A 16-3 bakteriofág h génje

A 16-3 bakteriofág h génje

Diplomamunka

Békási Krisztina biológus hallgató

témavezető: Dr. Putnoky Péter PTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék

Pécs, 2004.

BK_DIP04.doc

A 16-3 fág h génje - 2

TARTALOM 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. 1.1.1. 1.1.2. 1.1.3. 1.1.4. 1.2. 1.2.1. 1.2.2. 1.2.3. 1.2.4.

A 16-3 bakteriofág A 16-3 bakteriofág genetikai térképe A fágfertőzés folyamata A 16-3 bakteriofág ismert génjei A h gén lokalizálása A rhizobiumok A szimbiózisban résztvevő partnerek Endoszimbiózis Sejtfelszíni poliszacharidok A kapszuláris poliszacharidok jelentősége

OLDAL 3 3 3 4 5 6 6 7 7 10 10

2. CÉLKITŰZÉSEK

12

3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

13

3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.5. 3.6. 3.7. 3.8. 3.9. 3.10. 3.11. 3.12. 3.13.

Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Plazmid DNS izolálás Agaróz gélelektroforézis Fragmentizolálás Fehérjepreparátum készítése SDS-PAGE-hoz SDS-PAGE Ligálási reakció Kompetens sejtek készítése Transzformáció PCR DNS szekvencia meghatározás Számítógépes szekvencia analízis

4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5.

A h gén klónozása A BamHI fragment nukleotid szekvenciájának meghatározása A 3’ régió nukleotid szekvenciájának meghatározása Az 5’ régió nukleotid szekvenciájának meghatározása Host-range mutáció igazolja, hogy a feltételezett H fehérje a fágreceptor felismerésében játszik szerepet 4.6. A feltételezett H fehérje összehasonlítása az adatbázisokkal 4.7. A h gén expressziója 4.7.1. A h gén expressziós vektorba történő klónozása 5. ÖSSZEFOGLALÁS 6. FELHASZNÁLT IRODALOM RÖVIDÍTÉSEK KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

BK_DIP04.doc

13 14 14 15 16 16 16 17 17 18 18 18 19 20 20 21 24 26 28 29 30 30 33 34 38 39


1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS

1.1. A 16-3 bakteriofág A bakteriofágok a baktériumgenetika fontos eszközei, elég, ha csak az Escherichia coli - lambda fág rendszerre utalunk, mely kiemelkedő jelentőségűvé vált. Ennek mintájára a rhizobium genetikában, melynek fő célja a szimbiotikus baktériumgének megismerése,

szintén

fontosnak

tűnt

egy

megfelelő

fág-baktérium

rendszer

megismerése. A rhizobiumok számos bakteriofágja ismert. Ezek közül többel végeztek sikeresen általános vagy speciális transzdukciót. A legtöbb eredmény a Sinorhizobium meliloti törzsek fágjaival született. Ezek közül is kiemelkedik a Magyarországon használt S. meliloti 41 törzsön szaporodó 16-3 fág, amely az egyetlen részletesen tanulmányozott rhizobium fág. A 16-3 fágot a talajból izolálták Balatonberény környékén (Szende and Ordogh, 1960). A virion kromoszómája kétszálú, lineáris, 60,8 kb nagyságú molekula (Dallman et al., 1979), amely 10 bázis hosszú, 3’ túlnyúló ragadós végekkel rendelkezik. Alakjában és több molekuláris sajátságában is emlékeztet a lambda fágra és ahhoz hasonlóan egy speciális transzdukáló fág. Ismert a részletes genetikai-fizikai térképe, a represszor fehérje szerkezete, a fág és a baktérium kromoszómáján lévő att régió pontos szekvenciája,

tanulmányozták

a

fág

integrációjának

mechanizmusát.

Ennek

eredményeként egy speciális vektorcsaládot is kifejlesztettek, mely a fág int génjét és att régióját hordozza és melynek felhasználásával a legkülönbözőbb gének építhetők be az S. meliloti 41 kromoszóma att helyére (Papp et al., 1993).

1.1.1. A 16-3 bakteriofág genetikai térképe A 16-3 fág alapvető genetikai analízisét és genetikai térképezését különböző mutánsok segítségével végezték el. Az izolált, mintegy 150 ts (hőérzékeny) mutáns a fágszaporodás szempontjából korai és kései típusokra bontható. A korai és kései funkciók elkülönülését jól tükrözi a 16-3 fág genetikai térképe, szoros korreláció van a gének elhelyezkedése és működésének ideje között (Orosz et al., 1973).

BK_DIP04.doc


A géntérkép régiói a következők: att régió - int gén - avirC operátor - C cisztron avirT operátor - rekombináció gén korai ts mutációk - kései ts mutációk - farki rost és ant gén - lizozim gén. A géntérkép hossza a C cisztrontól a lizozim génig

40

térképegység hosszúságú. Elkészítették a 16-3 fág kromoszómájának fizikai térképét 13 féle restrikciós endonukleáz segítségével. Ez több, mint száz térképezett hasítóhelyet tartalmaz. Lényegesen kevesebb a 16-3 fágról szerzett ismeretanyag, mint az, ami az E. coli lambda vagy T4 fágjáról felhalmozódott. Ennek ellenére a 16-3 fág ma már a viszonylag jól ismert bakteriofágok szűk köréhez tartozik (Dallman et al., 1979; Dorgai et al., 1981; Orosz et al., 1973).

1.1.2. A fágfertőzés folyamata A fág farki rostjával a fertőzés során először a baktérium sejtfal speciális struktúráin, az ún. fágreceptorokon tapad meg. Ezt fág adszorpciónak nevezzük, mely hatékony, kalciumiont igénylő folyamat. A bakteriofágoknak kétféle szaporodási módja van. A lizogén úton a fág DNS beépül a baktérium kromoszómába és a baktérium zavarása nélkül szaporodik. A lítikus szaporodási mód drasztikusabb. Ebben az esetben egy baktériumsejtből akár 102, 103 fág keletkezik, ciklikusan elszaporodik. Lizogén útvonal esetén helyspecifikus rekombinációra van szükség ahhoz, hogy a bejutott fág DNS képes legyen integrálódni a bakteriális genomba. Az, hogy a 16-3 fág helyspecifikus rekombinációs rendszere E. coliban nem működik, arra utal, hogy a fág kromoszómába épüléséhez specifikus gazdafaktor is szükséges, amely az E. coliban nem található meg. A 16-3 helyspecifikus rekombinációs rendszer közvetlen felhasználhatóságának tehát két feltétele van, az egyik a specifikus gazdafaktor jelenléte, a másik pedig az, hogy a rekombinációs célszekvencia az adott baktérium kromoszómáján megtalálható legyen. (Semsey et al., 1999). A fág a beépülés után a baktériummal együtt replikálódik. A profágot hordozó baktérium lizogén, azaz a fágszaporodás környezeti indukció hatására következik be. A lízis során bizonyos gyakorisággal (10-5) bakteriális eredetű, cys-46 lokusz környéki kromoszómaszakasz vágódik ki, ezt a folyamatot transzdukciónak nevezzük. Kiderült tehát, hogy ez egy speciális transzdukáló fág, mert csak a baktérium egy meghatározott régiójához (attB) tud hozzákapcsolódni. BK_DIP04.doc


Egyedi cys+ transzduktáns telepekből fágot indukáltak és megvizsgálták a fág DNS restrikciós képét. Gyakran találtak stabilan transzdukáló, ugyanakkor életképtelen fágokat, amelyeket dtr-nek neveztek el. Az ilyen fág csakis helper fág jelenlétében szaporodott. A dtr fágokban a fág DNS óriási része hiányzott. A hiányzó fág DNS-t bakteriális DNS helyettesítette. A deléció/inszerció nem érinti a ragadós végeket és a replikációs origót, aminek következtében a dtr kromoszóma jól pakolódik és replikálódik. A kiesett fág funkciókat és az ezeket kódoló fág DNS szakaszokat azonosítva megállapították, hogy a Sinorhizobium meliloti DNS modifikáló aktivitással rendelkezik (Svab et al., 1978). Az érett fágrészecske elkészüléséhez minimálisan (ún. eklipsz periódus) 80 percre van szükség 28 °C-on és 65 percre 36 °C-on (Orosz et al., 1973). A fág fej 3 főbb (18,5 Kd, 31,5 Kd, 47 Kd) és 5 kisebb mennyiségben (25 Kd, 27 Kd, 50 Kd, 59 Kd, 68 Kd) polipeptid láncból épül fel, míg a farokrész 2-ből (72 Kd, 86 Kd) (Erdei et al., 1982).

1.1.3. A 16-3 bakteriofág ismert génjei A 16-3 fág legjobban ismert génje a c regulátorgén, amely a lizogén életciklus kialakításában játszik szerepet. A c gén terméke egy represszor fehérje, mely transzkripciógátló hatást fejt ki. A DNS szekvencia adatok alapján a C represszor egy 263 aminosav hosszúságú bázikus fehérje. Amino-terminális doménje egy “helix-turnhelix” DNS kötő motívumot hordoz, amely az operátorhoz való kötődésért felelős (Dallmann et al., 1991). A 16-3 fág int génje és az integráz fehérje (Int) az integrációért felelős. Az integráz fehérje C-terminális végéhez közel két tirozin oldallánc található a 334. és 346. pozíciókban. A homológia vizsgálatok alapján valószínűbb, hogy a 346-os pozícióban található tirozin oldallánc vesz részt a DNS szálak hasításában. Ezen oldallánc hidroxil csoportjának eltávolítása a fehérje rekombináz aktivitásának elvesztéséhez vezet. Ez az integráz fehérje hordozza mindazon jegyeket, amelyek a helyspecifikus rekombinázok integráz családjának tagjaira jellemzőek (Semsey et al., 1999). A 16-3 Xis fehérje 140 aminosavból áll, és számítógépes analízis szerint az Nterminálisán valószínűleg egy “helix-turn-helix” motívum található. Mérete hasonló az eddig ismert néhány hasonló fehérje méretéhez, de azokhoz számottevő szekvencia homológiát nem mutat. BK_DIP04.doc


Az attB egy olyan régió a baktérium kromoszómán, amely arra szolgál, hogy a fág integrálódhasson. A bakteriofágok helyspecifikus rekombinációjának modellje szerint az attB hely két fordított orientációjú integráz kötőhelyből áll.

1.1.4. A h gén lokalizálása Ha a baktérium felszínén megváltozik a fág receptora, de még jelen van, akkor lehet olyan fág mutánsokat izolálni, amelyek egy mutáció révén képesek ismét felismerni ezt a felszínt. Ezen fenotípust okozó változást host-range mutációnak, az érintett gént pedig h génnek nevezzük. Orosz László laborjában Palágyi Zsuzsanna határozta meg a h gén körülbelüli helyzetét marker rescue technikával, mely során h mutáns fágból klónozott DNS fragmenteket egy plazmidba. Ha a plazmidot tartalmazó baktériumon vad típusú fágokat szaporítottak el, akkor homológ rekombináció révén a fágokban megjelenhet a h mutáció. A h mutánsok nagy száma jelezte, hogy a kérdéses mutáció a klónozott DNS szakaszon helyezkedik el. Egyre kisebb DNS fragmentumokkal dolgozva, ezen az elven a pZS5 klón, amely EcoRI hasítással keletkezett, illetve a BamHI enzimmel előállított pZS10 klón (2. ábra) tartalmazta a mutációt. Így a h mutációt az 1.16 kb-os BamHI szakaszon belül lehetett lokalizálni.

1.2. A rhizobiumok A 16-3 bateriofág gazdabaktériuma a Sinorhizobium meliloti 41-es törzs, amely a Rhizobiaceae családba tartozó endoszimbionta talajbaktérium. A Sinorhizobium meliloti pálcika alakú, endospóra nélküli Gram-negatív baktérium, melynek gazdaságilag legfontosabb partnere a lucerna (Medicago sativa) (Allen and Allen, 1981). Összefoglaló néven rhizobiumoknak hívjuk az Azorhizobium, Bradyrhizobium, Mezorhizobium, Rhizobium és Sinorhizobium fajokat. A Rhizobiaceae családba tartozó baktériumfajok képesek átprogramozni bizonyos növényi differenciálódási és anyagcserefolyamatokat, ezzel biztosítva maguknak tápanyagutánpótlást a gazdanövény belsejében, valamint háborítatlan életteret.

BK_DIP04.doc


A rhizobiumok esetében az átprogramozást jelcserék sorozata határozza meg és a folyamat eredményeként egy új növényi szerv keletkezik, a szimbiotikus gümő. A szimbiózis olyan kapcsolat, melyben mindkét fél számára hasznos az együttélés, hiszen a gümő belsejébe került rhizobiumok képesek a légköri nitrogéngázt ammóniává redukálni a növénytől származó tápanyagok energiájának segítségével.

1.2.1. A szimbiózisban résztvevő partnerek A Leguminosae (hüvelyesek) családjába tartozó növényfajok valamelyikével a Rhizobiaceae

baktériumcsalád

(Bacteria,

Proteobacteria,

Alphaproteobacteria,

Rhizobales) azon tagjai alkítanak ki endoszimbiózist, amelyek nitrogénkötésre képesek (Allen and Allen, 1981). A rhizobiumok kutatásának fő célja elsősorban azoknak a bakteriális géneknek a megismerése, amelyek a szimbiózis kialakulását irányítják vagy a szimbiotikus gümő anyagcseréjében játszanak jelentős szerepet. Ebből a szempontból az egyik legjobban ismert baktérium a Sinorhizobium meliloti (régebbi nevén Rhizobium meliloti), mely a lucerna (Medicago sativa) és még néhány más pillangós virágú növény (Medicago, Melilotus, Trigonella) szimbiotikus partnere.

1.2.2. Endoszimbiózis A szimbiotikus gümő a gazdanövény gyökerén partnerspecifikus módon létrejövő új növényi szerv, melynek kialakulásához a megfelelő baktériumfaj szükséges. A növények nagy mennyiségben bocsájtanak ki szerves molekulákat a rhizoszférába. A kezdeti genetikai kísérletek is arra utaltak, hogy a nodulációs gének két csoportba oszthatók. Közös nod géneknek nevezzük a legtöbb rhizobiumban megtalálható, funkcionálisan egymást helyettesíteni tudó géneket, míg az egyes növények nodulálását befolyásoló géneket gazdaspecifitási nod géneknek nevezték el (Djordjevic et al., 1985; Fisher et al., 1985; Kondorosi et al., 1984; Truchet et al., 1985). Ez utóbbiak természetüknél fogva nem találhatók meg mindenütt egységesen. Kiderült az is, hogy ezek a gének egy diffúzibilis szignál szintézisét kódolják, amely a gazdanövény gyökerén jellegzetes változásokat hoz létre. A nod gének inducerei elsősorban flavonoid típusú molekulák (1. ábra). Nem minden rhizobium képes BK_DIP04.doc


egyformán érzékelni ezeket a jeleket, mivel a gyökér által kibocsájtott molekulák konkrét szerkezete már a gazdaspecifitást is befolyásolja (Denarie et al., 1992; Firmin et al., 1986; Peters et al., 1986; Phillips and Kapulnik, 1995). A flavonoid növényi szignálra válaszként küldött bakteriális Nod szignál elégséges a gümőfejlődés elindításához (1. ábra). Az összes eddig megismert Nod-faktor szerkezetét és a felépítésükben fontos nod gén szerepét részletesen tárgyalja több összefoglaló cikk (Denarie and Debelle, 1996; Perret et al., 2000; Spaink, 2000). A szimbiotikus gümő belsejében történik a nitrogénkötés. A rhizobiumok feladata a nitrogéngáz ammóniává redukálása során nyert nitrogén bekapcsolása a növényi anyagcserébe. A szimbiózis kialakulásának első lépéseként mikroszkóposan megfigyelhető a baktériumoknak a gyökérszőrsejtekhez történő specifikus kötődése (1. ábra).

1. ábra: A pillangósok és a Rhizobium baktériumok közötti molekuláris párbeszéd vázlatos sémája (Kondorosi and Kondorosi, 1986). Az ábra felső részén a Sinorhizobium melilotira jellemző Nod-faktor szerkezete látható, kiemelve a specifitásért felelős régiókat.

BK_DIP04.doc


A rhizobiumok többsége a gyökérszőrökön keresztül jut be a növény belsejébe. A szomszédos fertőzési helyek távolsága és a növény fiziológiai állapota befolyásolja a fertőzés kimenetelét. Miután a baktériumok megtapadnak, a gyökérszőrsejt növekedése a csúcsról áthelyeződik a baktériumokkal szembeni oldalra majd jellegzetesen meggörbül. A fertőzés pontján leépül a régi sejtfal és kialakul egy csőszerű képlet az újonnan lerakódó belső sejtfal folyamatos növekedése révén. Ez a képlet az infekciós fonal, mely bejutási útvonalat bíztosít a baktériumok számára a gyökérszőrsejt belsejébe. Ezt követően a baktériumok a növekedő és elágazódó infekciós fonalon keresztül fertőzik meg a gümősejteket. Néhány pillangósvirágú növénynél a fertőzés kevésbé specifikus módon, az oldalgyökér-kiágazódásoknál található nyílásokon keresztül megy végbe (Newcomb, 1981). A gyökér belső kéregsejtjei között, a fertőzési ponttól sok sejtrétegnyi távolságra dedifferenciáció,

mitózis

figyelhető

meg

(gümőprimordium),

mely

során

gümőmerisztéma, egy új osztódó szövet keletkezik (1. ábra). A fertőzés után néhány nappal már mikroszkóppal látható kidudorodás jelenik meg a gyökér felszínén, melynek merisztematikus zónájában sokszorosan elágazódó infekciós fonalak figyelhetők meg. Később infekciós fonal végződik a legtöbb proximális merisztémasejtben, majd a baktériumok elözönlik ezeket a sejteket (Dudley et al., 1987). Mitotikus aktivitása több hétig megmarad a merisztémának. A gümő kéregrészében szállítónyalábok húzódnak, majd ezeken keresztül jutnak a gümőbe a különböző fotoszintátok és a kötött nitrogén a növény többi részébe aminosavak formájában. A gümő jellegzetes szövettani zónái: a gümőmerisztéma, a korai és késői szimbiotikus zóna, valamint az öregedési zóna. A többféle gümőtípus között a különbség a morfológiai felépítésben, a fertőzés stratégiájában és a merisztematikus aktivitásban van (Newcomb, 1981; Vasse et al., 1990). A két leggyakoribb ilyen típus az indeterminált, valamint a determinált gümő. A fent leírtak leginkább az ún. indeterminált gümő kialakulására és felépítésére vonatkoznak. Ennél a gümőtípusnál a gümőmerisztéma hosszabb ideig, folyamatosan működik. A másik jellegzetes forma a determinált gümő, melynél viszonylag rövid ideig aktív a merisztéma. A mai fő kutatási irányok e két gümőtípust létrehozó pillangós-rhizobium kapcsolatra orientálódnak (Cook, 1999; Stougaard, 2001). A baktériumok endocitózis segítségével kerülnek be a gümősejtekbe oly módon, hogy az infekciós fonal sejtfal nélküli végénél a növényi sejtmembrán befűződései egy vagy több baktériumot magában foglaló vezikulummá alakulnak, mely így egy külön BK_DIP04.doc


membránnal (peribakteroid membrán, PBM) van körülvéve. A sejt belsejébe került baktériumok további osztódásokat követően fiziológiai, majd morfológiai változásokon mennek

keresztül

és

ún.

bakteroidokká

sejtorganellumként

is

felfogható,

alakulnak.

amelyet

a

A

bakteroid

növény

a

időleges

felhasználható

nitrogénvegyületeknek hiányában importál a környezetéből. A

fertőzött

sejtekben

intenzív

fehérjeszintézis

és

anyagcsere

folyik,

membránfelületük 20-40-szer nagyobb, mint a fertőzetleneké. A legnagyobb mennyiségben előforduló növényi szimbiotikus fehérje a leghemoglobin, mely egyrészt biztosítja a megfelelő oxigénszegény (mikroaerob) környezetet az oxigénre érzékeny bakteriális nitrogenáz enzim működéséhez az oxigén megkötése révén, másrészt a bakteroidban zajló fokozott respirációhoz szállítja az oxigénutánpótlást (Appleby, 1984). Így a gümő belsejében a szabad oxigén koncentrációja akár százezred része is lehet (3-30 nM) a szokásos módon növesztett baktériumkultúrában található mennyiségnek (kb. 250 mM).

1.2.3. Sejtfelszíni poliszacharidok A

szimbiózis

poliszacharidoknak,

kialakításában melyeken

fontos belül

szerepük

van

rhizobiális

lipopoliszacharidokról

(LPS),

sejtfelszíni kapszuláris

poliszacharidokról (KPS) és exopoliszacharidokról (EPS) beszélünk.

1.2.4. A kapszuláris poliszacharidok jelentősége Szende Kálmán izolálta és kezdte el vizsgálni a S. meliloti 41 törzset (RM41) mely a magyarországi rhizobiumkutatás kiindulópontja volt (Szende and Ordogh, 1960). Kondorosi

Ádám

és

társai

ebből

a

törzsből

izoláltak

egy

“kompakt”

kolóniamorfológiával rendelkező, nem mukoid törzset (AK631), amely szintén képes volt szimbiózisra a lucernával (Banfalvi et al., 1981). A további genetikai munkák kiindulópontja az AK631 lett. A későbbiekben kiderült, hogy az AK631 egy exoB mutáns, amelyet az inváziós folyamatban az exopoliszacharid helyett egy másik felszíni poliszacharid segít (Putnoky et al., 1990).

BK_DIP04.doc


A kezdetekben ez az anyag liposzacharidnak tűnt a genetikai és biokémiai vizsgálatok alapján (Brzoska and Signer, 1991; Putnoky et al., 1990). Később kiderült, hogy kapszuláris poliszacharid (KPS), és így egy KPS-bioszintézisben szerepet játszó géncsoportot sikerült azonosítani a “nemtermelő”, Inf⎯ mutánsok segítségével (Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). A KPS szerkezete, bioszintézise és a megfelelő gének jellemzése a különböző humánpatogén E. coli, Salmonella, Neisseria, Haemophilus, illetve a növénypatogén Pseudomonas és Erwinia törzsek vizsgálata révén váltak leginkább ismertté (Boulnois and Roberts, 1990; Jann and Jann, 1990; Roberts, 1996; Whitfield and Roberts, 1999). A kapszuláris poliszacharidok a baktériumok felszínéhez kötöttek, és szintén erős immunogének lehetnek, ezért K-antigéneknek is nevezik őket. A különböző E. coli törzsek több, mint 80-féle K-antigént termelnek. Rhizobiumoknál elsők között R. Carlson laboratóriumából számoltak be a KPS jelenlétéről és kezdeti jellemzéséről egy R. fredii és a S. meliloti 41 törzs vizsgálata kapcsán. Kimutatták, hogy a S. meliloti 41 törzs egy törzsspecifikus poliszacharidot termel, amely felípétésében hasonló az E. coli törzseknél ismert II. típusú K-antigénekhez. Ezt a poliszacharidot KR5 antigénnek nevezték el (Reuhs et al., 1993). Érdekes példáját adták a S. meliloti 41 törzsnél kapott eredmények annak, hogy helyettesítheti egymást két felszíni poliszacharid az invázió folyamatában. Ennél a törzsnél képesek hatékony szimbiózist kialakítani a lucernával mind az exoB (EPS¯, nemtermelő), mind a különböző rkp (KPS¯, nemtermelő) mutánsok, és Inf¯ fenotípust csak az exoB/rkp (EPS¯, KPS¯) kettős mutánsok mutatnak (Putnoky et al., 1990). A megvizsgált gazdanövények egyaránt képesek a csak szükcinoglükánt vagy csak KR5 antigént termelő törzsek fertőzésére (Putnoky et al., 1990), de azok a mutánsok, amelyek csak galaktoglükánt termelnek, egyedül a lucernát tudják fertőzni (Glazebrook and Walker, 1989).

BK_DIP04.doc


2. CÉLKITŰZÉSEK A fágrezisztenciát okozó baktériummutációk és a mutáns baktériumon izolálható host-range fágmutációk elemzése bepillantást ad a felismerési mechanizmusok molekuláris természetébe. Korábbi eredmények alapján a KR5 antigént érdemesnek tartottuk arra, hogy segítségével olyan, különleges mutációkat keressünk, vizsgáljunk, amelyek a fág-baktérium és a növény-baktérium felismerési folyamatokat egyaránt befolyásolják, hiszen azt feltételeztük, hogy a KR5 antigénnek mind a szimbiózisban, mind a 16-3 fág fertőzésében fontos szerep jut (Putnoky et al., 1990). Korábbi munkákban feltételezték, hogy a fág receptora ez a törzsre jellemző KPS. Célul tűztük ki a fágreceptor természetének tanulmányozását, így fágreceptor mutáns baktériumok és host-range fágmutánsok azonosítását és jellemzését. Kiindulási feltételezésünk az volt, hogy a fágreceptor vizsgálata által a fág-baktérium kapcsolat és a baktérium-növény kapcsolatról is többet tudhatunk meg. E munkában feladatunk a bakteriofág vizsgálata volt. Valójában a 16-3 fág azért érdekelt minket, mert segítségével KPS-bioszintézis hibás mutánsokat lehet előállítani. Feltételeztük, hogy ez a speciális KPS a fágreceptor, ezt a kölcsönhatást kezdtük tanulmányozni. A 16-3 fág egy host-range mutációjának izolálása és térképezése már hosszú évekkel ezelőtt megtörtént (Orosz and Sik, 1970; Orosz et al., 1973), de a további vizsgálatok elmaradtak. Ezért fogtunk bele tehát egy új mutánsizolálási kísérletbe. Az én feladatom volt annak a DNS szakasznak a klónozása, aminek a területén belül található az eredetileg meghatározott h mutáció, valamint olyan szubklónok készítése, amelyek alkalmasak a szekvencia leolvasására. A továbbiakban a meghatározott szekvenciát elemeztük bioinformatikai eszközökkel. Velem párhuzamosan végezte Maász Anita a h mutáns fágok izolálását és ezek feltérképezését, valamint tulajdonságainak megállapítását.

BK_DIP04.doc


3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 3.1. Baktériumtörzsek, bakteriofágok és plazmidok Jellemzők Baktériumtörzsek AK631

RM41; exoB631; Nod +;Fix+

RM41

E. coli K12, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44, relA1, lacZ∆M15 (Strategene USA) + + + S. meliloti 41 vad típusú (Exo , Nod , Fix ) (Putnoky et al., 1990)

GH4046

RM41 rkpM4046 (Hoffmann Gyula)

GH4178

RM41 rkpM4178 (Hoffmann Gyula)

GH4180

RM41 rkp-4180 (Hoffmann Gyula)

XL1-Blue

Bakteriofágok 16-3

S. meliloti 41 baktériumtörzsre specifikus vad típusú fág (Orosz L.)

16-3 h5

16-3 fág, host-range mutáns

16-3 h15

16-3 fág host-range mutáns

16-3 h109


16-3 h111


16-3 h114


Plazmidok pBS

pBluescript II SK (+), AmpR, klónozó vektor, (Stratagene USA)

pDH1

pLAFR1 kozmid 16-3 fág klón, h régió, (Papp P.)

pSEM91 pBM4128

Rhizobiumban is működő expressziós vektor, Km, (Semsey et al., 1999) pBS::16-3 fág EcoRI D frg.; ori2, Amp

pBM4129

pBS::16-3 fág EcoRI D frg.; ori1, Amp

pBM4135

pBS::16-3 fág 1.16 kb BamHI frg. (feltételezett h gén), Amp

pBM4144

pBS::16-3 fág 3.1 kb PstI frg.; ori1 (feltételezett h gén), Amp

pBM4145

pBS::16-3 fág 3.1 kb PstI frg.; ori2 (feltételezett h gén), Amp

pBM4146

pBS::16-3 fág 1.6 kb XhoI frg.; ori1 (feltételezett h gén), Amp

pBM4147

pBS::16-3 fág 1.6 kb XhoI frg.; ori2 (feltételezett h gén), Amp

pBM4137

pBM4146; EcoRV deléció, Amp

pBM4138

pBM4146; EcoRV deléció, Amp

pBM4148

pBM4145; BamHI deléció; ori2

BK_DIP04.doc


pBM4153

pBM4146; EheI-SmaI deléció

pBM4238

pSEM91, h régió, (SphI-StuI), Km

pBM4239


pBM4240


3.2. Baktériumok és bakteriofágok szaporítása Az E. coli törzseket LB komplett táptalajon, a megfelelő antibiotikum jelenlétében 37 °C-on, a S. meliloti törzseket pedig TA komplett táptalajon, 32°C-on növesztettük. Az LB tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton, 5 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl (pH 7,0). A TA tápfolyadék komponensei: 10 g/l Bacto trypton, 1 g/l Yeast extract, 5 g/l NaCl, 1mM MgSO4, 1mM CaCl2 tartalmú (pH 7,2). Táptalaj esetében 1.5 % agarózzal egészítettük ki a tápoldatot. A szilárd táptalajokban alkalmazott antibiotikum koncentrációk a következők: ampicillin: 200 µg/ml, tetraciklin: 15 µg/ml. Tetraciklin koncentrációja folyékony táptalajban: 5 µg/ml. Kanamicin koncentrációja E. coli törzseknél 30 µg/ml (7.5 mg/ml), S. meliloti törzsek esetén 200 µg/ml (50 mg/ml). A bakteriofág szaporításakor 4 ml TA tápoldatot és 0.2 ml megfelelő éjszakán át rázatott baktérium kultúrát (friss) összekevertünk, majd elhelyeztünk benne egy fágplakkot. A szaporítást egy éjszakán át, 32 °C-on, erős rázatás mellett végeztük.

3.3. Plazmid DNS izolálás A plazmidot 3-3 ml TA tápfolyadékban egész éjszakán át növesztett sejtekből preparáltuk (Ish-Horovicz and Burke, 1981). 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe mértünk és a sejteket ülepítettük centrifugálással, majd felszuszpendáltuk 100 µl TEG oldatban (25 mM TrisHCL, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz pH 8,0). Óvatos keverés mellett 200 µl NS oldat (0,2N NaOH, 1% SDS) hozzáadásával történt a feltárás. A mintákat 5 percig jégen (0°C) inkubáltuk, majd 160 µl 0°C-os Na-acetát oldatot (3M, pH 4,8) adtunk az elegyhez. A keletkezett csapadékot 5 perc, 0°C-os inkubáció után centrifugáltuk. Minden centrifugálást 12.000 fordulatszámon 5 percig végeztünk.

BK_DIP04.doc


A felülúszóból 320 µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS mintákat. 10 perc 20°C-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, mostuk (400 µl 70%-os etanollal) és szárítottuk. A csapadékot 100 µl Tris-pufferben (50 mM TrisHCL, 100 mM Naacetát, pH 8,0) oldottuk fel, majd 200 µl 96%-os etanollal ismét kicsaptuk. 10 perc 0°Cos inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, szárítottuk, majd kozmidok esetén 30 µl, pBluescript esetén 50 µl RNáz tartalmú oldatban (10 mg/ml) vettük fel. Szekvenálás esetén a plazmid DNS izolálás után még egy extra tisztítást alkalmaztunk. A mintákhoz 0.1 térfogat 10%-os SDS-t és 1 térfogat. 7.5 mólos NH4acetátot (0°C-os) mértünk, majd alapos összerázás után 15 percig jégen inkubáltuk őket. A keletkezett csapadékot centrifugáltuk és a felülúszóból 0.6 térfogat izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS mintákat. 20 perc -20ºC-os inkubáció után a csapadékot lecentrifugáltuk, mostuk (400 µl 70%-os etanollal) és szárítottuk. A DNS-t 40 µl desztillált vízben vettük fel.

3.4. Agaróz gélelektroforézis és restrikciós endonukleázok alkalmazása A tisztított DNS-ből 0,2-0,5 µg-ot használtunk fel restrikciós emésztésekhez. A mintákat 1-2 U mennyiségű FERMENTAS enzim jelenlétében 1-2 óráig 37 °C-on inkubáltuk. Az emésztés végén a reakcióelegybe 1/5 rész mintafelviteli puffert mértünk (5xSTOP: 10 % ficoll; 0,25 M EDTA; pH 8,0; 0,2 % brómfenolkék). A restrikciós enzimekkel hasított minták fragmentjeit agaróz gélen választottuk el. Az agarózt 1xTBE pufferben (10.8 g TRIS, 5.5 g bórsav, 0,1 M EDTA, pH 8,0/1000ml) oldottuk fel. Majd a feloldódást követően etídium-bromidot mértünk bele, melynek végkoncentrációja : 0.1 µg/ml. Kis fragmentek (200-500 bp) esetén 1,3-1,5 %-os gélt, nagy fragmentek elválasztására 0,7-0,8 %-os gélt használtunk. Ezután a mintákat TBE pufferben, a gél dimenziójától függően 60-120 V-on, fragmentizolálás esetén 20-40 V-on választottuk el. A kiértékelést UV fény segítségével végeztük.

BK_DIP04.doc


3.5. Fragmentizolálás A

megfelelő

restrikciós

enzimmel

hasított

fragmenteket

elektroforézissel

szétválasztottuk. Az izolálni kívánt fragment elé bevágtunk és a gélbe Whatman DE 81 papírt helyeztünk. 20 perces 60V feszültség mellett történő további elektroforézis után a papírról a DNS fragmentet 2×50 µl 1M NaCl oldattal távolítottuk el. A DNS-t 0.1 térfogat 3 M Na-acetát oldat (pH 7,0) és 80 µl izopropanol hozzáadásával kicsaptuk. 20 perces -20°C-os inkubáció után centrifugáltuk, szárítottuk és 20 µl desztillált vízben feloldottuk a csapadékot.

3.6. Fehérjepreparátum készítése SDS-poliakrilamid gélelektroforézishez Éjszakán át rázatott rhizobium kultúrát huszadára visszahigítottuk (10 ml táptalaj + 0.5 ml baktérium + megfelelő antibiotikum). 37 ˚C-os rázóban 90 percig rázattuk, törzsenként 2-2 lombikot indítva. Egyikbe beletettük az IPTG-t (23 mg/ml), majd minden kultúrát továbbnövesztettük. Az indukció után 4 órával megmértük az OD-kat. OD mérés után 1.5 ml-t lefugáltunk minden törzsből. A kapott OD értékek függvényében oldottuk fel a mintákat: 0.5 OD-ra 50 µl desztillált vizet adtunk. Ezt követően ugyanannyi µl mintafelviteli puffert (2xSTOP-ot) adtunk hozzá, mint amennyi desztillált vízbe felvettük a baktériumot. Az eppendorf csöveket 10 percre 95˚C-ra raktuk, majd a mintákat felhasználásig +5˚C-on tároltuk.

3.7. SDS-PAGE (poliakrilamid gélelektroforézis) Futtató gél (15 ml) :6 ml 30 % akrilamid/biszakrilamid, 5.625 ml 1 M-os pH 8.8-as TRIS, 0.3 ml 5 %-os SDS, 3.075 ml desztillált víz, 6-8 mg APS, 15 µl TEMED Tömörítő gél (5 ml):0.83 ml 30 % akrilamid/biszakrilamid, 0.625 ml 1 M-os pH 6.8-as TRIS, 0.1 ml 5 %-os SDS, 3.5 ml desztillált víz, 8 mg APS, 10 µl TEMED

BK_DIP04.doc


Mintafelvitel előtt a mintákat 90˚C-ra raktuk. Ezután a gélt glicin pufferben 30 mAen előfuttattuk, majd a mintákat a tömörítő fázison 20 mA-en, majd a szeparáló fázison 40 mA-en választottuk el. A gélfestéshez 0.2 %-os Coomassie kék festéket használtunk. Az éjszakán át festett gélt mosópufferben mostuk, melynek összetétele a következő: 10 % metanol, 30 % ecetsav, desztillált víz.

3.8. Ligálási reakció A ligálási elegyet vektor DNS oldat, fragment DNS oldat, 5× ligáz puffer (500 mM TrisHCL, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, pH 7,6) és desztillált víz felhasználásával állítottuk össze. A reakcióhoz higított T4 DNS ligázt használtunk (4µl T4 DNS ligáz -1 weiss U/µl- és 200 µl T4 DNS ligáz puffer) és az elegyet legalább 1 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk. A ligálási reakciót 15 µl végtérfogatban végeztük, 5 µl DNS-t mértünk bele.

3.9. Kompetens sejtek készítése A kompetens sejtek készítéséhez E. coli XL1-blue törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, pH 7,0) éjszakán át 18-22°C-on 0.5-0.6-os OD-ig (OD600) növesztettük a baktériumkultúrát, majd 10 percre jégre tettük, ezután mindig 0°C-on dolgoztunk. A sejteket 10 perces centrifugálással (4000 rpm) gyűjtöttük össze, majd 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl, pH 6,7) szuszpendáltuk fel. 10 percig jégen inkubáltuk, majd centrifugáltuk és 20 ml 0°C-os TB pufferben szuszpendáltuk. A szuszpenzióhoz 1,5 ml dimetil szulfoxidot (DMSO) adtunk, a sejteket Eppendorfcsövekbe szétosztva fagyasztottuk és transzformációig -80°C-on tároltuk (Inoue et al., 1990).

BK_DIP04.doc


3.10. Transzformáció 100 µl kompetens sejtet használtunk fel egy transzformáláshoz. A sejteket -80°C-ról jégre tettük és 15 perc elteltével hozzáadtuk a transzformációhoz ligált DNS-oldatot. 30 percig jégen inkubáltunk, majd 2 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 500 µl SOC oldatot (2% Bacto trypton, 0,5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 20 mM glükóz, pH 7,0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os inkubáció után a sejteket szelektív táptalajra szélesztettük. A táptalajba pBluescript használata esetén 40 µl IPTG (100 mM) és 40 µl Xgal oldatot (2% dimetil-formamidban) tettünk és a fehér (inszertet tartalmazó) telepekkel dolgoztunk tovább (Inoue et al., 1990).

3.11. PCR (polimeráz láncreakció) A reakcióelegy 25 µl végtérfogatába 1 µl 100x-osára higított templát DNS-t, 1-1 µl oligonukleotid primert (20µΜ), 6 µl 4x PCR mixet (40 mM TRIS - pH:8.8, 20 mM KCl, 0,32 % Nonidet P40, 0.8 mM dNTP), 15 µl tridesztvizet, 1 µl Taq polimeráz enzimet (2-5 U) mértünk. A kisérletet a következő programmal végeztük: 1. 94°C 2 perc; 2. 94°C 5. 35 x GO TO 2; 6. 25°C

30 mp; 3. 65°C 1 perc; 7. END

30 mp; 4. 72°C

1 perc;

A PCR során az alábbi oligonukleotid primereket használtuk: h31 h51 h32 h52 h33 h53

GCGGGCTGCAAAATCCAGA CAACTGCCGCGGAGATGG CCGCCAGAAACGACTTCC GCCATTGCCCGATGAGG TCACCAACCGCCGAATGCTC AGTTCGGCGCCATCCACGAC

3.12. DNS szekvencia meghatározás A munkánk során tisztított plazmid DNS minták és PCR fragmentumok nukleotid szekvenciáját, a megfelelő oligonukleotidok segítségével a MTA Szegedi Biológiai Központ DNS Szekvenáló Laboratóriumában határozták meg.

BK_DIP04.doc


3.13. Számítógépes szekvencia analízis A kapott DNS részszekvenciákat számítógép segítségével összeillesztettük és megvizsgáltuk mind a hat leolvasási keretben a kódoló kapacitásukat (LaserGene programcsomag, DNA Star Inc., USA). A feltételezett h gén által kódolt fehérje szekvenciáját a BLAST program segítségével (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) hasonlítottuk össze a nem redundáns (nr) fehérje adatbázissal. A feltételezett h gént tartalmazó szekvenciát beküldtük az EMBL nukleotid szekvencia adatbázisba. A szekvencia regisztrációs száma: AJ567376

BK_DIP04.doc


4. KÍSÉRLETI EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK

4.1. A h gén klónozása A 16-3 fág egy host-range mutációjának a körülbelüli helyzete a bakteriofág genetikai térképén már ismert volt. Orosz László munkacsoportjától megkaptuk a pDH1 kozmid klónt, mely a 16-3 genom jelentős részét tartalmazza és hordozza a feltételezett h gén környezetét (2. ábra). A h mutációt a 6,19 kb nagyságú EcoRI fragment (D EcoRI fragment) területére eső 1,16 kb BamHI fragmenten belül azonosították, ezért első feladatunk volt, hogy izoláljuk ezt a fragmentet.

2. ábra: h mutáció elhelyezkedése a 16-3 fág fizikai térképén (Semsey et al., 1999).

A fizikai térkép alapján tudtuk, hogy a D EcoRI fragmentet közel azonos molekulatömege miatt nem lehet elválasztani a C EcoRI fragmenttől (3. ábra). A két fragmentet együtt izoláltuk, és ligálás majd transzformálás után külön azonosítottuk az EcoRI-EcoRV emésztési mintázat alapján a D EcoRI fragmentet hordozó klónokat. A kiválasztott klónokat XbaI emésztés segítségével még egyszer ellenőriztük. Ez az emésztés egyértelműen azonosította a kérdéses fragmentet, mivel XbaI hely a C EcoRI fragmenten nem található. A XbaI és EcoRV emésztések segítségével már a beépült DNS-szakasz orientációját is meg lehetett határozni. Ezek után a D EcoRI klónt hordozó plazmidból már könnyen izolálni és klónozni tudtuk az 1,16 kb nagyságú BamHI fragmentet. EcoRV emésztéssel meghatároztuk a BamHI fragment mindkét orientációját (pBM4128, pBM4129).

BK_DIP04.doc


A pBM4128 esetén a vektor multiklónozó régiójában lévő EcoRV hasítóhelyhez közelebb helyezkedik el az inszerten lévő EcoRV hely, a pBM4129 esetében pedig távolabb.

3. ábra: A D EcoRI fragment helyzete a 16-3 fizikai térképén. Az ábra felső részén a 16-3 kromoszóma EcoRI restrikciós hasítóhelyei vannak kezdőbetűikkel jelölve. Az alsó részen a D EcoRI fragment részletesebb fizikai térképe látható, melyen a számozás a restrikciós hasítóhelyek pozíciójára utal a 16-3 fág publikált fizikai térképén (Semsey et al., 1999).

4.2 Az 1,16 kb hosszúságú BamHI fragment nukleotid szekvenciájának meghatározása Az izolált BamHI fragment túl hosszú volt (1.2 kb) ahhoz, hogy egy-egy szekvenálási reakcióval mindkét irányból meg lehessen határozni a bázissorrendjét. Ezért különböző szubklónokat készítettünk belőle, amelyek segítségével körülbelül 500 bp hosszúságú leolvasásokból össze tudtuk állítani a teljes szekvenciát.

BK_DIP04.doc


A 4. ábra szemlélteti, hogy az EcoRV hasítóhely nagyjából a BamHI fragment közepén helyezkedik el, így alkalmasnak látszott arra, hogy az EcoRV restrikciós emésztés segítségével szubklónokat készítsünk. Mivel a vektor klónozó helyén is volt egy EcoRV hasítóhely, ezért a kétféle orientációjú BamHI fragmentet tartalmazó plazmidokból (pBM4128, pBM4129) további szekvencia meghatározásokra alkalmas deléciós származékokat tudtunk készíteni. E deléciók létrehozására azért volt szükség, hogy a klónozó hely területén található szekvenáló primer-helyhez közelebb legyen a szekvencia meghatározásra kiszemelt régió. Az EcoRV hasítóhely körüli szekvencia meghatározásához klónoztuk továbbá az 1,6 kb nagyságú XhoI fragmentet is (pBM4129). A XhoI fragmentet SacI restrikciós endonukleázzal emésztve igazoltuk a kétféle orientációt (pBM4146, pBM4147).

4. ábra: A BamHI fragment nukleotid szekvenciájának meghatározása. Az ábra felső részén a D EcoRI fragment fizikai térképe látható. Az egyes hasítóhelyek pozícióját is feltüntettük. Az alsó részen a nyilak a szekvenálási reakcióban leolvasott részszekvenciákat jelképezik, melyeket a szövegben részletezett szubklónok segítségével kaptunk (pBM4128, pBM4129, pBM4144, pBM4145, pBM4146, pBM4147, pBM4153).

Mindezek eredményeképpen a részszekvenciákból már a teljes BamHI fragment pontos nukleotid szekvenciáját meg lehetett állapítani (5. ábra). Hogy a h gént vagy annak részletét azonosítsuk a meghatározott 1157 bázispáron belül, először megvizsgáltuk, milyen nyitott leolvasási keretek találhatók ezen a szakaszon. Egyetlen esetben a teljes meghatározott szekvencián keresztül húzódik egy nyitott leolvasási keret (ORF-open reading frame, 5. ábra).

BK_DIP04.doc


Valószínűnek tartottuk, hogy a H fehérje aminosav sorrendjét ez az ORF határozza meg. Nem találtuk azonban meg a transzlációs stop kodont a szekvencia 3' végén és 5' irányban sem volt biztosan megallapítható az ORF eleje, mert nem találtunk stop kodont, ami jelezte volna az ORF maximális kiterjedését. Így az ORF legvégső határait az 5' végen sem lehetett biztosan megállapítani. Tehát a megismert DNS szakasz nem tartalmazza a gén végét, de feltételezhetően az elejét sem. Ezért meg kellett határoznunk mindkét irányban a szomszédos régiók nukleotid sorrendjét is.

5. ábra: A BamHI fragment nukleotid szekvenciája Az ábrán az egyetlen előforduló nyitott leolvasási keret által meghatározott fehérjeszekvencia-részletet is feltüntettük. A másik öt lehetséges leolvasási keretben több helyen is előfordultak stop kodonok.

BK_DIP04.doc


4.3. A 3’ régió nukleotid szekvenciájának meghatározása Az 1.6 kb-os XhoI fragmenten (pBM4146) belül található BamHI-BamHI fragmentben (pBM4135) lévő EheI hely felhasználásával deléciót készítettünk és a XhoI fragment elejének kiejtése után határoztuk meg a (36)BamHI hely szekvenciáját a T3-as primertől a (37) EcoRI hasítóhely felé (3’ irányba). Az így kapott deléciós származék a pBM4153. PruII emésztéssel ellenőriztük a deléció meglétét. Ezt követően a szekvenciát mindkét szálon, mindkét irányban az StuI hasítóhelyig pontosan meghatároztuk (6.ábra).

6. ábra: A szekvencia meghatározás kiterjesztése 3’irányba. Az ábra felső részén a D EcoRI fragment fizikai térképe látható, alsó részén a nyilak a szekvenálási reakcióban leolvasott részszekvenciákat jelképezik. A korábban meghatározott DNS szakaszt a feltüntetett hasáb jelzi.

A meghatározott szekvenciák öszeillesztése után kiderült , hogy az ORF továbbhalad a BamHI helytől a körülbelül 300 bp távolságra lévő TAA transzlációs stop kodonig, mely a kódoló régió végét jelenti (7. ábra). Találtunk egy transzkripció terminációs szignálszerű szekvenciát is, amely az mRNS átíródásának leállítását jelzi. Ez a struktúra fordítottan ismétlődő részeket tartalmaz, melyek a mRNS molekulában összekapcsolódnak és a közöttük elhelyezkedő bázisok hurkot képeznek. Ennek a szignálnak a jelenléte alátámasztja azon feltételezésünket, hogy ténylegesen ez a h gént kódoló régiónak a vége.

BK_DIP04.doc


7. ábra: Az 1,16 kb BamHI fragmenttől 3’ irányba eső DNS szekvencia. A feltételezett H fehérjét kódoló leolvasási keret ebben a régióban egy stop kodonnal fejeződik be (kék sávval jelölve). A stop kodon után mintegy 30 bpral egy feltételezett transzkripció terminációs szignál található (amit a nyíl és a vastag szakasz jelez).

BK_DIP04.doc


4.4. Az 5’ régió nukleotid szekvenciájának meghatározása A (32)PstI - (34)BamHI hasítóhelyek közötti szekvencia meghatározása céljából izoláltuk a PstI fragmentet a D EcoRI fragment 1-es orientációját tartalmazó pBM4129 plazmidból. Ezt az izolált fragmentet tartalmazó klónt EcoRI restrikciós enzimmel emésztve meg tudtuk határozni a (34)BamHI hasítóhely környékének szekvenciáját is. A 2-es orientációjú BamHI deléciós származékra (pBM4128) azért volt szükség, hogy a (34)BamHI helytől a (32)PstI hasítóhelyig meghatározzuk a szekvenciát (8. ábra).

8. ábra: A szekvenciameghatározás kiterjesztése 5’ irányba. Az ábra felső részén a D EcoRI fragment fizikai térképe látható. Az alsó részen a nyilak a szekvenálási reakcióban leolvasott részszekvenciákat jelzik.

A feltételezett h gén elejének pontos bázissorrendjét a 9. ábra mutatja. Az új szekvencia értékelésekor felvetődött a kérdés, vajon honnan kezdődik a h gén. Többféle lehetőség is adódhat. Tudjuk, hogy a legtöbb esetben ATG start kodonnal kezdődik a fehérjekódoló régió. A h régió 5' végén viszont még több mint 300 bp kódoló kapacitás van stop kodon nélkül, az első ATG előtt. Elképzelhető ezért, hogy a kódoló régió-nem szokványos módon-jóval az első ATG előtt kezdődik. Transzlációs kezdetként az itt található “in frame” GTG, de a TTG vagy CTG kodonok is szóba jöhetnek. A 16-3 fág eddig megismert génjei esetében két ATG-től eltérő iniciátor kodon létét bizonyították a géntermék N-terminális aminosavainak meghatározásával. Az int gén GTG

míg az immX régió egyik kódoló szekvenciája CTG kodonnal kezdődik

(Csiszovszki et al., 2003).

BK_DIP04.doc


A S. meliloti genomban a feltételezett fehérje kódoló régiók 6.2 %-os gyakorisággal TTG kodonnal kezdődnek (Capela et al., 2001). A feltételezett H fehérje szekvenciájának meghatározásához mi az első “in frame” TTG kodont használtuk. Ez a kodon a meghatározott DNS-szekvencia 85. bázisánál kezdődik, és megelőzi egy GGAG motívum, ami riboszóma-kötőhelyként szolgálhat. A 9. ábrán látható, hogy több lehetséges start kodon is megelőzi az "első" ATG kodont. Azt, hogy melyik a valós kezdőpont, a H fehérje termeltetése, és N-terminális aminosav sorrendjének meghatározása révén szeretnénk bizonyítani.

9. ábra: A feltételezett h gén 5’ végének szekvenciája. Az ábrán az adott ORF-ben található egyetlen stop kodon (TGA) után kezdődő fehérjeszekvenciát tüntettük fel. Ettől kezdve a kódoló kapacitás, a feltételezett h gén, egészen az előzőekben ismertetett 3’ végig tart (7. ábra). A lehetséges start kodonokat bekereteztük. Az első ATG kodont kék sáv jelzi.

BK_DIP04.doc


4.5. Host-range mutáció igazolja, hogy a feltételezett H fehérje a fágreceptor felismerésében játszik szerepet Maász Anita munkájának eredményei alátámasztották, hogy ez a feltételezett gén valóban a H farki rost fehérjét kódolja, mert szerepe van a gazdaspecifitás (host-range) meghatározásában. Azt vártuk, hogy a h génben és az általa kódolt fehérjében olyan változás alakuljon ki, amivel a fág alkalmazkodni tud a fágreceptor mutáns baktérium felszínéhez. Kísérletei során a fágreceptor mutáns GH4046 baktériumon a vad típusú fágpopuláció egy töredéke “visszanyerte” fertőzőképességét, mert ezek a fágok egy host-range mutációt hordoznak a farki rostot meghatározó génben, és ez teszi lehetővé a megváltozott RkpM4046 receptorfehérje felismerését. Két, random kiválasztott mutáns fág izolálása után célja a mutáns allélok (h5, h15) pontos szerkezetének felderítése volt. Mindkét allél esetében missense mutációt talált a feltételezett H fehérjét kódoló régióban. Ahol a vad típusú fág esetében GGC, azaz glicint kódoló triplet volt, ott a mutánsokban GAC kodont talált, ami aszparaginsavat határoz meg. A h5, h15 allélokban lévő missense mutáció bizonyítja, hogy a feltételezett h gén által kódolt fehérje szerepet játszik a fágreceptor felismerésében. Az aminosavcsere helye arra utal, hogy a kódolt fehérje C-terminális része fontos szerepet tölt be ebben a folyamatban (Maász Anita diplomamunkája, 2004). Korábbi eredmények alapján azt feltételezték, hogy a KR5 antigénnek mind a szimbiózisban, mind a 16-3 fág fertőzésében fontos szerep jut (Kereszt et al., 1998; Kiss et al., 2001; Kiss et al., 1997; Petrovics et al., 1993; Putnoky et al., 1990). Komplementációs kísérletekben a baktérium mutációját az rkpM4046 allélként azonosították és kimutatták, hogy a baktérium egyáltalán nem termel kapszuláris poliszacharidot. Ez nem várt eredmény volt, mivel a KR5 antigént tartották a fág receptorának, amit mások eredményei is megerősítettek (Putnoky et al., 1990; Williams et al., 1990).

BK_DIP04.doc


A mutánsról korábban azt feltételezték, hogy egy módosult poliszacharidot fog termelni. Mivel ez nem igazolódott, az látszott valószínűnek, hogy maga az RkpM fehérje a receptor. Egy speciális mutációról lehet szó, amely csak kis változást okoz az RkpM fehérje szerkezetében. Ezt a feltételezést az allél szekvenciájának meghatározása igazolta is, mivel egy Leu252Phe aminosavcserét okozó missense mutációban találták meg a fágrezisztencia okát (Deák Veronika, illetve Pálvölgyi Addrienn diplomamunkája, 2004).

4.6. A feltételezett H fehérje összehasonlítása az adatbázisokkal A feltételezett H fehérje szekvenciáját összehasonlítottuk a fehérje adatbázisokban (SwissProt, nr) található fehérjékkel a BLAST program segítségével. A H fehérje nem ad jó egyezést semmilyen ismert fehérjével. Csak a Mesorhizobium loti egy nyitott leolvasási kerete által feltételezetten kódolt, ismeretlen funkciójú szekvenciával mutat 30 %-ban azonosságot, mely a M. loti genomproject keretében vált ismertté.

BK_DIP04.doc


4.7. A h gén expressziója A további kísérletekben a h gén expresszióját próbáltuk megnövelni a feltételezett H fehérje valós kezdőpontjának meghatározása érdekében.

4.7.1. A h gén expressziós vektorba történő klónozása Az expresszió nyomonkövetéséhez a h gént klónoztuk a pSEM91 plazmidba (10. ábra), az alábbiakban ismertetett kísérletsorozat alapján (11. ábra).

10. ábra: Az ábrán a 6.7 kb nagyságú, kanamicin (Km) rezisztens pSEM91 plazmid látható (Semsey et al., 1999). A kísérlethez a D EcoRI fragmentet (pBM4128) használtuk, mely tartalmazza a h gént és környezetét. Kiindulásként ezt a D EcoRI fragmentet klónoztuk a pBS plazmidba. Erre a lépésre azért volt szükség, hogy a kapott klón megfelelő hasításának segítségével tompavégű fragmentet létrehozva lehetővé tegyük a h gén klónozását a pSEM91 plazmid EcoRI hasítóhelyére. Miután a h gént behelyeztük a pBS plazmid EcoRI hasítóhelyére (11/A. ábra), megvizsgáltuk, hogy milyen egyedi hasítóhelyeket tartalmaz az inszert és a plazmid.

BK_DIP04.doc


A tompa végek kialakításához a h gén 5’ végéhez nagyon közel elhelyezkedő SphI helyet használtuk. Azonban a pBS nem tartalmaz ilyen hasítóhelyet. Az inszerten nem található HindIII hely, ezért a plazmidot HindIII enzimmel hasítottuk. A megfelelő hasítóhelyek kiválasztása után izoláltuk az SphI–HindIII fragmentet (11/B. ábra), majd ebből az SphI–HindIII fragmentből tompavégű fragmentet hoztunk létre (11/C. ábra) T4 DNS polimeráz segítségével (5’ túlnyúló vég feltöltése, 3’ túlnyúló vég eltávolítása). Így ez a fragment már klónozható volt a pBS plazmid tompavégű EcoRV hasítóhelyére (11/D. ábra). Az volt a célunk, hogy az inszert olyan orientációban épüljön be a vektorba, hogy közel legyen az SphI hasítóhelye a vektoron található promóterhez. A vektoron található EcoRV hasítóhely közvetlen közelében található egy EcoRI hely, mely ezáltal a beépült inszert 5’ végéhez is közel helyezkedik el. Az említett EcoRI hasítóhelyet felhasználva izoláltuk a körülbelül 3.2 kb nagyságú EcoRI fragmentet, amely már beépíthető volt a pSEM91 vektor EcoRI hasítóhelyére (11/E. ábra). A pSEM91 plazmid (10. ábra) viszonylag kis kópiaszámú, ezért nem vártunk nagy expressziót. A plazmidon tac promóter található, mely két promóter fúziójaként jött létre, de ugyanúgy represszálható, mint a lac promóter. A transzformánsokat LB Km30-ra szelektáltuk A h klónt tartalmazó pSEM91 plazmidok keresését polimeráz láncreakcióval végeztük, mert kék-fehér szelekcióval nem lehetett igazolni az inszert beépülését. PCR reakciók során 300 transzformánst teszteltünk, oly módon, hogy 25-ös csoportokban végeztük a kísérletet. A továbbiakban azokat a csoportokat vizsgáltuk, amelyekben jelen voltak a h klónok. Az inszertet tartalmazó vektorok esetében BamHI és EcoRI emésztéssel igazoltuk az orientációt. A 11/E. ábra szemlélteti a h klón helyzetét a pSEM91 plazmidban. Jelenlegi kísérleteink arra irányulnak, hogy SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel meghatározzuk, nyomonkövethető.

BK_DIP04.doc

melyek

azok

a

körülmények,

amelyekkel

az

expresszió


SphI

EcoRI

h

EcoRI

A HindIII pBS:: D EcoRI fragment (ori 1)

B

EcoRI

SphI

HindIII

T4 DNS polimeráz (SphI)

C

EcoRI

tompa vég

pBS

D

tompa vég (HindIII)

EcoRV EcoRI

EcoRI

EcoRV

EcoRV

E h gén EcoRI

tacP

BamHI

BamHI

EcoRI

PstI

11. ábra: Az ábrán a h gén pSEM91 plazmidba történő klónozásának lépései láthatóak. A szürkés téglalap a plazmidot, a színtelen az inszertet jelöli.

BK_DIP04.doc


5. ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk célja, hogy jellemezzük egy baktériumfelszín felismerésében részt vevő bakteriofág fehérjének, az azt kódoló génnek a szerkezetét és a kapcsolat kialakulásának mechanizmusát. Kísérleti rendszerünket a lucernával szimbiotikus nitrogénkötésre képes Sinorhizobium meliloti baktérium és a rajta szaporodni képes 163 bakteriofág alkotja. Az előzetes eredmények szerint a baktérium-fág és a baktériumnövény felismerésnek azonos elemei is vannak, ezért általánosabb következtetések is remélhetők a feltett kérdés megválaszolásával. Egyes

fágrezisztens

baktériummutánsokon

izolálhatók

fertőzőképességüket

visszanyert fágmutánsok. A felismerés specifitását módosítja a fág egy (esetleg több) génjében bekövetkezett változás (host-range mutáció). Ezek segítségével azonosíthatók azok a gének (fehérjék), melyek a baktérium felismerésében szerepet játszanak. A 16-3 bakteriofág egy host-range mutációjának körülbelüli helyzete a fág genetikai térképén már ismert volt (h gén). Ennek alapján izoláltuk a megfelelő vad típusú

DNS

szakaszt,

és

különböző

szubklónok

készítésével,

majd

azok

szekvenálásával meghatároztuk a régió bázissorrendjét. Találtunk egy legalább 1900 bázispár hosszúságú nyitott leolvasási keretet (ORF), mely feltehetően a fág farki rost fehérjéjét (H fehérje) kódolja. A meghatározott DNS szakasz hossza mintegy 2300 bázispár, amin belül a maximális kódoló kapacitás 2121 bázispár. Ez egy 706 aminosavból álló fehérjének felel meg. A gén végét egy transzláció terminációs szignál is jelzi, de a kódoló régió elejét a szekvencia alapján nem lehetett pontosan meghatározni. Az első ATG kodontól 5' irányban még több mint 300 bp kódoló kapacitás található, melyben számos - e fág esetében már bizonyítottan - start kodonként funkcionáló triplet van. Maász Anita mutáns fágok izolálását követően missense mutációt talált a feltételezett H fehérjét kódoló régióban. Ahol a vad típusú fág esetében GGC, azaz glicint kódoló triplet volt, ott a mutánsokban GAC kodont talált, ami aszparaginsavat határoz meg. Ez a missense mutáció bizonyítja, hogy a feltételezett h gén által kódolt fehérje szerepet játszik a fágreceptor felismerésében. Valamint az aminosavcsere helye arra utal, hogy a kódolt fehérje C-terminális része fontos szerepet tölt be ebben a folyamatban (Maász Anita diplomamunkája, 2004).

BK_DIP04.doc


6. FELHASZNÁLT IRODALOM Allen, O.N. and E.K. Allen 1981. The Leguminosae: A source book of characteristics, uses, and nodulation The University of Wisconsin Press, Madison. Appleby, C.A. 1984. Leghemoglobin and Rhizobium respiration. Annu. Rev. Plant Physiol. 35:443-478. Banfalvi, Z., V. Sakanyan, C. Koncz, A. Kiss, I. Dusha, and and A. Kondorosi 1981. Location of nodulation and nitrogen fixation genes on a high molecular weight plasmid of R. meliloti. Mol. Gen. Genet. 184:318-325. Boulnois, G.J. and I.S. Roberts 1990. Genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 150:1-18. Brzoska, P.M. and E.R. Signer 1991. lpsZ, a lipopolysaccharide gene involved in symbiosis of Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 173:3235-3237. Capela, D., F. Barloy-Hubler, J. Gouzy, G. Bothe, F. Ampe, J. Batut, P. Boistard, A. Becker, M. Boutry, E. Cadieu, S. Dreano, S. Gloux, T. Godrie, A. Goffeau, D. Kahn, E. Kiss, V. Lelaure, D. Masuy, T. Pohl, D. Portetelle, A. Puhler, B. Purnelle, U. Ramsperger, C. Renard, P. Thebault, M. Vandenbol, S. Weidner and F. Galibert 2001. Analysis of the chromosome sequence of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti strain 1021. Proc Natl Acad Sci U S A. 98:9877-9882. Cook, D., R. 1999. Medicago truncatula - a modell in the making! Curr. Opin. Plant Biol. 2:301-304. Csiszovszki, Z., Z. Buzas, S. Semsey, T. Ponyi, P. Papp and L. Orosz 2003. immX immunity region of Rhizobium phage 16-3: Two overlapping cistrons of repressor function. J Bacteriol. 185:4382-4392. Dallman, G., L. Orosz and B. Sain 1979. Restriction mapping of DNA of temperate Rhizobium meliloti phage 16-3 : Comparision of genetic and physical maps indicates a long genetically silent chromosomal arm. Mol. Gen. Genet. 176:439448. Dallmann, G., F. Marincs, P. Papp, M. Gaszner and L. Orosz 1991. The isolated Nterminal DNA binding domain of the c repressor of bacteriophage 16-3 is functional in DNA binding in vivo and in vitro. Mol Gen Genet. 227:106-112. Denarie, J. and F. Debelle 1996. Rhizobium lipo-chitooligosaccharide nodulation factors: Signaling molecules mediating recognition and morphogenesis. Annu. Rev. Biochem. 65:503-535. Denarie, J., F. Debelle and C. Rosenberg 1992. Signalling and host range variation in nodulation. Annu. Rev. Microbiol. 46:497-531.

BK_DIP04.doc


Djordjevic, M.A., P.R. Schofield and B.G. Rolfe 1985. Tn5 mutagenesis of Rhizobium trifolii host-specific nodulation genes result in mutants with altered host-range ability. Mol. Gen. Genet. 200:463-471. Dorgai, L., F. Olasz, M. Berenyi, G. Dallmann, A. Pay and L. Orosz 1981. Orientation of the genetic and physical map of Rhizobium meliloti temperate phage 16-3. Mol. Gen. Genet. 182:321-325. Dudley, M.E., T.W. Jacobs and S.R. Long 1987. Microscopic studies of cell divisions induced in alfalfa roots by Rhizobium meliloti. Planta. 171:289-301. Erdei, S., B. Dudas, L. Orosz and E. Duda 1982. Identification of structural proteins of Rhizobium meliloti temperate phage 16-3. J Gen Virol. 62:145-152. Firmin, J.L., K.E. Wilson, L. Rossen and A.W.B. Johnston 1986. Flavonoid activation of nodulation genes in Rhizobium reversed by other compounds presents in plants. Nature. 324:90-92. Fisher, R.F., J.K. Tu and S.R. Long 1985. Conserved nodulation genes in Rhizobium meliloti and Rhizobium trifolii. Appl. Environ. Microbiol. 49: 1432- 1435. Glazebrook, J. and G.C. Walker 1989. A novel exopolysaccharide can function in place of the Calcofluor-binding exopolysaccharide in nodulation of alfalfa by Rhizobium meliloti. Cell. 56:661-672. Inoue, H., H. Nojima and H. Okayama 1990. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96:23-28. Ish-Horovicz, D. and J.F. Burke 1981. Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9:2989-2998. Jann, B. and K. Jann 1990. Structure and biosynthesis of the capsular antigens of Escherichia coli. Curr Top Microbiol Immunol. 150:19-42. Kereszt, A., E. Kiss, B. Reuhs, R.W. Carlson, A. Kondorosi and P. Putnoky 1998. Novel rkp gene clusters of Sinorhizobium meliloti involved in capsular polysaccharide production and the invasion of the symbiotic nodule: rkpK gene encodes for a UDP-glucose dehydrogenase. J. Bacteriol. 180:5426-5431. Kiss, E., A. Kereszt, F. Barta, S. Stephens, B. Reuhs, L., A. Kondorosi and P. Putnoky 2001. The rkp-3 gene region of Sinorhizobium meliloti Rm41 contains strainspecific genes that determine K antigen structure. Molecular Plant-Microbe Interactions. 14:1395-1403. Kiss, E., B. Reuhs, J. Kim, A. Kereszt, G. Petrovics, P. Putnoky, I. Dusha, R.W. Carlson and A. Kondorosi 1997. The rkpGHI and -J genes are involved in capsular polysaccharide production by Rhizobium meliloti. J. Bacteriol. 179:2132-2140.

BK_DIP04.doc


Kondorosi, E., Z. Banfalvi and A. Kondorosi 1984. Physical and genetic analysis of a symbiotic region of Rhizobium meliloti: Identification of nodulation genes. Mol. Gen. Genet. 193:445-452. Kondorosi, E. and A. Kondorosi 1986. Nodule induction on plant roots by Rhizobium. Trends Biochem. 11:296-299. Newcomb, W. 1981 Nodule morphogenesis and differentiation. In Biology of the Rhizobiaceae Eds. K.L. Giles and A.G. Atherly. Academic Press, New York, pp. 247-298. Orosz, L. and T. Sik 1970. Genetic mapping of rhizobiophage 16-3. Acta Microbiol. Acad. Sci. Hung. 17:185-194. Orosz, L., Z. Svab, A. Kondorosi and T. Sik 1973. Genetic studies on Rhizobio- phage 16-3. Genes and functions on the chromosome. Mol. Gen. Genet. 125:341- 350. Papp, I., L. Dorgai, P. Papp, E. Jonas, F. Olasz and L. Orosz 1993. The bacterial attachment site of the temperate Rhizobium phage 16-3 overlaps the 3' end of a putative proline tRNA gene. Mol. Gen. Genet. 240:258-264. Perret, X., C. Staehelin and W. Broughton 2000. Molecular basis of symbiotic promiscuity. Microbiol Mol Biol Rev. 64:180-201. Peters, N.K., J.W. Frost and S. Long 1986. A plant flavon, luteolin, induces expression of Rhizobium meliloti nodulation genes. Science. 233:977-980. Petrovics, G., P. Putnoky, B. Reuhs, J. Kim, T.A. Thorp, K.D. Noel, R.W. Carlson and A. Kondorosi 1993. The presence of a novel type of surface polysaccharide in Rhizobium meliloti requires a new fatty acid synthase-like gene cluster involved in symbiotic nodule development. Mol. Microbiol. 8:1083-1094. Phillips, D.A. and Y. Kapulnik 1995. Plant isoflavonoids, pathogens and symbionts. Trends Microbiol. 3:58-64. Putnoky, P., G. Petrovics, A. Kereszt, E. Grosskopf, D.T.C. Ha, Z. Banfalvi and A. Kondorosi 1990. Rhizobium meliloti lipopolysaccharide and exopolysaccharide can have the same function in the plant-bacterium interaction. J. Bacteriol. 172:5450-5458. Reuhs, B.L., R.W. Carlson and J.S. Kim 1993. Rhizobium fredii and Rhizobium meliloti produce 3-deoxy-D-manno-2- octulosonic acid-containing polysaccharides that are structurally analogous to group II K antigens (capsular polysaccharides) found in Escherichia coli. J. Bacteriol. 175:3570-3580. Roberts, I.S. 1996. The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 50:285-315. Semsey, S., I. Papp, Z. Buzas, A. Patthy, L. Orosz and P. Papp 1999. Identification of site-specific recombination genes int and xis of the Rhizobium temperate phage 16-3. J Bacteriol. 181:4185-4192.

BK_DIP04.doc


Spaink, H.P. 2000. Root nodulation and infection factors produced by rhizobial bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 54:257-288. Stougaard, J. 2001. Genetics and genomics of root symbiosis. Curr Opin Plant Biol. 4:328-335. Svab, Z., A. Kondorosi and L. Orosz 1978. Specialized transduction of a cystein marker by Rhizobium meliloti phage 16-3. J. Gen. Microbiol. 106:321-327. Szende, K. and F. Ordogh 1960. Die Lysogenie von Rhizobium meliloti. Naturwissenschaften. 47:404-412. Truchet, G., F. DebellE, J. Vasse, B. Terzhagi, A.M. Garnerone, C. Rosenberg, J. Batut, F. Maillet and J. Denarie 1985. Identification of a Rhizobium meliloti 2011 region controlling the host specificity of root hair curling and nodulation. J. Bacteriol. 164:1200-1210. Vasse, J., F. De Billy, S. Camut and G. Truchet 1990. Correlation between ultrastructural differentiation of bacteroids and nitrogen fixation in alfalfa nodules. J. Bacteriol. 172:4295-4306. Whitfield, C. and I.S. Roberts 1999. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 31:1307-1319. Williams, M.N.V., R.I. Hollingsworth, P.M. Brzoska and E.R. Signer 1990. Rhizobium meliloti chromosomal loci required for suppression of exopolysaccharide mutations by lipopolysaccharide. J. Bacteriol. 172:6596-6598.

BK_DIP04.doc


RÖVIDÍTÉSEK

Amp

ampicillin

APS

ammónium-perszulfát

ATP

adenozin-5′-trifoszfát

bp

bázispár

kb

kilobázispár

Cm

chloramphenicol

DNS

dezoxi-ribonukleinsav

EDTA

etilén-diamino-tetra-acetát

EPS

exopoliszacharid

IPTG

izopropil-β-D-tiogalaktopiranozid

Km

kanamicin

KPS

kapszuláris poliszacharid

LPS

lipopoliszacharid

Neo

neomicin

PCR

polimeráz láncreakció

SDS

nátrium-dodecil-szulfát

Sm

streptomicin

Tc

tetraciklin

Tris

tris-(hidroxi-metil)-amino-metán

X-gal

5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranozid

BK_DIP04.doc


KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS A diplomadolgozat alapját képező kísérleteket a Pécsi Tudományegyetem Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszékén végeztem. Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért, bírálataiért és a problémák megoldásában nyújtott segítségéért. Köszönetet mondok a tanszék oktatóinak, Dr. Kerepesi Ildikónak és Dr. Hoffmann Gyulának értékes megjegyzéseikért és bíztatásukért. Köszönöm a tanszéken dolgozó laboránsoknak, Miklósvári Zoltánné Maricának és Keidl Zoltánné Juditnak a kísérletek technikai hátterének biztosítását.

BK_DIP04.doc

A 16-3 bakteriofág h génje

Recommend Documents