BIOTECHNOLÓGIAI FEJLESZTÉSI POLITIKA, KUTATÁSI IRÁNYOK A biotechnikát és az anyagtudományokat összekapcsoló nanorészecskék, fehérjék és nukleinsavak Tárgyszavak: analitikai módszerek; biotechnológia; anyagkutatás; nanoszerkezetek; szupramolekuláris kémia. A szupramolekuláris kémia a gyenge, nem kovalens kölcsönhatásokkal összetartott molekulatömörülések úttörő vizsgálatából kiindulva, az elmúlt három évtized alatt érett mára önálló tudománnyá. Az összetett és fontos funkciókat ellátó természetes molekulatársulások felépítő elveit kutatva igyekszik, ezekre az elvekre építve létrehozni újszerű funkcionális egységeket és anyagokat, amelyek felhasználhatók a katalízis- és érzékelőtechnikában, a közlekedésben és más mérnöki tudományokban, valamint az orvosbiológiai kutatásban. További látványos alkalmazások: – optikai és elektronikai műszerek (szub)µm méretű építőelemei elektromosan vezető és elektrolumineszcens szerves polimerekből, valamint – különleges funkciókra képes ún. intelligens anyagok (advanced materials). A DNS kettős spiráljának felfedezése a biológiát tisztán jelenségeket megfigyelő és leíró (fenomenológiai) ismeretanyagból átalakította molekuláris tudománnyá, betekintést nyújtva biokémiai folyamatokba és utat nyitva a DNS-rekombinációs technikának. Ez a forradalmi fejlődés jelenleg a biotechnika és az anyagtudományok közötti kapcsolat megteremtésének lehetősége, ill. kihívása előtt áll. A kettő összeolvadása (1. ábra), közös alapjuk, a kémia segítségével módot adna – új típusú anyagokhoz az evolúciónak megfelelően optimált biológiai komponensek előállítására és – az anyagkutatás nyújtotta új anyagok és fizikai–kémiai eljárások felhasználásával, biológiai problémák megoldására. A biotechnikának és az anyagtudományoknak közös lévén a mérettartománya (10–9-es nagyságrend) (2. ábra) a természetes nanoméretű rendszerek (pl. a 2–300 nm-es biomolekulák szerkezetének vizsgálatára, az iparban pedig további miniatürizáláshoz – a mai mikroprocesszorok 200 nm körüli méretűek – ki kell fejleszteni az ún. nanokémiát.
kémia mikro- és nanotechnológiák anyagtudományok
szerves és szervetlen kémia
biokémia mikrobiológia, bioengineering
bioorganikus és bioanorganikus kémia
biotechnológia
szupramolekuláris kémia fizikai kémia
molekuláris biológia
funkcionális anyagok
a felhasználáshoz szabott bimolekulák
kerámiák, nanoaggregátumok,vezető polimerek
fehérjék, nukleinsavak, részegységek, szervecskék
újszerű funkciós egységek • érzékelés, manipulálás, katalízis • molekuláris (nano) elektronika és optika • molekuláris gyógyászat és protézisek
1. ábra A kémia az alkalmazott tudományok központjában
„fentről le”: fénylitográfia, mikrokontakt nyomtatás
„lentről felfelé”: szerves szintézis, önszerveződés
• biomolekulák • nanotömörülések
2. ábra Az előállítások méretkorlátai, azaz 5 és 200 nm közötti hézagot a biomolekulák és a kolloid nanorészecskék töltik ki
A nanokémia és az anyagtudományok találkozásával definált új kutatási terület egyéb elméleti, kísérleti és gyakorlati kapcsolódásai: – a felületek kémiája, – bioorganikus és a bioanorganikus kémia, – a DNS-szintézis és a rekombináns DNS-technika molekuláris-biológiai vonatkozásai, valamint – az immunológia. Nanorészecskék és biomolekulák összekapcsolása Az enzimek reakcióközpontjában aminosavak oldalcsoportjai és fémionok közt fellépő kölcsönhatások analógiájára a szerves ligandok és fémes vagy félvezető nanorészecske-felületek közötti kötődések is alkalmat adnak biomolekuláris egységeknek a részecskével való összekapcsolására, és ilyen módon új, hibrid anyagok felépítésére. Erre a legújabb szakirodalomból ismeretesek sikeres kísérletek, többek között arany- és különböző fémszulfid-részecskékkel, a szerves oldalon pedig fehérjékkel immunglobulinokkal és DNS-sel. A biomolekula és a nanorészecske között erősebb kötés létesítésére olykor a funkcionális kapcsolócsoportjaikkal csereakcióba lépő ligandokat (pl. HS-cisztein, -lizin, H2Nlizin, HOOC-glutamin) használnak. Ezen az úton rétegeznek pl. kolloid aranyra tioltartalmú fehérjét (immunglobulinokat, szérumalbumint). A biomolekulát gyakran kapcsolják anionos liganddal, pl. citromsavval stabilizált nanorészecskékhez nem kovalens elektrosztatikus kölcsönhatások révén. Az e módszerrel készült immunglobulin-bevonatú ezüst és arany nanorészecskék előállításakor az adszorpciót a citrátcsoport izoelektromos pontjánál nagyobb pH-értéken végzik, amikor is a fehérje pozitív töltésű aminosav-oldalláncain át tartósan kötődik a kolloidhoz, és megakadályozza annak tömörülését. Hasonlóan kötődnek DNS-molekulák pozitív vagy negatív ligandokkal stabilizált CdS-nanorészecskékhez. Más módszerek terminális karboxil-, amino- vagy maleinsavimid-csoporttal való észterezéssel, ill. amidálással hozzák létre a kívánt kapcsolódást. Ezt alkalmazzák pl. a szövettani vizsgálatokhoz szükséges, fehérjéből és jól definiált 0,8 nm-es arany nanoaggregátumból álló kombinációk. Több közlemény számol be félvezető nanorészecskék szintéziséről tiol ligand jelenlétében, ciszteinnel stabilizált CdS- és ZnS-kolloidok, valamint vízben oldható nanokristályos ZnS-por előállításáról. Szervetlen és biológiai komponensek kapcsolódására a fentiek szerint már több módszer ismeretes, de megoldásra várnak még olyan feladatok, mint – az agresszív reakciókörülmények kiküszöbölése, amelyek gyakran inaktiválják az érzékeny biomolekulát, és – legnagyobb kihívásként: sztöchiometriailag meghatározott nanorészecske/biomolekula egységek előállítása, ugyancsak jól definiált nanoarchitektúrákhoz.
Nanorészecskék biomolekuláris szerveződése Nanoméretű részecskék biomolekulákkal térhálót képezhetnek. Ehhez a részecskéket un. felismerő csoportokkal látják el, amelyek egymással vagy egy liganddal vannak kiegészítő viszonyban (3. ábra), ezáltal akár makroméretig növelhető háló is létrejöhet. Ennek gyakorlati jelentőségét a rendkívül specifikus felismerőképességű biomolekláris ligandokkal igen finom, érzékeny szabályozások és átkapcsolások, valamint kimutatási módszerek kidolgozásának lehetősége adja.
A)
B)
C)
3. ábra Nanorészecskék és biomolekuláris felismerőcsoportok kapcsolódása A)funkcionalizálás egymással kompatibilis felismerőcsoportokkal, B)nem kompatibilis csoportok közt ligand (linker) közvetít, C)kétfunkciós (divalens) linker specifikusan ismeri fel a nanorészecskék felületét.
linker 8
8
linker 9
9
4. ábra Immunglobulinnal funkcionalizált arany- és ezüstrészcskék összekapcsolását közvetítő divalens linkerek A felismerőrendszerek többsége fehérjékre épül: – Egyik elsőként (1999) realizált példájukban a kutatók az antitestek és az ún. haptének (kis molekulájú szerves vegyületek) közötti kölcsönhatásokat használják fel nanorészecskék térhálósítására. Ehhez a
szervetlen részecskét be kell vonni a hapténnel szembeni antitesttel – a példában kolloid ezüst- vagy aranyszemcsét G- vagy E-immunglobulinnal – amely specifikusan kötődik D-biotinhoz vagy dinitro-fenilcsoporthoz. A bevont szemcsék térhálósodásához kétértékű (divalens) ligandokat, (az angol nyelvű szakirodalomban és onnan átvéve: linker) szintetizáltak, molekulájukban két végállású hapténcsoporttal (4. ábra). Ezek elindították a részecskék irányított aggregálódását, majd leválását csapadékként. Itt a tömörülés még nem éri el az oligomer fokot, a rendszer tehát kiérleltebb antitest/antigén illeszkedést igényel. – A nanorészecskék fehérje alapú felismeréses szerveződésének másik példája egy biotinkötő fehérje, a sztreptavidin és kismolekulájú ligandja a D-biotin közötti kölcsönhatásra épül. A vízben oldódó biotin (H-vitamin) és a tetramer sztreptavidin között áll fenn a ma ismert legerősebb ligand/receptor kapcsolat, 1014 dm/mol affinitási állandóval. Mivel biotinos komponensek már kereskedelmi forgalomban vannak, a sztreptavidin/biotin konjugátumok több diagnosztikai próba alapját képezik. A fenti elven készült aranykolloid térhálók elektronmikroszkópos felvételén átlagosan 20 részecskéből álló egységek láthatók, egymástól a sztreptavidin molekula átmérőjének megfelelő átlagosan 5, minimálisan 4 nm távolságra. A biotin/sztreptavidin rendszer sokoldalúan használhatónak bizonyult nanorészecskék oldatban vagy szubsztrátumon való szerveződésének kiváltására és szupramolekuláris tömörülések felépítésére. A lehetőségeket tovább bővítik biotin-analogonok és rekombinálns sztreptavidin-mutánsok. Ezáltal széles határok közt szabályozhatók a tömörülés sebességi és egyensúlyi állandói és a kolloid hibridtermékek dinamikai és kémiai szerkezeti tulajdonságainak finombeállítására van mód. A fehérjealapú önszerveződés elvén – szól a prognózis – „a jövő nanogyárai”: speciális biomolekuláris felismerőcsoportok segítéségével különböző, térbelileg definált részecskeaggregátumokat fognak termelni. S ha ez a „forgatókönyv” megvalósulna, már „menet közben” profitálhatna a modern géntechnikával előállított, nagy affinitású ligandpárokból. 1997-ben amerikai kutatók már beszámoltak ilyen, digoxigeninre és fluoreszcein-hapténekre specializált antitestek bioszintéziséről. Géntechnikával előállítottak olyan fehérjelinkereket is, amelyek speciálisan felismerik félvezetők különböző anyaginak felületét, ami szükségtelenné teszi a részecskék előzetes, ún. kémiai funkcionalizálását (megfelelő bevonását). Ehhez, a Nature egy 2000. évi közleménye szerint egy 109 · 12-mer (12szeres ismétlődésű) peptidből választottak ki „fág-display” segítségével öt fém egykristály-félvezető közül egyhez szelektíven kötődő fág-klónokat kristályösszetétel- és kristályforma-kombinációjuk alapján. A peptidet hordozó fágok szelektivitása a szubsztrátumok különböző kémiai reakcióképességének, de felületi oxidjaik eltérő összetételének is tulajdonítható.
DNS-alapú nanorészecske-tömörülések A különféle, nanotechnikai funkciós egységek kifejlesztésére alkalmas biomolekulák közül kiemelkedik a DNS, néhány különleges tulajdonságával: – az adenin/timin- és a guanin/cisztin bázispárosítás egyszerűségénél és egyedülálló specifikusságánál fogva, a mesterséges DNS-receptorok programozása is egyszerű, – bármely DNS-szekvencia szintetizálása automatizálható, – polimeráz-láncreakció útján az egyes nukleinsav-molekulák makroszkópos tömegig szaporíthatók, – számos ligáz, nukleáz és más DNS-módosító enzim áll rendelkezésre, amelyekkel a DNS-molekula szinte atomnyi pontossággal alkalmassá tehető funkcionális nanoszerkezetek felépítésére. DNS-sel térhálósított aranykolloidok (5. ábra) részletes vizsgálatával megállapították, hogy a linker hossza kinetikailag szabályozza a tömörülések nagyságát, és optikai tulajdonságait, ezzel szemben az elektromos jellemzőit nem befolyásolja. Szárításkor a hálószerkezet DNS-sel szigetelt nanorészecskékből álló félvezető tulajdonságú tömeggé esik össze. E hasznos felismerések ellenére még kevéssé sikerül a szerveződés folyamán célzottan módosítani az összeálló szerkezet topográfiáját.
DNS-linker A’
B’
5. ábra Aranykolloid önszerveződése DNS-hibridizálódás útján kétféle aranykolloid módosítása oligonukleotidok egymással nem kompatibilis 5’-, ill. 3’-tiolcsoportjai útján Az újszerű hibrid anyagok szerveződését és sztöchiometriáját molekuláris egységek térben jól definiált rendjével lehet ellenőrizni. Ennek modellezéséhez tiollal kezelt 18-as oligonukleotidból és 1,4 nm-es aranykolloidból álló
monoadduktumokat állítottak elő, amelyek egyetlen reakcióképes maleinsavimid-csoportot tartalmaztak. Ezek önszerveződéssel komplementer szakaszokat tartalmazó, egyszálas DNS-hez kapcsolódtak, sztöchiometriailag és térbelileg egyaránt jól definiált „nanokristály-molekulákat” hozva létre, mégpedig az egyes DNS-szakaszok bázissorrendjétől függően a dimer molekulák fej/fej vagy fej/farok elrendezésében (6. ábra). A NHS-biotin NH2 1,4 nm-es aranytömörülés
bio-Au
DNS/sztreptavidin konjugátum
nukleinsavminta
B
C
6. ábra Biotinilezett arany nanotömörülések (bio-Au) DNS-közvetítésű önszerveződése DNS/sztreptavidin konjugátummal (A), bio/fém aggregátum (B) és immunglobulinos (sztreptavidines) másodlagos szerkezet (C) A két izomerben a részecskék távolsága 3–10, ill. 2–6 nm volt, összhangban a modellszámításokkal. Az elektronmikroszkópos felvételeken a trimer változatnak is a várakozásnak megfelelő szerkezete volt. Más összetételű nanokristály-aggregátumokkal végzett vizsgálatok a nanokristály-molekulák
nagy flexibilitásáról tanúskodnak, feltéve, hogy a DNS-gerincen rések vannak, de megszűnik, ha a lánc megszakítatlan. Azt az elképzelést, hogy (makro) molekulák térbeli elrendezéséhez DNS szolgáljon vázként, eredetileg egyszálas DNS-oligomerekből és sztreptavidinből szintetizált kovalens konjugátumokkal valósították meg. Ezek is jól modellezik makromolekuláris komponensek DNS-közvetítésű szerveződését, emellett sokoldalúan alkalmazhatók mint „molekuláris adapterek” nanoméretű szupramolekuláris szerkezetek felépítésére. A fehérjéhez kovalensen kötött oligonukleotid-egység a sztreptavidin négy molekula biotinra kiterjedő természetes megkötőképességét kibővíti komplementer nukleinsavak speciláis felismerésével. E kettős specifikusság által a DNS/sztreptavidin konjugátumok adapterként alkalmazhatók csaknem tetszés szerinti biotinos komponensek nukleinsav-szakaszokon való elrendezésére. Ezen az elven egyetlen aminohelyettesítést tartalmazó 1,4 nm-es komplex aranyszemcsékhez biotincsoportot kapcsoltak (7. ábra), amelynek segítségével magasabb rendű pszeudotetraéderes szerkezetbe rendezték őket. A konjugátumok ezután komplementer egyszálas szakaszokon való nukleinsavhibridizálás útján újszerű nanostruktúrákká szervezhetők.
kationos cianinszínezék porfirin kationos helyettesítésekkel
pirrolidinszármazékkal kapcsolt fullerén
speciális polimer kation
7. ábra Mintákkal (templát) végzett szupramolekuláris szintézisek alapegységei
A DNS/sztereptavidin konjugátumokból, mintegy „molekuláris-építőszekrény”-elven, készíthetők olyan funkcionális aggregátumok, amelyek szervetlen és biológiai komponenst egyesítenek. Pl. a sztereptavidin-konjugátumot hordozó aranykolloidhoz „biotinilált” antitestet kapcsolva – a két kapcsolást egyegy előzetes lépésben végrehajtva – az így előállt szuperszerkezetet, a benne lévő antitest révén olyan szövetekhez, felületekhez lehet szelektíven hozzákötni, amelyeket az immunglobulin-molekula felismer. Biomolekulákból felépült rendszerek A biológiai makromolekulák és a belőlük felépült szupramolekuláris képződmények, elektrosztatikai és topográfiai tulajdonságaik révén szerves és szervetlen komponensek egységévé szintetizálhatók és szervezhetők. Ilyen architektúrák felépítésére felhasználtak már – bakteriális sejtfelületi fehérjékből álló, szabályos kétdimenziós rácsokat, – nano- vagy mikronméretű egységekből épült nukleinsav-szerkezeteket, sőt – biomolekuláris üregeket, pl. vírusburkokat is. A baktériumsejt kristályos felületi rétegei, az ún. S-rétegek számos polipeptid-másolatból spontán állnak össze különböző geometriájú, nagymértékben rendezett, nanoporózus szuperszerkezetté. Izolált, természetes vagy genetikailag és/vagy kémiailag módosított S-rétegek biotechnikai alkalmazása a diagnosztikától az oltóanyag-kutatáson át a molekuláris nanotechnológiáig terjed. Példák nanorészecskék szervezésére S-rétegek segítségével: – CdS-szuperstruktúrákat szintetizáltak elektronmikroszkóp tárgylemezén immobilizált Bacillus stearothermophilus átkristályosított Srétegével. A réteget először CdCl2-oldattal, majd H2S-sel kezelték, az ekkor kivált monodiszperz, 5 nm-es CdS-kristályok a fehérjemátrix nanopórusaiban szabályosan rendeződtek. – Bacillus sphaericus S-rétegének felhasználásával 4–5 nm-es aranyszemcsékből 13 nm beosztású tetragonális „szuperrács” készült. Az S-réteg fehérjéit előzőleg tiolcsoportokkal módosították, majd tetraklóraranysav-oldattal vékony aranyréteget képeztek a rácson, amelyből elektronbesugárzás hatására 5 nm-es aranyszemcsék alakultak ki. – Sporosarcina ureae S-rétegének vizes szuszpenzióját először K2PtCl4-, majd redukáló NaN3-oldattal kezelték. A kivált fémes platina a fehérjekristályoknak megfelelő rácsot alkotott. – Egy aranykolloiddal végzett nagy távlati értékű kísérletben egy hatszögesen rendezett bakteriális közbenső rétegen (hexagonally packed imermediale, HPI) egy 5 és 10 nm-es szemcsék 1:1 arányú keverékéből túlnyomórészt a kisebb frakció, egy 10 nm-es átlagméretű szemcsekeverékből a 8,0±1,3 nm-esek, 20 nm-es és 5 nm-es pozitív töltésű
kolloidszemcsék pedig egyáltalán nem kötődtek meg. E kísérletek alapján a fehérjerácshoz hasonló biológiai rendszerek formája és elektrosztatikai tulajdonságai felhasználhatók szervetlen nanorészecskék mikrométeres osztású szuperszerkezetek térbeli eloszlásának ellenőrzésére. Ennek a kísérletnek az ad különös jelentőséget, hogy az Sréteg topográfiai és kémiai tulajdonságait csupán egyetlen gén megváltoztatásával, a mindenkori alkalmazáshoz lehet szabni. Önszerveződés DNS-mintára Szerves és szervetlen molekulákból álló szupramolekuláris aggregátumok szintézisére DNS-molekulák elektrosztatikai és topográfiai tulajdonságai is felhasználhatók: – Egy korai példában kationos oldalcsoportokkal rendelkező porfirinszármazékok DNS jelenlétében kiterjedt másodlagos szerkezetet képeznek (7. ábra); követve az adott „helicitást” (helix: csiga, csavarmenet). – Egy kationos cianinszinezék dimerizálódva gyorsan követi a DNSmolekula csavarmenetét és nagy szupramolekuláris aggregátum jön létre, amelyek térbeli méreteit a DNS-szerkezet határozza meg. – Dimetil-pirrolidinium-jodiddal helyettesített fullerén (elemi szén gyűrűiből álló molekula) is makromolekulává rendeződött a DNS-bázisok foszforsavészterein mint gerincen. Az így képződött hibrid komplexumban a cirkuláris DNS-plazmid átmérője az eredetinek kb. az ötödére zsugorodott. Ez a sűrűsödés és rövidülés valószínűleg a DNS-hez kötött fullerénegységek közötti hidrofób kölcsönhatásoknak tulajdonítható. – Hasonló kondenzáló hatást váltanak ki DNS-re poliamidok, így spermin és spermidin is. A spermidinből képzett, levegőn polimerizálódó kation hatására a jelenlevő plazmid DNS 50±15 nm átmérőjű részecskékre esik össze. Ilyen nanoszkópos monomolekuláris DNS-részecskéket génátviteli reagensként lehetne használni. – DNS-sel fém- és félvezető nanorészecskéket is előállítottak, felhasználva a DNS-kettősspirál foszfátgerincének negatív töltését Cd2+-ionok feldúsítására, amelyeket ezután Na2S-sel CdS nanoszemcsékké alakítottak át. Az átlagosan 5 nm átmérőjű szemcsékről elektromikroszkópos vizsgálatok kiderítették, hogy méretüket befolyásolja a DNSmolekula bázisszekvenciája, különösen az adenin. Biológiai nanoreaktorok A fémek szállítására vagy tárolására alkalmas természetes fehérjék közül a legtöbbet vizsgált képlet a ferritin, amely fehérjeburokkal körülvett, hidratált vas(III)-oxid magból áll.
Az összetételében a ferrihidrit érchez hasonlító, kb. 8 nm átmérőjű mag a porózus fehérjeburkon át kioldható, az így létrejött üres héjat, az apoferritint pedig ugyanezen az úton ismét „ki lehet tölteni” szervetlen anyaggal. Ilyen remineralizációs kísérletek kapcsán bebizonyosodott az apoferritin katalitikus hatása a vas(II) oxidálására, és a ferrihidrit nukleációjára (mag képződésére). E megfigyelések alapján indultak kísérletek az 1990-es évek elején a ferritin kipróbálására nanoméretű bioreaktorként különféle fémrészecskék előállításához, amelyeknek monodiszperzitását szavatolja a fehérjeburok. Sikerrel járt fehérje/fémoxid rendszerek rekonstruálása mangán-oxiddal, uranilés magnetit/maghemit-eleggyel oxihidroxiddal, magnetittel (Fe3O4) (Fe3O4/γFe2O3). Ilyen mágneses tulajdonságú, egységesen 6-8 nm-es szemcsékből álló fehérjék alkalmasak lehetnének orvosbiológiai képalkotó eljárásokban sejtek jelzésére vagy elválasztásra. A biomineralizálásra használható biológiai szerkezetek egy másik osztályát a vírusok képezik, amelyek néhány száz – néhány ezer azonos, üreges formába rendeződött fehérjéből, és az üregben helyet foglaló nukleinsavból állnak. A legismertebb, egyben kémiailag és fizikailag legstabilabb rendszert a dohánymozaik-vírus alkotja; ebben a nukleinsav magot 2130 fehérjemolekula spirálja veszi körül olyan módon, hogy egy 300×18 nm méretű cső és egy 4 nm átmérőjű belső csatorna keletkezik. A szupramolekuláris fehérjeszerkezet külső és belső felületén töltést hordozó aminosavgyökök (glutaminsav, arginin, lizin stb.) ismétlődő mintát képeznek, nukleációs pontokat nyújtva felszíni szabályozású biomineralizáláshoz. Ennek alapján állítottak elő különféle szervetlen/szerves nanocső-kompozitokat dohánymozaik-vírus felhasználásával: – tetraetoxi-szilán szól/gél kondenzálódása útján elektronelnyelő SiO2rudakat nyertek, vagyis 3 nm-es SiO2-réteggel egyenletesn bevont víruselemeket, – a vírus, valamint CdCl2 és Pb(NO3)2 együttes kénhidrogénes kicsapásakor a CdS 5 nm-es, ill. a PbS 30 nm-es szemcséi a mozaikvírus külső felületén egyenetlen eloszlásban válnak le és adszorbeálódnak, – a dohánymozaik-vírussal sikeres volt a vasoxid-mineralizálás is olyan módon, hogy a vírusrészecskék vas(II)- és vas(III)-tartalmú savas diszperziójához nátronlúgot adtak, aminek eredményeképpen gyengén kristályos ferrihidrit rakódott le ugyancsak a vírus külső felületén. Szerves–szervetlen zárvány jellegű hibridek gömb alakú vírusfehérjeüregek segítségével is készíthetők. A marhaborsó fehér levélfoltosodását okozó vírus- (cowpea-chlorotic-mottle-virus, CCMV) fehérjéből in-vitro önszerveződéssel képződött 28 nm-es részecskék 18 nm-es üregében kilenc bázisos aminosav- (arginin- vagy lizin-) gyök nyúlik be. Ez a szerkezet kiválóan alkalmas szervetlen kristályosodási folyamatban a gócképződés elindítására és a gyors kristálynövekedés fenntartására. Ezt egy speciális dinamizmus te
szi lehetővé: 6,5-nél nagyobb pH-nál a CCMV-részecskék az eredetinek mintegy 10%-ával nagyobb térfogatra duzzadnak, így szabadon cserélődnek molekuláris komponensek az üreg és a külső közeg közt. Ez a csere pH >6,5-nél megszűnik, vagyis a pH szabályozásával rögzíteni lehet a burokban kialakult egyenlő nagyságú kristályokat. A felsorolt példák arról tanúskodnak, hogy zárt biomolekuláris térrészekben kialakíthatók különféle nanoproduktumok és szupramolekuláris zárványok. A fejlesztés most a natív fehérjékből igények szerint megtervezett tulajdonságú és géntechnikai eszközökkel rekombinált változatokra irányul. Alkalmazások – fizikai vizsgálati módszerek A szokásos értelemben vett és a piac bizonyos szeletének birtoklását is magába foglaló „alkalmazás” az ismertetett bioanorganikus hibridekre ma még nem érvényes. A biotechnika és az anyagtudományok egyesítése viszont új anyagok és egybeépített elemek létrehozásának hatalmas lehetőségeit tárja fel, miközben az alapvető élettani ismeretek, az anyagtudományok modern kimutatási módszereivel bővülnek, amelyekkel tisztázható sok megválaszolatlan biológiai kérdés. Így jelenleg ennek az interdiszciplináris területnek bioanalitikai alkalmazásai vannak előtérben. Az elmúlt évtizedben biomolekuláris rendszerek kutatására igen elterjedt rácserőmikroszkópia (Rasterkraftmikroskopie, SFM) nagy feloldással képez le biológiai felületeket, ezáltal pl. feltárja nukleinsavak konformációját és fehérjemolekulák gyűrődését, csavarodását. A felületi plazmonrezonancia-spektroszkópia (surface plasmon resonance spectroscopy, SPRS) szintén gyorsan fejlődő eljárás biomolekuláris szerkezetek és dinamikájuk megfigyelésére. Mivel érzékenyen és valós időben tudja mérni a kétdimenziósan rendezett, immobilizált kapcsolódó partnerek és az oldott anyagok közötti kölcsönhatásokat, különösen bevált biomolekuláris reakciók, pl. heterogén antitest/antigén kölcsönhatások vagy szilárd fázison való DNS-hibridizálódások jellemzésére és folyamatos megfigyelésére (monitoringjára). Biomolekulák és fémfelületek között végbemenő fázisközi folyamatok intenzív megfigyelése ösztönözte egyes spektroszkópiai módszerek továbbfejlesztését is. Ennek kiemelkedő példája a felületi fokozott Raman-szórás (surface enhanced Raman scattering, SERS), amely azon alapszik, hogy durva arany- vagy ezüstfelületre adszorbeált molekulák rezgésspektrumának intenzitása akár 100 000-szeresre felerősödhet. Mivel ez a jelenség a módszer lényege szerint csak a közvetlenül a szubsztrátumon levő, ún. monorétegen alakul ki, tanulmányozható vele a fémes fémfázis és a rá adszorbeálódott biomolekulák speciális egymásra hatása. Kiváló SERS-tulajdonságainál és kellő biokompatibilitásuknál fogva alkalmaznak szubsztrátumként citráttal stabilizált ezüstkolloidot adszorbeált fe
hérjék vizsgálatára, amely több enzimről kimutatta, hogy adszorbeálódva is megtartja aktivitását. Az ezüstkolloidokban azonban rendszerint széles a részecskék méreteloszlása, ami nehezen reprodukálhatóvá teszi optikai tulajdonságaikat és adszorbeálóképességüket is. A nehézség nélkül előállítható monodiszperz aranykolloidokban viszont sokkal kisebb a SERS-erősítés mértéke. A problémát egy összetett rendszerrel oldották meg, amelyben citrátréteggel stabiliált aranyrészecskéket a réteghez jól kötődő citokróm c redoxienzimmel vontak be, és az így nyert konjugátum segítségével adszorbeáltatták a vizsgálandó enzimfehérjét az ezüstkolloidra. Az Ag/Cc/Au-”szendviccsel” végzett SERS-mérések is azt igazolták, hogy a fehérje megtartotta natív másodlagos szerkezetét. A módszernek az az előnye, hogy a hármas aggregátumot a hordozó aranyrészecskék pontosan meghatározott koncentrációjából kiindulva lehet elkészíteni, a SERS-mérések pedig elvégezhetők más töménységű ezüstkolloidon, amely kevésbé definiált is lehet. A rezgésintenzitás hullámhosszfüggő növekedéséből a részecskék közötti erős elektromágneses kötődésre lehet következtetni, aminek alapján a SERS-technikából kifejleszthetők elemzési módszerek pl. kapilláris elektroforézis szerkezettől függő kiegészítéseként, vagy DNS mennyiségi bioanalíziséhez. Nanorészecskék mint biológiai jelzők „Biomarkerként” a szövettan rutinszerűen használ antitest-molekulákkal bevont, 10–40 nm szemcseméretű aranykolloidot kiválasztott szövetrészek elektronmikroszkópos jelölésére. Kisebb, 0,8–1,4 nm-es aranykonjugátumokat biológiai makromolekulák helyi kimutatásához fejlesztettek ki. Ezek kovalens módon kapcsolódva hagyományos elektronmikroszkóp alatt megengednek kb. 7 nm-es térbeli feloldást. A kimutathatóság erőteljesen növelhető a részecskék felületén lezajló ezüstelőhívással. Ilyen módon a szövetek láthatóvá tehetők elektron- vagy fénymikroszkópos hisztológiai vizsgálatokban vagy pikogramm mennyiségű antigének immunfoltban. Az ezüstelőhívással való jelerősítés felhasználható biomolekuláris kötések elektromos kimutatására is, mikroelektródok rövidre zárásával. Ehhez mikroelektródok rendszerének hézagaiban arany nanorészecskéket immobilizálnak, speciális biológiai kölcsönhatások, pl. antitesten alapuló immunoszorpció útján. A kolloidszemcsék katalizálják vezető ezüstréteg reduktív leválását, amely előidézi az elektródok rövidre zárását (8. ábra). Ezáltal hirtelen leesik az ohmos ellenállás, és ez az említett biospecifikus kötés mérőjele. Ezen az alapon készítettek érzékelőket, peroxidáz adszorpciójával hidrogén-peroxid elektrokatalitikus kimutatására.
biomolekula/ aranyrészecske konjugátum vizsgálandó anyag
elektród
biológiai felismerőcsoport szubsztrátum
immobilizálás
ezüstelőhívás
vezető ezüstréteg
8. ábra Biológiai felismerőfolyamatok elektromos detektálása
Nukleinsavval bevont részecskék A már régebben ismert fehérjebevonatú aranykolloidokkal szemben DNS-sel funkcionalizált aranyrészecskékről 1996-ból származik az első beszámoló. A nanorészecskék DNS-sel közvetített tömörülésén (5. ábra) alapulnak olyan egyszerű és viszonylag olcsó érzékelők, amelyekkel kimutathatók pl. kórokozók nukleinsavai. Érdeklődésre tarthat számot DNS-sel funkcionalizált nanorészecskék alkalmazása csiphez kötött oligonukleotiddal folytatott heterogén nukleinsav-hibridizáló kísérletekben. DNS-sel immobilizált aranyszemcsékből sikerült szupramolekuláris rendszert felépíteni, továbbá felületen megkötött nukleinsavakon topográfiai jelölést alkalmazni analitikai
célokra. Így lehet igen érzékenyen, mikrorendszerben (microarray) „letapogatni” különböző nukleinsavakat. Ez utóbbi eljárás aranyrészecskék jelenlétében ezüstionok redukálásán nyugszik, és a hagyományos fluoreszcenciás DNSpróbához képest a kimutatási határ 100-szoros csökkentését teszi lehetővé. Kolloid aranyrészecskékkel a nukleinsav-vizsgálat mérőjele egyaránt felerősíthető – a kvarckristály-mérlegen, – a szögfüggő fényszóráson és – a felületi plazmonrezonancián alapuló módszereknél. Gyógyászati alkalmazások Aranyrészecskék régóta alkalmazásban vannak kétszálas DNS átvitelére az un. génpuska-(„gene-gun”) technika részeként. Eszerint több ezer bázispár hosszú távú plazmid DNS-t vagy RNS-t arany- vagy volfrámkolloidra adszorbeáltatnak, amelynek szemcsenagysága 500 nm-től néhány µm-ig terjed. A bevont szemcséket egy pisztolyszerű szerkezetből héliumtúlnyomással lövik ki a kívánt szövetbe. A genetikai módosításhoz tehát nem kell belőle sejtet izolálni, a részecskék behatolnak a szöveti sejtbe, bediffundálnak a sejtmagba, ahol beépülhetnek a szervezet kromoszómáiba. A génpuska eljárás az 1980-as évek közepén történt kifejlesztése óta, mint ismeretes, a génátvitel óriási alkalmazási területeit hódította meg. Köztük van az ún. DNS-immunizálás (DNS-vakcinálás vagy genetikai immunizálás), amely stimulálja az immunrendszert, állatkísérletben védelmet nyújtva számos kórokozó, tumor és autoimmun betegség ellen. Ehhez részecskebelövéssel pl. egy polipeptid-antigént kódoló plazmid-DNS-t juttatnak a gazdasejtbe, ahonnan az kiváltja a celluláris vagy humorális immunreakcióját. Jelenleg paramágneses nanorészecskéket vizsgálnak rákbetegek kezelhetősége szempontjából, ugyanis kiderült, hogy ráksejtek endocitózis útján fel tudnak venni dextránnal vagy szilánnal bevont, biokompatibilis szuperparamágneses nanorészecskéket. Ezután a mágneses sejtfolyadék gerjeszthető sejten kívüli váltakozó mágneses térrel, ami helyi hőmérséklet-emelkedést idéz elő. Kísérletben mellráksejtek ilyen mágneses folyadék okozta hipertermiával in vitro és in vivo befolyásolhatónak bizonyultak. Nanorészecskék mint modellrendszerek A nanoméretű fém- és félvezető részecskéket két lényeges tulajdonságuk szinte felkínálja alapvető biológiai jelenségek tanulmányozására: – nagyságuk – 2–200 nm – megegyezik az élő szervezetek: fehérjék, nukleinsavszakaszok és az azokból képződött szupramolekuláris agg
regátumok, így a nukleoszómák vagy átírásos és replikációs komplexumaik, továbbá a riboszómák jellegzetes méreteivel, – szervetlen nanorészecskék az építőkövei a biomineralizációnak, annak az alapfolyamatnak, amellyel a természet genetikai információból, kémiai módszerekkel jól definiált morfológiákat hoz létre. Mindezek alapján szervetlen nanoszemcsék mint modellek szolgálják – a nem specifikus fehérje/nukleinsav kölcsönhatások és – a biomineralizálás elveit és mechanizmusait felderítendő kutatást. Antitestek vagy oligonukleotidok jelzésén kívül fehérjeméretüknél fogva fém és félvezető nanorészecskékkel magukkal is „megszondázhatók” bizonyos biológiai folyamatok. Különösen jelentős fehérjemag befogása a DNS meggörbült kettősspiráljába, ill. annak egy 1–50 nm hosszú, kb. 150 bázispárból álló szakaszába (9. ábra). Az így kialakult hiszton magját nyolc bázikus fehérje alkotja. A hosszú időn át passzív szerkezeti egységeknek tekintett hisztonokról mára kiderült, hogy aktívan befolyásolják az átírás tényezőit, amennyiben „versenyben vannak” a DNS-kötésekért.
DNS
hisztonmag 11 nm
hiszton H1
9. ábra A nukleoszóma modellje
Biomineralizáció A csontokat, fogakat, kagylóhéjakat alkotó „biológiai ásványok” nmméretű mineralizált kristályokból épülnek fel, amelyek az élő szervezetek sejt
jeiben vagy azokon kívül válnak ki és szerveződnek makroszkópos szerkezetekké. Az elmúlt 25 év kutatásai többirányú betekintést engedtek ugyan a biomineralizálás folyamatába, mégis sok feltáratlan részlet maradt, különösen ami a gerinceseket illeti. Jól ismert pl. a fogbél mineralizálása egy széntartalmú hidroxiapatittal, de még bizonytalan a fogban és a csontokban először képződő kristályok kémiája, nem eléggé tisztázottak e képződést elindító tényezők és a kristályokhoz kötődő makromolekulák funkciója. Annyi eredmény és következtetés azonban már összegyűlt, amennyi megengedi egyes, a természetes mineralizálási folyamat zavarán alapuló betegségek gyógykezelését. A szervetlen struktúrákat specifikusan felismerő makromolekulák egy másik csoportját a „biológiai fagyállók”, vagyis fagyásgátló – fehérjék és – glükoproteinek alkotják, amelyek képesek meggátolni jégkristályok növekedését és megtalálhatók minden olyan élettérben honos élőlény – sarki halak, kétéltűek, rovarok, növények – szervezetében, ahol rendszeres a fagypont alatti hőmérséklet. A jegesedést gátló mechanizmus elvben ismert: a fagyállók a jégre adszorbeálódva akadályozzák növekedését. A lineáris spirált képező molekulaláncon szabályos sorrendben elhelyezkedő poláros aminosavgyökök komplementer módon illeszkednek a jégkristályrács egyik síkjához. További kutatások olyan új fagyásgátló fehérjék „megtervezésére irányulnak, amelyek élelmiszerek adalékaként megelőznék” az állagukat és külsejüket is rontó, mélyhűtés okozta elváltozásaikat. A biomineralizálásnak nagy jelentősége van a mikroorganizmusok világában is. Az ún. magnetotaktikus baktériumok mozgását a sejtjeikben termelődő magnetoszómák irányítják a földmágnesség erővonalai alapján. A magnetoszómák baktériumfajonként 35 és 120 nm között változó átmérőjű monodiszperz vasérc-, többnyire magnetit- (Fe3O4-)kristályok, amelyeket hártyás burok véd a tömörüléstől. A burok fehérjéi közül tizet már azonosítottak, ami egy ígéretes alkalmazási lehetőségért folytatott kutatásnak köszönhető, ti. a bakteriális vasdúsítás, főként a magnetoszóma egységes felépítésénél és szerkezeténél fogva előnyösebb lehet mágnesrészecsék mesterséges szintézisénél. Emellett a magnetoszómákat, lipideket is tartalmazó kétrétegű membránjuk alkalmassá teszi nukleinsavakkal, enzimekkel vagy antitestekkel való kapcsolásra, azaz biológiai komponensekkel való mágneses műveletekre. Pl. tisztítva és receptorfunkcióval ellátva, már sikerrel alkalmazták őket kontrasztanyagként tumor kimutatására a mágneses rezonancián alapuló tomográfia módszerével. A bakteriáils nanorészecskék kutatása közvetlen biotechnikai alkalmazásai mellett hozzájárulhat a hasonló szintetikus termékek anyagszerkezeti feltárásához. Azt a hosszú időn át érvényes felfogást, hogy nanokristályok tömö
rülése mindig tökéletlen szerkezetet eredményez, cáfolni látszanak azok az új kísérletek, amelyek szerint egyes természetes biomineráliák egy irányított felrakódásnak nevezhető folyamatban képződnek. Ehhez valószínűleg szükség van olyan termodinamikai erőforrásra, amely a közbenső fázis eltávolításával csökkenti a határfelületi energiát. Mindenképpen meglepő azonban, hogy a tömörüléshez szükséges összeolvadáskor a részek magas fokú renddé állnak össze, elkerülve a rendezetlenség végtelen számú lehetőségét. A biológiai mineralizációnak ezt a szabályos menetét a kutatás most megpróbálja a modern molekuláris biológiában és biotechnikában hasznosítani. Elsősorban szerves és szervetlen felületek fehérjékkel közvetített felismerését tanulmányozzák. Megfigyelték, hogy különböző kristályos anyagokkal immunizált állatokból nyert antitestek nagy specifikussággal megkülönböztetnek még kémiai és molekulaszerkezeti szempontból azonos kristályokat is, tehát feltételezhető, hogy kapcsolódási rendszerükben fellelhető a kristályfelszínek lenyomata. Ilyen antitestek felhasználhatók gócképző mintaként in vitro kristályosodás gyorsítására. E megállapítás általános érvényét több antitesttel igazolták. Eszerint az antitestek nem az egyedi molekulaszerkezetet ismerik fel, hanem a molekulának a kristály felületén ismétlődő egy-egy motívumát. Ezek a kísérletek – az antitest/antigén kölcsönhatások modelljéül szolgálhatnának, pl. biológiai rendszerekben szupramolekuláris szerkezetek antitestekkel történő kimutatásához, ezen kívül – új utakat nyithatnak immunglobulinok kristályfelületi kötéseinek vizsgálatához, és ezzel új (fél)szintetikus biomineralizációs kapcsoló fehérjék előállításához, amihez kellő „megtervezéssel” bő lehetőségeket kínál a géntechnika. A jövő kutatásai, a fentieket folytatva, olyan eljárások kidolgozására irányulhatnak, amelyekkel genetikai információkból kiindulva biológiai növekedéssel nyerhetők mesterséges szervetlen anyagok. Kilátás A biotechnika és az anyagismeret „joint venture”-jének erősödése a kémia mint alaptudomány és a genomika gyors fejlődésének is köszönhető. Az így megszerzett adatok révén egyre jobban használható biológiai komponensekhez lehet jutni – nanoérzékelők, – katalitikus és – fénygyűjtő egységek, – ultragyors molekuláris kapcsolórendszerek, – elektronikai és élő egységek közötti közvetítők, valamint – más bio- és optoelektronikai rendszerek
felépítéséhez. Bár a tudományos/műszaki haladás messze van még a science fiction világának „nanogépeitől”, amelyek élő szervezetekben öntevékenyen gyógyítanak be sebeket vagy végeznek műtéteket, mégis érdemes felidézni azt a viharos fejlődést, amelyben a szerves kémiai totálszintézis keresztülment a 20. század kezdetétől a 90-es évekre jellemző, a „molekuláris hegycsúcsokat” bevevő versenyfutásig. Valószínűleg hasonló növekedési ütem előtt áll a szupramolekuláris kémia is ott, ahol a biotechnika az anyagtudományokkal egymást megtermékenyítve találkozik. (Dr. Boros Tiborné) Niemeyer, Ch. M.: Nanopartikel, Proteine und Nuckleinsäuren: Die Biotechnologie begegnet den Materialwissenschaften. = Angewandte Chemie, 113. k. 22. sz. 2001. nov. 19. p. 4254– 4287. Fazal, M. A.; Bidhan, C. R. stb.: Übergangsmetallkomplexe, die mehrere Kupferionen enthalten, binden spezifisch an komplementäre Muster aus Histidinresten auf der Oberfläche von Proteinen. = Journal of American Chemical Society, 123. k. 10. sz. 2001. p. 6283–6290.
