A ferrilhemoglobin szerepe az LDL oxidációjában
MTA-DEOEC Hemosztázis,Trombózis és Vaszkuláris Biológiai Kutató Csoport Belgyógyászati, Gyermekgyógyászati Intézet Vaszkuláris Biológiai Kutató Laboratórium
Potor László
Bevezetés Az LDL szubendotheliális térben történő oxidatív modifikációja az egyik első lépés az atheroszklerózis kialakulásában. In vitro LDL oxidation: 1.átmeneti fémek- vas;réz 2.hemproteinek- hemoglobin;cöruloplazmin;mioglobin 3.enzimeket-lipoxigenáz;mieloperoxidáz;tormaperoxidáz. Kutatócsoportunk korábban megállapította,hogy in vivo körülmények között a hem előidézi az LDL oxidációját. A reakció során a hem gyűrű (protoporfirin IX) felnyílik és vas szabadul fel,mely katalizálja az LDL oxidációját. Az oxidált LDL toxikus a legtöbb vaszkuláris sejtre nézve,így fokozza az endothelium károsodását is. LDL oxidációs termékek -konjugált diének -lipid-hidroperoxidok - tiobarbitursav reaktív anyagok
AZ LDL oxidatív modifikációja: Lipid peroxidáció mechanizmusa: 1.Iniciációs szakasz: hidrogén elvonásalkil gyök képződése átrendeződés mezoméria stabilizált konjugált dién 2.Propagáció: (szabadgyök képződés láncreakciószerű kiteljesedése) oxigén jelenlétében peroxil gyök hidrogén elvonáslipid-hidroperoxid Fe2+ alkoxil gyök 3.Termináció: hidrogén elvonásgyökök stabilizálódnakzsírsav fragmentációdialdehidek keletkeznek
Anyagok és módszerek LDL szeparálása: Felnőtt egészséges donortól származó vénás vér Plazma inkubálása1 órán át 37oC-on: 1. Natív LDL 2. 80uM Hemmel 3. 80uM Ferrylhemoglobin 4. 160uM Ferrylhemoglobin Egy lépéses gradiens ultracentrifugálás LDL frakció begyűjtése. Ferrylhemoglobin előállítása: Felnőtt egészséges donortól származó vénás vér hemoglobin preparálás tisztítás ioncserés kromatográfiával és dializálássalferrylhemoglobin preparálása 10* moláris mennyiségű H2O2-aldializálás Vizsgálati módszerek: 1.LDL oxidatív rezisztenciájának mérése hem eltűnés,lag-time mérés 2.LDL oxidatív módosulásának mérésekonjugált dién keletkezés 3.LOOH tartalom mérés 4.Tiobarbitursav reaktív anyagok mérésemalondialdehid keletkezés
Az LDL hem/H2O2-al történő oxidációjának és konjugált diének keletkezésének kinetikája B4 1,500
0,240
1,400
0,220
1,300 4 32 -5 ,
OD /m
1,000 0,900
0,120
0,800
0,100 0:00:00
0:20:00
0:40:00
1:00:00
1:20:00
1:40:00
0,700 0:00:00
2:00:00
0:20:00
t at Max V
0,140
OD at Max V
3m
0,160
1,100 24 ,71
0,180
1,200
m D/ t at Max V mO
OD at Max V
OD
0,200 OD
C4
0,260
0:40:00
1:00:00
Time
1:20:00
1:40:00
2:00:00
Time
B11
D11
0,210
1,250
0,200
1,200
0,190 1,150
0,180 , -2
OD at Max V
0,130
0:10:00
0:20:00
0:30:00
0:40:00
0:50:00 Time
1:00:00
1:10:00
1:20:00
1:30:00
1:40:00
0,900 0:00:00
13 ,47
6m
0,950
0,120 0,110 0:00:00
OD /m
OD
1,000
t at Max V
0,140
1,050 OD at Max V
t at Max V
0,150
1,100
m D/
0,160
O m
OD
9 90
0,170
0:10:00
0:20:00
0:30:00
0:40:00
0:50:00 Time
1:00:00
1:10:00
1:20:00
1:30:00
1:40:00
A hem és a konjugált dién (lipidperoxidációs termék) koncentrációjának változása spektrofotometriásan követve: LDL oxidatív rezisztenciájának változása (405nm) 80 70 ΔT at Vmax
60
natív LDL
50
80uM Hem
40
80uM Ferrylhb.
30
160uM Ferrylhb.
20 10 0 1.nap
2.nap
3.nap
5.nap
6.nap
7.nap
8.nap
9.nap 14.nap 19.nap
LDL oxidatív módosulása (konjugált dién keletkezés;UV-234nm)
ΔT at Vmax
90 80 70 60
natív LDL
50 40
80uM Hem
30 20
160uM Ferrylhb.
80uM Ferrylhb.
10 0 1.nap 2.nap 3.nap 5.nap 6.nap 7.nap 8.nap 9.nap 14.nap 19.nap
Lipid-hidroperoxid és malondialdehid tartalom mérése
3 2.5 natív LDL
2
80uM Hem
1.5
80uM Ferrylhb.
1
160uM Ferrylhb.
0.5 0
1. na p 2. na p 3. na p 5. na p 6. na p 7. na p 8. na p 9. na p 14 .n ap 15 .n ap 16 .n ap
Concentration (uM/mg protein)
LOOH tartalom
0.250 0.200 natív LDL 0.150
80uM Hem
0.100
80uM Ferrylhb. 160uM Ferrylhb.
0.050 0.000
1. na p 2. na p 3. na p 5. na p 6. na p 7. na p 8. na p 9. na p 14 .n ap 15 .n ap
Concentration (uM/mg protein)
Malondialdehid mérés tiobarbitursavas módszerrel
Anyagok és módszerek 1. LDL szeparálása: Na2EDTA-val alvadásgátolt vénás vér (50ml) Plazmát (23ml) 1 órán át inkubáltam 37oC-on: 1. Natív LDL 2. 80uM Hemmel 3. 80uM Ferrylhb. 4. 160uM Ferrylhb. A plazma sűrűségét KBr-dal beállítottam (1,3g/ml) Quick-Seal csőbenkétrétegű grádiens fiz.só-val. LDL szeparálás: egy lépéses gradiens ultracentrifugálással (302000G ;4oC; 2hour; VTi 50.2 rotor,Beckman Instrument) Fehérje tartalom mérés: BCA protein módszerrel (mg fehérje/ml) hemoglobin preparálás: Önkéntestől származó alvadás gátolt vérből tisztítás ioncserés kromatográfiával (DEAESepharose CL-6B oszlopon. Oxidált hemoglobin: 1,5* moláris mennyiségű káliumferricianiddal inkubálás 30percigdializálás. Oxidált hemoglobin inkubálás H2O2-al amíg a methemoglobin 70%-a át nem alakul ferrylhemoglobinná (spektrofotometriás nyomonkövetés). LDL oxidatív rezisztenciájának és módosulásának detektálás: Biotek Synergy4 Microplate readeren végeztem. LDL oxidatív rezisztenciáját:405nm-en detektáltam.(hemeltűnés), LDL oxidatív módosulását:UV- 234nm en detektáltam.
Anyagok és módszerek 2. LDL lipid-hidroperoxid tartalma: Ferrous Oxidation in Xilenol Orange (FOX) módszerrel. A mintákat ELISA plate readeren 580nm-en fotometráltam. Tiobarbitursav reaktív anyagok meghatározása: (malondialdehid) Tiobarbitursav reagenssel(2-tiobarbitursav;HCl;TCA) Extrahálás után a minták felűlúszóját 532nm-en fotometráltam. MTT-assay on HUVEC cells: Köldökzsinórból szeparált endotél sejteket toxicitási tesztnek vetettem alá. Toxicitási teszt:1 órás hemes vagy ferrilhemoglobinos előkezeléskezelés h2o2-al.
LDL oxidatív rezisztenciájának (hem eltűnés) és módosulásának (konjugált dién keletkezés) kinetikája: El nem oxidált LDL kinetikája:
Hem eltűnés
Konj.dién keletkezés
Hem eltűnés
Konj.dién keletkezés
Oxidált LDL kinetikája:
