A MASP-1 dózis-függő módon vazorelaxációt. okoz egér aortában

184.0 3531

A MASP-1 dózis-függő módon vazorelaxációt okoz egér aortában 170.8 8993

15.80

157.7 4455 minute s

144.5 9917

20.00

Volts

Vehikulum

MASP-1 0,2 μM

W

24.20 29.785970

W

23.54

23.54

28.40

Channe l 12

Channel 12 Volts

Channel 8Channel 8

Analog input

24.892985

20.00

20.00

20.000000

16.46

16.46

MASP-1 0,6 μM 157.34272

MASP-1 2 μM

15.107015

167.83224

178.32175 minutes

W

12.91 144.59917

188.81127

157.74455 minutes

22.282037

12.91 133.20846

146.52931

159.85015 minutes

133.20846

146.52931

159.85015 minutes

173.17100

W

173.17100

22.905952

20.000000

Volts

Analog input

Analog input

20.000000

157.34272

167.83224 minutes

Relaxáció (prekontrakció %)

17.717963

70

17.094048

60 15.435927

50 40

14.188097

156.53849

164.73893

172.93938 minutes

30

178.32175

188.81127

20 10 0 0

0,2

0,6

MASP-1 (μM)

2

181.13983

Endotheliális NO közvetíti a MASP-1 vazorelaxáns hatását MASP-1 0,6 μM

Vad típusú (WT) egér W

23.580729

60

Endotheliális NO-szintetáz deficiens (eNOS-KO) egér aorta 157.34272

MASP-1 0,6 μM

167.83224

W

178.32175 minutes

Volts

Relaxáció (prekontrakció %)

Analog input

20.000000

50 40 30

16.419271

20 10 12.838542

0 -10

188.81127

33.692220

***

WT Volts

Analog input

26.846110

20.000000

eNOS-KO

Thrombin hatására nem deszenzitizálódnak a MASP-1 hatását közvetítő receptorok Thrombin 0,1 U/ml

Thrombin 1 U/ml

W

Thrombin 0,1 U/ml

30.05

MASP-1 0,6 μM

W

Channel 5

Volts

Channel 1

25.03

20.00

14.97

MASP-1 165.60534

178.34421

191.08308 minutes

Thrombin 1 U/ml

203.82195

W 32.46 165.60534

178.34421

191.08308 minutes

Vehikulum

Volts

Channel 7

26.23

20.00

Signaling pathways Dobó, Schroeder, Jenny, Cervenak, Závodszky, Gál Molecular Immunology, Volume 61, Issue 2, 2014, 69 - 78 13.77

203.82195

Kis dózisú MASP-1 nem okoz deszenzitizációt MASP-1 0,2 μM

MASP-1 0,6 μM

22.88

W Volts

Channel 3

20.00

17.12

MASP-1 0,2 μM

144.59917

14.24

157.74455

170.88993

184.03531 28.40

minutes

Thrombin 0,1 U/ml

W

Volts

Channel 12

24.20

20.00

15.80

Kalmodulin és az ér-reaktivitásban fontos eNOS és MLCK enzimek kölcsönhatásának szabályozása szfingolipid mediátorokkal

Benyó Zoltán SE Klinikai Kísérleti Kutatóés Humán Élettani Intézet

Liliom Károly MTA TTK Enzimológiai Intézet

MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program konferencia Budapest, 2015. március 21.

Szfingolipid mediátorok Sph

S1P

SMase szerkezeti lipid

ceramidase

Cer

SM

SMaseD

SPC

MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 2015. március 21. Benyó-Liliom

Szfingolipid mediátorok receptorai Fluo-4 fluorescence

300

S1P–S1P1

ARG 292

GLU 121

Parrill AL, Wang D, Bautista DL, Van Brocklyn JR, Lorincz Z, Fischer DJ, Baker DL, Liliom K, Spiegel S, Tigyi G (2000) J Biol Chem 275(50):39379-84., Wang DA, Lorincz Z, Bautista DL, Liliom K, Tigyi G, Parrill AL (2001) J Biol Chem 276(52):4921320.

200

HepG2

No caged-S1P

1 µM S1P

150 100 50 1 mM ATP

0 0 200

Fluo-4 fluorescence

ARG120

250

60

120

180

240

300

40 µM caged-S1P 150

100 50 0 0

Time (s) 60

120

180

240

300

A HepG2 sejtek plazmamembránján nincsenek S1P receptorok. Meyer zu Heringdorf D, Liliom K, Schaefer M, Danneberg K, Jaggar JH, Tigyi G, Jakobs KH (2003) FEBS Lett 554(3):443-9


Melyik fehérje közvetíti az intracelluláris hatást? S1P SPC

G

GPCR

G G IP3

Sph

Ca2+

FceRI

SphK

ER

S1P

SPC

Az S1P és az SPC az IP3-receptortól függetlenül az ER thapsigarginszenzitív tartályaiból szabadítja fel a Ca2+-ionokat. A kalmodulinról ismert, hogy szabályozza az IP3-receptort. Hipotézisünk: az S1P és/vagy az SPC a kalmodulinra hatva mobilizálhatja intracellulárisan a Ca2+-ionokat.

RTK

4 Ca2+

apokalmodulin Ca2+-kalmodulin MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 2015. március 21. Benyó-Liliom

Az SPC a kalmodulin kompetitív gátlószere

Kovacs E, Tóth J, Vértessy BG, Liliom K (2010) Dissociation of calmodulin-target peptide complexes by the lipid mediator sphingosylphosphorylcholine: implications in calcium signaling. J Biol Chem 285(3):1799-808 Kovacs E, Liliom K (2008) Sphingosylphosphorylcholine as a novel calmodulin inhibitor. Biochem J 410(2):427-37 MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 2015. március 21. Benyó-Liliom

Kalmodulin kölcsönhatása szfingozinnal Affinitás + sztöchiometria Sph : CaM Kd

1. process

2. process

~300 : 1

~ 30 : 1

Sph – Ca2+-CaM kristályszerkezete

Funkcionális esszék

4.2 ± 2.6 nM 0.13 ± 0.09 µM

Sph+apoCaM

Sph : CaM Kd

1. process 2. process ~80 : 1 ~8:1 6.0 ± 1.9 nM 0.64 ± 0.20 µM

Sph+Ca2+-CaM


A kalmodulin SPC és Sph hatására zárt inhibitorikus konformációt vesz fel Sph

SPC

M13 target peptid

Kovacs E, Harmat V, Tóth J, Vértessy BG, Módos K, Kardos J, Liliom K (2010) Structure and mechanism of calmodulin binding to a signaling sphingolipid reveal new aspects of lipid-protein interactions. FASEB J 24 (10): 3829-3839 MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 2015. március 21. Benyó-Liliom

eNOS és MLCK az értónus szabályozásában S1P

szfingozin in vivo ? S1P

S1Pr PLC → Ca2+CaM → eNOS → NO

S1Pr sGC

Relaxáció

MLCK ← Ca2+CaM ← PLC

Kontrakció


A szfingozin gátolja az eNOS aktivitását in vitro

Az eNOS enzimet növekvő koncentrációjú kalmodulinnal aktiváltuk. 100 mM szfingozin mindegyik koncentrációban gátlást fejt ki.

Az eNOS enzimet közepes koncentrációjú kalmodulinnal aktiváltuk. A szfingozin koncentráció-függő módon gátolja az eNOSt.

A szfingozin gátolja a kalmodulin-függő foszfodiészterázt, kalcineurint, neuromodulint és eNOSt. MedInProt Fehérjetudományi Kiválósági Együttműködési Program, Budapest 2015. március 21. Benyó-Liliom

Szfingozin (B panel: 10 µM, D panel: 50 µM) ill. vehikulumának (A és C panelek) hatása az acetilkolin endotélium-függő vazorelaxációs hatására A

B

C

D


Szfingozin (10 µM és 50 µM) ill. vehikulumának hatása az NO-donor nátrium-nitroprusszid (SNP) vazorelaxáns hatására


Szfingozin (30 nmol/g, i.a.) hatása az artériás középnyomásra és a szívfrekvenciára 450 425

115

400

110 375

105

350

100

325

Artériás középnyomás 95

Szívfrekvencia

300 275

90 250 85

Szívfrekvencia (1/perc)

Artériás középnyomás (Hgmm)

120

225

80

200

-2

-1

0

1

2

3

4

5

6

Idő (perc)

7

8

9

10 11


A szfingozin kalmodulin-függő módon gátolja az eNOS aktivitását artéria-szeleteken ex vivo S1P Sph S1P

S1Pr Sph? PLC → Ca2+CaM → eNOS → NO S1Pr sGC

Relaxáció


Kontrakció


eNOS és MLCK az értónus szabályozásában S1P

Szfinganin ? Ceramid ? S1P

S1Pr PLC → Ca2+CaM → eNOS → NO S1Pr sGC

Relaxáció


Kontrakció


Köszönetnyilvánítás Ruisanchez Éva

Juhász Tünde

Köszönjük a MedInProt támogatását!


A MASP-1 dózis-függő módon vazorelaxációt. okoz egér aortában

Recommend Documents