolgozott ki, amelynek segítségével a HSC-k és MSC-k gyógyító hatását ötvözve képesek vagyunk véglegesen meggyógyítani I.-es típusú diabeteshez hasonló betegségben szenvedő egereket. A betegség állatmodelljéül STZ-vel kezelt egerek szolgáltak. A kezelés során önmagukban sem az in vitro tenyésztett mesenchymális őssejtek, sem a szeparálatlan csontvelői sejtek transzplantációja nem veztetett sikerhez, azonban a kétféle sejtet együtt beadva az egerek vércukorszintje, inzulinszintje és terheléses vércukor értékei tartósan normalizálódtak, a szövettani metszeteken pedig jól láthatóak az újra megjelenő, funkcionáló Langerhans szigetek. Ez ellentmond azoknak a cikkeknek, amelyekben arról számolnak be, hogy kizárólag szeparálatlan csontvelői sejtek, illetve csak MSC infúzió segítségével sikeresen kezeltek STZ-vel kiváltott diabetesben szenvedő NOD/SCID egereket. Az ellentmondások oka valószínűleg a különböző kísérleti elrendezésben rejlik: Banerjee és mtsai (2005) szerint pl. 3 egymást követő BMC injekció szükséges a javulás eléréséhez, Lee és mtsai (2006) pedig igen nagy mennyiségű, 2x106 db MSC-t adtak be az egerek bal szívkamrájába (saját indoklásuk szerint azért ide, hogy elkerülje a nagy mennyiségű sejt aggregációja miatt fellépő embóliaveszélyt). Mi ezzel szemben egyszeri kezelést, és a farokvénába adott jóval kisebb mennyiségű (105) MSCt használtunk.
A kezelés hatásos volt, azonban nem tudjuk, hogy pontosan hogyan segítette elő a kotranszplantáció a hasnyálmirigy β-sejtjeinek regenerációját? Lehetséges, hogy a
72
donor eredetű csontvelői- vagy mesenchymális sejtek differenciálódtak inzulintermelő sejtekké, ahogyan ezt korábban Ianus és mtsai (2003) állították, a mi vizsgálataink azonban nem ezt támasztották alá. Hím, illetve EGFP-transzgénikus hím donorokat, és nőstény recipienseket alkalmazva az Y-kromoszóma specifikus FISH és anti-inzulin immunfestés nem mutatott ki Y-kromoszóma+, illetve EGFP+ donor eredetű inzulintermelő sejteket a recipiens nőstény egerek hasnyálmirigyében. A csontvelőben ezzel szemben megfigyelhető egy átmeneti kimérizmus, ami egybevág számos más munkacsoport eredményeivel. Úgy tűnik tehát, hogy a csontvelői őssejtek nagy fokú in vitro plaszticitása ellenére in vivo nem közvetlenül belőlük lesznek az újonnan keletkezett β-sejtek. Egy másik lehetőség, hogy endogén regenerációról van szó. Számos példát találhatunk az irodalomban arra, hogy a pancreas részleges eltávolítása vagy sérülése esetén képes a spontán regenerációra. Újszülött korban a β-sejtek még bizonyosan képesek osztódni (Zhang és mtsai, 2005). Egyes munkacsoportok feltételezett hasnyálmirigy-prekurzor sejteket izoláltak a felnőtt egér, ill. ember hasnyálmirigyéből is, amelyek a mirigy bármely sejttípusát képesek voltak létrehozni (Seaberg és mtsai, 2004). Azt azonban nem tudhatjuk, hogy kísérleteinkben a regeneráció a megmaradt βsejtek osztódásának, a hasnyálmirigy feltételezett specifikus szöveti őssejtjeinek, vagy nem-endokrin eredetű epitheliális sejtek transzdifferenciációjának köszönhető, és ennek kiderítéséhez további kísérletekre lesz szükség. A következő kérdés, hogy az általunk alkalmazott kombinált kezelés hogyan képes elősegíteni a hasnyálmirigy endogén regenerációját? Talán az MSC-k és BMC-k olyan faktorokat termelnek, amelyek szükségesek a regenerációhoz. Azt nem tudjuk, hogy pontosan milyen anyagokról lehet szó - de leírták például, hogy a transzplantált csontvelői sejtek által termelt HGF regenerációt indított el STZ kezelt patkányok hasnyálmirigyében (Izumida és mtsai, 2005). Más források szerint a graftban lévő endothel prekurzor sejtek játszanak fontos szerepet az STZ-vel károsított hasnyálmirigy regenerációjában (Hess és mtsai, 2003), amit azzal magyaráznak, hogy az egyedfejlődés során is fontos szerepe van az endothel sejtekkel való kapcsolatnak és az általuk termelt faktortoknak a Langerhans szigetek kialakulásában (Lammert, Cleaver és Melton, 2003).
73
A mesenchymális sejtek kétféle módon is segíthetik a gyógyulást: az általuk termelt faktorok támogathatják az endogén regenerációt, míg immunmoduláló képességükkel megvédhetik az újonnan keletkező β-sejteket az autoreaktív T-sejtek támadásától. Egyes feltételezések szerint a mesencymális őssejtek gátolják a fibrózist, és olyan citokineket termelnek, melyek elősegítik könyezetükben az angiogenezist (Caplan és Dennis, 2006). Ezt a hipotézist számos olyan kísérlet eredménye támasztja alá, ahol szívinfarktusban, ízületi károsodásban ill. stroke-ban szenvedő betegek kaptak MSC kezelést (Bunnell, 2005) (Zimmet és Hare, 2005)(Caplan, 2005)(Bang, 2005). Könnyen hihető az is, hogy a regenerációban fontos szerepet játszik az MSCk nemrég felfedezett immunszuppresszív tulajdonsága. Noha az STZ kezelés először direkt módon pusztítja a β-sejteket, később azonban a sejtpusztulást autoreaktív T-sejt klónok megjelenése követi, így az emberi I. típusú diabeteshez igen hasonló betegség alakul ki a kísérleti állatokban (Like és Rossini, 1976) (Paik és mtsai, 1980) (Kiesel és Kolb, 1982). A kifejlődő autoimmun folyamat pedig – épp úgy, mint az I. típusú diabetes esetében – kizárja az endogén regeneráció lehetőségét, mivel az újonnan keletkező β-sejtek is áldozatul esnek az őket pusztító T-sejteknek. Emiatt a β-sejtspecifikus immunválasz megszűntetése után nem csak a még megmaradt β-sejtek maradnak életben, hanem az újonnan keletkező sejtek is képesek fennmaradni ebben az új környezetben. Korábban leírták már, hogy immunszuppresszív és gyulladáscsökkentő gyógyszerek adásával megelőzhető vagy késleltethető az I-es típusú diabetes kialakulása NOD egerekben, anti-CD3 ellenanyag segítségével pedig legalább 18 hónapig
megtartható
a
β−sejt
funkció
olyan
betegeknél,
akiknél
nemrég
diagnosztizálták az I. típusú cukorbetegséget (Herold és mtsai, 2002). Megpróbáltuk a saját kezelési eljárásunk során a mesenchymális sejteket immunszuppresszív gyógyszerrel (CsA) helyettesíteni, azonban nem jártunk sikerrel. Valószínűleg - a mesenchymális sejtek szerepe ebben az esetben nem csak a gyulladás megállítása, hanem szerepet játszanak az endogén regeneráció elősegítésében is - a CsA mellékhatásai közé tartozik a vesék és a máj súlyos károsodása, illetve a különböző szövetek regenerációjának gátlása
74
Összefoglalva tehát munkánk egy új, kuratív terápiát ajánl az I típusú diabetesben szenvedők számára. A szingén csontvelői- és szingén, vagy akár allogén mesenchymális őssejtek kotranszplantációja egyértelműen elősegíti a hasnyálmirigy regenerációját és a vércukor- és szérum inzulin szintek stabilizálódását és meggyógyítja az STZ indukált diabetesben szenvedő egereket. Az általunk kifejlesztett eljárás számos előnnyel bír az eddig létező módszerekhez képest: -
a szükséges, alacsony dózisú besugárzás csak minimális szövetkárosodással jár
-
a transzplantáció egy lépésben, egyetlen intravénás injekcióval történik, és nem jár azzal a kockázattal, hogy az összetapadt sejtek embóliát okozhatnának,
-
a beadott MSC-knek nem kell genetikailag egyeznie a recipienssel, mégsincs szükség további immunszuppresszív kezelésre.
Nyitott kérdések azonban maradnak: azonosításra vár, hogy pontosan mely sejtpopuláció(k) és faktorok felelősek a β-sejtek regenerációjáért.
A haematopoietikus őssejtek és a csontvelői stromasejtek által számukra biztosított mikrokörnyezet együttműködése, a szabályozó molekulák finom egyensúlya szükséges ahhoz, hogy a normális vérképzést fenntartsa (Li és Li, 2006). A vérképzőrendszer megbetegedéseit általában egy hibás vérsejt klón megjelenésével indokolják, és az őssejt niche szerepére sokáig alig fordítottak figyelmet. Ma már tudjuk, hogy a szöveti ős- és elődsejtekkel kapcsolatos kutatások fontos eleme az őssejtek mikrokörnyezetének megismerése is, mivel az őssejtek önmagukban, ebből a közegből kiragadva teljesen másképp viselkednek, mint amikor a számukra szükséges faktorok, citokinek, extracelluláris mátrix elemek és sejtkapcsolatok a rendelkezésükre állnak. Munkánkban a vérképzőszervi megbetegedések esetében egyszerre vizsgáltuk a haematopoietikus sejteket és a vérképzést támogató stromát. A
myelodysplasiás
következtében,
szindróma
leggyakrabban
idős
(MDS)
korban
csontvelői
(70-80
év)
őssejtek kialakuló,
defektusa klonális
megbetegedések heterogén csoportja (Steensma és Tefferi, 2003). Jellemzője az ineffektív vérképzés: normális vagy fokozott cellularitású csontvelő ellenére egy vagy több sejtfejlődési sort (vörösvérsejt, granulocyta-macrophag és/vagy thrombocyta)
75
érintő cytopenia észlelhető. A betegek közel felében idővel akut (elsősorban myeloid, ritkán lymphoid) leukaemia alakul ki (Zoumbos, 2001)(Hirai, 2003). Több vizsgálat látszik alátámasztani, hogy a betegek stromája maga is beteg, a vérképzést nem képes megfelelően támogatni (Aizawa és mtsai, 1999)(Zoumbos, 2001)(Wallace és mtsai, 2001). A betegek stromasejtjei túlzott mértékben termelik többek között a TNF-α-t, amely a csontvelőben proapoptotikus környezet kialakulásához, és a vérképző sejtek fokozott pusztulásához vezet )(Tauro és mtsai, 2002). A myeloma multiplex (MM) csontvelői plazmasejtek monoklonális, daganatos proliferációja (Hideshima és mtsai, 2004). Progresszióját csontléziók kialakulása és monoklonális immunglobulin (paraprotein) szaporulat jellemzi. A kiindulási sejt ismeretlen, de valószínűleg egy nagyon korai B-sejt alak. A betegek stromasejtjei a normálisnál nagyobb mennyiségű IL-6-ot termelnek, ezzel elősegítve a daganatos Bsejtek fennmaradását és proliferációját (Wallace és mtsai, 2001) A stromasejtek megfigyelését a frissen szeparált csontvelő vizsgálatával kezdtük. Mind az MDSes, mind az MM-es betegek, mind pedig egészséges donorok esetében kolóniatesztet végeztünk, amely kimutatta, hogy az MDSes betegek – és kisebb mértékben az MM-es betegek - esetében a kolóniaképző sejtek gyakorisága alacsonyabb a normálisnál. Ezután a beteg és az egészséges csontvelőkből is MSC tenyészetet hoztunk létre. Ennek során megfigyelhető volt, hogy a myelodysplasiások mesenchymális sejtjeinek osztódási képessége csökkent, és a szeneszcencia is hamarabb bekövetkezett ezekben a tenyészetekben. Az MM-es betegek stromája az egészséges sejtekhez hasonlóan viselkedett, nem mutatott károsodást. A vérképzést támogató képességet macskakő kultúrában vizsgáltuk, és azt találtuk, hogy a myelodysplasiások stromája kevésbé képes támogatni a vérképző sejtek osztódását és differenciálódását, ugyanis nem csak az eleve beteg myelodysplasiás csontvelői sejtek, hanem az egészséges donoroktól származók sem növekedtek megfelelően az MDS-es stromarétegen – ezzel szemben a myelomás stroma vérképzést támogató képessége nem tért el szignifikánsan az egészséges értékektől. Az MDS-es betegek jelentős részében az MSCk plaszticitása is jelentősen csökkent az egészséges donorokéhoz képest: nem csak az az in vitro vérképzést támogató képességben mutatkozik ez a kifejezett csökkenés, hanem az adipocyta irányú differenciálódásban is. Egyedül az in vitro csont irányú differenciálódásban nem volt
76
különbség a két csoport között. A myeloma multiplexes betegek MSC-inek plaszticitása a vérképzést támogató stroma mellett csont- és zsír irányba is megfelelő volt. Az MDS-es stroma vizsgálatával nyert megfigyelések egybevágnak számos korábbi tanulmány eredményeivel. Shetty és mtsai (2002) megnövekedett apoptózist, fagocitózist és lefűződött sejtmag fragmentumokat találtak a myelodysplasiás betegek stromasejtjeiben. Emellett a csontvelői mikrokörnyezet citokinprofiljának súlyos megváltozását is leírták MDS esetében (Tennant és mtsai, 2000), Flores-Figueroa és mtsai (2005) pedig kromoszóma rendellenességeket is találtak az MDS-es betegek stromájában. A fentieket összefoglalva tehát valószínűnek látszik, hogy a mikrokörnyezet károsodása részt vesz az MDS patogenezisében. Feltételezzük, hogy a myelodysplasiára jellemző vérképzési „mintázat” a defektív, hibás stroma és a transzformálódott vérképző klón közötti kóros interakció eredménye. A stroma defektusát okozhatja az MDSes betegek MSCinek felgyorsult öregedése és korai szeneszcenciája. Ezzel szemben a MM oka valószínűleg valóban kizárólag a hibás vérsejt klónban keresendő, a stroma érintettsége nem bizonyítható. Így elmondhatjuk, hogy a vérképzőszervi megbetegedések egy részében a stroma sokkal fontosabb szerepet játszik, mint ahogy eddig feltételezték, azonban nem minden esetben figyelhetjük meg az őssejt niche kóros elváltozását.
77
6. Következtetések Összefoglalásként tehát megállapíthatjuk, hogy:
1. A csontvelői vérképző ős- és elődsejtek ciklofoszfamiddal és G-CSF-el indukált mobilizációja rekombináns galektin-1-el erőteljesen gátolható. Ez elsősorban az ős,
és
a
gyulladási
folyamatok
szempontjából
fontos,
myeloid
(granulocyta/makrofág) irányba elkötelezett elődsejtek vérbe történő kiáramlását érinti. A lektin a sejtek transzendotheliális migrációját gátolja, kemotaxisukat nem befolyásolja, és – az alkalmazott koncentrációban - nem is toxikus a vérképző sejtekre.
2. Frissen izolált, szingén csontvelő és szingén vagy allogén MSC-k egyidejű adásával az STZ-indukált 1-es típusú diabetes gyógyítható. Egyetlen kotranszplantációs injekció helyreállítja a kísérleti állatok vércukor- és a szérum inzulinszinjét, egyidejűleg biztosítja a pancreas regenerációját. Az újjáépült Langerhans-szigetekben azonban nem találtunk donor eredetű sejteket. A szövetregeneráció tehát nem közvetlenül a graftból történt, hanem egy endogén regenerációs
folyamatot
eredménye.
Ugyanakkor
az
MSC-kkel
(is)
transzplantált egerek hasnyálmirigyében az STZ-indukált diabetes kialakulását kísérő autoreaktív T-sejt válasz is elmaradt. A gyógyulás hátterében tehát feltehetően két párhuzamos folyamat húzódik meg. A csontvelői vérképző sejtek és az MSC-k megindítják a szervezet saját inzulin-termelő sejtjeinek regenerációját és – ezzel párhuzamosan - az MSC-k gátolják az újonnan képződő β-sejtek elleni T-sejtes immunválaszt.
3. Az egészséges emberek MSC-iből kialakított stroma tenyészetek jól növekednek in vitro, érett állapotban konfluensek és minden vizsgált irányba jól differenciálódnak. Ezzel szemben a myelodysplasiás strómák morfológiailag kevésbé egységes képet mutatnak, lassabban növekednek, erősen apoptotikusak és általában nem érik el a konfluenciát. Jelentős mennyiségű adipocyta keletkezését is csak néhány MDS beteg stromájában sikerült indukálni. Vérképzést támogató képességük gyakran szintén rosszabb, mint az egészséges
78
emberek csontvelőjéből kialakított stroma rétegeké. MDS-ben tehát valószínűleg a stroma – illetve az azt létrehozó MSC-k - betegsége az elsődleges, ezek fokozott öregedése teszi lehetővé egy beteg vérképző klón „elszabadulását”, a myeloproliferatív kórkép kialakulását.
79
7. Összefoglalás 7.1 Összefoglalás Elsőként egy erős immunszuppresszív és gyulladáscsökkentő aktivitással rendelkező, a mesenchymális őssejtek (MSC) által nagy mennyiségben termelt endogén lektinnek, a galektin-1-nek a vérképző ős- és progenitorsejtek Cy/G-CSF-indukált mobilizációjára gyakorolt hatását vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy rekombináns galektin-1 adásával erőteljesen gátolható a vérképző sejtek kiáramlása a csontvelőből (mobilizáció) és –ezzel párhuzamosan – csökken a perifériás monocytózis és neutrofília is. A galektin-1 hatása a sejtek transzendotheliális migrációjának gátlásán alapul, életképességüket és in vitro mérhető kemotaktikus aktivitásukat nem befolyásolja. Ez részben megmagyarázza a lektin in vivo megfigyelhető erőteljes gyulladáscsökkentő hatásának mechanizmusát. Munkánk következő részében egy olyan őssejtterápiás eljárást dolgozunk ki, amely alkalmas egerek STZ-vel indukált (1-es típusú) diabetesenek gyógyítására. A cukorbeteg állatokat 106 frissen izolált csontvelői magvas sejt (vérképző ős- és progenitor sejtek), valamint 105 in vitro kultúrában felszaporított MSC egyidejű adásával kezeltük. A beavatkozás eredményeként a vércukor- és szérum inzulin szint gyors normalizálódását, valamint a hasnyálmirigy szigetek regenerációját figyeltük meg. Önmagában sem az MSC, sem a vérképző őssejt kezelés nem volt hatásos. A regenerációban nem lehet szerepe a beadott őssejtek transzdifferenciációjának, mivel a gyógyult állatokban soha nem sikerült donor eredetű β-sejteket kimutatni. Ezért úgy gondoljuk, hogy a kombinált kezelés sikerének kulcsa az, hogy a kétféle őssejttípus egymás hatását egészíti ki a cukorbetegség gyógyításában. Amellett, hogy a beadott sejtek elősegítik a beteg hasnyálmirigyének endogén regenerációját, a mesenchymális őssejtek egyedülálló immunológiai tulajdonságaik révén képesek megakadályozni, hogy az immunrendszer újra és újra elpusztítsa a keletkező β-sejteket, így biztosítva végleges gyógyulást. Végül, mivel a vérképző őssejtek csak az MSC eredetű stromasejtek által létrehozott speciális mikrokörnyezetben, az „őssejt niche”-ben képesek normális működésre, két, a vérképző rendszert érintő betegség (myelodysplasiás szindróma (MDS) és myeloma multiplex (MM) esetében megvizsgáltuk, hogy a hibás vérképző klón önmagában okozza-e a problémát, vagy esetleg bizonyos esetekben a stroma
80
megváltozása is szerepet játszik a betegség kialakulásában? Megállapítottuk, hogy MDS esetében a betegek stromájának mind a vérképzést támogató képessége, mind a plaszticitása elmaradt az egészséges mesenchymális sejtekétől. MM-es betegeknél ugyanez nem volt megfigyelhető. Az MDS tehát – szemben a MM-el - egy olyan betegség, ami nem csak egy vérképző klón hibás működésére, illetve neoplasztikus transzformációjára vezethető vissza. Ezeknek a betegeknek a csontvelői stromája is beteg, ami véleményünk szerint MSC-ik idő előtti öregedésére vezethető vissza.
81
7.2 Summary In the first part of our work, we examined the effect of gal-1, an endogenous lectin with strong immunosuppressive and anti-inflammatory properties, on Cy/G-CSFinduced mobilization of hematopoietic stem- and progenitor cells. We observed, that gal-1 dramatically inhibited HPC migration to the periphery, as well as decreased peripheral monocytosis and neutrophilia. Effect of gal-1 is based on the inhibition of transendothelial migration, without any effect on the viability or chemotactic ability of the cells. This might contribute to the strong anti-inflammatory effects of the protein under in vivo conditions. In the second part of our work, we developed a method for the stem cell therapy of STZ-induced diabetes in mice. Diabetic animals were injected with a combination of 106 freshly isolated BMCs and 105 cultured MSCs. The treatment resulted in the rapid normalization of blood sugar and serum insulin levels, and regeneration of the pancreatic islets. Neither MSC or BMC transplantation was effective alone. Regeneration was not due to transdifferentiation of the transplanted cells, since no donor-derived β-cells were found in the recovered animals. Therefore, we suggest that the two cell types cooperate in the treatment of diabetes: BMCs and MSCs induce the endogenous regeneration of the recipient’s pancreas, while MSCs inhibit T-cell mediated immune response against newly formed β-cells, thus providing the possibility of total recovery. Finally, since HSCs can sustain normal hematopoiesis only in the special microenvironment (called stem cell niche) provided by MSCs, we examined two diseases affecting the hematopoietic system: myelodysplastic syndromes (MDS) and myeloma multiplex (MM), in order to find out, whether these syndroms are caused by the altered hematopoietic clone alone, or defects of the stromal cells might also contribute to the onset of the disease. In the case of MDS, we found that both myelosupportive ability, and plasticity of the stromal cells decreased in comparision to normal MSCs. In MM patients however, no such alterations could be observed. According to these results, our conclusion is that MDS –unlike MM- is caused not only by the neoplastic transformation of a hematopoietic cell clone, but also an alteration of the stromal cells contributes to the disease. These alterations in the MSCs are consistent with those that are observed during the aging of stromal cells.
82
8. Irodalomjegyzék
Aggarwal S, Pittenger MF.: Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses, 2005; Blood, 105:1815-22.
Aizawa S, Nakano M, Iwase O, Yaguchi M, Hiramoto M, Hoshi H, Nabeshima R, Shima D, Handa H, Toyama K: Bone marrow stroma from refractory anemia of myelodysplastic syndrome is defective in its ability to support normal CD34-positive cell proliferation and differentiation in vitro, 1999; Leukemia Research, 23: 239-246
Albera C, Polak JM, Janes S, Griffiths MJ, Alison MR, Wright NA, Navaratnarasah S, Poulsom R, Jeffery R, Fisher C, Burke M, Bishop AE: Repopulation of human pulmonary epithelium by bone marrow cells: a potential means to promote repair, Tissue Eng., 2005; 11(7-8):1115-21.
Alison MR, Poulsom R, Otto WR, Vig P, Brittan M, Direkze NC, Preston SL and Wright NA: Plastic adult stem cells: will they graduate from the school of hard knocks?, 2003; Journal of Cell Science, 116: 599-603.
Anjos-Afonso F, Siapati EK and Bonnet D: In vivo contribution of murine mesenchymal stem cells into multiple cell-types under minimal damage conditions, 2004; Journal of Cell Science, 117: 5655-5664.
Anker PS, Noort WA, Scherion SA, Kleijburg-van der Keur C, Kruisselbrink AB, van Bezooijen RL, Beekhuizen W, Willemze R, Kanhai HH, Fibbe WE: Mesenchymal stem cells in human second-trimester bone marrow, liver, lung, and spleen exhibit a similar immunophenotype but a heterogenous multilineage differentiation potential, 2003; Haematologica 88(08): 845-852.
Augello A, Tasso R, Negrini SM, és mtsai: Bone marrow mesenchymal progenitor cells inhibit lymphocyte proliferation by activation of the programmed death-1 pathway, 2005; Eur. J. Immunol, 35: 1482-1490.
83
Augello A, Tasso R, Negrini SM, Cancedda R, Pennesi G.: Cell therapy using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells prevents tissue damage in collageninduced arthritis, 2007; Arthritis Rheum.;56:1175-86.
Baksh D, Song L, Tuan RS: Adult mesenchymal stem cells: characterisation, differentiation, and application in cell and gene therapy, 2004; Journal of Celular and Molecular Medicine, 8 (3): 301-316.
Banerjee M, Kumar A, Bhonde RR.: Reversal of experimental diabetes by multiple bone marrow transplantation, 2005; Biochem Biophys Res Commun., 328(1):318-25.
Bang OY, Lee JS, Lee PH, Lee G: Autologous mesenchymal stem cell transplantation in stroke patients, 2005; Ann Neurol, 57(6):874-82.
Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, Ferrer K, McIntosh K, Patil S, Hardy W, Devine S, Ucker D, Deans R, Moseley A, Hoffman R: Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo, 2002; Exp Hematol, 30(1):42-8.
Baum LG, Blackall DP, Arias-Magallano S, Nanigian D, Uh SY, Browne JM, Hoffmann D, Emmanouilides CE, Territo MC, Baldwin GC.: Amelioration of graft versus host disease by galectin-1, 2003; Clin Immunol., 109(3):295-307.
Bianco P and Robey PG: Marrow Stromal Stem Cells, 2000; The Journal of Clinical Investigation, 105 (12): 1663-1668
Bianco P, Riminucci M, Gronthos S, Robey PG: Bone Marrow Stromal Stem Cells: Nature, Biololgy, and Potential Applications, 2001; Stem Cells, 19: 180-192
Bonner-Weir S, Sharma A: Pancreatic stem cells, 2002; J. Pathol, 197 (4):519−526
Bunnell BA, Deng W, Robinson CM, Waldron PR, Bivalacqua TJ, Baber SR, Hyman AL, Kadowitz PJ: Potential application for mesenchymal stem cells in the treatment of cardiovascular diseases, 2005; Can J Physiol Pharmacol, 83(7):529-39.
84
Caplan AI.: Mesenchymal stem cells: cell-based reconstructive therapy in orthopedics, 2005; Tissue Eng, 11(7-8):1198-211.
Caplan AI, Dennis JE: Mesenchymal stem cells as trophic mediators, 2006; J Cell Biochem, 98(5):1076-84.
Chamberlain G, Fox J, Ashton B, Middleton J: Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing, 2007; Stem Cells, 25(11):2739-49.
Chen LB, Jiang XB, Yang L: Differentiation of rat marrow mesenchymal stem cells into pancreatic islet beta-cells, 2004; World J Gastroenterol, 10(20):3016-20.
Corcione A, Benvenuto F, Ferretti E, és mtsai: Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions, 2006; Blood, 107: 367-372.
Deb KD, Sarda K.J: Human embryonic stem cells: preclinical perspectives.2008; Transl Med., 6:7.
Di Nicola M, Carlo-Stella C, Magni M, Milanesi M, Longoni PD, Matteucci P, Grisanti S, Gianni AM: Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli, 2002; Blood, 99(10):3838-43.
Djouad F, Plence P, Bony C, Tropel P, Apparailly F, Sany J, Noël D, and Jorgensen C: Immunosuppressive effect of mesenchymal stem cells favors tumor growth in allogeneic animals, 2003; Blood, 102(10): 3837-3844
Djouad F, Fritz V, Apparailly F, Louis-Plence P, Bony C, Sany J, Jorgensen C, Noel D.: Reversal of the immunosuppressive properties of mesenchymal stem cells by tumor necrosis factor alpha in collagen-induced arthritis, 2005; Arthritis Rheum, 52:1595-603.
85
Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D, Deans R, Keating A, Prockop Dj, Horwitz E: Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement, 2006; Cytotherapy, 8(4):315-7.
Dor Y: Beta-cell proliferation is the major source of new pancreatic beta cells, 2006; Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 2(5):242-3.
Donath, MY, Halban PA: Decreased β-cell mass in diabetes: significance, mechanisms and therapeutic implications, 2004; Diabetologia, 47: 581−589.
Fajka-Boja R, Szemes M, Ion G, Légrádi A, Caron M, Monostori E: Receptor tyrosine phosphatase, CD45 binds galectin-1 but does not mediate its apoptotic signal in T cell lines, 2002; Immunol Lett, 82(1-2):149-54.
Ferber S, Halkin A, Cohen H, Ber I, Einav Y, Goldberg I, Barshack I, Seijffers R, Kopolovic J, Kaiser N, Karasik A: Pancreatic and duodenal homeobox gene 1 induces expression
of
insulin
genes
in
liver
and
ameliorates
streptozotocin-induced
hyperglycemia, 2000; Nature Med, 6(5):568−572.
Flores-Figueroa E, Arana-Trejo R. Gutiérrez-Espindola G, Pérez-Cabrera A, Mayani H: Mesenchymal stem cells in myelodysplastic syndromes: phenotypic and cytogenetic characterization, 2005; Leuk. Res., 29: 215-224.
Forbes SJ, Vig P, Poulsom R, Wright NA and Aliston MR: Adult stem cell plasticity: new pathways of tissue regeneration become visible, 2002; Clinical Science, 103: 355369
Fischbach GD and Fischbach RL: Stem cells: science, policy, and ethics, 2004; The Journal of Clinical Investigetion, 114(10): 1364-1370
Galamb O, Molnár B, Sipos F, és Tulassay Zs.: A humán szöveti (felnőtt) őssejtek kutatása és klinikai alkalmazási lehetőségei, 2003; Orvosi Hetilap, 144 (46): 2263-2270
86
Gao J, Dennis JE, Muzic RF, Lundberg M, Caplan AI: The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion, 2001; Cells Tissues Organs, 169(1):12-20.
Gerdoni E, Gallo B, Casazza S, Musio S, Bonanni I, Pedemonte E, Mantegazza R, Frassoni F, Mancardi G, Pedotti R, Uccelli A.: Mesenchymal stem cells effectively modulate pathogenic immune response in experimental autoimmune encephalomyelitis, 2007; Ann Neurol. 61:219-27.
Gerecht-Nir S, Itskovitz-Eldor J.: The promise of human embryonic stem cells, 2004; Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol, 18(6):843-52
Gruen L, Grabel L. : Concise review: scientific and ethical roadblocks to human embryonic stem cell therapy, 2006; Stem Cells, 24(10):2162-9.
Hadjantonakis AK, Gertsenstein M, Ikawa M, Okabe M, Nagy A: Generating green fluorescent mice by germline transmission of green fluorescent ES cells, 1998; Mech Dev, 76(1-2):79-90.
Hall B, Andreeff M, Marini F: The participation of mesenchymal stem cells in tumor stroma formation and their application as targeted-gene delivery vehicles, 2007; Handb Exp Pharmacol, (180):263-83.
Hao E, Tyrberg B, Itkin-Ansari P, Lakey JR, Geron I, Monosov EZ, Barcova M, Mercola M, Levine F: Beta-cell differentiation from nonendocrine epithelial cells of the adult human pancreas, 2006; Nat Med, 12(3):310-6
He J, Baum LG: Endothelial cell expression of galectin-1 induced by prostate cancer cells inhibits T-cell transendothelial migration, 2006; Lab Invest, 86(6):578-90.
Heissig B, Hattori K, Dias S, Friedrich M, Ferris B, Hackett NR, Crystal RG, Besmer P, Lyden D, Moore MA, Werb Z, Rafii S: Recruitment of stem and progenitor cells from the bone marrow niche requires MMP-9 mediated release of kit-ligand, 2002; Cell. 109(5):625-37.
87
Herold KC, Hagopian W, Auger JA, Poumian-Ruiz E, Taylor L, Donaldson D, Gitelman SE, Harlan DM, Xu D, Zivin RA, Bluestone JA: Anti-CD3 monoclonal antibody in new-onset type 1 diabetes mellitus, 2002; N Engl J Med, 346(22):1692-8.
Herzog EL, Chai L, Krause DS: Plasticity of Marrow Derived Stem Cells, 2003; Blood, 102 (10): 3483-3493
Hess D, Li L, Martin M, Sakano S, Hill D, Strutt B, Thyssen S, Gray DA, Bhatia M: Bone marrow-derived stem cells initiate pancreatic regeneration, 2003; Nat Biotechnol, 21(7):763-70.
Hideshima T, Bergsagel PL, Kuehl WM, Anderson KC: Advances in biology of multiple myeloma: clinical applications, 2004; Blood, 104:3
Hirai H: Molecular Mechanisms of Myelodysplastic Sydrome, 2003; Japanese Journal of Clinical Oncology, 33(4): 153-160
Homo-Delarche F, Drexhage HA: Immune cells, pancreas development, regeneration and type 1 diabetes, 2004; Trends Immunol, 25(5):222-229.
Horowitz EM, Prockop DJ, Gordon PL, Koo WW, Fitzpatrick LA, Neel MD, McCarville ME, Orchard PJ, Pyeritz RE, Brenner MK: Clinical responses to bone marrow transplantation in children with severe osteogenesis imperfecta, 2001; Blood, 97: 1227-1231.
Horwitz MS, Ilic A, Fine C, Rodriguez E, Sarvetnick N: Presented antigen from damaged pancreatic beta cells activates autoreactive T cells in virus-mediated autoimmune diabetes, 2002; J Clin Invest. 2002, 109(1):79-87.
Ianus A, Holz GG, Theise ND, Hussain MA: In vivo derivation of glucose-competent pancreatic endocrine cells from bone marrow without evidence of cell fusion, 2003; J. Clin. Invest, 111(6): 843–850.
88
Ilarregui JM, Bianco GA, Toscano MA, Rabinovich GA: The coming of age of galectins as immunomodulatory agents: impact of these carbohydrate binding proteins in T cell physiology and chronic inflammatory disorders, 2005; Ann Rheum Dis, 64:96– 103.
Ion G, Fajka-Boja R, Toth GK, Caron M, Monostori E: Role of p56lck and ZAP70mediated tyrosine phosphorylation in galectin-1-induced cell death, 2005; Cell Death Differ, 12:1145–1147.
Ion G, Fajka-Boja R, Kovács F, Szebeni G, Gombos I, Czibula A, Matkó J, Monostori E: Acid sphingomyelinase mediated release of ceramide is essential to trigger the mitochondrial pathway of apoptosis by galectin-1, 2006; Cell Signal, 18(11):1887-96.
Izumida Y, Aoki T, Yasuda D, Koizumi T, Suganuma C, Saito K, Murai N, Shimizu Y, Hayashi K, Odaira M, Kusano T, Kushima M, Kusano M: Hepatocyte growth factor is constitutively produced by donor-derived bone marrow cells and promotes regeneration of pancreatic beta-cells, 2005; Biochem Biophys Res Commun, 333(1):273-282
Javazon EH, Beggs KJ, and Flake AW: Mesenchymal stem cells: paradoxes of passaging, 2004; Experimantal Haematology 2004; 32: 414-425
Jiang Y, Vaessen B, Lenvik T, Blackstad M, Reyes M, and Verfaille CM: Multipotent progenitor cells can be isolated from postnatal murine bone marrow, muscle and brain, 2002; Experimental Haematology, 30: 896-904
Jiang XX, Zhang Y, Liu B, Zhang SX, Wu Y, Yu XD, Mao N.: Human mesenchymal stem cells inhibit differentiation and function of monocyte-derived dendritic cells, 2005; Blood, 105:4120-6.
Jones PM, Courtney ML, Burns CJ, Persaud SJ: Cell-based treatments for diabetes, 2008; Drug Discov Today, doi: 10.1016/j.drudis.200806.014
Kadri T, Lataillade JJ, Doucet C, et al: Proteomic study of Galectin-1 expression in human mesenchymal stem cells, 2005; Stem Cells Dev,14:204–212.
89
Kiesel U, Kolb H: Low-dose streptozotocin-induced autoimmune diabetes is under the genetic control of the major histocompatibility complex in mice, 1982; Diabetologia, 23(1):69-71.
Kilpatrick DC: Animal lectins: a historical introduction and overview, 2002; Biochem Biophys Acta,1572:187–197.
Kucia M, Reca R, Miekus K, Wanzeck J, Wojakowski W, Janowska-Wieczorek A, Ratajczak J, Ratajczak MZ: Trafficking of normal stem cells and metastasis of cancer stem cells involve similar mechanisms: pivotal role of the SDF-1-CXCR4 axis, 2005; Stem Cells, (7):879-94.
La M, Cao TV, Cerchiaro G, Chilton K, Hirabayashi J, Kasai K, Oliani SM, Chernajovsky Y, Perretti M.: A novel biological activity for galectin-1: inhibition of leukocyte-endothelial cell interactions in experimental inflammation, 2003; Am J Pathol, 163(4):1505-15.
Lammert E, Cleaver O, Melton D: Role of endothelial cells in early pancreas and liver development, 2003; Mech Dev, 120(1):59-64.
Lapidot T and Petit I: Current understanding of stem cell mobilization: The roles of chemokines, proteolytic enzymes, adhesion molecules, cytokines and stromal cells, 2002; Experimental Hematology, 30: 973-981
Le Blanc K, Tammik L, Sundberg, B és mtsai: Mesenchymal stem cells inhibit and stimulate mixed lymphocyte cultures and mitogenic responses independently of the major histocompatibility complex, 2003; Scand. J. Immunol., 57: 11-20
Le Blanc K, Rasmusson I, Sundberg B, Götherström C, Hassan M, Uzunel M, Ringdén O: Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells 2004; The Lancet, 363(9419):1439-41.
90
Le Blanc K és Ringden O: Mesenchymal stem cells: properties and role in clinical bone marrow transplantation, 2006; Curr. Opin. Immunol, 18: 586-591.
Lee RH, Seo MJ, Reger RL, Spees JL, Pulin AA, Olson SD, Prockop DJ: Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice, 2006; Proc Natl Acad Sci U S A, 103(46):17438-43.
Leschner A and Habener JF: Bone marrow stem cells find a path to the pancreas, 2003; Nature Biotechnology, 21 (7): 755-756
Li FX, Zhu JW, Tessem JS, Beilke J, Varella-Garcia M, Jensen J, Hogan CJ, DeGregori J: The development of diabetes in E2f1/E2f2 mutant mice reveals important roles for bone marrow-derived cells in preventing islet cell loss, 2003; Proc Natl Acad Sci U S A, 100(22):12935-40.
Li Z, Li L: Understanding hematopoietic stem-cell microenvironments, 2006; Trends Biochem Sci, 31(10):589-95. Like AA, Rossini AA: Streptozotocin-induced pancreatic insulitis: new model of diabetes mellitus, 1976; Science, 193(4251):415-7.
Liu H, Gronthos S és Shi S: Dental Pulp Stem Cells, 2006; Methods in Enzimology, 419: 99-117.
Liu X, Driskell RR és Engelhardt: Stem Cells in the Lung, 2006; Methods in Enzimology, 419: 285-322.
Maccario R, Podesta M, Moretta A, és mtsai: Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation of CD4+ T-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype, 2005; Hematologica, 90: 516-525
91
Mansilla E, Marin GH, Sturla F, Drago HE, Gil MA, Salas E, Gardiner MC, Piccinelli G,
Bossi S,
Salas E, Petrelli L, Iorio G, Ramos CA, and Soratti C: Human
Mesenchymal Stem Cells Are Tolerized by Mice and Improve Skin aSpinal Cord Injuries, 2005; Transplantation Proceedings, 37: 292-294
Matarrese P, Tinari A, Mormone E, Bianco GA, Toscano MA, Ascione B, Rabinovich GA, Malorni W: Galectin-1 sensitizes resting human T lymphocytes to Fas (CD95)mediated cell death via mitochondrial hyperpolarization, budding, and fission, 2005; J Biol Chem, 280(8):6969-85.
Merani S, Shapiro AM: Current status of pancreatic islet transplantation, 2006; Clin Sci (Lond), 110(6):611-25
Minguell JJ, Erices A, and Conget P: Mesenchymal Stem Cells, 2001; Exerimental Biology and Medicine, 226 (6): 407-520
Molineux G, Pojda Z, Hampson IN, Biard L, Dexter TM: Transplantation potential of peripheral blood stem cells induced by granulocyte colony-stimulating factor, 1990; Blood, 76: 2153-2158.
Moore KA, Lemischka IR: Stem cells and their niches, 2006; Science, 311(5769):18805.
Moriscot C, de Fraipont F, Richard MJ, Marchand M, Savatier P, Bosco D, Favrot M, Benhamou PY: Human bone marrow mesenchymal stem cells can express insulin and key transcription factors of the endocrine pancreas developmental pathway upon genetic and/or microenvironmental manipulation in vitro, 2005; Stem Cells, 23(4):594-603.
Morrison SJ, Wright DE és Weissman IL: Cyclophosphamide / granulocyte colonystimulating factor induces hematopoietic stem cells to proliferate prior to mobilization, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 94: 1908-1913.
Nanji SA, Shapiro AM: Islet transplantation in patients with diabetes mellitus: choice of immunosuppression, 2004; BioDrugs, 18(5):315-28.
92
Narendran P, Estella E, Fourlanos S: Immunology of type 1 diabetes, 2005; QJM, 98(8):547-56. Németh K, Leelahavanichkul A, Yuen PS, Mayer B, Parmelee A, Doi K, Robey PG, Leelahavanichkul K, Koller BH, Brown JM, Hu X, Jelinek I, Star RA, Mezey E: Bone marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their interleukin-10 production, 2009; Nat Med, 15(1):42-9 . Offner H, Celnik B, Bringman TS, Casentini-Borocz D, Nedwin GE, Vandenbark AA: Recombinant human
-galactoside binding lectin suppresses clinical and histological
signs of experimental autoimmune encephalomyelitis, 1990; J Neuroimmunol, 28:177– 184.
Oh SH, Muzzonigro TM, Bae SH, LaPlante JM, Hatch HM, Petersen BE: Adult bone marrow-derived cells trans-differentiating into insulin-producing cells for the treatment of type I diabetes, 2004; Lab Invest, 84(5):607-17.
Oswald J, Boxberger S, Jorgensen B, Feldmann S, Ehninger G, Bornhäuser M, Werner C: Mesenchymal Stem Cells Can Be Differentiated Into Endothelial Cells In Vitro, 2004; Stem Cells, 22:377-384
Paik SG, Fleischer N, Shin SI: Insulin-dependent diabetes mellitus induced by subdiabetogenic doses of streptozotocin: obligatory role of cell-mediated autoimmune processes, 1980; Proc Natl Acad Sci U S A, 77(10):6129-33.
Panepucci RA, Siufi JL, Silva WA Jr, et al: Comparison of gene expression of umbilical cord vein and bone marrow–derived mesenchymal stem cells, 2004; Stem Cells, 22:1263–1278.
Papayannopoulou T: Current mechanistic scenarios in hematopoietic stem/ progenitor cell mobilization, 2004; Blood, 103: 1580-1585
93
Peister A, Mellad JA, Larson BL, Hall BM, Gibson LF, Prockop DJ: Adult stem cells from bone marrow (MSCs) isolated from different strains of inbred mice vary in surface epitopes, rates of proliferation, and differentiation potential, 2004; Blood, 103(5):16628.
Perillo NL, Pace KE, Seilhamer JJ, Baum LG: Apoptosis of T cells mediated by galectin-1, 1995; Nature, 378:736–739.
Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, Jaiswal RK, Douglas R, Mosca JD, Moorman MA, Simonetti DW, Craig S, Marshak DR: Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells, 1999; Science, 284(5411):143-7.
Pochampally RR, Neville BT, Schwarz EJ, Li MM, and Prockop DJ: Rat adult stem cells (marrow stromal cells) engraft and differentiate in chick embryos without evidence of cell fusion, 2004; Procedings of the National Academy of Science, 101 (25): 9282 – 9285
Poirier F, Robertson EJ: Normal development of mice carrying a null mutation in the gene encoding the L14 S-type lectin, 1993; Development, 119(4):1229-36.
Prevosto C, Zancolli M, Canevali P, Zocchi MR, Poggi A: Generation of CD4+ or CD8+ regulatory T cells upon mesenchymal stem cell-lymphocyte interaction, 2007; Haematologica, 92:881-8.
Prindull G and Zipori D: Enviromental guidance of normal and tumor cell plasticity: epithelial mesenchymal transitions as a paradigm, 2004; Blood, 103 (5): 2892-2896
Rabinovich GA: Galectins: an evolutionarily conserved family of animal lectins with multifunctional properties; a trip from the gene to clinical therapy, 1999; Cell Death Differ, 6(8):711-21.
Rabinovich GA, Daly G, Dreja H, Tailor H, Riera CM, Hirabayashi J, Chernajovsky Y: Recombinant galectin-1 and its genetic delivery suppress collagen-induced arthritis via T cell apoptosis, 1999; J Exp Med, 190(3):385-98.
94
Ramasamy R, Fazekasova H, Lam EW, Soeiro I, Lombardi G, Dazzi F.: Mesenchymal stem cells inhibit dendritic cell differentiation and function by preventing entry into the cell cycle, 2007; Transplantation, 83:71-6.
Rasmusson I, Le Blanc K, Sundberg B és mtsai: Mesenchymal stem cells stimulate antibody secretion in human B cells, 2007; Scand. J. Immunol, 65: 336-343.
Reh TA és Fischer AJ: Retinal Stem Cells, 2006; Methods in Enzimology, 419: 52-73.
Rietze RL és Reynolds BA: Neural Stem Cell Isolation and Characterization, 2006; Methods in Enzimology, 419: 3-23.
Rojas M, Xu J, Woods CR, Mora AL, Spears W, Roman J, Brigham KL.Bone marrowderived mesenchymal stem cells in repair of the injured lung, 2005; Am J Respir Cell Mol Biol, Aug;33(2):145-52.
Rudnicki MA: Marrow to muscle, fission versus fusion, 2003; Nature Medicine, 9 (12): 1461-1462
Ryan JM, Barry F, Murphy JM, és mtsai: Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection, 2005; J. Inflamm. (Lond), 8,8 Ryan EA, Paty BW, Senior PA, Bigam D, Alfadhli E, Kneteman NM, Lakey JR, Shapiro AM: Five-year follow-up after clinical islet transplantation, 2005; Diabetes, 54(7):20609.
Sanchez-Ramos JR: Neural Cells Derived from Adult Bone Marrow and Umbilical Cord Blood, 2002; Journal of Neuroscience Research, 69: 880-893
Santucci L, Fiorucci S, Cammilleri F, Servillo G, Federici B, Morelli A: Galectin-1 exerts immunomodulatory and protective effects on concanavalin A-induced hepatitis in mice, 2000; Hepatology, 31(2):399-406
95
Santucci L, Fiorucci S, Rubinstein N, Mencarelli A, Palazzetti B, Federici B, Rabinovich GA, Morelli A: Galectin-1 suppresses experimental colitis in mice, 2003; Gastroenterology, 124(5):1381-94.
Seaberg RM, Smukler SR, Kieffer TJ, Enikolopov G, Asghar Z, Wheeler MB, Korbutt G, van der Kooy D: Clonal identification of multipotent precursors from adult mouse pancreas that generate neural and pancreatic lineages, 2004; Nature Biotechnology, 22(9):1115 – 1124.
Sherry NA, Kushner JA, Glandt M, Kitamura T, Brillantes AM, Herold KC: Effects of autoimmunity and immune therapy on beta-cell turnover in type 1 diabetes, 2006; Diabetes, 55(12):3238-45.
Shetty V, Hussaini S, Alvi S, et al: Excessive apoptosis, increased phagocytosis, nuclear inclusion bodies and cylindrical confronting cisternae in bone marrow biopsies of myelodysplastic syndrome patients, 2002; Br J Haematol, 116: 817-825.
Smith PL, Buffington DA és Humes HD: Kidney Epithelial Cells, 2006; Methods in Enzimology, 419:194-208.
Sotiropoulou PA, Perez SA, Gritzapis AD, Baxevanis CN, Papamichail M: Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells, 2006; Stem Cells, 24:74-85.
Spaggiari GM, Capobianco A, Becchetti S és mtsai: Mesenchymal stem cell – natural killer cell interactions: evidence that activated NK cells are capable of killing MSCs, whereas MSCs can inhibit IL-2-induced NK-cell proliferation, 2006; Blood, 107: 14841490.
Steensma DP, Tefferi A: The myelodysplastic syndrome(s): a perspective and review highlighting current controversies, 2003; Leuk Res 27: 95-120.
96
Tang DQ, Cao LZ, Burkhardt BR, Xia CQ, Litherland SA, Atkinson MA, and Yang LJ: In Vivo and In Vitro Characterization of Insulin-Producing Cells Obtained From Murine Bone Marrow, 2004; Diabetes, 53: 1721-1732
Tauro S, Hepburn MD, Peddie CM, Bowen DT és Pippard MJ: Functional disturbance of marrow stromal microenviroment in the myelodysplastic syndromes, 2002; Leukemia, 16: 785-790
Tennant GB, Walsh V, Truran LN, Edwards P, Mills KI és Burnett AK: Abnormalities of adherent layers grown from bone marrow of patients with myelodysplasia, 2000; British Journal of Haematology, 111: 853-862.
Tessem JS and DeGregori J: Roles for bone-marrow-derived cells in β-cell maintenance, 2004; TRENDS in Molecular Medicine, 10 (11): 558-564
Uccelli A, Moretta L, Pistoia V: Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells, 2006; Eur J Immunol, 36(10):2566-73.
Urbán VS, Kiss J, Kovács J, Gócza E, Vas V, Monostori E, Uher F: Mesenchymal stem cells cooperate with bone marrow cells in therapy of diabetes, 2008; Stem Cells, 26(1):244-53. Epub 2007 Oct 11.
Vardiman JW, Harris NL, Brunning RD: The World Health Organization (WHO) classification of the myeloid neoplasms, 2002; Blood, 100: 2292-2302.
Vas V, Fajka-Boja R, Ion G, Dudics V, Monostori E, Uher F: Biphasic effect of recombinant galectin-1 on the growth and death of early hematopoietic cells, 2005; Stem Cells, 23(2):279-87.
Wallace SR, Oken MM, Lunetta KL, Panoskaltsis-Mortari A, Masellis AM: Abnormalities of Bone Marrow Mesenchymal Cells in Multiple Myeloma Patients, 2001; Cancer, 91 (7): 1219-1230
97
Xu J, Woods CR, Mora AL, Joodi R, Brigham KL, Iyer S, Rojas M.: Prevention of Endotoxin-Induced Systemic Response by Bone Marrow Derived Mesenchymal Stem Cells in Mice, 2007; Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 293: 131-141
Yin T, Li L: The stem cell niches in bone, 2006; J Clin Invest, 116(5):1195-201
Zalzman M, Gupta S, Giri RK, Berkovich I, Sappal BS, Karnieli O, Zern MA, Fleischer N, Efrat S: Reversal of hyperglycemia in mice by using human expandable insulinproducing cells differentiated from fetal liver progenitor cells, 2003; Proc Natl Acad Sci USA, 100 (12): 7253−7258.
Zhang L, Hu J, Hong TP, Liu YN, Wu YH, Li LS: Monoclonal side population progenitors isolated from human fetal pancreas, 2005; Biochem Biophys Res Commun, 333(2):603-608.
Zhu W, Xu W, Jiang R, Qian H, Chen M, Hu J, Cao W, Han C, Chen Y: Mesenchymal stem cells derived from bone marrow favor tumor cell growth in vivo, 2006; Exp Mol Pathol, 80(3):267-74.
Zimmet JM, Hare JM: Emerging role for bone marrow derived mesenchymal stem cells in myocardial regenerative therapy, 2005; Basic Res Cardiol, 100(6):471-81.
Zipori D: The nature of stem cells: state rather than entity, 2004; Nature reviews / Genetics, 5: 873-878
Zoumbos NC: The pathogenesis of myelodysplastic syndromes 2001; Haema, 4(3): 151-157
Zuk PA, Zhu M, Mizuno H, Huang J, Futrell JW, Katz AJ, Benhaim P, Lorenz HP, Hedrick MH: Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies, 2001; Tissue Eng, (2):211-28.
98
9. Publikációk jegyzéke A disszertációhoz kapcsolódó közlemények: 1. Urbán S. Veronika, Kiss Judit, Vas Virág, Kovács János, Uher Ferenc: A diabetes mellitus őssejtterápiája: eredmények, lehetőségek,és kérdőjelek, 2006; Orvosi Hetilap, 147:791-797. 2. Zsuzsanna Kertész, Virág Vas, Judit Kiss, Veronika S. Urbán, Éva Pozsonyi, András Kozma, Katalin Pálóczi, Ferenc Uher: In vitro expansion of long-term repopulating hematopoetic stem cells in the presence of immobilized Jagged-1 and early acting cytokines, 2006; Cell Biology International, 30: 401-405. (IF=1,36) 3. Judit Kiss, Aliz Kunstár, Roberta Fajka-Boja, Valéria Dudics, József Tóvári, Ádám Légrádi, Éva Monostori and Ferenc Uher: Function of Human Galectin-1: Inhibition of Hematopoietic Progenitor cell mobilization, 2007; Experimental Hematology, 35: 305-313 (IF=3,15) 4. Gergely Varga, Judit Kiss, Judit Várkonyi, Virág Vas, Péter Farkas, Katalin Pálóczi and Ferenc Uher: Inappropriate Notch Activity and Limited Mesenchymal Stem Cell Plasticity in the Bone Marrow of Patients with Myelodysplastic Syndromes, 2007; Pathology Oncology Research 13: 311-319 (IF=1,27) 5. Veronika S. Urbán, Judit Kiss, János Kovács, Elen Gócza, Virág Vas, Éva Monostori, Ferenc Uher: Mesenchymal Stem Cells Cooperate with Bone Marrow Cells in Therapy of Diabetes, 2007; Stem Cells, 26: 244-253. (IF=7,74) 6. Kiss Judit, Urbán S. Veronika, Dudics Valéria, VasVirág, Uher Ferenc: A mesenchymális őssejtek és az immunrendszer – immunszuppresszió gyógyszerek nélkül, 2008; Orvosi Hetilap, 149: 339-346. 7. . Beáta Hegyi, Bernadett Sági, János Kovács, Judit Kiss, Veronika S. Urbán, Gabriella Mészáros, Éva Monostori, Ferenc Uher: Identical, similar or different? learning about immunomodulatory function of mesenchymal stem cells isolated from various mouse tissues: bone marrow, spleen, thymus and aorta wall, 2010; International Immunology, in press (IF=3,18)
IF összesen: 16, 70
99
10. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. habil. Uher Ferencnek, az Őssejt-biológiai laboratórium vezetőjének, témavezetőmnek, aki lehetővé tette, hogy az Országos Gyógyintézeti Központban / Országos Vérellátó Szolgálatnál tudományos munkát végezhessek, értékes szakmai tanácsokkal és rengeteg türelmes segítséggel látott el az évek során.
Továbbá köszönet Dr. Vas Virágnak és Dr. Suhajdáné Urbán Veronikának, akik munkám elkészítése alatt szintén az Őssejtbiológia laboratóriumban dolgoztak, a sikeres együttműködésért, és segítségükért
Külön köszönet Ullrich Olga, Renner Mária és Szigetvári Csilla asszisztenseknek a mindennapi munkám során nyújtott segítségükért.
A tudományos együttműködésért és önzetlen szakmai segítségért köszönettel tartozom:
Dr. Kovács Jánosnak (ELTE TTK Anatómiai, Sejt és Fejlődésbiológiai Tanszék) Dr. Gócza Elennek (MBK, Állatbiológiai Intézet, Gödöllő) Dr. Monostori Évának (MTA Szegedi Biológiai Központ Genetikai intézet) Dr. Varga Gergelynek (SE, III.sz. Belklinika) és Dr. Mikala Gábornak (OGYK, Haematológiai Osztály)
100
