A kísérletes diabétesz hatása a vékonybél és a máj eliminációs tevékenységére. PhD értekezés. Dr. Almási Attila. Pécsi Tudományegyetem

A kísérletes diabétesz hatása a vékonybél és a máj eliminációs tevékenységére

PhD értekezés

Dr. Almási Attila

Pécsi Tudományegyetem Programvezető: Prof. Dr. Fischer Emil, egyetemi tanár, MTA doktora Témavezető: Prof. Dr. Fischer Emil, egyetemi tanár, MTA doktora Prof. Dr. Perjési Pál, egyetemi tanár, PhD Gyógyszertudományi Doktori Iskola Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Barthó Loránd, egyetemi tanár, MTA doktora

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet Gyógyszerészi Kémiai Intézet Pécs

2013

1

Tartalom oldal 1. Bevezetés – Célkitűzés

8

1.1. A vékonybél és a máj eliminációs tevékenysége

8

1.2. A PNP modellvegyületként történő alkalmazása, metabolizmusa

12

1.3. Kísérletes diabétesz, hiperglikémia, inzulin

15

1.4. Célkitűzés

18

20

2. Vizsgálati módszerek

2.1. Kémiai anyagok, vegyszerek, reagensek

20

2.2. Állatkísérletek: kísérleti állatok, a vékonybél perfúziója, az epevezeték kanülálása és az epe gyűjtése, a kísérletes diabétesz

20

létrehozása 2.3.Analitikai eljárások, a minták előkészítése és mérése

21

2.3.1. A bélperfuzátumokból nyert minták analízise az általunk fejlesztett HPLC – módszerrel

21

2.3.2. Az epeminták analízise az általunk módosított HPLC – módszerrel

23

2.3.3. A vércukorszint mérése

24

2.3.4. Az enzimaktivitások meghatározása

25

2.3.4.1. Az UDP – glükuroniltranszferáz – aktivitás mérése

25

2.3.4.2. A β – glükuronidáz – aktivitás meghatározása

25

2.3.4.3. A szulfotranszferáz – aktivitás mérése

26

2.3.4.4. Az arilszulfatáz – aktivitás meghatározás

26

27

3. Számítások, statisztikai analízis 3.1 A metabolitok megjelenése a béllumenben: a PNP – G és a PNP – S mennyiségének a kiszámítása a luminális koncentráció és a perfúziós volumen alapján

27 2

3.2. A PNP – G, PNP – S és a PNP mennyiségének kiszámítása az epében a biliáris koncentráció és az epevolumen alapján

28

3.3. Az enzimaktivitások kiszámítása és kifejezése

28

3.4. Az adatok kiszámítása és prezentálása

28

3.5. A szignifikancia kiszámítása (Student – féle t – teszt)

28

29

4. Eredmények 4.1. A HPLC – vel történő mérési módszer fejlesztése, módosítása

29

4.1.1. Izokratikus RP – HPLC módszer kidolgozása és validálása, a PNP, PNP – G és a PNP – S egyidejű analizise

29

4.1.2. A PNP, PNP – G és a PNP – S retenciós idejének és a csúcsok alatti területeknek a paraméterei

29

4.1.2.1. A PNP retenciós ideje és csúcsok alatti területe bélperfúziós oldat alkalmazása esetén

30

4.1.2.2. A PNP – G retenciós ideje és csúcsok alatti területe bélperfúziós oldat alkalmazása esetén

30

4.1.2.3. A PNP – S retenciós ideje és csúcsok alatti területe bélperfúziós oldat alkalmazása esetén

31

4.1.2.4. A PNP retenciós ideje és csúcsok alatti területe az epeminták mérésénél ETP belső standarddal

31

4.1.2.5. A PNP – G retenciós ideje és csúcsok alatti területe az epeminták mérésénél ETP belső standarddal

32

4.1.2.6. A PNP – S retenciós ideje és csúcsok alatti területe az epeminták mérésénél ETP belső standarddal

32

4.2. A vékonybél és a máj eliminációs tevékenységének vizsgálata kontroll állatokban

34

4.2.1. A PNP – G megjelenése a vékonybél lumenében és az epében

34

4.2.2. Az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz enzimek aktivitása a vékonybélben és a májban

35

4.2.3. A PNP – S megjelenése a vékonybél lumenében és az epében

37

4.2.4. A szulfotranszferáz és az arilszulfatáz enzimek aktivitása a vékonybélben és a májban

38

4.3. A vércukorszint kontroll és diabéteszes állatokban

40 3

4.4. A vékonybél eliminációs tevékenységének változása kísérletes diabéteszben: metabolitok képzése és megjelenése a béllumenben

41

4.4.1. A PNP – G megjelenése a béllumenben kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében

41

4.4.2. A kísérletes diabétesz hatása az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz aktivitásra a bélben inzulin távollététben és jelenlétében

43

4.4.3. A PNP – S megjelenése a béllumenben kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében

45

4.4.4. A kísérletes diabétesz hatása a szulfotranszferáz és az arilszulfatáz aktivitásra a bélben inzulin távollétében és jelenlététben

47

4.5. A máj eliminációs tevékenységének változása kísérletes diabéteszben: metabolitok képzése és exkréciója az epével

49

4.5.1. A PNP – G biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében

49

4.5.2. A kísérletes diabétesz hatása az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz aktivitására a májban inzulin távollétében és jelenlétében

51

4.5.3. A PNP – S biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében

53

4.5.4. A kísérletes diabétesz hatása a szulfotranszferáz – és az arilszulfatáz – aktivitására a májban inzulin távollétében és jelenlétében

55

4.5.5. A PNP biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében

57

4

60

5. Megbeszélés 5.1. A HPLC – vel történő mérési módszer fejlesztése, módosítása

60

5.2. A konjugációs reakciókban résztvevő enzimek aktivitása, valamint a metabolitok intesztinális és hepatikus exkréciója közötti összefüggés kontroll állatokban

61

5.3. A kísérletes diabétesz hatása a bél és a máj eliminációs tevékenységére

64

5.3.1. A kísérletes diabétesz hatása a vékonybél eliminációs tevékenységére

66

5.3.2. A kísérletes diabétesz hatása a máj eliminációs tevékenységére

68

5.4. Az értekezésben tárgyalt kísérleti eredmények rövid összefoglalása

71

73

6. Saját közlemények és kongresszusi prezentációk

6.1. Közlemények

73

6.2. Kongresszusi prezentációk

74

7. Irodalom

77

8. Köszönetnyilvánítás

90

5

Rövidítések ADP: adenozin – 5’ – difoszfát APS: adenozin – 5’ – foszfoszulfát ATP: adenozin – trifoszfát

AUC: area under the curve (görbe alatti terület) CYP: citokrom P – 450 enzimrendszer ETP: 4 – etilfenol

GA: glükuronsav

GSH: redukált glutation GST: glutation – S – transzferáz

MDR 1: multidrug resistance protein 1 (multidrog rezisztens protein 1)

n: kísérletek száma NC: 4 – nitrokatekol

NE: nemzetközi egység PAP: 3’ – foszfoadenozin – 5’ – foszfát (adenozin – 3’,5’ – bifoszfát) PAPS: 3’ – foszfoadenozin 5’ – foszfoszulfát

6

PNP: p – nitrofenol PNP – G: p – nitrofenol – glükuronid PNP – S: p – nitrofenil – szulfát

PPi: pirofoszfát RP – HPLC: fordított fázisú magasnyomású folyadék kromatográfia

RSD: relatív standard deviáció

S.D.: standard deviáció

S.E.: standard error

STZ: streptozotocin

SULT: szulfotranszferáz TBAB: tetrabutil – ammónium – bromid

Tm: transzport maximum UDP: uridin – foszfát UDPGA: uridin – foszfoglükuronsav UDPGT: uridin – difoszfo – glükuroniltranszferáz UGT: uridin – glükuroniltranszferáz

7

1. Bevezetés – Célkitűzés

1.1. A vékonybél és a máj eliminációs tevékenysége A gyógyszerek a szájon keresztül történő bevételt követően először a gyomor – béltraktusba jutnak, majd a felszívódást követően a vena portae – n keresztül a májba kerülnek és csak ezek után érik el a szisztémás keringést, illetve a vérárammal a hatás helyét (különböző szervek, szövetek, receptorok, enzimek stb.). Ezen folyamatok során a gyógyszermolekulák

kémialiag

átalakulhatnak

(metabolizmus,

biotranszformáció)

és

kiválasztódhatnak (exkréció) mind a bélben, mind a májban (9, 39, 43, 48, 49, 64, 93), azaz eliminálódhatnak mielőtt a szisztémás keringést elérnék (preszisztémás elimináció). Másszóval a beadott gyógyszer mennyiségének csak egy, a fenti folyamatok által meghatározott része jut a szisztémás keringésbe és fejthet ki farmakológiai és terápiás hatásokat (12, 66), illetve lehet hasznos biológiai szempontból (biológiai hasznosulás, hasznosíthatóság: biovailability). A biológiai hasznosíthatóságot illetően tehát mind a bélnek, mind a májnak döntő szerepe van. A két szerv relatív jelentősége különböző tényezőktől (pl. a gyógyszer kémiai struktúrája, a metabolizmus típusa, a metabolizáló enzimek expressziója, a gyógyszer dózisa és lokális koncentrációja a bélben és a májban stb.) függően azonban eltérő, illetve változó lehet a preszisztémás eliminációban. A bélnek mindenesetre az említett tényezőkön kívül különleges és kitüntetett szerepet biztosít az a tény, hogy a per os adott gyógyszermolekulák először a béltraktust érik el, a májba és a szisztémás keringésbe csak az alkalmazott dózisnak az a része juthat, amelyik a bélben nem metabolizálódik, illetve nem választódik ki a széklettel (56, 92, 121). A bélben és a májban, illetve az enterocitákban és a hepatocitákban történő metabolikus és transzport folyamatokról az alábbi két ábra ad egy összefoglaló, sémás áttekintést.

8

1. ábra. A gyógyszerek (piros körök) és metabolitjaik (sárga körök) intesztinális exkréciója az MDR1 transzport közreműködésével

Az ábra demonstrálja azokat a lehetséges folyamatokat, amelyek a gyógyszerek per os adása során a molekulák sorsát a béltraktusban befolyásolják, illetve meghatározzák (2). A gyógyszerkészítmény (pl. tabletta) szétesése után a gyógyszermolekulák a bélen keresztülhaladva a széklettel elhagyhatják a szervezetet minden változás vagy felszívódás nélkül is. A molekulák azonban már a béllumenben is metabolizálódhatnak és metabolitként vagy eredeti formában beléphetnek az enterocitákba. A bélhámsejtekből mind az anyavegyületek, mind az ott képződött a metabolitok tovább juthatnak a vena portae – n keresztül a májba, de exkréció révén visszakerülhetnek a bél lumenébe is, ahonnan intesztinális exkrécióval eliminálódhatnak, azaz a széklettel elhagyják a szervezetet. 1: belépés az enterocitákba és átlépés a vérbe; 2: a gyógyszer exkréciója a béllumenbe; 3: metabolizmus (pl. a CYP 3 enzimcsalád által); 4: metabolitok egy részének transzportja a vérbe; 5: a metabolitok egy részének az exkréciója a béllumenbe 9

A májba jutott molekulák további sorsát a 2. ábra mutatja be.

2. ábra. Metabolikus és transzport folyamatok a hepatocitákban

Az ábrán látható rövidítések: SULT: szulfotranszferáz, GSH: redukált glutation, GST: glutation – S – transzferáz , CYP: citokrom P – 450 enzimrendszer, UGT: uridin – glükuroniltranszferáz OAT2: szerves anion transzporter 2 OCT1: szerves kation transzporter 1 OATP: szerves anion transzporter polipeptid MRP: multidrog rezistens protein MDR: multidrog rezistens transzporter BSEP: epesó export pumpa BCRP: mellrák – rezisztenciafehérje NTCP: nátrium – taurokolát kotranszporter fehérje MCT2: monokarboxilát transzporter 2

10

Az ábra a hepatocitákat, azok membránjait (bazolaterális, kanalikuláris), valamint a különböző transzportrendszereket és enzimrendszereket mutatja be, amelyek az eltérő struktúrájú exogén és endogén vegyületeknek a májon belüli sorsáért felelősek. Látható, hogy különböző transzportrendszerek segítségével jutnak a hepatocitákba a kisebb, vagy nagyobb molekulájú savas és bázikus karakterű anyagok és az epesavak. A sejtekbe került vegyületeknek a sejtekből történő eltávolításában pedig a multidrog rezisztens transzporterek (MDR), valamint a multidrog rezisztens proteinek (MRP) vesznek részt. A hepatocitákból a kanalikuláris membránon át transzportálódó vegyületek az epébe, illetve az epeutakba jutnak, majd exkretálódnak és az epével a béltraktusba kerülnek, ahonnan felszívódva újra elérik a májat (enterohepatikus cirkuláció), vagy a széklettel elhagyják a szervezetet, azaz az intesztinális exkrécióval eliminálódnak. A metabolitok kiválasztásának tehát fontos szereplői a különböző transzporterek, amelyek aktivitása, vagy annak a változása jelentős mértékben befolyásolhatja

az exkréció mértékét. A membrántranszporterek az ATP energiájának a

felhasználásával koncentráció grádiens ellenében is képesek a xenobiotikumokat exkretálni. Az MDR élettani feladata lehet a sejtek és a szervezet védelme a különféle toxikus anyagokkal szemben, megtalálható többek között a májban, bélben, vesében, valamint a placentában. Az MRP a redukált glutationnal, szulfáttal és a glükuronsavval konjugálódott xenobiotikumok exkrécióját növeli, illetve gátolja azok felszívódását a béltraktusból. Az 1. és a 2. ábra adataiból látható, hogy mind az enterocitákban, mind a hepatocitákban számos transzportfolyamat, illetve lehetőség van a különböző molekulák számára, amelyek révén a sejtek egyik oldalán bejuthatnak a sejtbe, a másik oldalán pedig kiléphetnek abból akár változatlan formában, akár metabolitként (51, 97, 102). Kísérleteink során az intesztinális perfúziós médiumban, illetve az epében megjelenő molekulák tehát különböző membránokon át történő transzport lépések és esetleges enzimatikus reakciók (metabolizmus) következtében, valamint ezek végeredményeként kerülnek a béllumenbe és az epébe. Célszerű ezeket a szempontokat mindig szem előtt tartani, amikor az intesztinális és hepatikus eliminációról beszélünk, illetve ha ezeknek a lépéseknek a végeredményeként a béllumenben és az epében a metabolitokat vagy az anyavegyületet meghatározzuk, azok mennyiségét összehasonlítjuk és interpretáljuk.

11

1.2. A PNP modellvegyületként történő alkalmazása, metabolizmusa A xenobiotikumok biotranszformációjában különböző enzimreakciók (I. fázisú vagy funkcionalizáló, II. fázisu vagy konjugációs) vesznek részt (18, 19, 25, 45, 52, 62, 83, 85, 89, 104). A fenolos tipusú vegyületek jelentős részben a II. fázisú, tehát a konjugációs reakciókkal metabolizálódnak (65, 68, 72, 86, 94). Az értekezésben ismertetett vizsgálatokban a p – nitrofenolt (PNP) alkalmaztuk modellvegyületként, mert ismert, hogy a PNP szinte kizárólag konjugációs reakciókkal alakul át: glükuronidáció révén PNP – glükuronidot (PNP – G), szulfatáció során pedig PNP – szulfátot (PNP – S) képez (10, 34, 61, 63). A glükuronidképzésben az UDP – glükuroniltranszferáz (UDPGT) vesz részt (21, 53, 75, 108), a szulfátképződést pedig a szulfotranszferáz (SULT) katalizálja (11, 20, 24, 36, 58, 69). A konjugátumokat bontó enzimek (β – glükuronidáz, arilszulfatáz) azok hidrolíziséért felelősek (12, 31, 84, 107). Az említett enzimek mind a májban, mind a béltraktus nyálkahártyájában megtalálhatók. A PNP konjugációs reakciókkal történő metabolizmusát, a PNP – G és a PNP – S képződésének a folyamatát mutatja be a következő két ábra (3. és 4. ábra) 3. ábra. A PNP konjugációja glükuronsavval és a konjugátum hidrolízise NO2 HOO C

NO2

+ OH

UGT

O OH HO

O

O

NH

NH HOO C

O O O P O P C H2 N HO O OH OH

O

OO HO

UDPGA

O

OH H HO OH

OH

OHOH

PNP

+

O O HO P O P CH2 N O OH OH

PNP - G

UDP

NO2

béta - glükuronidáz HOO C

OO HO

OH

O OH +

H2O HO

+

OH OH

OH

PNP - G

NO2

HOO C

GA

OH

PNP

12

13

SULT – szulfotranszferáz ARS – arilszulfatáz

APS – adenozin 5’ – foszfoszulfát

ADP – adenozin 5’ – difoszfát

ATP – adenozin – trifoszfát

PAPS – 3’ – foszfoadenozin 5’ – foszfoszulfát

PAP – adenozin 3’5’ – bifoszfát

4. ábra. A PNP konjugációja szulfáttal és a konjugátum hidrolízise

A patkány bélcsatornájának a felépítése és működése sok hasonlóságot mutat a humán intesztinális rendszerrel, eltérően más, a törzsfejlődésben hozzá közelebb álló fajokétól (122). A tápcsatornában található enzimek döntő hányada a vékonybélben, azon belül is az epitelsejtekben található. A vékonybél a tápcsatorna leghosszabb szakasza, emellett számos felületnövelő strukturát is tartalmaz, ami mind a felszívódás, mind a metabolizmus szempontjából fontos. Az egyes enzimek denzitása és aktivitása változó a bélrendszer különböző szakaszain, ezért a gyógyszerek metabolizmusa is jelentősen eltérhet az egyes szegmentumokban. Az UDP – glükuroniltranszferázok a sejtek simafelszínű endoplazmás retikulumában helyezkednek el és katalizálják a glükuronsav konjugációját a reakciópartnerek hidroxil és karboxil funkcióscsoportjain, amelyek már eredetileg is megtalálhatók a molekulákon vagy az I. fázisú, funkcionalizáló reakciókkal épülnek ki rajtuk. A humán sejtekben található UDP – glükuronil – transzferázokat négy családra tudjuk felosztani. Az enzimreakció jellegzetes szubsztrátjai a fenolok ( pl. PNP, 1 – naftol , morfin, szteroidok, nem szteroid gyulladáscsökkentők, pajzsmirigyhormonok, antidepresszánsok ) (13, 17, 23, 41, 47, 100, 101). A hepatociták mikroszómájában a glükuronidáció mértéke általában magasabb, mint a enterocitákban, azonban a bél szerepe az első passzázs effektusban (first pass effect) per os történő gyógyszerelés esetén nagyon jelentős lehet. A

glükuronidáció

a

vegyületek

többségének

hatáscsökkenéséhez

vagy

inaktivációjához vezet, bizonyos esetekben azonban ennek révén citotoxikus reaktiv intermedierek is keletkezhetnek. A β – glükuronidázt a lizoszómákban mutatták ki, de újabb feltételezések szerint eredetileg az endoplazmás retikulumból származik és innen kerül a lizoszómákba. A szulfotranszferázok a citoszolban található enzimek, amelyek szulfurilcsoporttal konjugálják például a szteroidokat, a fenolos struktúrákat vagy az alifás vegyületek hidroxil, amino – és

szulfonamid – csoportjait. A szulfátképződés mértéke a vékonybélben és a

májban eltérő lehet különböző esetekben, illetve a körülményektől függően. Tengerimalac vékonybelében például a szulfátképződés

a PNP esetében lényegesen nagyobb, mint a

glükuronidáció, patkányban azonban éppen fordított ezen metabolitok képződésének a mértéke. Bizonyos kísérleti adatokból arra is lehet következtetni, hogy a glükuronidáció és a szulfatáció egymás alternatívái is lehetnek, azaz az egyik reakciótípus maximumának az elérésével mintegy kompenzatórikusan fokozódik a másik reakciótípus aktivitása. A szulfát – konjugáció esetén fontos lehet a szulfát – donor molekula (PAPS) jelenléte és mennyisége, 14

valamint, hogy a szulfotranszferáz és az arilszulfatáz enzimrendszerek lokalizációja és aktivitása hogyan viszonylik egymáshoz (36). A szulfáttal történő konjugáció reverzibilis, a konjugátum mennyiségét két enzimrendszer

által

katalizált

folyamat

határozza

meg.

A

szulfotranszferázok

a

szulfátképződést katalizálják, a szulfátészterek hidrolízisét pedig az arilszulfatázok végzik (27). A szulfotranszferázok a citoplazmában találhatók, míg az arilszulfatázok a lizoszómákban és az endoplazmás retikulumban vannak jelen. Mindkét enzimcsaládnak több (a szulfotranszferázoknak 5, az arilszulfatázoknak 3) tagja van (27). Az enzimrendszerek molekuláris biológiájáról viszonylag sok információ áll rendelkezésünkre, de az élettani szerepük, valamint kölcsönhatásaik és a befolyásolhatóságuk kevésbé ismert.

1.3. Kísérletes diabétesz, hiperglikémia, inzulin A xenobiotikumok eliminációját számos tényező befolyásolhatja, pl. interakciók, a táplálékfelvétel zavarai, patológiás változások, betegségek, köztük például a diabétesz is (1, 5, 26, 27, 30, 102, 103). Diabétesz során számos fontos változás következik be az anyagcsere és hormonális folyamatokban, eltérő lehet a különböző szervek és szövetek glükózfelvétele és felhasználása, változások következhetnek be a fehérjeszintézisben, az enzimek és transzportfehérjék mennyiségében és működésében is (5, 6, 15, 28, 33, 37). A diabétesz egyik legjellemzőbb tünete a hiperglikémia, illetve a glükózanyagcsere zavara. Maga a hiperglikémia is képes bizonyos változásokat kiváltani, például a sejtek működésének a zavarait vagy glükóz – deszenzitizációt hozhat létre (14). Az infúzióval bejuttatott glükóz a máj cukoranyagcseréjét az inzulintól és a glukagontól függetlenül is megváltoztathatja. Hatása nagyobb a glikogenolízisre, mint a glikogeneogenezisre, csökkenti az inzulintól függő cukorfelhasználást annak ellenére, hogy a plazma inzulinszintje nem változik lényegesen vagy akár azonos értéken marad (67, 91). A diabétesz különböző formáinak, valamint a késői szövődményeinek a létrejöttében az oxidatív stressznek is szerepet tulajdonítanak, melynek a kísérő jelensége a DNS, a fehérjék, a lipidek, a szénhidrátok oxidatív károsodása (81). A diabéteszben a szabad gyökök kóros mennyiségű felszabadulását a glükóz autooxidációja, a fehérjék nem enzimatikus glikációja,

a

prosztaglandinok

bioszintézisében

történő

változások

és

a

társuló

rizikófaktoroknak a jelenléte (pl. dohányzás, hipertónia stb.) segítheti elő 70., 119).

15

A diabéteszben létrejövő változások tanulmányozására állatkísérletekben különböző eljárásokat, illetve modelleket alkalmaznak. Ezek közé tartoznak például az izolált májsejteken végzett vizsgálatok, melynek során a hepatocitákat kísérletesen létrehozott diabéteszes állatokból nyerik, vagy a normál hepatociták környezetében alakítanak ki olyan körülményeket (pl. magas glükóz koncentráció, különböző inzulin szintek, inzulin jelenléte vagy hiánya stb.). amelyek a diabétesz során jöhetnek létre. De idetartoznak az izolált szervekkel (máj, bél) vagy a mikroszómákkal történő vizsgálatok is (25, 77, 78, 96, 110). Az in vivo végzett kísérletek legfontosabb tipusai pedig a glükóz – infúzióval hiperglikémiássá tett állatok vizsgálata, valamint a kísérletes diabétesz létrehozása. A kísérletes diabéteszt általában olyan vegyületek beadásával váltják ki az állatokban (legtöbbször patkányban), amelyek az inzulintermelést gátolják a hasnyálmirigyben. Erre a célra leginkább az alloxánt, vagy a streptozotocint (STZ) használják. A két vegyület által kiváltott kísérletes diabétesz sok hasonlóságot mutat, de eltérések is megfigyelhetők (103, 115, 116). Az STZ hatását specifikusabbnak tartják, mert ez a vegyület szelektíven károsítja, illetve elpusztítja a hasnyálmirigyben a béta – sejteket, ezért a beadást követő rövid időn belül megszűnik az inzulintermelés, kialakul a hiperglikémia, az inzulinhiány, illetve a kísérletes diabétesz. A vércukorszint jellegzetesen változik az STZ beadása után, a béta – sejteket károsító hatás miatt először csökkenés tapasztalahtó a vér glükóz koncentrációjában, ez a károsodott béta - sejtekből felszabaduló inzulin hatásának a következménye (90). A hiperglikémia csak ezt követően, általában a beadás utáni második napra alakul ki, majd éri el azt a szintet, amit a kísérletes diabéteszre jellemzőnek tartanak (17 – 34 mM, azaz 300 – 600 mg/ 100 ml) (38). A hiperglikémiát minden károsító hatású anyag beadása nélkül is létre lehet hozni, például glükóz intravénás adásával. Ennél a módszernél először egy úgynevezett kezdő adagot kapnak az állatok intravénásan annak érdekében, hogy a vércukorszintet gyorsan megemeljék, majd magas koncentrációjú (10 – 30 %) glükóz oldat infúziójával tartják fenn a hiperglikémiát tetszőleges szinten és időtartamban (15). Az ilyen módon kiváltott hiperglikémia mindenesetre lényegesen rövidebb időtartamú, mint az STZ – vel létrehozott kísérletes diabétesz, az előbbi inkább órákban, az utóbbi pedig napokban, hetekben mérhető, akár az 1 hónapot is elérheti, illetve meghaladhatja. Az időtartamban meglévő eltérések mellett egyéb különbségek is vannak a két módszert illetően, fontos ezek közül például az inzulinszintben, illetve termelésben megnyilvánuló különbözőség, amely szerint az STZ – vel kiváltott diabéteszes állatok nem termelnek inzulint, de a glükóz infúzióval hiperglikémiás állatok erre képesek. 16

Tekintettel arra, hogy a diabéteszben a két legkarakterisztikusabb változás az inzulinhiány és a hiperglikémia, a diabétesszel kapcsolatos vizsgálatok során gyakran kerül sor az inzulinhiány megszüntetésére, azaz inzulin adására. Különböző megfontolások alapján az inzulin adásának a stratégiája, illetve metodikája eltérő lehet. Egyik esetben például a kísérletes diabétesz teljes időtartama alatt folyamatosan történik az inzulin adása annak a vizsgálata érdekében, hogy a diabétesz során lassan kifejlődő és tartósan fennálló hatásokat a folyamatosan adagolt inzulin tudja-e gátolni (50). A másik megközelítési módnál az inzulin egyszeri adásával annak elsősorban az akut hatásait kívánják vizsgálni. Ezeken kívül közbülső adásmódok is találhatók az irodalomban, nevezetesen csak a kísérleti diabéteszes időtartam egy részében, általában a vizsgálatok előtti néhány napon át is történhet inzulinadás a kísérleti állatoknak (8., 99). Természetesen az alkalmazott inzulin dózisokban is jelentős eltérések lehetnek a néhány tized NE/kg-os adagtól egészen 15 NE/kg – os adagolásig (50). Az inzulinreceptor tirozin – kináz enzimként működik, amelynek a hatása a glükóz, a különféle

ionok

és

aminosavak

membrántranszportjában,

aktiválásában

és/vagy

inaktiválásában, továbbá a gének expressziójában nyilvánul meg. Az inzulin nélkülözhetetlen hormon a glükóz transzportjában, felhasználásában és tárolásában, a máj glükóz termelésében, annak a gátlásában, valamint a zsírok és fehérjék szintézisében. A töltésmentes aminosavak ,,A” tipusú transzportere inzulinnal aktiválható. A fokozott aminosav beáramlás mellett az inzulin a fehérjeszintézist is serkenti, valamint a citoplazmatikus fehérjelebontás fő rendszerét jelentő proteoszómát gátolja (74). Az inzulin hatásának időbeli lezajlását illetően három kategóriát különböztetünk meg: gyors, közepesen gyors és lassú hatásokat (46, 59, 112). A gyors hatás néhány percen belül lezajlik, pl. glükóztranszporter aktiváció és transzlokáció, iontranszport, enzimreguláció (aktiválás – inaktiválás). A közepesen gyors hatások, pl. a piroszőlősav-kináz, glükokináz aktiválás, a foszfoenolpiroszőlősav – karbokináz és a fruktóz – 1,6 – difoszfatáz gátlása órák alatt zajlanak le. A lassú hatások kifejlődése (pl. a DNS – szintézis, sejtproliferáció – differenciáció változása) pedig több órát, illetve napot igényel. Ezeket a hatásokat, illetve azok időbeli megjelenését és lefutását figyelembevéve indokoltak lehetnek az inzulin adásban észlelt különbségek, eltérő megközelítési módok a diabéteszes állatokkal történt vizsgálatok esetén. Az inzulin kontroll állatokban is kivált bizonyos effektusokat, például növeli az epefolyást és a különböző vegyületek biliáris exkrécióját (55, 105, 113), illetve kompenzálni képes a xenobiotikumok által létrehozott kolesztatikus hatásokat. Néhány kísérletes adat arra is utal, hogy mind a hiperglikémia, mind a kísérletes diabétesz által a metabolikus enzimek aktivitására és az exkréciós folyamatokra vonatkozólag kiváltott eltérések is kompenzálhatók 17

inzulinnal, legalábbis részlegesen (98). A gyógyszerek eliminációjában létrejött változások mechanizmusa és az egyes paraméterekben észlelt eltérések közötti összefüggések azonban nem tisztázottak.

1.4. Célkitűzés Az értekezésben összefoglalt kísérletek alapvető célja a vékonybél és a máj eliminációs tevékenységének a vizsgálata volt kontroll állatokban és kísérletes diabéteszben. A vékonybélre és a májra azért esett a választásunk, mert ez a két szerv az eliminációs folyamatokban általában is alapvetően fontos szerepet játszik, a xenobiotikumok metabolizáló és exkretáló funkciójuk pedig különleges jelentőségű a gyógyszerek per os adása esetén. Az eliminációs folyamatok sokrétűek és a gyógyszerek kémiai strukturájától függően különbözők lehetnek. Egy értekezés keretében az elimináció valamennyi aspektusa, a metabolikus reakciók széles spektrumának minden típusa nem vizsgálható. Kísérleteink során ezért elsősorban az intesztinális és a hepatikus exkrécióra és a II – es

tipusú

biotranszformációs reakciókra koncentráltunk, ezek közül is a glükuronsavval és a szulfáttal történő konjugációt tanulmányoztuk elsősorban azért, mert az általunk modell vegyületnek használt PNP ezen reakciók során szinte kizárólag glükuronid – és szulfát – konjugátum formájában jelenik meg metabolitként. Kísérleteink során olyan elrendezést, illetve módszert alkalmaztunk, amely nagymértékben megfelel a per os gyógyszerbevitelnek. Az in vivo izolált jejunális bélkacs keringését és kapcsolatát megtartotta a bélcsatornával, illetve a szervezettel, tehát in vivo, fiziológiás viszonyok között működött. A bélkacsot izotóniás médiummal perfundáltuk, amely PNP – t tartalmazott, ez a kísérleti elrendezés lényegében a per os gyógyszeradás utáni helyzetnek felel meg, hiszen az ilyen adásmódot követően is a vékonybélbe jutnak a gyógyszermolekulák. Adekvát következtetések levonásának egyik alapvető feltétele a pontos, megbízható és reprodukálható meghatározása a metabolitoknak, esetünkben a PNP – G – nek és a PNP – S – nek a perfúziós folyadékban és az epében. Ezért a kísérleteink egy részében a PNP – nek és metabolitjainak a szeparálására és meghatározására a rendelkezésre álló HPLC – vel történő mérési módszer továbbfejlesztését tűztük ki célul. A metabolitok megjelenésében és kiválasztásában alapvető fontosságuak azok az enzimek,

amelyek

azok

képzését

katalizálják

(UDP

–

glükuroniltranszferáz,

szulfotranszferáz), illetve a lebontásukban (hidrolízis) vesznek részt (β – glükuronidáz, 18

arilszulfatáz). Nem tisztázott az a kérdés, hogy milyen a kapcsolat, vagy, hogy van – e direkt összefüggés az említett enzimek aktivitása és az exkréciós folyamatok, illetve azok változása között. Ezért a kísérleteink során párhuzamosan vizsgálni kívántuk az enzimaktivitásokat a bélben és a májban, valamint az intesztinális és biliáris exkréciót, illetve ezek összefüggéseit először kontroll állatokban, majd kísérletes diabéteszben. A kísérletes diabéteszt STZ – vel (65 mg/kg i.v.) hoztuk létre (15, 28, 103), a kísérleteket a STZ beadása után egy héttel végeztük. A diabétesz viszonylagos gyakorisága és a megjelenési arányának növekvő tendenciája feltétlenül indokolttá teszi, hogy az általa kiváltott különböző változásokkal foglalkozzunk. Kísérletes diabéteszes állatoknál a xenobiotikumok eliminációjával kapcsolatban különböző szerzők változó, esetenként jelentős eltéréseket írtak le a biliáris exkréciót illetően. Az extrahepatikus metabolizmust (109), pl. a bél eliminációs tevékenységét kontroll állatoknál jóval kevésbé vizsgálták, még kevésbé ismert az intesztinális elimináció változása diabéteszben. Ezért a kísérleteinket ebbe az irányba is kívántuk kiterjeszteni annak érdekében, hogy össze tudjuk hasonlítani a máj és a vékonybél eliminációs tevékenységét, illetve azok a változását kísérletes diabéteszben. Az inzulin hatásának a vizsgálatával az volt a célunk, hogy választ kapjunk arra a kérdésre, hogy képes-e az inzulin a diabéteszben létrejött változásokat az enzimaktivitásokat és az exkréciót illetően kompenzálni, hiszen a kísérletes diabéteszt az inzulinhiány hozza létre. Elsősorban az inzulin akut hatását kívántuk tanulmányozni, ezért gyorshatású inzulint adtunk az állatoknak közvetlenül a bélperfúziós kísérletek előtt, az STZ beadását követő egy hét múlva, ezen belül egyébként inzulinadás nem történt. Célkitűzéseinket röviden összefoglalva azt mondhatjuk, hogy vizsgálataink elsősorban az alábbi három kérdés tanulmányozására irányultak: 1.

A PNP – nek és a metabolitjainak (PNP – G , PNP – S ) a HPLC – vel történő mérése biológiai mintákban (bélperfuzátum, epe) a mérési módszer fejlesztése;

2.

A metabolikus enzimek aktivitása és a metabolitok intesztinális és hepatikus exkréciója közötti összefüggés vizsgálata kontroll állatokban;

3.

A kísérletes diabétesz hatása a bél és a máj eliminációs tevékenységére.

19

2. Vizsgálati módszerek

2.1. Kémiai anyagok, vegyszerek, reagensek A p – nitrofenolt, a metabolitjait ( p – nitrofenol – glükuronid és p – nitrofenil – szulfát), a 4 – etilfenolt, a streptozotocint, a tetrabutil – ammónium – bromidot, a fenolftaleint, a fenolftalein – β – glükuronidot, az uridin – 5’ – difoszfoglükuronsavat , a 3’ – foszfoadenozin – 5 – foszfoszulfátot , a nitrokatekolt, a 4 – naftolt , a Brij 56® - t, a HEPES – t , a DL – ditiotreitolt a Sigma Aldrich cégtől (Budapest) szereztük be. A gyorshatású inzulint (Actrapid) a Lilly Hungaria – tól (Budapest) vásároltuk. Az összes többi vegyszer és reagens analitikai, vagy HPLC tisztaságú, illetve minőségű volt. A bélperfúzióhoz használt izotóniás oldat a következő összetételű volt (nmol/l): NaCl 96,4; KCl 7,0; CaCl2 3,0; MgSO4 1,0, Nátrium foszfát puffer (pH 7,4) 0,9; TRIS puffer (pH 7,4) 29,5; glükóz 14,0; mannitol 14,0.

2.2. Állatkísérletek: kísérleti állatok, a vékonybél perfúziója, az epevezeték kanülálása és az epe gyűjtése, a kísérletes diabétesz létrehozása A vizsgálatokat 220-250 g – os hím patkányokon végeztük. Az állatokat uretánnal (1,2 g/kg i.p.) narkotizáltuk. A hasfalat a középvonalban hosszanti irányú metszéssel felnyitottuk és a duodenum utáni jejunális szegmentumot kb. 10 cm – es hosszban kanüláltuk in vivo. A béllument átöblítettük meleg (37○C – os) izotóniás oldattal a bélben lévő táplálék maradványok eltávolítása céljából, majd 4 – 5

ml levegő átfújásával üressé tettük. A

béllument ezt követően az izolált szegmentum mindkét végébe helyezett kanül, illetve a hozzájuk csatlakozó műanyagcső segítségével 13 ml/perc sebességű izotóniás médiummal perfundáltuk recirkulációs módszerrel, az oldat meghatározott koncentrációjú (általában 500 µM ) PNP – t tartalmazott. Egyéb kísérleteinkben különböző koncentrációjú (20 – 1000 µM) PNP luminális perfúziójára is sor került, jelen vizsgálataink során azért választottuk az 500 µM – os

koncentrációt, mert ilyen kísérleti körülmények között tudtuk megbízhatóan

analizálni és összehasonlítani a PNP metabolitjainak az intesztinális és biliáris eliminációját. Az izolált bélszakasz disztális végén kifolyó oldatot egy rezervoárba vezettük, amelyből egy perfúziós pumpa segítségével azt folyamatosan juttattuk vissza a béllumenbe. A kezdeti perfúziós volumen 15,0 ml volt, a perfúzió 90 percig tartott. A kanülált szegmentumból

20

kifolyó perfúziós folyadékból 250 µl – es mennyiségű mintát vettünk különböző időpontokban. Az állatokat és a perfúziós folyadék hőmérsékletét 37○C – on tartottuk. A biliáris exkréció vizsgálatához az epevezetéket egy vékony műanyagcsővel (PE – 10) kanüláltuk és az epét folyamatosan, 15 perces időperiódusokban gyűjtöttük. A mintákat az analizis előtt hűtőszekrényben ( – 20 ○C ) tartottuk. A kísérletes diabéteszt STZ intravénás beadásával (65 mg/kg i.v.) hoztuk létre, a kísérleteket az STZ beadása után egy héttel végeztük. A gyorshatású inzulint (1 NE / kg i.v.) közvetlenül a kísérletek megkezdése előtt kapták az állatok.

2.3. Analitikai eljárások, a minták előkészítése és mérése A fordított (reverz) fázisú HPLC (RP – HPLC) elválasztás talán a leggyakrabban használt és legnépszerűbb folyadékkromatográfiás elválasztási módszer. A PNP – nek és metabolitjainak az elválasztására már több eljárást, beleértve az RP – HPLC módszert is, közöltek (10, 32, 34, 57, 76, 104). Ezeknek egy részét nem biológiai minták mérésére alkalmazták, illetve a mintaelőkészítés során nem használtak belső standardot és egyikben sem közöltek a reprodukálhatóságra és a kimutatási határra vonatkozó adatokat. Másrészről az elválasztási idők ezeknél a módszereknél relatíve hosszúnak bizonyultak (15 – 20 perc), ami nagyszámú minta esetén, jelentősen megnöveli a mérések és az eredmények kiértékelésének az idejét. A nagyszámú bélperfúziós– és epeminták mérésének megkönnyítése céljából új, módosított elválasztási módszereket fejlesztettünk ki.

2.3.1. A bélperfuzátumokból nyert minták analízise az általunk fejlesztett HPLC-módszerrel A PNP és metabolitjainak (PNP – G, PNP – S) az intesztinális perfuzátumokban történő elválasztása és mennyiségi meghatározása Nucleosil 100 fordított fázisú C18 oszlopon (250 mm x 4,6 mm, 10µm) történt. A HPLC készülék Varian 2010 pumpából, Rheodyne 7725i injektorból, UV – Detector 308 detektorból és PowerChrom 280 adatgyűjtő egységből és programcsomagból állt. A pH értékek beállítását Mettler Toledo MP 220 pH mérővel végeztük, míg az előzetes UV-VIS mérések Secomam Anthelie Light spektrofotométern történtek. A felhasznált oldószerek HPLC minőségűek voltak (3).

21

A vékonybélperfuzátumok analizisénél eluensként 0,01 M tetrabutil – ammónium – bromid

ionpárképzőt tartalmazó 50 : 50 (v/v/%) metanol : víz elegyet használtunk. A

vékonybél – perfuzátum mintákat 1 perc vortexszelés után 10 percig 3000 g –vel centrifugáltuk és a méréseket szobahőmérsékleten végeztük. Az ionpárképző használatára az elválasztandó komponensek eltérő sav-bázis tulajdonságai miatt került sor; az elválasztandó vegyületek pKs értékei a következők: PNP – S: ≤ 4 (72), PNP – G: ≈ 3,0-3,4 (88), PNP: = 7,19 (72, 88). Az ionizálódó komponensek retenciója az ionpárképző alkalmazásával módosult. A retenciós idők a PNP-G, PNP, PNP-S esetében 3,46; 5,42; 6,31 perc (5/a. ábra), míg a retenciós faktorok értékei 0,91; 1,95; 2,42 voltak.

5/a. ábra. A PNP-G (1), a PNP (2), és a PNP-S (3) kromatogrammja bélperfuzátum esetén

A PNP-t és metabolitjait nem tartalmazó bélperfuzátum nem produkált csúcsot, ezért nem jelentett zavaró tényezőt a mérések során (3). A standard oldatokat ötször injektáltuk hat különböző koncentrációban ( PNP – G – t és a PNP – S – t: 2,5 – 100 µM, illetve a PNP – t 6 – 1200 µM között). Az egy napon belüli mérési reprodukálhatóságot a retenciós idők értékeivel és a görbe alatti területek relativ standard deviációival (RSD) jellemeztük.

22

A kalibrációs sor mérését öt egymást követő napon megismételtük. Ezen napok közötti mérési pontosság meghatározásához (reprodukálhatóság) kiszámoltuk az eredményekből adódó RSD – értékeket (3). A retenciós időket reprodukálhatónak találtuk 1,05 – 3,20 % intervallumon belül. Az integrált csúcs alatti területek RSD értékei is a reprodukálhatóság szempontjából elfogadható 2,15 – 3,78 % intervallumba estek. A mérés beállítása során ellenőriztük a retenciós időket azokban az esetekben is, amikor az eluens pH – ja 5, 6 illetve 7 volt (ezekben az esetekben a pH értékek pontos beállítására nem került sor). A mérések során az irodalmi adatokkal megegyező értékeket kaptunk, az eluens pH értéke az elválasztandó anyagok retencióját nem befolyásolta.

2.3.2. Az epeminták analízise az általunk módosított HPLC – módszerrel Az epeminták vizsgálata során a kromatográfiás oszlopot TR – C – 160K1 előtétoszloppal is kiegészítettük, az eluens 0,03 M tetrabutil – ammónium – bromidot (TBAB) tartalmazó 53:47 (v/v/%) metanol: 0,01 M citrátpuffer pH 6,2 volt. Ez utóbbi esetben belső standardként 4 – etilfenolt (ETP) alkalmaztunk úgy, hogy 50 µl epemintához fehérjementesítés céljából 200 µl 3,125 M belső standardot tartalmazó metanolt adtunk (4). Az epemintákat 10 másodperc után 10 percig 10000 g-vel centrifugáltuk, majd a minták felülúszóját injektáltuk. A mérések szobahőmérsékleten történtek. A módszer alkalmazásánál sor került az eluens pH – jának a pontos beállítására is, mert az epében található egyéb ionok, valamint az epe sav – bázis karaktere miatt az előbbiekben tárgyalt módszer (3) már nem volt alkalmazható (4). Az előzetes kísérletek alapján az eluens pH – ját a megfelelő szelektívitást biztosító pH 6,2 értékre állítottuk. Az ionerősség növelése miatt megemeltük a TBAB koncentrációját is 0,01 M – ról 0,03 M – ra. A PNP és metabolitjainak egyidejű meghatározását mindkét kromatográfiás módszer esetén UV – VIS detektor alkalmazásával 290 nm hullámhosszon történő méréssel (detektálással) végeztük. A retenciós idők (perc) PNP – G, PNP, PNP – S és az ETP esetében 4,96; 7,78; 10,5 és 14,5 (5/b. ábra), míg a retenciós faktorok (k) 0,86; 2,51; 3,42 és 4,63 voltak.

23

5/b. ábra. A PNP – G (1), a PNP (2), a PNP – S (3) HPLC kromatogrammja az epeminták mérésénél belső standard ETP (4) alkalmazásával

A standard oldatokat ebben az esetben is ötször injektáltuk és a méréseket öt egymást követő napon megismételtük (hat különböző koncentráció, 2,5 – 100 µM esetén). A retenciós időket reprodukálhatónak találtuk 0,42 – 4,04 % RSD intervallumon belül. Az integrált csúcsok alatti területek RSD értékei is a reprodukálhatóság szempontjából elfogadható 0,57-0,49 % intervallumba estek (4). A mérési eljárások általunk bevezetett módosításának egyéb adatai az ,,Eredmények” fejezet 4.1. pontjában találhatók.

2.3.3. A vércukorszint mérése A vércukorszintet Accu – Chek® digitális vércukor mérővel mértük.

24

2.3.4. Az enzimaktivitások meghatározása 2.3.4.1. Az UDP – glükuroniltranszferáz – aktivitás mérése A kontroll és a PNP – vel (500 µM) perfundált patkányok szerveit (vékonybél, máj) narkózisban, illetve a kísérletek végén eltávolítottuk és rögtön lefagyasztottuk, majd – 80 ○C hőmérsékleten tároltuk. A meghatározásokhoz a szervekből mintegy 250 – 500 mg – nyi mennyiségű darabot kivágtunk és 2,5 – 5 ml hideg (4 ○C) homogenizációs pufferbe (250 mM szacharóz, 1 mM DL – ditiotreitol, 10 mM Hepes – Tris puffer pH 8) helyeztük. A szervdarabokat Ultra – Turrax homogenizátorral, majd egy üveg (Potter – Elvheim) homogenizátorral homogenizáltuk. Ezt követően a homogenizátumot úgy higítottuk homogenizációs pufferrel, hogy a protein koncentráció 1 mg/ml legyen. A protein koncentrációt a biuret rekcióval (99) határoztuk meg. Az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitás mérése egy olyan inkubációs keverékben történt, amely 100 µl szervhomogenátumot (1 mg/ml protein) és 100 µl inkubációs puffert (200 mM Tris – HCl, 10 mM MgCl2, 0,1 % Brij 56® pH 7,4) tartalmazott, ehhez 2 mM PNP – t adtunk. Az inkubátum egyik fele 5 mM UDPGA – t (uridin 5’ – difoszfoglükuronsav) tartalmazott a teljes térfogatra vonatkoztatva. A 30 perces 37 ○C – on történő inkubáció után a reakciót 3,8 ml 0,1 %-os jégben hűtött NaOH hozzáadásával leállítottuk és a nem – konjugált PNP abszorpcióját mértük 405 nm – nél. A specifikus UDP – glükuroniltranzferáz aktivitást a metabolizált PNP mennyiség (a mérés elején hozzáadott és a mérés végén maradt PNP közti különbség fejezi ki a metabolizált mennyiséget) alapján számítottuk ki és 1 mg proteinre és 1 percre vonatkoztatava adtuk meg: µmol PNP/mg protein/perc (21).

2.3.4.2. A β – glükuronidáz – aktivitás meghatározása A szervek kivétele és homogenizálása, a homogenátum készítése és beállítása azonos volt a 2.3.4.1. pontban leírtakkal. A β – glükuronidáz – aktivitás mérése egy olyan inkubációs keverékben történt, amely 100 µl szerv homogenátumot (1 mg/ml protein) és 150 µl 70 mM – os acetát puffert ( pH 5,0 ) tartalmazott. Az inkubáció 60 percig tartott, 37 ○

C-os hőmérsékleten. Az inkubátum egyik fele a teljes volumenre vonatkoztatva 1 mM

fenolftalein – β – glükuronidot

tartalmazott. A reakciót 250 µl jégben hűtött 5% – os 25

triklórecetsavval állítottuk le. A minták neutralizálása 12,9 pH – jú 0,22 M glycin oldatnak az inkubációs keverékhez való hozzáadásával történt. A fenolftalein abszorpcióját 540 nm – nél mértük. A β – glükuronidáz aktivitást a hidrolízis során képződött fenolftalein mennyisége alapján számítottuk ki és a szabad (nem – konjugált) fenolftalein mennyiségében fejeztük ki 1 mg proteinre és 1 percre vonatkoztatva (µmol fenolftalein/mg protein/perc). Az acetát puffer, a glicin oldat és a desztillált víz keveréke szerepelt referenciaként (40).

2.3.4.3. A szulfotranszferáz – aktivitás mérése A szervek kivétele, homogenizálása és a homogenátum készítése és beállítása azonos volt a 2.3.4.1. pontban leírtakkal. A szulfotranszferáz – aktivitás

mérése olyan

inkubációs keverékben történt, amely 100 µl szerv homogenátumot és 450 µl inkubációs puffert (62,5 mM Tris puffer, pH 6,2), 1 mg/ml protein – t, továbbá 25 µM PAPS – t, 125 µM 2 – naftolt és 6,25 mM PNP – S – t tartalmazott. A reakció elindítása a homogenátumnak az inkubációs pufferhez való hozzáadásával történt. Az inkubációt 37 ○C-os hőmérsékleten végeztük és az 30 percig tartott. A reakció leállítása 500 µl 0,25 M Tris puffernek (pH 8,7) a keverékhez való hozzáadásával történt.. A PNP abszorpcióját 401 nm – nél mértük. A referencia oldat szerv – homogenátum nélküli homogenizációs puffert tartalmazott (24, 69). Az enzimreakció alapja és előnye, hogy a szulfotranszferáz katalizálja a szulfurilcsoport átvitelét a PNP – S-ről és regenerálja a PAPS – t, továbbá, hogy a szulfuril csoportnak a PNP-S-ről történő átvitele következtében keletkező színes PNP könnyen detektálható UV – Vis spektrofotometriával. Az enzimaktivitást a PNP – S azon mennyiségével fejeztük ki, amelyből a szulfurilcsoport transzportja révén a szabad PNP keletkezik. Ez utóbbi szintén alkalmas az enzimaktivitás kifejezésére, amely mindkét esetben µmol/mg protein/perc-ben történik.

2.3.4.4. Az arilszulfatáz – aktivitás meghatározása A szervek kivétele, homogenizálása és a homogenátum készítése és beállításaa azonos volt a 2.3.4.1. pontban leírtakkal. Az arilszulfatáz – aktivitás meghatározása olyan inkubációs keverékben történt, amely 50 µl szerv homogenátumot és 400 µl inkubációs puffert (0,25 M Na acetát puffer pH 5,5), továbbá nitrokatekol (NC) – szulfátot tartalmazott. A reakció indítása a homogenátumnak az inkubációs pufferhez való hozzáadásával történt. Az 26

inkubáció 37○C hőmérsékleten 30 percig tartott. A reakció leállítását 500 µl 5 m/v % triklórecetsavnak az inkubációs keverékhez való hozzáadásával értük el. Ezt követően a keveréket 10 percig, 1600 g – vel centrifugáltuk, majd 500 µl felülúszót adtunk 500 µl 5 M NaOH – hoz. Az NC – szulfátból keletkező NC mennyiséget 520 nm – nél mértük. A referencia oldat a szerv homogenátum helyett homogenizációs puffert tartalmazott (31).

3.

Számítások, statisztikai analízis

3.1. A metabolitok megjelenése a béllumenben: a PNP – G és a PNP – S mennyiségének a kiszámítása a luminális koncentráció és a perfúziós volumen alapján A metabolitok szeparálása és mennyiségének a meghatározása a perfuzátumból vett mintákból HPLC módszerrel történt, melynek a leírása a 2.3.2., illetve a 4.1. pontok által jelzett fejezetekben található. Ezeknek a méréseknek az alapján kiszámítottuk a metabolitok koncentrációját a perfúziós oldatban. A perfúziós médium kezdeti volumene 15,0 ml volt, amely a perfúzió időtartama alatt a mintavételek következtében csökkent, illetve a bél folyadékot exkretáló vagy felszívó tevékenysége révén is módosulhatott. Mindkét tényező figyelembevételével történő korrekció segítségével számítottuk ki az aktuális perfúziós volument egy adott időpontra vonatkoztatva. Az ilymódon korrigált

volumen és a

meghatározott koncentráció szorzatával pontosan ki tudtuk számítani a bármely időpontra vagy időtartamra vonatkozó luminális megjelenését a metabolitoknak. A kumulatív luminális megjelenés több mérési periódusra, de általában a teljes perfúziós időtartamra (90 perc) vonatkozó összesített megjelenési adatokat jelenti.

27

3.2. A PNP – G, PNP – S és a PNP mennyiségének a kiszámítása az epében a biliáris koncentráció és az epevolumen alapján A metabolitok és az anyavegyületek szeparálása és mennyiségének a meghatározása az epemintákból HPLC módszerrel történt, melynek a leírása a 2.3.2., illetve a 4.1. pontok által jelzett fejezetekben található. Ezeknek a méréseknek az alapján kiszámítható a vegyületek koncentrációja az epében. Az epét folyamatosan gyűjtöttük 15 perces periódusokban, ezeket a térfogatokat mértük. Az egyes periódusok térfogatát a meghatározott koncentrációval megszorozva megkapjuk a periódusonként kiválasztott mennyiségeket. A kumulatív biliáris exkréció kifejezés több peródus összesített adatát vagy a teljes kísérleti időtartam (90 perc) alatt összesen kiválasztott mennyiséget jelenti.

3.3. Az enzimaktivitás kiszámítása és kifejezése Az enzimaktivitás mérését, illetve meghatározását a 2.3.4. pontban részletesen leírtuk. Az enzimaktivitásokat vagy az átalakított szubsztrátok vagy a képződött metabolitok mennyiségében fejeztük ki 1 mg proteinre és 1 percre vonatkoztatva.

3.4. Az adatok kiszámítása és prezentálása Az adatok kiszámításának a módját a fentiekben már ismertettük. A táblázatokban és az ábrákon feltüntetett adatok az átlagértékeket és a standard errort (S.E.) vagy a standard deviációt (S.D.) jelölik . Az n a kísérletek vagy mérések számát jelenti.

3.5. A szignifikancia kiszámítása (Student – féle t – teszt) A szignifikanciát az egymintás Student – féle t – teszttel számítottuk ki, a kontrolltól való szignifikáns eltérés jelölése: * p < 0,05; ** p < 0,01. Ha nem csak a kontrolltól való eltérést akartuk jelölni, mint pl. a diabéteszes állatoknál az inzulinnal kezelt és nem kezelt csoportok közti különbségek esetén, akkor más szimbólumot is használtunk: # p < 0,05; ## p < 0,01, ezekben az esetekben kapoccsal jelöltük azokat az adatokat, amelyek közti különbségnek a szignifikanciáját kívántuk megadni.

28

4.

Eredmények

4.1. A HPLC – vel történő mérési módszer módosítása, továbbfejlesztése 4.1.1. Izokratikus ionpár RP – HPLC módszer kidolgozása és validálása, a PNP, PNP – G és a PNP – S egyidejű analizise A vékonybél perfúziója során a perfuzátumból nyert minták analízisére kidolgoztunk egy UV – detektálással összekapcsolt izokratikus ionpár képzésen alapuló, fordított fázisú HPLC (RP – HPLC) eljárást, amely alkalmas a PNP, PNP – G és a PNP – S egyidejű meghatározására (3). A vékonybél és a máj eliminációs tevékenységének a vizsgálata és összehasonlítása során a bélperfuzátumok mellett az epeminták vizsgálata is szükséges volt. Az epeminták analizise céljából módosítottuk a perfuzátumok mérésére optimalizált HPLC módszert, melynek során előtétoszlopot alkalmaztunk és ETP – t használtunk belső standardként az epemintákban lévő PNP, PNP – G és PNP – S detektálására és mennyiségi meghatározására. Az általunk módosított és továbbfejlesztett eljárások lehetővé teszik a PNP – nek és metabolitjainak preciz, megbízható és reprodukálható azonosítását és mennyiségi meghatározását nagyszámú biológiai minta esetén is (3, 4). Az optimalizált RP – HPLC módszert alkalmazva kb. 6 – 15 perces kromatográfiás időtartamon belül jól szeparálhatók az említett vegyületek belső standard alkalmazásával is, ez az időtartam rövidebb, mint a korábban alkalmazott és mások által is használt eljárásokhoz szükséges 15 – 20 perces időperiódus (63, 76, 104).

4.1.2. A PNP, PNP – G és a PNP – S retenciós idejének és a csúcsok alatti területeknek a paraméterei A retenciós idők és az integrált csúcsok alatti területek mérési reprodukálhatóságát hat különböző koncentráció esetén vizsgáltuk, a kapott adatokat mutatja be a következő hat táblázat, három (I., II., III.) a perfúziós oldatokra (3), három (IV., V., VI.) pedig az epemintákra (4) vonatkozólag. Minden koncentrációt ötször analizáltunk, a napok közötti mérések időtartama öt egymást követő napot jelent.

29

4.1.2.1. A PNP retenciós ideje és csúcsok alatti területe bélperfúziós oldat alkalmazása esetén I. táblázat. A retenciósidők és csúcsok alatti területek egy napon belüli és az egymást követő napok közötti méréseinek a pontossága, reprodukálhatósága a standard perfúziós oldatokban (RSD,%: relativ standard deviáció, %)

Standard oldatok koncentrációja (µM) PNP

Retenciós idők egy napon belüli pontossága (RSD,%) (n=5)

Csúcsok alatti területek egy napon belüli pontossága (RSD,%) (n=5)

6 12 60 120 600 1200

0,95 0,93 0,74 0,97 1,44 1,02

2,38 2,38 2,16 2,24 2,50 2,48

Retenciós idők Csúcsok alatti napok közötti területek napok pontossága közötti pontossága (RSD,%) (n=5) (RSD,%) (n=5) 2,89 2,91 2,84 2,76 2,92 2,76

2,53 2,73 2,39 2,24 2,44 2,62

4.1.2.2. A PNP – G retenciós ideje és csúcsok alatti területe bélperfúziós oldat alkalmazása esetén II. táblázat. A retenciósidők és csúcsok alatti területek egy napon belüli és az egymást követő napok közötti méréseinek a pontossága, reprodukálhatósága a standard perfúziós oldatokban (RSD,%: relativ standard deviáció,%) Standard oldatok koncentrációja (µM) PNP-G



2,5 5 10 25 50 100

1,92 1,29 1,25 1,75 1,33 1,06

4,45 3,65 3,60 3,14 3,03 2,86


3,78 3,27 2,94 2,67 2,58 2,59

30

4.1.2.3. A PNP – S retenciós ideje és csúcsok alatti területe bélperfúziós oldat alkalmazása esetén III.

táblázat. A retenciósidők és csúcsok alatti területek egy napon belüli és az egymást követő napok közötti méréseinek a pontossága, reprodukálhatósága a standard perfúziós oldatokban (RSD,%: relativ standard deviáció, %)




2,5 5 10 25 50 100

1,25 1,27 2,20 1,67 1,22 1,98

3,71 3,43 3,83 2,88 2,71 2,78


3,43 2,95 3,45 2,93 2,15 2,21

4.1.2.4. A PNP retenciós ideje és csúcsok alatti területe az epeminták mérésénél ETP belső standarddal IV.

táblázat. A retenciós idők és csúcsok alatti területek egy napon belüli és az egymást követő napok közötti méréseinek a pontossága, reprodukálhatósága a standard oldatokban (a csúcs alatti terület pontossága a PNP / ETP hányadosokból került meghatározásra) (RSD,%: relativ standard deviáció, %)




2,5 5 10 25 50 100

1,15 1,05 1,40 2,13 1,72 1,01

2,59 5,49 3,93 4,87 1,88 1,77


4,77 4,31 1,36 2,26 2,83 0,86

31

4.1.2.5. A PNP – G retenciós ideje és csúcsok alatti területe az epeminták mérésénél ETP belső standarddal V. táblázat. A retenciós idők és csúcs alatti területek egy napon belüli és az egymást követő napok közötti méréseinek a pontossága, reprodukálhatósága a standard oldatokban (a csúcs alatti terület pontossága a PNP – G / ETP hányadosokból került meghatározásra) (RSD,%: relativ standard deviáció, %)




2,5 5 10 25 50 100

0,50 0,50 0,45 0,42 0,51 0,57

3,96 4,61 2,40 4,19 1,40 1,63


1,30 2,44 1,34 1,64 2,02 0,79

4.1.2.6. A PNP-S retenciós ideje és csúcsok alatti területe az epeminták mérésénél ETP belső standarddal VI. táblázat. A retenciós idők és csúcs alatti területek egy napon belüli és az egymást követő napok közötti méréseinek a reprodukálhatósága a standard oldatokban (a csúcs alatti terület pontossága a PNP – S / ETP hányadosokból került meghatározásra) (RSD,%: relativ standard deviáció, %)




2,5 5 10 25 50 100

0,83 0,92 1,04 1,02 1,41 1,23

4,21 3,30 3,42 3,50 2,36 3,48


2,40 2,88 2,68 2,58 2,41 0,57

32

A fenti táblázatokban ( I – VI.) összefoglalt adatok demonstrálják, hogy a PNP – nek és a konjugátumainak a meghatározására és kvantifikálására sikerült egy olyan izokratikus RP – HPLC módszert kialakítani, amely egyszerű, könnyen kivitelezhető, időtakarékos, pontos és megbízható, valamint jól reprodukálható mérési adatokat szolgáltat mind a bélperfúziós, mind az epeminták esetében. Az ionizáló komponensek retenciója az ionpárképző alkalmazásával módosult, a retenciós idők csökkentek. A retenciós időket reprodukálhatónak találtuk 1,05 – 3,20 % RSD intervallumon belül, a csúcsok alatti területek RSD értékei a reprodukálhatóság tekintetében az elfogadható 2,15 – 3,78 % tartományba estek a bél perfúziós folyadékának az alkalmazása során. Az epeminták mérésénél az epe sav – bázis karakterét figyelembevéve, valamint az egyéb komponensekre való tekintettel is, az eljárásunk során puffert használtunk a pontos pH beállítás céljából, emeltük az ionpár képző TBAB mennyiségét, előtétoszlopot, valamint belső standardot (ETP) alkalmaztunk a módszer pontosságának a növelése érdekében. A PNP – G és a PNP – S metabolitok optimális pH értékek esetén gyakorlatilag teljes mértékben ionizált formában vannak jelen, amelyek ilymódon ionpárokat tudnak képezni az RP stacionáris fázishoz adszorbeált TBAB – al. Az epeminták mérésénél a retenciós idők reprodukálhatónak bizonyultak a 0,42 – 4,04 % RSD intervallumon belül, a csúcsok alatti területek RSD értékei a reprodukálhatóság szempontjából elfogadható 0,57 – 5,49 % intervallumba estek.

33

4.2. A vékonybél és a máj eliminációs tevékenységének vizsgálata kontroll állatokban A továbbiakban a kontroll állatok, valamint a kísérletesen diabéteszessé tett állatok adatai kerülnek ismertetésre, illetve összehasonlításra. Ezért először a kontroll állatok intesztinális és hepatikus eliminációs tevékenységét és az arra vonatkozó értékeket ismertetjük.

4.2.1. A PNP – G megjelenése a vékonybél lumenében és az epében A 6. ábra demonstrálja a vékonybél és a máj metabolikus és kiválasztó funkcióját, azaz a PNP glukuronid metabolitjának a béllumenben és az epében történő megjelenését.

6.

ábra. Az intesztinális és a hepatikus kiválasztódás: a PNP – G megjelenése a béllumenben és az epében a perfúziós idő függvényében, melynek során a vékonybelet olyan izotóniás médiummal perfundáltuk, amely 500 µM PNP – t tartalmazott.

34

Az adatok az egymást követő periódusok összegzett értékeinek az átlagát és a S.E. – t jelölik (n=8). Nincs szignifikáns különbség a PNP – G bélben történő megjelenése és a biliáris exkréciójának az értékei között. Bár a PNP – G megjelenése a vékonybélben minden vizsgált időpontban valamivel alacsonyabb volt, mint a biliáris exkréció értékei, a különbség statisztikailag nem bizonyult szignifikánsnak.

4.2.2. Az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz enzimek aktivitása a vékonybélben és a májban A következő két ábra azoknak az enzimeknek (UDP – glükuroniltranszferáz, β – glükuronidáz) az aktivitását mutatja be, amelyek a PNP – G mennyiségét a béllumenben, illetve az epében meghatározzák. Ezek az enzimek felelősek ugyanis a glükuronid – konjugátum – képzéséért, valamint a hidrolíziséért. 7. ábra. Az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása a vékonybélben és a májban kontroll és luminálisan perfundált állatokban.

A vékonybél perfúziója 500 µM koncentrációju PNP – t tartalmazó izotóniás oldattal történt. Az enzim aktivitását a metabolizált (glükuronsavval konjugált) PNP mennyisége 35

(µmol/perc) alapján számítottuk ki 1 mg proteinre vonatkoztatva. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=10). Sem a májban, sem a bélben nem volt szignifikáns eltérés a kontroll és a PNP – vel perfundált állatok adatai között. Szignifikáns különbség volt azonban a vékonybél és a máj megfelelő csoportjai (kontroll, illetve perfundált) között: ** p < 0,01. Az ábra adatai egyértelműen mutatják, hogy a májban az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása lényegesen (kb. 2,5 – 3-szor) magasabb, mint a vékonybélben. A következő ábra a β – glükuronidáz aktivitását illusztrálja a vékonybélben és a májban. 8. ábra.. A β – glükuronidáz aktivitása a vékonybélben és a májban.

Az enzimaktivitást a fenolftalein – β – glükuronid hidrolízise alapján határoztuk meg és a képződött szabad fenoftalein mennyiségében (µmol/perc) fejeztük ki 1 mg proteinre vonatkoztatva. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik ( n=10 ). Szignifikáns eltérés a kontroll és a luminálisan perfundált (500 µM PNP) állatok értékei között sem a vékonybél, sem a máj esetében nem volt megfigyelhető. Szignifikáns különbség volt azonban a vékonybél és a máj megfelelő értékei (kontroll, 500 µM PNP – vel perfundált) között: ** p < 0,01.

36

A β – glükuronidáz aktivitása lényegesen magasabb volt a májban, mint a vékonybélben, nagyjából hatszor nagyobb volt a β – glükuronidáz hatása következtében képződött szabad fenolftalein mennyisége a májban, mint a vékonybélben.

4.2.3. A PNP – S megjelenése a vékonybél lumenében és az epében A következő ábra a vékonybél és a máj metabolikus és exkréciós működését mutatja be a szulfát – konjugátumra vonatkozólag: a PNP – S luminális megjelenése és a biliáris exkréciója a PNP (500 µM) luminális perfúziója során a perfúziós idő függvényében látható az ábrán (9. ábra). 9. ábra. A PNP – S intesztinális és hepatikus kiválasztódása: a PNP – S megjelenése a béllumenben és kiválasztódása az epével a vékonybél olyan izotóniás médiummal történő perfúziója esetén, amely 500 µM koncentrációjú PNP – t tartalmazott.

Az adatok az egymást követő periódusok összegzett értékeinek az átlagát és a S.E. – t jelölik (n = 10). Szignifikáns különbség a PNP – S luminális megjelenése és a biliáris exkréciója között: ** p < 0,01. Az exkréciós értékek nmol – ban vannak kifejezve, tehát az ordinátán a skála számszerű értékei egy nagyságrenddel kisebbek, mint az 6. ábrán, ugyanis a PNP – S

37

luminális és biliáris exkréciója határozottan alacsonyabb, mint a PNP – G – é. Ez a tény egyúttal azt is jelenti, hogy a PNP biotranszformációja esetén a fő metabolit a glükuronid; a szulfát – konjugátum mennyisége ennél lényegesen alacsonyabb. Az ábra adataiból azt is ki lehet olvasni, hogy a PNP-S biliáris exkréciója lényegesen, statisztikailag szignifikánsan meghaladja a PNP szulfát metabolitjának a bélben történő megjelenését. A szulfát metabolit képzésében és lebontásában szereplő enzimek aktívitását demonstrálja a következő két ábra.

4.2.4. A szulfotranszferáz és az arilszulfatáz enzimek aktivitása vékonybélben és a májban 10. ábra. A szulfotranszferáz aktivitása a vékonybélben és a májban.

**

**

Az enzimaktivitást a reakció során képződött PNP-S metabolit mennyisége (nmol/perc) alapján határoztuk meg 1 mg proteinre számítva. Az adatok az átlagértékeket és a S.E.-t jelölik (n=10). A vékonybélben mért aktivitások szignifikánsan alacsonyabbak a májban mért megfelelő (kontroll, 500 µM PNP – vel perfundált) értékeknél: ** p < 0,01. Szignifikáns különbség a kontroll és a luminálisan perfundált állatok adatai között sem a vékonybél, sem a máj esetében nem volt megfigyelhető.

38

Az enzimaktivitás mintegy háromszor – négyszer magasabb a májban, mint a bélben, ez az arány nagyjából hasonló ahhoz, amit az UDP – glükuroniltranszferáznál megfigyelhettünk a máj és a vékonybél vonatkozásában. Az arilszulfatáz aktivitását mutatja be a 11. ábra.

11. ábra. Az arilszulfatáz aktivitása a vékonybélben és a májban.

Az enzimaktivitás meghatározása a 4 – nitroketakol (NC) – szulfát hidrolízise, illetve a reakció során képződött szabad NC mennyisége alapján történt (nmol/perc) 1 mg proteinre vonatkoztatva. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=10). Az enzimaktivitások a vékonybélben szignifikánsan alacsonyabbak, mint a máj megfelelő (kontroll, illetve 500 µM PNP – vel perfundált) értékei: ** p < 0,01. Szignifikáns különbség a kontroll és a luminálisan perfundált (500 µM PNP) állatok adatai között sem a vékonybél, sem a máj esetében nem volt megfigyelhető. Az arilszulfatáz aktivitása mintegy hétszer magasabb a májban, mint a vékonybélben a 11. ábra adatai alapján. Érdekes összehasonlítani a PNP – S és a PNP – G képzésében és hidrolízisében szerepet játszó enzimek aktivitását: a szulfotranszferáz és arilszulfatáz aktivitások lényegesen alacsonyabbak (a 10. –11. ábrákon nmol – ban vannak kifejezve), mint az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz aktivitása (a 7. – 8. ábrákon µmol – ban vannak kifejezve). 39

4.3. A vércukorszint kontroll és diabéteszes állatokban A vércukorszint értékei a STZ – al kiváltott kísérletes diabéteszben jellegzetesen változnak meg. A STZ a beadást követően a hasnyálmirigy béta – sejtjeinek a károsodását okozva először inzulint szabadít fel, aminek a következtében a vér glükóz koncentrációja csökken. Ezután az átmeneti fázis után az inzulintermelésre már képtelenné váló béta – sejtek miatt a vércukorszint emelkedni kezd, majd tartósan magas marad, ami általában a STZ beadást követő 48 órán belül következik be. A kísérletes diabéteszre jellemző vércukorszintnek az irodalmi adatok szerint a 300 és 600 mg/100 ml közötti értékeket tekinthetjük, ami kb. 17-34 mmol/l-nek felel meg. A saját kísérleteinkben mért vércukorszint is ebbe a tartományba esik, amelyet a STZ beadása után, illetve 1 héttel azt követően, közvetlenül a kísérletek előtt mértünk, az adatokat a 12. ábra mutatja be. 12.ábra. A vér glükóz – koncentrációja kontroll és STZ-al előkezelt állatokban inzulin távollétében és jelenlétében.

Az adatok az átlagértékeket és a S.E.-t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: ** p < 0,05. Szignifikáns különbség a STZ-előkezelt állatok értékéhez viszonyítva: # < 0,05. 40

Az ábra oszlopdiagrammjai egyértelműen igazolják, hogy az STZ – vel kiváltott kísérletes diabétesz jelentősen megemeli a vércukorszintet, továbbá, hogy ezt az emelkedést az inzulin szignifikánsan csökkenti és az STZ hatását teljesen képes kompenzálni. A gyors hatású inzulint a kísérletek előtt kapták az állatok 1 NE (nemzetközi egység) / kg dózisban i.v.

4.4. A vékonybél eliminációs tevékenységének a változása kísérletes diabéteszben: metabolitok képzése és megjelenése a béllumenben A következő ábrák a kísérletes diabétesz hatását mutatják be a vékonybél eliminációs tevékenységére, azaz a PNP metabolizmusára és a metabolitoknak a vékonybél lumenébe történő exkréciójára.

4.4.1. A PNP – G megjelenése a béllumenben kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében 13. ábra. A PNP – G luminális megjelenése kontroll és diabéteszes patkányokban a PNP 90 perces luminális perfúziója alatti különböző időpontokban.

41

A luminális perfúzió olyan izotóniás oldattal történt, amely 500 µM koncentrációjú PNP – t tartalmazott. A diabéteszes állatok egyik csoportja csak STZ – t kapott inzulin nélkül, a másik csoportot inzulinnal is kezeltük. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: * p < 0,05. Az ábrán feltüntetett adatokból látható, hogy a vizsgált időtartam 45. percétől kezdődően valamennyi esetben szignifikánsan magasabb volt a PNP – G megjelenése a diabéteszes állatok béllumenében, mint a kontrolloknál. Az adatokból az is kitűnik, hogy az inzulin teljes mértékben antagonizálja az STZ – vel kiváltott kísérletes diabétesz hatását, az inzulinnal kezelt patkányok értékei a kontroll szintre csökkentek, azoktól szignifikánsan nem térek el. Hasonló erdményt mutat a következő ábra is, amelyben a teljes perfúziós időre vonatkozó kumulatív értékeket tüntettük fel. 14. ábra. A PNP – G kumulatív (90 percig összesített) megjelenése a béllumenben kontroll és STZ – al előkezelt patkányokban.

A kísérleti körülmények azonosak az előző ábrán ismertetettekkel. A diabéteszes patkányok egyik csoportja inzulin kezelésben is részesült. Az adatok az átlagértékeket és a 42

S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: * p < 0,05. Szignifikáns különbség a STZ – vel kezelt állatok értékeihez viszonyítva: # p < 0,05. A PNP – G luminális megjelenése szignifikánsan magasabb a diabéteszes patkányokban, mint a kontrollokban. Ezt a növekedést az inzulin teljes mértékben kompenzálni tudta. A 12. és a 14. ábra oszlopdiagrammjait összehasonlítva megállapítható, hogy a vércukorszint és a PNP – G luminális megjelenése között párhuzam van a kontroll és a diabéteszes állatok értékeit illetően, amely inzulin távollétében

vagy jelenlétében is

megfigyelhető.

4.4.2. A kísérletes diabétesz hatása az UDP – glükuroniltranszferáz és a β-glükuronidáz aktivitásra a bélben inzulin távollétében és jelenlétében A PNP glükuronidációjában és a metabolit hidrolízisében szerepet játszó enzimek aktivitását mutatják be a következö ábrák. 15. ábra. Az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása a vékonybélben kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin adása nélkül és inzulin adása után.

43

Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: * p < 0,05; ** p < 0,01. Az ábra adataiból látható, hogy az UDP – glükuroniltranszferáz

aktivitása a

diabéteszes állatoknál a vékonybélben szignifikánsan magasabb, mint a kontrollokban. Érdekes, hogy ez a növekedés csak részben volt kompenzálható inzulinnal és az inzulinnal kezelt diabéteszes patkányok enzimaktivitása magasabb maradt a kontrolloknál. Az enzimaktivitást µmol/mg/perc – ben fejeztük, ami lényegében azt a PNP mennyiségét jelenti, amelyet az UDP – glükuroniltranszferáz konjugálni tudott glükuronsavval. 16. ábra. A β – glükuronidáz aktívitása a vékonybélben kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin adást követően.

Az adatok az átlagértékeket és a S.E.-t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollokhoz viszonyítva: * p < 0,05; ** p < 0,01. Szignifikáns különbség az STZ – vel kezelt patkányok értékéhez viszonyítva: ## p < 0,01. Az emelkedett UDP – glükuroniltranszferáz aktivitáshoz hasonlóan a β – glükuronidáz aktivitása is megnőtt a diabéteszes patkányokban a kontrollhoz viszonyítva. Inzulin csökkentette a fokozott β – glükuronidáz aktivitást a STZ – előkezelt állatokban, azonban az aktivitás a kontroll szintre nem tért vissza, annál szignifikánsan magasabb maradt. Másszóval, az UDP – glükuroniltranszferáz enzimnél megfigyelthez hasonlóan, az inzulin nem teljesen, hanem csak részlegesen antagonizálta a STZ – előkezelés által kiváltott kísérletes diabétesz hatását a glükuronid hidrolízisében résztvevő enzimek aktivitására vonatkozólag. Az oszlopok 44

az enzimaktivitásokat a fenolftalein – β – glükuronid konjugátumból a β – glükuronidáz hatására képződött szabad fenolftalein mennyiségében (µmol/mg/perc) kifejezve mutatják.

4.4.3. A PNP-S megjelenése a béllumenben kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében A következő két ábra a PNP másik metabolitjának (PNP – S) a béllumenben történő megjelenését mutatja be a perfúziós idő függvényében, illetve az összesített (kumulatív) értékek alapján. 17. ábra. A PNP – S luminális megjelenése a perfúziós idő függvényében kontroll és diabéteszes állatokban inzulin adás nélkül és inzulin adást követően.

A luminális perfúzió olyan izotóniás oldattal történt, amely 500 µM koncentrációjú PNP – t tartalmazott. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik. A 17. ábra a PNP – S luminális megjelenését mutatja be a perfúziós idő függvényében. Látható, hogy a PNP – S jóval kisebb mennyiségben mutatható ki a béllumenben, mint a

45

PNP – G (13. ábra). A PNP szulfát – metabolitja lényegében csak a PNP – vel történő perfúzió 40. percétől kezdve ért el kimutatható értékeket, de ezt követően is lényegesen alacsonyabb volt, mint a PNP – G-nél mért intesztinális exkréció. Az ábra adataiból az is kitűnik, hogy STZ előkezelés kismértékben fokozta ugyan a PNP – S luminális megjelenését a bél lumenében, a különbség azonban egyik időpontnál sem volt szignifikáns. Az inzulin az STZ – vel kiváltott kísérletes diabéteszben hatástalan maradt. Ezek az adatok tehát lényeges eltérést mutatnak a PNP glükuronid – metabolitjával kapcsolatos változásokhoz képest, a PNP – G luminális megjelenése ugyanis nőtt a diabéteszes patkányokban és ez a növekedés inzulinnal antagonizálható volt. A PNP – S kumulatív luminális megjelenési adatait a következő ábra foglalja össze. 18 ábra. A PNP – S kumulatív, azaz a perfúziós időtartam végén mért összesített luminális megjelenése a bélben.

A kísérleti körülmények a 17. ábránál említettekkel azonosak. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik. Sem az STZ – előkezelést, sem az inzulin adást követően a

46

kontrollhoz, illetve a diabéteszes értékekhez viszonyítva szignifikáns különbség nem volt megfigyelhető. Ezek az adatok lényegében megerősítik az időfüggéssel kapcsolatos megállapításokat, mely szerint – a PNP – G luminális exkréciójától eltérően– az STZ által kiváltott kísérletes diabétesz nem befolyásolja a PNP – S luminális megjelenését, illetve, hogy ebben az esetben az inzulin is hatástalan.

4.4.4. A kísérletes diabétesz hatása a szulfotranszferáz és az arilszulfatáz aktivitására a bélben inzulin távollétében és jelenlétében A szulfát metabolit (PNP – S) képzésében és hidrolízisében szerepet játszó enzimek (szulfotranszferáz, arilszulfatáz) adatait mutatja be a következő két ábra kontroll és diabéteszes patkányokban.

19. ábra. A szulfotranszferáz enzim aktivitása a vékonybélben kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adás esetén.

Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Az ábrán feltüntetett oszlopdiagrammok a szulfotranszferáz enzim aktivitását mutatják az enzim hatására a vékonybélben képződött metabolit (PNP – S) mennyiségében (nmol) 47

kifejezve 1 mg proteinre és 1 percre vonatkoztatva.Az adatokból látható, hogy az STZ – vel kiváltott diabéteszes patkányok értékei nem különböznek szignifikánsan a kontrolltól sem inzulin távollétében, sem inzulin jelenlétében. A következő ábra a szulfát – metabolit hidrolízisében szerepet játszó enzim (arilszulfatáz) aktivitását demonstrálja kontroll és diabéteszes patkányokban .

20. ábra. Az arilszulfatáz enzim aktivitása a vékonybélben kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adás esetén.

Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Az ábra adatai egyértelműen mutatják, hogy nincs szignifikáns különbség a PNP – S hidrilízisét katalizáló enzim aktivitásában STZ – előkezelést követően a vékonybélben, valamint, hogy az inzulin sem fejt ki statisztikailag értékelhető (szignifikáns) hatást a diabéteszes állatokban az intesztinális arilszulfatáz aktivitására. A PNP – S képzésében és hidrolízisében fontos enzimek aktivitása, illetve annak változatlansága a diabéteszes állatokban, összhangban van azzal a kísérleti adattal, mely szerint a PNP szulfát – metabolitjának a luminális megjelenése nem tér el a diabéteszben a kontroll értékektől. Jelentősen különbözik ugyanakkor ez a megfigyelés a PNP – G – vel kapcsolatos eredményektől, a PNP – glükuronid luminális megjelenésében és a közreműködő

48

enzimek aktivitásában ugyanis jelentős változásokat találtunk a diabéteszes patkányokban, illetve inzulin hatására.

4.5. A máj eliminációs tevékenységének változása kísérletes diabéteszben: metabolitok képzése és exkréciója az epével A következő ábrák a máj eliminációs tevékenységét mutatják be kontroll és diabéteszes patkányokban, azaz a metabolitok képzését a májban és azok biliáris exkrécióját. A kontroll vércukorszint 9,61 ± 1,92, a diabéteszes állatokban 27,1 ± 2,95, az inzulinnal kezelt diabéteszes patkányokban 11,9 ± 3,99 nmol/l volt.

4.5.1. A PNP – G biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében. 21. ábra. A PNP – G biliáris exkréciója a 15 perces periódusokban meghatározott értékek alapján a perfúziós idő függvényében kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adása esetén.

49

A kísérleti periódus alatt a vékonybél lumenét olyan izotóniás médiummal perfundáltuk, amely 500 µM koncentrációjú PNP – t tartalmazott. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: * p < 0,05; ** p < 0,01. A 21. ábra adatai a perfúziós idő függvényében mutatják a 15 perces periódusokban gyűjtött epében megjelent PNP – G mennyiségét. Jól látható, hogy az STZ – előkezeléssel kiváltott diabétesz valamennyi 15 perces periódusban csökkentette a PNP – G biliáris exkrécióját. Az ábra adataiból az is kiolvasható, hogy a diabétesszel létrehozott csökkenés a PNP – G epével történő kiválasztásában inzulin adásával teljes mértékben kompenzálható volt, azaz az inzulin jelenlétében mért exkréciós értékek nem különböztek a kontrolltól. A kísérleteket a STZ beadása után 1 héttel végeztük, az inzulin (1 NE/kg i.v. ) beadása közvetlenül a kísérlet megkezdése előtt történt. A luminális perfúzió teljes időtartama alatt (90 perc) meghatározott kumulatív (összesített) biliáris exkréciós értékeket mutatja be a következő ábra a PNP – G – re vonatkozólag. 22. ábra. A PNP – G kumulatív biliáris exkréciója a teljes perfúziós időtartamra (90 perc) vonatkoztatva kontroll és diabéteszes patkányokban. A vékonybél luminális perfúziója azonos volt az előző ábrán leírtakkal.

50

Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). A kísérleteket az STZ beadása után 1 héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v.) közvetlenül a kísérlet megkezdése előtt kapták az állatok. Szignifikáns különbség a kontrolltól: ** p < 0,01. Szignifikáns különbség a diabéteszes állatok értékei között inzulin távollétében vagy jelenlétében történő vizsgálatok esetén: ## p < 0,01. Az ábra adataiból kitűnik, hogy az STZ – vel kiváltott diabétesz szignifikánsan csökkentette a PNP – G biliáris exkrécióját. Az ábrán feltüntetett adatok egyértelműen mutatják, hogy inzulin adásával a diabétesz okozta depressziós hatás a PNP – G epével történő kiválasztására teljes mértékben kompenzálható volt.

4.5.2. A kísérletes diabétesz hatása az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz aktivitására a májban inzulin távollétében és jelenlétében A 23. és a 24. ábra foglalja össze azon enzimek aktivitási értékeit, amelyek a májban a PNP – G képződéséért és a hidrolíziséért felelősek. 23. ábra. Az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása a májban kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adás esetén.

51

A kísérleteket az STZ beadás után egy héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v. ) közvetlenül a kísérletek megkezdése előtt kapták a diabéteszes állatok. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: ** p < 0,01. Szignifikáns különbség a diabéteszes állatok értékei között inzulin távollétében vagy jelenlétében történő vizsgálatok esetén: ## p < 0,01. Az ábra adatai egyértelműen mutatják, hogy az STZ – vel kiváltott diabétesz szignifikánsan csökkentette az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitását a májban. Az is világosan látható, hogy ez a negatív hatás teljes mértékben antagonizálható inzulin adásával. Ezek az eredmények párhuzamosságot mutatnak a PNP – G biliáris exkréciójánál megfigyelt változásokkal a diabéteszes állatokban. Az enzimaktivitást µmol/mg/perc-ben fejeztük ki, amely azt a PNP mennyiséget jelenti, amely az UDP – glükuroniltranszferáz működése révén glükuronidálódott 1 mg proteinre és 1 percre vonatkoztatva. 24. ábra. A β – glükuronidáz aktivitása a májban kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adás esetén.

A kísérleteket az STZ beadás után 1 héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v.) közvetlenül a kísérletek előtt kapták az állatok. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: ** p <0,01. Szignifikáns különbség a diabéteszes állatok értékei között inzulin távollétében és jelenlétében történő vizsgálatok esetén: ## p < 0,05.

52

Az UDP – glükuroniltranszferáz enzim aktivitására gyakorolt negatív hatáshoz hasonlóan a diabétesz a β – glükuronidáz aktivitását is csökkentette, bár a csökkenés itt kisebb mértékű volt. Érdekes azonban megfigyelni az inzulin hatását, ugyanis ellentétben a glükuronidképző enzimnél (UDP –glükuroniltranszferáz) tapasztaltakkal, a diabétesz okozta csökkenést a hidrolízisért felelős enzimnél az inzulin nem antagonizálta. A két enzim aktivitásában észlelt eltérés hozzájárulhat az inzulin azon hatásához, melynek révén a PNP – G csökkent biliáris exkrécióját az inzulin fokozni tudta diabéteszes patkányokban (növekedés a glükuronid képzésben és csökkenés a hidrolízisben).

4.5.3. A PNP-S biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulativ értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében 25. ábra. A PNP – S biliáris exkréciója a 15 perces periódusokban meghatározott értékek alapján a perfúziós idő függvényében kontroll és diabéteszes állatokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adása esetén.

A kísérleti periódus alatt a vékonybél lumenét olyan izotóniás médiummal perfundáltuk, amely 500 µM koncentrációjú PNP – t tartalmazott. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). A kísérleteket a STZ beadása után egy héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v.) 53

közvetlenül a kísérletek megkezdése előtt kapták a diabéteszes állatok. Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: * p < 0,05; ** p < 0,01. Az ábrán a diabétesz hatását mutatjuk be PNP – S epével történő kiválasztására a perfúziós idő függvényében. Látható, hogy az STZ előkezelés szignifikánsan csökkentette a PNP – S biliáris exkrécióját valamennyi periódusban a kontrollhoz viszonyítva. Ez a változás hasonló a PNP – G biliáris exkréciójánál megfigyelt eltéréshez, azonban az inzulin a szulfát – konjugátum kiválasztásában észlelt csökkenést nem befolyásolta szignifikánsan, ami eltér a PNP – G-nél tapasztalt változásoktól. A diabéteszes patkányoknál a PNP – S biliáris exkréciójában nem volt szignifikáns eltérés az inzulinnal nem kezelt és az inzulinnal kezelt patkányok értékei között. 26. ábra. A PNP – S kumulatív (összesített érték 90 perc alatt) biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adás esetén.

A kísérleti körülmények azonosak a 25. ábránál leírtakkal. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: ** p < 0,01. A kumulatív értékeket bemutató ábra adatai megerősítik az előző ábrával kapcsolatos megállapításokat. Látható, hogy az STZ – vel kiváltott diabétesz szignifikánsan csökkentette a PNP – S kumulativ biliáris exkrécióját a kontrollhoz viszonyítva, sőt itt a különbség még kifejezettebb, mert az egyes periódusoknál látott változások összegződnek. Ezen az ábrán is 54

jól megfigyelhető, hogy a diabéteszes állatoknál a PNP – S biliáris exkréciójában létrejött csökkenést az inzulin nem képes kompenzálni.

4.5.4. A kísérletes diabétesz hatása a szulfotranszferáz és az arilszulfatáz aktivitására a májban inzulin távollétében és jelenlétében A következö két ábra demonstrálja azoknak az enzimeknek az aktivitását kontroll és diabéteszes patkányokban, amelyek a PNP – S szintézisében és hidrolízisében játszanak fontos szerepet.

27. ábra. A szulfotranszferáz aktivitás a májban kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin kezelés esetén.

A kísérleteket az STZ beadása után egy héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v.) közvetlenül a kísérletek megkezdése előtt kapták a diabéteszes patkányok. Az adatok az átlagértékeket és az S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség diabéteszben a kontrollhoz viszonyítva, sem a diabéteszes állatoknál az inzulin nélküli és az inzulinnal kezelt csoportok között nem volt megfigyelhető.

55

A máj szulfotranszferáz aktivitását annak a PNP – S-nek a mennyiségével fejeztük ki nmol-ban, amely ennek az enzimnek a működése révén keletkezett 1 perc alatt 1 mg proteinre vonatkoztatva. Az adatokból látható, hogy a diabétesz nem változtatta meg a szulfotranszferáz aktivitását és hogy az inzulin sem hozott létre szignifikáns változást az enzim aktivitásában diabéteszes patkányokban.

28. ábra. Az arilszulfatáz aktivitása a májban kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin kezelés esetén.

A kísérleteket az STZ beadása után egy héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v.) közvetlenül a kísérlet megkezdése előtt kapták a diabéteszes patkányok. Az adatok az átlagértékeket és az S.E. – t jelölik (n=7). A diabéteszes állatok arilszulfatáz aktivitása nem tért el szignifikánsan a kontrollokétól és a diabéteszes patkányok inzulinnal nem kezelt és kezelt csoportjainak az enzimaktivitása sem különbözik szignifikánsan egymástól. Az enzimaktivitás adatait a 4 – nitrokatekol (4 – NC) azon mennyiségében (nmol) fejeztük ki, amely az arilszulfatáz hatására képződött a 4 – NC szulfát konjugátum hidrolízise során 1 perc alatt 1 mg proteinre vonatkoztatva. A diabétesz hatástalan volt az enzim aktivitására és az inzulin sem befolyásolta a diabéteszes patkányok májában az arilszulfatáz aktivitását. A PNP szulfát – konjugációját befolyásoló enzimek aktivitása tehát nem változott az STZ – vel kiváltott kísérletes diabétesz hatására, miközben a PNP – S biliáris exkréciója 56

szignifikánsan csökkent diabéteszben. Ezek a kísérleti adatok arra utalnak, hogy nincs direkt korreláció az exkréciós folyamatok és az enzimaktivitások, illetve azok változása között. A metabolitoknál kisebb mennyiségben ugyan, de mégis megjelenik az epében maga az anyavegyület, a PNP is. A PNP biliáris exkréciójára vonatkozó adatokat tünteti fel a következő két ábra.

4.5.5. A PNP biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes állatokban a kísérleti idő függvényében és a kumulatív értékek alapján inzulin távollétében és jelenlétében A PNP luminális perfúziója során a perfúziós médiumból a PNP egy része felszívódik és a vena portae – n keresztül először a májba kerül, ahol metabolizálódik és a metabolitok az epével kiválasztódnak. Ezekről a folyamatokról, a hepatikus elimináció részleteiről, mennyiségi viszonyairól és a folyamatokban résztvevő enzimek aktívitásáról adtak információt a 4.5. pontban eddig bemutatott ábrák. Az epével azonban nemcsak a metabolitok (PNP – G, PNP – S), hanem maga az anyavegyület (PNP) is kiválasztódhat. Az ezzel kapcsolatos kísérleti eredményeket foglalja össze a következő két ábra. 29. ábra. A PNP biliáris exkréciója 15 perces időperiódusokban meghatározott értékek alapján a perfúziós idő függvényében kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin adása esetén.

57

A kísérleti periódus alatt a vékonybél lumenét olyan izotóniás médiummal perfundáltuk, amely 500 µM koncentrációjú PNP – t tartalmazott. A kísérleteket az STZ beadása után egy héttel végeztük, az inzulint (1 NE/kg i.v.) közvetlenül a kísérletek megkezdése előtt kapták a diabéteszes állatok. Az adatok az átlagértékeket és a S.E. – t jelölik (n=7). Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: * p < 0,05, ** p < 0,01. Az ábra adatai mutatják, hogy az STZ – vel kiváltott diabétesz szignifikánsan csökkentette a szabad, nem – konjugált PNP biliáris exkrécióját vizsgált időperiódusok többségében. Az is kitűnik az ábrán feltüntetett adatokból, hogy az inzulin nem befolyásolta a diabéteszes állatokban az anyavegyület (PNP) kiválasztódását az epével, másszóval nem antagonizálta az STZ – vel létrehozott diabétesz csökkentő hatását a PNP biliáris exkréciójára. A vizsgált 15 perces periódusok összesített (kumulatív) adatait mutatja be a PNP biliáris exkréciójára vonatkozólag a következő ábra.

30. ábra. A PNP kumulativ (összesített érték 90 perc alatt) biliáris exkréciója kontroll és diabéteszes patkányokban inzulin kezelés nélkül és inzulin kezelés esetén.

A kísérleti körülmények azonosak a 29. ábrával leírtakkal. Az oszlopok az egyes periódusok összesített adatainak az átlagértékeit és a S.E. – t jelölik. Szignifikáns különbség a kontrollhoz viszonyítva: ** p < 0,01. Az eltérés nem szignifikáns a diabéteszes patkányok két 58

csoportja ( inzulin nélküli és inzulinnal kezelt) között a PNP biliáris exkréciójára vonatkozóan. A kumulatív értékeket demonstráló ábra még hangsúlyosabbá teszi az előző ábrán bemutatott eltéréseket. Látható, hogy a diabétesz szignifikánsan csökkentette a PNP biliáris exkrécióját a kontrollhoz képest, sőt a kumulativ értékek között még kifejezettebb a különbség, mert az egyes időperiódusoknál észlelt eltérések összeadódnak. Ezen az ábrán is látható továbbá, hogy a diabéteszes állatoknál a PNP biliáris exkréciójában észlelhető csökkenést az inzulin nem befolyásolta. Az utolsó két ábrán bemutatott kísérleti eredmények arra utalnak, hogy a diabétesz magát az exkréciós folyamatot is képes befolyásolni a metabolizáló enzimek aktivitásának a változása nélkül. Ezekben a kísérletekben ugyanis a szabad, nem – konjugált

PNP

transzportjáról van szó, függetlenül az enzimek hatásától, illetve az aktivitásuk változásától.

59

5. Megbeszélés Az értekezésben bemutatott vizsgálatok lényegében három téma köré csoportosíthatók: 1. A PNP – nek és metabolitjainak (PNP – G, PNP – S) RP – HPLC módszerrel történő mérése, a mérési módszer kidolgozása és adaptálása az epeminták meghatározására; 2. A konjugációs reakciókban résztvevő enzimek aktivitása és a metabolitok intesztinális és hepatikus exkréciója közötti összefüggés vizsgálata kontroll állatokban; 3. A kísérletes diabétesz hatása a bél és a máj eliminációs tevékenységére. Az eredmények bemutatása alapvetően ennek a tagozódásnak megfelelően történt, célszerűnek látszik, hogy a vizsgálatok során kapott adatokat is hasonló megközelítésben tárgyaljuk, illetve értékeljük.

5.1. A HPLC – vel történő mérési módszer módosítása, továbbfejlesztése A mérési módszerek megbízhatósága és pontossága minden kísérletes munka esetén kulcsfontosságú, hiszen adekvát következtetéseket csak a reprodukálható és pontos mérésekből és kísérleti eredményekből tudunk levonni. Célkitűzéseink megvalósítása céljából egy új, fordított fázisú HPLC módszer kifejlesztésére került sor, hogy a kísérleteink során nyert biológiai mintákból egyidejüleg tudjuk meghatározni a PNP, PNP – G és a PNP – S jelenlétét.

Az epeminták mérése során, ezt az általunk fejlesztett módszert tovább

módosítottuk és belső standardként ETP – t alkalmaztunk. Az új módszerek fejlesztése azért is szükséges volt, mert a kísérleti elrendezésünkben egy – egy állatból esetenként nagyszámú minta ( 12 perfuzátum, 6 epe) gyűjtése történt meg, és a már meglévő módszerekkel nem tudtuk volna viszonylag rövid idő alatt és megfelelő költséghatékonységgal analizálni a mintáinkat (3, 4).

A módszer kidolgozása a meghatározandó anyagok kémiai

tulajdonságainak és korábbi mérési eljárások tapasztalatainak figyelembevételével történt (10, 32, 34, 44, 57, 76, 104). A kidolgozott, metanol – víz eluenst tartalmazó RP – HPLC módszer könnyen és viszonylag gyorsan kivitelezhető, ezért időtakarékos, továbbá jól reprodukálható mérési adatokat biztosít (3, 4). Az új HPLC mérési módszer előnyei az alábbi pontokban foglalhatók össze: az ionpárképző alkalmazásával a retenciós idők rövidültek, a 60

perfúziós mintáknál 6, az epemintáknál pedig 15 perces időtartamon belül valamennyi vizsgált vegyület szeparálható volt. A retenciós időket

a bélperfuzátumok esetén

reprodukálhatónak találtuk 1,05 – 3,20 % RSD intervallumon belül, a csúcsok alatti területek RSD értékei a reprodukálhatóság szempontjából szintén az elfogadható 2,15 – 3,78 tartományba estek. Az epe savas és bázikus komponenseit és karakterét figyelembe véve adekvát puffert használtunk a pH beállítására, emeltük az ionpár képző TBAB mennyiségét, előtét oszlopot, valamint belső standardot (ETP) alkalmaztunk a módszer megbízhatóságának és a pontosságának a növelése érdekében (4). A metabolitok (PNP – G, PNP – S) optimális pH esetén gyakorlatilag teljes mértékben ionizált formában vannak jelen és ilyen módon ionpárokat tudnak képezni az RP stacionáris fázisához adszorbeált és az eluensben is jelenlévő TBAB – al. Az epeminták esetén a retenciós időket reprodukálhatónak találtuk a 0,42 -4,04 % RSD intervallumon belül és az integrált csúcsok alatti területek RSD értékei is a reprodukálhatóság szempontjából elfogadható 0,49-0,57 % intervallumba estek (4). Összefoglalva a HPLC módszerrel kapcsolatos fejlesztő és módosító munkánkat azt mondhatjuk, hogy az általunk fejlesztett, az UV detektálással összekapcsolt izokratikus ionpár fordított fázisú eljárás (RP – HPLC) alkalmas a PNP, a PNP – G és a PNP – S egyidejű, megbízható, pontos és gyors szeparálására és meghatározására mind az intesztinális perfúziós folyadékból, mind az epéből származó minták esetén. A retenciós idők által meghatározott és az analizishez szükséges 6 –14 perces kromatográfiás időtartam rövidebb az általunk fejlesztett módszernél, mint a korábban használt eljárásokhoz szükséges időperiódus, ami különösen a nagyszámú minták sorozatban történő mérésénél jelent értékelhető előnyt.

5.2. A konjugációs reakciókban résztvevő enzimek aktivitása, valamint a metabolitok intesztinális és hepatikus exkréciója közötti összefüggés kontroll állatokban Az értekezésben bemutatott kísérletekben azoknak az enzimeknek az aktivitását vizsgáltuk, amelyek a PNP glükuronidációjában (UDP – glükuroniltranszferáz, β – glükuronidáz) és szulfatációjában (szulfotranszferáz, arilszulfatáz) játszanak szerepet. A metabolizmus során képzett glükuronid – és szulfát – származékok

mennyiségének a

szempontjából mind a szintézisükben, mind a hidrolitikus bontásukban közreműködő enzimek is fontosak (73, 79, 80), ezért nemcsak a metabolitok létrejöttét katalizáló enzimek, hanem a konjugátumok hidrolíziséért felelős enzimek aktivitását is vizsgáltuk. Ez azért is indokolt, 61

mert abban a helyzetben, ha például a konjugátum szintézise és hidrolízise ugyanolyan mértékben és irányban változik, akkor a metabolit kimutatható mennyiségében eltérés nem várható, illetve nem észlelhető. A gyógyszerek döntő többsége szájon keresztül kerül alkalmazásra, ennek következtében a molekulák először a béltraktust, majd a májat érik el és csak ezt követően juthatnak be a véráramba, a szisztémás keringésbe, majd onnan a hatás helyére. A gyógyszerek tehát a szisztémás keringésbe való kerülés előtt, a bélben és a májban metabolizálódhatnak

és

kiválasztódhatnak,

azaz

eliminálódhatnak

az

úgynevezett

preszisztémás eliminációval (12, 19, 43, 48, 52, 56, 89, 121). Ezeknek a folyamatoknak a következtében a per os bevett gyógyszereknek csak egy hányada éri el a szisztémás keringést és vált ki farmakológiai és terápiás hatást (biológiai hasznosulás, hasznosíthatóság, hozzáférhetőség, biovailability). Sokszor és több szempontból is felmerül a kérdés, hogy a perszisztémás eliminációban, amely a biológiai hasznosíthatóság döntő tényezője, milyen mértékben vesz részt a béltraktus és a máj, milyen ezen szerveknek az egymáshoz viszonyított jelentősége. A legutóbbi ideig döntő, szinte kizárólagos szerepet tulajdonítottak a gyógyszerek metabolizmusában és a preszisztémás eliminációban a májnak. A legutóbbi egy – két évtizedben azonban egyre több adat, kísérleti eredmény szól amellett, hogy a preszisztémás eliminációban, illetve a gyógyszerek biológiai hasznosíthatóságában a béltraktusnak is nagyon fontos szerepe van (12, 39, 48, 49, 64). Az eddig rendelkezésre álló adatok alapján nem mindig könnyű eldönteni, hogy a máj és a béltraktus egyes konkrét esetekben milyen relatív jelentőséggel bír. Ezt jól igazolja és jellemzi például egy nemrég megjelent farmakológiai review-nak már címe is: „Is the role of small intestine in first-pass metabolism overemphasized?”, azaz, hogy manapság esetenként akár már túl is hangsúlyozzák a vékonybél ilyen irányú tevékenységét és jelentőségét (66). A fentieket figyelembe véve az értekezésben összefoglalt kísérletekben olyan elrendezést és metodikát igyekeztünk alkalmazni, amelyeknek révén mind a bél, mind a máj metabolikus enzimjeinek aktivitását, azaz a metabolitok képzését, illetve a konjugátumok exkrécióját is vizsgálni tudtuk mind két szerv (vékonybél, máj) esetében. Az általunk alkalmazott kísérleti elrendezés lényegében megfelel a per os gyógyszeralakalmazásnak, a vizsgált vegyületet ugyanis közvetlenül juttattuk és perfundáltuk a vékonybélbe, ahová a szájon keresztül történő bevétel után is jutott volna. További előnye a kísérleti metodikánknak, hogy ugyanazon az állaton egyidejűleg tudtunk információt nyerni az intesztinális és a hepatikus eliminációról, sőt a metabolikus enzimaktivitásokról is.

62

Kísérleti adataink szerint az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása mintegy 2,5 – 3 – szor

magasabb volt a májban, mint a vékonybélben. Ehhez hasonlóan más szerzők is

magasabb glükuronidációs rátát találtak például emberi májban, mint a bél mikroszóma frakciójában (12, 21, 84). Érdekes azonban, hogy kísérleteinkben a β – glükuronidáz aktivitás is magasabb volt a májban, sőt a különbség ebben az esetben még jelentősebb, mintegy hatszoros volt a máj és a bél között. Ez az adat – legalább is részben – magyarázhatja azt a megfigyelésünket, hogy a máj magasabb UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása ellenére sem volt szignifikáns különbség a PNP – G – nek a béllumenbe történő megjelenése és a biliáris exkréciója között. Tovább árnyalja a képet, illetve a két szerv működésének az összehasonlítását, hogy az enzimaktivitások egységnyi, tehát azonos szövetmennyiségre vonatkoznak, ugyanakkor az általunk demonstrált adatok az alkalmazott metodikából adódóan egyik esetben a máj egészének az exkréciós tevékenységét fejezik ki az epébe történő kiválasztás esetén, a vékonybéllel kapcsolatban közölt adatok viszont csak a kanülált bélszakasz (mintegy 10 cm hosszú) működését reprezentálják. Ezt a tényt figyelembe véve joggal feltételezhező, hogy a vékonybél, illetve a béltraktus egésze nagyobb mennyiségű PNP – G – t exkretált a béllumenbe, mint a máj az epébe, még akkor is, ha a metabolikus és exkréciós aktivitás bélszakaszonként eltérő lehet (16). Azt is hangsúlyozni kell, hogy az értekezésben közölt kísérleti eredmények egy adott koncentrációjú (500 µM) PNP luminális perfúziójára vonatkoznak. Különböző koncentrációjú (20 – 1000

µM) PNP luminális

perfúziója esetén és egyéb vizsgálataink során azt találtuk ugyanis, hogy a PNP – G luminális megjelenése és biliáris exkréciója közötti arány a szubsztrát koncentrációtól, azaz a dózistól függően változik (39, 87). Ez pontosabban azt jelenti, hogy alacsonyabb dózisnál az általunk vizsgált kísérleti elrendezésben a perfundált bélben jelent meg több PNP – G , mint az epében, a dózis emelésével (kb. az 500 µM PNP perfúziós koncentrációnál) egy hozzávetőleges egyensúly érhető el, a dózis további növelésével azonban már meghaladta a PNP – G biliáris exkréciója ennek a metabolitnak a luminális megjelenését. A szulfát – képzéssel kapcsolatos enzimeknek a bélben és a májban mért aktivitása némiképpen hasonlóságot mutatott a glükuronidációnál említettekkel. Nevezetesen a szulfotranszferáz aktivitása a májban hozzávetőlegesen szintén kb. háromszor magasabb volt, mint a vékonybélben, a máj arilszulfatáz aktivitása pedig kb. hétszer nagyobb volt a bélben mért értéknél. Egyéb vegyületek vizsgálata során más szerzők is találtak hasonló eltéréseket a szulfatációban emberi máj és intesztinális citoszól analízisekor (12, 21). Ellentétben azonban a PNP – glükuronid intesztinális és biliáris exkréciós értékével, a szulfát – konjugátum (PNP – S) epével történő kiválasztása konzekvensen és szignifikánsan magasabb volt, mint annak 63

az intesztinális megjelenése a perfundált bélkacsban. A különböző enzimek aktivitásának összehasonlításakor

érdemes

felhívni

a

figyelmet

arra

is,

hogy

az

UDP

–

glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz aktivitás lényegesen, mintegy két, illetve három nagyságrenddel magasabb volt mind a májban, mind a vékonybélben, mint a szulfát – konjugátum

mennyiségét meghatározó enzimeké (szulfotranszferáz, arilszulfatáz). Ilyen

jellegű vizsgálatok során más szerzők is hasonló eltéréseket, illetve arányokat találtak (12, 21, 84). Ezek a különbségek részben magyarázhatják a PNP – G és a PNP – S luminális és biliáris exkréciójában észlelt nagyon jelentős eltéréseket. Közvetlen összefüggés vagy arányosság azonban a metabolikus enzimek aktivitása és a metabolitok intesztinális és biliáris exkréciója között nem állapítható meg. Ez valószínűleg azzal magyarázható, hogy a metabolitok luminális megjelenésében és epével történő kiválasztásában a metabolikus enzimek ugyan fontos, de nem kizárólagos szerepet játszanak és hogy ezenkívül még számos egyéb faktor is befolyásolja az említett transzport folyamatokat, illetve azok mérhető végeredményét, mint például a szubsztrát kínálat, a dózis, membrán funkciók, exkréciós lépések, cseretranszport, kofaktorok jelenléte és mennyisége stb. (9, 12, 60, 84, 87, 95). A máj és a vékonybél eliminációs tevékenységében észlelt különbségek magyarázatánál azt a tényt is számításba kell venni, hogy a szubsztrát koncentrációk a mi kísérleti elrendezésünknél, de általában a per os gyógyszeradást követően is, jelentősen különbözhetnek az enterocitákban és a hepatocitákban.

5.3. A kísérletes diabétesz hatása a bél és máj eliminációs tevékenységére A diabétesz egy komplex, elsősorban inzulinhiányon alapuló betegség, amely viszonylag gyakori a népesség körében és az incidenciája sajnos folyamatosan nő. Egy olyan megbetegedésről

van

szó,

amely

alapvetően

érinti

a

hormonális

–

és

az

anyagcserefolyamatokat, de befolyásolja a gyógyszerek eliminációját is (1, 33, 115, 116, 117). Számos transzport funkció változik ebben a betegségben a vékonybélben, beleértve például magát a cukorfelszívódást is (28, 37). Módosulhat továbbá a máj struktúrája és funkciója, valamint a különböző szervek intracelluláris metabolikus aktivitása is (5, 6, 26, 35, 54, 71, 89). Érdekes azonban, hogy viszonylag kevés adat áll rendelkezésre a máj gyógyszereket elimináló (metabolizáló és exkretáló) tevékenységéről diabéteszben vagy a hiperglikémia esetén és az inzulin hatására vonatkozólag is (1, 15, 22, 29, 77, 78, 115, 116, 117). Még kevesebb, szinte elenyésző azon közleményeknek a száma, amelyek a 64

vékonybélben létrejövő eliminációs változásokkal foglalkoznak diabétesz vagy hiperglikémia hatására (1, 38, 43, 82). Kísérleteinkben ezért elsősorban a farmakonok eliminációja szempontjából is fontos két szerv, a bél és a máj tevékenységében tapasztalható változásokkal foglalkoztunk, főleg a metabolikus és exkréciós működésre koncentrálva vizsgáltuk továbbá a metabolikus reakciókban szerepet játszó enzimek aktivitását, illetve azok változását is kísérletes diabéteszben. A kísérleteket experimentális diabéteszes patkányokon végeztük, melyet STZ-vel hoztunk létre. Az STZ a hasnyálmirigy béta – sejtjeinek a károsítása révén átmenetileg csökkenti a vércukorszintet az inzulin felszabadítása következtében, és a beadást követő második naptól mérhetünk az állatoknál tartósan magas cukorkoncentrációt a vérben. A kísérletes diabétesz létrehozására a specifikus hatása miatt manapság szinte kizárólag STZ-t használnak, de sokszor különbség van azonban a tekintetben, hogy bizonyos változásokat a STZ beadását követően mennyi idő múlva vizsgálnak a szerzők (8, 106). Ebből a szempontból gyakran jelentős eltérések vannak, történtek vizsgálatok az STZ beadását követő 7 napon belül szinte már az 1. naptól kezdődően az első hét végéig terjedő különböző időpontokban, de két hetes, sőt hosszabb időtartam után is. Az STZ beadását követő rövidebb időtartamú diabéteszt (egy-két naptól kb. hét-tíz napig) rövid tartamú (short term), a két hétnél hosszabb időtartamú kísérletes diabéteszt pedig általában hosszú tartamú vagy lefolyású (long term) diabétesznek is szokták nevezni. Esetenként csaknem egy hónapos (28 napos) időtartamú kísérleti diabéteszt követően is végeztek vizsgálatokat (8). A kísérleti eredmények, illetve azok értékelése vagy összehasonlíthatósága miatt is érdekes lehet a kísérletes diabétesz időtartama, mert ennek függvényében az adatok eltérhetnek egymástól. A gyógyszerek eliminációjára irányuló vizsgálatokkal kapcsolatosan is érdekes lehet, hogy a fennálló diabétesz (hiperglikémia) időtartamától függően számos olyan változás, illetve azok közti eltérés is létrejöhet, melyek a farmakokinetikai paramétereket is érinthetik. Többek között például a testtömeg, a máj tömege, a fehérjeszintézis mértéke a különböző szervekben, vagy a megoszlási tér is változhat, főleg a hosszabb időtartamú kísérletes diabéteszben. Továbbá bizonyos, például a hormonális változások miatt létrejövő kompenzációs mechanizmusok is beindulhatnak, illetve különbözőek lehetnek a long term típusú diabétesz esetén (29, 30). Ezért a különböző kísérleti eredmények összehasonlításakor az látszik a legkorrektebbnek, ha a nagyjából azonos időtartamú és hasonló módon kiváltott kísérletes diabétesz során kapott adatokat vetjük össze egymással. Esetünkben a vizsgálatok az STZ beadását követően 1 hét múlva történtek, ami a fenti terminológiát használva a rövid lefolyású vagy időtartamú (short

65

term) diabétesz kategoriába tartozik, ezért a mások által nyert adatokkal való összehasonlításnál ezt a körülményt célszerű figyelembe venni. Az STZ beadás után a hasnyálmirigy a béta – sejtjeinek elpusztulása következtében inzulinhiány, illetve hiperglikémia alakul ki. Számos egyéb változás mellett ezek tekinthetők a legjellegzetesebb, legkarakterisztikusabb tüneteknek az experimentális diabéteszben. Ezért nem véletlen, hogy több kísérleti elrendezésben történtek vizsgálatok annak kiderítésére, hogy az inzulin pótlásával, illetve az inzulin különböző típusú és hatástartamú készítményeivel és azok eltérő adásával kompenzálhatók-e a kísérletes diabéteszben észlelt változások (50, 88, 105). Az értekezésben bemutatott vizsgálatokban mi a gyorshatású inzulin hatását elemeztük olymódon, hogy az inzulint közvetlenül a kísérletek megkezdése előtt adtuk 1 héttel az STZ beadását követően, ami tehát egy akut inzulin kezelésnek vagy visszapótlásnak felel meg annak hangsúlyozásával, hogy a kísérlet előtti periódusban a vércukorszint folyamatosan magas volt és a diabéteszes tartománynak megfelelő értékeket mutatott. Az eredmények összehasonlításakor ezt a körülményt figyelembe kell venni, mert az inzulin hatását számos egyéb formában és időtartamban történő adagolásnál is vizsgálták (50, 55, 88, 105, 113). Egyes kísérletekben gyorshatású, másokban tartóshatású készítményeket alkalmaztak, vagy a kettő kombinációját, de számos eltérés figyelhető meg az inzulin adagolásának az időtartamában és dózisában is (42, 55, 105, 113). Esetenként az inzulint több napon keresztül adták, esetleg azt a diabétesz teljes időtartama alatt kapták az állatok. A különböző típusú vizsgálatok során az inzulin dózisában is jelentős eltérések voltak, a néhány tized NE-től az 1 NE-n át a 30 (!) NE/kg-os dózisokig terjednek a közleményekben az alkalmazott inzulin mennyiségek. Ezek alapján természetesen nehézséget okoz a különböző kísérleti körülmények között kapott adatok egymással való összevetése, másszóval a saját kísérleteinkben akut formában és egyszeri 1 NE/kg-os dózisban adott inzulin adása során kapott értékek és változások interpretációjánál a fenti szempontokat figyelembe kell venni.

5.3.1. A

kísérletes

diabétesz hatása

a

vékonybél

eliminációs

tevékenységére Az értekezésben bemutatott kísérleti adatok szerint a PNP – G megjelenése a vékonybélben a PNP luminális perfúziója során magasabb volt diabéteszes állatokban, mint a kontrollokban, ez a növekedés a hiperglikémiával mutatott párhuzamot és a magas vércukorszinthez hasonlóan teljes mértékben kompenzálható volt inzulinnal. Az UDP – 66

glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz enzimek aktivitása fokozódott kísérletes diabéteszben, ami hasonló irányú változás a PNP – G luminális megjelenésében észlelt eltérésekhez. Érdekes azonban, hogy az enzimaktivitások növekedésében és a mértékében különbség van, nevezetesen a konjugátum szintéziséért felelős UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása mintegy kétszeresére, a hidrolízisért felelős β – glükuronidáz aktivitása mintegy négyszeresére nőtt diabétesz hatására, amely már nincs összhangban a PNP – G nagyobb mértékű luminális megjelenésével. Az inzulin ezen hatása az enzimek aktivitására ugyancsak arra utal, hogy nincs direkt összefüggés a bélben a PNP glükuronidációjában szerepet játszó enzimek aktivitásának a változása és a PNP – G luminális exkréciójának a módosulása között, ugyanis az inzulin teljesen antagonizálta diabéteszben a PNP – G intesztinális exkréciójának a növekedését, de csak részlegesen kompenzálta az enzimaktivitások fokozódását. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a PNP – G metabolizmusában szerepet játszó enzimek fontos szerepet játszanak ugyan a glükuronidációban és a konjugátumnak a vékonybélben való megjelenésében, de az intesztinális exkréciónak, illetve az abban észlelt változásoknak nem kizárólagos tényezői, ezekben egyéb faktorok is fontosak lehetnek. Érdekes, hogy a PNP szulfát – metabolitjának a vékonybélben történő megjelenése nem különbözött szignifikánsan diabéteszes állatokban a kontrollokétól, de lényegében ugyanez mondható el a szulfatációban fontos enzimekről (szulfotranszferáz, arilszulfatáz) is. A PNP-S – nél mért metabolikus enzimaktivitási adatok, valamint az intesztinális exkréciós értékek tehát a PNP – G – nél észlelt változásoktól eltérően nem módosultak diabétesz hatására. Az inzulin sem a PNP – S keletkezésében és a hidrolízisében érintett enzimek aktivitását, sem a szulfát metabolit intesztinális exkrécióját nem befolyásolta a diabéteszes állatokban. Ezeknek a kísérleteknek az adataiból azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a STZ – vel kiváltott experimentális diabétesz különböző, viszonylag szelektív hatásokat képes kifejteni a xenobiotikumokat metabolizáló enzimek aktivitására, valamint az azokat transzportáló (exkretáló) folyamatokra a vékonybélben. Jellegzetes változások elsősorban a glükóz anyagcseréjével összefüggő glükuronidációnál és az intesztinális glukuronid exkréciónál voltak megfigyelhetők. Kísérleteinkben különbséget találtunk egyrészt a glükuronidációban résztvevő enzimek aktivitásának és a PNP – G intesztinális exkréciójának a változása között, de jelentős eltérés volt a glükuronid – és a szulfátképzésben, illetve azok intesztinális megjelenésében is a diabéteszes állatokban.

67

5.3.2. A kísérletes diabétesz hatása a máj eliminációs tevékenységére A PNP – G biliáris exkréciója mind a perfúziós idő fügvényében vizsgálva, mind a kumulatív értékeket tekintve jelentősen csökkent a diabéteszes állatokban a kontrollhoz viszonyítva. Ez a változás éppen ellentétes a bélben tapasztaltakkal, a vékonybélben ugyanis növekedést észleltünk a glükuronid – konjugátum eliminációjában az STZ adását követően. Érdekes azonban, hogy az inzulin a két ellentétes irányú változást, azaz mind az epével történő kiválasztás csökkenését, mind a bélben létrehozott exkréció növekedését kompenzálni tudta. Az UDP – glükuroniltranszferáz és a β – glükuronidáz enzimek aktivitása a májban csökkent, másszóval ezek a változások is ellentétes irányúak diabéteszben a bélnél észleltekkel. Az UDP-glükuroniltranszferáznak a diabétesz által létrehozott csökkenése inzulinnal antagonizálható volt, a β – glükuronidáz aktivitás csökkenését azonban az inzulin nem befolyásolta számottevően. Ezek az adatok egyértelműen mutatják, hogy mind a bélben, mind a májban jelentős változások történtek kísérletes diabétesz hatására, a változások azonban az eliminációt tekintve ellentétes irányúak, a bélben növekedés, a májban a csökkenés a jellemző. Az inzulin érdekes módon mind a két szerv esetében kompenzáló jellegű hatást produkált. A gyorshatású inzulinnal kiváltott akut effektusok, illetve a diabétesszel létrehozott változások antagonizálása arra utal, hogy az inzulinhiány, valamint az általa kiváltott hiperglikémia rapid megszűntetése önmagában is gyorsan és hatékonyan módosíthatja a short term diabétesz által kiváltott hatásokat a metabolizáló enzimekre és az exkréciós folyamatokra vonatkozólag a PNP – G esetében. Ezek a megfigyelések és kísérleti adatok egyértelműen jelzik a hiperglikémia és az inzulinhiány hangsúlyos szerepét a diabétesszel kiváltott eliminációs változásokban a glükuronid konjugátum esetén. A szulfát – konjugátum

mennyiségét meghatározó enzimek (szulfotranszferáz,

arilszulfatáz) aktivitása nem változott szignifikánsan kísérletes diabéteszben a májban, továbbá az enzimaktivitások inzulin hatására sem módosultak. Csökkent azonban diabéteszben a PNP – S biliáris exkréciója, amelyet az inzulin nem befolyásolt. Ezek az adatok arra hívják fel a figyelmet, hogy a szulfát – konjugátum biliáris exkréciójában az enzimaktivitások változása nélkül is létrejöhet eltérés a diabéteszes állatokban, illetve, hogy inzulinnal nem befolyásolható, vagy csak részben módosítható transzport változások is kialakulhatnak diabéteszben. Ezt a feltételezést erősíti az a kísérleti eredményünk is, mely szerint a nem – konjugált, tehát a szabad formában lévő PNP biliáris exkréciója is csökkent kísérletes diabéteszben, valamint, hogy az inzulin ez esetben is hatástalan volt. A PNP eredeti, 68

nem – konjugált

formájának az epében történő megjelenésekor ugyanis metabolikus

enzimreakció nem történik, ezért az vagy annak a változása nem is játszhat szerepet a PNP biliáris exkréciójában, illetve annak a módosulásában. A PNP – S – el, illetve a PNP – vel kapcsolatos eredmények a diabéteszes állatok biliáris exkréciójával összefüggésben egyúttal azt is jelentik, hogy a kísérletes diabétesz a glükuronid – képzésben, illetve a glükuronidok transzportjában viszonylag szelektív hatásokat fejt ki, amelyek nyilvánvalóan a glükóz anyagcseréjének a változásával kapcsolatosak. Továbbá, hogy ezek a specifikus effektusok nem befolyásolják, vagy csak részben, illetve másképpen érintik az ezzel nem közvetlenül összefüggő folyamatokat, mint például a szulfát – képzést, illetve a PNP – S kiválasztását az epébe, valamint a metabolizmus nélkül az epébe kerülő szabad formájú PNP biliáris exkrécióját. Ez utóbbi folyamatok feltehetően a diabétesznek a membrán vagy transzport funkciókra gyakorolt hatásával függhetnek össze, de nincsenek szoros vagy direkt

kapcsolatban

a

glükózanyagcsere

zavarával

és

a

hiperglikémiával, ezért talán nem is meglepő, hogy ezeket a hatásokat inzulinnal nem tudtuk befolyásolni. A saját kísérleti eredmények, illetve azok fenti interpretálása sok tekintetben összhangban vannak mások adataival és véleményével. Többen találtak csökkenést a biliáris exkrécióban különböző vegyületek (diazepam, szulfobromftalein) esetén short term diabéteszben, de long term diabéteszben változatlan (pl. fenolvörös) vagy enyhén emelkedett (prokainamid – etobromid, ouabain) epével való kiválasztást is leírtak (7, 22, 117). Érdekes, hogy a fenolvörössel kapcsolatban a glükuronsavval történő fokozott konjugáció ellenére változatlannak találták a fenolvörös – glükuronid biliáris exkrécióját (117). Ez a megfigyelés támogatja a mi kísérleti adatainkból levont következtetést, mely szerint a konjugációs reakciók és a glükuronid – képzés változása nincsen feltétlenül szoros korrelációban a biliáris exkrécióval, illetve annak módosulásával. Ez magyarázhatja például az eltérő kísérleti körülmények között kapott eredmények közötti látszólagos különbségeket is. Izolált hepatocitákban például a PNP esetében emelkedettnek találták a glükuronid – , de kisebb mértékben még a szulfátképzést is (30), ugyanakkor a saját in vivo végzett kísérleteink adatai szerint a biliáris exkréció mindkét esetben csökkent az STZ – vel kiváltott kísérletes diabéteszben. A hepatocitákkal végzett kísérletekben kapott fokozott glükuronidációt egyébként a szerzők nem az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitás változásával, hanem inkább a folyamatban kofaktorként szereplő UDPGA fokozott képződésével, illetve mennyiségének a növekedésével magyarázzák (66). Ennek a hátterében valószínűleg az áll, hogy a kísérletes diabéteszben az inzulinhiány következtében a glükóz – flux a gátolt inzulin 69

szenzitív (dependens) útról, amely normál állatokban a glikogén képzés irányába mutat, áttevődik egy inzulin – inszenzitív forma irányába, amelyben az UDP – glükóz az UDP – glükóz – dehidrogenáz (sebességmeghatározó lépés) segítségével UDPGA – t amelyből az UDP – glükuroniltranszferáz

képez,

közreműködésével a glükuronidáció, azaz a

glükuronid – képzés jön létre (5, 6, 120). Az UDP – glükóz – dehidrogenáz

fokozott

működése révén tehát több UDPGA áll rendelkezésre kofaktorként diabéteszben a glükuronid – képzés számára, valószínűleg ennek nagyobb szerepe van a diabéteszben megfigyelhető emelkedett glükuronid – produkcióban az izolált hepatocitákkal végzett kísérletek esetén mint az UDP-glükuroniltranszferáz aktivitás változásának. Az elimináció, illetve a biliáris exkréció, valamint az azok szempontjából alapvetően fontos transzport folyamatok azonban izolált hepatocitákkal természetesen nem vizsgálhatók. In vitro vizsgálatokban kimutatták, hogy különböző szubsztrátokat (morfin, PNP, ösztron) alkalmazva az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása és a glükuronid – képzés eltérő módon változhat diabéteszben: morfinnál csökkent, PNP – nél lényegesen nem változott, ösztronnál nőtt. Az UDP-glükuroniltranszferáz tulajdonképpen egy enzimcsaládot jelent különböző enzimekkel, eltérő szubsztrát specifitással és egyéb tulajdonságokkal, például indukálhatósággal (114). A vegyületek egy csoportjának (pl. PNP) glükuronsavval való konjugációja 3 – metilkolantrénnel, egy másik csoportjának a konjugációja (pl. morfin) fenobarbitállal indukálható, egy harmadik csoport (pl. ösztron) metabolizmusa pedig csak részben indukálható enziminduktorokkal. Ezért az egyik vegyület, vagy általában csak egyetlen vegyület vizsgálatakor kapott eredményekből nem lehet általánosítani, vagy más vegyületekre nézve következtetést levonni még az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitására, vagy annak a változására vonatkozólag sem (113, 115, 116). Kísérleteinkben az inzulin a bélben és a májban a glükuronidációval kapcsolatos enzimek aktivitásának a változását diabéteszben általában ellensúlyozta, de ez nem mindig volt teljes mértékű. Ezzel szemben az exkréciós folyamatokban észlelt különbségeket mind a májban, mind a bélben teljes mértékben kompenzálta az inzulin a kísérletes diabéteszes állatokban. Ez egyrészt igazolja az inzulin hatékonyságát és a glükuronidációval összefüggő specifikus hatását a diabéteszes változásokkal kapcsolatban, másrészt arra is utal, hogy a transzport folyamatokban észlelt eltérések és az enzimatikus változások között nincs szoros korreláció. Ezt erősítik a szulfát – konjugátummal kapcsolatos kísérleti eredményeink is. Ebben az esetben ugyanis enzimaktivitás változást nem észleltünk diabéteszben, de a PNP – S biliáris exkréciója csökkent, amit azonban az inzulin nem befolyásolt. Hasonló eredményt kaptunk a 70

konjugálatlan, eredeti formájában kiválasztódó PNP – vel kapcsolatban is. Az inzulin pontos hatásai és hatásmechanizmusa a fenti folyamatokban és változásokban nem ismert, hatásában minden bizonnyal több tényező is szerepet játszhat (42, 50, 55, 105, 113, 117). A mi kísérleteinkben az akut adagolási mód miatt elsősorban a gyors hatások jöhetnek számításba, mint például az inzulinhiány megszűntetése, a vércukorszint normalizálása és feltehetően az epetermelésre és

az epefolyásra gyakorolt effektusok. Az inzulin hatásának és

hatásmechanizmusának egyéb aspektusai további vizsgálatokat igényelnek arra vonatkozólag is, hogy van-e különbség az akut és tartós inzulin adás által kiváltott változásokban diabétesz esetén.

5.4. Az értekezésben tárgyalt kísérletek eredményeinek rövid összefoglalása Az értekezés ,,Eredmények” fejezetében leírt három tématerület köré csoportosított megállapításokat röviden az alábbiakban foglalhatjuk össze. 1. A HPLC – vel

kapcsolatos irodalmi módszerek felhasználásával sikerült az UV

detektálással összekapcsolt olyan izokratikus fordított fázisú ionpár eljárást (RP – HPLC) kidolgozni, amely alkalmas a PNP, PNP – G és a PNP – S egyidejű, megbízható,

reprodukálható,

pontos

és

viszonylag

gyors

szeparálására

és

meghatározására. Az általunk módosított eljárás alkalmas továbbá nagyszámú biológiai (pl. a bélperfuzátumból vagy az epéből származó) minta viszonylag gyors és sorozatban történő analízisére. 2. Kontroll patkányokban a PNP metabolizmusa során a fő metabolit a PNP – G. A PNP – S ennél lényegesen kisebb mennyiségben jelenik meg mind a vékonybélben, mind az epében. 3. A

metabolizmusban

szerepet

játszó

enzimek

aktivitását

összehasonlítva

megállapítható, hogy a kontroll állatokban a glükuronid – képzésben résztvevő enzimek (UDP – glükuroniltranszferáz , β – glükuronidáz ) aktivitása lényegesen, nagyságrendekkel magasabb volt, mint a szulfátképzésben szerepet játszóké (szulfotranszferáz, arilszulfatáz). 4. Közvetlen összefüggés a kontroll állatoknál a metabolikus enzimek aktivitása és a PNP – metabolitok luminális és biliáris exkréciója között nem volt megállapítható.

71

5. Az STZ – vel kiváltott kísérletes diabétesz (hiperglikémia) jelentősen befolyásolta mind az intesztinális, mind a biliáris exkréciót a PNP-G esetében érdekes módon azonban ellentétes irányban: a PNP-G intesztinális exkréciója nőtt, a biliáris exkréciója pedig csökkent. 6. Az UDP – glükuroniltranszferáz aktivitása a bélben fokozódott, a májban csökkent; a β-glükuronidáz aktivitása a májban csökkent, a bélben pedig nőtt a diabéteszes állatokban. 7. Inzulin akut adásával a PNP-G intesztinális és biliáris exkréciójában a diabéteszben észlelt változások teljes mértékben, a glükuronid – képzésben közreműködő enzimek aktivitásában talált eltérések csak részben voltak kompenzálhatók. 8. A PNP-S biliáris exkréciója a májban csökkent, a bélben nem változott kísérletes diabéteszben. 9. A

PNP

szulfát

–

metabolitjának

a

képzésében

közreműködő

enzimek

(szulfotranszferáz, arilszulfatáz) aktivitásában nem észleltünk eltérést diabéteszben a kontrollhoz viszonyítva. 10. Inzulin akut adásával diabéteszes állatokban sem a PNP – S intesztinális , sem a biliáris exkrécióját nem tudtuk befolyásolni, de az enzimaktivitások is változatlanok maradtak inzulin adást követően. 11. A PNP változatlan, nem – konjugált formában is kiválasztódik az epébe, ezt a diabétesz gátolta, a gátló hatást az inzulin nem befolyásolta.

A kísérleti eredményeket összefoglalva megállapítható, hogy a kísérletes diabétesz megváltoztatja a farmakonok intesztinális és hepatikus eliminációját. A változások specifikus, szelektív jelleget mutatnak: elsősorban a cukoranyagcsere változásával összefüggő

glükuronid

–

képzésben

és

exkrécióban

nyilvánulnak

meg.

Az

enzimaktivitások változása és az exkréció módosulása között szoros korrelációt nem találtunk. A diabéteszben megfigyelt változások az intesztinális és hepatikus eliminációban részben kompenzálhatók akut inzulin adásával.

72

6. Saját közlemények és kongresszusi prezentációk

6.1. Közlemények 1. Almási A, Fischer E, Perjési P: A simple and rapid ion-pair HPLC method for simultaneous quantitation of 4-nitrophenol and its glucuronide and sulfate conjugates. J. Biochem. Biophys. Methods 69, 43-50 (2006)

2. Almási A, Fischer E, Perjési P: Isocratic ion-pair HPLC method for quantification of 4-nitrophenol and it’s conjugated metabolites from bile. Sci. Pharm. 79, 837847 (2011)

3. Bojcsev S, Almási A, Simon H, Perjési P, Fischer E: Investigation of drug metabolism in various segments of small intestine in the rat. Acta Physiol. Hung.100, 115-123 (2013)

4. Almási A, Bojcsev S, Fischer T, Simon H, Perjési P, Fischer E: Metabolic enzyme activities and drug excretion in the small intestine and in the liver in the rat. Acta Physiol. Hung. Accepted for publication.

5. Almási A, Bojcsev S, Fischer T, Simon H, Perjési P, Fischer E: Effect of experimental diabetes and insulin replacement on the intestinal metabolism and excretion of p-nitrophenol in the rat. Submitted for publication.

6. Almási A, Bojcsev S, Fischer T, Simon H, Perjési P, Fischer E: Changes in the metabolic enzyme activities and hepatic elimination of p-nitrophenol in streptozotocin-induced diabetes with or without insulin replacement in the rat. Submitted publication.

73

6.2. Kongresszusi prezentációk 1. Almási A, Perjési P, Fischer E: Kísérletes diabetes hatása a xenobiotikumok eliminációjára (Poszter). Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2005.

2. A Almási, E Fischer, P Perjési: HPLC method for simultaneous determination of 4-nitrophenol and its glucuronide and sulfate conjugates (Poszter). Symposium on Instrumental Analysis, Graz (Austria), 2005.

3. A Almási, P Perjési, E Fischer: Effect of streptozotocin on the intestinal metabolism and excretion of p-nitrophenol in the rat (Poszter). BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, Siófok, 2005.

4. Almási A, Perjési P, Fischer E: Kísérletes diabetes hatása a p-nitrofenol eliminációjára

(Poszter).

,,Kihívások

és

eredmények”

Gyógyszerkutatási

Szimpózium, Pécs, 2005.

5. Perjési P, Almási A, Fischer E: A kísérletes diabetes hatása a p-nitrofenol vékonybélben és májban történő metabolizmusára patkányban (Poszter). Farmakokinetikai

és

gyógyszermetabolizmus

továbbképző

szimpózium,

Mátraháza, 2006.

6. Almási A, Fischer E, Perjési P: A kísérletes diabetes hatása a p-nitrofenol vékonybélben és májban történő metabolizmusára patkányban (Poszter). Congressus Pharmaceuticus Hungaricus, Budapest, 2006.

7. Almási A, Perjési P, Fischer E: Kísérletes diabetes hatása a xenobiotikumok eliminációjára (Poszter). Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2006.

8. Almási A, Fischer E, Perjési P: A p-nitrofenol és metabolitjainak szimultán meghatározása epéből HPLC-s módszerrel (Poszter). ,,Kihívások és eredmények” Gyógyszerkutatási Szimpózium, Debrecen, 2006.

74

9. Almási A, Perjési P, Fischer E: Inzulin hatása a farmakonok hepatikus és intesztinális eliminációjára (Poszter). Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2007.

10. Almási A, Perjési P, Fischer E: A streptozotocin és inzulin hatása a xenobiotikumok

eliminációjára

(Poszter).

,,Kihívások

és

eredmények”

Gyógyszerkutatási Szimpózium, Szeged, 2007.

11. Fischer E, Almási A, Perjési P: A vékonybél szerepe a xenobiotikumok eliminációjában (Előadás). MGYT Gyógyszerkutatási Szimpózium, Szeged, 2007.

12. Almási A, Fischer E, Perjési P: HPLC módszer a 4-nitrofenol és metabolitjainak kísérletes

meghatározására

epéből

(Poszter).

Farmakokinetikai

és

Gyógyszermetabolizmus Továbbképző Szimpózium, Galyatető, 2008.

13. Perjési P, Almási A, Fischer E: Kísérletes diabétesz hatása 4-nitrofenol vékonybélben és májban lejátszódó metabolizmusára patkányban (Előadás). Farmakokinetikai

és

Gyógyszermetabolizmus

Továbbképző

Szimpózium,

Galyatető, 2008.

14. Almási A, Perjési P, Fischer E: A streptozotocin és inzulin hatása a xenobiotikumok eliminációjára és az UDP-glukuroniltranszferáz és β-glukuronidáz enzimek aktivitására (Poszter). Membrán-Transzport Konferncia, Sümeg, 2008.

15. A Almási, E Fischer, P Perjési: HPLC method for experimental quantitation of 4nitrophenol and its metabolites from bile (Poszter). International symposium on instrumental analysis, Pécs, 2008.

16. Almási A, Perjési P, Fischer E: Gyors és lassú hatású inzulin befolyása a farmakonok intesztinális és hepatikus eliminációjára (Poszter). Gyógyszer az ezredfordulón VII. ,,Szakmai kihívásaink a XXI. század elején”, A Magyar Gyógyszerésztudományi Társaság Ipari Szervezete, Gyógyszertechnológiai és Gyógyszerkutatási Szakosztályának Konferenciája, Sopron, 2008. 75

17. Fejes Á, Almási A, Perjési P, Fischer E: A glükózkínálat hatása a farmakonok intesztinális és hepatikus metabolizmusára (Poszter). Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2009.

18. Almási A, Fischer E, Perjési P: A streptozotocin kiváltotta diabetes és inzulin hatása a 4-nitrofenol metabolizmusára és az UDP-glukuroniltranszferáz és βglukuronidáz aktivitására (Poszter). Congressus Pharmaceuticus Hungaricus, Budapest, 2009.

19. Almási A, Markovics Z, Perjési P, Fischer E: A streptozotocin és inzulin hatása a xenobiotikumok eliminációjára, a szulfotranszferáz és arilszulfatáz enzimek aktívitására (Poszter). Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2011.

20. Almási A: Fenolos gyógyszervegyületek metabolizmusának vizsgálata a vékonybélben és a májban fiziológiás és hiperglikémiás körülmények között (Poszter). Clauder Ottó Emlékverseny, Budapest, 2011.

21. Bojcsev S, Almási A, Simon H, Perjési P, Fischer E: A metabolikus aktivitás vizsgálata a vékonybél különböző szegmentjeiben (Poszter). Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2012.

22. Almási A, Takács Cs, Bojcsev S, Fischer T, Perjési P, Fischer E: A p-nitrofenol metabolitok (glükuronid, szulfát) a bélben, májban és a vérben (Poszter) Membrán- Transzport Konferencia , Sümeg, 2013.

76

7. Irodalom 1.

Ackerman DM, Leibman KC: Effect of experimental diabetes on drug metabolism in the rat. Drug Metab. Dispos. 5, 405-410 (1977)

2.

Aktories K, Förstermann U, Hofman FB, Starke K eds. (2008) Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie. Elsevier, Urban und Fischer, München.

3.

Almási A, Fischer E, Perjési P: A simple and rapid ion-pair HPLC method for simultaneous quatitation of 4-nitrophenol and its glucuronoide and sulfate conjugates. J.Biochem. Biophys. Methods 69, 43-50 (2006)

4.

Almási A, Fischer E, Perjési P: Isocratic Ion-pair HPLC Method for Quantification of 4-nitrophenol and it’s conjugated metabolites from bile. Sci. Pharm. 79, 837-847 (2011)

5.

Anderson JW.: Alterations in metabolic fate of glucose in the liver of diabetic animals. Am.J. clin. Nutr. 27, 746-755 (1974)

6.

Anderson JW.: Metabolic abnormalities contributing to diabetic complications. I. Glucose metabolism in insulin-insensitive pathway. Am.J. clin. Nutr. 28, 273-280 (1975)

7.

Andrews SM, Griffitsh LA: The metabolism and disposition of [Z

14

C] diazepam in

the streptozotocin-diabetic rat. Xenobiotica 14, 751-760 (1984)

8.

Ar'Rajab A, Ahrén B. Long-term diabetogenic effect of streptozotocin in rats. Pancreas. 8, 50-7 (1993)

9.

Ayrton A, Morgan P: Role of transport proteins in drug absorption, distribution and excretion. Xenobiotica 31, 469-497 (2001)

77

10. Baldvin MK, Selby MA, Bloomberg H: Measurement of phenol in urine by the method of van Haaften and Sie: a critical appraisal. Analyst 106, 763-767 (1981)

11. Barnes S, Buchina ES, King RJ, Mc Burnett T, Taylor KB: Bile acid sulfotransferase from rat liver sulfates bile acids and 3-hydroxy steroids: purification, N-terminal amino acid sequence and kinetic properties, J. Lipid Res. 30, 429-440 (1989)

12. Beaumont K (2004): The importance of gut wall metabolism in determining drug biovailability. In: Drug bioavailability: Estimation of solubility, permeability, absorption and bioavailability, eds. van de Waterbeemd, Lenneräus H, Artursson P, Willey-VCH Verlag GmbH and Co. KgaA, Wenheim, FRG. Ch. 13. pp. 311-328

13. Beetstra JB, van Engelen JG, Karels P, van der Hoek HJ, Jong M, Docter R, Krenning EP, Hennemann G, Brouwer A, Visser TJ: Thyroxin 3,3,5-triiodothyronine are glucuronidated in rat liver by different uridine diphosphate glycuronyltransferases. Endocrinology 128, 741-746 (1991)

14. Björklund A, Bondo Hansen J, Falkmer S, Grill V: Openers of ATP-dependent K+channels protect against a signal-transduction-linked and not freely reversible defect of insulin secretion in a rat islet transplantation model of Type 2 diabetes. Diabetologia. 47, 885-91 (2004)

15. Bojcsev S, Rafiei A, Fischer E: Changes in the biliary excretion of exogenous organic anions streptozotocin-induced diabetes I. Acta Physiol. Hung. 84, 171-172 (1996)

16. Bojcsev S, Almási A, Simon H, Perjési P, Fischer E: Investigation of drug metabolism in various segments of small intestine in the rat. Acta Physiol. Hung. 100, 115 – 123 (2013)

17. Burchell BMWH, Coughtrie MWH: UDP-Glucuronyltransferases. Pharmac. Ther. 43, 261-289 (1989)

18. Caldwell J (1980): Conjugation reactions. In: Concepts in drug metabolism, eds. Jenner P, Testa B, Marcel Dekker, New York and Basel, pp. 211-250 78

19. Caldwell J, Marsh M (1982): Metabolism of drugs by the gastrointestinal tract. In: Clinical Pharmacology and Therapeutics: Presystemic Drug Elimination, eds. George CF., Shand DG., Renwick AG., Butterworths, London, pp. 29-42

20. Capiello M, Franchi M, Guiliani L, Pacifici GM: Distribution of 2-naphthol sulphotransferase and its endogenous substrate adenosine 3-phosphate 5phosphosulfate in human tissues. Eur. J. Clin. Pharmacol. 37, 317-320 (1989)

21. Capiello M, Guiliani L, Pacifici GM: Distribution of UDP-glucuronosyl transferase and its endogenous substrate uridine 5-diphosphoglucuronic acid in human tissues. Eur. J. Clin. Pharmacol. 41, 345-350 (1991)

22. Carnovale CE, Rodriquez-Garay EA: Reversible impairment of hepatobiliar function induced by streptozotocin in the rat. Experientia 40, 248-250 (1984)

23. Cassidy MK, Huston JB: Phenol conjugation by lung in vivo. Biochem. Pharmacol. 29, 471-474 (1980)

24. Chen G, Bettaglia E, Senay C, Falany CN, Rodominska-Pandya A: Photoaffinity probe for the substrate binding site of human phenol sulphotransferase (SULT 1Q1): 7-azido-4-methylcoumarin. Protein Sci. 8, 2151-2157 (1999)

25. Chen J, Pang KS: Effect of flow on first pass metabolism of drugs. Single pass studies on 4-methylum- belliferone conjugation in the serially perfused rat intestine and liver preparations J. Pharmacol. Exp. Ther. 280, 24-31 (1997)

26. Costa C, Pupo C, Viscomi G, Catania S, Salemi M, Imeratore C: Modification in the metabolic pathways of benzene in streptozotocin-induced rat. Arch. Toxicol. 73, 301-306 (1999)

27. Coughtrie MWH, Sharp S, Maxwell K, Innes NP: Biology and function of the reversible sulfatation pathway catalysed by human sulfotransferases and sulfatases. Chemico-Biological Interactions, 109, 3-27 (1998) 79

28. Csáky TZ, Fischer E: Intestinal sugar transport in experimental diabetes. Diabetes 30, 568-574 (1981) 29. Dainitich H, Stevenson JH, O’Malley K: Influence of diabetes mellitus on drug metabolism in man. J. Clin. Pharmacol. Biopharm. 13, 55-58 (1976)

30. Dajani RM, Kayyali S, Saheb DE, Birbary G: A study on the physiological disposition of acetophenetidin by the diabetic man. Gen. Pharmacol.. 5, 1-9 (1974)

31. Danovitch SH, Laster R: The developement of arylsulfatase in the small intestine of the rat. Biochem. J. 114, 343-350 (1996)

32. Diamond GL, Quebbemann AJ: Rapid separation of p-nitrophenol and its glucuronide and sulfate conjugates by reversed phase high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. 177, 368-371 (1979)

33. Eacho PI, Sweeny D, Weiner M: Effects of glucose and fructose on conjugation of pnitrophenol in hepatocytes of normal and streptozotocin diabetic rats. Biochem. Pharmacol. 30, 2616-2619 (1981)

34. Eadsforth CV, Coveney DC: Measurement of phenol in urine using a highperformance liquid chromatographic method. Analyst 109, 175-176 (1984)

35. Emudianughe TS, Kalderon B, Gopher A, Lapidot A: Effect of streptozotocin-induced diabetes on drug metabolism in rats. Arch. Int. Pharmacodyn. 293, 14-19 (1988)

36. Falany CN: Molecular enzymology of human cytosolic sulfotransferases. Trends Pharmacol. Sci. 12, 255-259 (1991)

37. Fischer E, Lauterbach F: Effect of hyperglycemia on sugar transport in the isolated mucosa of guinea pig small intestine. J. Physiol. (Lond.) 355, 567-586 (1984)

80

38. Fischer E, Rafiei A, Bojcsev S: Effect of hyperglycemia on the intestinal elimination of p-nitrophenol in the rat. Acta Physiol. Hung. 84, 287-288 (1996)

39. Fischer E, Rafiei A, Bojcsev S: Intestinal elimination of p-nitrophenol in the rat. Acta Physiol. Hung. 83, 355-362 (1995) 40. Fishman WH (1974): β-glucuronidase. In: Methods of Enzymatic Analysis, ed. Bergmeyer HU, Academic Press. New York, pp. 929-943

41. Frei J, Selmid E, Birchmeier H (1974): UDP-Glucuronyltransferase. In: Methods of Enzymatic Analysis, ed. Bergmeyer HU, Academic Press, New York, pp. 929-943

42. Garberoglio

CA,

Richter

HM,

Henavejos

A,

Moossa,

A.R,

Baker

AL:

Pharmacological and physiological doses of insulin and determinats of bile flow in dogs. Am. J. Physiol. 245, G 157-163 (1983)

43. George CF: Drug metabolism by gastrointestinal mucosa. Clin. Pharmacokinet. 6, 259-274 (1981)

44. Gessner T, Hamoda N: Identification of p-nitrophenyl glucoside as an urinary metabolite. J. Pharm. Sci. 59, 1528-1529 (1970)

45. Goon D, Klaassen CD: Dose-dependent intestinal glucuronidation and sulfation of acetaminophen in the rat in situ. J. Pharmacol. Exp. Ther. 252, 201-207 (1990)

46. Grasso G, Frittitta L, Anello M, Russo P, Sesti G, Trischitta V. Insulin receptor tyrosine-kinase activity is altered in both muscle and adipose tissue from non-obese normoglycaemic insulin-resistant subjects. Diabetologia, 38, 55 – 61 (1995)

47. Griffeth LK, Rosen GM, Rauckman EJ: Effect of model traumatic injury on hepatic drug metabolism in the rat. IV. Glucuronidation. Drug. Metab. Disp. 13, 391-397 (1980)

81

48. Hänninen O, Lindström-Seppä P, Pelkonen K: Role of the gut in xenobiotic metabolism. Arch. Toxicol. 60, 34-36 (1987)

49. Hartiala KJW: Metabolism of hormones, drugs and other substances by the gut. Physiol. Rev. 53, 496-534 (1973)

50. Haughton CL, Dillehoy DL, Phillips LS: Insulin replacement therapy for the rat model of streptozotocin-induced diabetes mellitus. Lab. Animal Sci. 49, 639-644 (1999)

51. Holland B, Cole SPC, Kuchler K, Higgins C: ABC proteins : from bacteria to Man. Academic Press, ISBN 0-12-352551 (2003)

52. Ilett KF, Tee LBG, Reeves PT, Miachin RF: Metabolism of drugs and other xenobiotics in the gut lumen wall. Pharmacol. Ther. 46, 67-93 (1990)

53. Inoue H, Yokota H, Tamiyama H, Kuwahara H, Ogawa H, Kato S, Yuasa A: 1naphthol-β-o-glucuronides formed intraluminally in rat small intestine mucosa and absorbed into the colon. Life Sci. 65, 1579—1588 (1999)

54. Jefferson LS, Liao WS, Peavy DE, Miller TB, Appel MC, Taylor JM: Diabetesinduced alterations in liver protein synthesis. Changes in the relative abundance of mRNAs for albumin and other plasma proteins. J. Biol. Chem. 258, 1369-1375 (1983)

55. Jones RS: Effect of insulin on canalicular bile formation. Am. J. Physiol. 231, 40-43 (1976)

56. Kaminsky LS, Zhang Q: The small intestine as a xenobiotic-metabolising organ. Drug Metab. Dispos. 31, 1520-1525 (2003)

57. Karakaya A, Carter DE: High performance liquid chromatography of glucuronide and sulphate conjugates using ion-pair chromatography. J. Chromatogr. 195, 431-434 (1979)

82

58. Kauffman FC: Sulfatation in Pharmacology and Toxicology. Drug Metab. Rev. 36, 823-843 (2004)

59. Kellerer M, Lammers R, Haring HU: Insulin signal transduction: possible mechanisms for insulin resistance. Exp. Clin. Endocrin. Diabetes. 107, 126 – 132 (1999)

60. Koster AS, Noordhoek J: Glucuronidation in the rat intestinal wall. Comparison of isolated mucosal cells, latent microsomes and activited microsomes. Biochem. Pharmacol. 32, 895-950 (1983)

61. Kothare AP, Zimmerman CL: Intestinal metabolism: The role of enzyme localization in phenol metabolite kinetics. Drug Metab. Disp. 30, 586-594 (2002)

62. Krishna DR, Klotz U: Extrahepatic metabolism of drugs in humans. Clin. Pharmacokinet. 26, 144-160 (1994)

63. Kuhn MD, Rost M, Müller D: Para-nitrophenol glucuronidation and sulphation in rat and human slices. Exp. Toxic. Pathol. 53, 81-87 (2001)

64. Laitinen M, Watkins JB (1986): Mucosal biotransformations. In: Gastrointestinal Toxicology, eds. Rozmna K, Hännien O, Elsevier Press, Amsterdam, pp. 169-192

65. Lauterbach F, Schrorn M, Sprakties G, Sund RB: Compartmentalization of intestinal conjugation reactions and conjugate transports: studies with phenols and paminobenzoic acid. Progr. Pharmacol. Clin. Pharmacol 7, 231-242 (1982)

66. Linn LH, Chila M, Baillie TA: Is the role of small intestine in first-pass metabolism overemphasized? Pharm. Rev. 51, 135-157 (1999)

67. Lisato G, Cusin I, Tiengo A, Del Prato S, Jeanrenaud B: The contribution of hyperglycaemia and hypoinsulinaemia to the insulin resistance of streptozotocin – diabetic rats. Diabetologia. 35, 310 – 315 (1992)

83

68. Machida M, Morita Y, Hayashi M, Awazu S: Pharmakokinetic evidence for the occurrence of extrahepatic conjugative metabolism of nitrophenol in rats. Biochem. Pharmacol. 31, 787-791 (1982)

69. Maiti S, Grant S, Baker SM, Karanth S, Pope CN, Chen G. Stress regulation of sulfotransferases in male rat liver. Biochem. Biophys. Res. Commun. 323, 235-241 (2004) 70. Mandl J. Biotranszformáció – méregtelenítés (1996):

in Orvosi Biokémia,

Semmelweis Kiadó, Budapest, pp 254 – 265

71. Mc Nurlan MA, Garlick PJ: Protein synthesis in liver and small intestine in protein deprivation and diabetes. Am. J. Physiol. 241, 238-245 (1981)

72. Meermann JHN, Nijland C, Mulder GJ: Sex differences in sulfatation and glucuronidation of phenol. Biochem. Pharmacol. 36, 2605-2608 (1987)

73. Miettinen TA, Leckinen E (1970): in Metabolic Conjugation and Metabolic Hydrolysis, ed. Fishman WH, Acedemic Press, New York, p.157

74. Mitch WE, Bailey JL, Wang X, Jurkovitz C, Newby D, Price SR. Evaluation of signals activating ubiquitin-proteasome proteolysis in a model of muscle wasting. Am. J. Physiol. 276, C1132 – 1138 (1999)

75. Mojorrabi B, Mackenzie PI: Characterization of two UDP glucuronyl transferases that are predominantly expressed in human colon. Biochem. Biophys. Res. Commun. 247, 704-709 (1998) 76. Morris ME, Hansel SB: High – performance liquid chromatographic analysis of pnitrophenol and conjugates in biological samples. J. Chromatogr. 532, 285-293 (1990)

84

77. Morrison MH, Barber HE, Foschi PG, Hawksworth GM: The kinetics of 4-nitrophenol conjugation by perfused liver and hepatic microsomes from streptozotocin induced diabetic rats. J. Pharm. Pharmacol. 38, 188-194 (1986)

78. Morrison MH, Hawksworth GM: Glucuronic acid conjugation by hepatic microsomal fraction isolated from streptozotocin-induced diabetic rats. Biochem. Pharmacol. 33, 3833-3838 (1984)

79. Morrison MH, Hawksworth GM: The effect activators of glucuronyltransferase in the streptozotocin-induced diabetic rats. Biochem. Pharmacol. 31, 1944-1946 (1982) 80. O’ Brien PJ, Herschlog D: Alkaline phosphatase revisited: hydrolysis of alkyl phosphates. Biochemistry 41, 3207-3225 (2002)

81. Ohkuwa T, Sato Y, Naoi M: Hydroxyl radical formation in diabetic rats induced by streptozotocin. Life Sci. 56, 1789-1798 (1995)

82. Olsen WH Perchellet A, Malinowski RL: Intestinal mucosa in diabetes: synthesis of total proteins and sucrose-isomaltase. Am. J. Physiol. 250, 788-793 (1986)

83. Pacifici GM, Eligi M, Guiliani L: (+) and (-) terbutaline are sulfated at a higher rate in human intestine than in liver. Eur. J. Clin. Pharmacol. 45, 483-487 (1993)

84. Preuksaritonont T, Gorham LM, Hochman JH, Tran LO, Vyas KP: Comparative studies of drug metabolising enzymes in dog, monkey and human small intestines and in CaCo-2-cells. Drug Metab. Disp. 24, 634-642 (1996)

85. Price VF, Jollow DJ: Increased resistance of diabetic rats to acetaminophen-induced hepatotoxicity. J. Pharmacol. Exp. Ther. 220, 504-513 (1982)

86. Quebbemann AJ, Anders MW: Renal tubular conjugation and excretion of phenol and p-nitrophenol in the chicken: differing mechanism of renal transfer. J. Pharm. Exp. Ther. 184, 695-708 (1973)

85

87. Rafiei A, Bojcsev S, Fischer E: Dose-dependent intestinal and hepatic glucuronidation and sulfatation of p-nitrophenol in the rat. Acta Physiol. Hung. 84, 333-335 (1996)

88. Reaven EP, Peterson DT, Reaven GM: The effect of experimental diabetes mellitus and insulin replacement on hepatic ultrastructure and protein synthesis. J. Clin. Invest. 52, 248-262 (1973)

89. Renwick AG, George CF (1989): Metabolism of xenobiotics in the gastrointestinal tract.

In:

Intermediary Xenobiotic Metabolism in Animals Methodology,

Mechanismus and Significance, eds. Huston DH, Caldwell J, Paulson GD, Taylor and Francis, London, pp. 13-40

90. Rerup CC: Drugs producing diabetes through demage of the insulin secreting cells. Pharmacol. Rev. 22, 485-520 (1970) 91. Rosetti L, Giaccari A, DeFronzo RA: Glucose toxicity. Diabetes care. 13, 610 – 630 (1990)

92. Schwenk M: Directed efflux of glucuronides and sulphate esters from the intestinal mucosa. Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharmacol. Suppl. 311, R15 (1980)

93. Schwenk M: Glucuronidation and sulphatation in gastrointestinal tract. Progr. Pharmacol. Clin. Pharmacol. 7, 155-169 (1989)

94. Sekura RD, Jakoby WD: Phenol Sulfotransferases. J. Biological Chemistry, 254: 5658-5663 (1979)

95. Shiratani H, Katoh M, Nakijama M, Yokoi T: Species differences in UDP glucuronyltransferase activities in mice and rats. Drug. Metab. Disp. 36, 1745-1752 (2008) 96. Shölhammer I, Poll DS, Bichel MH: Liver microsomal β-glucuronidase and UDPglucuronyltransferase. Enzyme, 20, 269-276 (1975)

86

97. Staimer N, Gee SJ, Hammock BD: Development of a sensitive enzyme immunoassay for the detection of phenyl-β-d-thiofluennoide in human urine. Fresenius. J. Anal. Chem. 369, 273-279 (2001)

98. Steger RW, Kienast SG. Effect of continuous versus delayed insulin replacement on sex behavior and neuroendocrine function in diabetic male rats. Diabetes. 39, 942-8 (1990)

99. Storey JM, Bailey E. Effect of streptozotocin diabetes and insulin administration on some liver enzyme activities in the post-weaning rat. Enzyme. 23, 382-7 (1978)

100.Sund RB, Hillestad B: Uptake, conjugation and transport of laxative diphenols by everted sacs of the rat jejunum and stripped colon. Acta Pharmacol. Toxicol. 51, 377387 (1982)

101.Sund RB, Lauterbach F. Drug metabolism and metabolite transport in the small and large intestine: experiments with 1-naphtol and phenolphthalein by luminal and contraluminal administration in the isolated guinea pig mucosa. Acta Pharmacol. Toxicol. 58, 74-83 (1986)

102.Suzuki H, Sugiyama S: Role of metabolic enzymes and transporters in the absorption of drugs from the small intestine. Eur. J. Pharmaceut. Sci. 12, 3-12 (2000)

103.Szkudelszki T: The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B-cells of the rat pancreas. Physiol. Res. 50, 536-546 (2001)

104.Thompson MJ, Ballinger LN, Cross SE, Roberts MS: High performance liquid chromatographic determination of phenol, 4-nitrophenol, β-naphthol and a number of their glucuronide and sulphate conjugates in organ perfusate. J. Chromatogr. B 677, 117-122 (1996)

105.Thomsen OO, Larsen JA: Interaction of insulin, glucagon, and DBc HMP on bile acid dependent bile production in the rat. Scand. J. Gastroenterol. 17, 687-693 (1987)

87

106. Thulesen J, Orskov C, Holst JJ, Poulsen SS. Short-term insulin treatment prevents the diabetogenic action of streptozotocin in rats. Endocrinology. 138, 62-8 (1997)

107.Toannes SW, Manser HH: Efficient cleavage of conjugates of drugs and poisons by immobilized β-glucuronidase and arylsulfatase in columns. Clin. Chem. 45, 21732182 (1999)

108.Tukey RH, Strassburg CP: Human UDP-glucuronosyltransferases: metabolism, expression and disease. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 40, 581-616 (2000)

109.Vainio H, Hietanen E (1980): Role of extrahepatic metabolism. In: Concepts in drug metabolism, eds. Jenner P, Testa B, Marcel Dekker, New York and Basel, pp. 251284

110.van de Kerkhof E, de Graaf IA, Groothuis GM: In vitro methods to study intestinal drug metabolism. Curr. Drug Metab. 8, 658-675 (2007)

111.van Norman KH: The biuret reaction and the cold nitric acid test in the recognition of protein. Biochem. J. 4, 127-135 (1909)

112. van Obberghen E: Signalling, through the insulin receptor and the insulin like growth factor I. receptor. Diabetologia, 37, 125 – 134 (1994)

113.Varga F, Málly J, Fischer E: Effect of insulin on the biliary excretion of some organic anions in rats. Arch. Toxicol. Suppl. 4, 391-393 (1980)

114.Vereczkey L., Jemnitz K., Gregus Z: Humán gyógyszermetabolizáló enzimek II. Konjugációs enzimek. Acta. Pharm. Hung. 68, 284 – 288 (1998)

115.Vega P, Gaule C, Mancilla J, Del Villar E: Comparison of alloxan and streptozotocin induced diabetes in rats: differential effects on microsomal drug metabolism. Gen. Pharmacol. 24, 489-495 (1993)

88

116.Vega P, Gaule C, Sanchez E, Del Villar E: Inhibition and activation on UDPglucoronyltransferase in alloxanic-diabetic rats. Gen. Pharmacol. 17, 641-645 (1986)

117.Watkins JB, Dykstra TP: Alterations in biliary excretory function by streptozotocininduced diabetes. Drug Metab. Disp. 15, 177-183 (1987)

118.Weinhilboum RM: Sulfate conjugation of neutronsmitters and drugs. Introduction, Fed. Proc. 45, 2220 – 2222 (1986) 119.Wieland OH: Protein modification by non – enzymatic glucosylation: Possible role in the development of diabetic late complications. J. Mol. Cell. Endocrinol. 29, 125 – 122 (1983)

120.Winegrad AI, Clements RS, Beiswender PS, Burden-Russel CL (1967): In: International Symposium of Metabolism, Physiology and Clinical Use of Pentoses and Polyols, eds. Horecker BL, Laud K, Takagi Y, Springer, New York, p. 258 (1967)

121.Yusuhara M, Kurosaki Y, Kinur T, Sezaki H: Drug elimination function of rat small intestine: metabolism and intraluminal excretion. Biochem. Pharmacol. 33, 31313136 (1984)

122. Zhao WH, Abraham MH, Le J, Hersey A, Luscombe CN, Beck G, Sherborne B, Cooper I: Evaluation of rat intestinal absorption data and correlation with human intestinal absorption. Eur. J. Med. Chem. 38, 233 – 243 (2003)

89

8. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. Fischer Emil egyetemi tanárnak, program- és témavezetőmnek, aki mindvégig támogatott és stimulált a PhD munkám során. Tanácsai, útmutatása és segítőkész hozzáállása alapvetően hozzájárult ahhoz, hogy az értekezésben bemutatott kísérleteket eredményesen elvégezhettem és az adatokat az értekezésben összefoglalva bemutathattam. Köszönettel tartozom Dr. Perjési Pál egyetemi tanárnak, témavezetőmnek, a Gyógyszerészi Kémiai Intézet vezetőjének, aki a szakmai munkámban nyújtott segítsége mellett lehetőséget biztosított az intézetben a tudományos munka végzésére. Köszönettel tartozom Dr. Barthó Loránd egyetemi tanárnak, a Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet, valamint a Gyógyszerésztudományi Doktori Iskola vezetőjének, aki lehetővé tette számomra a kísérletes munka elvégzését az általa vezetett Intézetben, valamint a PhD tevékenységet a Gyógyszertudományi Doktori Iskola keretein belül. Köszönetemet szeretném kifejezni Reiszné Horváth Mária asszisztensnőnek, akitől nem csak az állatkísérletek kivitelezésében, de az értekezés összeállításának a technikai vonatkozásaiban is rendkívül értékes segítséget kaptam. Köszönöm Kovács Péter informatikusnak az értekezés összeállításában nyújtott értékes technikai segítségét. Végül, de nem utolsósorban megköszönöm családomnak, elsősorban szüleimnek, hogy mindvégig kitartó erkölcsi és anyagi támogatásban részesítettek.

90

A kísérletes diabétesz hatása a vékonybél és a máj eliminációs tevékenységére. PhD értekezés. Dr. Almási Attila. Pécsi Tudományegyetem

Recommend Documents