LAMPIRAN
42 Lampiran 1. Prosedur Kerja Ekstraksi Minyak Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr.), Pengambilan Sampel Darah, Penetapan Profil Urea Darah (DAM) dan Penentuan Profil Asam Urat Darah (Follin-Wu) A. Ekstraksi Minyak Buah Makasar (Brucea javanica (L.) Merr.) Produksi minyak esensial diperoleh secara ekstraksi sesuai dengan prosedur penelitian Subeki dkk. (2006) : 1. Sebanyak 80 kg tepung buah makasar direndam selama 1 minggu dan setiap hari selama 10 menit dilakukan pengadukan. Campuran divorteks selama 1 menit dan didiamkan selama 30 menit. 2. Filtrat disaring dengan menggunakan kain saring dan kemudian diuapkan dengan evaporator menjadi 1 L. 3. Filtrat pekat tersebut kemudian diekstrak dengan etil asetat (EtOAc) hingga diperoleh fraksi air dan EtOAc. 4. Fraksi CHCl³ diuapkan hingga kering dan kemudian dimasukkan ke dalam silika gel kolom kromatografi dan dielusi dengan clorofom sehingga diperoleh 3 fraksi. 5. Minyak esensial diperoleh dari fraksi 2 (1:2) lalu dievaporasi untuk memperoleh minyak esensial murni. B. Pengambilan Sampel Darah 1. Objek penelitian (itik Cihateup fase grower) disiapkan sebanyak 48 ekor. 2. Sebelum sampel darah diambil, bagian vena pectoralis dibersihkan terlebih dahulu dengan alkohol 70%. 3. Sampel darah diambil pada bagian vena pectoralis sebanyak 9 mL dengan menggunakan syringe.
43 4. Sampel darah tersebut selanjutnya ditampung dengan menggunakan tabung ber-EDTA yang mengandung anti koagulan. C. Penetapan Profil Urea Darah (DAM) 1. Disediakan 31 tabung reaksi, yaitu 1 tabung reaksi yang diberi tanda standar dan 30 tabung diberi tanda uji. 2. Dipipetkan kepada tabung reaksi standar sebanyak 5 mL larutan TCA 5% dan larutan standar sebanyak 0,25 mL. 3. Dipipetkan kedalam 30 tabung reaksi uji larutan TCA 5% sebanyak 5 mL, serum atau darah sebanyak 0,25 mL dan larutan standar 0,25 mL. 4. Masing-masing tabung dicampur dengan baik, selanjutnya endapan dipisah dengan cara disentrifugasi selama 5 menit. Supernatan digunakan untuk penetapan profil urea darah. 5. Langkah berikutnya yaitu disediakan 32 buah tabung reaksi, 1 tabung diberi tanda blanko, 1 tabung diberi tanda standar, dan 30 tabung diberi tanda uji. 6. Dipipetkan kedalam tabung reaksi blanko larutan katalisator dan larutan DAM masing-masing sebanyak 5 mL. 7. Dipipetkan kedalam tabung reaksi standar supernatan standar (hasil sentrifugasi tabung reaksi standar pada langkah b dan d ) sebanyak 0,25 mL, larutan katalisator dan larutan DAM masing-masing sebanyak 5 mL. 8. Dipipetkan kedalam 30 tabung reaksi uji supernatan serum (hasil sentrifugasi tabung reaksi uji pada langkah c dan d sebelumnya) sebanyak 0,25 mL, larutan katalisator dan larutan DAM masing-masing sebanyak 5 mL. 9. Selanjutnya larutan dalam tabung dicampur dengan baik.
44 10. Lalu seluruh tabung diletakkan dalam penangas air mendidih selama 6 menit. 11. Kemudian tabung diangkat dari penangas dan didiamkan selama 10 menit pada suhu kamar. 12. Serapan sampel dibaca pada panjang gelombang 525 nm. Warna yang terbentuk cepat memucat, sehingga pembacaan harus cepat dilakukan. D. Penentuan Profil Asam Urat Darah (Folin-Wu) 1. Sampel yang diperlukan yaitu filtrat darah bebas protein dibuat terlebih dahulu dengan menggunakan cara Follin-Wu. 1) Dipipetkan 7 mL akuades kedalam labu Erlenmeyer 125 mL yang kering. 2) Ditambahkan 1 mL bahan yang akan diperiksa, lalu labu digoyang dengan perlahan. 3) Ditambahkan 1 mL larutan Na-tungstat 10%, dicampurkan dengan cara menggoyang labu. 4) Ditambahkan 1 mL H2SO4 2/3 N secara tetes demi tetes sambil `terus menggoyang labu. 5) Labu didiamkan selama 10 menit. 6) Lalu disaring melalui kertas saring yang kering dan filtrat yang keluar ditampung. 2. Reagen yang diperlukan untuk menetapkan profil asam urat darah seperti larutan urea sianida, pereaksi asam urat, larutan standar asam urat, dibuat terlebih dahulu. 3. Pembuatan larutan (Reagen) sianida :
45 1) Dilarutkan 75 g natrium sianida dalam 700 mL air dalam gelas kimia 2000 mL. 2) Lalu ditambahkan 300 g urea dan diaduk. 3) Selanjutnya ditambahkan 5 g kalsium oksida dan aduk selama 10 menit. 4) Larutan didiamkan selama 24 jam setelah itu disaring. 5) Ditambahkan 2 g bubuk lithium oksalat. 6) Larutan dikocok selama 15 menit kemudian disaring. 4. Membuat pereaksi asam urat. 1) Dimasukkan 100 g natrium tungstat (bebas molibdat) ke dalam labu florence 500 mL. 2) Pada labu lain dicampur 32-33 mL asam fosfat 85% dengan 150 mL akuades. 3) Larutan asam fosfat ini dituangkan ke dalam labu berisi tungstat dan diaduk. 4) Ditambahkan beberapa butir gelas didih dan dididihkan dengan hatihati diatas api kecil (burnermikro) selama 1 jam. 5) Diletakkan labu berisi 200 mL air dingin sebagai kondensor untuk mencegah cairan hilang akibat menguap. 6) Pada akhir pendidihan dihilangkan warna yang terjadi dengan sedikit air brom. 7) Lalu dididihkan kembali untuk menghilangkan brom yang berlebihan. 8) Selanjutnya didinginkan dan diencerkan sampai 500 mL. 5. Larutan standar asam urat 0,02 mg/5 mL dibuat dengan cara mengencerkan larutan stok asam urat (1 mg/5 mL):
46 Membuat stok asam urat (1 mg/5 mL): 1) Dinatrium hidrogen fosfat sebanyak 9 g dan 1 g natrium dihidrogen fosfat dilarutkan kedalam 300 mL akuades panas. 2) Bila ada cairan tidak jernih arutan tersebut disaring, lalu diencerkan sampai 500 mL dengan akuades panas. 3) Larutan ini dituangkan kedalam labu ukur 1000 mL yang berisi 200 mg asam urat yang telah dilarutkan dengan beberapa mL akuades. 4) Larutan dikocok sampai larut sempurna dan didinginkan. 5) Lalu ditambahkan 1,4 mL asam asetat glasial dan diencerkan sampai 1000 mL. 6) Selanjutnya kloroform ditambahkan untuk mencegah tumbuhnya jamur dan bakteri. a.
Larutan stok asam urat yang telah dibuat (langkah a sampai f) dimasukkan sebanyak 10 mL kedalam dimasukkan labu ukur 500 mL.
b.
Kemudian ditambahkan 400 mL akuades.
c.
Terakhir, ditambahkan 5 mL asam klorida pekat dan diencerkan sampai 500 mL.
6. Disediakan 62 buah tabung reaksi 25 mL dan diberi tanda, 1 tabung ditandai blanko, 1 tabung ditandai standar dan 30 tabung ditandai uji 7. Dipipetkan kedalam tabung reaksi blanko akuades sebanyak 5 mL dan larutan urea sianida sebanyak 10 mL. 8. Dipipetkan kedalam tabung reaksi standar larutan standar asam urat sebanyak 5 mL dan larutan urea sianida sebanyak 10 mL.
47 9. Dipipetkan kedalam 30 tabung reaksi uji filtrat darah bebas protein sebanyak 5 mL, standar asam urat sebanyak 5 mL dan larutan urea sianisa sebanyak 10 mL. 10 Isi masing-masing tabung dicampur dengan cara diputar pada 60oC. 11 Pereaksi asam urat dipipetkan kedalam seluruh tabung sebanyak 4 mL kedalam masing-masing tabung. 12 Tabung didiamkan selama 20 menit pada suhu kamar. 13 Selanjutnya, diencerkan dengan akuades hingga 25 mL dengan cara membolak-balikkan tabung. 14 Setelah 20 menit serapan dibaca pada panjang gelombang 540 nm.
48 Lampiran 2. Output Analisis Varians Polinomial Orthogonal Pengaruh Pemberian Minyak Buah Makasar terhadap Kadar Asam Urat Darah Itik Cihateup Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
8,606
3
2,869
37,358
0,000
Contrast
7,865
1
7,865
102,423
0,000
Deviation
0,741
2
0,371
4,826
0,019
Within Groups
1,536
20
0,77
Total
10,142
23
Between Groups
(Combined) Linear Term
49
Lampiran 3. Output Analisis Contrast Orthogonal Perbedaan Kadar Asam Urat Darah dengan Level Pemberian Minyak Buah Makasar yang Berbeda Value of Contrast Asam Urat Darah
Contrast
Std. Error
t
df
Sig. (2-tailed)
Assume equal
1
3,6923
0,39190
9,422
20
0,000
variances
2
0,8158
0,27712
2,944
20
0,008
3
0,6122
0,15999
3,826
20
0,001
Does not assume
1
3,6923
0,50373
7,330
6,170
0,000
equal variances
2
0,8158
0,24894
3,277
7,928
0,011
3
0,6122
0,11767
5,203
9,048
0,001
50
Lampiran 4. Output Analisis Varians Polinomial Orthogonal Pengaruh Pemberian Minyak Buah Makasar terhadap Kadar Urea Darah Itik Cihateup Sum of Squares
df
Mean Square
F
Sig.
3516,923
3
1171,308
25,827
0,000
Contrast
3216,232
1
3216,232
70,856
0,000
Deviation
300,691
2
150,346
3,312
0,057
Within Groups
907,821
20
45,391
Total
4424,744
23
Between Groups
(Combined) Linear Term
51
Lampiran 5. Output Analisis Contrast Orthogonal Perbedaan Kadar Urea Darah dengan Level Pemberian Minyak Buah Makasar yang Berbeda Value of Contrast
Contrast
Std. Error
t
df
Sig. (2-tailed)
1
-74,9822
9,52796
-7,870
20
0,000
2
-26,2682
6,73729
-3,899
20
0,001
3
-2,2908
3,88977
-0,589
20
0,562
Does not assume
1
-74,9822
6,11830
-12,255
8,640
0,000
equal variances
2
-26,2682
10,54116
-2,492
5,194
0,053
3
-2,2908
1,45375
-1,576
6,996
0,159
Urea Darah Assume equal variances
52
Lampiran 6. Proses Pengambilan Sampel Darah
Lampiran 7. Sampel yang telah Dicampur Reagen
Lampiran 8. Analisis Sampel Menggunakan Spektrofotometer
