DIPLOMAMUNKA
A 16-3 bakteriofág host-range mutációi
Maász Anita biológus hallgató
témavezető: Dr. Putnoky Péter
Pécsi Tudományegyetem Természettudományi Kar Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
2004.
MA_DIP04.doc
TARTALOM
RÖVIDÍTÉSEK 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. A 16-3 bakteriofág 1.1.1. A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe 1.1.2. A 16-3 bakteriofág ismert génjei 1.1.3. A fágfertőzés folyamata 1.1.4. A h gén lokalizálása 1.2. A rhizobiumok 1.2.1. A szimbiózis kialakulása 1.2.2. Sejtfelszíni poliszacharidok 1.2.3. A szimbiózisban szerepet játszó fontosabb gének
3 4 4 4 6 7 9 10 10 11 12
2. KÍSÉRLETI ELŐZMÉNYEK 3. CÉLKITŰZÉSEK
14 16
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok 4.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása 4.3. Cseppteszt 4.4. Fágkötési teszt 4.5. Bakteriofág DNS izolálás 4.6. Plazmid DNS preparálás 4.7. DNS tisztítás a minták nukleotidsorrendjének meghatározásához 4.8. Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása 4.9. Fragmentizolálás 4.10. Ligálási reakció 4.11. Kompetens sejtek készítése 4.12. Transzformáció 4.13. PCR 4.14. DNS szekvencia meghatározás 4.15. Számítógépes szekvencia analízis
17 17 18 18 19 19 20 20 21 21 21 22 22 23 24 24
5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5.1. Egy host-range mutáció jellemzése 5.2. Újabb host-range fágmutánsok azonosítása 5.3. A fág baktériumfelszín felismerésében más fágfehérje is szerepet játszhat 5.4. A h mutáns fágok baktériumhoz történő kötődésének vizsgálata
25 25 28 30 30
6. ÖSSZEFOGLALÁS 7. FÜGGELÉK 8. FELHASZNÁLT IRODALOM KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
34 35 36
MA_DIP04.doc
2
RÖVIDÍTÉSEK
MA_DIP04.doc
Amp
ampicillin
ATP
adenozin-5’-trifoszfát
bp
bázispár
DMSO
dimetil-szulfoxid
DNS
dezoxi-ribonukleinsav
EDTA
etilén-diamin-tetraacetát
EPS
exopoliszacharid
IPTG
izopropil-β-D-galaktopiranozid
kb
kilobázis
Km
kanamicin
KPS
kapszuláris poliszacharid
LPS
lipopoliszacharid
Neo
neomicin
ORF
open reading frame (nyitott leolvasási keret)
PCR
polimeráz láncreakció
SDS
nátrium-dodecil-szulfát
Tris
tris-(hidroxi-metil)-amino-metán
X-gal
5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-tiogalaktopiranozid
3
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. A 16-3 bakteriofág A bakteriofágok a baktériumgenetika fontos eszközei, elég, ha csak az Escherichia coli - lambda fág rendszerre utalunk, amely kiemelkedő jelentőségűvé vált. A rhizobium genetikában, melynek fő célja a szimbiotikus baktériumgének megismerése, ennek mintájára szintén fontosnak tűnt egy megfelelő fág - baktérium rendszer megismerése. A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert. Ezek közül többel végeztek sikeresen általános vagy speciális transzdukciót. A legtöbb eredmény a Sinorhizobium meliloti törzsek fágjaival született. Ezek közül is kiemelkedik a Magyarországon használt S. meliloti 41 törzsön szaporodó 16-3 fág, amely az egyetlen részletesen tanulmányozott rhizobium fág. A 16-3 fágot a talajból izolálták Balatonberény környékén (Szende et al., 1960). A virion kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú molekula (Dallman et al., 1979), amely 10 bázis hosszú, 3’ túlnyúló ragadós végekkel rendelkezik. Alakjában és több molekuláris sajátságában is emlékeztet a lambda fágra és ahhoz hasonlóan egy speciális transzdukáló fág. Ismert a részletes genetikai-fizikai térképe (1. ábra), a represszor fehérje szerkezete, a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régió pontos szekvenciája,
tanulmányozták
a
fág
integrációjának
mechanizmusát.
Ennek
eredményeként egy speciális vektorcsaládot is kifejlesztettek, amely a fág int génjét és att régióját hordozza. Ennek felhasználásával a legkülönbözőbb gének építhetők be a S. meliloti 41 kromoszóma att helyére (Papp et al., 1993).
1.1.1. A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe A 16-3 fág alapvető genetikai analízisét és térképezését különböző mutánsok segítségével végezték el. Az izolált, mintegy 150 ts (hőérzékeny) mutáns a fágszaporodás szempontjából korai és kései típusokra bontható. A korai és kései funkciók elkülönülését jól tükrözi a 16-3 fág genetikai térképe, szoros korreláció van a gének elhelyezkedése és működésének ideje között (1. ábra) (Orosz et al., 1973). A géntérkép régiói a következők: h gén - ant gén - lizozim gén - immX régió - att régió - int gén - xis gén - avirC operátor - C cisztron - avirT operátor (Orosz et al., 1973). A géntérkép hossza a C cisztrontól a lizozim génig 40 térképegység hosszúságú.
MA_DIP04.doc
4
Elkészítették a 16-3 fág kromoszómájának fizikai térképét 10 féle restrikciós endonukleáz segítségével. Ez száz térképezett hasítóhelyet tartalmaz (7. fejezet). Lényegesen kevesebb a 16-3 fágról szerzett ismeretanyag, mint az, ami az E. coli lambda vagy T4 fágjáról felhalmozódott. Ennek ellenére a 16-3 fág ma már a viszonylag jól ismert bakteriofágok szűk köréhez tartozik (Orosz et al., 1973; Dallmann et al., 1979; Dorgai et al., 1981).
1. ábra: A 16-3 bakteriofág genetikai és fizikai térképe. Az ábra felső részén a 16-3 fág publikált fizikai térképe látható két restrikciós endonukleázzal hasítva (Dorgai et al., 1983). A számok az 1. táblán (7. fejezet) található hasítóhelyek pozíciójára utalnak. A színes téglalapok a géneket, illetve a fontos régiókat jelölik. Az ábra alsó részén az egyes régiók felépítését tüntettük fel. PR, PC: a C cisztron promotereit, az OR az operátor régiókat jelöli. (Csiszovszki et al., 2003; Semsey et al., 1999; Dallmann et al., 1991)
MA_DIP04.doc
5
1.1.2. A 16-3 bakteriofág ismert génjei A 16-3 fágnak két fő regulátor génje van: a c cisztron és az immX régió (Orosz et al., 1973). A c regulátorgén a 16-3 egyik legjobban ismert génje, amely a lizogén életciklus kialakításában játszik szerepet, a fág baktériumba integrálódását és kivágódását szabályozza. A gén kódoló régiója az (55)HindIII-(60)HindIII fragmenten található (1. ábra). Két operátor régióval rendelkezik: avirC és avirT. Az avirC a géntől 5’ irányban található, míg az avirT -t 3’ irányban a korai génekhez közel lokalizálták. A c gén terméke egy represszor fehérje, amely transzkripciógátló hatást fejt ki. A DNS szekvencia adatok alapján a C represszor egy 197 aminosav hosszúságú bázikus fehérje. Amino-terminális doménje egy „helix-turn-helix” DNS kötő motívumot hordoz, amely az operátor régióhoz való kötődésért felelős (Dallmann et al., 1991). A másik regulátor régió, az immX a (41)EcoRI hasítóhely környékén lévő körülbelül 1500 bázispáros régióban foglal helyet (EcoRI L, H fragment) (1. ábra). A vizsgálatok alapján ez a regulátor nagymértékű hasonlóságot mutat a lambda fág cI represszorával. Az immX régió 3 részből áll: XU, XL és XV. Az XU és XL két átfedő cisztron, amelyek a pXU, pXL fehérjéket kódolják. E fehérjék szabályozó tevékenységének célpontja az XV régió, amely szintén három részből áll: XV1, XV2, XV3. Az XV1 egy rho független transzkripció terminációs struktúra. Az XV2 az XV1 és XV3 expresszivitását növeli (Dorgai et al., 1986; Csiszovszki et al., 2003). A 16-3 egy tipikus temperált fág, amelyik helyspecifikus rekombináció révén képes integrálódni a gazdakromoszóma egy meghatározott helyére. A baktérium és a fág részéről is az att régiók (fág: attP, baktérium: attB) vesznek részt a folyamatban. A fág genomjában az attP szekvencia a (48)EcoRI - (52)EcoRI hasítóhelyek között (K fragment) található (1. ábra). Az att régión belül egy 51 bázispár hosszúságú szakaszt, egy „core” (magi) régiót különíthetük el, amely a fágban és a baktériumban is azonos. E részen belül történik meg a szálkicserélődés. A baktérium kromoszómáján található attB hely két fordított orientációjú integráz kötőhelyet tartalmaz (Dorgai et al., 1993; Papp et al., 1993). A helyspecifikus rekombináció működését két rekombináns gén teszi lehetővé: az int és a xis gén (1. ábra). Az int gén az integrációért felelős fehérjét (Int) kódolja, a xis gén pedig a baktérium kromoszómájából történő kivágódásért felelős. Mindkét gént az att régiótól 3’ irányban a (48)EcoRI - (55)HindIII hasítóhelyek között lokalizálták. A két gén körülbelül 240 bázispár hosszú része átfed egymással. Mindkét gént a C represszor
MA_DIP04.doc
6
fehérje szabályozza. Az int gén által kódolt fehérje hordozza mindazon jegyeket, amelyek a helyspecifikus rekombinázok integráz családjának tagjaira jellemzőek. Így az Int fehérje is ebbe a csoportba sorolható. A homológia vizsgálatok alapján elmondható, hogy a fehérje C-terminális részéhez közel a 346-os pozícióban található tirozin oldallánc vesz részt a DNS szálak hasításában. Ezen oldallánc hidroxil csoportjának eltávolítása a fehérje rekombináz aktivitásának elvesztéséhez vezet (Semsey et al., 1999). A xis gén által kódolt fehérje (Xis) 140 aminosavból áll. Számítógépes analízis szerint az N-terminálisán valószínűleg egy “helix-turn-helix” motívum található. Mérete hasonló az eddig ismert néhány hasonló fehérje méretéhez, de azokhoz számottevő szekvencia homológiát nem mutat. A 16-3 fág h génje a (28) EcoRI - (37) EcoRI (D) fragmenten található. A fág farki rost fehérjéjét (H) kódolja, amely a fág baktériumhoz tapadásában játszik fontos szerepet. Az ant gén a h gén közelében, attól 3’ irányban helyezkedik el (1. ábra). Az általa termelt fehérje (Ant) a fág poliklonális ellenanyagokkal történő reakciójában vesz részt (Orosz et al., 1970).
1.1.3. A fágfertőzés folyamata A fág a fertőzés során először farki rostjával a baktérium sejtfal speciális kiemelkedésein, az ún. fágreceptorokon tapad meg. Ezt fág adszorpciónak nevezzük, amely hatékony, kalciumiont igénylő folyamat. A fág a tapadási folyamat után lítikus és lizogén módon szaporodhat (2. ábra). Lítikus úton a fágok a baktériumon belül sokszorozódnak, majd a baktériumsejtet „szétroncsolva” kiszabadulnak és újabb baktériumokat fertőznek meg. A lizogén módon szaporodó fágok kromoszómájukat a baktérium genomjába képesek integrálni és ott generációkon keresztül a baktériummal együtt replikálódni. A 16-3 tulajdonságainak és viselkedésének beható tanulmányozása során kiderült, hogy ez a bakteriofág egy temperált (mérsékelt) fág, amely képes profágként a baktérium genomjába integrálódni, illetve lítikus úton is szaporodni. Ezzel szemben léteznek agresszív fágok, amelyek csak lítikus módon képesek önmaguk sokszorozására (Szende et al., 1960). A 16-3 fág integrációja helyspecifikus rekombináció révén valósul meg. A folyamat meghatározott szekvenciájú rövid homológ
MA_DIP04.doc
DNS szakaszok között játszódik le,
7
amelynek során profág keletkezik. Az, hogy a 16-3 fág helyspecifikus rekombinációs rendszere E. coliban nem működik, arra utal, hogy a fág kromoszómába épüléséhez specifikus gazdafaktor is szükséges, amely az E. coliban nem található meg. A 16-3 helyspecifikus rekombinációs rendszer közvetlen felhasználhatóságának tehát két feltétele van, az egyik a specifikus gazdafaktor jelenléte, a másik pedig az, hogy a rekombinációs célszekvencia az adott baktérium kromoszómáján megtalálható legyen (Semsey et al., 1999). A 16-3 fág csak a baktérium egy meghatározott régiójához (attB) tud hozzákapcsolódni. Környezeti indukció hatására bekövetkező kivágódása során e régió környéki kromoszómaszakaszokat képes magával vinni. Így a fág fehérjeburkába a fág DNS helyett bakteriális DNS darabok kerülhetnek. A 16-3 fág tehát egy speciális transzdukáló fág. Léteznek azonban általános transzdukcióra képes fágok, amelyek a baktérium kromoszómájából bizonyos gyakorisággal (10-5) kivágódva bármely baktérium-kromoszómadarabot magukkal ragadhatnak.
2. ábra: A bakteriofágok szaporodási formái ( lizogén, lítikus).
MA_DIP04.doc
8
Egyedi cys+ transzduktáns telepekből fágot indukáltak és megvizsgálták a fág DNS restrikciós képét. Gyakran találtak stabilan transzdukáló, ugyanakkor életképtelen fágokat, amelyeket dtr-nek neveztek el. Az ilyen fág csakis helper fág jelenlétében szaporodott. A dtr fágokban a fág DNS óriási része hiányzott. A hiányzó szakaszt bakteriális DNS helyettesítette. A deléció/inszerció nem érinti a ragadós végeket és a replikációs origót, aminek következtében a dtr kromoszóma jól pakolódik és replikálódik. A kiesett fág funkciókat és az ezeket kódoló fág DNS szakaszokat azonosítva megállapították, hogy a Sinorhizobium meliloti DNS modifikáló aktivitással rendelkezik (Svab et al., 1978 ). Az érett fágrészecske elkészüléséhez (ún. eklipsz periódus) 28 °C-on minimálisan 80 percre, 36 °C-on 65 percre van szükség (Orosz et al., 1973). A fágot a késői gének által kódolt 5 nagy (72 Kd, 18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd, 86 Kd) és 5 kicsi (25 Kd, 27 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd) fehérje építi fel. Eddigi ismereteink alapján a fágfej 6 (18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd), a farokrész pedig 2 polipeptidláncot (72 Kd, 86 Kd) tartalmaz. A két legkisebb fehérje (25, 27 Kd) helyzete még bizonytalan (Erdei et al., 1982).
1.1.4. A h gén lokalizálása Ha a baktérium felszínén megváltozik a fág receptora, de még jelen van, akkor lehet olyan fágmutánsokat izolálni, amelyek egy mutáció révén képesek ismét felismerni ezt a felszínt. A jelenséget host-range mutációnak, az érintett gént pedig h génnek nevezzük. Orosz László laborjában Palágyi Zsuzsanna (pZS plazmidok) határozta meg a h gén körülbelüli helyzetét marker rescue technikával, mely során h mutáns fágból klónozott DNS fragmenteket egy plazmidba. Ha a plazmidot tartalmazó baktériumon vad típusú fágokat szaporítottak el, akkor homológ rekombináció révén a fágokban megjelenhet a h mutáció. A h mutánsok nagy száma jelezte, hogy a kérdéses mutáció a klónozott DNS szakaszon helyezkedik el. Egyre kisebb DNS fragmentumokkal dolgozva, ezen az elven a pZS5 klón,- amely EcoRI hasítással keletkezett, illetve a BamHI enzimmel előállított pZS10 klón (4. ábra) tartalmazta a mutációt. Így a h mutációt az 1,16 kb hosszúságú BamHI szakaszon belül lehetett lokalizálni.
MA_DIP04.doc
9
1.2. A rhizobiumok A 16-3 bateriofág gazdabaktériuma a Sinorhizobium meliloti 41-es törzs, amely a Rhizobiaceae családba tartozó endoszimbionta talajbaktérium. E család tagjai (Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, röviden rhizobiumok) nitrogénkötésre képesek. Általában a Leguminosae (hüvelyesek) növénycsalád tagjaival alakítanak ki szimbiótikus kapcsolatot (Allen et al., 1981). Ez az együttélés mindkét fél számára előnyös, hiszen a baktérium tápanyagokhoz jut a növény által, a növény pedig a szervezete felépítéséhez szükséges nitrogént a baktériumok segítségével veszi fel. Így a növény tulajdonképpen függetleníti fejlődését a talajtól és közvetve a légkör nitrogéntartalmát hasznosítja. Az általunk vizsgált Sinorhizobium meliloti 41 (régi nevén Rhizobium meliloti 41) egy pálcika alakú, endospóra nélküli Gram-negatív baktérium, amely Medicago, Melilotus és Trigonella fajokkal alakít ki endoszimbiózist. Gazdaságilag legfontosabb partnere a lucerna (Medicago sativa).
1.2.1. A szimbiózis kialakulása A rhizobiumok hüvelyes növényekkel kialakított kapcsolatát endoszimbiózisnak nevezzük. A baktériumok e folyamatban egy új növényi szerv, a szimbiótikus gümő (nodulus) belsejében végzik a nitrogénfixációt. Ez a struktúra csak a megfelelő baktérium jelenlétében alakul ki a gazdanövény gyökerén. A rhizobiumok a gümő belsejében a nitrogéngázt ammóniává redukálják, hasznosíthatóvá téve ezáltal a növény számára. A fertőzési folyamat függ a növény fiziológiai állapotától és a fertőzési helyek egymástól való távolságától. A baktériumok a növény gyökérszőrsejtjein keresztül jutnak be azok belsejébe. A baktériumok ezért először e képletekhez kapcsolódnak. Hatásukra a fertőzési ponttal ellentétes oldalon megindul a gyökérszőrsejt növekedése, ami annak görbülését eredményezi. A fertőzési ponton a sejtfal leépül és egy sejtösszetevőkből álló, újonnan kialakuló csőszerű képlet, az infekciós fonal jön létre. Ebben a baktériumok a kéregsejteken át a kéreg belsejébe jutnak, ahol mitózist indukálnak. Ennek hatására egy új osztódószövet, a gümőmerisztéma jön létre (Dudley et al., 1987), amelyből aztán a gümő fejlődik. Ezzel egyidőben a baktériumok endocitózissal belépnek a gümősejtekbe, így egy ún. peribakteroid membránnal határolódnak, amely transzportfehérjéket tartalmaz és jelentős MA_DIP04.doc
10
anyagtranszportot bonyolít le. Közben a baktériumok fiziológiai változásokon mennek keresztül, illetve térfogatuk 30-40-szeresére megduzzad, vagyis bakteroidokká alakulnak. A bakteroidok nitrogenáz enzimének működéséhez nélkülözhetetlen bizonyos mennyiségű (csekély) oxigén. A komplex azonban túl nagy oxigén-koncentrációra érzékeny. A gazdanövényben egy olyan különleges hemoglobin képződik, a leghemoglobin, amely biztosítja az alacsony, de még szükséges oxigén mennyiséget (mikroaerob környezet).
1.2.2. Sejtfelszíni poliszacharidok A szimbiózis kialakulásában fontos szerepük van a rhizobiális sejtfelszíni poliszacharidoknak.
Ezen
belül
elkülöníthetünk
exopoliszacharidokat
(EPS),
lipopoliszacharidokat (LPS) és kapszuláris poliszacharidokat (KPS). Az exopoliszacharidok a sejtfelszínen felhalmozódó és a környezetbe nagy mennyiségben kiválasztott extracelluláris poliszacharidok. Nélkülözhetetlen szerepet töltenek be a gümőfejlődésben, ugyanakkor a szimbiózis kialakulásában nem meghatározó a funkciójuk. A S. meliloti 41 törzs egy szükcinoglükán természetű heteropoliszacharidot termel, amely ismétlődő oktaszacharid egységekből épül fel. Az alegységek szukcinil, piruvil és acetil módosításokat tartalmaznak. Ezek közül a szukcinil és piruvil csoportok elengedhetetlenül szükségesek a gümő kialakulásához. (Hiányuk esetén gümő nem képződik.) A S. meliloti 41 által termelt exopoliszacharidot kromatográfiás módszerrel egy nagy (HMW) és egy kis (LMW) molekulatömegű frakcióra lehet elkülöníteni. Az exopoliszacharidok szintézise négy lépéses folyamat: 1. nukleotidcukrok szintézise (UDP-glükóz,
UDP-galaktóz);
2.
az
oktaszacharid
alegységek
szintézise
a
nukleotidcukrokból egy lipidhordozó felszínén; 3. az alegységek módosítása piruvil, szukcinil és acetil-csoportok elhelyezése révén; 4. az oktaszacharid alegységek polimerizációja. A lipopoliszacharidok a Gram-negatív baktériumok sejtfelszínének fontos alkotói, a külső membrán integráns részei. Egy LPS molekula három szerkezeti egységre tagolható: lipidA egység, amely a molekulát a külső membránhoz horgonyozza. Ehhez kapcsolódik a
konzerválódott
MA_DIP04.doc
szerkezetű
„core”
oligoszacharid,
amellyel
az
ismétlődő
11
oligoszacharidokból álló törzsspecifikus O-antigén alakít ki kapcsolatot (Kannenberg et al.,1994). A lipopoliszacharidok a nagy variabilitással és nagyfokú immunogén aktivitással rendelkező alkotórészük (O-antigén) által fontos szerepet tölthetnek be például a patogenitás mértékének meghatározásában. Ezek a sejtfelszíni struktúrák az új eredmények alapján a rhizobiumoknál szerepet játszhatnak a szimbiózis kialakításában. A kapszuláris poliszacharidok ─ más néven (erős immunogén hatásuk miatt) Kantigének ─ a baktérium felszínéhez szorosabban kötődő struktúrák, amelyek (az EPS-sel ellentétben) nem választódnak ki a környezetbe. A KPS-ek szerkezetüket tekintve diszacharidegységekből felépülő poliszacharidok. A diszacharidegységek a 2-keto-3-deoxi-oktulonsavat (Kdo) vagy annak valamilyen variánsát tartalmazzák. Az EPS-sel ellentétben, melynek szerkezete fajon belül állandó, a KPS törzsspecifikus antigén, vagyis a faj különböző törzsei eltérő szerkezetű sejfelszíni KPS-sel rendelkeznek (Reuhs et al., 1997). A S. meliloti 41 törzs KR5 nevű poliszacharidot termel. Ez a struktúra felépítésében hasonló az E. coli törzs II. típusú K antigénjéhez (Reuhs et al., 1993). A KPS-ek képesek akár az EPS-ek szerepét is betölteni a szimbiózisban. Erre az általunk vizsgált baktériumtörzs exoB mutánsa mutatott rá, amely az EPS elvesztése mellett továbbra is ki tudott alakítani szimbiózist a gazdanövénnyel. Ezt pedig a KPS biztosította (Putnoky et al., 1990). A KPS-ek elősegítik a bakteriofág baktériumhoz történő kötődését, azonban léteznek a 16-3 fágra rezisztens KPS⎯ baktériummutánsok, amelyekhez a fág nem tud hozzákapcsolódni, mert megváltozott szerkezetű poliszacharidot termelnek, vagy egyáltalán nem képeznek ilyen sejtfelszíni struktúrákat (Petrovics et al., 1993; Kereszt et al., 1998; Kiss et al., 2001).
1.2.3. A szimbiózisban szerepet játszó fontosabb gének A S. meliloti 41 törzs 6,7 Mb nagyságú genommal rendelkezik (Honeycutt et al., 1993). Kromoszómája 3,7 Mb hosszú, emellett egy pSymA (1,4 Mb) és egy pSymB (1,7 Mb) megaplazmidot hordoz. A pSymA replikon a nod, nif és fix géneket illetve a transzfert irányító szekvenciákat (oriT és tra gének) tartalmazza. A pSymB plazmidon az oriT és tra gének homológjai és sok poliszacharid bioszintézist irányító gén található.
MA_DIP04.doc
12
Rendelkezik még néhány esszenciális aminosav bioszintézisét kódoló, illetve a sejtosztódáshoz nélkülözhetetlen génnel. A hordozott gének által a pSymB megaplazmid növeli a baktérium környezethez való alkalmazkodóképességét. A szimbiózis kialakulásának és a nitrogénfixáció egyes lépéseinek kódolásáért felelős géneket három csoportba sorolhatjuk: nodulációs gének, gümőinváziót meghatározó gének és a nitrogénkötés génjei. A nodulációs gének (nodABC) a növény által kibocsátott szignálmolekulák (flavonoidok) megjelenésével aktiválódnak. Egy diffúzibilis molekula, a Nod-faktor szintézisét kódolják, amely a gazdanövény gyökerén hoz létre változásokat: indukálja a gümőmerisztéma és a gümő kialakulását. A gümőinváziót meghatározó gének közé a sejtfelszíni struktúrák bioszintézis útjait kódoló géneket soroljuk, hiszen a szimbiózis e szakaszában elsődleges szerepet ezek a struktúrák játszanak. Az infekcióban hibás mutánsok gümőfejlődést tudnak indukálni, azonban a fertőzési folyamat nem jön létre. Az exopoliszacharidok szintézisét (1.2.2. fejezet) exo gének irányítják (exoA-W). A KR5 antigén bioszintézisében szerepet játszó gének a pSymB megaplazmidon, az rkp1,2,3 régióba tartoznak. A poliszacharidok szintézisében és a transzportban jelentős funkcióval bírnak az NdvA, B fehérjék, amelyeket az ndv gének kódolnak. A nitrogénkötés génjei közé sorolhatók a nif és fix gének. A nif gének a nitrogenáz enzimkomplex egyes részeit és kofaktorának szintézisét irányítják. A fix gének pedig a nitrogenáz enzimkomplexhez elektront szállító rendszer elemeit kódolják.
MA_DIP04.doc
13
2. KÍSÉRLETI ELŐZMÉNYEK
Munkám kezdetekor a vad típusú 16-3 fág h génjének DNS-szekvencia meghatározására vonatkozó kísérletek is megkezdődtek. (A kapott részletes eredmények Békási Krisztina diplomamunkájában olvashatók.) A vad típusú szekvencia meghatározásához először a fág fizikai térképe alapján a D és a C EcoRI fragmentet kellett elválasztani egymástól (3. ábra). Ezután a D fragmentből izolálva az 1,16 kb hosszúságú BamHI fragmentet, meghatározták annak nukleotidszekvenciáját.
3. ábra: A D EcoRI fragment helyzete a 16-3 fág fizikai térképén. Az ábra felső részén a 16-3 kromoszóma EcoRI restrikciós hasítóhelyei és a fragmentek jelei vannak feltüntetve. Az alsó részen a D EcoRI fragment részletesebb fizikai térképe látható, amelyen a számozás a restrikciós hasítóhelyek pozíciójára utal a 16-3 fág publikált fizikai térképén. (7. fejezet) (Dorgai et al., 1983)
MA_DIP04.doc
14
A kapott szekvenciát elemezve megállapítható volt, hogy egyetlen esetben a meghatározott 1157 bp-os szakaszon keresztül húzódik egy ORF. Valószínűnek tartották, hogy ez az ORF határozza meg a H fehérje aminósavsorrendjét. A kapott szekvenciában azonban sem a gén elejét (5’ vég), sem a gén végét (3’ vég) nem találták meg. Ezért mindkét irányban meghatározták a szomszédos régiók nukleotidsorrendjét is. A 3’ irányban történő szekvenálás eredményeként a (36)BamHI helytől körülbelül 300 bp távolságra elhelyezkedő transzlációs stop kodon, illetve egy transzkripció terminációs szignálszerű szekvencia volt azonosítható, amelynek jelenléte alátámasztja, hogy ez ténylegesen a h gént kódoló régió. Később a (34)BamHI helytől 5’ irányba haladva azt próbálták meghatározni, vajon honnan kezdődik a h gén. Többféle esetleges transzlációs start kodont is detektáltak (ATG, GTG, GTT). Ezek közül a valós kezdőpont kiválasztásához a H fehérje termeltetésével kapcsolatos kísérleteket terveztek. A bakteriofág genetikai-fizikai térképén Palágyi Zsuzsanna révén már ismert volt egy host-range mutáció körülbelüli helyzete. A mutációt Orosz László laborjában „marker-rescue” technikával azonosította. Eredményei azt mutatták, hogy ez a változás a pDH1 klónon, a pPZS5 klónon ((29)BamHI - (36)BamHI fragmenten), illetve a pPZS10 klónon ((34)BamHI - (36)BamHI fragmenten) belül helyezkedik el (4. ábra). Az érintett gén nukleotid-szekvenciáját és természetét azonban eddig még nem határozták meg.
4. ábra: Egy h mutáció elhelyezkedése a 16-3 fág fizikai térképén.
MA_DIP04.doc
15
3. CÉLKITŰZÉSEK
A 16-3 fág kizárólag a Sinorhizobium meliloti 41 baktériumtörzsön képes szaporodni, feltehetően azért, mert ez a törzs egy speciális kapszuláris poliszachariddal rendelkezik, amelynek szerepe van a gazdanövénnyel való szimbiózis kialakításában is. Korábbi munkákban feltételezték, hogy a fág receptora ez a törzsre jellemző KPS. A fágreceptor természetének tanulmányozása érdekében célul tűztük ki receptor-mutáns baktérium és host-range fágmutánsok azonosítását és jellemzését. E munkában feladatunk a bakteriofág vizsgálata volt. Orosz László laborjában sok évvel ezelőtt egy mutációval azonosították a megváltozott baktériumfelszín felismerésében szerepet játszó fehérjét (H) kódoló h gén helyét a bakteriofág genetikai-fizikai térképén. Az érintett gén nukleotid-szekvenciájában történt változásokat azonban még nem vizsgálták.
Ennek ismeretében célunk:
•
a 16-3 bakteriofág feltételezett farki rost fehérjéjét kódoló h génben található mutáció(k) helyzetének feltérképezése, és
•
a mutáció(k) természetének meghatározása volt.
MA_DIP04.doc
16
4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok A munkánk során használt baktériumtörzseket, bakteriofágokat és plazmidokat, illetve azok jellemzőit az 1. táblázat foglalja össze. 1. táblázat: Alkalmazott baktériumtörzsek, bakteriofágok, plazmidok.
Elnevezés
Jellemzők, hivatkozások
Baktériumtörzsek AK631
RM41 ”kompakt” kolóniamorfológiájú változata (exoB631, Nod+, Fix+) (Kondorosi et al., 1977)
RM41
S. meliloti 41 vad típusú (Exo+, Nod+, Fix+) (Putnoky et al., 1990)
XL1-Blue
E. coli K12, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lacZ∆M15 (Stratagene USA)
GH4046
RM41 rkpM4046 (Hoffmann)
GH4178
RM41 rkpM4178 (Hoffmann)
GH4180
RM41 rkp-4180 (Hoffmann)
PP2511
AK631 rkp-3::Tn5 (212) KmR SmR (Kiss et al., 2001)
Bakteriofágok 16-3
S. meliloti 41 baktériumtörzsre specifikus vad típusú fág (Orosz et al., 1970)
16-3 h5
16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)
16-3 h15
16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)
16-3 h109
16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)
16-3 h111
16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)
16-3 h114
16-3 fág, host-range mutáns (ez a munka)
Plazmidok pBS
pBluescript II SK (+), AmpR, klónozó vektor, (Stratagene USA)
pBBR1-MCS 2
+ KmR, Tra─, Mob (Kovach et al., 1995)
pDH1
PLAFR1 kozmid 16-3 fág klón, h régió; (Dorgai et al., 1986)
MA_DIP04.doc
17
4.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Az E. coli törzseket LB komplett táptalajon, a megfelelő antibiotikum jelenlétében 37 ºC-on, a S. meliloti törzseket pedig TA komplett táptalajon, 32 ºC-on növesztettük. Az LB tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton 5 g/l Yeast extract 5 g/l NaCl (pH 7,2). (Meade et al., 1977) A TA tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton 1 g/l Yeast extract 5 g/l NaCl (pH 7.0) 1 mM MgSO4 1 mM CaCl2 (pH 7,2-7,5). (Orosz et al., 1973) A táptalajok készítésekor a tápoldatokat 1,5 % agarózzal, fedőagar esetében pedig 0,7 % agarral egészítettük ki. A szilárd táptalajokban alkalmazott antibiotikum koncentrációkat a 2. táblázat tartalmazza. 2. táblázat: Alkalmazott antibiotikum koncentrációk (µg/ml). Antibiotikumok
E. coli
S. meliloti
ampicillin
100
—
kanamicin
30
200
tetraciklin
15
15
A bakteriofágok esetében 4 ml TA tápfolyadékban 0,2 ml megfelelő baktériumot (friss kultúra) és 1 plakk növeszteni kívánt bakteriofágot kevertünk össze, majd ezt éjszakán át 32 ºC-on erős rázatás mellett szaporítottuk.
4.3. Cseppteszt A kísérlet elvégzéséhez 4 ml TA fedőagarban elkevert, éjszakán át növesztett 0,2 ml rhizobium kultúrát TA táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztettünk. A tesztelendő
MA_DIP04.doc
18
bakteriofág szuszpenziójából 1 µl-t (105-106 db fág részecske) a megszilárdult fedőagar tetejére cseppentettünk, majd 32 °C-on, termosztátban inkubáltuk. Ha a fág fertőzése sikeres volt, másnapra tiszta tarfolt (plakk) vált láthatóvá. Kísérleteinkben ennek meglétét illetve hiányát elemeztük.
4.4. Fágkötési teszt A kísérletben éjszakán át növesztett baktériumkultúrát (RM41, GH4178, GH4180) és megfelelő higítású (103 - 104 db/ml) bakteriofágot (16-3, 16-3 h5, 16-3 h109) használtunk. A teszt kivitelezése előtt meghatároztuk a fágok titerét [16-3 (3,4x109); 16-3 h5 (1,05x1010); 16-3 h109 (4,2x109)]. Ezen értékek alapján állapítottuk meg a higítás mértékét. A reakcióhoz 800 µl TA tápoldatot, 200 µl baktériumot és 50 µl megfelelő fágot használtunk. A vak (kontroll) oldatba baktérium helyett 200 µl TA oldatot adtunk. Ezután az
Eppendorf-csöveket
szobahőmérsékleten
azonos
inkubáltuk,
körülmények majd
a
között
baktériumokat
kezeltük: a
5
percig
hozzájuk
tapadt
fágrészecskékkel együtt lecentrifugáltuk (5 perc, 12000 rpm). Ezután a felülúszóból származó 100 µl fágot 0,2 ml vad típusú baktériummal kevertük össze és fedőagar jelenlétében TA táptalajt tartalmazó lemezekre szélesztve 32 °C-on növesztettük. E fágtitrálással meghatározható volt a felülúszóban maradt (baktériumok által nem kötött), fertőzőképes bakteriofágok száma.
4.5. Bakteriofág DNS izolálás A szükséges mennyiségű DNS oldatot 20 ml TA táptalajban egész éjszakán át növesztett bakteriofágból (109-1010 fág/ml) izoláltuk. 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük. A felülúszót új csőbe átpipettázva 300 µl PEG/NaCl (20% PEG 6000; 2,5M NaCl) oldattal kevertük össze. Ezután a mintákat 15 percig jégen (0 °C) inkubáltuk, majd újra lecentrifugáltuk. Az üledéket 50 µl TE (50mM Tris; 20mM EDTA; pH 8,0) oldatban szuszpendáltuk és 0,1 térfogat 10 % SDS oldatban vettük fel. Az elegyet 1 térfogat 7,5 M hűtött ammónium-acetáttal kevertük össze. 15 perces 0 °C-on történő inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, majd a felülúszót új csőbe mérve 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki a DNS oldatot. A mintákat 15 percig 20 °C-on inkubáltuk, majd 5 percig centrifugáltuk. Ezután az üledéket 400 µl 70 %-os
MA_DIP04.doc
19
etanollal mostuk, szárítottuk, majd 25 µl (vagy 50 µl) steril desztillált vízben oldottuk fel. A kísérlet sikerességét restrikciós endonukleázokkal történő DNS emésztés után agaróz gélelektroforézissel ellenőriztük (4.8. fejezet). Az emésztés során 1 µl bakteriofág DNS mintát használtunk.
4.6. Plazmid DNS preparálás A plazmid DNS oldatot 3 ml TA táptalajban éjszakán át növesztett sejtekből alkalikus lízissel preparáltuk (Ish-Horovicz et al., 1981). 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk és a sejteket centrifugálással ülepítettük, majd 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCl; 10 mM EDTA; 50 mM glükóz; pH 8,0) szuszpendáltuk fel. A feltárást óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0,2 N NaOH; 1% SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig jégen (0 ºC) inkubáltuk, majd 160 µl 0 ºC-os nátrium-acetátot (3M, pH4,8) adtunk az oldathoz. A keletkezett csapadékot 5 perc 0 ºC-os inkubáció után 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszóban lévő plazmidot 320 µl izopropanollal csaptuk ki. 10 perc –20 ºC-on történő inkubáció után a mintákat lecentrifugáltuk, 400 µl 70 %-os etanollal mostuk és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-pufferben (50 mM TrisHCL; 100 mM nátrium-acetát; pH 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0 ºC-os inkubáció után a mintákat újból lecentrifugáltuk, mostuk és szárítottuk, majd kozmidok esetén 30 µl, pBluescript, illetve pBBR plazmidok esetében 50 µl RNáz (50100 µg/ml) oldatban vettük fel.
4.7. DNS tisztítás a minták nukleotidsorrendjének meghatározásához A szekvenálási reakció előtt ─ nagy tisztaságú minták előállításához ─ erre a célra tervezett tisztítási lépést végeztünk. A preparált DNS mintákhoz 0,1 térfogat 10 %-os SDS oldatot adtunk, és 5 percig jégen inkubáltuk. Ezután az DNS-SDS elegyhez 1 térfogat (0 ºC-os) 7,5 M ammónium-acetát oldatot tettünk és a mintákat 15 percig jégen inkubáltuk, majd a keletkezett csapadékot 5 percig centrifugáltuk (12000 rpm). A felülúszót azonnal átpipettáztuk egy másik Eppendorf-csőbe, és a benne lévő DNS oldatot 0,6 térfogat izopropanollal csaptuk ki. 20 perc –20 ºC-on történő inkubáció után a mintákat 400 µl 70 %-os etanollal mostuk, szárítottuk, majd a tisztított DNS oldatot 2540 µl steril desztillált vízben oldottuk fel. MA_DIP04.doc
20
4.8. Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása A tisztított plazmid DNS mintából 0,2-0,5 µg-ot, a bakteriofág DNS preparátumból 12 µg-ot használtunk fel restrikciós endonukleázokkal történő emésztésekhez. A mintákat 1-2 U mennyiségű FERMENTAS enzim, megfelelő enzimpuffer és steril desztillált víz jelenlétében 1-2 óráig 37 ºC-on inkubáltuk. Az emésztés végén a reakcióelegybe 1/5 rész mintafelviteli puffert (10 % ficoll; 0,25 M EDTA; pH 8,0; 0,2 % brómfenolkék) mértünk. (Maniatis et al., 1982) A restrikciós endonukleázokkal hasított minták fragmentjeit agaróz gélen választottuk el. A gél készítéséhez az agarózt 0,5xTBE pufferben (5,4 g TRIS; 2,75 g bórsav; 2 ml 0,5 M EDTA/1000 ml; pH 8,0) oldottuk fel, majd 100 µg/ml koncentrációjú etídiumbromidot mértünk bele, így a gél végkoncentrációja etídium-bromidra nézve 0,1 µg/ml lett. Munkánk során többnyire 1%-os gélt készítettünk. A gél dermedése (40-60 perc) után a fragmenteket 0,5xTBE pufferben 60-120 V-on, fragmentizolálás esetén 20-40 Von szeparáltuk. Az elektroforézis során molekulatömeg-standardként PstI enzimmel hasított lambda fág DNS mintát alkalmaztunk. A kiértékelést UV fény segítségével végeztük és az eredményeket dokumentáltuk.
4.9. Fragmentizolálás A megfelelő restrikciós endonukleázokkal hasított fragmenteket elektroforézissel választottuk szét. Az izolálni kívánt fragment elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettünk. 20 perces 60 V feszültség mellett történő futtatás után az izolálandó fragment a papírra került, amelyről 2x50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS-t ezután 0,1 térfogat 3M nátrium-acetát oldat (pH 7,0) és 0,6 térfogat izopropanol hozzáadásával csaptuk ki. 20 perces (vagy éjszakán át) –20 ºC-on történő inkubáció után a mintát lecentrifugáltuk, 400 µl 70 %-os etanolban mostuk, szárítottuk és a keletkezett csapadékot 20 µl steril desztillált vízben oldottuk fel.
4.10. Ligálási reakció A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, 5x ligáz puffer (500 mM Tris HCl; 100 mM MgCl2; 10 mM ATP; pH 7,6), steril desztillált víz és T4 ligáz enzim
MA_DIP04.doc
21
felhasználásával állítottuk össze 15 µl végtérfogatra. A vektor és a fragment mennyiségét az ellenőrző emésztés eredményétől függően állapítottuk meg. A reakcióban a ligálandó végek minősége alapján kétféle T4 DNS ligáz enzimet használtunk: tompa végek esetében tömény, ragadós végek esetében higított ligázt alkalmaztunk. A ligálási elegyet ezután legalább 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
4.11. Kompetens sejtek készítése A kompetens sejtek készítéséhez E. coli XL1-blue törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2 % Bacto trypton; 0,5 % Yeast extract; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; pH 7,0) 22 °C-on történő erős rázatás mellett, 24 óráig növesztett baktériumkultúrát (OD= 0,50,6) 10 percre jégre tettünk, ezután mindig 0 ºC-on dolgoztunk. A sejteket 10 perces centrifugálással (4000 rpm) gyűjtöttük össze, majd 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES; 15 mM CaCl2; 250 mM KCl; pH 6,7) szuszpendáltuk fel. A következő lépésben a mintát újra 10 percig jégen inkubáltuk, lecentrifugáltuk, majd 20 ml 0 °C-os TB pufferben vettük fel. A szuszpenzióhoz 1,5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket Eppendorfcsövekbe szétosztva transzformációig –80 °C-on tároltuk. (Inoue et al.,1990)
4.12. Transzformáció Egy transzformáláshoz 100 µl kompetens sejtet használtunk fel. A sejteket –80 °C-ról jégre tettük, és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz használt vektorba ligált DNS fragmentet, amelyet ezután 30 percig jégen inkubáltunk, majd 3 percig 37 °C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400 µl SOC oldatot (2 % Bacto trypton; 0,5% Yeast extract; 10 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 20 mM glükóz; pH 7,0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37 °C-on történő inkubáció után a sejteket szelektív LB táptalajra szélesztve másnapig 37 °C-on inkubáltuk. A táptalaj 100 µl megfelelő antibiotikumot, 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl X-gal (2%, DMSO) oldatot tartalmazott. A másnapra felnövő telepek közül kék-fehér screen segítségével választottuk ki az inszertet tartalmazókat (fehér), vagyis amelyeknél nem figyelhető meg β–galaktozidáz (lacZ gén) aktivitás. A kiválasztott telepekkel további kísérleteket végeztünk.
MA_DIP04.doc
22
4.13. Polimeráz láncreakció (PCR) A reakcióelegy 25 µl végtérfogatába: 1 µl higított (100x) templát DNS oldatot, 1-1 µl oligonukleotid primert [h31 (62,2 nmol); h51 (31,3 nmol); h32 (61,4 nmol); h52 (48,7 nmol)], 6 µl PCR-mixet (4x Taq puffer; 0,8 mM dNTP; 6 mM MgCl2), 15 µl steril desztillált vizet, 1 µl (2-5 U) Taq polimeráz enzimet mértünk. A reakció során előre megtervezett programot használtuk. A program leírása a 3. táblázatban olvasható. 3. táblázat: A kísérlet során alkalmazott PCR program. 1. 94°C
2 perc
2. 94°C
30 mp
3. 65°C
30 mp
4. 72°C
1 perc
5.
35x
6. 25°C
GO TO 2 1 perc
7. END
A PCR reakcióban felsokszorozni kívánt szekvenciához oligonukleotid primereket terveztünk. A primereket és azok nukleotidsorrendjét az 4. táblázat tartalmazza.
4. táblázat: Alkalmazott primerek és szekvenciáik. primerek
szekvenciáik
h31 h51 h32 h52
gcgggctgcaaaatccaga caactgccgcggagatgg ccgccagaaacgacttcc gccattgcccgatgagg
Az oligonukleotid primerek reakcióban elfoglalt helyzetét a 5. ábra mutatja.
MA_DIP04.doc
23
4.14. DNS szekvencia meghatározás A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotidszekvenciáját a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg. A szekvenálást Sanger-féle láncterminációs módszer alapján működő reakcióval készítették elő és ABI PRISM automata szekvenáló berendezéssel végezték.
4.15. Számítógépes szekvencia analízis A meghatározott DNS részszekvenciákat számítógép segítségével összeillesztettük és megvizsgáltuk mind a hat leolvasási keretben a kódoló kapacitásukat (LaserGene programcsomag, DNA Star Inc., USA).
MA_DIP04.doc
24
5. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK
5.1. Egy host-range mutáció jellemzése Munkám kezdetekor folytak a vad típusú 16-3 fág h génjének DNS-szekvencia meghatározására vonatkozó kísérletek. Emellett fontosnak tűnt a 16-3 fág farki rost fehérjéjét kódoló génben hibás, mutáns allélek (h5, h15 allél) pontos szerkezetének felderítése is. A fágrezisztens receptor-mutáns baktériumon (GH4046) a rezisztencia-tesztben vizsgált vad típusú populáció (kb. 5x109) egy töredéke „visszanyerte” fertőzőképességét. Ez esetben a fágpopulációban feltételezéseink szerint olyan spontán mutációk jöhetnek létre a baktériumfelszínt felismerő H farki rost fehérjét kódoló génben, amelyek révén a fág „adaptálódik” a baktérium megváltozott, RkpM4046 receptorfehérjéjéhez. A baktérium részéről jelen kell lennie valamilyen sejtfelszíni struktúrának, amelyhez a bakteriofág kötődni képes. Az is bizonyos, hogy ezeknél a mutánsoknál (GH4046,
GH4178)
a
fágreceptor
valamelyest
különbözik
a
vad
típusú
baktériumtörzsétől (RM41), hiszen a vad típusú fág nem képes azt felismerni. Megvizsgáltuk az izolált fágplakkok morfológiáját, majd az azonos fenotípusú és nagy számú plakkot adó fágokat választottuk ki kísérleteink folytatására. Az ilyen módon izolált fágokat tisztítottuk és a bennük található feltételezett h allélt h5 és h15 allélnek neveztük el, majd mindkét törzsből DNS preparátumot készítettünk. Ezután azt vizsgáltuk, hogy a h génen belül megtalálhatók-e az újonnan izolált hostrange mutációk, illetve mi azoknak a pontos helyzete. Ennek érdekében PCR reakció során felsokszoroztuk a h régiót két erre a célra tervezett oligonukleotid primer segítségével (5. ábra). A tisztított PCR fragmentek nukleotid-szekvenciáját ezekkel és két további primert használva határoztuk meg (5. ábra). Az oligonukleotid primerek szekvenciája a 4.13. fejezetben található.
MA_DIP04.doc
25
5. ábra: A 16-3 fág h5 és h15 alléljében található mutáció helyzetének meghatározása. Az ábra felső része a 16-3 fág illetve a h régió fizikai térképét mutatja, összefoglalva a h régió elemzése során nyert következtetéseket (Dorgai et al., 1983). Az alsó részen a PCR kísérlethez használt primerek elhelyezkedését és a mutáns allélekben talált változás természetét foglaltuk össze.
A kapott szekvencia (6. ábra) elemzésekor „csak” egyféle host-range mutációt, egy változást találtunk az általunk H fehérjét kódoló régiónak tartott szakaszon. Természetét tekintve ez egy missense mutáció, ami olyan aminosavcserét jelent, amely a H fehérje hosszát nem, de a fág baktériumhoz történő kötődését megváltoztatja. Esetünkben ez a következőképpen alakult. A vad típusú bakteriofág h génjében ΄ggc΄, azaz glicint kódoló triplet található, míg a mutáns fág h génjének ugyanezen helyén ΄gac΄ bázishármast azonosítottunk, ami már nem glicint, hanem aszparaginsavat kódol.
MA_DIP04.doc
26
vad típusú bakteriofág
h5 mutáns allélt hordozó bakteriofág
h15 mutáns allélt hordozó bakteriofág
h109 mutáns allélt hordozó bakteriofág
h111 mutáns allélt hordozó bakteriofág
h114 mutáns allélt hordozó bakteriofág
6. ábra: A vad típusú bakteriofág, illetve a h5, h15, h109, h111 és h114 mutáns allélt hordozó fágok h génjének szekvenciarészlete (1650-2100 bp). A zöld téglalapok jelölik az egyes fágok szekvenciájában található eltérő bázishármas pozícióját.
MA_DIP04.doc
27
Ez az eredmény több dolgot is jelentett számunkra: egyrészt alátámasztotta, hogy ez a feltételezett gén valóban a H farki rost fehérjét kódoló ORF, és ez a fehérje a host-range jelenség kialakulását befolyásolja. Azt vártuk, hogy a h génben és az általa expresszált fehérjében olyan változás alakuljon ki, amivel a fág alkalmazkodni tud a baktérium szintén mutáció által megváltozott fágfelismerő felszínéhez és ezt meg is találtuk. (A baktériummutánsok izolálása, illetve azok vizsgálata Deák Veronika és Pálvölgyi Adrienn diplomadolgozatában olvasható.) a másik fontos megállapítás a mutáció és az aminosavcsere helye, amit kísérleteink alapján a gén által kódolt H fehérje C-terminális részén lokalizáltunk. Ebből azt a következtetést vonhatjuk le, hogy ez a C-terminális rész funkcionálisan fontos szerepet tölt be a fág baktériumfelszínhez történő tapadásában.
5.2. Újabb host-range fágmutánsok azonosítása A fág baktériumfelszínt felismerő fehérjéje és a baktérium fágreceptora között létrejövő kölcsönhatás pontosabb megismerése érdekében a már elmondott elvek alapján (5.1. fejezet) újabb receptor-mutáns baktériumokat és host-range fágmutánsokat izoláltunk. A kísérlet eredményét a 5. táblázat mutatja be.
5. táblázat: A host-range fágmutánsok megjelenése a különböző baktériumtörzseken. A fertőzésnél minden esetben ugyanazt a fágpopulációt alkalmaztuk.
MA_DIP04.doc
Baktériumtörzs
16-3 fágpopulációval (5x109) való fertőzés után, egy lemezen lévő plakkok száma
RM41
5x109 plakk
GH4046
50 plakk
GH4178
50 plakk
GH4180
200 plakk
28
Az 5. táblázat adatai alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy valószínűleg két eltérő fenotípusú fágot tartalmazott a vizsgált lizátum (a vad típusú fág nagy többsége mellett). Az egyik a GH4046, illetve a GH4178 törzsön 50 plakk által képviselt fág. Ezen felül (vagy kívül) a GH4180 baktériumot egy további, a kísérletben 150 (200) plakkot adó fágmutáns is képes volt fertőzni. Azonban a GH4180 törzsön szaporodó fágok 75%-a (150) nem képes a másik két baktériumtörzshöz (GH4046, GH4178) kapcsolódni. Ezért mondhatjuk, hogy két különböző mutáns fágot sikerült kimutatnunk. A mutánsok közül hármat kiválasztottunk és h109, h111, h114 jelzéssel láttuk el őket. E fágok további jellemzését a 6. táblázat mutatja. A táblázatban összehasonlításképpen feltüntettük az elsődlegesen izolált mutáns fágok fertőzőképességét is. 6. táblázat: A különböző host-range fág, receptor-mutáns és vad típusú baktérium gazdaspecifitása. A (-) jel a fágra való rezisztenciát, a (+) az érzékenységet jelenti. Host-range bakteriofág-mutánsok
Receptormutáns baktériumok
h109
h111
h114
h5
h15
GH4046
-
-
+
+
+
GH4178
-
-
+
+
+
GH4180
+
+
+
+
+
RM41
+
+
+
+
+
A kapott eredményeket elemezve elmondható, hogy abban az esetben, ha a h114-es fágtörzzsel fertőztük az rkpM4046 allélt tartalmazó baktériumot (GH4046), pozitív eredményt kaptunk, vagyis a h114-es törzs mindkét baktériummutánson ugyanúgy képes szaporodni, ahogy azt a h5 és h15 allélt tartalmazó fágok esetében is megállapítottuk. Ez azt jelentheti, hogy e három bakteriofágban (h5, h15, h114) a mutáció ugyanabban a régióban helyezkedhet el. (Az erre vonatkozó kísérletek és eredmények az 5.3. fejezetben találhatók.) A táblázat adatai alapján a h109, h111 allélt hordozó fágok az eredeti mutáns baktériumot (GH4046) nem, de az újonnan izolált mutánst (GH4180) képesek fertőzni. Tehát feltételezhető, hogy a h109, h111-es törzsekben a mutáció legalábbis más aminosavcserét eredményez a h génen belül, vagy más gént érint.
MA_DIP04.doc
29
5.3. A fág baktériumfelszín felismerésében más fágfehérje is szerepet játszhat Az 5.2. fejezetben olvasható feltevések bizonyítása érdekében meghatároztuk az újonnan izolált bakteriofágok (h109, h111, h114) h régiójának nukleotid-szekvenciáját is, hasonlóan mint a h5 és h15 allél esetében (5.1. fejezet). Azt az eredményt kaptuk, hogy a h114 mutáns allélben pontosan ugyanott és ugyanolyan mutáció található, mint az előzőleg izolált mutánsoknál (h5, h15 – 5. ábra), viszont a h109 és h111 alléleket hordozó fágok h régiójának egész területén nem találtunk változást (6. ábra). Tehát a mutáció egy másik gén területére esik, ami azt feltételezi, hogy a fág ─ baktérium kölcsönhatásban a fág több fehérjéje is részt vesz. Ezt a feltételezést alátámasztják a fág kezdeti vizsgálatakor kapott eredmények, miszerint a h génben talált mutáción kívül egy Ant─ mutáció is izolálható és térképezhető volt, amely a fág poliklonális ellenanyagokkal való reakcióját lényegesen gyengítette. Ezek ismeretében elképzelhető, hogy az általunk izolált 16-3 h109 és h111 az ant gén mutáns allélje. Ennek megállapítására vonatkozó kísérleteket a h109 allélt tartalmazó törzs esetében terveztünk. Eredményeink nagyon hasonlítanak az E. coli ─ lambda fág rendszerben tapasztaltakhoz. Mint ismeretes a lambda fág farki rost fehérjéjét (J) a j gén kódolja. E gén 3’ végén szintén missense mutációt azonosítottak. A mutációt hordozó fágok csak a receptor-mutáns baktériumokat képesek fertőzni. E baktériumokban a fág-baktérium kapcsolat kialakításáért a malB gén által kódolt fehérje (MalB) felelős. A malB génben szintén egy missense mutációt detektáltak a C-terminális részen. Tehát mind a fág, mind a baktérium részéről a fehérjék C-terminális része fontos szerepet játszik a felismerés folyamatában (Wang et al., 1998) (Werts et al., 1994). A 16-3 fág ─ S. meliloti kapcsolatban szintén a fehérje C-terminális része alakít ki kapcsolatot a fág és a baktérium között. Azonban a lambda fág esetében mindkét oldalról egy-egy fehérje, míg a 16-3 fág – S. meliloti rendszerben legalább két fehérje vesz részt a tapadásban.
5.4. A h mutáns fágok baktériumhoz történő kötődésének vizsgálata A receptor-mutáns baktériumon újonnan izolált fágmutánsok (16-3 h109) kötődésének megismerése céljából tervezett fágkötési tesztben a felnövesztett spontán mutáns baktériumokat ismert titerű 16-3 fág szuszpenzióval inkubáltuk, majd a sejtek lecentrifugálása után a felülúszót vad típusú KPS-t termelő (RM41) törzsön titráltuk MA_DIP04.doc
30
(4.4. fejezet). A tesztben a kontroll oldatokban nem található baktérium, így a belőlük nyert felülúszóból a fágok teljes mennyisége számolható. A baktériumokat is tartalmazó elegyben pedig a fágok egy része hozzá tud tapadni a baktériumok sejtfelszíni receptorához a fág kötődésének mértékétől függően. Így a felülúszóban csak azok a fágok találhatók, amelyek nem képesek a baktérium fágreceptorához kapcsolódni. A fág titerének nagymértékű csökkenése azt jelzi, hogy a vizsgált baktérium megkötötte a fágot. Ellenkező esetben (ha a fág képtelen a baktériumhoz kötődni), a titer nem változik jelentősen.
7. táblázat: Az izolált bakteriofágok kötődésének vizsgálata mutáns allélt tartalmazó (GH4046, GH4178, PP2511) és nem hordozó baktériumokon (RM41). A kontroll oldatok baktériumot nem tartalmaztak. Bakteriofágok Baktériumok RM41
GH4046
GH4178
GH4180
PP2511
MA_DIP04.doc
16-3
16-3 h5
16-3 h109
kontroll
255
395
469
RM41
0
0
2
16-3
16-3 h5
16-3 h109
kontroll
477
770
14
GH4046
361
106
8
16-3
16-3 h5
16-3 h109
kontroll
252
406
556
GH4178
35
17
46
16-3
16-3 h5
16-3 h109
kontroll
342
411
586
GH4180
22
5
17
16-3
16-3 h5
16-3 h109
kontroll
467
644
561
PP2511
311
553
497
31
A 7. táblázat adatai alapján elmondható, hogy a vad típusú baktériumot (RM41) mindhárom fág körülbelül ugyanolyan mértékben (100%) képes fertőzni. A baktérium fágreceptorában nem történt változás, így a fágok felismerik azt és kromoszómájukat a baktérium genomjába tudják juttatni (profág). Különös eredményt kaptunk a fágok kötődését a GH4046 és a GH4178 baktériumon összehasonlítva. A GH4178 egy újonnan izolált mutáns, amely SDSpoliakrilamid gélelektroforézissel vizsgálva ugyanolyan KPS-t termel, mint a GH4046 (7. ábra). Az rkpM gén ugyanazon mutáns allélját hordozza, mint a GH4046 baktériumtörzs. Mégis a tesztben a fágok GH4046 és GH4178 baktériumokhoz kötődésében szignifikáns eltérés mutatkozott. Az eltérés oka feltételezéseink szerint a GH4178 baktérium kromoszómáján más régióban bekövetkezett mutáció lehet, amely erősebb kötődés létrejöttét engedélyezi. Ezt a hipotézist a GH4178 baktériummutánson végzett további kísérletekkel szeretnénk alátámasztani.
7. ábra: A mutáns baktériumok sejtfelszínén található kapszuláris poliszacharidok. Az ábrán Dr. Kerepesi Ildikó által készített SDS-poliakrilamid gél látható. Az ábra felső részén a KPS nagy molekulasúlyú, alsó részén a kis molekulasúlyú alkotója látható. A gélek felett a megfelelő mutáns törzsek számát tüntettük fel, amelyekből a KPS preparátum készült.
A GH4178 baktériummal egyidőben izolált mutáns törzsön (GH4180) mindhárom fág erősebb kötődése észlelhető, mint a GH4046 vagy a GH4178 esetében, ami arra vezethető vissza, hogy az újonnan izolált baktérium ─ eddigi mutánsokétól eltérő ─
MA_DIP04.doc
32
sejtfelszíni struktúrájában feltételezhetően olyan változás következett be, amely lehetővé tette a fágok tapadását (7. ábra). A két bakteriofágot (16-3 és 16-3 h5) összehasonlítva megállapítható, hogy a h5 mutáns allélt hordozó fág erősebb kötődést (85%) mutat az elsődlegesen izolált baktériumhoz (GH4046), mint a vad típusú fág (25%). A GH4046 rkpM régiójában létrejött mutáció által megváltozott sejtfelszíni struktúrához a vad típusú fág már nem képes hozzátapadni, míg a h5 allélt hordozó fágról elmondható, hogy a genomjában bekövetkezett mutáció révén újra felismeri a megváltozott KPS-t. A fágok újonnan izolált mutáns baktériumokhoz (GH4178, GH4180) történő kötődését vizsgálva ugyanez elmondható, bár az eltérés nem ennyire szignifikáns. A h109 allélt hordozó mutáns fág tapadásáról azt állapíthatjuk meg, hogy a vad típusú baktériumhoz erős a kötődése (szinte 100%), mivel a kísérletben kevés plakkot képezett (2/469). A fág rkpM4046 allélt tartalmazó baktériumtörzshöz (GH4046) történő kapcsolódása a vad típusú baktériumhoz képest gyengébb lett, ami azt mutatja, hogy a fág a baktérium megváltozott sejtfelszíni struktúrájához nagy mértékben már nem képes kapcsolódni. (A 16-3 h109 fág plakkjainak száma GH4046 baktériumon titrálva jelentősen lecsökkent, ami a kísérleti körülmények megváltozásának is betudható.) A 16-3 h109 fágot az újonnan izolált mutáns baktériumon (GH4180) titrálva elmondható, hogy az a genomjában történt változások által „visszanyerte” fertőzőképességét, így kötődése erősebb (97%) lett, a kísérletben kevesebb plakkot képezett (17/586). Kontrollként egy Tn5 transzpozont tartalmazó baktériumot is felhasználtunk a fágok vizsgálatához (PP2511). Ez a transzpozon a baktérium genomjában olyan helyzetben van (rkp régióban), hogy jelenlétével megakadályozza a fágfelismerő sejtfelszíni fehérjét kódoló gén expresszióját. Így a baktérium felszínén nem található meg az a struktúra, amelyhez a fág farki rost fehérjéje hozzákapcsolódhatna. Tehát a fág a tesztben körülbelül ugyanakkora mennyiségben képezett plakkokat a baktérium jelenlétében, mint annak hiányában.
MA_DIP04.doc
33
6. ÖSSZEFOGLALÁS
Munkánk kezdetén a lucernával szimbiótikus nitrogénkötésre képes S. meliloti 41 baktériumot
és
a
rajta
szaporodó
16-3
bakteriofágot
választottuk
kísérleti
rendszerünkként. Előzetes eredmények alapján ismert volt a vad típusú 16-3 fág h génjének szekvenciája. Orosz László laborjában meghatározták a 16-3 fág h génjét érintő host-range mutáció körülbelüli helyzetét. A mutáció típusát, illetve azt, hogy milyen mértékben módosítja ez a változás a fág baktérium-felszín felismerési mechanizmusát, még nem vizsgálták. Így munkánk célja az volt, hogy jellemezzük a h génben bekövetkezett mutációt. Egyes fágrezisztens receptor-mutáns baktériumokon (amelyek nem termelnek kapszuláris poliszacharidot) izolálhatók fertőzőképességüket visszanyert
host-range
fágmutánsok. A felismerés specifitását módosítja a fág egy (esetleg több) génjében bekövetkezett változás (host-range mutáció). Ezek segítségével azonosíthatók azok a gének (fehérjék), amelyek a baktériumfelszín felismerésében szerepet játszanak. A mutáns h gén (h5) pontos nukleotid-szekvenciájának meghatározása révén azt figyelhettük meg, hogy a h5 allélt hordozó mutáns fág farki rost fehérjéjének C-terminális részén egy aminosav eltérés található a vad típusú fehérjéhez képest. Tehát a mutáns gén analízise megerősítette, hogy a régióban talált ORF kódolja a H fehérjét, és megmutatta, hogy a baktériumfelszín felismerésében részt vesz annak C-terminális része. Újabb eredményeink azt mutatják, hogy izolálhatók mind a baktérium (GH4180), mind a fág oldaláról (16-3 h109 ) más fenotípusú és eltérően viselkedő mutánsok. Ezek vizsgálata még nem fejeződött be. Kísérleteink alapján azt állapíthatjuk meg, hogy a h109 allélt hordozó fág esetében a változás máshol helyezkedik el, mint az eredeti mutánsokban (16-3 h5, h15). Feltételezéseink szerint a mutáció egy másik gént érint. E hipotézis bizonyításához további kísérleteket terveztünk.
MA_DIP04.doc
34
7. FÜGGELÉK
1. tábla: A 16-3 bakteriofág kromoszómáján található legfontosabb restrikciós hasítóhelyek. A restrikciós endonukleázokat számozás jelöli (1-100). A táblázatban a hasítóhelyek pontos pozícióját is feltüntettük (bp). (Dorgai et al., 1983)
MA_DIP04.doc
35
8. FELHASZNÁLT IRODALOM
Allen, O.N. and Allen, E.K. (1981) The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation . The University of Wisconsin Press, Madison Csiszovszki, Z., Buzas, Z., Semsey, S., Ponyi, T., Papp, P. and Orosz, L. (2003) ImmX immunity region of Rhizobium phage 16-3: Two overlapping cistrons of repressor function. J Bacteriol 185: 4382-4392. Dallmann, G., Orosz, L., and Sain, B. (1979) Restriction mapping of DNA of temperate Rhizobium meliloti phage 16-3 : Comparision of genetic and physical maps indicates a long genetically silent chromosomal arm. Mol Gen Genet 176: 439-448. Dallmann, G., Marincs, F., Papp, P., Gaszner, M. and Orosz, L. (1991) The isolated Nterminal DNA binding domain of the c repressor of bacteriophage 16-3 is functional in DNA binding in vivo and in vitro. Mol Gen Genet 227: 106-112 Dorgai, L., Olasz, F., Berenyi, M., Dallmann, G., Pay, A. and Orosz, L. (1981) Orientation of the genetic and physical map of Rhizobium meliloti temperate phage 16-3. Mol Gen Genet 182: 321-325. Dorgai, L., Polner, G., Jonas, E., Garamszegi, N., Ascher, Z., Pay, A., Dallmann, G. and Orosz, L. (1983) The detailed physical map of the temperate phage 16-3 of Rhizobium meliloti 41. Mol Gen Genet 191: 430-433 Dorgai, L., Olasz, F. and Nemet, K. (1986) Lysogenic control of temperate phage 16-3 of Rhizobium meliloti is governed by two distinct regions. Mol Gen Genet 205: 568-571. Dorgai, I., Papp, I., Papp, P., Kalman, M. and Orosz, L. (1993) Nucleotide sequences of the sites involved in the integration of phage 16-3 of Rhizobium meliloti 41. Nucl Acids Res 21: 1671. Dudley, M.E., T.W. Jacobs and S.R. Long (1987) Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta 171: 289-301. Erdei, S., Dudas, B., Orosz, L. and Duda, E. (1982) Identification of structural proteins of Rhizobium meliloti temperate phage 16-3. J Gen Virol 62: 145-152. Honeycutt, R.J., M.McClelland and B.W.S. Sobral (1993) Physical map of Rhizobium meliloti 1021. J Bacteriol 175: 6945-6952. Inoue, H., Nojima, H. and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28. Ish-Horovicz, D. and Burke, J.F. (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl Acids Res 9: 2989-2998 .
MA_DIP04.doc
36
Kannenberg, E.L. and N.J. Brewin (1994) Host-plant invasion by Rhizobium meliloti:The role of cell surface components Trend Microbiol 2: 277-283. Kereszt, A., Kiss, E., Reuhs, B., Carlson, R.W., Kondorosi, A. and Putnoky, P. (1998) Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpK gene encodes for a UDPglucose dehydrogenase. J Bacteriol 180: 5426-5431. Kiss, E., Kereszt, A., Barta, F., Stephens, S., Reuhs, B., L., Kondorosi, A. and Putnoky, P. (2001) The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strainspecific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions 14: 1395-1403. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. (1982) Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. Meade, H.M. and Signer, E.R. (1977) Genetic mapping of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 2076-2078. Orosz, L. and Sik, T. (1973) Genetic mapping of rhizobiophage 16-3 Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 17: 185-194 Orosz, L., Svab, Z., Kondorosi, A. and Sik, T. (1973) Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3: Genes and functions on the chromosome. Mol Gen Genet 125: 341- 350. Papp, I., Dorgai, L., Papp, P., Jonas, E., Olasz, F. and Orosz, L. (1993) The bacterial attachment site of the temperate Rhizobium phage 16-3 overlaps the 3' end of a putative proline tRNA gene. Mol Gen Genet 240: 258-264. Petrovics, G., Putnoky, P., Reuhs, B., Kim, J., Thorp, T.A., Noel, K.D., Carlson, R.W. and Kondorosi, A. (1993) The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol Microbiol 8: 1083-1094. Putnoky, P., Petrovics, G., Kereszt, A., Grosskopf, E., Ha, D.T.C., Banfalvi, Z. and Kondorosi, A. (1990) Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J Bacteriol 172: 54505458. Putnoky, P., Deak, V., Bekasi, K., Palvolgyi, A., Maasz, A., Palagyi, Z., Hoffmann, G. and Kerepesi, I. (2004) H protein of bacteriophage 16-3 and RkpM protein of Sinorhizobium meliloti 41 are involved in phage adsorbtion. J Bacteriol 186: 15911597. Reuhs, B.L., R.W. Carlson and J.S. Kim (1993) Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2-octulosonic-acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigenes (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J Bacteriol 175: 3570-3580.
MA_DIP04.doc
37
Reuhs, B.L. (1997) Acidic capsular polysaccharides (K antigens) of Rhizobium. In Biology of Plant-Microbe Interactions. Stacey, G., Mullin, B., Gresshoff, P.M. (eds). St. Paul: International Society for Molecular Plant-Microbe Interactions, pp. 331-336. Semsey, S., Papp, I., Buzas, Z., Patthy, A., Orosz, L. and Papp, P. (1999) Identification of site-specific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol 181: 4185-4192. Semsey, S., Blaha, B., Koles, K., Orosz, L. and Papp, P. (2002) Site-specific integrative elements of Rhizobiophage 16-3 can integrate into prolin tRNA (CGG) genes in different bacterial genera. J Bacteriol 184: 177-182. Svab, Z., Kondorosi, A. and Orosz, L. (1978) Specialized transduction of a cysteine marker by Rhizobium meliloti phage 16-3. J Gen Microbiol 106: 321-327 . Szende, K. and Ordogh, F. (1960) Die Lysogenie von Rhizobium meliloti. Naturwissenschaften 47: 404-412 Wang, J., Michel, V., Hofnung, M. and Charbit, A. (1998) Cloning of the j gene of bacteriophage lambda, expression and solubilization of the J protein: first in vitro studies on the interactions between J and LamB, its cell surface receptor. Res Microbiol 149: 611-624. Werts, C., Michel, M., Hofnung and Charbit, A. (1994) Adsorption of bacteriophage lambda on the LamB protein of E. coli K12: point mutations in gene j of lambda responsible for extended host-range. J Bacteriol 176: 941-947.
MA_DIP04.doc
38
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
A diplomadolgozatom alapjául szolgáló kísérleteket a Pécsi Tudományegyetem Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Köszönettel
tartozom témavezetőmnek,
Dr.
Putnoky
Péternek
munkám
irányításáért, bizalmáért, a felmerülő problémák megoldásában nyújtott segítségéért és bírálataiért. Köszönetet szeretnék mondani a tanszéken dolgozó oktatóknak: Dr. Hoffmann Gyulának, Siposné Dr. Kerepesi Ildikónak, akik tanácsaikkal, észrevételeikkel és tapasztalataikkal hozzásegítettek dolgozatom megírásához. Hálás vagyok laboránsainknak: Miklósvári Zoltánné, Maricának és Keidl Zoltánné, Juditnak, hogy kísérleteim kivitelezéséhez megfelelő légkört és technikai hátteret biztosítottak.
MA_DIP04.doc
39
